Dėkojame, kad apsilankėte Nature.com.Naudojama naršyklės versija turi ribotą CSS palaikymą.Norėdami gauti geriausią patirtį, rekomenduojame naudoti atnaujintą naršyklę (arba išjungti suderinamumo režimą „Internet Explorer“).Tuo tarpu norėdami užtikrinti nuolatinį palaikymą, svetainę pateiksime be stilių ir „JavaScript“.
Angustifolius lubinas (NLL, Lupinus angustifolius L.) – ankštinis augalas, naudojamas maistui gaminti ir dirvožemiui gerinti.Pasaulinis NLL, kaip pasėlių, išplitimas pritraukė daug patogeninių grybų, įskaitant lubinų antracnozę, kuri sukelia niokojančią antraknozės ligą.NLL veisimui buvo naudojami du aleliai, Lanr1 ir AnMan, kurie padidina atsparumą, tačiau pagrindiniai molekuliniai mechanizmai lieka nežinomi.Šiame tyrime Lanr1 ir AnMan žymenys buvo naudojami Europos NLL mėginiams tikrinti.Vakcinos bandymai kontroliuojamoje aplinkoje patvirtino abiejų atsparių donorų veiksmingumą.Diferencialinis genų ekspresijos profiliavimas buvo atliktas reprezentatyviose atspariose ir jautriose linijose.Atsparumas antracnozei buvo susijęs su pernelyg dideliu genų ontologijos terminų „GO:0006952 Defense Response“, „GO:0055114 Redox Process“ ir „GO:0015979 Photosynthesis“ ekspresija.Be to, Lanr1 (83A: 476) linija greitai po inokuliacijos parodė reikšmingą transkripto perprogramavimą, o kitose eilutėse šis atsakas vėlavo maždaug 42 valandomis.Gynybos atsakai yra susiję su TIR-NBS, CC-NBS-LRR ir NBS-LRR genais, 10 patogenezėje dalyvaujančių baltymų, lipidų pernešimo baltymais, endogliukano-1,3-β-gliukozidaze, glicino turtingais ląstelių sienelių baltymais ir reaktyvaus deguonies kelio genais.Ankstyvieji atsakai į 83A: 476, įskaitant kruopštų su fotosinteze susijusių genų slopinimą, sutapo su sėkminga apsauga grybų biologijos vegetatyvinio augimo fazėje, o tai rodo, kad efektorius sukelia imunitetą.Mandeloop reakcija sulėtėja, kaip ir bendras horizontalus tempimas.
Siauralapis lubinas (NLL, Lupinus angustifolius L.) yra daug baltymų turintis javas, kilęs iš vakarinio Viduržemio jūros regiono1,2.Šiuo metu jis auginamas kaip maistinis augalas gyvūnams ir žmonėms.Ji taip pat laikoma žaliąja trąša sėjomainos sistemose dėl azoto fiksavimo simbiotinėmis azotą fiksuojančiomis bakterijomis ir bendro dirvožemio struktūros pagerinimo.NLL per pastarąjį šimtmetį išgyveno greitą prijaukinimo procesą ir vis dar patiria didelį veisimosi spaudimą3,4,5,6,7,8,9,10,11,12.Plačiai auginant NLL, patogeninių grybų sukcesija sukūrė naujas žemės ūkio nišas ir sukėlė naujas pasėlius naikinančias ligas. Žymiausias lubinų augintojams ir augintojams buvo antraknozės atsiradimas, kurį sukėlė patogeninis grybas Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler ir Hagedorn13. Žymiausias lubinų augintojams ir augintojams buvo antraknozės atsiradimas, kurį sukėlė patogeninis grybas Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler ir Hagedorn13. Наиболее примечательным для фермеров и селекционеров люпина было появление антракноза антракноза, вызванногоныrich памто Nirenbergas, Feileris ir Hagedornas13. Žymiausias lubinų augintojams ir augintojams buvo antraknozės atsiradimas, kurį sukėlė patogeninis grybas Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler ir Hagedorn13.对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是由痟irchondar) enberg, Feiler ir Hagedorn13 引起的.对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它昏现，它是由痆trich养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现Bondarum) Plaukai.1 Наиболее поразительным для фермеров и селекционеров люпина является появление антракмриотрих, вызбонкопагогогоми Bondaras) Nirenbergas, Feileris ir Hagedornas13. Labiausiai lubinų augintojus ir augintojus stebina antraknozės atsiradimas, kurį sukelia patogeninis grybas Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler ir Hagedorn13.Pirmieji pranešimai apie ligą buvo iš Brazilijos ir JAV, tipiški simptomai pasireiškė atitinkamai 1912 ir 1929 m.Tačiau po maždaug 30 metų patogenas buvo pavadintas Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc., teleomorfas Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorfas Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., телеоморф Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld teleomorfas. & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld в Целенаправленной морфологии. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld tikslinėje morfologijoje. & H. Šrenkas,. & H. Šrenkas, .ir H. Šrenkas. & H. 施伦克 ，。 & H. 施伦克 ，。ir H. Šlenkas, .XX amžiaus viduryje atliktas preliminarus ligos fenotipų nustatymas parodė tam tikrą NLL ir geltonųjų lubinų (L. luteus L.) ataugų atsparumą, tačiau visi tirti baltųjų lubinų (L. albus L.) ataugai buvo labai jautrūs15,16.Tyrimai parodė, kad antracnozės vystymasis yra susijęs su padidėjusiu kritulių kiekiu (oro drėgnumu) ir temperatūra (12–28 °C diapazone), o tai lemia atsparumo pažeidimą aukštesnėje temperatūroje17, 18. Tiesą sakant, laikas, reikalingas konidijoms sudygti ir ligai prasidėti, buvo keturis kartus trumpesnis 24 °C temperatūroje, esant aukštai oro drėgmei (6 val.)9.Taigi, vykstantis visuotinis atšilimas paskatino antraknozės plitimą.Tačiau ši liga buvo pastebėta Prancūzijoje (1982 m.) ir Ukrainoje (1983 m.) kaip gresiančios grėsmės pranašas, tačiau tuo metu lubinų pramonė ją, matyt, ignoravo20,21.Po kelerių metų ši niokojanti liga išplito visame pasaulyje ir paveikė didžiąsias lubinus auginančias šalis, tokias kaip Australija, Lenkija ir Vokietija22,23,24.Po antraknozės protrūkio dešimtojo dešimtmečio viduryje, atlikus išsamų patikrinimą, NLL19 mėginiuose buvo nustatyti keli atsparūs donorai.NLL atsparumą antracnozei kontroliuoja du atskiri dominuojantys aleliai, randami skirtinguose germplazmos šaltiniuose: Lanr1 veislėje Tanjil ir Wonga bei AnMan veislėje.Mandalay 25, 26. Šie aleliai papildo molekulinius žymenis, palaikančius atsparios gemalo atranką veisimo programose25,26,27,28,29,30.Atspari veisimo linija 83A:476, turinti Lanr1 alelį, buvo sukryžminta su jautria laukine linija P27255, kad būtų gauta RIL populiacija, atskirta nuo atsparumo antracnozei, todėl Lanr1 lokusą buvo galima priskirti NLL-1131, 32, 33 chromosomai. atskleidė visų trijų alelių vietą toje pačioje chromosomoje (NLL-11), bet skirtingose ​​padėtyse 29, 34, 35.Tačiau dėl nedidelio RIL skaičiaus ir didelio genetinio atstumo tarp žymenų ir atitinkamų alelių negalima daryti patikimų išvadų apie jų pagrindinius genus.Kita vertus, naudoti atvirkštinę genetiką lubinuose yra sunku dėl labai mažo jų regeneracijos potencialo, todėl genetinis manipuliavimas yra sudėtingas37.
Prijaukintos gemalinės plazmos, turinčios pageidaujamą alelį homozigotinėje būsenoje, pvz., 83A:476 (Lanr1) ir Mandelup (AnMan), sukūrimas atvėrė duris atsparumo antracnozei tyrimui, kai laukinėse populiacijose yra priešingų alelių derinių.Molekulinių mechanizmų galimybės.Palyginkite specifinių genotipų generuojamus gynybinius atsakus.Šis tyrimas įvertino ankstyvą NLL transkriptinį atsaką į C. lupini vakcinaciją.Pirma, Europos NLL germplazmos skydelis, kuriame yra 215 linijų, buvo patikrintas naudojant molekulinius žymenis, žyminčius Lanr1 ir AnMan alelius.Tada antracnozės fenotipų nustatymas buvo atliktas 50 NLL linijų, anksčiau atrinktų molekuliniams žymenims, kontroliuojamomis sąlygomis.Remiantis šiais eksperimentais, buvo atrinktos keturios linijos, besiskiriančios atsparumu antracnozei ir Lanr1 / AnMan alelinei kompozicijai, skirtos diferencinei gynybos genų ekspresijos profiliavimui, naudojant du vienas kitą papildančius metodus: didelio našumo RNR sekos nustatymą ir realaus laiko PGR kiekybinį nustatymą.
NLL gemalų rinkinio (n = 215) rinkinio su žymekliais LANR1 (ANSEQ3 ir ANSEQ4) ir Anman (Anseq4) ir Anman (Anmanm1) parodė, kad tik viena eilutė (95726, šalia Salamanca-B).Trylika linijų sukūrė du „atsparius“ Lanr1 žymeklio alelius, o 8 linijos – „atsparius“ Lanr1 alelius.žymeklis.AnMan žymeklio „atsparumo“ alelis (papildoma lentelė S1).Dvi linijos buvo heterozigotinės Anseq3 žymeniui ir viena heterozigotinė AnManM1 žymeniui.42 linijos (19, 5%) turėjo priešingas Anseq3 ir Anseq4 alelių fazes, o tai rodo aukštą rekombinacijos tarp šių dviejų lokusų dažnį.Antraknozės fenotipai kontroliuojamomis sąlygomis (papildoma lentelė S2) atskleidė išbandytų genotipų atsparumo kintamumą, kuris atsispindėjo antracnozės sunkumo laipsnyje.Vidutinių balų skirtumai svyravo nuo 1,8 (vidutinio atsparumo) iki 6,9 (jautrūs), o augalo svorio skirtumai – nuo ​​0,62 (jautrūs) iki 4,45 g (atsparūs). Buvo reikšminga koreliacija tarp verčių, pastebėtų atliekant dvi eksperimento kopijas (0,51 ligos sunkumo balams, P = 0,00017 ir 0,61 augalo svoriui, P < 0,0001), taip pat tarp šių dviejų parametrų (-0,59 ir -0,77, P < 0,0001). Buvo reikšminga koreliacija tarp verčių, pastebėtų atliekant dvi eksperimento kopijas (0,51 ligos sunkumo balams, P = 0,00017 ir 0,61 augalo svoriui, P < 0,0001), taip pat tarp šių dviejų parametrų (-0,59 ir -0,77, P < 0,0001). Выявлена достоверная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностях эксперимента эксперимента (0,51) , P = 0,00017 ir 0,61 для массы растения, P < 0,0001), а также между этими двумя параметрами (-0,59 ir -0,7,0,0 Р0,1)0,0). Buvo nustatyta reikšminga koreliacija tarp verčių, pastebėtų atliekant du eksperimento kartojimus (0,51 ligos sunkumo balams, P = 0,00017 ir 0,61 augalo svoriui, P < 0,0001), taip pat tarp šių dviejų parametrų (- 0,59 ir -0,77, P < 0,0000)1).在两次重复实验中观察到的值之间存在显着相关性（疾病严重复实验中观察到的值之间存在显着相关性（疾病严重复实验中观察度评分1，0.物重量为0,61，P < 0,0001）以及这两个参数之间（- 0,59 和-0,77，P < 0,0001).在 两 次 重复 实验 中 观察 的 值 之间 存在 相关性 （疾病 严 庍 程庆 证. 1, p = 0,00017, 植物 为 为 0,61, p <0,0001和 – 0,59 和 – 0,77, P < 0,0001). Pastaba: 0017 ir масса растения 0,61, P <0,0001), и между этими двумя параметрами (-0,59 ir -0,0001) 0,77, P <0,0001. Buvo reikšminga koreliacija tarp verčių, stebėtų du kartus (ligos sunkumo balas 0,51, P = 0,00017 ir augalo svoris 0,61, P < 0,0001) ir tarp šių dviejų parametrų (-0,59 ir -0 ,0001) 0,77, P < 0,0001. ).Tipiški jautrių augalų simptomai yra stiebo susilenkimas ir sukimasis, panašus į „piemens lanko“ struktūrą, po to atsiranda ovalūs pažeidimai su oranžiniais / rausvais sporozoitais (papildomas 1 pav.).Australijos priedai, turintys Lanr1 (83A: 476 ir Tanjil) ir AnMan (Mandelup) genus, yra vidutiniškai atsparūs, 0, 0331 ir 0, 0036.Kai kurios linijos, kuriose taip pat yra „atsparūs“ Lanr1 ir (arba) AnMan aleliai, rodo ligos simptomus.
Įdomu tai, kad kelios NLL linijos, neturinčios jokio „atsparaus“ žymeklio alelio, atskleidė aukštą atsparumo antracnozei lygį (panašų arba didesnį nei Lanr1 arba AnMan genotipų), pvz., Boregine (P vertė < 0,0001 abiem parametrams), Bojar (P vertė < 0,0001 balams ir 0,001 P9b/0,00 augalo svorio) 1 už balą ir nereikšmingas pagal svorį). Įdomu tai, kad kelios NLL linijos, neturinčios jokio „atsparaus“ žymeklio alelio, atskleidė aukštą atsparumo antracnozei lygį (panašų arba didesnį nei Lanr1 arba AnMan genotipų), pvz., Boregine (P vertė < 0,0001 abiem parametrams), Bojar (P vertė < 0,0001 balams ir 0,001 P9b/0,00 augalo svorio) 1 už balą ir nereikšmingas pagal svorį). Интересно, что несколько линий NLL, лишенных какого-либо «резистентного» маркерного аллеля, показали высовейх высколько высокий кнозу (сопоставимый или более высокий, чем для генотипов Lanr1 или AnMan), таких как Boregine (значевние P <0,0001 длхерона) е P < 0,0001 для оценки ir 0,001 для массы растения) ir популяции B-549/79b (значение P <0,0001 для оценесласломоцен). Įdomu tai, kad kelios NLL linijos, neturinčios jokio „atsparaus“ žymeklio alelio, parodė aukštą atsparumo antracnozei lygį (panašų į Lanr1 arba AnMan genotipų arba didesnį nei), pavyzdžiui, Boregine (P vertė < 0,0001 abiem parametrams), Bojar (P vertė < 0,0001 vertinant ir B vertė <0,0001, kai vertinama, o populiacijos svoris < 0,0,0,0,0, 0,0b/91) 01 vertinimui ir nereikšmingas svoriui).有趣的是，一些缺乏任何“抗性”标记等位基因的NLL 系显示出高気平示出高気平的炭爊気平的炭疍基因型相当或更高），例如Boregine（两个参数的P 值< 0,0001）、伩驩鏉麍捸01＇0.0.0 .001）和种群B-549/79b（得分P 值< 0,0001，重量不显着）. Įdomu tai, kad kai kurios NLL sistemos, neturinčios jokių „antigeninių“ žymenų, pasižymi dideliu horizontaliu atsparumu (atitinka Lanr1 arba AnMan genus ar aukštesnius), pavyzdžiui, Boregine (abu parametrai P < 0,0001), Bojar (P reikšmė < 0,0001, augalo svoris 0,001) ir štamas B-549/0,00, svoris nereikšmingas (P0 reikšmė <10,0). Интересно, что некоторые линии NLL, лишенные каких-либо маркерных аллелей «резистентности», показали высок ракнозу (сравнимые или выше, чем у генотипов Lanr1 или AnMan), такие как Boregine (значение P для обоих параметров), <0,00,00езна, Boче0,0001 са растения 0,001) ir популяция B-549/79b (оценка P-значение <0,0001, масса незначительна). Įdomu tai, kad kai kurios NLL linijos, neturinčios jokių „atsparumo“ žymenų alelių, parodė aukštą atsparumo antracnozei lygį (panašų į Lanr1 arba AnMan genotipų arba didesnį nei), pavyzdžiui, Boregine (abiejų parametrų P vertė <0,0001), Bojar (P vertė <0,0001, augalų svoris <0,0001, augalų svoris <0,0b04)/9.0b04. 01, svoris nereikšmingas).Šis reiškinys rodo naujo genetinio atsparumo šaltinio galimybę, paaiškinantį pastebėtą koreliacijos tarp žymenų genotipų ir ligos fenotipų trūkumą (P vertės nuo ~0,42 iki ~0,98).Taigi Kolmogorovo-Smirnovo testas parodė, kad duomenys apie atsparumą antracnozei buvo maždaug normaliai pasiskirstę pagal balus (P vertės 0,25 ir 0,11) ir augalų masę (P vertės 0,47 ir 0,55), o tai leidžia manyti, kad yra daugiau alelių nei Lanr1 ir AnMan.
Remiantis atsparumo antracnozei atrankos rezultatais, transkripto analizei buvo parinktos 4 linijos: 83A:476, Boregine, Mandelup ir Population 22660. Šios linijos buvo pakartotinai tiriamos dėl atsparumo juodligei inokuliacijos eksperimentuose RNR sekos nustatymu, su sąlyga, kad jos buvo tokios pačios kaip ir ankstesniame tyrime.Balų reikšmės buvo tokios: Boreginas (1,71 ± 1,39), 83A: 476 (2,09 ± 1,38), Mandelupas (3,82 ± 1,42) ir 22 660 gyventojų (6,11 ± 1,29).
„Illumina NovaSeq 6000“ protokolas vidutiniškai pasiekė 40,5 Mread porų vienam mėginiui (29,7–54,4 Mreads) (papildoma S3 lentelė).Lygiavimo balai etaloninėje sekoje svyravo nuo 75,5% iki 88,6%.Vidutinė skaitymo skaičiaus duomenų koreliacija tarp eksperimentinių variantų tarp biologinių pakartojimų svyravo nuo 0,812 iki 0,997 (vidurkis 0,959). Iš 35 170 analizuotų genų 2917 neatskleidė jokios ekspresijos, o kiti 4785 genai buvo išreikšti nereikšmingu lygiu (bazinis vidurkis < 5). Iš 35 170 analizuotų genų 2917 neatskleidė jokios ekspresijos, o kiti 4785 genai buvo išreikšti nereikšmingu lygiu (bazinis vidurkis < 5). Из 35 170 проанализированėtis генов 2917 не прояли экспресeisti не (базовое среднее <5). Iš 35 170 analizuotų genų 2917 neparodė ekspresijos, o likę 4785 genai buvo išreikšti nereikšmingu lygiu (bazinis vidurkis <5).在 分析 的 35,170 个 中 中 ， 2917 个 没有 表达 ， 其他 4785 个 的 表达 表达 可以 （（基本 平均值 <5）。。35,170 Из 35 170 проанализированėtis генов 2917 не экспресироkaitusi енее значение <5). Iš 35 170 analizuotų genų 2917 nebuvo išreikšti, o likusių 4785 genų ekspresija buvo nereikšminga (bazinis vidurkis <5).Taigi, eksperimento metu išreikštų genų skaičius (bazinis vidurkis ≥ 5) buvo 27 468 (78, 1%) (papildoma S4 lentelė).
Nuo pirmojo laiko momento visos NLL linijos reagavo į C. lupini (padermė Col-08) inokuliaciją perprogramuodamos transkriptą (1 lentelė), tačiau tarp linijų buvo pastebėti reikšmingi skirtumai.Taigi atsparumo linija 83A:476 (nešanti Lanr1 geną) parodė reikšmingą transkripto perprogramavimą pirmuoju laiko tašku (6 hpi), o izoliuotų aukštyn ir žemyn nukreiptų genų skaičius padidėjo 31–69 kartus, palyginti su kitais laiko momentais šiuo metu.Be to, šis pikas buvo trumpalaikis, nes tik kelių genų ekspresija išliko reikšmingai pakitusi antrajame laiko taške (12 hpi).Įdomu tai, kad Boregine, kuris taip pat parodė aukštą atsparumo lygį transplantato teste, eksperimento metu nebuvo atliktas toks didžiulis transkripcijos perprogramavimas.Tačiau skirtingai išreikštų genų (DEG) skaičius buvo toks pat Boregine ir 83A: 476 esant 12 HPI.Tiek Mandelup, tiek populiacija 22660 rodė DEG smailes paskutiniu laiko tašku (48 l/s), o tai rodo santykinį gynybos atsako vėlavimą.
Kadangi 83A:476 buvo atliktas didžiulis transkripto perprogramavimas, reaguojant į C. lupini esant 6 HPI, palyginti su visomis kitomis linijomis, ~91% DEG, stebėtų šiuo metu, buvo būdingi linijai (1 pav.).Tačiau ankstyvieji atsakymai tarp tyrimo linijų šiek tiek sutapo, nes atitinkamai 68,5%, 50,9% ir 52,6% DEG Boregine, Mandelup ir 22660 populiacija tam tikrais laiko momentais sutapo su 83A:476.Tačiau šie DEG sudarė tik nedidelę dalį (0,97–1,70%) visų šiuo metu aptiktų DEG naudojant 83A:476.Be to, šiuo metu 11 DEG iš visų linijų buvo nuoseklūs (papildomos lentelės S4-S6), įskaitant bendrus augalų apsaugos atsakų komponentus: lipidų pernešimo baltymą (TanjilG_32225), endogliukano-1,3-β-gliukozido fermentą (TanjilG_23384), du streso sukeliamus baltymus (TanjilG_23384) ir S3G_G_22 Tanjil82, pvz. 31), bazinis latekso baltymas (TanjilG_32352) ir du glicino turintys struktūriniai ląstelės sienelės baltymai (TanjilG_19701 ir TanjilG_19702).Taip pat buvo santykinai didelis transkripto atsakų sutapimas tarp 83A:476 ir Boregine esant 24 HPI (iš viso 16–38 % DEG) ir tarp Mandelup ir 22660 populiacijos esant 48 HPI (iš viso 14–20 % DEG).
Venno diagrama, rodanti skirtingai išreikštų genų (DEG) skaičių siauralapių lubinų (NLL) linijose, užkrėstose Colletotrichum lupini (Col-08 padermė, gauta iš lubinų laukų Wierzhenice, Lenkija, 1999).Išanalizuotos NLL linijos buvo: 83A:476 (atsparios, turinčios Lanr1 alelį), Boregine (atsparios, genetinis fonas nežinomas), Mandelup (vidutinio atsparumo, turi AnMan alelį) ir 22660 populiacija (labai jautri).Santrumpa hpi reiškia valandas po vakcinacijos.Nulinės reikšmės buvo pašalintos siekiant supaprastinti grafiką.
Pernelyg išreikštų genų rinkinys esant 6 hpi buvo ištirtas, ar nėra kanoninių R genų domenų (papildoma lentelė S7).Šis tyrimas atskleidė klasikinių atsparumo ligoms genų su NBS-LRR domenais transkripto indukciją tik esant 83A: 476.Šį rinkinį sudarė vienas TIR-NBS-LRR genas (tanjilg_05042), penki CC-NBS-LRR genai (tanjilg_06165, tanjilg_06162, tanjilg_22773, tanjilg_22640 ir tanjilg_16162) ir keturi NBS_LR-1, Tanilgjilg6 ir NBS_LR (Tanjilgjilg6,1). 162), taip pat keturi NBS-Lrr (tanjilg_16162) ir keturi NBS-LRR (TANJILG_16162).Visi šie genai turi kanoninius domenus, išdėstytus konservuotomis sekomis.
Genams, kurių ekspresija reikšmingai pakitusi, reaguojant į inokuliaciją su C. lupini (Col-08 padermė), buvo atlikta genų ontologijos (GO) praturtinimo analizė (papildoma S8 lentelė). Dažniausiai per daug reprezentuojamas biologinio proceso terminas buvo „GO:0006952 gynybos atsakas“, kuris pasirodė 6 iš 16 (laikas × linija) derinių, turinčių didelę reikšmę (P reikšmė < 0,001) (2 pav.). Dažniausiai per daug reprezentuojamas biologinio proceso terminas buvo „GO:0006952 gynybos atsakas“, kuris pasirodė 6 iš 16 (laikas × linija) derinių, turinčių didelę reikšmę (P reikšmė < 0,001) (2 pav.). Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 защитятный», потвсятый» 6 из 16 (время × линия) комбинаций с высокой значимостью (значение P <0,001) (рис. 2). Dažniausiai per daug atstovaujamas biologinio proceso terminas buvo „GO:0006952 gynybos atsakas“, kuris pasirodė 6 iš 16 (laikas × linija) derinių, turinčių didelę reikšmę (P reikšmė < 0,001) (2 pav.).最常被过度代表的生物过程术语是“GO:0006952 防御反应”，它出现在16 丶（的生物过程术语是个中，具有高显着性（P 值< 0,001）（图2）. Reprezentatyviausias biologinio proceso terminas yra „GO:0006952 gynybos atsakas“, kuris yra 6 iš 16 (时间×线) derinių, turintis didelę reikšmę (P vertė < 0,001) (图2). Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 gynybos atsakas», копяр1 инаций (время × линия) с высокой значимостью (значение P <0,001) (рис. 2). Dažniausiai per daug atstovaujamas biologinio proceso terminas buvo „GO:0006952 Defense Response“, kuris pasirodė 6 iš 16 derinių (laikas × linija), turintis didelę reikšmę (P reikšmė < 0,001) (2 pav.).Šis terminas buvo per daug vaizduojamas dviem laiko momentais 83A: 476 ir Boregine (6 ir 24 AG), o vienu metu Mandelup ir 22660 populiacija (atitinkamai 12 ir 6 AG).Tai laukiamas rezultatas, pabrėžiantis atsparių linijų priešgrybelinį atsaką.Be to, 83A:476 reagavo į C. lupini, greitai sukeldamas genus, susijusius su oksidaciniu pliūpsniu, pažymėtu terminu „GO:0055114 redokso procesas“, nurodant specifinį gynybos atsaką, o Boregine atskleidė specifinius gynybos atsakus, susijusius su terminu „GO“.:0006950 Reagavimas į stresą“.22660 populiacija suaktyvino horizontalų atsparumo atsaką, apimantį antrinius metabolitus, išryškindama per didelį terminų skaičių „GO:0016104 Triterpeno biosintezės procesas“ ir „GO:0006722 Triterpeno metabolizmo procesas“ (abu terminai priklauso tam pačiam genų rinkiniui), atsižvelgiant į Boregeno sodrinimo reakcijos2 stabilumo analizės rezultatus. 60. Be to, ankstyvoji reakcija 83A:476 (6 hpi) ir uždelsta reakcija Mandelup ir Population 22660 apima terminą GO:0015979 „fotosintezė“ ir kitus susijusius biologinius procesus.
Bioproceso genų ontologijos terminai, parinkti anotuojant skirtingai išreikštus genus siauralapių lubinų (NLL), užkrėstų juodligės lubinais (Col-08 padermė, gauta iš lubinų laukų Wierzhenice, Lenkijoje, 1999 m.), transkripto atsakai, yra labai perdėti.Išanalizuotos NLL linijos buvo: 83A:476 (atsparios, turinčios homozigotinį Lanr1 alelį), Boregine (atsparus, nežinomas genetinis fonas), Mandelup (vidutinio atsparumo, turintis homozigotinį AnMan alelį) ir 22660 populiacija (jautri).
Kadangi šiuo tyrimu buvo siekiama nustatyti genus, kurie prisideda prie atsparumo antraknozei, genai, priskirti terminams GO „GO: 0006952 Defensive responses“ ir „GO: 0055114 Redox process“ buvo analizuojami su ribiniais dydžiais, nes pradinė vertė yra ≥ 30 su bent viena linija.× laiko taškas, derinant statistiškai reikšmingas log2 reikšmes (kartų pokytis).Šiuos kriterijus atitinkančių genų skaičius buvo 65 GO:0006952 ir 524 GO:0055114.
83A:476 atskleidė dvi DEG smailes, pažymėtas terminu GO:0006952, pirmoji - 6 genai colyje (64 genai, reguliavimas aukštyn ir žemyn), o antrasis - 24 genus colyje (15 genų, tik aukštesnis reguliavimas).Boregine taip pat parodė, kad GO:0006952 pasiekė aukščiausią tašką tuo pačiu metu, bet su mažesniu DEG (11 ir 8) ir lengvatiniu aktyvavimu.Mandeloop parodė dvi GO smailes: 0006952 ties 12 ir 48 HPI, abu turi 12 genų (pirmasis su aktyvuojančiais genais, o antrasis su tik slopinančiais genais), o 22660 populiacija esant 6 HPI (13 genų) turėjo didesnę padidėjimo smailę.Reglamentas.Reikėtų pažymėti, kad 96, 4% GO: 0006952 DEG šiose smailėse turėjo tokio paties tipo atsaką (aukštyn arba žemyn), o tai rodo reikšmingą gynybos atsakų sutapimą, nepaisant dalyvaujančių genų skaičiaus skirtumų.Didžiausia sekų grupė, susijusi su terminu GO:0006952, koduoja su bado stresu susijusį pranešimo baltymą 22 (panašų į SAM22), kuris priklauso 10 klasės patogeneze susijusio baltymo (PR-10) baltymų kladui ir pagrindiniam baltymo lateksui.panašus (į MLP panašus) baltymas) baltymas (3 pav.).Abi grupės skyrėsi išraiškos pobūdžiu ir atsako kryptimi.Genai, koduojantys į SAM22 panašius baltymus, parodė nuoseklią ir reikšmingą indukciją ankstyvaisiais laiko momentais (6 arba 12 hpi) ir paprastai nereagavo eksperimento pabaigoje (48 hpi), o į MLP panašūs baltymai koordinavo esant 6 hpi.HPI.83A:476 ir Mandelup esant 48 AG/in, beveik visi kiti duomenų taškai nereagavo.Be to, SAM22 tipo baltymų genų ekspresijos profilių skirtumai sekė pastebėtą atsparumo antracnozei kintamumą, nes atsparesnės linijos turėjo daugiau laiko taškų, reikšmingai indukuojančių šiuos genus nei jautresni genai.Kitas į LlR18A/B panašus PR-10 genas parodė labai panašų ekspresijos modelį į SAM22 panašaus baltymo geną.
Buvo nustatyti pagrindiniai biologinio proceso termino „GO:0006952 Defense Response“ komponentai ir Lanr1 bei AnMan alelių kandidatų genų ekspresijos modeliai.Log2 skalė rodo log2 vertes (kartų pokytis) tarp inokuliuotų (Colletotrichum lupini, padermė Col-08, gauta iš lubinų laukų, Wizhenica, Lenkija, 1999 m.) ir kontrolinių (fiktyviai inokuliuotų) augalų tuo pačiu metu.Buvo analizuojamos šios siauralapių lubinų linijos: 83A:476 (atsparus, turintis homozigotinį Lanr1 alelį), Boregine (atsparus, genetinis fonas nežinomas), Mandelup (vidutinio atsparumo, turintis homozigotinį AnMan alelį) ir populiacija 22660 (jautri).
Be to, buvo įvertinti RNA-seq kandidatų genų Lanr1 (TanjilG_05042) ir AnMan (TanjilG_12861) ekspresijos profiliai (3 pav.).TanjilG_05042 genas parodė reikšmingą atsaką (aktyvavimą) esant 83A:476 tik pirmą kartą (6 hpi), o TanjilG_12861 Mandeloop buvo reikšmingas tik dviem laiko taškais: 6 hpi (žemyninis reguliavimas) ir 24 hpi (6 hpi).Su.).reguliuojamas)).
Labiausiai per daug išreikšti genai termine GO:0055114 „redokso procesas“ buvo genai, koduojantys citochromo P450 baltymus ir peroksidazę (4 pav.).Mėginiuose, išskirtuose iš 83A:476, esant 6 HPI, didžiausios arba minimalios log2 (kartų pokytis) vertės (86,6 % genų) paprastai buvo stebimos tarp inokuliuotų ir kontrolinių augalų, o tai pabrėžia didelį šio genotipo atsaką į inokuliuojamą lytį.83A:476 parodė reikšmingiausią GO: 0055114 DEG esant 6 hpi (503 genai), o likusios linijos - 48 hpi (Boregine, 31 genas; Mandelup, 85 genai; ir populiacija 22660, 78 genai)).Daugumoje GO:0055114 šeimos genų buvo pastebėti dviejų tipų atsakai į vakcinaciją (aktyvacija ir slopinimas).Įdomu tai, kad iki 97,6 % DEG, nustatytų terminui GO: 0055114 Mandelupėje esant 48 AG. Šie stebėjimai rodo, kad, nepaisant žymiai mažesnio masto (ty mutavusių redokso genų skaičiaus, 85, palyginti su 503), uždelsto transkripto atsako į skruzdėlyną 6:4 ankstyvą mandelozę modelis yra panašus.Boregine ir 22660 populiacijoje ši konvergencija yra mažesnė – atitinkamai 51,6 % ir 75,6 %.
Buvo atskleisti biologinio proceso termino „GO:0055114 Redokso procesas“ pagrindinių komponentų raiškos dėsniai.Log2 skalė rodo log2 vertes (kartų pokytis) tarp inokuliuotų (Colletotrichum lupini, padermė Col-08, gauta iš lubinų laukų, Wizhenica, Lenkija, 1999 m.) ir kontrolinių (fiktyviai inokuliuotų) augalų tuo pačiu metu.Buvo analizuojamos šios siauralapių lubinų linijos: 83A:476 (atsparus, turintis homozigotinį Lanr1 alelį), Boregine (atsparus, genetinis fonas nežinomas), Mandelup (vidutinio atsparumo, turintis homozigotinį AnMan alelį) ir populiacija 22660 (jautri).
83A:476 Transkriptominiai atsakai į inokuliaciją C. lupini (padermė Col-08) taip pat apėmė koordinuotą genų, priskiriamų terminui GO:0015979 „fotosintezė“ ir kitus susijusius biologinius procesus, nutildymą (5 pav.).Šiame GO:0015979 DEG rinkinyje buvo 105 genai, kurie buvo žymiai slopinami esant 6 hpi, esant 83A:476.Šiame pogrupyje 37 genai taip pat buvo sumažinti Mandelup 48 HPI ir 35 tuo pačiu metu 22660 populiacijoje, įskaitant 19 DEG, būdingų abiem genotipams.Jokie DEG, susiję su terminu GO: 0015979, nebuvo reikšmingai suaktyvinti jokiu deriniu (eilutė x laikas).
Buvo atskleisti biologinio proceso „GO:0015979 Fotosintezė“ termino pagrindinių komponentų raiškos dėsniai.Log2 skalė rodo log2 vertes (kartų pokytis) tarp inokuliuotų (Colletotrichum lupini, padermė Col-08, gauta iš lubinų laukų, Wizhenica, Lenkija, 1999 m.) ir kontrolinių (fiktyviai inokuliuotų) augalų tuo pačiu metu.Buvo analizuojamos šios siauralapių lubinų linijos: 83A:476 (atsparus, turintis homozigotinį Lanr1 alelį), Boregine (atsparus, genetinis fonas nežinomas), Mandelup (vidutinio atsparumo, turintis homozigotinį AnMan alelį) ir populiacija 22660 (jautri).
Remiantis diferencinės ekspresijos analizės rezultatais ir, tikėtina, dalyvaujant gynybos atsakuose nuo patogeninių grybų, šis septynių genų rinkinys buvo pasirinktas ekspresijos profilių kiekybiniam įvertinimui realiuoju laiku PGR (papildoma S9 lentelė).
Tariamas baltymo genas TanjilG_10657 buvo reikšmingai indukuotas visose tirtose linijose ir laiko taškuose, palyginti su kontroliniais (mimikos) augalais (papildomos lentelės S10, S11).Be to, TanjilG_10657 išraiškos profilis parodė didėjančią tendenciją eksperimento metu visoms linijoms.22660 populiacija parodė didžiausią TanjilG_10657 jautrumą inokuliacijai su 114 kartų aktyvinimu ir aukščiausiu santykiniu ekspresijos lygiu (4,4 ± 0,4) esant 24 HPI (6a pav.).PR10 LlR18A baltymo genas TanjilG_27015 taip pat aktyvavosi visose linijose ir laiko taškuose, o daugelyje duomenų taškų jis buvo statistiškai reikšmingas (6b pav.).Panašiai kaip ir TanjilG_10657, didžiausias santykinis TanjilG_27015 ekspresijos lygis buvo pastebėtas 22660 inokuliuotų populiacijų esant 24 HPI (19,5 ± 2,4).Rūgšties endochitinazės genas TanjilG_04706 buvo žymiai padidintas visose linijose ir visais laiko momentais, išskyrus Boregine 6 hpi (6c pav.).Jis buvo stipriai sukeltas pirmuoju laiko tašku (6 HPI) esant 83A:476 (10,5 karto) ir vidutiniškai padidėjo kitose linijose (6,6–7,5 karto).Eksperimento metu TanjilG_04706 ekspresija išliko panašiame lygyje 83A:476 ir Boregine, o Mandelup ir Population 22660 ji žymiai padidėjo, pasiekdama gana aukštas reikšmes (atitinkamai 5,9 ± 1,5 ir 6,2 ± 1,5).Į endogliukaną-1,3-β-gliukozidazę panašus genas TanjilG_23384 parodė didelį aktyvumą pirmaisiais dviem laiko taškais (6 ir 12 hpi) visose linijose, išskyrus 22660 populiaciją (6d pav.).Didžiausi santykiniai TanjilG_23384 ekspresijos lygiai buvo pastebėti antrame laiko taške (12 hpi) Mandelup (2,7 ± 0,3) ir 83A:476 (1,5 ± 0,1).Esant 24 HPI, TanjilG_23384 ekspresija buvo palyginti žema visose tirtose linijose (nuo 0,04 ± 0,009 iki 0,44 ± 0,12).
Pasirinktų genų (ag) ekspresijos profiliai, atskleisti kiekybine PGR.Skaičiai 6, 12 ir 24 reiškia valandas po vakcinacijos.LanDExH7 ir LanTUB6 genai buvo naudojami normalizavimui, o LanTUB6 buvo naudojamas kalibravimui tarp serijų.Klaidų juostos rodo standartinį nuokrypį, pagrįstą trimis biologiniais pakartojimais, kurių kiekvienas yra trijų techninių pakartojimų vidurkis. Ekspresijos lygių skirtumų tarp inokuliuotų (Colletotrichum lupini, padermė Col-08, gauta 1999 m. iš lubinų lauko Wierzenicoje, Lenkijoje) ir kontrolinių (apgalvotų) augalų statistinis reikšmingumas pažymėtas virš duomenų taškų (*P reikšmė < 0,05, **P reikšmė ≤ 01,0.0.0.0). Ekspresijos lygių skirtumų tarp inokuliuotų (Colletotrichum lupini, padermė Col-08, gauta 1999 m. iš lubinų lauko Wierzenicoje, Lenkijoje) ir kontrolinių (apgalvotų) augalų statistinis reikšmingumas pažymėtas virš duomenų taškų (*P reikšmė < 0,05, **P reikšmė ≤ 01,0.0.0.0). Статистическая значимость различий в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, штаменпо лу.199 Col-08, штаменпо Col-0. я люпина в Верженице, Польша) и контрольными (ложно инокулированными) растениями отмечена над точния (*0,5, над точниче ение P ≤ 0,01, ***значение P ≤ 0,001). Statistiškai reikšmingi ekspresijos lygių skirtumai tarp inokuliuotų (Colletotrichum lupini, padermė Col-08, gauta 1999 m. iš lubinų lauko Wierzhenice mieste, Lenkijoje) ir kontrolinių (apgalvotų) augalų yra virš duomenų taškų (*P vertė < 0,05, **P vertė ≤ 0,01 *** 0,0).接种 (Colletotrichum lupini), Col-08株，1999年从波兰Wierzenica的羽扇豆田获得）和对照（模槍）水平差异的统计学显着性标记在数据点上方（*P值< 0,05, **P 值≤ 0,01, ***P 值≤ 0,01, ***P 值0,0)接种 (colletotrichum lupini ， color-08 株 ， 1999 年 波兰 波兰 wierzenica 的 羽扇 获得） 和 对玤）平 差异 的 统计学 显着性 标记 数据点 上方*p 值 <0,05, **P ≤ 0,01, ***P ≤ 0,001) Статистически значимые различия в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, штаменныюпч-08, лич-08 на в Верженице, Польша, в 1999 г.) и контрольными (ложно инокулированными) растениями отмечены отмечены отмечены над точкам ** P-значение ≤ 0,01, ***P-значение ≤ 0,001). Statistiškai reikšmingi ekspresijos lygių skirtumai tarp inokuliuotų (Colletotrichum lupini, padermė Col-08, gauta iš lubinų laukų Verženicėje, Lenkijoje, 1999 m.) ir kontrolinių (fiktyviai inokuliuotų) augalų yra virš duomenų taškų (*P vertė < 0,05 , **P vertė ≤ 0,01, 0,0 0,0 *** P).Išanalizuotos NLL linijos buvo: 83A:476 (atsparios, turinčios homozigotinį Lanr1 alelį), Mandelup (vidutinio atsparumo, turinčios homozigotinį AnMan alelį), Boregine (atsparus, nežinomas genetinis fonas) ir 22660 populiacija (jautri).
Kandidato genas TanjilG_05042 Lanr1 lokuse parodė ryškiai skirtingą ekspresijos modelį nuo profilių, gautų iš RNR-seq tyrimų (6e pav.).Reikšmingas šio geno aktyvavimas buvo pastebėtas Mandelup ir 22660 populiacijoje (atitinkamai iki 39,7 ir 11,7 karto), todėl ekspresijos lygis buvo gana aukštas (atitinkamai iki 1,4 ± 0,14 ir 7,2 ± 1,3).83A:476 taip pat atskleidė tam tikrą TanjilG_05042 geno padidėjimą (iki 3,8 karto), tačiau pasiekti santykiniai ekspresijos lygiai (0,044 ± 0,002) buvo daugiau nei 30 kartų mažesni nei Mandelup ir 22660 populiacijos.išanalizuoti qPCR parodė reikšmingus ekspresijos lygių skirtumus tarp genotipų imitaciniuose vakcinuotuose (kontroliniuose) variantuose, pasiekę 58 kartų skirtumą tarp 22660 ir 83A:476 populiacijų, taip pat tarp 22660 ir 22660 populiacijų. Tarp Boregine ir Mandalup buvo pasiektas dvigubas skirtumas.
Kandidato genas AnMan lokuse TanjilG_12861 buvo aktyvuotas reaguojant į vakcinaciją 83A:476 ir Mandelup, buvo neutralus 22660 populiacijoje ir buvo sumažintas Boregine (6f pav.).Santykinė TanjilG_12861 geno ekspresija buvo didžiausia pasėtuose 83A: 476 (0,14±0,01).17,4 kDa I klasės šilumos šoko baltymo genas TanjilG_05080 HSP17.4 parodė žemesnius santykinius ekspresijos lygius visose tirtose padermėse ir laiko taškuose (6g pav.).Didžiausia vertė buvo nustatyta esant 24 HPI 22660 populiacijai (0,14 ± 0,02, atsakas į vakcinaciją padidėjo aštuonis kartus).
Palyginus genų ekspresijos profilius (7 pav.), nustatyta didelė koreliacija tarp TanjilG_10657 ir keturių kitų genų: TanjilG_27015 (r = 0,89), TanjilG_05080 (r = 0,85), TanjilG_05042 (r = 0,80_.9) ir 4 TanjilG_10657 (r = 0,80_.9).Tokie rezultatai gali rodyti šių genų bendrą reguliavimą gynybos reakcijos metu.TanjilG_12861 ir TanjilG_23384 genai parodė skirtingus ekspresijos profilius su mažesnėmis Pearsono koreliacijos koeficiento reikšmėmis (atitinkamai nuo 0,08 iki 0,43 ir -0,19 iki 0,28), palyginti su kitais genais.
Koreliacijos tarp genų ekspresijos profilių buvo aptiktos naudojant kiekybinę PGR.Buvo analizuojamos šios siauralapių lubinų linijos: 83A:476 (atsparus, turi homozigotinį Lanr1 alelį), Mandelup (vidutiniškai atsparus, turi homozigotinį AnMan alelį), Boregine (atsparus, genetinis fonas nežinomas) ir 22660 populiacija (jautri).Buvo apskaičiuoti trys laiko momentai (6, 12 ir 24 valandos po inokuliacijos), įskaitant inokuliuotus (Colletotrichum lupini, padermė Col-08, gauta iš lubinų laukų Wierzhenice, Lenkijoje, 1999 m.) ir kontrolinius (fiktyviai užkrėstus) augalus.Skalė rodo Pirsono koreliacijos koeficiento reikšmę.
Remiantis duomenimis, gautais esant 6 arklio galioms colyje, WGCNA buvo atlikta 9981 DEG, nustatyta lyginant inokuliuotus ir kontrolinius augalus, siekiant sutelkti dėmesį į ankstyvą gynybos atsaką (papildoma lentelė S12).Buvo rasti 22 genų moduliai (klasteriai) su koreliuojančiais (teigiamais arba neigiamais) ekspresijos profiliais tarp genotipų ir eksperimentinių variantų. Vidutiniškai genų ekspresijos lygiai mažėjo 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 (tačiau abiejuose variantuose ši tendencija buvo stipresnė kontroliniuose augaluose). Vidutiniškai genų ekspresijos lygiai mažėjo 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 (tačiau abiejuose variantuose ši tendencija buvo stipresnė kontroliniuose augaluose). В среднем уровни экспрессии генов снижались в порядке 83A:476 > Mandelup > Boregine > Gyventojų skaičius 22660 (в обоих вариантац, елэаца, нотац, сильнее у контрольных растений). Vidutiniškai genų ekspresijos lygiai sumažėjo tvarka 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 (tačiau abiejuose variantuose ši tendencija buvo stipresnė kontroliniuose augaluose).平均而言，基因表达水平按83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 的顺序下降（然而，作两势在对照植物中更强）.平均 而 言 ， 基因 水平 按 按 83a: 476> mandelup> boregine> Gyventojų skaičius 22660 的 顺序 下降 （Ｇ 下降 （Ｇ 在在 植物 中 更）。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。. В среднем уровни экспрессии генов снижались в ряду 83A:476 > Mandelup > Boregine > Gyventojų skaičius 22660 е у контрольных растений). Vidutiniškai genų ekspresijos lygis sumažėjo serijoje 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 (tačiau abiejuose variantuose ši tendencija buvo stipresnė kontroliniuose augaluose).Vakcinacija padidino genų ekspresijos reguliavimą, ypač 18, 19, 14, 6 ir 1 moduliuose (poveikio mažėjimo tvarka), neigiamą reguliavimą (pvz., 9 ir 20 moduliai) arba neutralų poveikį (pvz., 11, 22, 8 ir 13 moduliai).GO termino sodrinimo analizė (papildoma lentelė S13) atskleidė „GO: 0006952 Apsauginiai atsakai“ pasėtam moduliui (18) su maksimaliu aktyvavimu, įskaitant genus, analizuotus naudojant qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_0106G), TanjilG_016p57 as many7 as many7. presuoti fotosintezės moduliai (9).18 modulio koncentratorius (8 pav.) buvo identifikuotas kaip TanjilG_26536 genas, koduojantis PR-10 panašų LlR18B baltymą, o 9 modulio koncentratorius buvo identifikuotas kaip TanjilG_28955 genas, koduojantis fotosistemos II PsbQ baltymą.Atsparumo antracnozei genas Lanr1, TanjilG_05042, buvo rastas 22 modulyje (9 pav.) ir yra susijęs su terminais „GO:0044260 ląstelių makromolekuliniai metaboliniai procesai“ ir „GO:0006355 Transkripcijos reguliavimas, DNR šablonas“, turintis TanjilG hub_012112.genas koduoja šilumos streso transkripcijos faktorių A-4a (HSFA4a).
Modulių genų koekspresijos svertinė tinklo analizė su pernelyg išreikštais biologinio proceso terminais „GO: 0006952 Gynybos atsakai“.Ligavimas buvo supaprastintas, siekiant pabrėžti keturis qPCR analizuotus genus (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 ir TanjilG_27015).
Modulio su per daug atstovaujamu biologinio proceso terminu „GO: 0006355: Transkripcijos reguliavimas, DNR šablonas“ ir turinčio kandidato antracnozei atsparumo geną Lanr1 TanjilG_05042, svertinė tinklo analizė.Ligavimas buvo supaprastintas, norint išskirti TanjilG_05042 geną ir centrinį TanjilG_01212 geną.
Atsparumo antracnozei atranka, surinkta Australijoje, parodė, kad dauguma anksčiau išleistų veislių buvo jautrios;Kalya, Coromup ir Mandelup buvo aprašyti kaip vidutiniškai atsparūs, o Wonga, Tanjil ir 83A:476 buvo apibūdinti kaip labai atsparūs26,27,31.turėjo tą patį atsparumo alelį, pavadintą Lanr1, o Coromup ir Mandelup turėjo skirtingą alelį, pavadintą AnMan10, 26, 39, o Kalya perdavė skirtingą alelį., Lanr2.Atliekant atsparumo antracnozei patikrą Vokietijoje, buvo nustatyta atspari linija Bo7212 su kandidatu, kitu nei Lanr1 aleliu, pažymėtu LanrBo36.
Mūsų tyrimas atskleidė labai žemą Lanr1 alelio dažnį (apie 6%) tirtoje gemalo plazmoje.Šis stebėjimas atitinka Rytų Europos germplazmos atrankos rezultatus naudojant Anseq3 ir Anseq4 žymenis, kurie parodė, kad Lanr1 alelis yra tik dviejose Baltarusijos linijose.Tai rodo, kad Lanr1 alelis dar nėra plačiai naudojamas vietinėse veisimo programose, skirtingai nei Australijoje, kur jis yra vienas iš pagrindinių alelių veisimui naudojant žymenį.Tai gali būti dėl mažesnio Lanr1 alelio atsparumo lygio Europos lauko sąlygomis, palyginti su Australijos ataskaita.Be to, antracnozės tyrimai Australijos vietose, kuriose gausu kritulių, parodė, kad Lanr1 alelio sukeliami atsparumo atsakai gali būti neveiksmingi oro sąlygomis, kurios skatina augimą ir greitą patogeno vystymąsi19, 42.Tiesą sakant, šiame tyrime kai kurie antracnozės simptomai taip pat buvo pastebėti genotipams, turintiems Lanr1 alelį, o tai rodo, kad atsparumas gali išnykti esant optimalioms C. lupini vystymosi sąlygoms.Be to, galimi klaidingai teigiami Anseq3 ir Anseq4 žymenų, kurie yra maždaug 1 cM atstumu nuo Lanr1 lokuso, buvimo interpretacijos 28, 30, 43 .
Mūsų tyrimas parodė, kad 83A:476, turintis Lanr1 alelį, reagavo į C. lupini inokuliaciją didelio masto transkripto perprogramavimu pirmuoju analizuojamu laiko momentu (6 hpi), o Mandelupe, turinčiame AnMan alelį, transkriptominiai atsakai buvo pastebėti daug vėliau.(nuo 24 iki 48 AG).Šie laikini gynybos atsakų skirtumai yra susiję su ligos simptomų skirtumais, pabrėžiant ankstyvo patogeno atpažinimo svarbą sėkmingam atsakui į atsparumą.Norėdami užkrėsti augalų audinius, juodligės sporos turi pereiti keletą vystymosi stadijų šeimininko paviršiuje, įskaitant daigumą, ląstelių dalijimąsi ir appresoriumo susidarymą.Priedas yra infekcinė struktūra, kuri prisitvirtina prie šeimininko paviršiaus ir palengvina prasiskverbimą į šeimininko audinius.Taigi, C. gloeosporioides sporos žirnių ekstrakte parodė pirmąjį branduolio dalijimąsi po 75-90 minučių inkubacijos, gemalo vamzdelio susidarymą po 90-120 minučių ir slopinimą po 4 valandų 45 .Mango C. gloeosporioides parodė daugiau nei 40% konidijų daigumą po 3 valandų inkubacijos ir apie 20% appresorių susidarymą po 4 valandų.Su virulentiškumu susijęs C. gloeosporioides CAP20 genas parodė transkripcijos aktyvumą epifitus formuojančiose konidijose po 3,5 val. inkubacijos avokado paviršiaus vaške su didelėmis CAP20 baltymo koncentracijomis po 4 val. 46 min.Panašiai melanino biosintezės genų aktyvumas C. trifolii buvo sukeltas 2 valandų inkubacijos metu, o po 1 valandos susiformavo appresoriumas.Lapų audinių tyrimai parodė, kad braškės, užkrėstos C. acutatum, pirmą kartą slopina 8 hpi, o pomidorai, užkrėsti C. coccodes, pirmą kartą slopina 4 hpi48,49.iš esmės atitinka Colletotrichum spp.infekcinis procesas.Greitas gynybos atsakas į 83A:476 rodo, kad šioje linijoje yra augalų atsparumo ir efektoriaus sukelto imuniteto (ETI) genų, o Mandelup uždelstas atsakas patvirtina mikro-susijusio molekulinio modelio sukelto imuniteto (MTI) hipotezę 50. Ankstyvieji atsakai į 83A: 476 ir Mandelup.Dalinis aukštyn arba žemyn reguliuojamų genų sutapimas vėluojant atsaką taip pat patvirtina šią koncepciją, nes ETI dažnai laikomas pagreitėjusiu ir sustiprintu MTI atsaku, kuris baigiasi užprogramuota ląstelių mirtimi infekcijos vietoje, žinomu kaip anafilaksinis šokas51,52.
Dauguma genų, priskiriamų per daug atstovaujamam terminui Gene Ontology GO:0006952 „Gynybos atsakas“, yra 11 streso sukelto badavimo pranešimo 22 baltymo (panašaus į SAM22) ir septynių pagrindinių latekso baltymo tipo (MLP) homologų.- panašūs baltymai 31, 34, 43 ir 423 parodė sekos panašumą.Į SAM22 panašūs genai parodė reikšmingą aktyvavimą, kuris truko ilgiau, parodydamas padidėjusį atsparumą antracnozei (83A: 476 ir Boregine).Tačiau į MLP panašūs genai buvo sumažinti tik linijose, turinčiose kandidato atsparumo alelį (83A: 476 / Lanr1 esant 6 hpi ir Mandelup / AnMan 24 hpi).Reikėtų pažymėti, kad visi nustatyti į SAM22 panašūs homologai kilę iš maždaug 105 kb apimančio genų klasterio, o į MLP panašūs genai kilę iš atskirų genomo regionų.Koordinuotas tokių SAM22 tipo genų aktyvavimas taip pat buvo nustatytas mūsų ankstesniame tyrime dėl NLL atsparumo Diaporthetoxica inokuliacijai, o tai rodo, kad jie yra susiję su horizontaliaisiais gynybos atsako komponentais.Šią išvadą taip pat patvirtina pranešimai apie teigiamą SAM22 tipo genų atsaką į sužalojimą ar gydymą salicilo rūgštimi, grybelių induktoriais ar vandenilio peroksidu.
Įrodyta, kad į MLP panašūs genai reaguoja į įvairius abiotinius ir biotinius stresus, įskaitant daugelio augalų rūšių bakterines, virusines ir patogenines grybelines infekcijas55.Reagavimo į tam tikras augalų ir patogenų sąveikas kryptys svyravo nuo stipriai didėjančios (ty medvilnės užkrėtimo Verticillium dahliae metu) iki reikšmingai mažėjančios (ty po obels užkrėtimo Alternaria spp.)56,57.Buvo pastebėtas reikšmingas į MLP panašaus 423 geno reguliavimas, kai avokadas buvo apsaugotas nuo F. niger infekcijos ir užsikrėtus obelis Botryosphaeria berengeriana f.CN.piricola ir Alternaria alternata yra obuolių patotipai58,59.Be to, į MLP panašų 423 geną per daug ekspresuojantys obuolių kaliai turėjo mažesnę su atsparumu susijusių genų ekspresiją ir buvo jautresni grybelinei infekcijai59.Po Fusarium oxysporum f į MLP panašus 423 genas taip pat buvo slopinamas atsparioje paprastųjų pupelių gemalo plazmoje.cn.Pupelių infekcija 60.
Kiti PR-10 šeimos nariai, nustatyti mūsų RNR-seq tyrime, buvo LlR18A ir LlR18B genai, reaguojantys į padidintą reguliavimą, taip pat padidintas (1 genas) arba sumažintas (3 genai) lipidų pernešimo baltymo DIR1 genas..Be to, WGCNA pabrėžia LlR18B geną kaip šio modulio centrą, kuris yra labai jautrus vakcinacijai ir turi keletą apsauginio atsako genų.LlR18A ir LlR18B genai buvo indukuoti geltonuosiuose lubinų lapuose, reaguojant į patogenines bakterijas, taip pat NLL stiebuose po D. toxica inokuliacijos, o šių genų ryžių homologas RSOsPR10 buvo greitai sukeltas grybelinės infekcijos, kuri, kaip manoma, buvo susijusi su D6ensonic genu, signalizuojančiu 1IR.563 geną. specifiniai lipidų transportavimo baltymai, reikalingi sisteminiam įgytam atsparumui (SAR) atsirasti.Vystantis apsauginėms reakcijoms, DIR1 baltymas yra pernešamas iš infekcijos židinio per floemą, kad sukeltų SAR tolimuose organuose.Įdomu tai, kad TanjilG_02313 DIR1 genas buvo reikšmingai indukuotas pirmuoju laiko tašku 84A:476 ir 22660 populiacijose, tačiau atsparumas antracnozei sėkmingai išsivystė tik 84A:476 eilutėje.Tai gali reikšti tam tikrą DIR1 geno subfunkcionalizaciją NLL, nes likę trys homologai reagavo į inokuliaciją tik 83A:476 linijoje esant 6 hpi, ir šis atsakas buvo nukreiptas žemyn.
Mūsų tyrime dažniausiai pasitaikantys komponentai, atitinkantys biologinį procesą, vadinamą „GO:0055114 redokso procesu“, buvo citochromo P450 baltymas, peroksidazė, linolo rūgšties 9S-/13S-lipoksigenazė ir 1-aminociklopropan-1-karboksirūgšties oksidazė.Be to, mūsų WGCNA apibrėžia HSFA4a homologą kaip mazgą, turintį modulius, tokius kaip Lanr1 atsparumo geno kandidatas TanjilG_05042.HSFA4a yra nuo redokso priklausomo augalų branduolinės transkripcijos reguliavimo komponentas.
Citochromo P450 baltymai yra oksidoreduktazės, katalizuojančios nuo NADPH ir (arba) nuo O2 priklausomas hidroksilinimo reakcijas pirminiame ir antriniame metabolizme, įskaitant ksenobiotikų, taip pat hormonų, riebalų rūgščių, sterolių, ląstelių sienelių komponentų, biopolimerų metabolizmą ir apsauginių junginių biosintezę. 0,6 log2 (karto pokytis) iki 5,7 dėl daugybės pakitusių homologų (37) ir konkrečių genų atsako modelių skirtumų, atspindinčių peržiūrą aukštyn..Naudojant tik RNR-seq duomenis, siekiant išsiaiškinti numanomą NLL genų biologinę funkciją tokioje didelėje baltymų superšeimoje, būtų labai spekuliatyvu.Tačiau verta paminėti, kad kai kurie citochromo P450 genai yra susiję su padidėjusiu atsparumu patogeniniams grybams ar bakterijoms, įskaitant indėlį į alergines reakcijas69, 70, 71.
III klasės peroksidazės yra daugiafunkciniai augalų fermentai, dalyvaujantys įvairiuose medžiagų apykaitos procesuose augalų augimo ir vystymosi metu, taip pat reaguojant į aplinkos įtempius, tokius kaip druskingumas, sausra, didelis šviesos intensyvumas ir patogenų ataka72.Peroksidazės dalyvauja kelių augalų rūšių sąveikoje su Anthracis, įskaitant Stylosanthes humilis ir C. gloeosporioides, Lens culinaris ir C. truncatum, Phaseolus vulgaris ir C. lindemuthianum, Cucumis sativus ir C. lagenarium73, 74, 75, 76.Atsakas yra labai greitas, kartais net 4 HPI, kol grybelis neprasiskverbia į augalo audinį73.Peroksidazės genas taip pat reagavo į D. toxica NLL inokuliaciją.Be savo tipiškų funkcijų, reguliuojančių oksidacinį sprogimą arba pašalinant oksidacinį stresą, peroksidazės gali trukdyti patogenų augimui, sukurdamos fizines kliūtis, pagrįstas ląstelės sienelės sutvirtėjimu lignifikacijos, subvieneto arba konkrečių junginių kryžminio susiejimo metu.Šią funkciją in silico galima priskirti TanjilG_03329 genui, koduojančiam spėjamą ligniną formuojančią anijonų peroksidazę, kuri mūsų tyrime buvo žymiai padidinta 83A:476 atsparioje linijoje esant 6 HPI, bet ne kitose padermėse ir laiko taškais, kurie nereagavo.
Linolo rūgšties 9S-/13S-lipoksigenazė yra pirmasis lipidų biosintezės oksidacinio kelio žingsnis78.Šio kelio produktai atlieka daugybę augalų apsaugos funkcijų, įskaitant ląstelių sienelių stiprinimą formuojant kaliozės ir pektino nuosėdas ir oksidacinio streso reguliavimą gaminant reaktyviąsias deguonies rūšis79, 80, 81, 82, 83.Šiame tyrime linolo rūgšties 9S-/13S-lipoksigenazės ekspresija buvo pakeista visose padermėse, tačiau jautrioje populiacijoje 22660 skirtingais laiko momentais vyravo padidėjęs reguliavimas, o padermėse, turinčiose atsparų Lanr1 ir AnMan alelį, tai pabrėžia oksilipino sluoksnio, esančio apsauginiuose anthrax sluoksniuose, įvairinimą.
1-aminociklopropan-1-karboksilato oksidazės (ACO) homologas buvo žymiai padidintas (9 genai) arba sumažintas (2 genai), kai buvo užkrėstas lubinais.Išskyrus dvi išimtis, visi šie atsakai įvyko esant 6 AG.83A: 476.Fermentinė reakcija, kurią sukelia ACO baltymai, yra etileno gamybos greitį ribojantis žingsnis, todėl yra labai reguliuojamas84.Etilenas yra augalų hormonas, kuris atlieka įvairius vaidmenis reguliuojant augalų vystymąsi ir atsaką į abiotinio ir biotinio streso sąlygas.ACO transkripcijos indukcija ir etileno signalizacijos kelio aktyvinimas yra susiję su ryžių atsparumo hemibiotrofiniam grybui oryzae oryzae didinimui reguliuojant reaktyviųjų deguonies rūšių ir fitoaleksinų gamybą.Labai panašus lapų užkrėtimo procesas, nustatytas tarp M. oryzae ir C. lupini88,89, atsižvelgiant į reikšmingą ACO homologų reguliavimą 83A:476 linijoje, apie kurį pranešta šiame tyrime, pakeičia galimybę suteikti atsparumą NLL antracnozei Etilenui signalizacijos pagrindiniu žingsniu molekuliniuose keliuose.
Šiame tyrime buvo pastebėtas didelio masto daugelio su fotosinteze susijusių genų slopinimas esant 6 hpi 83A:476 ir 48 hpi Mandeloop ir 22660 populiacijai.Šių pokyčių mastas ir progresavimas yra proporcingas lygiui.Šiame eksperimente buvo pastebėtas atsparumas antracnozei.Pastaruoju metu buvo pranešta apie stiprią ir ankstyvą su fotosinteze susijusių transkriptų slopinimą keliuose augalų ir patogenų sąveikos modeliuose, įskaitant patogenines bakterijas ir grybus.Skubėjimas (kai kuriose sąveikose nuo 2 HPI) ir visuotinis su fotosinteze susijusių genų slopinimas reaguojant į infekciją gali sukelti augalų imunitetą, pagrįstą reaktyviųjų deguonies rūšių dislokavimu ir jų sąveika su salicilo rūgšties keliu, siekiant tarpininkauti alerginėms reakcijoms 90, 94.
Apibendrinant galima pasakyti, kad atspariausios linijos (83A: 476) siūlomi gynybos atsako mechanizmai apima greitą patogeno atpažinimą pagal R geną (greičiausiai TIR-NBS-LRR TanjilG_05042) ir alerginio atsako sukeltą salicilo rūgšties ir etileno signalizaciją, o po to sukuriamas ilgalaikis SAR.veikimą palaiko DIR-1 baltymas.Pažymėtina, kad C. lupini infekcijos biotrofinis laikotarpis yra labai trumpas (apie 2 dienas), po kurio atsiranda nekrozinis augimas95.Perėjimas tarp šių etapų gali būti susijęs su nekroze ir etileno indukuojamų baltymų ekspresija, kurie sukelia padidėjusio jautrumo reakcijas augaluose šeimininkuose.Todėl sėkmingo C. lupini sugavimo biotrofinėje stadijoje laiko langas yra labai siauras.Genų, susijusių su redoksu ir fotosinteze, perprogramavimas, pastebėtas 83A:476 esant 6 hpi, atitinka grybelinių hifų progresavimą ir skelbia sėkmingo apsauginio atsako vystymąsi biotrofinėje stadijoje.Mandelup ir 22660 populiacijos transkriptominiai atsakai gali būti per vėluoti, kad užfiksuotų grybelį prieš pereinant prie nekrozinio augimo, tačiau Mandelup gali būti veiksmingesnis nei 22660 populiacija, nes palyginti greitas PR-10 baltymo reguliavimas skatina horizontalų atsparumą.
ETI, kurią skatina kanoninis R genas, atrodo, yra įprastas pupelių atsparumo antracnozei mechanizmas.Taigi pavyzdinių ankštinių augalų Medicago truncatula atsparumą antracnozei suteikia RCT1 genas, TIR-NBS-LRR97 augalo R genų klasės narys.Šis genas taip pat suteikia liucernos plataus spektro atsparumą antracnozei, kai perkeliamas į jautrius augalus.Paprastojoje pupoje (P. vulgaris) iki šiol buvo nustatyta daugiau nei dvi dešimtys atsparumo antracnozei genų.Kai kurie iš šių genų randami regionuose, kuriuose nėra kanoninių R genų, tačiau daugelis kitų yra chromosomų, turinčių NBS-LRR genų klasterį, įskaitant TIR-NBS-LRR99, kraštuose.Viso genomo SSR tyrimas taip pat patvirtino NBS-LRR geno ryšį su paprastosios pupelės atsparumu antracnozei.Kanoninis R genas taip pat buvo rastas genominiame regione, kuriame yra pagrindinis baltojo lubino 101 atsparumo antracnozei lokusas.
Mūsų darbas rodo, kad greita atsparumo reakcija, suaktyvinta ankstyvoje augalų infekcijos stadijoje (geriausia ne vėliau kaip 12 hpi), veiksmingai apsaugo siauralapius lubinus nuo antraknozės, kurią sukelia patogeninis grybas Collelotrichum lupini.Naudodami didelio našumo sekos nustatymą, parodėme skirtingus antracnozei atsparių genų ekspresijos profilius NLL augaluose, tarpininkaujant Lanr1 ir AnMan atsparumo genams.Sėkminga gynyba apima kruopštų baltymų, dalyvaujančių redokso, fotosintezės ir patogenezėje, genų projektavimą per kelias valandas nuo augalo pirmojo kontakto su patogenu.Panašios apsauginės reakcijos, tik uždelstos, yra daug mažiau veiksmingos saugant augalus nuo ligų.Atsparumas juodligei, kurį sukelia Lanr1 genas, panašus į tipišką greitą R geno atsaką (efektoriaus sukeltas imunitetas), o AnMan genas greičiausiai suteikia horizontalų atsaką (imunitetą, kurį sukelia su mikrobais susijęs molekulinis modelis), užtikrinant vidutinį tvarumo lygį.
215 NLL linijų, naudotų antracnozės žymenims tikrinti, sudarė 74 veislės, 60 linijų, gautų kryžminant arba veisiant, 5 mutantai ir 76 laukinės arba originalios gemalozės.Linijos buvo iš 17 šalių, daugiausia iš Lenkijos (58), Ispanijos (47), Vokietijos (27), Australijos (26), Rusijos (19), Baltarusijos (7), Italijos (5) ir kitų linijų.iš 10 šalių.Rinkinyje taip pat yra atskaitai atsparios linijos: 83A:476, Tanjil, Wonga, turintis Lanr1 alelį, ir Mandelup, turintis AnMan alelį.Linijos buvo gautos iš Europos lubinų genetinių išteklių duomenų bazės, kurią tvarko Poznań Plant Breeding Ltd., Wiatrowo, Lenkija (papildoma lentelė S1).
Augalai buvo auginami kontroliuojamomis sąlygomis (fotoperiodas 16 valandų, temperatūra 25°C dieną ir 18°C ​​naktį).Buvo išanalizuoti du biologiniai pakartojimai.DNR buvo išskirta iš trijų savaičių senumo lapų, naudojant DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Vokietija) pagal protokolą.Išskirtos DNR kokybė ir koncentracija buvo įvertinti spektrofotometriniais metodais (NanoDrop 2000; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, JAV).AnManM1 žymuo, žymintis atsparumo antracnozei geną AnMan (gautas iš cv. Mandelup) ir žymekliai Anseq3 ir Anseq4, besiribojantys su genu Lanr1 (gautas iš cv. Tanjil), buvo analizuojami 11,26,28.Atsparaus alelio homozigotai buvo įvertinti kaip „1“, jautrūs – „0“, o heterozigotai – kaip 0,5.
Remiantis AnManM1, AnSeq3 ir AnSeq4 žymenų atrankos rezultatais ir sėklų prieinamumu galutiniams tolesniems eksperimentams, antracnozei atsparumo fenotipams nustatyti buvo atrinkta 50 NLL linijų.Analizė buvo atlikta dviem egzemplioriais kompiuteriu valdomame šiltnamyje su 14 valandų fotoperiodu, kai temperatūros diapazonas buvo 22 ° C dieną ir 19 ° C naktį.Sėklos prieš sėją subraižomos (su aštriu peiliuku nupjaunamos sėklos apvalkalas priešingoje embriono pusėje), kad būtų išvengta sėklų ramybės dėl per kieto sėklos lukšto ir užtikrinti vienodą daigumą.Augalai buvo auginami vazonuose (11 × 11 × 21 cm) su sterilia žeme (TS-1 REC 085 Medium Basic, Klasmann-Deilmann Polska, Varšuva, Lenkija).Inokuliacija buvo atlikta Colletotrichum lupini Col-08 štamu, išaugintu 1999 m. iš siauralapių lubinų augalų stiebų, auginamų lauke Verženicoje, Didžiojoje Lenkijoje (52° 27′ 42″ N 17° 04′ 05″ E).Gaukite plotą.Izoliatai buvo kultivuojami SNA terpėje 20 °C temperatūroje juodoje šviesoje 21 dieną, kad sukeltų sporuliaciją.Praėjus keturioms savaitėms po sėjos, augalams pasiekus 4-6 lapų tarpsnį, inokuliacija atlikta purškiant konidijų suspensija, kurios koncentracija 0,5 x 106 konidijų/ml.Po inokuliacijos augalai buvo laikomi tamsoje 24 valandas, esant maždaug 98% drėgnumui ir 25 °C temperatūrai, kad būtų palengvintas konidijų dygimas ir infekcijos procesas.Tada augalai buvo auginami 14 valandų fotoperiodu 22 °C dieną / 19 °C naktį ir 70% drėgmei.Ligos balas buvo atliktas praėjus 22 dienoms po inokuliacijos ir svyravo nuo 0 (imunine) iki 9 (labai jautrus), priklausomai nuo stiebų ir lapų nekrozinių pažeidimų ar jų nebuvimo.Be to, suskaičiavus balus, buvo išmatuotas augalų svoris.Ryšiai tarp žymenų genotipų ir ligos fenotipų buvo apskaičiuoti kaip taškinės dviejų sekų koreliacijos (atsparumo antracnozei fenotipo analizės linijų rinkinyje heterozigotinių žymenų nebuvimas).