Dėkojame, kad apsilankėte Nature.com. Naudojama naršyklės versija palaiko ribotą CSS. Kad gautumėte geriausią patirtį, rekomenduojame naudoti atnaujintą naršyklę (arba išjungti suderinamumo režimą „Internet Explorer“). Tuo tarpu, norėdami užtikrinti nuolatinį palaikymą, svetainę rodysime be stilių ir „JavaScript“.
Porėtos silicio dioksido dalelės buvo paruoštos sol-gelio metodu su tam tikrais modifikacijomis, kad būtų gautos makroporinės dalelės. Šios dalelės buvo gautos polimerizacijos grįžtamojo pridėjimo fragmentacijos grandinės pernešimu (RAFT) būdu su N-fenilmaleimido-metilvinilizocianatu (PMI) ir stirenu, kad būtų paruošta N-fenilmaleimido kolonėlės fazė (PMP-be polistirolo fazės) 00 × 1,8 mm id) buvo supakuoti suspensijos pakavimo būdu. Įvertintas peptidų mišinio, susidedančio iš penkių peptidų (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucino chromatografinis HA eliucino albumin S virškinimas ir optimalios leucino chromatografinės enkefalino plovimo sąlygos) kolonėlėje. , teorinis peptidų mišinio plokštelių skaičius yra net 280 000 plokštelių/m². Lyginant sukurtos kolonėlės atskyrimo efektyvumą su komercine Ascentis Express RP-Amide kolonėlė, pastebėta, kad PMP kolonėlės atskyrimo efektyvumas buvo pranašesnis už komercinę kolonėlę atskyrimo efektyvumo ir skiriamosios gebos požiūriu.
Pastaraisiais metais biofarmacijos pramonė tapo besiplečiančia pasauline rinka, kurios užimama rinkos dalis labai išaugo. Sparčiai augant biofarmacijos pramonei1,2,3, labai pageidaujama atlikti peptidų ir baltymų analizę. Be tikslinio peptido, peptidų sintezės metu susidaro keletas priemaišų, todėl reikia skysčių analizės, chromatografijos ir peptidų gryninimo. audiniai ir ląstelės yra labai sudėtinga užduotis dėl didelio potencialiai aptinkamų rūšių skaičiaus viename mėginyje. Nors masės spektrometrija yra veiksminga peptidų ir baltymų sekos nustatymo priemonė, jei tokie mėginiai į masių spektrometrą įšvirkščiami vienu praėjimu, atskyrimas nebus idealus. Šią problemą galima sušvelninti įdiegus skysčių chromatografijos spektrometro analizę, kuri sumažina masės atskyrimo (MS) skaičių. duotas laikas4,5,6.Be to, skystos fazės atskyrimo metu analitės gali būti sufokusuotos siauruose regionuose, taip sukoncentruojant šias analites ir pagerinant MS aptikimo jautrumą.Skysčių chromatografija (LC) per pastarąjį dešimtmetį gerokai pažengė į priekį ir tapo populiaria proteominės analizės technika7,8,9,10.
Atvirkštinės fazės skysčių chromatografija (RP-LC) plačiai naudojama peptidų mišiniams valyti ir atskirti, naudojant oktadecilu modifikuotą silicio dioksidą (ODS) kaip stacionarią fazę11,12,13.Tačiau RP stacionarios fazės neužtikrina patenkinamo peptidų ir baltymų atskyrimo dėl jų stacionarių1 sudėtingų1 ir amfifirinių savybių. reikia analizuoti peptidus ir baltymus su polinėmis ir nepolinėmis dalimis, kad sąveikautų su šiomis analitais ir išlaikytų jas.16.Mišraus režimo chromatografija, užtikrinanti multimodalinę sąveiką, gali būti alternatyva RP-LC atskiriant peptidus, baltymus ir kitus sudėtingus mišinius. ,20,21.Mišraus režimo stacionarios fazės (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, polar intercalation/RPLC) yra tinkamos peptidų ir baltymų atskyrimui dėl tiek polinių, tiek nepolinių grupių22,23,24,25,26,27,28. -polinės analitės, nes atskyrimas priklauso nuo analitės ir stacionarios fazės sąveikos.Multimodalinės sąveikos 29, 30, 31, 32. Neseniai Zhang ir kt.30 paruošė dodecilo galą turinčią poliamino stacionariąją fazę ir sėkmingai atskyrė angliavandenilius, antidepresantus, flavonoidus, nukleozidus, estrogenus ir keletą kitų analičių. Polinis interkalatorius turi ir polines, ir nepolines grupes, todėl juo galima atskirti peptidus ir baltymus, turinčius ir hidrofobines, ir hidrofilines kolonėles. yra komerciškai prieinamos prekės pavadinimu Ascentis Express RP-Amide kolonėlės, tačiau šios kolonėlės naudojamos tik amino 33 analizei.
Šiame tyrime buvo paruošta polinė stacionari fazė (į N-fenilmaleimidą įterptas polistirenas) ir įvertinta HSA peptidų ir tripsino skaidinių atskyrimas. Stacionarioji fazė buvo paruošta taikant tokią strategiją. Poringos silicio dioksido dalelės buvo paruoštos pagal mūsų ankstesniame leidinyje pateiktą procedūrą su tam tikrais modifikacijomis, vandens TMOS ir preparato protokolu. buvo sureguliuota acto rūgštis, kad būtų galima paruošti didelio porų dydžio silicio dioksido daleles. Antra, buvo susintetintas naujas ligandas, fenilmaleimido-metilvinilo izocianatas ir naudojamas silicio dioksido dalelių derivatizacijai, kad būtų paruošta polinė įterpta stacionari fazė. Gauta stacionari fazė buvo supakuota į mechaninę pakavimo schemą naudojant nerūdijančio plieno kolonėlę. kolonėlės viduje susidaro vienalytė lova. Įvertinkite peptidų mišinių, susidedančių iš penkių peptidų, supakuotų kolonėlių atskyrimą;(Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucino enkefalinas) ir žmogaus serumo albumino (HAS) suskaidymas tripsinu. Buvo pastebėta, kad peptidų mišinys ir HSA suskaidytas tripsinas atsiskyrė geros skiriamosios gebos ir efektyvumo. Atskyrimo našumas buvo lyginamas su PMP kolonėlės PMP. ir buvo pastebėta, kad baltymai gerai išskiriami ir veiksmingi PMP kolonėlėje, kuri buvo efektyvesnė nei Ascentis Express RP-Amide kolonėlė.
PEG (polietilenglikolis), karbamidas, acto rūgštis, trimetoksiortosilikatas (TMOS), trimetilo chlorosilanas (TMCS), tripsinas, žmogaus serumo albuminas (HSA), amonio chloridas, karbamidas, heksanas metildisilazanas (HMDS), metakriloilo chloridas, peroksiloksilas (MCTEHPOM) (MCTEHPOM). ), HPLC laipsnio acetonitrilas (ACN), metanolis, 2-propanolis ir acetonas, įsigytas iš Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, JAV).
Karbamido (8 g), polietilenglikolio (8 g) ir 8 ml 0,01 N acto rūgšties mišinys maišomas 10 minučių, po to į jį šaltomis sąlygomis įpilama 24 ml TMOS. Reakcijos mišinys kaitinamas 40 °C automobilyje 6 valandas, o po to 120 °C temperatūroje, o medžiaga buvo išplaunama be vandens 8 valandas. džiovinama 70 °C temperatūroje 12 valandų. Išdžiovinta minkšta masė lygiai sumalama krosnyje ir 12 valandų kaitinama 550 °C temperatūroje. Buvo paruoštos trys partijos ir apibūdintos, kad būtų galima ištirti dalelių dydžio, porų dydžio ir paviršiaus ploto atkuriamumą.
Silicio dioksido dalelių paviršių modifikuojant iš anksto susintetintu ligandu fenilmaleimido-metilvinilizocianatu (PCMP), po to radialine polimerizacija stirenu, buvo paruoštas polinių grupių turintis junginys.Stacionari fazė užpildams ir polistireno grandinėms. Paruošimo procesas aprašytas toliau.
N-fenilmaleimidas (200 mg) ir metilvinilo izocianatas (100 mg) buvo ištirpinti sausame toluene ir į reakcijos kolbą įpilama 0,1 ml 2,2'-azoizobutironitrilo (AIBN), kad būtų paruoštas fenilmaleimido-metilvinilo izocianato mišinys, o mišinys filtruojamas 3 val. 6 °C temperatūroje (PMC). 40°C orkaitėje 3 valandas.
Džiovintos silicio dioksido dalelės (2 g) buvo disperguotos sausame toluene (100 ml), maišomos ir ultragarsu apdorojamos 500 ml apvaliadugnėje kolboje 10 min. PMCP (10 mg) buvo ištirpintas toluene ir lašinamas į reakcijos kolbą per lašinamąjį piltuvą. Mišinys virinamas su grįžtamu šaldytuvu 100 °C temperatūroje ir 3 valandas filtruojamas 0 °C temperatūroje. Tada PMCP surištos silicio dioksido dalelės (100 g) buvo ištirpintos toluene (200 ml) ir pridėta 4-hidroksi-TEMPO (2 ml), kaip katalizatorius dalyvaujant 100 µl dibutilalavo dilaurato. Mišinys maišomas 50 °C temperatūroje 8 valandas ir džiovinamas 5 valandas, filtruojamas 0.
Stirenas (1 ml), benzoilo peroksidas BPO (0,5 ml) ir TEMPO-PMCP prijungtos silicio dioksido dalelės (1,5 g) buvo disperguotos toluene ir prapūstos azotu. Stireno polimerizacija buvo vykdoma 100 °C temperatūroje 12 valandų. Gautas produktas buvo plaunamas per naktį metanoliu 0 °C.
Mėginiai buvo degazuoti 393 K temperatūroje 1 valandą, kad liekamasis slėgis būtų mažesnis nei 10-3 Torr.Bendiniam porų tūriui nustatyti naudotas N2 kiekis, adsorbuotas esant santykiniam slėgiui P/P0 = 0,99.Plikų ir ligandais surištų silicio dioksido dalelių morfologija buvo ištirta naudojant Japonijos mėginį (Jachnopyngita, To microdeschitkyricopylogias, TooDinkykyrita). (plikos silicio dioksido ir su ligandu sujungtos silicio dioksido dalelės) buvo dedamos ant aliuminio kolonėlės, naudojant lipnią anglies juostą. Auksas buvo padengtas mėginiais naudojant Q150T purškimo dangą, o ant mėginių buvo nusodintas 5 nm Au sluoksnis. Tai pagerina proceso efektyvumą naudojant žemą įtampą ir užtikrina smulkiagrūdį, šaltą analizę, MA1A (The USArWaltmoelect, MA1A)1. r buvo naudojamas elementų analizei. Dalelių dydžio pasiskirstymui buvo naudojamas Malvern (Worcestershire, JK) Mastersizer 2000 dalelių dydžio analizatorius. Atviros silicio dioksido dalelės ir su ligandu sujungtos silicio dioksido dalelės (kiekviena po 5 mg) buvo disperguotos 5 ml izopropanolio, 10 minučių apdorojamos ultragarsu ir dedamos ant 5 min. ravimetrinė analizė buvo atlikta 5 °C per minutę greičiu nuo 30 iki 800 °C temperatūros diapazone.
Stikliniu pamušalu nerūdijančio plieno siauros angos kolonos, kurių matmenys (100 × 1,8 mm vid), buvo supakuotos naudojant srutų pakavimo metodą, taikant tą pačią procedūrą, naudotą nuorodoje.31. Nerūdijančio plieno kolonėlė (apklota stiklu, 100 × 1,8 mm vid.) su išleidimo jungtimi, kurioje yra 1 µm fritas, buvo prijungta prie srutų pakavimo įrenginio (Alltech Deerfield, IL, JAV). Paruoškite stacionarios fazės suspensiją suspenduodami 150 mg stacionarios kolonėlės. kaip suspensijos tirpiklis ir varomasis tirpiklis. Užpildykite kolonėlę paeiliui taikydami 100 MP slėgį 10 minučių, 80 MP 15 minučių ir 60 MP 30 minučių. Pakavimo metu mechaninė vibracija buvo taikoma dviem GC kolonėlės kratytuvais (Alltech, Deerfield, IL, JAV), kad būtų užtikrintas vienodas kolonėlės slėgis. apsaugokite nuo bet kokių pažeidimų kolonoje. Atjunkite kolonėlę nuo srutų pakavimo įrenginio ir prijunkite kitą jungiamąją jungtį prie įleidimo angos ir LC sistemos, kad patikrintumėte jos veikimą.
Sukurtas LC siurblys (10AD Shimadzu, Japonija), purkštukas (Valco (JAV) C14 W.05) su 50 nL įpurškimo kilpa, membranos degazatorius (Shimadzu DGU-14A), UV-VIS kapiliarinis langas. Po supakavimo kapiliarai (50 μm id 365 ir redukuojantys jungiamieji kapiliarai (50 μm) buvo sumontuoti redukuojančios jungties 1/16″ išėjime. Duomenų rinkimas ir chromatografinis apdorojimas atliktas naudojant Multichro 2000 programinę įrangą. Stebėjimas esant 254 nm.
Albuminas iš žmogaus serumo, liofilizuoti milteliai, ≥ 96% (agarozės gelio elektroforezė) 3 mg, sumaišyta su tripsinu (1,5 mg), 4,0 M karbamidu (1 ml) ir 0,2 M amonio bikarbonatu (1 ml). Tirpalas maišomas 10 minučių, po to 1 °C vandens vonioje 17 val. % TFA. Filtruokite tirpalą ir laikykite žemesnėje kaip 4 °C temperatūroje.
Peptidų mišinių ir HSA tripsino skaidulų atskyrimas buvo vertinamas atskirai PMP kolonėlėse. Patikrinkite peptidų mišinio ir HSA suskaidymo tripsino atskyrimą PMP kolonėlėje ir palyginkite rezultatus su Ascentis Express RP-Amide kolonėle. Teorinis plokštelės numeris apskaičiuojamas taip:
Plikų silicio dioksido dalelių ir su ligandu sujungtų silicio dalelių SEM vaizdai parodyti Fig.2 .Plikų silicio dioksido dalelių (A, B) SEM vaizdai rodo, kad, priešingai nei ankstesniuose tyrimuose, šios dalelės yra sferinės, kuriose dalelės yra pailgos arba netaisyklingos simetrijos. Su ligandais susietų silicio dioksido dalelių (C, D) paviršius yra lygesnis nei pliko silicio dioksido dalelių, kurios gali būti dėl polietileno paviršiaus polietileno.
Skenuojamosios elektroninės mikroskopinės pliko silicio dioksido dalelių (A, B) ir su ligandu sujungtų silicio dioksido dalelių (C, D) vaizdai.
Plikų silicio dalelių ir su ligandu susietų silicio dioksido dalelių pasiskirstymas parodytas 3 paveiksle (A). Dalelių dydžio pasiskirstymo tūrio kreivės parodė, kad silicio dioksido dalelių dydis padidėjo po cheminio modifikavimo (3A pav.). Dabartinio ir ankstesnio tyrimo silicio dalelių dalelių pasiskirstymo duomenys iš dabartinio ir ankstesnio tyrimo yra lyginami lentelėje P.,-1(AMP) dydis yra P.3 (AMP). .36 μm, palyginti su mūsų ankstesniu tyrimu, kurio ad(0,5) vertė buvo 3,05 μm (su polistirenu surištos silicio dioksido dalelės)34. Šios partijos dalelių pasiskirstymas buvo siauresnis, palyginti su ankstesniu mūsų tyrimu, nes anksčiau buvo skirtingi PEG, karbamido, TMOS ir acto rūgšties santykiai nei reakcijos mišinio dalelės yra didesnės nei PMP dalelių fazė. Tai reiškia, kad silicio dalelių paviršinis funkcionalizavimas stirenu ant silicio paviršiaus nusodino tik polistireno sluoksnį (0,97 µm), o PMP fazėje sluoksnio storis buvo 1,38 µm.
Plikų silicio dioksido dalelių ir su ligandais susietų silicio dalelių dalelių dydžio pasiskirstymas (A) ir porų dydžio pasiskirstymas (B).
Dabartinio tyrimo silicio dioksido dalelių porų dydis, porų tūris ir paviršiaus plotas pateikti 1(B) lentelėje. Pliko silicio dioksido dalelių ir su ligandu susietų silicio dioksido dalelių PSD profiliai parodyti 3(B) paveiksle. Rezultatai yra palyginami su ankstesnio tyrimo rezultatais. Plikų ir su ligandu susietų silicio dioksido dalelių porų dydžiai rodo, kad atitinkamai sumažėja310 ir atitinkamai silicio dioksido dalelių dydis4. 69 po cheminio modifikavimo, kaip parodyta 1(B) lentelėje, o kreivės pokytis parodytas 3(B) pav. Panašiai, po cheminio modifikavimo silicio dalelių porų tūris sumažėjo nuo 0,67 iki 0,58 cm3/g. Šiuo metu tiriamų silicio dalelių savitasis paviršiaus plotas yra 116 m2/m. 1(B) lentelėje po cheminio modifikavimo silicio dalelių paviršiaus plotas (m2/g) taip pat sumažėjo nuo 116 m2/g iki 105 m2/g.
Stacionarios fazės elementinės analizės rezultatai pateikti 2 lentelėje. Dabartinės stacionarios fazės anglies įkrova yra 6,35%, o tai yra mažesnė nei mūsų ankstesnio tyrimo anglies apkrova (polistirenu surištos silicio dioksido dalelės, atitinkamai 7,93%35 ir 10,21%) buvo naudojami tokie kaip fenilmaleimido-metilvinilizocianatas (PCMP) ir 4-hidroksi-TEMPO. Dabartinės stacionarios fazės azoto masės procentas yra 2,21%, palyginti su atitinkamai 0,1735 ir 0,85% azoto masės ankstesniuose tyrimuose. Tai reiškia, kad dabartinės stacionarios fazės azoto masės procentas yra didesnis dėl stacionarios azoto fazės. produktų (4) ir (5) buvo atitinkamai 2,7% ir 2,9%, o galutinio produkto (6) anglies įkrova buvo 6,35%, kaip parodyta 2 lentelėje. Svorio kritimas buvo patikrintas naudojant stacionarią PMP fazę, o TGA kreivė parodyta 4 paveiksle. ir H.
Fenilmaleimido-metilvinilizocianato ligandas buvo pasirinktas silicio dioksido dalelių paviršiaus modifikavimui, nes turi polinių fenilmaleimido grupių ir vinilizocianato grupių. Vinilo izocianato grupės gali toliau reaguoti su stirenu gyvos radikalinės polimerizacijos būdu. Antroji priežastis yra įterpti grupę, kuri turi vidutinę sąveiką su p-analimine faze, nes tarp stiprios elektroanalitinės fazės ir analitinės fazės nėra Ide fragmentas neturi virtualaus krūvio esant normaliam pH. Nejudančios fazės poliškumą galima kontroliuoti optimaliu stireno kiekiu ir laisvųjų radikalų polimerizacijos reakcijos laiku. Paskutinis reakcijos etapas (laisvųjų radikalų polimerizacija) yra labai svarbus ir gali pakeisti nejudančios fazės poliškumą. Buvo atlikta elementų analizė, siekiant patikrinti šių stacionarių fazių anglies įkrovą ir stacionarių fazių apkrovą. .SP, paruošti su skirtingomis stireno koncentracijomis, turi skirtingą anglies įkrovą.Vėlgi, įdėkite šias stacionarias fazes į nerūdijančio plieno kolonėles ir patikrinkite jų chromatografines charakteristikas (selektyvumą, skiriamąją gebą, N vertę ir kt.). Remiantis šiais eksperimentais, buvo pasirinkta optimizuota formulė, skirta PMP stacionariai fazei paruošti, kad būtų užtikrintas kontroliuojamas poliškumas ir geras analitės sulaikymas.
Penki peptidų mišiniai (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucino enkefalinas) taip pat buvo įvertinti naudojant PMP kolonėlę, naudojant mobiliąją fazę;60/40 (t/v) acetonitrilo/vandens (0,1 % TFA) esant 80 μL/min srautui. Optimaliomis eliuavimo sąlygomis teorinis plokštelės numeris (N) kolonėlėje (100 × 1,8 mm id) yra 20 000 ± 100 (200/000 M² chromo plokštelių kolonėlėje). Gramos parodytos 5A paveiksle. Greita analizė PMP kolonėlėje esant dideliam srauto greičiui (700 μL/min.), penki peptidai buvo išplaunami per vieną minutę, N vertės buvo labai geros, 13 500 ± 330 kolonėlėje (100 × 1,8 mm id), atitinka 135,00 Tre 135,00 treplokštelės/m. 00 × 1,8 mm id) buvo supakuotos su trimis skirtingomis PMP stacionarios fazės partijomis, kad būtų galima patikrinti atkuriamumą. Kiekvienos kolonėlės analitės koncentracija buvo užregistruota naudojant optimalias eliuavimo sąlygas ir teorinių plokštelių skaičių N bei sulaikymo trukmę, kad kiekvienoje kolonėlėje atskirtų tą patį tiriamąjį mišinį. Rodomi PMP kolonėlių atkuriamumo duomenys, PMP kolonėlių atkuriamumo D vertės yra rodomos PMP stulpelių atkuriamumo D vertės. 3 lentelė.
Peptidų mišinio atskyrimas PMP kolonėlėje (B) ir Ascentis Express RP-Amide kolonėlėje (A);judrioji fazė 60/40 ACN/H2O (TFA 0,1%), PMP kolonėlės matmenys (100 × 1,8 mm id);analitinė Junginių eliuavimo tvarka: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) ir 5 (leucino) rūgštis enkefalinas)).
PMP kolonėlė (100 × 1,8 mm id) buvo įvertinta žmogaus serumo albumino tripsinių skaidulų atskyrimui naudojant didelio efektyvumo skysčių chromatografiją. 6 paveiksle pateikta chromatograma rodo, kad mėginys gerai atskirtas, o skiriamoji geba yra labai gera. gramą (6 pav.), HSA virškinimas buvo padalytas į 17 smailių, atitinkančių 17 peptidų. Apskaičiuotas kiekvienos HSA skaidymo smailės atskyrimo efektyvumas ir reikšmės pateiktos 5 lentelėje.
Triptinis HSA virškinimas (100 × 1,8 mm id) buvo atskirtas PMP kolonėlėje;srauto greitis (100 µl/min.), judri fazė 60/40 acetonitrilas/vanduo su 0,1 % TFA.
čia L yra kolonėlės ilgis, η yra judriosios fazės klampumas, ΔP yra kolonėlės priešslėgis, o u yra judriosios fazės linijinis greitis. PMP kolonėlės pralaidumas buvo 2,5 × 10-14 m2, srauto greitis buvo 25 μL/min., o naudota 60/40 v/v. ACN perm. buvo panašus į mūsų ankstesniame tyrime Ref.34.Paviršutiniškai poringomis dalelėmis užpildytos kolonėlės pralaidumas yra: 1,7 × 10-15 1,3 μm dalelėms, 3,1 × 10-15 1,7 μm dalelėms, 5,2 × 10-15 ir 210-15 μm . μm dalelės 43.Todėl PMP fazės pralaidumas yra panašus į 5 μm šerdies ir apvalkalo dalelių.
čia Wx yra chloroformo užpildytos kolonėlės masė, Wy yra metanolio užpildytos kolonėlės masė, o ρ yra tirpiklio tankis. Metanolio (ρ = 0,7866) ir chloroformo (ρ = 1,484) tankiai. Bendras silicio DALELĖS akytumas Karbamido kolonėlės 31, kurias anksčiau tyrinėjome, buvo atitinkamai 0,63 ir 0,55. Tai reiškia, kad karbamido ligandų buvimas sumažina stacionarios fazės pralaidumą. Kita vertus, bendras PMP kolonėlės poringumas (100 × 1,8 mm id) yra 0,60. tipo stacionariose fazėse C18 ligandai prie silicio dalelių yra prijungiami kaip linijinės grandinės, o polistireno tipo stacionariose fazėse aplink jį susidaro santykinai storas polimero sluoksnis. Tipiško eksperimento metu kolonėlės poringumas apskaičiuojamas taip:
7A, B paveiksluose pavaizduota PMP kolonėlė (100 × 1,8 mm id) ir Ascentis Express RP-Amide kolonėlė (100 × 1,8 mm id), naudojant tas pačias eliuavimo sąlygas (ty 60/40 ACN/H2O ir 0,1 % TFA).) van Deemter sklypo.Atrinkti peptidų mišiniai (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkefalin) buvo paruošti 20 µL/ Minimalus srautas abiejose kolonėlėse yra 800 µL/min. Optimalios HETP vertės A ir 0 µL tėkmės kolonėlėje (8 µL) centis Express RP-Amide kolonėlė buvo atitinkamai 2,6 µm ir 3,9 µm. HETP reikšmės rodo, kad PMP kolonėlės atskyrimo efektyvumas (100 × 1,8 mm id) yra daug geresnis nei komerciškai prieinamos Ascentis Express N RP-Amide kolonėlės (100 × 1,8 mm id. srauto grafiko padidėjimas rodo, kad tėkmės sumažėjimas yra 7). nėra reikšmingas, palyginti su mūsų ankstesniu tyrimu. Didesnis PMP kolonėlės atskyrimo efektyvumas (100 × 1,8 mm id), palyginti su Ascentis Express RP-Amide kolonėlė, pagrįstas dalelių formos, dydžio patobulinimais ir sudėtingomis kolonėlės pakavimo procedūromis, naudojamomis dabartiniame darbe34.
(A) van Deemterio grafikas (HETP ir judriosios fazės linijinis greitis), gautas naudojant PMP stulpelį (100 × 1,8 mm id) 60/40 ACN/H2O su 0,1 % TFA.(B) van Deemterio grafikas (HETP ir judriosios fazės linijinis greitis), gautas naudojant Ascentis Express Ascentis Express RP-Amide stulpelį 10/0/0H20. su 0,1% TFA.
Buvo paruošta ir įvertinta polistireno stacionari fazė, skirta sintetinių peptidų mišiniams ir žmogaus serumo albumino (HAS) virškinimui tripsinais atskirti didelio efektyvumo skysčių chromatografijoje. Peptidų mišinių PMP kolonėlių chromatografinės savybės yra puikios atskyrimo efektyvumo ir skiriamosios gebos požiūriu. sis stacionarios fazės ir sudėtingos kolonėlės užpildymo. Be didelio atskyrimo efektyvumo, mažas kolonėlės priešslėgis esant dideliam srauto greičiui yra dar vienas šios stacionarios fazės privalumas. PMP kolonėlės pasižymi geru atkuriamumu ir gali būti naudojamos peptidų mišinių analizei ir įvairių baltymų skaidymui tripsinu. Šią kolonėlę ketiname naudoti P kolonėlės chromografijos ekstraktui iš natūralių augalų, biologiškai aktyvių junginių chromografijoje. vertinamas dėl baltymų ir monokloninių antikūnų atskyrimo.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Peptidų atskyrimo sistemų tyrimai atvirkštinės fazės chromatografijos būdu I dalis: Kolonėlės apibūdinimo protokolo kūrimas.J.Chromatography.1603, 113–129.https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038 (2019).
Gomez, B. et al.Patobulinti aktyvūs peptidai, skirti infekcinėms ligoms gydyti.Biotechnology.Advanced.36(2), 415-429.https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Sintetiniai terapiniai peptidai: mokslas ir rinka.vaistų atradimas.15 (1-2) šiandien, 40-56.https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Xie, F., Smith, RD ir Shen, Y. Advanced Proteomic Liquid Chromatography.J.Chromatography.A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. ir kt. Išplėstinė skysčių chromatografijos-masių spektrometrija leidžia įtraukti plačiai taikomą metabolomiką ir proteomiką.anus.Chim.Acta 1069, 89–97 (2019).
Chesnut, SM & Salisbury, JJ UHPLC vaidmuo kuriant vaistus.J.Sep. Sci.30(8), 1183-1190 (2007).
Wu, N. & Clausen, AM Pagrindiniai ir praktiniai ultraaukšto slėgio skysčių chromatografijos aspektai greitam atskyrimui.J.Sep. Sci.30(8), 1167-1182.https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA & Tchelitcheff, P. Itin didelio efektyvumo skysčių chromatografijos taikymas kuriant vaistus.J.Chromatography.1119(1-2), 140-146.https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. ir kt. Monolitiniai makroporiniai hidrogeliai, pagaminti iš aukštos vidinės fazės emulsijų aliejuje vandenyje, skirta efektyviam enterovirusų valymui. Cheminė medžiaga. Britanija. J.401, 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA Skysčių chromatografijos vaidmuo proteomikoje.J.Chromatography.A 1053(1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Veuthey, J.-L.& Guillarme, D. Kylančios tendencijos atvirkštinės fazės skysčių chromatografijos terapinių peptidų ir baltymų separacijose: teorija ir taikymas.J.Farmacija.Biomedicinos mokslas.anus.69, 9-27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC Dvimatis peptidų atskyrimas naudojant RP-RP-HPLC sistemą, naudojant skirtingas pH vertes pirmajame ir antrajame atskyrimo matmenyse.J.Sep. Sci.28(14), 1694-1703 (2005).
Feletti, S. et al.Tirtos didelio efektyvumo chromatografinių kolonėlių, užpildytų C18 sub-2 μm pilnai ir paviršutiniškai poringomis dalelėmis, masės perdavimo charakteristikos ir kinetinės charakteristikos.J.Sep. Sci.43 (9–10), 1737–1745 (2020).
Piovesana, S. ir kt. Naujausios tendencijos ir analitiniai iššūkiai augalų bioaktyvių peptidų išskyrimo, identifikavimo ir patvirtinimo srityje.anus.biological anus.Chemical.410(15), 3425–3444.https://doi.org/10.1007/s00216-028-08.
Mueller, JB ir kt. Gyvybės karalystės proteominis peizažas. Gamta 582(7813), 592-596.https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
DeLuca, C. ir kt. Terapinių peptidų apdorojimas preparatine skysčių chromatografija. Molecule (Bazelis, Šveicarija) 26(15), 4688(2021).
Yang, Y. & Geng, X. Mišriojo režimo chromatografija ir jos taikymas biopolimerams.J.Chromatography.A 1218(49), 8813–8825 (2011).
Zhao, G., Dong, X.-Y. & Sun, Y. Ligands for mix-mode protein chromatography: Princips, Charactization and Design.J.Biotechnologija.144(1), 3-11 (2009).