Dėkojame, kad apsilankėte Nature.com.Naudojama naršyklės versija turi ribotą CSS palaikymą.Norėdami gauti geriausią patirtį, rekomenduojame naudoti atnaujintą naršyklę (arba išjungti suderinamumo režimą „Internet Explorer“).Tuo tarpu norėdami užtikrinti nuolatinį palaikymą, svetainę pateiksime be stilių ir „JavaScript“.
Reikia patikimos in vitro sistemos, kuri galėtų tiksliai atkurti fiziologinę širdies aplinką vaistų tyrimams.Dėl riboto žmogaus širdies audinių kultūros sistemų prieinamumo buvo netiksliai interpretuojamas vaistų poveikis širdžiai.Čia mes sukūrėme širdies audinių kultūros modelį (CTCM), kuris elektromechaniškai stimuliuoja širdies pjūvius ir patiria fiziologinį tempimą sistolinės ir diastolinės širdies ciklo fazėse.Po 12 dienų kultivavimo šis metodas iš dalies pagerino širdies skyrių gyvybingumą, tačiau nevisiškai išsaugojo jų struktūrinį vientisumą.Todėl po mažų molekulių atrankos nustatėme, kad į mūsų terpę pridėjus 100 nM trijodtironino (T3) ir 1 μM deksametazono (Dex), sekcijų mikrostruktūra išliko 12 dienų.Kartu su gydymu T3 / Dex, CTCM sistema išlaikė transkripcijos profilius, gyvybingumą, metabolinį aktyvumą ir struktūrinį vientisumą 12 dienų tokiu pačiu lygiu kaip šviežias širdies audinys.Be to, per didelis širdies audinio tempimas kultūroje sukelia hipertrofinį širdies signalą, o tai rodo, kad CTCM gali imituoti hipertrofines sąlygas, kurias sukelia širdies tempimas.Apibendrinant galima pasakyti, kad CTCM gali modeliuoti širdies fiziologiją ir patofiziologiją kultūroje ilgą laiką, todėl galima patikimai patikrinti vaistus.
Prieš atliekant klinikinius tyrimus, reikalingos patikimos in vitro sistemos, galinčios tiksliai atkurti žmogaus širdies fiziologinę aplinką.Tokios sistemos turėtų imituoti pakitusias mechanines tempimo, širdies ritmo ir elektrofiziologines savybes.Gyvūnų modeliai dažniausiai naudojami kaip širdies fiziologijos atrankos platforma, kurios patikimumas yra ribotas, atspindintis vaistų poveikį žmogaus širdžiai 1, 2.Galiausiai idealus širdies audinių kultūros eksperimentinis modelis (CTCM) yra modelis, kuris yra labai jautrus ir specifinis įvairioms terapinėms ir farmakologinėms intervencijoms, tiksliai atkuriantis žmogaus širdies fiziologiją ir patofiziologiją3.Tokios sistemos nebuvimas riboja naujų širdies nepakankamumo gydymo būdų atradimą4,5 ir lėmė vaistų kardiotoksiškumą, kuris yra pagrindinė pasitraukimo iš rinkos priežastis6.
Per pastarąjį dešimtmetį aštuoni ne širdies ir kraujagyslių vaistai buvo pašalinti iš klinikinio vartojimo, nes jie sukelia QT intervalo pailgėjimą, dėl kurio atsiranda skilvelių aritmija ir staigi mirtis7.Taigi vis labiau reikia patikimų ikiklinikinių patikros strategijų, kad būtų galima įvertinti širdies ir kraujagyslių sistemos veiksmingumą ir toksiškumą.Neseniai žmogaus sukeltų pluripotentinių kamieninių ląstelių kardiomiocitų (hiPS-CM) naudojimas atliekant vaistų patikrą ir toksiškumo tyrimus yra dalinis šios problemos sprendimas.Tačiau nesubrendęs hiPS-CM pobūdis ir širdies audinio daugialąsčio sudėtingumo trūkumas yra pagrindiniai šio metodo apribojimai.Naujausi tyrimai parodė, kad šį apribojimą galima iš dalies įveikti naudojant ankstyvą hiPS-CM, kad susidarytų širdies audinių hidrogeliai netrukus po spontaniškų susitraukimų pradžios ir laikui bėgant palaipsniui didinant elektrinę stimuliaciją.Tačiau šie hiPS-CM mikroaudiniai neturi brandžių suaugusiųjų miokardo elektrofiziologinių ir susitraukiančių savybių.Be to, žmogaus širdies audinys turi sudėtingesnę struktūrą, susidedančią iš nevienalyčio skirtingų ląstelių tipų mišinio, įskaitant endotelio ląsteles, neuronus ir stromos fibroblastus, sujungtus specifiniais ekstraląstelinės matricos baltymų rinkiniais.Šis ne kardiomiocitų populiacijų 11, 12, 13 heterogeniškumas suaugusių žinduolių širdyje yra pagrindinė kliūtis modeliuojant širdies audinį naudojant atskirus ląstelių tipus.Šie pagrindiniai apribojimai pabrėžia nepažeisto miokardo audinio auginimo fiziologinėmis ir patologinėmis sąlygomis metodų kūrimo svarbą.
Kultivuotos plonos (300 µm) žmogaus širdies dalys pasirodė esąs perspektyvus nepažeisto žmogaus miokardo modelis.Šis metodas suteikia prieigą prie visos 3D daugialąstės sistemos, panašios į žmogaus širdies audinį.Tačiau iki 2019 m. kultivuotų širdies sekcijų naudojimą ribojo trumpas (24 val.) kultūros išgyvenimas.Taip yra dėl daugelio veiksnių, įskaitant fizinio-mechaninio tempimo trūkumą, oro ir skysčio sąsają ir paprastų laikmenų, kurios nepalaiko širdies audinio poreikių, naudojimą.2019 m. kelios tyrimų grupės parodė, kad mechaninių veiksnių įtraukimas į širdies audinių kultūros sistemas gali pailginti kultūros gyvenimą, pagerinti širdies ekspresiją ir imituoti širdies patologiją.Du elegantiški tyrimai 17 ir 18 rodo, kad vienaašė mechaninė apkrova turi teigiamą poveikį širdies fenotipui kultūros metu.Tačiau šiuose tyrimuose nebuvo naudojama dinaminė trimatė fizinė-mechaninė širdies ciklo apkrova, nes širdies sekcijos buvo apkrautos arba izometrinėmis tempimo jėgomis 17, arba linijine auksotonine apkrova 18 .Šie audinių tempimo metodai lėmė daugelio širdies genų slopinimą arba pernelyg didelę genų, susijusių su nenormalia tempimo reakcija, ekspresiją.Pažymėtina, kad Pitoulis ir kt.19 sukūrė dinamišką širdies pjūvio kultūros vonią, skirtą širdies ciklo rekonstrukcijai, naudojant jėgos keitiklio grįžtamąjį ryšį ir įtempimo pavaras.Nors ši sistema leidžia tiksliau in vitro modeliuoti širdies ciklą, metodo sudėtingumas ir mažas pralaidumas riboja šios sistemos taikymą.Mūsų laboratorija neseniai sukūrė supaprastintą auginimo sistemą, kurioje naudojama elektrinė stimuliacija ir optimizuota terpė, kad kiaulių ir žmogaus širdies audinių dalys būtų gyvybingos iki 6 dienų20,21.
Dabartiniame rankraštyje aprašome širdies audinių kultūros modelį (CTCM), kuriame naudojami kiaulių širdies skyriai, kuriuose yra humoralinių ženklų, kad būtų galima apibendrinti trimatę širdies fiziologiją ir patofiziologinį išsiplėtimą širdies ciklo metu.Šis CTCM gali padidinti ikiklinikinių vaistų prognozavimo tikslumą iki tokio lygio, kokio dar niekada nebuvo pasiekta, suteikdama ekonomiškai efektyvią, vidutinio pralaidumo širdies sistemą, imituojančią žinduolių širdies fiziologiją / patofiziologiją ikiklinikiniams vaistų tyrimams.
Hemodinaminiai mechaniniai signalai atlieka svarbų vaidmenį palaikant kardiomiocitų funkciją in vitro 22, 23, 24.Dabartiniame rankraštyje sukūrėme CTCM (1a pav.), kuris gali imituoti suaugusiųjų širdies aplinką, sukeldamas elektrinę ir mechaninę stimuliaciją fiziologiniais dažniais (1, 2 Hz, 72 dūžiai per minutę).Siekiant išvengti per didelio audinių tempimo diastolės metu, buvo naudojamas 3D spausdinimo įrenginys, siekiant padidinti audinių dydį 25 % (1b pav.).C-PACE sistemos sukeltas elektrinis stimuliavimas buvo nustatytas taip, kad prasidėtų likus 100 ms iki sistolės, naudojant duomenų rinkimo sistemą, kad būtų visiškai atkurtas širdies ciklas.Audinių kultūros sistemoje naudojama programuojama pneumatinė pavara (LB Engineering, Vokietija), kad cikliškai išplėstų lanksčią silikoninę membraną, kad viršutinėje kameroje išsiplėstų širdies pjūviai.Sistema buvo prijungta prie išorinės oro linijos per slėgio keitiklį, kuris leido tiksliai reguliuoti slėgį (± 1 mmHg) ir laiką (± 1 ms) (1c pav.).
a Pritvirtinkite audinio dalį prie 7 mm atraminio žiedo, pavaizduoto mėlynai, prietaiso auginimo kameroje.Kultūros kamera nuo oro kameros atskirta plona lanksčia silikonine membrana.Tarp kiekvienos kameros įdėkite tarpiklį, kad išvengtumėte nuotėkio.Prietaiso dangtelyje yra grafito elektrodai, kurie suteikia elektrinę stimuliaciją.b Scheminis didelio audinio prietaiso, kreipiamojo žiedo ir atraminio žiedo vaizdas.Audinių sekcijos (rudos spalvos) dedamos ant negabaritinio prietaiso su kreipiamuoju žiedu į griovelį išoriniame prietaiso krašte.Naudodami kreiptuvą, atsargiai uždėkite atraminį žiedą, padengtą audinių akrilo klijais, ant širdies audinio dalies.c Grafikas, rodantis elektrinės stimuliacijos laiką kaip oro kameros slėgio, valdomo programuojamu pneumatiniu aktu, (PPD) funkciją.Elektrinei stimuliacijai sinchronizuoti naudojant slėgio jutiklius buvo naudojamas duomenų rinkimo įrenginys.Kai slėgis kultūros kameroje pasiekia nustatytą slenkstį, impulsinis signalas siunčiamas į C-PACE-EM, kad suaktyvintų elektrinę stimuliaciją.d Keturių CTCM, pastatytų ant inkubatoriaus lentynos, vaizdas.Keturi prietaisai yra prijungti prie vieno PPD per pneumatinę grandinę, o slėgio jutikliai įterpiami į hemostatinį vožtuvą, kad būtų galima stebėti slėgį pneumatinėje grandinėje.Kiekviename įrenginyje yra šešios audinių sekcijos.
Naudodami vieną pneumatinę pavarą, galėjome valdyti 4 CTCM įrenginius, kurių kiekviename tilpo 6 audinių sekcijos (1d pav.).CTCM oro slėgis oro kameroje paverčiamas sinchroniniu slėgiu skysčio kameroje ir sukelia fiziologinį širdies pjūvio išsiplėtimą (2a pav. ir 1 papildomas filmas).Audinių tempimo įvertinimas esant 80 mm Hg.Art.parodė audinių pjūvių tempimą 25 % (2b pav.).Įrodyta, kad šis procentinis ruožas atitinka 2,2–2,3 µm fiziologinį sarkomero ilgį normaliam širdies sekcijos susitraukimui17, 19, 25.Audinių judėjimas buvo įvertintas naudojant pasirinktinius fotoaparato nustatymus (papildomas 1 paveikslas).Audinių judėjimo amplitudė ir greitis (2c, d pav.) atitiko tempimą širdies ciklo metu ir laiką sistolės ir diastolės metu (2b pav.).Širdies audinio tempimas ir greitis susitraukimo ir atsipalaidavimo metu išliko pastovūs 12 dienų kultūroje (2f pav.).Norėdami įvertinti elektrinės stimuliacijos poveikį kontraktilumui kultivavimo metu, sukūrėme aktyvios deformacijos nustatymo metodą, naudojant šešėliavimo algoritmą (papildomas 2a, b pav.) ir sugebėjome atskirti deformacijas su elektrine stimuliacija ir be jos.Ta pati širdies dalis (2f pav.).Judančioje pjūvio srityje (R6-9) elektros stimuliacijos metu įtampa buvo 20% didesnė nei nesant elektrinės stimuliacijos, o tai rodo elektrinės stimuliacijos indėlį į susitraukimo funkciją.
Reprezentatyvūs oro kameros slėgio, skysčio kameros slėgio ir audinių judėjimo matavimų pėdsakai patvirtina, kad kameros slėgis keičia skysčio kameros slėgį, sukeldamas atitinkamą audinio pjūvio judėjimą.b Tipiški audinių sekcijų procentinio tempimo pėdsakai (mėlyni), atitinkantys procentinį tempimą (oranžinė).c Išmatuotas širdies pjūvio judesys atitinka išmatuotą judėjimo greitį.d) reprezentatyvios ciklinio judėjimo (mėlyna linija) ir greičio (oranžinė punktyrinė linija) trajektorijos širdies pjūvyje.e Ciklo trukmės (n = 19 skiltelių grupėje, iš skirtingų kiaulių), susitraukimo laiko (n = 19 griežinėlių grupėje), atsipalaidavimo laiko (n = 19 griežinėlių grupėje, iš skirtingų kiaulių), audinių judėjimo (n = 25) kiekybinis įvertinimas.griežinėliai) / grupė iš skirtingų kiaulių), didžiausias sistolinis greitis (n = 24 (D0), 25 (D12) pjūviai / grupė iš skirtingų kiaulių) ir didžiausias atsipalaidavimo greitis (n = 24 (D0), 25 (D12) griežinėliai / grupė iš skirtingų kiaulių).Dviejų uodegų Stjudento t testas neparodė jokio reikšmingo skirtumo jokiame parametre.f Reprezentatyvūs audinių pjūvių su (raudona) ir be (mėlyna) elektrine stimuliacija deformacijų analizės pėdsakai, dešimt regioninių audinių sekcijų sričių iš tos pačios sekcijos.Apatinėse plokštėse parodytas procentinis deformacijų skirtumas audinių sekcijose su elektrine stimuliacija ir be jos dešimtyje sričių iš skirtingų sekcijų. (n = 8 griežinėliai/grupė iš skirtingų kiaulių, atliekamas dviuodegio studento t testas; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 griežinėliai/grupė iš skirtingų kiaulių, atliekamas dviuodegio studento t testas; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; ****p<0,0001, **p<0,01,5). (n = 8 skyriai/grupė iš skirtingų kiaulių, dviejų uodegų Stjudento t testas; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0,0001，**p < 0,01，*p < 0,01，*p （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0,0001，**p < 0,01，*p < 0,01，*p (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = 8 skyriai/grupė, iš skirtingų kiaulių, dviejų uodegų Stjudento t testas; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05).Klaidų juostos rodo vidurkį ± standartinį nuokrypį.
Ankstesnėje statinėje biomimetinėje širdies pjūvių kultūros sistemoje [20, 21] 6 dienas išlaikėme širdies pjūvių gyvybingumą, funkciją ir struktūrinį vientisumą, taikydami elektrinę stimuliaciją ir optimizuodami terpės sudėtį.Tačiau po 10 dienų šie skaičiai smarkiai sumažėjo.Remsimės skyriais, kultivuotais ankstesnėje statinėje biomimetinėje kultūros sistemoje 20, 21 valdymo sąlygomis (Ctrl) ir naudosime savo anksčiau optimizuotą terpę kaip MC sąlygas ir kultūrą vienu metu veikiant mechaninei ir elektrinei stimuliacijai (CTCM).skambino .Pirmiausia nustatėme, kad mechaninės stimuliacijos be elektrinės stimuliacijos nepakako audinių gyvybingumui palaikyti 6 dienas (papildomas 3a, b pav.).Įdomu tai, kad pradėjus taikyti fizinę-mechaninę ir elektrinę stimuliaciją naudojant STCM, 12 dienų širdies pjūvių gyvybingumas išliko toks pat kaip ir šviežių širdies pjūvių MS sąlygomis, bet ne Ctrl sąlygomis, kaip rodo MTT analizė (1 pav.).3a).Tai rodo, kad mechaninė stimuliacija ir širdies ciklo modeliavimas gali išlaikyti audinių sekcijas gyvybingas dvigubai ilgiau, nei buvo pranešta mūsų ankstesnėje statinėje kultūros sistemoje.Tačiau audinių sekcijų struktūrinio vientisumo įvertinimas imuniniu širdies troponino T ir konneksino 43 žymėjimu parodė, kad konneksino 43 ekspresija MC audiniuose buvo žymiai didesnė 12 dieną nei kontrolinėse grupėse tą pačią dieną.Tačiau vienoda connexin 43 ekspresija ir Z disko susidarymas nebuvo visiškai išlaikyti (3b pav.).Audinių struktūriniam vientisumui kiekybiškai įvertinti naudojame dirbtinio intelekto (AI) sistemą26, vaizdu pagrįstą giluminio mokymosi vamzdyną, pagrįstą troponino-T ir konneksino dažymu43, kad automatiškai kiekybiškai įvertintume širdies pjūvių struktūrinį vientisumą ir fluorescenciją pagal lokalizacijos stiprumą.Šis metodas naudoja konvoliucinį neuronų tinklą (CNN) ir gilaus mokymosi sistemą, kad būtų galima patikimai kiekybiškai įvertinti širdies audinio struktūrinį vientisumą automatizuotu ir nešališku būdu, kaip aprašyta nuorodoje.26. MC audinio struktūrinis panašumas pagerėjo 0 dieną, palyginti su statiniais kontroliniais pjūviais.Be to, Massono dažymas trichromu atskleidė žymiai mažesnį fibrozės procentą MS sąlygomis, palyginti su kontrolinėmis sąlygomis 12 auginimo dieną (3c pav.).Nors CTCM padidino širdies audinio skyrių gyvybingumą 12 dieną iki tokio lygio, kaip ir šviežio širdies audinio, jis reikšmingai nepagerino širdies pjūvių struktūrinio vientisumo.
stulpelinė diagrama rodo kiekybinį šviežių širdies pjūvių (D0) arba širdies griežinėlių kultūros MTT gyvybingumo įvertinimą 12 dienų statinėje kultūroje (D12 Ctrl) arba CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC), 12 (D12 MC) atliktas iš skirtingų ANO pjūvių ##p; 0001, palyginti su D0 ir **p < 0,01, palyginti su D12 Ctrl). stulpelinė diagrama rodo kiekybinį šviežių širdies pjūvių (D0) arba širdies pjūvių kultūros MTT gyvybingumo įvertinimą 12 dienų statinėje kultūroje (D12 Ctrl) arba CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl ), 12 (D12 Ctrl ), 12 (D12 MC) atliktas <pig. .0001 lyginant su D0 ir **p < 0.01 lyginant su D12 Ctrl).histograma rodo kiekybinį MTT šviežios širdies pjūvių (D0) arba širdies pjūvių kultūros gyvybingumo įvertinimą 12 dienų statinėje kultūroje (D12 kontrolė) arba CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 kontrolė).####p < 0,0001 по сравнению с D0 ir **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0,0001, palyginti su D0 ir **p < 0,01, palyginti su D12 Ctrl). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl)天的 活力的量化)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测行单向ANOVA 测行单向 测试；伌10 测试；与#0#0. ，与D12 Ctrl 相比，**p < 0,01). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片(D0) (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，####p < 0.0001，与D12アCtrl 相比，**phistograma, rodanti MTT gyvybingumo kiekybinį įvertinimą šviežiose širdies pjūviuose (D0) arba širdies pjūviuose, kultivuotuose 12 dienų statinėje kultūroje (D12 kontrolė) arba CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 kontrolė)), 12 (D12 MC) sekcijų/grupių iš skirtingų kiaulių;####p < 0,0001 по сравнению с D0, **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0,0001, palyginti su D0, **p < 0,01, palyginti su D12 Ctrl).b Troponin-T (žalias), konneksinas 43 (raudonas) ir DAPI (mėlynas) šviežiai izoliuotose širdies dalyse (D0) arba širdies pjūviuose, kultivuotose statinėmis sąlygomis (Ctrl) arba CTCM sąlygomis (MC) 12 dienų) reprezentatyvių imunofluorescencinių vaizdų (tuščia skalė = 100 µm). Širdies audinio struktūrinio vientisumo kiekybinis dirbtinis intelektas (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) pjūviai/grupė iš skirtingų kiaulių, atliekamas vienpusis ANOVA testas; ####p < 0,0001, palyginti su D0 ir ****p < 0,0001). Širdies audinio struktūrinio vientisumo kiekybinis dirbtinis intelektas (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) pjūviai/grupė iš skirtingų kiaulių, atliekamas vienpusis ANOVA testas; ####p < 0,0001, palyginti su D0 ir ****p < 0,0001). Количественная оценка структурной целостности сердечной ткани искусственным интеллектом (n = 7 (D0), 7 MCвгзо Ctrl 2, (D12) (D12) разных свиней, проводится однофакторный тест ANOVA; ####p < 0,0001 по сравнению с D0 ir ****p < 0,0001 по сравне12). Širdies audinio struktūrinio vientisumo kiekybinis įvertinimas dirbtiniu intelektu (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) skyriai/grupės iš skirtingų kiaulių, atliktas vienpusis ANOVA testas; ####p < 0,0001, palyginti su D0 ir ****p < 0,001, palyginti su D1201).人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) griežinėliai/grupė kiekvienos skirtingos kiaulės, vienpusis ANOVA testas <0#0#0p10;#. ，****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）.人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) griežinėliai/grupė, kiekviena iš skirtingų kiaulių, vienpusis 且 渔 渔 0#0D testas; ，****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）. Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной ткани (n = 7 (D0), Ctrl MCпрвр, n = 7 (D0), 7 (D1) (D1) (2рес1) у каждой из разных свиней, односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001 prieš D0 Для сравнения ****p < 0,0001 по сравнению2). Dirbtinis intelektas širdies audinio struktūriniam vientisumui įvertinti (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) skyriai / grupė skirtingų kiaulių, vienpusis ANOVA testas; ####p<0,0001 vs .D0 Palyginimui ****p < 0,0201, palyginti su D1201). c Širdies pjūvių, nudažytų Massono trichromo dėme, reprezentatyvūs vaizdai (kairėje) ir kiekybinis įvertinimas (dešinėje) (n = 10 pjūvių / grupėje kiekvienoje iš skirtingų kiaulių, atliekamas vienpusis ANOVA testas; ####p < 0,0001 ***p lyginant su D 0001). c Massono trichromo dėme nudažytų širdies pjūvių reprezentatyvūs vaizdai (kairėje) ir kiekybinis įvertinimas (dešinėje) (n = 10 pjūvių/grupėje iš skirtingų kiaulių, atliekamas vienpusis ANOVA testas; #### p < 0,00 ir 0,1 lyginant su D1 ir 0,1). c Репрезентативные изображения (слева) и количественная оценка (справа) срезов сердца, окрашенных трихром штаб без покрытия = 500 мкм) (n = 10 срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонний тест0 p1 поронний тест0 p1 поронний тест0 ANOVA; #0, ###0# ANOVA; и ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Massono trichromo dėme nudažytų širdies pjūvių reprezentatyvūs vaizdai (kairėje) ir kiekybinis įvertinimas (dešinėje) (nepadengta skalė = 500 µm) (n = 10 pjūvių/grupėje iš skirtingų kiaulių, atliktas vienpusis ANOVA testas; #### p < 0 .0001 Ctrl 0 ***1, palyginti su D0 ir .1). c 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（裸尺0）（裸尺0）（裸尺0）切片/组，每组来自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 伎D0 相比 0.0.0***p2 <丸比，*** . C 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化度 = 500 µm） （n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 单向 单同 单向 单向 单向 单向 单向 单向 单向 单向 单向 单向 ####0.0.相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）. c Репрезентативные изображения (слева) ir количественный анализ (справа) срезов сердца, окрашенных трихром ая шкала = 500 мкм) (n = 10 срезов/группа, каждый от другой свиньи, протестировано с помощонью однофактор; # #p < 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Širdies pjūvių, nudažytų Massono trichromo dėme (tuščia = 500 µm), reprezentatyvūs vaizdai (kairėje) ir kiekybinis įvertinimas (dešinėje) (n = 10 pjūvių / grupėje, kiekviena iš skirtingos kiaulės, patikrinta taikant vienpusę dispersijos analizę ;### # p < 0,0001 ***p < 0,0, 2, palyginti su D0, 2 lyginant su D0).Klaidų juostos rodo vidurkį ± standartinį nuokrypį.
Iškėlėme hipotezę, kad pridedant mažas molekules į auginimo terpę, CTCM kultūros metu galima pagerinti kardiomiocitų vientisumą ir sumažinti fibrozės vystymąsi.Todėl mes tikrinome mažas molekules, naudodami mūsų statines kontrolines kultūras 20, 21, nes buvo nedidelis skaičius trikdančių veiksnių.Šiam ekranui buvo pasirinktas deksametazonas (Dex), trijodtironinas (T3) ir SB431542 (SB).Šios mažos molekulės anksčiau buvo naudojamos hiPSC-CM kultūrose, kad paskatintų kardiomiocitų brendimą didinant sarkomero ilgį, T kanalus ir laidumo greitį.Be to, žinoma, kad tiek Dex (gliukokortikoidas), tiek SB slopina uždegimą 29, 30.Todėl išbandėme, ar vienos ar šių mažų molekulių derinio įtraukimas pagerintų širdies skyrių struktūrinį vientisumą.Pirminiam patikrinimui kiekvieno junginio dozė buvo parinkta pagal koncentracijas, dažniausiai naudojamas ląstelių kultūros modeliuose (1 μM Dex27, 100 nM T327 ir 2,5 μM SB31).Po 12 dienų auginimo T3 ir Dex derinys lėmė optimalų kardiomiocitų struktūrinį vientisumą ir minimalų pluoštinį remodeliavimą (papildomi 4 ir 5 paveikslai).Be to, naudojant dvigubą arba dvigubą T3 ir Dex koncentraciją, buvo žalingas poveikis, palyginti su normaliomis koncentracijomis (papildomas 6a, b pav.).
Po pirminio patikrinimo atlikome 4 auginimo sąlygų palyginimą (4a pav.): Ctrl: širdies sekcijos, kultivuotos mūsų anksčiau aprašytoje statinėje kultūroje, naudojant mūsų optimizuotą terpę;20.21 TD: T3 ir Ctrl s pridėtas Dex trečiadienį;MC: širdies sekcijos, kultivuotos CTCM naudojant mūsų anksčiau optimizuotą terpę;ir MT: CTCM su T3 ir Dex pridėta prie terpės.Po 12 dienų auginimo MS ir MT audinių gyvybingumas išliko toks pat kaip ir šviežių audinių, įvertintų MTT tyrimu (4b pav.).Įdomu tai, kad pridėjus T3 ir Dex į transwell kultūras (TD), gyvybingumas reikšmingai nepagerėjo, palyginti su Ctrl sąlygomis, o tai rodo svarbų mechaninės stimuliacijos vaidmenį palaikant širdies skyrių gyvybingumą.
Eksperimentinės konstrukcijos diagrama, vaizduojanti keturias auginimo sąlygas, naudojamas įvertinti mechaninės stimuliacijos ir T3 / Dex papildymo poveikį terpėje 12 dienų. b Stulpelinė diagrama rodo gyvybingumo kiekybinį įvertinimą praėjus 12 dienų po kultivavimo visomis 4 kultivavimo sąlygomis (Ctrl, TD, MC ir MT), palyginti su šviežiomis širdies griežinėliais (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD ir D12 MT), 12 (D12 MC) atliktas iš skirtingų pjūvių #0, #p bandymas. 0001, ###p < 0,001, palyginti su D0 ir **p < 0,01, palyginti su D12 Ctrl). b Stulpelinė diagrama rodo gyvybingumo kiekybinį įvertinimą praėjus 12 dienų po kultivavimo visomis 4 kultivavimo sąlygomis (Ctrl, TD, MC ir MT), palyginti su šviežiomis širdies griežinėliais (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD ir D12 MT), 12 (D12 MC) atliktas iš skirtingų pjūvių #0, #p bandymas. 0001, ###p < 0,001, palyginti su D0 ir **p < 0,01, palyginti su D12 ctrl). b Гистограмма показывает количественную оценку жизнеспособности через 12 d. вания (контроль, TD, MC ir MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD ir D122 (D12) разных свиней, проводится односторонний тест ANOVA; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 пнеюю2 пнеюю2). b Juostinė diagrama rodo gyvybingumo kiekybinį įvertinimą praėjus 12 dienų po auginimo visomis 4 kultivavimo sąlygomis (kontrolinė, TD, MC ir MT), palyginti su šviežios širdies pjūviais (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD ir D12 MT), 12 (D12 MC) <br><br><br>0p. 01, ###p < 0,001, palyginti su D0 ir **p < 0,01, palyginti su D12 Ctrl). b 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) (n = 18 (D15)D12D12 MT)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；####p < 0.0001，###p < 0.0001，###p < ** 0.0001，###p < 丌p01.0.0D01与D12控制).b 4 12 (D12 MC) b Гистограмма, показывающая все 4 условия культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срез0дими срез0дими срез0 15 (D12 Ctrl, D12 TD ir D12 MT), от разных свиней 12 (D12 MC) срезы/группа, односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001, D12, 0,0001, #0# p <0,01 по сравнению с контролем D12). b Histograma, kurioje rodomos visos 4 auginimo sąlygos (kontrolė, TD, MC ir MT), palyginti su šviežios širdies pjūviais (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD ir D12 MT), iš skirtingų kiaulių 12 (D12 MC) sekcijų / grupė, vienpusis ANOVA testas; #.###p1; #.## **p<0,01, palyginti su kontroline D12). c Juostinė diagrama rodo gliukozės srauto kiekybinį įvertinimą praėjus 12 dienų po kultivavimo visomis 4 kultivavimo sąlygomis (Ctrl, TD, MC ir MT), palyginti su šviežiomis širdies griežinėliais (D0) (n = 6 griežinėliai/grupė iš skirtingų kiaulių, atliekamas vienpusis ANOVA testas; ###p < 0,001, palyginti su ***p < 0,2 lyginant su D0.2). c Juostinė diagrama rodo gliukozės srauto kiekybinį įvertinimą praėjus 12 dienų po kultivavimo visomis 4 kultivavimo sąlygomis (Ctrl, TD, MC ir MT), palyginti su šviežiomis širdies griežinėliais (D0) (n = 6 griežinėliai/grupė iš skirtingų kiaulių, atliekamas vienpusis ANOVA testas; ###p < 0,001, palyginti su ***p < 0,2 lyginant su D0.2). c Гистограмма показывает количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования во во 4 все (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группу от разных свитныйя от разных свиняней, ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению с D0 ir ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Histograma rodo kiekybinį gliukozės srauto įvertinimą praėjus 12 dienų po kultivavimo visomis 4 kultivavimo sąlygomis (kontrolinė, TD, MC ir MT), palyginti su šviežios širdies pjūviais (D0) (n = 6 pjūviai/grupė iš skirtingų kiaulių, atliktas vienpusis ANOVA testas; ###p < 0,001, palyginti su D0 ir 21***p < su D0.0.0***p <). c 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) 相掐褡夡 相掐 2糖通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试；###***D < 0,001，与D0（縌 0,0 ，与D0相比）. C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （（ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 新鲜 心脏 切片 切片 切片养 后 后 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 猪 ， ， 来自 猪 ， 来自 猪试；###p < 0,001，与D0 相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）. c Гистограмма, показывающая количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после култивирования культивирования рования (контроль, TD, MC ir MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группа, от разныных, от разныйх сердца ены тесты ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 (контроль). c Histograma, rodanti gliukozės srauto kiekybinį įvertinimą praėjus 12 dienų po kultivavimo visomis 4 kultivavimo sąlygomis (kontrolinė, TD, MC ir MT), palyginti su šviežios širdies pjūviais (D0) (n = 6 pjūviai/grupė, iš skirtingų kiaulių, vienpusiai Ar buvo atlikti ANOVA testai, ###p < 0,001, palyginti su 1, 0,0 ***, palyginti su 0,001 ***p, palyginti su 0,001).d Šviežių (mėlyna), 12 dienos MC (žalia) ir 12 dienos MT (raudona) audinių deformacijų analizės diagramos dešimtyje regioninių audinių pjūvių taškų (n = 4 griežinėliai / grupė, vienpusis ANOVA testas; reikšmingo skirtumo tarp grupių nebuvo).e Vulkano diagrama, rodanti skirtingai išreikštus genus šviežiose širdies dalyse (D0), palyginti su širdies pjūviais, kultivuotais statinėmis sąlygomis (Ctrl) arba MT sąlygomis (MT) 10–12 dienų.f Sarkomerų genų šiluminis žemėlapis širdies pjūviams, kultivuojamiems kiekviena iš kultivavimo sąlygų.Klaidų juostos rodo vidurkį ± standartinį nuokrypį.
Metabolinė priklausomybė nuo perėjimo nuo riebalų rūgščių oksidacijos prie glikolizės yra kardiomiocitų dediferenciacijos požymis.Nesubrendę kardiomiocitai pirmiausia naudoja gliukozę ATP gamybai ir turi hipoplastines mitochondrijas, kuriose yra nedaug kristų5, 32.Gliukozės panaudojimo analizė parodė, kad MC ir MT sąlygomis gliukozės panaudojimas buvo panašus į 0 dienos audiniuose (4c pav.).Tačiau Ctrl mėginiai žymiai padidino gliukozės panaudojimą, palyginti su šviežiais audiniais.Tai rodo, kad CTCM ir T3 / Dex derinys padidina audinių gyvybingumą ir išsaugo 12 dienų kultivuotų širdies skyrių metabolinį fenotipą.Be to, deformacijų analizė parodė, kad MT ir MS sąlygomis padermės lygis išliko toks pat kaip šviežiame širdies audinyje 12 dienų (4d pav.).
Norėdami išanalizuoti bendrą CTCM ir T3 / Dex poveikį pasauliniam širdies pjūvio audinio transkripcijos kraštovaizdžiui, atlikome RNAseq širdies pjūviuose iš visų keturių skirtingų auginimo sąlygų (1 papildomi duomenys).Įdomu tai, kad MT sekcijos parodė didelį transkripcijos panašumą su šviežiu širdies audiniu, tik 16 skirtingai išreikštų iš 13 642 genų.Tačiau, kaip parodėme anksčiau, po 10–12 dienų kultūroje „Ctrl“ griežinėliai parodė 1229 skirtingai išreikštus genus (4e pav.).Šie duomenys buvo patvirtinti širdies ir fibroblastų genų qRT-PGR (papildomi 7a-c pav.).Įdomu tai, kad Ctrl skyriai parodė širdies ir ląstelių ciklo genų sumažėjimą ir uždegiminių genų programų aktyvavimą.Šie duomenys rodo, kad dediferenciacija, kuri paprastai atsiranda po ilgalaikio kultivavimo, yra visiškai susilpnėjusi MT sąlygomis (papildomas 8a, b pav.).Kruopštus sarkomerų genų tyrimas parodė, kad tik MT sąlygomis išsaugomi sarkomerą (4f pav.) ir jonų kanalą (papildomas 9 pav.) koduojantys genai, apsaugantys juos nuo slopinimo Ctrl, TD ir MC sąlygomis.Šie duomenys rodo, kad naudojant mechaninės ir humoralinės stimuliacijos (T3 / Dex) derinį, širdies pjūvio transkriptas gali išlikti panašus į šviežių širdies pjūvių po 12 dienų kultūroje.
Šiuos transkripcijos duomenis patvirtina faktas, kad kardiomiocitų struktūrinis vientisumas širdies pjūviuose geriausiai išsaugomas MT sąlygomis 12 dienų, kaip rodo nepažeistas ir lokalizuotas 43 junginys (5a pav.).Be to, fibrozė širdies pjūviuose MT sąlygomis buvo žymiai sumažinta, palyginti su Ctrl ir panašiai su šviežiomis širdies pjūviais (5b pav.).Šie duomenys rodo, kad mechaninės stimuliacijos ir T3 / Dex gydymo derinys veiksmingai išsaugo širdies struktūrą širdies sekcijose kultūroje.
a Reprezentatyvūs imunofluorescenciniai troponino-T (žalia), konneksino 43 (raudona) ir DAPI (mėlyna) vaizdai šviežiai izoliuotose širdies pjūviuose (D0) arba kultivuojami 12 dienų visomis keturiomis širdies pjūvio kultūros sąlygomis (skalės juosta = 100 µm).). Dirbtinio intelekto kiekybinis širdies audinio struktūros vientisumo įvertinimas (n = 7 (D0 ir D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC ir D12 MT) pjūviai/grupė iš skirtingų kiaulių, atliekamas vienpusis ANOVA testas; ####p < 0,0001, palyginti su D0 ir *5.1, palyginti su D0 ir *5.1, arba 0 ). Dirbtinio intelekto kiekybinis širdies audinio struktūros vientisumo įvertinimas (n = 7 (D0 ir D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC ir D12 MT) pjūviai/grupė iš skirtingų kiaulių, atliekamas vienpusis ANOVA testas; #### p < 0,0001, palyginti su D0 ir *5.1, palyginti su D0 ir *5.1, arba 0.0 ). Количественная оценка структурной целостности ткани сердца с помощью искусственного интеллекта), Ctrl интеллекта (t = 71,2D10) D12 MT) срезов/группу от разных свиней, проведен однофакторный тест ANOVA; #### p < 0,0001 по сравнению <****и сравнению <****и сравнению с < по сравнению с 0,0,0 *p с D0,0,0 сравнению с D12 Ctrl). Širdies audinio struktūrinio vientisumo kiekybinis įvertinimas naudojant dirbtinį intelektą (n = 7 (D0 ir D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC ir D12 MT) pjūviai/grupė iš skirtingų kiaulių, atliktas vienpusis ANOVA testas; ##****## p < 0,0001 lyginant su D0 ir *p < 0,0 p1, lyginant su *p < 0.0.0).对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、、D12 MC 和D12臺蛡工智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0,0001 与D0 和*p < 0,05 相比，或****p < 0,000112 䯎，D对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 (n = 7 （d0 和 d12 ctrl） （5 （d12 td 、 d12 mc 12 mc工 智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ########## p < 0,0001 与D0 和*p < 0,05 盔相比）.Širdies audinio struktūrinio vientisumo kiekybinis įvertinimas naudojant dirbtinį intelektą skirtingose ​​kiaulėse (n = 7 (D0 ir D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC ir D12 MT) sekcijos/grupė) taikant vienpusį ANOVA testą;#### p < 0,0001 по сравнению с D0 ir *p < 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). #### p < 0,0001, palyginti su D0 ir *p < 0,05 arba ****p < 0,0001, palyginti su D12 Ctrl). b Reprezentatyvūs vaizdai ir kiekybinis širdies pjūvių, nudažytų Massono trichromo dėme (Masson bar = 500 µm) įvertinimas (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD ir D12 MC), 9 (D12 MT) pjūviai / grupė atliekami iš skirtingų kiaulių, lyginant su <0 #0, bandymu viena kryptimi #0 #p. D0 ir ***p < 0,001 arba ****p < 0,0001, palyginti su D12 Ctrl). b Reprezentatyvūs vaizdai ir kiekybinis širdies pjūvių, nudažytų Massono trichromo dėme (Masson bar = 500 µm) įvertinimas (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD ir D12 MC), 9 (D12 MT) pjūviai / grupė atliekami iš skirtingų kiaulių, lyginant su <0 #0, bandymu viena kryptimi #0 #p. D0 ir ***p < 0,001 arba ****p < 0,0001, palyginti su D12 Ctrl). b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромным красителейм красителеным ка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD ir D12 MC), 9 (D12 MT) срезов/группу от разных свиней, выполняетрой, выполняется #0,0#01; по сравнению с D0 ir ***p < 0,001 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b Reprezentatyvūs vaizdai ir širdies pjūvių, nudažytų Massono trichromo dėme (mastelė = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD ir D12 MC), 9 (D12 MT) pjūviai / grupė iš skirtingų kiaulių, atliktas <***v.0p.1, <*** v. 0,001 arba ****p < 0,0001, palyginti su D12 Ctrl). b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺= 500 µm（D01＀D =1D01（n和D12 MC），来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方差分析，方差分析；#0##p0D12 0,001，或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）. b 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 （比例 尺 d 尺 尺 = 100 µ0 n = 100 µm ctrl 、 d12 td 和 d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切燇 切片 片片 切片 ​​切片 切片 切切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 组，进行单因素方差 单因素方差 单因素方差 单因素方差 切片 #. ***p < 0,001, 或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）. b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромом = Массца (тим00ромом Массца) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD ir D12 MC), 9 (D12 MT) срезов от разных свиней / группы, один- способ*** ANOVA; ####p <нне 0,0,0сра1 по 0,0 ,001 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b Reprezentatyvūs vaizdai ir širdies pjūvių, nudažytų Massono trichromu (skalės juosta = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD ir D12 MC), 9 (D12 MT) pjūvių iš skirtingų kiaulių / grupė, vienas ANOVA metodas, palyginimas ***, 0,0,0,0,1 ANOVA metodas <; ##.#0,1 ****p < 0,0001, palyginti su D12 Ctrl).Klaidų juostos rodo vidurkį ± standartinį nuokrypį.
Galiausiai, CTCM gebėjimas imituoti širdies hipertrofiją buvo įvertintas didinant širdies audinio tempimą.CTCM didžiausias oro kameros slėgis padidėjo nuo 80 mmHg iki 80 mmHg.Art.(normalus tempimas) iki 140 mmHg Art.(6a pav.).Tai atitinka tempimo padidėjimą 32 % (6b pav.), kuris anksčiau buvo parodytas kaip atitinkamas procentinis tempimas, reikalingas širdies pjūviams, kad būtų pasiektas sarkomero ilgis, panašus į tą, kuris matomas esant hipertrofijai.Širdies audinio tempimas ir greitis susitraukimo ir atsipalaidavimo metu išliko pastovūs šešias kultivavimo dienas (6c pav.).Širdies audinys, esantis MT sąlygomis, šešias dienas buvo veikiamas normaliu tempimu (MT (normalus)) arba pertempimo sąlygomis (MT (OS)).Jau po keturių dienų kultūroje hipertrofinis biomarkeris NT-ProBNP buvo žymiai padidėjęs terpėje MT (OS) sąlygomis, palyginti su MT (normaliomis) sąlygomis (7a pav.).Be to, po šešių kultivavimo dienų MT (OS) ląstelių dydis (7b pav.) žymiai padidėjo, palyginti su MT širdies pjūviais (normalus).Be to, NFATC4 branduolio translokacija žymiai padidėjo pertemptuose audiniuose (7c pav.).Šie rezultatai rodo laipsnišką patologinio remodeliavimo vystymąsi po hipertenzijos ir patvirtina koncepciją, kad CTCM prietaisas gali būti naudojamas kaip platforma tiriant tempimo sukeltą širdies hipertrofijos signalizaciją.
Reprezentatyvūs oro kameros slėgio, skysčio kameros slėgio ir audinių judėjimo matavimų pėdsakai patvirtina, kad kameros slėgis keičia skysčio kameros slėgį, sukeldamas atitinkamą audinio pjūvio judėjimą.b Tipinės tempimo procento ir tempimo greičio kreivės normaliai ištemptoms (oranžinėms) ir pertemptoms (mėlynos spalvos) audinių dalims.c Juostinė diagrama, rodanti ciklo trukmę (n = 19 skiltelių vienoje grupėje, iš skirtingų kiaulių), susitraukimo laiką (n = 18-19 griežinėlių grupėje, iš skirtingų kiaulių), atsipalaidavimo laiką (n = 19 griežinėlių grupėje, iš skirtingų kiaulių) ), audinių judėjimo amplitudę (n = 14 griežinėlių / grupėje, iš skirtingų kiaulių, greitis / grupė, iš skirtingų kiaulių). kiaulių) ir didžiausio atsipalaidavimo greičio (n = 14 (D0), 15 (D6) ) pjūvių / grupių) iš skirtingų kiaulių), dviejų uodegų Stjudento t testas neparodė jokio reikšmingo parametro skirtumo, o tai rodo, kad šie parametrai išliko pastovūs per 6 auginimo dienas su viršįtampiu.Klaidų juostos rodo vidurkį ± standartinį nuokrypį.
NT-ProBNP koncentracijos auginimo terpėje iš širdies pjūvių, kultivuotų MT normalaus tempimo (norma) arba pertempimo (OS) sąlygomis (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm ir D4 MTOS) pjūviai/grupė iš skirtingų kiaulių, 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm ir D4 MTOS) pjūviai / grupė iš skirtingų kiaulių, **p ANO lyginamas <0 normalus, **p yra atliktas <0 normalus ;.**p. NT-ProBNP koncentracijos auginimo terpėje iš širdies pjūvių, kultivuotų MT normalaus tempimo (norma) arba pertempimo (OS) sąlygomis (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm ir D4 MTOS) pjūviai/grupė, **, lyginant su skirtingų kiaulių, **p ANO atliktas <0;Kiekybinė NT-ProBNP koncentracijos auginimo terpėje histograma iš širdies pjūvių, kultivuotų normalios MT tempimo (normos) arba pertempimo (OS) sąlygomis (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm ir D4).MTOS) griežinėliai / grupė iš skirtingų kiaulių, atlikta dviejų faktorių dispersijos analizė;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0,01, palyginti su normaliu tempimu). a 在MT 正常拉伸(Norm) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP 浓庡(D2 MTNorm)、3（D2 MTOS、D4 MTNorm 和D4 MTOS）来自不同猪的切片/组，进行弭双向方差分析，p < 0,01）. NT-ProBNP koncentracijos kiekybinis širdies pjūvių, kultivuotų MT normalaus tempimo (norma) arba pertempimo (OS) sąlygomis (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm和D4 MTOS) iš skirtingų 猪的幇片䏐叐叐动; **palyginti su įprastu tempimu, p < 0,01).histograma NT-ProBNP koncentracijų kiekybinis nustatymas širdies pjūviuose, kultivuotuose normalios MT tempimo (normos) arba pertempimo (OS) sąlygomis (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) ir D4 MTOS) pjūviai/grupė iš skirtingų kiaulių, dvipusė dispersijos analizė;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0,01, palyginti su normaliu tempimu). b Reprezentatyvūs širdies pjūvių, nudažytų troponinu-T ir WGA (kairėje) ir ląstelių dydžio kiekybinio įvertinimo (dešinėje) vaizdai (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) ląstelės / grupė iš 10 skirtingų pjūvių iš skirtingų kiaulių, Dviejų uodegų studento t-testas lyginamas su 0 normaliu .****0 p1). b Reprezentatyvūs širdies pjūvių, nudažytų troponinu-T ir WGA (kairėje) ir ląstelių dydžio kiekybinio įvertinimo (dešinėje) vaizdai (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) ląstelės / grupė iš 10 skirtingų pjūvių iš skirtingų kiaulių, Dviejų uodegų studento t-1 testas lyginamas su normaliu . ****0 p testas 0). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и количествентивные количественадголкорезов сердца ва) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клеток/группу из 10 разных срезов от разных свиней, два- проводится разных свиней, два- проводится ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b Reprezentatyvūs širdies pjūvių, nudažytų troponinu-T ir AZP, vaizdai (kairėje) ir ląstelių dydžio kiekybinis įvertinimas (dešinėje) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) ląstelės / grupė iš 10 skirtingų skirtingų kiaulių pjūvių, atliktas dviejų uodegų Stjudento t-testas <palygintas su normaliu 0; ****p01. b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的代脏切片的代辨揃30D ），来自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾学玌有尾学生t比，****p < 0,0001）. b Reprezentatyvūs širdies pjūvių vaizdai, nudažyti calcarein-T ir WGA (kairėje) ir ląstelių dydis (dešinėje) (n = 330 (D6 MTOS), 369 iš 10 skirtingų pjūvių (D6 MTNorm)). 0,0001). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т ir АЗП (слева) и количественкаn (количественкаn) = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) из 10 различных срезов от разных свиней Клетки/группа, ****тьа двусторонние критай,0 двусторонние критери сравнению с нормальным растяжением). b Tipiniai troponinu-T ir AZP nudažytų širdies sekcijų vaizdai (kairėje) ir ląstelių dydžio kiekybinis įvertinimas (dešinėje) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) iš 10 skirtingų skirtingų kiaulių pjūvių) Ląstelės / grupė, dviejų uodegų kriterijus Studento t;****p < 0,0001, palyginti su normalia deformacija). c Reprezentatyvūs 0 ir 6 dienų MTOS širdies pjūvių vaizdai, imuniniu būdu pažymėti troponinu-T ir NFATC4, ir kiekybinis NFATC4 translokacijos į CM branduolius įvertinimas (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) pjūviai/grupė iš skirtingų studentų kiaulių, *t 0 p testas 0 .0. c Reprezentatyvūs 0 ir 6 dienų MTOS širdies pjūvių vaizdai, imuniniu būdu pažymėti troponinu-T ir NFATC4, ir NFATC4 translokacijos į CM branduolius kiekybinis įvertinimas (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) pjūviai/grupė iš skirtingų kiaulių , *t-ptai atliktas0 ;0 testas. c Репрезентативные изображения для срезов сердца 0 и 6 дней MTOS, иммуномеченых для тропонина-Т и NFATC4, ченерастина слокации NFATC4 в ядра кавернозных клеток (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срезов/группу от разных свинеристодриврийстояСннияетсо *p < 0,05). c Reprezentatyvūs širdies pjūvių vaizdai po 0 ir 6 dienų MTOS, pažymėti imuniniu būdu troponinu-T ir NFATC4, ir kiekybinis NFATC4 translokacijos kaverninių ląstelių branduolyje įvertinimas (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) pjūviai / grupė iš skirtingų kiaulių).*p < 0,05). c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天 和第 天 和第 天 于肌钙蛋白-T 和 NFATC4 免疫标记的第 天和第 6 天 和第 天 和第 天 于 䌼卪 表 性 图的NFATC4 易位至CM 细胞核的量化（n = 4 (D0)、3 (D6 MTOS) 切片/组, 进行双尾学生t 曂〼 5) 「＂ c Reprezentatyvūs kalkanino-T ir NFATC4 imuninio žymėjimo 第0天和第6天MTOS širdies pjūviai ir NFATC4 iš skirtingų NFATC4 易位至CM ląstelių branduolio vaizdai的痄痄痄痄 (D0), 痴凤OS 3 (D)双尾学生et 电影；*p < 0,05). c Репрезентативные изображения срезов сердца MTOS на 0 ir 6 день для иммуномаркировки тропонимаркировки тропонимаркировки тропоницном-Т ir NFATC4 кации NFATC4 в ядра CM от разных свиней (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срез/группа, два- хвостатый t-критерий Стьюде <, Стьюде < , 0 * 5). c Reprezentatyvūs MTOS širdies pjūvių vaizdai 0 ir 6 dienomis troponino-T ir NFATC4 imuniniam ženklinimui ir NFATC4 translokacijos CM branduolyje iš skirtingų kiaulių kiekybiniam įvertinimui (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) pjūviai / grupė, dviuodegiai < t.0 ;Klaidų juostos rodo vidurkį ± standartinį nuokrypį.
Transliaciniams širdies ir kraujagyslių tyrimams reikalingi ląstelių modeliai, kurie tiksliai atkuria širdies aplinką.Šiame tyrime buvo sukurtas ir apibūdintas CTCM prietaisas, galintis stimuliuoti itin plonas širdies dalis.CTCM sistema apima fiziologiškai sinchronizuotą elektromechaninę stimuliaciją ir T3 bei Dex skysčių sodrinimą.Kai kiaulių širdies sekcijos buvo veikiamos šiais veiksniais, jų gyvybingumas, struktūrinis vientisumas, metabolinis aktyvumas ir transkripcijos ekspresija išliko tokie patys kaip ir šviežiame širdies audinyje po 12 dienų auginimo.Be to, per didelis širdies audinio tempimas gali sukelti širdies hipertrofiją, kurią sukelia hiperekstenzija.Apskritai šie rezultatai patvirtina kritinį fiziologinių kultūros sąlygų vaidmenį palaikant normalų širdies fenotipą ir suteikia pagrindą vaistų patikrai.
Daugelis veiksnių padeda sukurti optimalią aplinką kardiomiocitų funkcionavimui ir išgyvenimui.Ryškiausi iš šių veiksnių yra susiję su (1) tarpląsteline sąveika, (2) elektromechanine stimuliacija, (3) humoraliniais veiksniais ir (4) metaboliniais substratais.Fiziologinei ląstelių tarpusavio sąveikai reikalingi sudėtingi trimačiai kelių tipų ląstelių tinklai, palaikomi tarpląstelinės matricos.Tokias sudėtingas ląstelių sąveikas sunku atkurti in vitro, kartu kultivuojant atskirų tipų ląsteles, tačiau jas galima lengvai pasiekti naudojant organotipinį širdies skyrių pobūdį.
Kardiomiocitų mechaninis tempimas ir elektrinė stimuliacija yra labai svarbūs palaikant širdies fenotipą 33, 34, 35.Nors mechaninė stimuliacija buvo plačiai naudojama hiPSC-CM kondicionavimui ir brendimui, pastaruoju metu keliuose elegantiškuose tyrimuose buvo bandoma mechaniniu būdu stimuliuoti širdies pjūvius kultūroje, naudojant vienaašę apkrovą.Šie tyrimai rodo, kad 2D vienaašė mechaninė apkrova turi teigiamą poveikį širdies fenotipui kultivavimo metu.Šių tyrimų metu širdies dalys buvo apkrautos izometrinėmis tempimo jėgomis17, linijine auksotonine apkrova18 arba širdies ciklas buvo atkurtas naudojant jėgos keitiklio grįžtamąjį ryšį ir įtempimo pavaras.Tačiau šie metodai naudoja vienaašį audinių tempimą be aplinkos optimizavimo, todėl daugelis širdies genų slopinami arba genų, susijusių su nenormaliomis tempimo reakcijomis, ekspresija.Čia aprašytas CTCM suteikia 3D elektromechaninį stimulą, kuris imituoja natūralų širdies ciklą ciklo trukmės ir fiziologinio tempimo požiūriu (25 % tempimas, 40 % sistolė, 60 % diastolė ir 72 dūžiai per minutę).Nors vien šios trimatės mechaninės stimuliacijos nepakanka audinių vientisumui palaikyti, norint tinkamai palaikyti audinių gyvybingumą, funkciją ir vientisumą, reikalingas humoralinės ir mechaninės stimuliacijos derinys naudojant T3/Dex.
Humoriniai veiksniai vaidina svarbų vaidmenį moduliuojant suaugusiųjų širdies fenotipą.Tai buvo pabrėžta HiPS-CM tyrimuose, kuriuose T3 ir Dex buvo dedami į auginimo terpę, kad paspartintų ląstelių brendimą.T3 gali turėti įtakos aminorūgščių, cukrų ir kalcio pernešimui per ląstelių membranas36.Be to, T3 skatina MHC-α ekspresiją ir MHC-β sumažinimą, skatindamas greito trūkčiojimo miofibrilių susidarymą brandžiuose kardiomiocituose, palyginti su lėtomis miofibrilėmis vaisiaus CM.Dex veikia gliukokortikoidų receptorius ir, kaip įrodyta, padidina miokardo susitraukimą izoliuotose perfuzuotose širdyse;Manoma, kad šis pagerėjimas yra susijęs su poveikiu kalcio nuosėdų skatinamam patekimui (SOCE) 39,40.Be to, Dex jungiasi prie savo receptorių, sukeldamas platų tarpląstelinį atsaką, kuris slopina imuninę funkciją ir uždegimą30.
Mūsų rezultatai rodo, kad fizinė mechaninė stimuliacija (MS) pagerino bendrą kultūros našumą, palyginti su Ctrl, tačiau per 12 dienų kultūroje nepavyko išlaikyti gyvybingumo, struktūrinio vientisumo ir širdies ekspresijos.Palyginti su Ctrl, T3 ir Dex pridėjimas prie CTCM (MT) kultūrų pagerino gyvybingumą ir išlaikė panašius transkripcijos profilius, struktūrinį vientisumą ir metabolinį aktyvumą su šviežiu širdies audiniu 12 dienų.Be to, kontroliuojant audinių tempimo laipsnį, naudojant STCM buvo sukurtas hiperekstenzijos sukeltos širdies hipertrofijos modelis, iliustruojantis STCM sistemos universalumą.Reikėtų pažymėti, kad nors širdies remodeliavimas ir fibrozė paprastai apima nepažeistus organus, kurių cirkuliuojančios ląstelės gali aprūpinti reikiamus citokinus, taip pat fagocitozę ir kitus remodeliavimo veiksnius, širdies dalys vis tiek gali imituoti fibrotinį procesą, reaguodamos į stresą ir traumą.į miofibroblastus.Tai anksčiau buvo įvertinta šiame širdies pjūvio modelyje.Reikėtų pažymėti, kad CTCM parametrus galima moduliuoti keičiant slėgį / elektros amplitudę ir dažnį, kad būtų galima imituoti daugelį būklių, tokių kaip tachikardija, bradikardija ir mechaninis kraujotakos palaikymas (mechaniškai neapkrauta širdis).Dėl to sistema yra vidutinė narkotikų testavimo našumas.CTCM gebėjimas modeliuoti per didelio krūvio sukeltą širdies hipertrofiją sudaro sąlygas išbandyti šią sistemą individualiai terapijai.Apibendrinant, šis tyrimas rodo, kad mechaninis tempimas ir humoralinė stimuliacija yra labai svarbūs palaikant širdies audinių sekcijų kultūrą.
Nors čia pateikti duomenys rodo, kad CTCM yra labai perspektyvi nepažeisto miokardo modeliavimo platforma, šis kultūros metodas turi tam tikrų apribojimų.Pagrindinis CTCM kultūros apribojimas yra tas, kad jis sukelia nuolatinius dinaminius mechaninius įtempius pjūviams, o tai neleidžia aktyviai stebėti širdies pjūvio susitraukimų kiekvieno ciklo metu.Be to, dėl mažo širdies sekcijų dydžio (7 mm), galimybė įvertinti sistolinę funkciją už kultūros sistemų ribų naudojant tradicinius jėgos jutiklius yra ribota.Dabartiniame rankraštyje mes iš dalies įveikiame šį apribojimą, įvertindami optinę įtampą kaip susitraukimo funkcijos rodiklį.Tačiau šis apribojimas pareikalaus tolesnio darbo ir ateityje gali būti sprendžiamas diegiant optinio širdies pjūvių funkcijos stebėjimo kultūroje metodus, pvz., optinį kartografavimą naudojant kalciui ir įtampai jautrius dažus.Kitas CTCM apribojimas yra tas, kad darbinis modelis nevaldo fiziologinio streso (išankstinio įkrovimo ir apkrovos).Naudojant CTCM, slėgis buvo sukeltas priešingomis kryptimis, kad būtų atkurtas 25% fiziologinis tempimas diastolėje (visas ištempimas) ir sistolė (susitraukimo ilgis elektros stimuliacijos metu) labai dideliuose audiniuose.Šis apribojimas turėtų būti pašalintas būsimuose CTCM projektuose tinkamai spaudžiant širdies audinį iš abiejų pusių ir taikant tikslius slėgio ir tūrio santykius, kurie atsiranda širdies kamerose.
Šiame rankraštyje aprašytas pertempimo sukeltas remodeliavimas apsiriboja hipertrofinių hipertempimo signalų imitavimu.Taigi šis modelis gali padėti tirti tempimo sukeltą hipertrofinį signalizavimą, nereikalaujant humoralinių ar nervinių faktorių (kurių šioje sistemoje nėra).Norint padidinti CTCM daugumą, reikia atlikti tolesnius tyrimus, pavyzdžiui, auginimas kartu su imuninėmis ląstelėmis, cirkuliuojantys plazmos humoraliniai faktoriai ir inervacija, kai auginami kartu su neuronų ląstelėmis, pagerins ligos modeliavimo galimybes naudojant CTCM.
Šiame tyrime buvo panaudota trylika kiaulių.Visos gyvūnų procedūros buvo atliktos pagal institucines gaires ir jas patvirtino Luisvilio universiteto institucinis gyvūnų priežiūros ir naudojimo komitetas.Aortos lankas buvo užspaustas ir širdis perfuzuojama 1 l sterilios kardioplegijos (110 mM NaCl, 1,2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 U/mL heparino, pH iki 7,4); širdys buvo laikomos lediniame kardiopleginiame tirpale, kol buvo gabenamos į laboratoriją ant ledo, o tai paprastai yra <10 min. širdys buvo laikomos lediniame kardiopleginiame tirpale, kol buvo gabenamos į laboratoriją ant ledo, o tai paprastai yra <10 min. сердца хранили в ледяном кардиоплегическом растворе до транспортировки в лабораторию на льду, что обынично льду. širdys buvo laikomos lediniame kardiopleginiame tirpale iki transportavimo į laboratoriją ant ledo, o tai paprastai trunka <10 min.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟 Держите сердца в ледяной кардиоплегии до транспортировки в лабораторию на льду, обычно <10 мин. Laikyti širdis ant ledo kardioplegija iki transportavimo į laboratoriją ant ledo, paprastai <10 min.
Kultūros kameros, skirstytuvai ir oro kameros yra pagamintos iš CNC skaidraus akrilo plastiko.7 mm skersmens atraminis žiedas pagamintas iš didelio tankio polietileno (HDPE) centre ir turi sandarinimo žiedo griovelį, kad tilptų silikoninis sandarinimo žiedas, naudojamas medžiagai sandarinti apačioje.Plona silicio dioksido membrana atskiria kultivavimo kamerą nuo atskyrimo plokštės.Silikoninė membrana yra lazeriu iškirpta iš 0,02 colio storio silikono lakšto, jos kietumas yra 35 A.Apatinės ir viršutinės silikoninės tarpinės yra išpjautos lazeriu iš 1/16 colio storio silikono lakšto ir jų kietumas yra 50 A.316L nerūdijančio plieno varžtai ir sparnuotos veržlės naudojami bloko tvirtinimui ir sandariam sandarinimui sukurti.
Speciali spausdintinė plokštė (PCB) skirta integruoti su C-PACE-EM sistema.Šveicariškų mašinų jungčių lizdai ant PCB sujungiami su grafito elektrodais sidabruotais variniais laidais ir į elektrodus įsuktais bronziniais 0-60 varžtais.Spausdintinė plokštė dedama į 3D spausdintuvo dangtelį.
CTCM įtaisas valdomas programuojama pneumatine pavara (PPD), kuri sukuria kontroliuojamą kraujotakos slėgį, panašų į širdies ciklą.Didėjant slėgiui oro kameroje, lanksti silikoninė membrana plečiasi į viršų, priversdama terpę po audinio vieta.Tada audinio plotas bus ištemptas dėl šio skysčio išstūmimo, imituojant fiziologinį širdies išsiplėtimą diastolės metu.Atsipalaidavimo piko metu grafito elektrodais buvo taikoma elektrinė stimuliacija, kuri sumažino slėgį oro kameroje ir sukėlė audinių pjūvių susitraukimą.Vamzdžio viduje yra hemostatinis vožtuvas su slėgio jutikliu, kuris aptinka slėgį oro sistemoje.Slėgio jutiklio juntamas slėgis taikomas duomenų rinktuvui, prijungtam prie nešiojamojo kompiuterio.Tai leidžia nuolat stebėti slėgį dujų kameroje.Pasiekus maksimalų kameros slėgį (standartinis 80 mmHg, 140 mmHg OS), duomenų rinkimo įrenginiui buvo nurodyta siųsti signalą į C-PACE-EM sistemą, kad būtų generuojamas dvifazis įtampos signalas 2 ms, nustatytas į 4 V.
Buvo paimtos širdies sekcijos ir atliktos kultivavimo sąlygos 6 šulinėliais taip: Surinktas širdis perkelkite iš pernešimo indo į padėklą su šalta (4°C) kardioplegija.Kairysis skilvelis buvo izoliuotas steriliu peiliuku ir supjaustytas 1-2 cm3 gabaliukais.Šie audinių blokai buvo pritvirtinti prie audinių atramų audinių klijais ir patalpinti į vibruojančią mikrotominę audinių vonią su Tyrode tirpalu ir nuolat prisotinti deguonimi (3 g/l 2,3-butanediono monooksimo (BDM), 140 mM NaCl (8,18 g) . ), 6 mM KCl (0,447 mM, 6 mM gliukoze (0,447 m2 EP10 M1). 2,38 g), 1 mM MgCl2 (1 ml 1 M tirpalo), 1,8 mM CaCl2 (1,8 ml 1 M tirpalo), iki 1 L ddH2O).Vibruojantis mikrotomas buvo nustatytas pjauti 300 µm storio griežinėlius 80 Hz dažniu, 2 mm horizontalios vibracijos amplitude ir 0,03 mm/s greičiu.Audinių vonia buvo apsupta ledu, kad tirpalas būtų vėsus, o temperatūra buvo palaikoma 4 ° C.Perkelkite audinių sekcijas iš mikrotomo vonios į inkubacinę vonią, kurioje yra nuolat deguonies prisotintas Tyrode tirpalas ant ledo, kol gausite pakankamai pjūvių vienai auginimo plokštelei.Transwell kultūroms audinių sekcijos buvo pritvirtintos prie sterilių 6 mm pločio poliuretano atramų ir dedamos į 6 ml optimizuotos terpės (199 terpės, 1x ITS priedas, 10% FBS, 5 ng/ml VEGF, 10 ng/ml FGF-šarminis ir 2x antibiotikas-priešgrybelinis).Audinių sekcijose per C-Pace buvo taikoma elektrinė stimuliacija (10 V, dažnis 1,2 Hz).TD sąlygomis kiekvieno terpės keitimo metu buvo pridėta šviežio T3 ir Dex 100 nM ir 1 μM.Terpė prisotinama deguonimi, prieš ją keičiant 3 kartus per dieną.Audinių sekcijos buvo auginamos inkubatoriuje 37 ° C temperatūroje ir 5% CO2.
CTCM kultūroms audinių sekcijos buvo dedamos į pagal užsakymą pagamintą 3D spausdintuvą Petri lėkštelėje, kurioje yra modifikuoto Tyrode tirpalo.Prietaisas skirtas padidinti širdies pjūvio dydį 25% atraminio žiedo ploto.Tai daroma tam, kad širdies dalys neišsitemptų po perkėlimo iš Tyrode tirpalo į terpę ir diastolės metu.Naudojant histoakrilinius klijus, 300 µm storio sekcijos buvo pritvirtintos prie 7 mm skersmens atraminio žiedo.Pritvirtinę audinių sekcijas prie atraminio žiedo, nupjaukite perteklines audinių dalis ir pritvirtintas audinių dalis įdėkite atgal į Tyrode tirpalo vonią ant ledo (4°C), kol bus paruošta pakankamai pjūvių vienam prietaisui.Bendras visų įrenginių apdorojimo laikas neturi viršyti 2 valandų.Po to, kai prie jų atraminių žiedų buvo pritvirtintos 6 audinių sekcijos, buvo surinktas CTCM įrenginys.CTCM kultivavimo kamera iš anksto užpildyta 21 ml iš anksto deguonies prisotintos terpės.Perkelkite audinių sekcijas į auginimo kamerą ir atsargiai pipete pašalinkite visus oro burbuliukus.Tada audinio dalis įvedama į skylę ir švelniai prispaudžiama į vietą.Galiausiai ant prietaiso uždėkite elektrodo dangtelį ir perkelkite prietaisą į inkubatorių.Tada prijunkite CTCM prie oro vamzdžio ir C-PACE-EM sistemos.Pneumatinė pavara atsidaro, o oro vožtuvas atidaro CTCM.Sistema C-PACE-EM buvo sukonfigūruota tiekti 4 V 1,2 Hz dažniu dvifazio stimuliavimo metu 2 ms.Jei reikia, audinių sekcijas galima išimti iš jų auginimo šulinėlių, kad būtų pašalinti po jomis galintys patekti oro burbuliukai.MT gydymo sąlygomis T3 / Dex buvo pridėtas šviežias kiekvieną kartą keičiant terpę su 100 nM T3 ir 1 μM Dex.CTCM prietaisai buvo auginami inkubatoriuje 37 ° C temperatūroje ir 5% CO2.
SLR fotoaparatas („Canon Rebel T7i“, „Canon“, Tokijas, Japonija) buvo naudojamas su „Navitar Zoom 7000“ 18–108 mm makro objektyvu („Navitar“, San Franciskas, CA).Vizualizacija buvo atlikta kambario temperatūroje, pakeitus terpę nauja terpe.Kamera pastatyta 51° kampu, o vaizdo įrašas įrašomas 30 kadrų per sekundę greičiu.Pirma, atvirojo kodo programinė įranga (MUSCLEMOTION43) buvo naudojama kartu su „Image-J“, kad būtų galima įvertinti širdies pjūvių judėjimą.Kaukė buvo sukurta naudojant MATLAB (MathWorks, Natick, MA, JAV), siekiant apibrėžti dominančias sritis, kuriose plakami širdies pjūviai, kad būtų išvengta triukšmo.Rankiniu būdu segmentuotos kaukės pritaikomos visiems vaizdams kadrų sekoje ir perduodamos į MUSCLEMOTION papildinį.Muscle Motion naudoja vidutinį pikselių intensyvumą kiekviename kadre, kad kiekybiškai įvertintų jo judėjimą, palyginti su atskaitos kadru.Duomenys buvo įrašyti, filtruojami ir naudojami ciklo trukmei įvertinti ir audinių tempimui širdies ciklo metu įvertinti.Įrašytas vaizdo įrašas buvo apdorotas naudojant pirmos eilės nulinės fazės skaitmeninį filtrą.Norint kiekybiškai įvertinti audinių tempimą (nuo smailės iki smailės), buvo atlikta nuo smailės iki smailės analizė, kad būtų galima atskirti įrašyto signalo smailes ir smailes.Be to, tendencijų mažinimas atliekamas naudojant 6 eilės polinomą, siekiant pašalinti signalo dreifus.Programos kodas buvo sukurtas MATLAB, siekiant nustatyti visuotinį audinių judėjimą, ciklo laiką, atsipalaidavimo laiką ir susitraukimo laiką (papildomas programos kodas 44).
Įtempimų analizei naudodami tuos pačius vaizdo įrašus, sukurtus mechaniniam tempimo įvertinimui, pirmiausia atsekėme du vaizdus, ​​vaizduojančius judesio smailes (aukščiausią (viršutinį) ir žemiausią (apatinį) judesio tašką) pagal MUSCLEMOTION programinę įrangą.Tada segmentavome audinių sritis ir segmentuotam audiniui pritaikėme šešėliavimo algoritmą (papildomas 2a pav.).Tada segmentuotas audinys buvo padalintas į dešimt paviršių, o kiekvieno paviršiaus įtempis buvo apskaičiuotas naudojant šią lygtį: Įtempimas = (Sup-Sdown)/Sdown, kur Sup ir Sdown yra atitinkamai formos atstumai nuo viršutinio ir apatinio audinio šešėlių (papildomas .2b pav.).
Fiksuoti audiniai buvo dehidratuoti 10% ir 20% sacharozėje 1 valandą, tada 30% sacharozėje per naktį.Tada sekcijos buvo įterptos į optimalios pjovimo temperatūros junginį (OCT junginį) ir palaipsniui užšaldomos izopentano / sauso ledo vonioje.UŠT įterpimo blokus laikykite -80 °C temperatūroje iki atskyrimo.Skaidrės buvo paruoštos kaip 8 μm storio sekcijos.
Norėdami pašalinti UŠT nuo širdies pjūvių, stiklelius kaitinkite ant šildymo bloko 95 °C temperatūroje 5 minutes.Į kiekvieną stiklelį įpilkite 1 ml PBS ir inkubuokite 30 minučių kambario temperatūroje, tada persmelkite pjūvius nustatydami 0,1% Triton-X PBS 15 minučių kambario temperatūroje.Kad nespecifiniai antikūnai neprisijungtų prie mėginio, į stiklelius įpilkite 1 ml 3% BSA tirpalo ir inkubuokite 1 valandą kambario temperatūroje.Tada BSA buvo pašalintas ir stikleliai plaunami PBS.Kiekvieną pavyzdį pažymėkite pieštuku.Pirminiai antikūnai (atskiesti santykiu 1:200 1 % BSA) (konneksinas 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) ir troponinas-T (Thermo Scientific; #MA5-12960) buvo pridėta per 90 minučių, po to antrinis antibodies1:2%d0 a Fluor 488 (Thermo Scientific; #A16079), prieš triušį Alexa Fluor 594 (Thermo Scientific; #T6391) papildomai 90 minučių. 3 kartus plaunama PBS Norėdami atskirti taikinio dažymąsi nuo fono, kaip kontrolę naudojome tik antrinį antikūną. Galiausiai buvo pridėta DAPI ir branduolio vektorių ir vektorių. ed su nagų laku. -x padidinimas) ir Keyence mikroskopas su 40 kartų padidinimu.
WGA dažymui buvo naudojamas WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) 5 μg/ml PBS ir tepamas ant fiksuotų pjūvių 30 minučių kambario temperatūroje.Tada stikleliai buvo plaunami PBS ir į kiekvieną stiklelį buvo pridėta Sudano juodumo ir inkubuojami 30 minučių.Tada stikleliai buvo plaunami PBS ir pridėta vectashield įterpimo terpė.Skaidrės buvo vizualizuotos Keyence mikroskopu 40 kartų padidinus.
UŠT buvo pašalinta iš mėginių, kaip aprašyta aukščiau.Nuėmę UŠT, stiklelius panardinkite į Bouin tirpalą nakčiai.Tada stikleliai 1 valandą buvo plaunami distiliuotu vandeniu ir 10 minučių dedami į Bibrich alavijo rūgšties fuksino tirpalą.Tada stikleliai buvo plaunami distiliuotu vandeniu ir 10 minučių dedami į 5% fosfomolibdeno / 5% fosfovolframo rūgšties tirpalą.Neplovę stiklelių perkelkite tiesiai į anilino mėlynojo tirpalą 15 minučių.Tada stikleliai plaunami distiliuotu vandeniu ir 2 minutėms dedami į 1% acto rūgšties tirpalą.Plokštelės buvo išdžiovintos 200 N etanolyje ir perkeltos į ksileną.Dažytos skaidrės buvo vizualizuotos naudojant Keyence mikroskopą su 10x objektyvu.Fibrozės ploto procentas buvo kiekybiškai įvertintas naudojant Keyence Analyzer programinę įrangą.
CyQUANT™ MTT ląstelių gyvybingumo tyrimas (Invitrogen, Carlsbad, CA), katalogo numeris V13154, pagal gamintojo protokolą su kai kuriais pakeitimais.Visų pirma, siekiant užtikrinti vienodą audinio dydį atliekant MTT analizę, buvo naudojamas 6 mm skersmens chirurginis perforatorius.Audiniai buvo atskirai dedami į 12 šulinėlių plokštelės, kurioje yra MTT substrato, šulinius pagal gamintojo protokolą.Pjūviai inkubuojami 37 °C temperatūroje 3 valandas, o gyvas audinys metabolizuoja MTT substratą, sudarydamas purpurinį formazano junginį.MTT tirpalą pakeiskite 1 ml DMSO ir inkubuokite 37 °C temperatūroje 15 minučių, kad iš širdies pjūvių išgautumėte purpurinį formazaną.Mėginiai buvo atskiesti 1:10 DMSO 96 šulinėlių skaidraus dugno plokštelėse ir purpurinės spalvos intensyvumas išmatuotas esant 570 nm, naudojant Cytation plokštelių skaitytuvą (BioTek).Rodmenys buvo normalizuoti pagal kiekvieno širdies pjūvio svorį.
Širdies pjūvio terpė buvo pakeista terpėmis, kuriose yra 1 μCi/ml [5-3H]-gliukozės (Moravek Biochemicals, Brea, CA, JAV), kad būtų galima atlikti gliukozės panaudojimo tyrimą, kaip aprašyta anksčiau.Po 4 valandų inkubavimo į atvirą mikrocentrifugos mėgintuvėlį, kuriame yra 100 µl 0,2 N HCl, įpilkite 100 µl terpės.Tada mėgintuvėlis buvo dedamas į scintiliacinį mėgintuvėlį, kuriame yra 500 μl dH2O, kad išgaruotų [3H]2O 72 valandas 37 °C temperatūroje.Tada išimkite mikrocentrifugos mėgintuvėlį iš scintiliacijos mėgintuvėlio ir įpilkite 10 ml scintiliacijos skysčio.Scintiliacijos skaičiavimai buvo atlikti naudojant Tri-Carb 2900TR skysčio scintiliacijos analizatorių (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, JAV).Tada gliukozės panaudojimas buvo apskaičiuojamas atsižvelgiant į [5-3H]-gliukozės specifinį aktyvumą, nepilną pusiausvyrą ir foną, [5-3H]-skiedimą į nepažymėtą gliukozę ir scintiliacijos skaitiklio efektyvumą.Duomenys normalizuojami pagal širdies skyrių masę.
Po audinių homogenizavimo Trizol, RNR buvo išskirta iš širdies sekcijų, naudojant Qiagen miRNeasy Micro Kit #210874 pagal gamintojo protokolą.RNAsec bibliotekos paruošimas, sekos nustatymas ir duomenų analizė buvo atlikti taip:
1 μg RNR vienam mėginiui buvo naudojama kaip pradinė medžiaga RNR bibliotekai paruošti.Sekvenavimo bibliotekos buvo sukurtos naudojant NEBNext UltraTM RNA Library Preparation Kit for Illumina (NEB, JAV) pagal gamintojo rekomendacijas, o prie kiekvieno mėginio atributų sekų buvo pridėti indeksų kodai.Trumpai tariant, mRNR buvo išgryninta iš visos RNR, naudojant magnetines granules, pritvirtintas poli-T oligonukleotidais.Fragmentavimas atliekamas naudojant dvivalečius katijonus aukštoje temperatūroje NEBNext pirmosios krypties sintezės reakcijos buferyje (5X).Pirmoji cDNR grandinė buvo susintetinta naudojant atsitiktinius heksamero pradmenis ir M-MuLV atvirkštinę transkriptazę (RNase H-).Tada antroji kDNR grandinė yra sintetinama naudojant DNR polimerazę I ir RNazę H. Likusieji iškyšos paverčiami bukais galais dėl egzonukleazės/polimerazės aktyvumo.Po DNR fragmento 3′ galo adenilinimo, prie jo pritvirtinamas NEBNext adapteris su plaukų segtuko kilpos struktūra, kad būtų paruošta hibridizacijai.Tinkamo ilgio 150-200 bp cDNR fragmentų atrankai.bibliotekos fragmentai buvo išvalyti naudojant AMPure XP sistemą (Beckman Coulter, Beverly, JAV).Tada 3 μl USER Enzyme (NEB, JAV) su pasirinkta cDNR, susieta su adapteriu, buvo naudojama 15 minučių 37 ° C temperatūroje ir 5 minutes 95 ° C temperatūroje prieš PGR.Tada PGR buvo atlikta naudojant Phusion High-Fidelity DNR polimerazę, universalius PGR pradmenis ir indekso (X) pradmenis.Galiausiai, PGR produktai buvo išgryninti (AMPure XP sistema) ir bibliotekos kokybė įvertinta naudojant Agilent Bioanalyzer 2100 sistemą.Neapdoroti vaizdo failai iš Illumina buvo konvertuoti į neapdorotus skaitymus naudojant CASAVA Base Calling.Neapdoroti duomenys saugomi FASTQ(fq) formato failuose, kuriuose yra skaitymo sekos ir atitinkamos pagrindinės savybės.Pasirinkite HISAT2, kad filtruotų sekos nuskaitymai atitiktų Sscrofa11.1 etaloninį genomą.Apskritai HISAT2 palaiko bet kokio dydžio genomus, įskaitant didesnius nei 4 milijardus bazių genomus, o daugumai parametrų yra nustatytos numatytosios vertės.Sujungimo skaitymai iš RNA Seq duomenų gali būti efektyviai suderinti naudojant HISAT2, greičiausią šiuo metu turimą sistemą, tokiu pačiu arba geresniu tikslumu nei bet kuris kitas metodas.
Transkriptų gausa tiesiogiai atspindi genų ekspresijos lygį.Genų ekspresijos lygiai vertinami pagal transkriptų, susijusių su genomu ar egzonais, gausą.Skaitymų skaičius yra proporcingas genų ekspresijos lygiams, geno ilgiui ir sekos gyliui.Buvo apskaičiuotas FPKM (fragmentai tūkstančiui nuorašo bazinių porų, sekvenuotų milijonui bazinių porų) ir diferencinės išraiškos P vertės buvo nustatytos naudojant DESeq2 paketą.Tada mes apskaičiavome klaidingą aptikimo dažnį (FDR) kiekvienai P reikšmei, naudodami Benjamini-Hochberg metodą9, remiantis integruota R funkcija „p.adjust“.
RNR, išskirta iš širdies pjūvių, buvo konvertuota į cDNR, esant 200 ng/μl koncentracijai, naudojant SuperScript IV Vilo Master mišinį iš Thermo (Thermo, kat. Nr. 11756050).Kiekybinis RT-PGR buvo atliktas naudojant Applied Biosystems Endura Plate Microamp 384 šulinėlių skaidrią reakcijos plokštelę (Thermo, kat. Nr. 4483319) ir mikroampų optinius klijus (Thermo, kat. Nr. 4311971).Reakcijos mišinį sudarė 5 µl Taqman Fast Advanced Master mišinio (Thermo, kat. Nr. 4444557), 0,5 µl Taqman Primer ir 3,5 µl H2O, sumaišyto vienoje duobutėje.Buvo atlikti standartiniai qPCR ciklai, o KT vertės išmatuotos naudojant Applied Biosystems Quantstudio 5 realaus laiko PGR prietaisą (384 šulinėlių modulis; produktas Nr. A28135).„Taqman“ gruntai buvo įsigyti iš „Thermo“ (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06018s) mH), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04243805_u1), visų PDGGH vertės buvo sunormalintos.
NT-ProBNP išsiskyrimas iš terpės buvo įvertintas naudojant NT-ProBNP rinkinį (kiaulę) (kat. Nr. MBS2086979, MyBioSource) pagal gamintojo protokolą.Trumpai tariant, 250 µl kiekvieno mėginio ir standarto buvo įpilta į kiekvieną šulinėlį dviem egzemplioriais.Iš karto po mėginio pridėjimo į kiekvieną šulinėlį įpilkite 50 µl tyrimo reagento A.Švelniai pakratykite plokštę ir užsandarinkite sandarikliu.Tada tabletės buvo inkubuojamos 37 ° C temperatūroje 1 valandą.Tada išsiurbkite tirpalą ir 4 kartus išplaukite šulinėlius 350 µl 1X plovimo tirpalo, kiekvieną kartą inkubuodami plovimo tirpalą 1–2 minutes.Tada į kiekvieną duobutę įpilkite 100 µl tyrimo reagento B ir uždarykite plokštelės sandarikliu.Tabletė švelniai suplakama ir 30 minučių inkubuojama 37°C temperatūroje.Išsiurbkite tirpalą ir 5 kartus išplaukite šulinėlius 350 µl 1X plovimo tirpalo.Į kiekvieną šulinėlį įpilkite 90 µl substrato tirpalo ir uždarykite plokštelę.Inkubuokite plokštelę 37°C temperatūroje 10-20 minučių.Į kiekvieną šulinėlį įpilkite 50 µl stabdymo tirpalo.Plokštelė buvo nedelsiant išmatuota naudojant Cytation (BioTek) plokštelių skaitytuvą, nustatytą 450 nm.
Buvo atlikta galios analizė, siekiant pasirinkti grupės dydžius, kurie suteiks > 80% galios, kad būtų galima nustatyti 10% absoliutų parametro pokytį su 5% I tipo klaidų lygiu. Buvo atlikta galios analizė, siekiant pasirinkti grupės dydžius, kurie suteiks > 80% galios, kad būtų galima nustatyti 10% absoliutų parametro pokytį su 5% I tipo klaidų lygiu. Анализ мощности был выполнен для выбора размеров групп, которые обеспечат >80% мощности для обнаруснеялнен для обнарунежения параметра с 5% частотой ошибок типа I. Buvo atlikta galios analizė, siekiant pasirinkti grupės dydžius, kurie suteiktų > 80% galios, kad būtų galima aptikti 10% absoliutų parametrų pokytį su 5% I tipo klaidų lygiu.进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对瀇变化和5４诤 型进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对瀇变化和5４诤 型 Был проведен анализ мощности для выбора размера группы, который обеспечил бы > 80% мощности для обеспечилоѶ10% обеспечил бы ния параметров и 5% частоты ошибок типа I. Buvo atlikta galios analizė, siekiant pasirinkti grupės dydį, kuris suteiktų > 80% galios, kad būtų galima nustatyti 10% absoliutų parametrų pokytį ir 5% I tipo klaidų dažnį.Audinių sekcijos buvo atsitiktinai parinktos prieš eksperimentą.Visoms statistinėms analizėms atlikti buvo naudojama programinė įranga GraphPad Prism (San Diegas, CA). Visoje statistikoje p reikšmės buvo laikomos reikšmingomis, kai reikšmės <0,05. Visoje statistikoje p vertės buvo laikomos reikšmingomis, kai vertės <0,05. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Visoje statistikoje p vertės buvo laikomos reikšmingomis, kai vertės <0,05.对于所有统计数据，p 值在值<0,05 时被认为是显着的.对于所有统计数据，p 值在值<0,05 时被认为是显着的. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Visoje statistikoje p vertės buvo laikomos reikšmingomis, kai vertės <0,05.Dviejų uodegų Stjudento t testas buvo atliktas naudojant duomenis tik 2 palyginimais.Vienpusė arba dvipusė ANOVA buvo naudojama kelių grupių reikšmingumui nustatyti.Atliekant post hoc testus, Tukey korekcija buvo pritaikyta siekiant atsižvelgti į kelis palyginimus.RNAsec duomenys turi ypatingų statistinių sumetimų apskaičiuojant FDR ir p.adjust, kaip aprašyta skyriuje Metodai.
Daugiau informacijos apie studijų planavimą rasite gamtos tyrimų ataskaitos santraukoje, susietoje su šiuo straipsniu.