Dėkojame, kad apsilankėte Nature.com. Jūsų naudojama naršyklės versija turi ribotą CSS palaikymą. Kad galėtumėte naudotis visomis įmanomomis funkcijomis, rekomenduojame naudoti atnaujintą naršyklę (arba išjungti suderinamumo režimą „Internet Explorer“). Tuo tarpu, siekdami užtikrinti nuolatinį palaikymą, svetainę pateiksime be stilių ir „JavaScript“.
Nauji imunologiniai ir masių spektrometriniai metodai, skirti kompleksiškai analizuoti patvarius oligosacharidus kukurūzų grūduose, apdorotuose AFEX. Lignoceluliozės biomasė yra tvari alternatyva iškastiniam kurui ir plačiai naudojama kuriant biotechnologijas, skirtas tokiems produktams kaip maistas, pašarai, kuras ir cheminės medžiagos gaminti. Šių technologijų raktas yra konkurencingų sąnaudų procesų, skirtų augalų ląstelių sienelėse esantiems kompleksiniams angliavandeniams paversti paprastais cukrumi, tokiais kaip gliukozė, ksilozė ir arabinozė, kūrimas. Kadangi lignoceluliozės biomasė yra labai užsispyrusi, norint gauti norimą produktą, ji turi būti apdorojama termocheminiu būdu (pvz., amoniakiniu pluoštu (AFEX), praskiestomis rūgštimis (DA), joniniais skysčiais (IL)) ir biologiniu būdu (pvz., fermentine hidrolize ir mikrobine fermentacija). Tačiau, kai hidrolizės procese naudojami komerciniai grybeliniai fermentai, tik 75–85 % susidariusių tirpių cukrų yra monosacharidai, o likę 15–25 % yra tirpūs, sunkiai įsisavinami oligosacharidai, kurie ne visada prieinami mikroorganizmams. Anksčiau sėkmingai išskyrėme ir išgryninome tirpius, užsispyrusius oligosacharidus, naudodami anglies ir diatomito atskyrimo bei dydžio išskyrimo chromatografijos derinį, taip pat ištyrėme jų fermentų slopinančias savybes. Nustatėme, kad oligosacharidus, turinčius didesnio polimerizacijos laipsnio (DP) metilintų urono rūgšties pakeitimų, sunkiau apdoroti komerciniais fermentų mišiniais nei mažo DP ir neutralius oligosacharidus. Čia aprašome kelių papildomų metodų, įskaitant glikanų profiliavimą naudojant monokloninius antikūnus (mAb), specifinius augalų biomasės glikanams, siekiant apibūdinti glikanų ryšius augalų ląstelių sienelėse ir fermentiniuose hidrolizatuose, matricos pagalba atliekamą lazerinę desorbcijos jonizaciją, skrydžio laiko masių spektrometriją. MALDI-TOF-MS) naudoja struktūros informatyvius diagnostinius pikus, gautus spektroskopijos būdu po antrinio neigiamų jonų skilimo, dujų chromatografiją ir masių spektrometriją (GC-MS), siekiant apibūdinti oligosacharidų ryšius su derivatizacija ir be jos. Dėl mažo oligosacharidų dydžio (DP 4–20) šias molekules sunku naudoti mAb prisijungimui ir apibūdinimui. Norėdami išspręsti šią problemą, pritaikėme naują biotino konjugacijos pagrindu pagrįstą oligosacharidų imobilizavimo metodą, kuris sėkmingai pažymėjo daugumą mažo DP tirpių oligosacharidų ant mikroplokštelės paviršiaus, o vėliau šis metodas buvo panaudotas didelio našumo monokloninių antikūnų sistemoje specifinės ligavimo analizei. Šis naujas metodas ateityje palengvins pažangesnių didelio našumo gliukozės tyrimų, kurie gali būti naudojami diagnostikos tikslais oligosaccharidams, esantiems biožymenyse, išskirti ir apibūdinti, kūrimą.
Lignoceluliozės biomasė, sudaryta iš žemės ūkio, miškininkystės, žolės ir sumedėjusių medžiagų, yra potenciali žaliava biologinės kilmės produktų, įskaitant maistą, pašarus, kurą ir cheminius pirmtakus, gamybai, siekiant pagaminti didesnės vertės produktus1. Angliavandeniai (pvz., celiuliozė ir hemiceliuliozė), esantys augalų ląstelių sienelėse, cheminio apdorojimo ir biotransformacijos (pvz., fermentinės hidrolizės ir mikrobinės fermentacijos) būdu depolimerizuojami į monosacharidus. Įprasti išankstiniai apdorojimo būdai yra amoniako pluošto išplėtimas (AFEX), praskiesta rūgštis (DA), joninis skystis (IL) ir garų sprogimas (SE), kurių metu naudojamas cheminių medžiagų ir šilumos derinys, siekiant sumažinti lignoceluliozės gamybą atidarant augalų ląstelių sieneles3,4. medžiagos užsispyrimas, 5. Fermentinė hidrolizė atliekama esant dideliam kietosios medžiagos kiekiui, naudojant komercinius aktyvius angliavandenius turinčius fermentus (CAZymes), ir mikrobinė fermentacija naudojant transgenines mieles arba bakterijas, siekiant pagaminti biologinės kilmės kurą ir chemines medžiagas6.
Komerciniuose fermentuose esantys CAZimai sudaryti iš sudėtingo fermentų mišinio, kuris sinergiškai skaido sudėtingus angliavandenių ir cukraus ryšius ir sudaro monosacharidus2,7. Kaip jau minėjome anksčiau, sudėtingas lignino ir angliavandenių aromatinių polimerų tinklas juos daro labai sunkiai apdorojamus, todėl cukrus neperdirbamas, kaupiantis 15–25 % lytinių oligosacharidų, kurie nesusidaro fermentinės hidrolizės metu iš anksto apdorotoje biomasėje. Tai dažna problema, susijusi su įvairiais biomasės išankstinio apdorojimo metodais. Kai kurios šios kliūties priežastys yra fermentų slopinimas hidrolizės metu arba esminių fermentų, reikalingų cukraus jungtims augalinėje biomasėje nutraukti, nebuvimas arba mažas jų kiekis. Cukrų sudėties ir struktūrinių savybių, tokių kaip cukraus jungtys oligosachariduose, supratimas padės mums pagerinti cukraus konversiją hidrolizės metu, todėl biotechnologiniai procesai taps konkurencingi kainos atžvilgiu, palyginti su iš naftos gautais produktais.
Angliavandenių struktūros nustatymas yra sudėtingas ir reikalauja tokių metodų derinio kaip skysčių chromatografija (LC)11,12, branduolinio magnetinio rezonanso spektroskopija (BMR)13, kapiliarinė elektroforezė (CE)14,15,16 ir masių spektrometrija (MS)17. ,aštuoniolika. MS metodai, tokie kaip skrydžio laiko masių spektrometrija su lazerine desorbcija ir jonizacija naudojant matricą (MALDI-TOF-MS), yra universalus angliavandenių struktūrų identifikavimo metodas. Pastaruoju metu natrio jonų aduktų susidūrimo sukeltos disociacijos (CID) tandeminė MS buvo plačiausiai naudojama pirštų atspaudams, atitinkantiems oligosacharidų prisijungimo pozicijas, anomerines konfigūracijas, sekas ir šakojimosi pozicijas, identifikuoti 20, 21.
Glikanų analizė yra puiki priemonė nuodugniai identifikuoti angliavandenių jungtis22. Šis metodas naudoja monokloninius antikūnus (mAb), nukreiptus į augalo ląstelės sienelės glikaną, kaip zondus, siekiant suprasti sudėtingus angliavandenių ryšius. Visame pasaulyje yra daugiau nei 250 mAb, sukurtų prieš įvairius linijinius ir šakotus oligosacharidus, naudojant įvairius sacharidus24. Keletas mAb buvo plačiai naudojami augalo ląstelės sienelės struktūrai, sudėčiai ir modifikacijoms apibūdinti, nes yra reikšmingų skirtumų, priklausomai nuo augalo ląstelės tipo, organo, amžiaus, vystymosi stadijos ir augimo aplinkos25,26. Pastaruoju metu šis metodas buvo naudojamas augalų ir gyvūnų sistemų pūslelių populiacijoms ir jų atitinkamiems vaidmenims glikanų pernašoje, nustatomiems pagal subląstelinius žymenis, vystymosi stadijas arba aplinkos stimulus, suprasti ir fermentiniam aktyvumui nustatyti. Kai kurios iš identifikuotų skirtingų glikanų ir ksilanų struktūrų yra pektinas (P), ksilanas (X), mananas (M), ksilogliukanai (XylG), mišrių jungčių gliukanai (MLG), arabinoksilanas (ArbX), galaktomananas (GalG), gliukurono rūgšties-arabinoksilanas (GArbX) ir arabino-galaktanas (ArbG)29.
Tačiau, nepaisant visų šių tyrimų pastangų, tik keli tyrimai buvo skirti oligosacharidų kaupimosi pobūdžiui didelės kietosios medžiagos koncentracijos (HSL) hidrolizės metu, įskaitant oligosacharidų išsiskyrimą, oligomerų grandinės ilgio pokyčius hidrolizės metu, įvairius mažo DP polimerus ir jų kreivių pasiskirstymą 30, 31, 32. Tuo tarpu, nors glikanų analizė pasirodė esanti naudinga priemonė išsamiai glikanų struktūros analizei, sunku įvertinti vandenyje tirpius mažo DP oligosacharidus naudojant antikūnų metodus. Mažesni DP oligosacharidai, kurių molekulinė masė yra mažesnė nei 5–10 kDa, nesijungia prie ELISA plokštelių 33, 34 ir yra nuplaunami prieš pridedant antikūnų.
Čia pirmą kartą pademonstruojame ELISA tyrimą su avidinu padengtomis plokštelėmis, naudodami monokloninius antikūnus, derindami vieno etapo biotinilinimo procedūrą tirpiems ugniai atspariems oligosacharidams su glikozidų analize. Mūsų glikozidų analizės metodas buvo patvirtintas MALDI-TOF-MS ir GC-MS pagrįstu komplementarių oligosacharidų jungčių tyrimu, naudojant hidrolizuotų cukraus kompozicijų trimetilsililo (TMS) derivatizaciją. Šis novatoriškas metodas ateityje gali būti plėtojamas kaip didelio našumo metodas ir plačiau taikomas biomedicininiuose tyrimuose35.
Posttransliacinės fermentų ir antikūnų modifikacijos, tokios kaip glikozilinimas,36 veikia jų biologinį aktyvumą. Pavyzdžiui, serumo baltymų glikozilinimo pokyčiai vaidina svarbų vaidmenį uždegiminio artrito atveju, o glikozilinimo pokyčiai naudojami kaip diagnostiniai žymenys37. Literatūroje pranešama, kad įvairūs glikanai lengvai pasireiškia sergant įvairiomis ligomis, įskaitant lėtines virškinamojo trakto ir kepenų uždegimines ligas, virusines infekcijas, kiaušidžių, krūties ir prostatos vėžį38,39,40. Glikanų struktūros supratimas naudojant antikūnais pagrįstus glikanų ELISA metodus suteiks papildomo pasitikėjimo diagnozuojant ligas, nenaudojant sudėtingų MS metodų.
Ankstesnis mūsų tyrimas parodė, kad užsispyrę oligosacharidai po išankstinio apdorojimo ir fermentinės hidrolizės liko nehidrolizuoti (1 pav.). Anksčiau paskelbtame darbe sukūrėme aktyvuotos anglies kietosios fazės ekstrakcijos metodą oligosaccharidams išskirti iš AFEX apdoroto kukurūzų grūdų hidrolizato (ACSH)8. Po pradinės ekstrakcijos ir atskyrimo oligosacharidai buvo toliau frakcionuojami dydžio išskyrimo chromatografija (SEC) ir surinkti pagal molekulinę masę. Cukraus monomerai ir oligomerai, išskirti iš įvairių išankstinių apdorojimo būdų, buvo analizuojami cukraus sudėties analize. Lyginant cukraus oligomerų, gautų taikant įvairius išankstinio apdorojimo metodus, kiekį, užsispyrusių oligosacharidų buvimas yra dažna biomasės konversijos į monosacharidus problema ir gali sumažinti cukraus išeigą mažiausiai 10–15 % ir net iki 18 % JAV. Šis metodas naudojamas tolesnei didelio masto oligosacharidų frakcijų gamybai. Gautas ACH ir jo vėlesnės frakcijos, turinčios skirtingą molekulinę masę, buvo naudojamos kaip eksperimentinė medžiaga oligosacharidams apibūdinti šiame darbe.
Po išankstinio apdorojimo ir fermentinės hidrolizės patvarūs oligosacharidai liko nehidrolizuoti. Čia (A) pateiktas oligosacharidų atskyrimo metodas, kurio metu oligosacharidai yra išskiriami iš AFEX apdoroto kukurūzų grūdų hidrolizato (ACSH), naudojant aktyvuotos anglies ir diatomito sluoksnį; (B) Oligosacharidų atskyrimo metodas. Oligosacharidai buvo toliau atskirti dydžio išskyrimo chromatografija (SEC); (C) Sacharidų monomerai ir oligomerai, išskirti po įvairių išankstinių apdorojimo būdų (praskiesta rūgštis: DA, joninis skystis: IL ir AFEX). Fermentinės hidrolizės sąlygos: didelis 25 % (m/m) kietosios medžiagos kiekis (maždaug 8 % gliukanų kiekis), 96 valandų hidrolizė, 20 mg/g komercinio fermento kiekis (Ctec2:Htec2:MP-2:1:1 santykis) ir (D) Cukraus monomerai ir gliukozės, ksilozės ir arabinozės oligomerai, išskirti iš AFEX apdoroto kukurūzų grūdų (ACS).
Glikanų analizė pasirodė esanti naudinga priemonė išsamiai struktūrinei glikanų analizei ekstraktuose, išskirtuose iš kietos biomasės likučių. Tačiau naudojant šį tradicinį metodą, vandenyje tirpūs sacharidai yra nepakankamai reprezentuojami41, nes mažos molekulinės masės oligosacharidus sunku imobilizuoti ELISA plokštelėse ir jie išplaunami prieš pridedant antikūnų. Todėl antikūnų surišimui ir apibūdinimui buvo naudojamas vieno etapo biotinilinimo metodas, skirtas tirpiems, nesuderinamiems oligosaccharidams padengti ant avidinu padengtų ELISA plokštelių. Šis metodas buvo išbandytas naudojant mūsų anksčiau pagamintą ACSH ir frakciją, pagrįstą jo molekuline mase (arba polimerizacijos laipsniu, DP). Vieno etapo biotinilinimas buvo naudojamas oligosacharidų surišimo afinitetui padidinti, pridedant biotino-LC-hidrazido prie redukuojančio angliavandenio galo (2 pav.). Tirpale hemiacetalinė grupė redukuojančiame gale reaguoja su biotino-LC-hidrazido hidrazido grupe ir sudaro hidrazono jungtį. Esant redukuojančiam agentui NaCNBH3, hidrazono jungtis redukuojama iki stabilaus biotinilinto galutinio produkto. Modifikavus cukraus redukcinį galą, tapo įmanoma prie ELISA plokštelių prisijungti mažo DP oligosacharidus, ir mūsų tyrime tai buvo padaryta avidinu padengtose plokštelėse, naudojant glikanus veikiančius monokloninius antikūnus.
Monokloninių antikūnų, nustatytų biotiniluotiems oligosacharidams, atranka ELISA metodu. Čia (A) parodytas oligosacharidų biotinilinimas kartu su ELISA tyrimu su glikanus veikiančiais monokloniniais antikūnais ant NeutrAvidin dengtų plokštelių, ir (B) parodytas vieno etapo reakcijos produktų biotinilinimo procesas.
Avidinu padengtos plokštelės su oligosacharidais konjuguotais antikūnais buvo pridėtos prie pirminių ir antrinių antikūnų ir plaunamos šviesai ir laikui jautrioje terpėje. Kai antikūnai visiškai prisijungia, plokštelė inkubuojama TMB substrato pagalba. Galiausiai reakcija sustabdyta sieros rūgštimi. Inkubuotos plokštelės buvo analizuojamos naudojant ELISA skaitytuvą, siekiant nustatyti kiekvieno antikūno prisijungimo stiprumą ir aptikti antikūnui būdingą kryžminį sujungimą. Išsamesnės informacijos ir eksperimento parametrų ieškokite atitinkamame skyriuje „Medžiagos ir metodai“.
Šio naujai sukurto metodo pritaikomumą specifiniams taikymams demonstruojame apibūdindami tirpius oligosacharidus, esančius ACSH, taip pat neapdorotose ir išgrynintose oligosacharidų frakcijose, išskirtose iš lignoceluliozės hidrolizatų. Kaip parodyta 3 paveiksle, dažniausiai epitopu pakeisti ksilanai, identifikuojami ACSH naudojant bioacilintų glikomų tyrimo metodus, paprastai yra urono (U) arba metilurono (MeU) ir pektino arabinogalaktanai. Dauguma jų buvo aptikti ir ankstesniame mūsų tyrime, kuriame analizuojami nehidrolizuotų kietųjų dalelių (UHS) glikanai43.
Nepaklusnių oligosacharidų epitopų aptikimas naudojant monokloninį antikūną, nukreiptą į ląstelės sienelės glikaną. „Neutrali“ frakcija yra ACN frakcija, o „rūgštinė“ frakcija – FA frakcija. Ryškesnės raudonos spalvos šilumos žemėlapyje rodo didesnį epitopų kiekį, o ryškesnės mėlynos spalvos – tuščią foną. Spalvų vertės skalėje pagrįstos neapdorotomis OD vertėmis formulėms N=2. Pagrindiniai antikūnų atpažįstami epitopai parodyti dešinėje.
Šių neceliuliozės struktūrų negalėjo suskaidyti dažniausiai pasitaikančios celiuliazės ir hemiceliulazės išbandomame komerciniame fermentų mišinyje, į kurį įeina dažniausiai naudojami komerciniai fermentai. Todėl jų hidrolizei reikalingi nauji pagalbiniai fermentai. Be būtinų neceliuliozės pagalbinių fermentų, šios neceliuliozės jungtys neleidžia visiškai virsti monosacharidus, net jei jų pirminiai cukraus polimerai yra intensyviai hidrolizuojami į trumpesnius fragmentus ir ištirpinami naudojant komercinius fermentų mišinius.
Tolesnis signalo pasiskirstymo ir jo surišimo stiprumo tyrimas parodė, kad surišimo epitopų buvo mažiau didelės DP cukraus frakcijose (A, B, C, DP iki 20+) nei mažos DP frakcijose (D, E, F, DP) dimeruose) (1 pav.). Rūgštiniai fragmentai dažniau pasitaiko neceliuliozės epitopuose nei neutralūs fragmentai. Šie reiškiniai atitinka ankstesniame mūsų tyrime pastebėtą modelį, kur didelės DP ir rūgštinės dalys buvo atsparesnės fermentinei hidrolizei. Todėl neceliuliozės glikanų epitopų ir U bei MeU pakeitimų buvimas gali labai prisidėti prie oligosacharidų stabilumo. Reikėtų pažymėti, kad surišimo ir aptikimo efektyvumas gali būti problemiškas mažos DP oligosacharidams, ypač jei epitopas yra dimerinis arba trimerinis oligosacharidas. Tai galima patikrinti naudojant skirtingo ilgio komercinius oligosacharidus, kurių kiekvienas turi tik vieną epitopą, kuris jungiasi prie konkretaus monokloninio antikūno.
Taigi, naudojant struktūrai specifinius antikūnus, buvo atskleisti tam tikri sunkiai besijungiančių ryšių tipai. Priklausomai nuo naudojamo antikūno tipo, tinkamo ligavimo modelio ir jo sukuriamo signalo stiprumo (daugiausia ir mažiausiai gausaus), galima identifikuoti naujus fermentus ir pusiau kiekybiškai pridėti juos prie fermentų mišinio, kad glikokonversija būtų visiškesnė. Analizuojant ACSH oligosacharidus kaip pavyzdį, galime sukurti glikaninių ryšių duomenų bazę kiekvienai biomasės medžiagai. Čia reikėtų atkreipti dėmesį į skirtingą antikūnų afinitetą, o jei jų afinitetas nežinomas, tai sukels tam tikrų sunkumų lyginant skirtingų antikūnų signalus. Be to, glikaninių ryšių palyginimas gali būti geriausias tarp to paties antikūno mėginių. Šiuos sunkiai besijungiančius ryšius galima susieti su CAZyme duomenų baze, iš kurios galime identifikuoti fermentus, pasirinkti kandidatus į fermentus ir tirti ryšius ardančius fermentus arba sukurti mikrobines sistemas šiems fermentams ekspresuoti, kad jie būtų naudojami biorafinavimo gamyklose44.
Norėdami įvertinti, kaip imunologiniai metodai papildo alternatyvius lignoceluliozės hidrolizatuose esančių mažos molekulinės masės oligosacharidų apibūdinimo metodus, atlikome MALDI (4 pav., S1–S8) ir TMS gautų sacharidų analizę, pagrįstą GC-MS, toje pačioje panelėje (5 pav.) oligosacharidų dalyje. MALDI naudojamas norint palyginti, ar oligosacharidų molekulių masės pasiskirstymas atitinka numatytą struktūrą. 4 pav. parodyta neutralių komponentų ACN-A ir ACN-B MC. ACN-A analizė patvirtino pentozių cukrų diapazoną nuo DP 4–8 (4 pav.) iki DP 22 (S1 pav.), kurių svoriai atitinka MeU-ksilano oligosacharidus. ACN-B analizė patvirtino pentozių ir gliukoksilanų serijas su DP 8–15. Papildomoje medžiagoje, pvz., S3 paveiksle, FA-C rūgštinės dalies masės pasiskirstymo žemėlapiuose parodytas (Me)U pakeistų pentozių cukrų, kurių DP yra 8–15, diapazonas, kuris atitinka pakeistus ksilanus, nustatytus ELISA pagrindu atliekant monokloninių antikūnų patikrą. Epitopai yra nuoseklūs.
ACS esančių tirpių nesuderinamų oligosacharidų MALDI-MS spektras. Čia (A) ACN-A mažo svorio frakcijos, turinčios metilintų urono rūgšties (DP 4-8) pakeistų gliukuroksilano oligosacharidų, ir (B) ACN-B ksilanas ir metilinti urono rūgšties oligosacharidai, pakeisti gliukuroksilanu (DP 8-15).
Atsparių ugniai oligosacharidų glikano liekanų sudėties analizė. Čia (A) Įvairių oligosacharidų frakcijų TMS sacharidų sudėtis, gauta naudojant GC-MS analizę. (B) Įvairių TMS būdu gautų cukrų, esančių oligosachariduose, struktūros. ACN – acetonitrilo frakcija, kurioje yra neutralių oligosacharidų, ir FA – ferulo rūgšties frakcija, kurioje yra rūgščiųjų oligosacharidų.
Dar viena įdomi išvada padaryta atlikus oligosacharidų frakcijos LC-MS analizę, kaip parodyta S9 paveiksle (metodus galima pamatyti elektroninėje papildomoje medžiagoje). Liguojant ACN-B frakciją, pakartotinai buvo stebimi heksozės ir -OAc grupių fragmentai. Šis atradimas ne tik patvirtina glikozidų ir MALDI-TOF analizėse pastebėtą fragmentaciją, bet ir suteikia naujos informacijos apie galimus angliavandenių darinius iš anksto apdorotoje lignoceluliozės biomasėje.
Taip pat analizavome oligosacharidų frakcijos cukraus sudėtį, naudodami TMS cukraus derivatizaciją. Naudodami GC-MS, nustatėme neuroninių (nedarinių) ir rūgštinių cukrų (GluA ir GalA) sudėtį oligosacharidų frakcijoje (5 pav.). Gliukurono rūgštis randama rūgštiniuose komponentuose C ir D, o galakturono rūgštis – rūgštiniuose komponentuose A ir B, kurie abu yra rūgštinių cukrų komponentai su dideliu DP. Šie rezultatai ne tik patvirtina mūsų ELISA ir MALDI duomenis, bet ir atitinka ankstesnius oligosacharidų kaupimosi tyrimus. Todėl manome, kad šiuolaikiniai imunologiniai metodai, naudojant oligosacharidų biotinilinimą ir vėlesnį ELISA patikrinimą, yra pakankami tirpiems sunkiai reaguojantiems oligosacharidus aptikti įvairiuose biologiniuose mėginiuose.
Kadangi ELISA pagrįsti monokloninių antikūnų atrankos metodai buvo patvirtinti keliais skirtingais metodais, norėjome toliau ištirti šio naujo kiekybinio metodo potencialą. Buvo įsigyti du komerciniai oligosacharidai, ksiloheksasacharidų oligosacharidas (XHE) ir 23-α-L-arabinofuranozil-ksilotriozė (A2XX), ir išbandyti naudojant naują monokloninių antikūnų metodą, nukreiptą į ląstelės sienelės glikaną. 6 paveiksle parodyta tiesinė koreliacija tarp biotinilinto prisijungimo signalo ir oligosacharidų koncentracijos logaritminės koncentracijos, rodanti galimą Langmuiro adsorbcijos modelį. Iš monokloninių antikūnų CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148 ir CCRC-M151 koreliavo su XHE, o CCRC-M108, CCRC-M109 ir LM11 koreliavo su A2XX 1 nm iki 100 nano diapazone. Dėl riboto antikūnų prieinamumo eksperimento metu su kiekviena oligosacharidų koncentracija buvo atlikta ribotas eksperimentų skaičius. Reikėtų pažymėti, kad kai kurie antikūnai labai skirtingai reaguoja į tą patį oligosacharidą kaip substratą, tikriausiai dėl to, kad jie jungiasi prie šiek tiek skirtingų epitopų ir gali turėti labai skirtingą jungimosi afinitetą. Tikslaus epitopų identifikavimo mechanizmai ir pasekmės bus daug sudėtingesnės, kai naujas monokloninių antikūnų metodas bus taikomas realiems mėginiams.
Įvairių glikanus veikiančių monokloninių antikūnų aptikimo diapazonui nustatyti buvo naudojami du komerciniai oligosacharidai. Čia tiesinė koreliacija su oligosacharidų koncentracijos logaritmu rodo Langmuiro adsorbcijos modelius (A) XHE su monokloniniu antikūnu ir (B) A2XX su monokloniniu antikūnu. Atitinkami epitopai rodo komercinių oligosacharidų, naudotų kaip substratai tyrime, struktūras.
Glikanus veikiančių monokloninių antikūnų naudojimas (glikokominė analizė arba ELISA pagrįsta monokloninių antikūnų patikra) yra galinga priemonė nuodugniai apibūdinti daugumą pagrindinių ląstelės sienelės glikanų, sudarančių augalų biomasę. Tačiau klasikinė glikanų analizė apibūdina tik didesnius ląstelės sienelės glikanus, nes dauguma oligosacharidų nėra efektyviai imobilizuojami ELISA plokštelėse. Šiame tyrime AFEX apdorotas kukurūzų kumpis buvo fermentiškai hidrolizuojamas esant dideliam sausųjų medžiagų kiekiui. Cukraus analizė buvo naudojama siekiant nustatyti hidrolizate esančių nepaklusnių ląstelės sienelės angliavandenių sudėtį. Tačiau mažesnių oligosacharidų monokloninių antikūnų analizė hidrolizatuose yra nepakankamai įvertinta, todėl norint efektyviai imobilizuoti oligosacharidus ELISA plokštelėse, reikia papildomų įrankių.
Čia aprašome naują ir efektyvų oligosacharidų imobilizavimo metodą monokloninių antikūnų patikrai, derinant oligosacharidų biotinilinimą ir ELISA patikrą ant „NeutrAvidin™“ padengtų plokštelių. Imobilizuoti biotinilinti oligosacharidai parodė pakankamą afinitetą antikūnui, kad būtų galima greitai ir efektyviai aptikti sunkiai reaguojančius oligosacharidus. Šių užsispyrusių oligosacharidų sudėties analizė, pagrįsta masių spektrometrija, patvirtino šio naujo imunoskreeningo metodo rezultatus. Taigi, šie tyrimai rodo, kad oligosacharidų biotinilinimo ir ELISA patikros su glikanus veikiančiais monokloniniais antikūnais derinys gali būti naudojamas oligosacharidų kryžminėms jungtims aptikti ir gali būti plačiai taikomas kituose biocheminiuose tyrimuose, apibūdinančiuose oligosacharidų struktūrą.
Šis biotino pagrindu sukurtas glikanų profiliavimo metodas yra pirmoji ataskaita, galinti ištirti tirpių oligosacharidų, esančių augalinėje biomasėje, sunkiai prisitaikančius angliavandenių ryšius. Tai padeda suprasti, kodėl kai kurios biomasės dalys yra tokios užsispyrusios biokuro gamyboje. Šis metodas užpildo svarbią glikozidų analizės metodų spragą ir išplečia jo taikymą platesniam substratų spektrui, neapsiribojant augaliniais oligosaccharidais. Ateityje galime naudoti robotiką biotinilinimui ir naudoti mūsų sukurtą metodą didelio našumo mėginių analizei naudojant ELISA.
Iš Pioneer 33A14 hibrido sėklų išauginti kukurūzų šiaudai (KS) buvo nuimti 2010 m. iš Kramer ūkių Rėjuje, Kolorado valstijoje. Gavus žemės savininko leidimą, ši biomasė gali būti naudojama tyrimams. Mėginiai buvo laikomi sausoje vietoje, < 6 % drėgmės, užsegamuose maišeliuose kambario temperatūroje. Mėginiai buvo laikomi sausoje vietoje, < 6 % drėgmės, užsegamuose maišeliuose kambario temperatūroje. Образцы хранились сухими при влажности < 6% в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре. Mėginiai buvo laikomi sausoje vietoje, kambario temperatūroje, esant <6 % drėgmei, užsegamuose maišeliuose.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中.样品在室温下以干燥< 6 % Образцы хранят в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре с влажностью < 6%. Mėginiai laikomi užtraukiamuose maišeliuose kambario temperatūroje, kai drėgmė < 6 %.Tyrimas atitiko vietines ir nacionalines gaires. Sudėties analizė atlikta naudojant NREL protokolą. Nustatyta, kad sudėtyje yra 31,4 % gliukano, 18,7 % ksilano, 3,3 % arabinano, 1,2 % galaktano, 2,2 % acetilo, 14,3 % lignino, 1,7 % baltymų ir 13,4 % pelenų.
„Cellic® CTec2“ (138 mg baltymų/ml, partija VCNI 0001) yra sudėtingas celiulazės, β-gliukozidazės ir „Cellic® HTec2“ (157 mg baltymų/ml, partija VHN00001) mišinys iš „Novozymes“ (Franklintonas, Šiaurės Karolina, JAV)). „Mulfect Pectinase®“ (72 mg baltymų/ml) – sudėtingas pektinus skaidančių fermentų mišinys – buvo padovanotas „DuPont Industrial Biosciences“ (Palo Alto, Kalifornija, JAV). Fermentų baltymų koncentracijos buvo nustatytos įvertinant baltymų kiekį (ir atimant nebaltyminio azoto indėlį) naudojant Kjeldalio azoto analizę (AOAC metodas 2001.11, „Dairy One Cooperative Inc.“, Itaka, Niujorkas, JAV). Diatomitas 545 buvo įsigytas iš „EMD Millipore“ (Billerica, Masačusetsas). Aktyvuota anglis (DARCO, 100 akių granulės), Avicel (PH-101), buko ksilanas ir visos kitos cheminės medžiagos buvo įsigytos iš „Sigma-Aldrich“ (Sent Luisas, Misūris).
AFEX išankstinis apdorojimas buvo atliktas GLBRC (Biomasės konversijos tyrimų laboratorija, MSU, Lansingas, MI, JAV). Išankstinis apdorojimas buvo atliktas 140 °C temperatūroje 15 minučių. 46 rezidavimo laikas, kai bevandenio amoniako ir biomasės santykis buvo 1:1, o įkrova buvo 60 % (m/m), nerūdijančio plieno stacionariame periodiniame reaktoriuje („Parr Instruments Company“). Tai truko 30 minučių. Reaktorius buvo įkaitintas iki 140 °C, ir amoniakas buvo greitai išleistas, todėl biomasė greitai sugrįžo į kambario temperatūrą. AFEX iš anksto apdorotos kukurūzų krūvos (ACS) sudėtis buvo panaši į neapdorotos kukurūzų krūvos (UT-CS).
Didelės kietosios medžiagos koncentracijos ACSH 25 % (m/m) (maždaug 8 % dekstrano) buvo paruoštas kaip pradinė medžiaga didelio masto oligosacharidų gamybai. ACS fermentinė hidrolizė buvo atlikta naudojant komercinį fermentų mišinį, įskaitant Cellic® Ctec2 10 mg baltymų/g gliukano (iš anksto apdorotoje biomasėje), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 mg baltymų/g gliukano ir Multifect Pectinase (Genencor Inc, JAV). ), 5 mg baltymų/g dekstrano. Fermentinė hidrolizė buvo atlikta 5 litrų bioreaktoriuje, kurio darbinis tūris buvo 3 litrai, pH 4,8, 50 °C ir 250 aps./min. Po 96 valandų hidrolizės hidrolizatas buvo surenkamas centrifuguojant 6000 aps./min. greičiu 30 minučių, o po to 14000 aps./min. greičiu 30 minučių, kad būtų pašalintos nehidrolizuotos kietosios medžiagos. Tada hidrolizatas buvo steriliai filtruojamas per 0,22 mm filtro stiklinę. Filtruotas hidrolizatas buvo laikomas steriliuose buteliuose 4 °C temperatūroje ir po to frakcionuojamas ant anglies.
Ekstraktų pagrindu gautų biomasės mėginių sudėties analizė pagal NREL laboratorinės analizės procedūras: mėginių paruošimas sudėties analizei (NREL/TP-510-42620) ir struktūrinių angliavandenių bei lignino nustatymas biomasėje (NREL/TP-510–42618)47.
Hidrolizato srauto oligosacharidų analizė atlikta 2 ml masteliu, naudojant autoklavo pagrindu veikiantį rūgštinės hidrolizės metodą. Hidrolizato mėginys sumaišomas su 69,7 µl 72 % sieros rūgšties 10 ml talpos kultivavimo mėgintuvėlyje su užsukamu dangteliu ir inkubuojamas 1 val. ant stalo 121 °C temperatūroje, atvėsinamas ant ledo ir filtruojamas į efektyviosios skysčių chromatografijos (HPLC) buteliuką. Oligosacharidų koncentracija nustatyta iš bendros cukraus koncentracijos rūgštimi hidrolizuotame mėginyje atėmus monosacharidų koncentraciją nehidrolizuotame mėginyje.
Rūgštimi hidrolizuotoje biomasėje gliukozės, ksilozės ir arabinozės koncentracijos buvo analizuojamos naudojant „Shimadzu HPLC“ sistemą su automatiniu mėginių ėmikliu, kolonėlės šildytuvu, izokratiniu siurbliu ir lūžio rodiklio detektoriumi, naudojant „Bio-Rad Aminex HPX-87H“ kolonėlę. Kolonėlė buvo palaikoma 50 °C temperatūroje ir eliuojama 0,6 ml/min. 5 mM H2SO4 vandens srautu.
Hidrolizato supernatantas buvo praskiestas ir išanalizuotas dėl monomerų ir oligosacharidų kiekio. Po fermentinės hidrolizės gauti monomeriniai cukrūs buvo analizuojami HPLC metodu, naudojant „Bio-Rad“ (Hercules, CA) „Aminex HPX-87P“ kolonėlę ir pelenų apsauginę kolonėlę. Kolonėlės temperatūra buvo palaikoma 80 °C, vanduo buvo naudojamas kaip judanti fazė, srauto greitis – 0,6 ml/min. Oligosacharidai buvo nustatyti hidrolizės būdu praskiestoje rūgštyje 121 °C temperatūroje pagal 41, 48, 49 nuorodose aprašytus metodus.
Sacharidų analizė atlikta su neapdorotais, AFEX apdorotais ir visais nehidrolizuotais biomasės likučiais (įskaitant serijinių ląstelių sienelių ekstraktų gamybą ir jų monokloninių antikūnų atranką), naudojant anksčiau aprašytas procedūras 27, 43, 50, 51. Glikomo analizei iš biomasės likučių paruošiami alkoholyje netirpūs augalo ląstelių sienelių medžiagos likučiai ir nuosekliai ekstrahuojami vis agresyvesniais reagentais, tokiais kaip amonio oksalatas (50 mM), natrio karbonatas (50 mM ir 0,5 % m/t), CON. (1 M ir 4 M, abu su 1 % m/t natrio borohidridu) ir rūgšties chloritas, kaip aprašyta anksčiau 52,53. Tada ekstraktai buvo analizuojami ELISA metodu, naudojant kompleksinę monokloninių antikūnų 50 plokštę, nukreiptą į ląstelės sienelės glikaną, o monokloninių antikūnų prisijungimo reakcijos pateiktos kaip šilumos žemėlapis. Monokloniniai antikūnai, nukreipti į augalo ląstelių sienelės glikaną, buvo įsigyti iš laboratorinių atsargų (CCRC, JIM ir MAC serijos).
Vieno etapo oligosacharidų biotinilinimas. Angliavandenių konjugacija su biotino-LC-hidrazidu buvo atlikta pagal šią procedūrą. Biotino-LC-hidrazidas (4,6 mg/12 μmol) buvo ištirpintas dimetilsulfokside (DMSO, 70 μl) intensyviai maišant ir kaitinant 65 °C temperatūroje 1 min. Buvo pridėta ledinės acto rūgšties (30 µl) ir mišinys supiltas ant natrio cianoborohidrido (6,4 mg/100 µmol) ir visiškai ištirpintas po kaitinimo 65 °C temperatūroje apie 1 minutę. Tada į džiovintą oligosacharidą (1–100 nmol) buvo įpilta nuo 5 iki 8 μl reakcijos mišinio, kad būtų gautas 10 kartų ar didesnis molinis žymės perteklius, palyginti su redukuojančiu galu. Reakcija buvo vykdoma 65 °C temperatūroje 2 val., po to mėginiai buvo nedelsiant išgryninti. Žymėjimo eksperimentuose natrio cianoborohidridas nebuvo naudojamas be redukcijos, o mėginiai buvo reaguojami 65 °C temperatūroje 2,5 valandos.
Biotinilintų oligosacharidų mėginių padengimas ELISA metodu ir plovimas. Į kiekvieną avidinu padengtos plokštelės šulinėlį buvo įpilta 25 μl biotinilintų mėginių (100 μl kiekvieno koncentruoto mėginio, praskiesto 5 ml 0,1 M Tris buferinio tirpalo (TBS)). Kontrolinės šulinėliai buvo padengti 50 μl biotino, kurio koncentracija 10 μg/ml 0,1 M TBS tirpale. Tuštiesiems matavimams danga buvo naudojamas dejonizuotas vanduo. Tabletė buvo inkubuojama 2 valandas kambario temperatūroje tamsoje. Plokštelė 3 kartus plaunama 0,1 % nugriebto pieno tirpalu 0,1 M TBS tirpale, naudojant 11 programą, skirtą Grenier 3A plokštei.
Pirminių antikūnų pridėjimas ir plovimas. Į kiekvieną šulinėlį įpilkite 40 µl pirminio antikūno. Mikroplokštelę inkubuokite 1 valandą kambario temperatūroje tamsoje. Tada plokštelės buvo 3 kartus plaunamos 0,1 % pienu 0,1 M TBS tirpale, naudojant 11 plovimo programą, skirtą „Grenier Flat 3A“.
Įpilkite antrinio antikūno ir nuplaukite. Į kiekvieną šulinėlį įpilkite po 50 µl pelės/žiurkės antrinio antikūno (praskiedimo santykiu 1:5000 0,1 % piene, ištirpintame 0,1 M TBS tirpale). Mikroplokštelę inkubuokite 1 valandą kambario temperatūroje tamsoje. Tada mikroplokštelės buvo 5 kartus plaunamos 0,1 % pienu, ištirpintu 0,1 M TBS tirpale, naudojant „Grenier Flat 5A“ plokštelių plovimo programą Nr. 12.
Substrato įdėjimas. Į bazinį substratą įlašinkite 50 µl 3,3′,5,5′-tetrametilbenzidino (TMB) (įlašinant 2 lašus buferio, 3 lašus TMB, 2 lašus vandenilio peroksido į 15 ml dejonizuoto vandens). Paruoškite TMB substratą ir prieš naudojimą suplakite sūkuriniame maišytuve. Inkubuokite mikroplokštelę kambario temperatūroje 30 minučių. Tamsoje.
Užbaikite šį veiksmą ir nuskaitykite tabletę. Į kiekvieną šulinėlį įpilkite 50 µl 1 N sieros rūgšties ir ELISA skaitytuvu užrašykite absorbciją nuo 450 iki 655 nm.
Paruoškite šių analitų 1 mg/ml tirpalus dejonizuotame vandenyje: arabinozės, ramnozės, fukozės, ksilozės, galakturono rūgšties (GalA), gliukurono rūgšties (GlcA), manozės, gliukozės, galaktozės, laktozės, N-acetilmanozamino (manNAc), N-acetilgliukozamino (glcNAc), N-acetilgalaktozamino (galNAc), inozitolio (vidinio standarto). Du standartai buvo paruošti įpilant 1 mg/ml cukraus tirpalų, parodytų 1 lentelėje. Mėginiai užšaldomi ir liofilizuojami -80 °C temperatūroje, kol pašalinamas visas vanduo (paprastai apie 12–18 valandų).
Į analitinių svarstyklių mėgintuvėlius su užsukamais dangteliais įpilkite 100–500 µg mėginio. Užrašykite įpiltą kiekį. Geriausia mėginį ištirpinti tam tikros koncentracijos tirpiklyje ir įpilti į mėgintuvėlį kaip skystą alikvotinę dalį. Kiekvienam mėgintuvėliui kaip vidinį standartą naudokite 20 µl 1 mg/ml inozitolio. Į mėginį įpilamo vidinio standarto kiekis turi būti toks pat, kaip ir į standartinį mėgintuvėlį įpilamo vidinio standarto kiekis.
Į buteliuką su užsukamu dangteliu įpilkite 8 ml bevandenio metanolio. Tada įpilkite 4 ml 3 N metanolio HCl tirpalo, užsukite ir suplakite. Šiame procese vanduo nenaudojamas.
Į oligosacharidų mėginius ir standartinius TMS mėgintuvėlius įpilkite 500 µl 1 M HCl metanolio tirpalo. Mėginiai buvo inkubuojami per naktį (168 valandas) 80 °C temperatūroje terminiame bloke. Metanolizės produktas džiovinamas kambario temperatūroje naudojant džiovinimo kolektorių. Įpilkite 200 µl MeOH ir vėl išdžiovinkite. Šis procesas kartojamas du kartus. Į mėginį įpilkite 200 µl metanolio, 100 µl piridino ir 100 µl acto rūgšties anhidrido ir gerai išmaišykite. Mėginiai buvo inkubuojami kambario temperatūroje 30 minučių ir džiovinami. Įpilkite 200 µl metanolio ir vėl išdžiovinkite.
Įpilkite 200 µl Tri-Sil ir uždenkite mėgintuvėlį 20 minučių. Kaitinkite iki 80 °C, tada atvėsinkite iki kambario temperatūros. Mėginį toliau išdžiovinkite džiovinimo kolektoriumi iki maždaug 50 µl tūrio. Svarbu atkreipti dėmesį, kad neleidome mėginiams visiškai išdžiūti.
Įpilkite 2 ml heksano ir gerai išmaišykite sūkuriniu maišytuvu. Užpildykite Pastero pipečių (5–8 mm) galiukus stiklo vatos gabalėliu, įkišdami stiklo vatą ant 5-3/4 colio skersmens pipetės viršaus. Mėginiai buvo centrifuguojami 3000 g greičiu 2 minutes. Bet kokios netirpios liekanos nusodinamos. Mėginys išdžiovinamas iki 100–150 µl. Maždaug 1 μl tūris buvo įšvirkštas į GC-MS, esant pradinei 80 °C temperatūrai ir 2,0 minučių centrifugavimo laikui (2 lentelė).