Paldies, ka apmeklējāt vietni Nature.com.Jūsu izmantotajai pārlūkprogrammas versijai ir ierobežots CSS atbalsts.Lai nodrošinātu vislabāko pieredzi, iesakām izmantot atjauninātu pārlūkprogrammu (vai izslēgt saderības režīmu pārlūkprogrammā Internet Explorer). Tikmēr, lai nodrošinātu nepārtrauktu atbalstu, vietne tiks rādīta bez stiliem un JavaScript.
Cilvēka zarnu morfoģenēze nosaka 3D epitēlija mikroarhitektūras un telpiskās organizācijas kriptovīksnes iezīmes. Šī unikālā struktūra ir nepieciešama, lai uzturētu zarnu homeostāzi, aizsargājot cilmes šūnu nišu bazālajā kriptā no eksogēniem mikrobu antigēniem un to metabolītiem. Turklāt uz zarnu funkcionālām barjerām ir dažādas aizsargājošas gļotādas šūnas ar epitēlija virsmu, kas izdala dažādas gļotādas šūnas. .Tādēļ 3D epitēlija struktūru atjaunošana ir ļoti svarīga in vitro zarnu modeļu konstruēšanā.Jo īpaši, organiskās mimētiskās zarnas uz mikroshēmas var izraisīt zarnu epitēlija spontānu 3D morfoģenēzi ar uzlabotām fizioloģiskām funkcijām un biomehāniku. Šeit mēs reproducējami morfogēno protokolu nodrošinām. t mikrofluidiskā mikroshēmā, kā arī Transvela iegultā hibrīda mikroshēmā. Mēs aprakstām detalizētas metodes ierīces izgatavošanai, Caco-2 vai zarnu organoīdu epitēlija šūnu kultivēšanai parastos apstākļos, kā arī mikrofluidiskā platformā, 3D morfoģenēzes indukcijai un izveidoto 3D epitēlija funkcionālo prototēliju raksturojumu. Šī mikrokologēno epitēlija funkcionālās kontroles modifikācija nodrošina vairākkārtēju attēlveidošanas attēlveidošanu. šķidruma plūsma uz 5 d.Mūsu in vitro morfoģenēzes metode izmanto fizioloģiski nozīmīgu bīdes spriegumu un mehānisko kustību, un tai nav nepieciešama sarežģīta šūnu inženierija vai manipulācijas, kas var pārspēt citas esošās metodes. Mēs paredzam, ka mūsu piedāvātajam protokolam varētu būt plaša ietekme uz biomedicīnas pētniecības kopienu, nodrošinot metodi 3D zarnu trakta atjaunošanai, klīniskiem, in vitro un farmaceitiskiem epitēlija slāņiem.
Eksperimenti parāda, ka zarnu epitēlija Caco-2 šūnas, kas kultivētas zarnās uz mikroshēmas 1, 2, 3, 4, 5 vai divslāņu mikrofluidiskajās ierīcēs6, 7, var iziet spontānu 3D morfoģenēzi in vitro bez skaidras izpratnes par pamatā esošo mehānismu. Mūsu nesenajā pētījumā mēs atklājām, ka pietiekama bazogēnās un antagonistiskās sekrēcijas morfogēnās kultūras noņemšana no inthe-chip ierīcēm ir nepieciešama. esis in vitro, ko pierādīja Caco-2 un pacientu iegūtie zarnu organoīdi.Tika apstiprinātas epitēlija šūnas. Šajā pētījumā mēs īpaši koncentrējāmies uz spēcīga Wnt antagonista Dickkopf-1 (DKK-1) šūnu veidošanos un koncentrācijas sadalījumu zarnās uz mikroshēmas un modificētās mikrofluidiskās ierīcēs, kas satur Transvela ieliktņus, ko sauc par "hibrīda mikroshēmu". Mēs demonstrējam, ka tiek pievienoti eksogēni Wnt saistītu antagonisti (piemēram, Wnt, S-Presed proteīns vai 11nt, DKK-1zz). oggy-1) uz mikroshēmas zarnām inhibē morfoģenēzi vai izjauc iepriekš strukturēto 3D epitēlija slāni, kas liecina, ka antagonistisks stress kultivēšanas laikā ir atbildīgs par zarnu morfoģenēzi in vitro. Tāpēc praktiska pieeja, lai panāktu spēcīgu morfoģenēzi epitēlija saskarnē, ir likvidēt vai minimāli uzturēt flucijas antagonistu aktīvās daļas līmeni. -on-a-chip vai hibrīda-on-a-chip platformas) vai difūzijas .Bazolaterālās vides (piem., no Transvela ieliktņiem lielos bazolaterālos rezervuāros akās).
Šajā protokolā mēs piedāvājam detalizētu metodi mikroierīču zarnās mikroshēmā un ar Transvela ievietojamu hibrīdu mikroshēmu izgatavošanai (1.–5. darbība), lai kultivētu zarnu epitēlija šūnas uz porainām membrānām, kuru pamatā ir polidimetilsiloksāns (PDMS) (6.A, 7A, 8., 9. darbība) vai poliestera membrānām (7, 6, 9, 8 spēļu ieliktņiem). 3D morfoģenēze in vitro (10. darbība). Mēs arī identificējām šūnu un molekulārās pazīmes, kas liecina par audu specifisku histoģenēzi un no ciltsrakstiem atkarīgu šūnu diferenciāciju, izmantojot vairākas attēlveidošanas metodes (11.-24. darbība). Mēs ierosinām morfoģenēzi, izmantojot cilvēka zarnu epitēlija šūnas ar porveida šūnu kultūru, piemēram, membrānas virsmas modifikāciju, piemēram, divu orgānu virsmas modifikāciju, intest intest Cainal-2. s, 2D monoslāņu izveidošana un zarnu bioķīmiskā un biomehāniskās mikrovides reproducēšana.in vitro.Lai izraisītu 3D morfoģenēzi no 2D epitēlija monoslāņiem, mēs noņēmām morfogēnu antagonistus abās kultivētajās formās, iepludinot barotni izmantotā slāņa daļā, kas var būt kultūras slāņa reģenerācija. lai modelētu no morfogēniem atkarīgu epitēlija augšanu, garenvirziena saimnieka un mikrobioma kopkultūras, patogēnu infekciju, iekaisuma bojājumus, epitēlija barjeras disfunkciju un uz probiotikām balstītas terapijas Piemērs.ietekmes.
Mūsu protokols var būt noderīgs plašam zinātnieku lokam fundamentālajā (piemēram, zarnu gļotādas bioloģijā, cilmes šūnu bioloģijā un attīstības bioloģijā) un lietišķajos pētījumos (piemēram, preklīniskajos zāļu testos, slimību modelēšanā, audu inženierijā un gastroenteroloģijā). Tā kā mūsu protokols ir reproducējams un noturīgs, lai ierosinātu 3D epidēmijas morfovīzijas tehnisko stratēģiju, mūsu protokols izplatīta auditorijai, kas pēta šūnu signālu dinamiku zarnu attīstības, reģenerācijas vai homeostāzes laikā. Turklāt mūsu protokols ir noderīgs, lai noskaidrotu infekciju, ko izraisa dažādi infekcijas izraisītāji, piemēram, norovīruss 8, smags akūts respiratorais sindroms koronavīruss 2 (SARS-CoV-2), Clostridium Vibrificile, Tybrichoraere.Slimību patoloģijas un patoģenēzes auditorijas ir arī noderīgas.Uz mikroshēmas iebūvētas zarnu mikrofizioloģijas sistēmas izmantošana var ļaut veikt garenvirziena kopkultūru 10 un pēc tam novērtēt saimniekorganisma aizsardzību, imūnās atbildes reakcijas un ar patogēniem saistītu traumu labošanu gastrointestinālajā (GI) traktā 11 .Citi GI traucējumi, kas saistīti ar leaky gut slimība, poceliuchitis coli slimība, poceliuchrits slimība,,, spējīgu zarnu sindromu var simulēt, ja tiek sagatavoti 3D zarnu epitēlija slāņi, izmantojot pacienta 3D zarnu epitēlija slāņus, šīs slimības ietver bārkstiņu atrofiju, kriptu saīsināšanos, gļotādas bojājumus vai traucētu epitēlija barjeru. skudru šūnu tipi, piemēram, pacientu perifēro asiņu mononukleārās šūnas (PBMC), modeļiem, kas satur 3D zarnu villus-kriptu mikroarhitektūras.audu specifiskās imūnās šūnas, 5.
Tā kā 3D epitēlija mikrostruktūru var fiksēt un vizualizēt bez sadalīšanas procesa, skatītājus, kas strādā ar telpisko transkriptomiku un augstas izšķirtspējas vai superizšķirtspējas attēlveidošanu, var interesēt mūsu gēnu un olbaltumvielu spatiotemporālās dinamikas kartēšana epitēlija nišās.Interesē tehnoloģija.Reakcija uz mikrobu vai imūnsistēmas stimuliem.Turklāt garengriezuma saimnieka-mikrobioma šķērsruna 10, 14, kas koordinē zarnu homeostāzi, var tikt izveidota 3D zarnu gļotādas slānī, kopīgi kultivējot dažādas mikrobu sugas, mikrobu kopienas vai fekāliju mikrobiotos.platformā.Šī pieeja ir īpaši pievilcīga auditorijai, kas pēta gļotādas imunoloģiju, gastroenteroloģiju, cilvēka mikrobiomu, kulturomiku un klīnisko mikrobioloģiju, lai laboratorijā kultivētu iepriekš nekulturētu zarnu mikrobiotu. Ja mūsu in vitro morfoģenēzes protokolu var pielāgot mērogojamiem kultūras formātiem, piemēram, nepārtrauktiem 3-laterāliem ieliktņiem. Protokolu var izplatīt arī tiem, kas izstrādā farmācijas, biomedicīnas vai augstas caurlaidības skrīninga vai validācijas platformas pārtikas rūpniecībai. Lai pierādītu principu, mēs nesen parādījām, ka ir iespējama multipleksa augstas caurlaidspējas morfoģenēzes sistēma, kas mērogojama līdz 24 iedobju plates formātam. Mūsu in vitro morfoģenēzes metodi var paātrināt un, iespējams, pieņemt daudzas pētniecības laboratorijas, nozares vai valdības un regulatīvās aģentūras, lai izprastu in vitro zarnu morfoģenēzes šūnu pārprogrammēšanu transkripta līmenī, lai pārbaudītu zāles vai bioterapijas līdzekļus. zarnu morfoģenēzes process.
Lai pētītu zarnu epitēlija morfoģenēzi, ir izmantots ierobežots skaits ar cilvēkiem saistītu eksperimentālu modeļu, galvenokārt tāpēc, ka trūkst ieviešamu protokolu 3D morfoģenēzes ierosināšanai in vitro. Patiesībā liela daļa pašreizējo zināšanu par zarnu morfoģenēzi ir balstīta uz pētījumiem ar dzīvniekiem (piemēram, zebrazivis20, peles21 vai vistas var būt darbietilpīgas21 vai vistas). un, pats galvenais, precīzi nenosaka cilvēka attīstības procesus. Šo modeļu iespējas ir arī ļoti ierobežotas, lai tos pārbaudītu daudzpusēji mērogojamā veidā. Tāpēc mūsu protokols 3D audu struktūru atjaunošanai in vitro pārspēj in vivo dzīvnieku modeļus, kā arī citus tradicionālos statiskos 2D šūnu kultūras modeļus. Kā aprakstīts iepriekš, izmantojot 3D atšķirīgās kriptošūnu lokālās spailizācijas struktūras. reaģējot uz dažādiem gļotādas vai imūnsistēmas stimuliem.3D epitēlija slāņi var nodrošināt telpu, lai izpētītu, kā mikrobu šūnas sacenšas, veidojot telpiskās nišas, un ekoloģisko evolūciju, reaģējot uz saimniekfaktoriem (piemēram, iekšējie un ārējie gļotu slāņi, IgA un pretmikrobu peptīdu sekrēcija). enerģiski ražo mikrobu metabolītus (piemēram, īsās ķēdes taukskābes), kas veido šūnu organizāciju un cilmes šūnu nišas bazālajās kriptās. Šīs pazīmes var parādīt tikai tad, kad in vitro ir izveidoti 3D epitēlija slāņi.
Papildus mūsu 3D zarnu epitēlija struktūru izveides metodei ir arī vairākas in vitro metodes.Zarnu organoīdu kultūra ir mūsdienīga audu inženierijas tehnika, kuras pamatā ir zarnu cilmes šūnu kultivēšana īpašos morfogēna apstākļos23,24,25.Tomēr 3D organoīdu modeļu izmantošana transporta analīzē vai kopkultūras biomātiskajai analīzei bieži ir Tas ir iekļauts organoīdā, un tāpēc luminālo komponentu, piemēram, mikrobu šūnu vai eksogēnu antigēnu, ievadīšana ir ierobežota.Piekļuvi organoīdiem lūmeniem var uzlabot, izmantojot mikroinžektoru,26,27 taču šī metode ir invazīva un darbietilpīga, un tās veikšanai ir nepieciešamas specializētas zināšanas.Turklāt tradicionālās organoīdu kultūras, kas tiek uzturētas hidrogēla sastatnēs statiskos apstākļos, precīzi neatspoguļo aktīvo in vivo biomehāniku.
Citas pieejas, ko izmanto vairākas pētniecības grupas, izmanto iepriekš strukturētas 3D hidrogēla sastatnes, lai atdarinātu zarnu epitēlija struktūru, kultivējot izolētas cilvēka zarnu šūnas uz gēla virsmas. Izgatavojiet hidrogēla sastatnes, izmantojot 3D drukātas, mikrofrēzētas vai litogrāfiski izgatavotas veidnes. Šī metode parāda morfogēno izolētu šūnu pašteogēno grafisko izkārtojumu pašplūsmā. s, izveidojot augstu proporciju epitēlija struktūru un stromas-epitēlija šķērsrunu, iekļaujot stromas šūnas sastatnēs. Tomēr iepriekš strukturētu sastatņu raksturs var novērst paša spontāna morfoģenētiskā procesa parādīšanos. Šie modeļi arī nenodrošina dinamisku luminālo vai intersticiālu morfogēno šūnu plūsmu, kam nav nepieciešama nepietiekama testa šķidruma fizioloģiska slodze. nevienā nesenajā pētījumā netika izmantotas hidrogēla sastatnes mikrofluidiskā platformā un rakstainas zarnu epitēlija struktūras, izmantojot lāzera kodināšanas paņēmienus.Peles zarnu organoīdi seko iegravētiem modeļiem, veidojot zarnu kanāliņu struktūras, un intraluminālo šķidruma plūsmu var apkopot, izmantojot mikrofluidikas moduli. Tomēr šis modelis neietver morfogēno kustību, nedz spontānisku kustību. Ar vienas un tās pašas grupas 3D drukāšanas paņēmieniem izdevās izveidot miniatūras zarnu caurulītes ar spontāniem morfoģenētiskiem procesiem.Neskatoties uz dažādu zarnu segmentu sarežģīto izgatavošanu caurulē, šim modelim trūkst arī luminālā šķidruma plūsmas un mehāniskas deformācijas. Turklāt modeļa darbspēja var būt ierobežota, īpaši pēc biodrukas procesa pabeigšanas, kas nodrošina mūsu ierosinātos eksperimentālos apstākļus, traucējot šūnu-protokogēnās mijiedarbības. ēze, fizioloģiski nozīmīgs bīdes spriegums, biomehānika, kas atdarina zarnu kustīgumu, neatkarīgu apikālo un bazolaterālo nodalījumu pieejamība un sarežģītas bioloģiskas modularitātes mikrovides atjaunošana. Tāpēc mūsu in vitro 3D morfoģenēzes protokols var nodrošināt papildu pieeju, lai pārvarētu esošo metožu izaicinājumus.
Mūsu protokols ir pilnībā vērsts uz 3D epitēlija morfoģenēzi, kultūrā ir tikai epitēlija šūnas, un nav citu veidu apkārtējo šūnu, piemēram, mezenhimālās šūnas, endotēlija šūnas un imūnās šūnas. Kā aprakstīts iepriekš, mūsu protokola pamatā ir epitēlija morfoģenēzes indukcija, noņemot morfogēna inhibitorus, kas tiek ievadīti robustajā barotnē, kas tiek ievadīta robustajā vidē. mikroshēma un hibrīds mikroshēmā ļauj mums atjaunot viļņaino 3D epitēlija slāni, papildu bioloģiskās sarežģītības, piemēram, epitēlija un mezenhimālās mijiedarbības33, 34, ekstracelulārās matricas (ECM) nogulsnēšanos 35, un mūsu modelī kripta-villus pazīmes, kas nodrošina kriptoblastu nišas, kas tālāk tiek uzskatītas par cilmes šūnu nišām bazālajās šūnās. man ir galvenā loma ECM proteīnu ražošanā un zarnu morfoģenēzes regulēšanā in vivo35,37,38.Mezenhimālo šūnu pievienošana mūsu modelim uzlaboja morfoģenētisko procesu un šūnu piesaistes efektivitāti.Endotēlija slānim (ti, kapilāriem vai limfvadiem) ir svarīga loma molekulāro šūnu transportēšanas, imūnvīrusu atjaunošanās un mikrovaskulārās sistēmas regulēšanā. kultūras komponenti, kurus var savienot starp audu modeļiem, ir priekšnoteikums, ja audu modeļi ir izstrādāti, lai demonstrētu vairāku orgānu mijiedarbību. Tāpēc var būt nepieciešams iekļaut endotēlija šūnas, lai modelētu precīzākas fizioloģiskās pazīmes ar orgānu līmeņa izšķirtspēju. No pacienta iegūtās imūnās šūnas ir būtiskas arī iedzimtu imūnreakciju parādīšanai, antigēnu prezentācijai, iedzimtai adaptīvai slimībai audu imūno krustpunktu kontekstā.
Hibrīda mikroshēmu izmantošana ir vienkāršāka nekā zarnās mikroshēmā, jo ierīces iestatīšana ir vienkāršāka un Transvela ieliktņu izmantošana ļauj veikt mērogojamu zarnu epitēlija kultūru. Tomēr komerciāli pieejamie Transwell ieliktņi ar poliestera membrānām nav elastīgi un nevar simulēt peristaltikai līdzīgas kustības. Turklāt apikālā mikroshēma palika noslogotā sānu stacijā. .Skaidrs, ka statiskās īpašības apikālajā nodalījumā reti nodrošina ilgstošu baktēriju kopkultūru hibrīda mikroshēmās. Lai gan, izmantojot hibrīda mikroshēmas, mēs varam spēcīgi izraisīt 3D morfoģenēzi Transvela ieliktņos, fizioloģiski nozīmīgas biomehānikas un apikālā šķidruma plūsmas trūkums var ierobežot hibrīda mikroshēmu platformu iespējamību potenciālajiem lietojumiem.
Pilna mēroga cilvēka kripta-villus ass rekonstrukcijas zarnās uz mikroshēmas un hibrīda uz mikroshēmas kultūrās nav pilnībā izveidotas. Tā kā morfoģenēze sākas no epitēlija monoslāņa, 3D mikroarhitektūras ne vienmēr nodrošina morfoloģisku līdzību kriptām in vivo. Lai gan mēs raksturojām proliferācijas šūnu populācijas tuvumā3. kripta un bārkstiņu apgabali nebija skaidri norobežoti. Lai gan augstāki augšējie mikroshēmas kanāli palielina mikroinženierijas epitēlija augstumu, maksimālais augstums joprojām ir ierobežots līdz ~ 300–400 µm. Cilvēka zarnu kriptu faktiskais dziļums tievajās un resnajās zarnās ir ~ 135 µm un ~ 400 µm tievās zarnas augstums ir attiecīgi ~ 400 µm. m41.
No attēlveidošanas viedokļa 3D mikroarhitektūras in situ superizšķirtspējas attēlveidošana var aprobežoties ar mikroshēmas zarnām, jo ​​nepieciešamais darba attālums no objektīva lēcas līdz epitēlija slānim ir aptuveni daži milimetri. Lai atrisinātu šo problēmu, var būt nepieciešams attāls objektīvs. Turklāt, veicot plānas sadaļas, ir nepieciešama augsta attēlveidošanas elastība, jo PDMS. Zarnu mikroshēmas slāņa slāņa mikroapstrāde ietver pastāvīgu adhēziju starp katru slāni, ir ārkārtīgi grūti atvērt vai noņemt augšējo slāni, lai pārbaudītu epitēlija slāņa virsmas struktūru. Piemēram, izmantojot skenējošu elektronu mikroskopu (SEM).
PDMS hidrofobitāte ir bijis ierobežojošs faktors pētījumos ar mikrofluīdiem, kas saistīti ar mazām hidrofobām molekulām, jo ​​PDMS var nespecifiski adsorbēt šādas hidrofobas molekulas. Var apsvērt PDMS alternatīvas, izmantojot citus polimēru materiālus. Alternatīva iespēja ir PDMS virsmas modifikācija (piemēram, pārklājums ar lipofīliem materiāliem3 vai polietilēna materiāliem)4. hidrofobās molekulas.
Visbeidzot, mūsu metode nav labi raksturota attiecībā uz augstas caurlaidības skrīninga vai "viens izmērs der visiem" lietotājam draudzīgas eksperimentālās platformas nodrošināšanu. Pašreizējā protokolā ir nepieciešams šļirces sūknis katrai mikroierīcei, kas aizņem vietu CO2 inkubatorā un novērš liela mēroga eksperimentus. Šo ierobežojumu var ievērojami uzlabot ar mērogojamību inovatīviem kultūras formātiem (piemēram, inovatīviem kultūras formātiem kas ļauj nepārtraukti papildināt un izņemt bazolaterālo barotni).
Lai ierosinātu cilvēka zarnu epitēlija 3D morfoģenēzi in vitro, mēs izmantojām mikrofluidisko mikroshēmu zarnu ierīci, kas satur divus paralēlus mikrokanālus un elastīgu porainu membrānu starp tiem, lai izveidotu lūmena-kapilāra saskarni. Mēs arī demonstrējam vienkanāla mikrofluidiskas ierīces (hibrīda mikroshēmas) izmantošanu, kas nodrošina nepārtrauktu bazolaterālo mikroshēmu augšanu zem abām platformām. ir no dažādām cilvēka zarnu epitēlija šūnām, var demonstrēt, izmantojot virziena manipulācijas ar plūsmu, lai noņemtu morfogēnu antagonistus no bazolaterālā nodalījuma. Visa eksperimentālā procedūra (1. attēls) sastāv no piecām daļām: (i) zarnu mikroshēmas vai Transvela ievietojamās hibrīda mikroshēmas mikroapstrāde (1.-5. darbība; 1. lodziņš) cilvēka epitēlija šūnu sagatavošana, (i) organoīdi;2.–5. lodziņš), (iii) zarnu epitēlija šūnu kultivēšana uz zarnu mikroshēmām vai hibrīda mikroshēmām (6.–9. darbība), (iv) 3D morfoģenēzes indukcija in vitro (10. darbība) un (v)), lai raksturotu 3D epitēlija mikrostruktūru (11.–24. darbība). ģenēzi, salīdzinot epitēlija morfoģenēzi ar telpisko, laika, nosacījumu vai procesuālo kontroli.
Mēs izmantojām divas dažādas kultivēšanas platformas: gut-on-a-chip ar taisniem kanāliem vai nelineāriem izliektiem kanāliem vai hibrīda mikroshēmas, kas satur Transvela (TW) ieliktņus mikrofluidiskā ierīcē, kas izgatavota, kā aprakstīts 1. lodziņā, un 1.-5. darbība. Ierīces izgatavošana parāda galvenos soļus vienas mikroshēmas vai hibrīda mikroshēmas izgatavošanā. sēklinieku organoīdi) un šajā protokolā izmantotā kultivēšanas procedūra."In vitro morfoģenēze" parāda vispārējos posmus, kuros Caco-2 vai no organoīdiem atvasinātas epitēlija šūnas tiek kultivētas zarnu mikroshēmā vai uz hibrīda mikroshēmas Transvela ieliktņiem, kam seko 3D morfoģenēzes indukcija un raksturotas epitēlija struktūras veidošanās. Tālāk ir parādīts katras testa rindas lietojumprogrammas numurs. al slāņus var izmantot, piemēram, šūnu diferenciācijas raksturošanā, zarnu fizioloģijas pētījumos, saimnieka-mikrobiomu ekosistēmu izveidē un slimību modelēšanā.Immunofluorescence images in “Cell Differentiation” showing nuklei, F-actin and MUC2 expressed in the 3D Caco-2 secreting surface cells and mucusal secreting surface cells and mucusal secreting surface cell and mucusal secreting surface cells and genered on the goC2 mucogutt signaling surface cells. s.Fluorescējošie attēli zarnu fizioloģijā parāda gļotas, kas iegūtas, krāsojot siālskābes un N-acetilglikozamīna atlikumus, izmantojot fluorescējošo kviešu dīgļu aglutinīnu. Divos pārklājošajos attēlos “Saimnieka un mikrobu kopkultūras” panelī ir redzams reprezentatīvs saimnieka un mikrobioma mikroshēmu kopkultūras panelis. (GFP) ar mikroinženierijas 3D Caco-2 epitēlija šūnām.Labajā panelī ir redzama GFP E. coli lokalizācija, kas kultivēta kopā ar 3D Caco-2 epitēlija šūnām, kam seko imunofluorescences krāsošana ar F-aktīnu (sarkans) un kodoliem (zils).Slimības modelēšana ilustrē veselīgu pret polifizisku iekaisumu (polifizioloģiskās problēmas ar lipogēno iekaisumu). aharīds, LPS) un imūnās šūnas (piemēram, PBMC;zaļa).Caco-2 šūnas tika kultivētas, lai izveidotu 3D epitēlija slāni.Mēroga josla, 50 µm.Attēli apakšējā rindā: “Šūnu diferenciācija” pielāgota ar atļauju no atsauces.2.Oxford University Press;Pārpublicēts ar 5. atsauces atļauju.NAS;“Saimnieka un mikrobu kopkultūra” pielāgota ar atļauju no ref.3.NAS;“Slimības modelēšana” pielāgota ar atļauju no atsauces.5.NAS.
Gan gut-on-chip, gan hibrīda mikroshēmas tika izgatavotas, izmantojot PDMS kopijas, kas tika izjauktas no silīcija veidnēm ar mīkstu litogrāfiju1,44 un veidotas ar SU-8. Katras mikroshēmas mikrokanālu dizains tiek noteikts, ņemot vērā hidrodinamiku, piemēram, bīdes spriegumu un hidrodinamisko spiedienu1,4,12.Oriģinālais gut-on-chip dizains, kas sastāv no. ed paralēli taisni mikrokanāli, ir attīstījusies par sarežģītu zarnu mikroshēmu (paplašināti dati 1.b att.), kas ietver izliektu mikrokanālu pāri, lai izraisītu palielinātu šķidruma uzturēšanās laiku, nelineārus plūsmas modeļus un kultivētu šūnu daudzaksiālu deformāciju (2.a–f att.). var izvēlēties.Mēs esam pierādījuši, ka vītņotā Gut-Chip arī spēcīgi inducē 3D morfoģenēzi līdzīgā laika posmā ar līdzīgu epitēlija augšanas pakāpi, salīdzinot ar sākotnējo Gut-Chip, neatkarīgi no kultivētās šūnas veida.Tāpēc, lai izraisītu 3D morfoģenēzi, tiek veikta lineāra un sarežģīta molu veidojošās SUPD projektēšanas pārveidošana. -8 modeļi nodrošināja negatīvas iezīmes pēc demontāžas (att.2a). Lai izgatavotu zarnas uz mikroshēmas, sagatavotais augšējais PDMS slānis tika secīgi savienots ar porainu PDMS plēvi un pēc tam izlīdzināts ar apakšējo PDMS slāni ar neatgriezenisku savienošanu, izmantojot koronas apstrādātāju (2.b–f att.). Lai izgatavotu hibrīda mikroshēmas, sacietētas PDMS kopijas tika savienotas ar mikroplūsmas un modificētu stikla priekšmetstikliņiem. 2h un paplašinātie dati 2.att.. Saistīšanas process tiek veikts, apstrādājot PDMS replikas un stikla virsmas ar skābekļa plazmu vai korona apstrādi.Pēc silikona caurulei pievienotās mikrofabricētās ierīces sterilizācijas ierīces iestatījums bija gatavs zarnu epitēlija 3D morfoģenēzes veikšanai2g (attēls).
a, Shematisks ilustrācija PDMS detaļu sagatavošanai no SU-8 rakstainām silīcija veidnēm.Nesacietējušais PDMS šķīdums tika izliets uz silīcija veidnes (pa kreisi), sacietējis 60 °C (vidū) un demontēts no formas (pa labi).Demontētais PDMS tika sagriezts gabalos un notīrīts turpmākai izmantošanai.b, Silīcija slāņa sagatavošanai izmantotā PDMS fotogrāfija. d, ko izmanto PDMS porainās membrānas izgatavošanai.d, fotoattēlu sērija ar augšējo un apakšējo PDMS komponentu un salikto mikroshēmas zarnu ierīci.e, Augšējo, membrānas un apakšējo PDMS komponentu izlīdzināšanas shēma. Katrs slānis ir neatgriezeniski savienots ar plazmas vai korona apstrādi.f um chambers.g, Setup of gut-on-a-chip for microfluidic cell culture.The Factory gut on the chip, mis samontēts ar silikona caurulīti un šļirci, tika uzlikts uz pārklājuma.Chēma ierīce tika novietota uz 150 mm Petri trauciņa vāka apstrādei.Saistviela tiek izmantota, lai aizvērtu silikona mikroshēmas, čipshotālās auduma čaulītes. .Transwell ieliktņi, kas sagatavoti neatkarīgi, lai kultivētu zarnu epitēlija šūnu 2D monoslāņus, tika ievietoti hibrīda mikroshēmā, lai izraisītu zarnu 3D morfoģenēzi. Barotne tiek perfūzēta caur mikrokanāliem zem šūnu slāņa, kas izveidots uz Transvela ieliktņa. Mēroga josla, 1 cm.h Pārpublicēts ar 4. atsauces atļauju.Elsevier.
Šajā protokolā Caco-2 šūnu līnija un zarnu organoīdi tika izmantoti kā epitēlija avoti (3.a att.). Abu veidu šūnas tika kultivētas neatkarīgi (2. un 5. lodziņš) un tika izmantotas, lai iesētu ar ECM pārklātus mikrokanālus uz mikroshēmas zarnām vai Transvela ieliktņiem. Kad šūnas ir saplūstošas ​​(in>9bētsd) lv 10. un 50. fragmenti) T-kolbās tiek novāktas, lai ar tripsinizācijas šķidrumu sagatavotu disociētu šūnu suspensijas (2. aile). Cilvēka zarnu organoīdi no zarnu biopsijām vai ķirurģiskām rezekcijas tika kultivēti Matrigel sastatņu kupolos 24 bedrīšu plāksnēs (mordīns, kas satur ēteriskos mikroelementus, mikroelementus, kas satur strukturālos mikroelementus). ggin) un augšanas faktori, kas sagatavoti, kā aprakstīts 3. lodziņā, tika papildināti katru otro dienu, līdz organoīdi izauga līdz ~ 500 µm diametrā. Pilnībā izaugušos organoīdus novāc un sadala atsevišķās šūnās, lai iesētu uz zarnām vai Transvela ieliktņiem mikroshēmā (5. lodziņš). Kā jau iepriekš ziņojām, to var diferencēt pēc vēža, kolīta, kolorīta slimības,3 veida. vai normāls donors), bojājuma vieta (piemēram, bojājums pret nebojāto zonu) un kuņģa-zarnu trakta atrašanās vieta traktā (piemēram, divpadsmitpirkstu zarnā, tukšajā zarnā, ileum, cecum, resnajā zarnā vai taisnajā zarnā). 5. lodziņā mēs piedāvājam optimizētu protokolu resnās zarnas organoīdu (koloīdu) kultivēšanai, nekā parasti ir nepieciešama lielāka morofogēnu testoīdu koncentrācija.
a, Workflow for the induction of gut morphogenesis in the gut chip.Caco-2 cilvēka zarnu epitēlijs un zarnu organoīdi šajā protokolā tiek izmantoti, lai demonstrētu 3D morfoģenēzi.Izolētās epitēlija šūnas tika iesētas sagatavotajā gut-on-a-chip ierīcē (čipu preparāts). (D0), apikālā (AP) plūsma tiek uzsākta un uzturēta pirmajās 2 dienās (plūsma, AP, D0-D2).Bazolaterālā (BL) plūsma tiek uzsākta arī kopā ar cikliskām stiepšanās kustībām (stiepums, plūsma, AP un BL), kad veidojas pilnīgs 2D vienslānis.Zarnu 3D morfoģenēze pēc mikrofluogenēzes 5 dienas pēc notikušas spontānas P spontānas slimības. attēli parāda reprezentatīvu Caco-2 šūnu morfoloģiju katrā eksperimenta solī vai laika punktā (joslu diagramma, 100 µm). Četras shematiskas diagrammas, kas ilustrē atbilstošās zarnu morfoģenēzes kaskādes (augšējā labajā pusē). Svītras bultiņas shēmā attēlo šķidruma plūsmas virzienu.b, SEM attēls, kurā parādīta izveidotā 3D epilācijas apgabala virsmas topoloģija. ) parāda reģenerētos mikrovilliņus uz 3D Caco-2 slāņa (pa labi).c, Horizontālais frontālais skats uz izveidoto Caco-2 3D, claudin (ZO-1, sarkans) un nepārtrauktas sukas apmales membrānas, kas marķētas ar F-aktīnu (zaļš) un kodoliem (zils). fokusa skats.d, Organoīdu morfoloģisko izmaiņu gaita, kas kultivēta mikroshēmā, kas iegūta ar fāzes kontrasta mikroskopiju 3., 7., 9., 11. un 13. dienā. Ielaidums (augšējā labajā pusē) parāda sniegtā attēla lielo palielinājumu.e, DIC mikrofoto organoīda 3D epitēlijs, kas izveidots zarnās, virs fluorescences šūnām. 5;fuksīna), kausu šūnas (MUC2; zaļa), F-aktīns (pelēks) un kodoli (ciāna), kas attiecīgi audzēti uz zarnu mikroshēmām 3 dienas (kreisajā pusē) un 13 dienu (vidējais) organoīdi epitēlija slānī. Skatiet arī paplašinātos datus 3. attēlu, kurā ir izcelta LGR5 signalizācija bez MUC2 signalizācijas mikrostruktūras (epitēlija orgānu)3 signāliem. epitēlijs, kas izveidots zarnās uz mikroshēmas, 13. kultivēšanas dienā krāsojot plazmas membrānu ar CellMask krāsvielu (pa labi).Mēroga josla ir 50 μm, ja nav norādīts citādi.b Pārpublicēts ar atļauju no atsauces.2.Oxford University Press;c Pielāgots ar atļauju no atsauces.2.Oxford University Press;e un f pielāgoti ar atļauju ar atsauci.12 Saskaņā ar Creative Commons License CC BY 4.0.
Zarnas mikroshēmā ir nepieciešams modificēt PDMS porainās membrānas hidrofobisko virsmu, lai nodrošinātu veiksmīgu ECM pārklājumu. Šajā protokolā mēs izmantojam divas dažādas metodes, lai modificētu PDMS membrānu hidrofobitāti. Caco-2 šūnu kultivēšanai pietiek ar virsmas aktivāciju ar UV/ozona apstrādi vien, lai samazinātu ECM membrānas hidrofobitāti, Coatow-PDCM virsmas, ko- PDMS šūnas. Organoīda epitēlija mikrofluidiskajai kultūrai nepieciešama virsmas funkcionalizācija uz ķīmiskām vielām, lai panāktu efektīvu ECM proteīnu nogulsnēšanos, secīgi uzklājot polietilēnimīnu (PEI) un glutaraldehīdu PDMS mikrokanālos. Pēc virsmas modifikācijas ECM proteīni tika nogulsnēti, lai pārklātu funkcionalizēto PDMS virsmu, un pēc tam tika ievadīti izolētajā šūnu kultūrā, pievienojot tikai perfuzijas mikrofluīdas šūnas. augšējais mikrokanāls, līdz šūnas veido pilnīgu monoslāni, savukārt apakšējais mikrokanāls uztur statiskus apstākļus. Šī optimizētā virsmas aktivācijas un ECM pārklājuma metode ļauj piestiprināt organoīdu epitēliju, lai izraisītu 3D morfoģenēzi uz PDMS virsmas.
Transwell kultūrām arī nepieciešams ECM pārklājums pirms šūnu iesēšanas;tomēr Transvela kultūrām nav nepieciešamas sarežģītas pirmapstrādes darbības, lai aktivizētu porainu ieliktņu virsmu. Caco-2 šūnu audzēšanai uz Transvela ieliktņiem, ECM pārklājums uz porainiem ieliktņiem paātrina disociēto Caco-2 šūnu piestiprināšanos (<1 stunda) un ciešas savienojuma barjeras veidošanos (<1-2 dienas). Organoīdu kultivēšanai uz Transvela virsmas ir pievienota membrāna, un CM ir pievienoti< ieliktņi. uztur, līdz organoīdi veido pilnīgu monoslāni ar barjeras integritāti .Transwell kultūras veic 24 bedrīšu plāksnēs, neizmantojot hibrīda mikroshēmas.
In vitro 3D morfoģenēzi var uzsākt, pielietojot šķidruma plūsmu noteikta epitēlija slāņa bazolaterālajam aspektam.Zarnās uz mikroshēmas epitēlija morfoģenēze sākās, kad barotne tika perfūzēta augšējos un apakšējos mikrokanālos (3.a att.).Kā aprakstīts iepriekš, ir ļoti svarīgi nodrošināt šķidruma plūsmu nepārtrauktas sekrēcijas inhibitora virzienā. barības vielas un serums šūnām, kas saistītas uz porainām membrānām un rada luminālo bīdes spriegumu, mēs parasti pielietojam dubultplūsmu zarnās uz mikroshēmas.Hibrīda mikroshēmās transvela ieliktņi, kas satur epitēlija monoslāņus, tika ievietoti hibrīda mikroshēmās. Pēc tam barotne tika uzklāta zem porainā Transvela kultūras ieliktņa bazolaterālās puses caur mikrokanālu.Zarnu plūsmas laikā tika novērota gan morfoģenēzes 5 dienas.
Mikroinženierijas 3D epitēlija slāņu morfoloģiskās iezīmes var analizēt, izmantojot dažādas attēlveidošanas metodes, tostarp fāzes kontrasta mikroskopiju, diferenciālo traucējumu kontrasta (DIC) mikroskopiju, SEM vai imunofluorescences konfokālo mikroskopiju (3. un 4. attēls). e attiecībā uz PDMS un poliestera plēvju optisko caurspīdīgumu, gan gut-on-a-chip, gan hibrīda mikroshēmu platformas var nodrošināt reāllaika attēlveidošanu in situ bez nepieciešamības sadalīt vai izjaukt ierīci. Veicot imunofluorescences attēlveidošanu (1., 3.c, f un 4b, c attēls), šūnas parasti tiek fiksētas (XFA) (ar/volde) 100 un 2% (masa/tilp.) ) liellopu seruma albumīns (BSA), secībā.Atkarībā no šūnas veida var izmantot dažādus fiksatorus, caurlaidības līdzekļus un bloķējošus līdzekļus. Primārās antivielas, kuru mērķauditorija ir no ciltsraksta atkarīgiem šūnas vai reģiona marķieriem, tiek izmantotas, lai izceltu šūnas, kas imobilizētas in situ uz mikroshēmas, kam seko sekundārais pretstatījums, piemēram,4. -diamidino-2-fenilēns) indols, DAPI) vai F-aktīns (piemēram, fluorescējoši iezīmēts faloidīns). Uz fluorescenci balstītu dzīvu attēlveidošanu var veikt arī in situ, lai noteiktu gļotu veidošanos (att.1, “Šūnu diferenciācija” un “Zarnu fizioloģija”), mikrobu šūnu nejauša kolonizācija (1. att., “Saimnieka un mikrobu kopkultūra”), imūno šūnu piesaiste (1. att., “Slimības modelēšana”) vai 3D epitēlija morfoloģijas kontūras, atdala mikroshēmu, atdala un atdala. augšējais slānis no apakšējā mikrokanālu slāņa, kā aprakstīts atsaucē. Kā parādīts 2. attēlā, 3D epitēlija morfoloģiju, kā arī mikrovilliņus uz apikālās otas robežas var vizualizēt ar SEM (3.b att.). Diferenciācijas marķieru ekspresiju var novērtēt, veicot kvantitatīvu PCR5 vai vienas šūnas RNS slāņa slāņa šūnu augšanas sekvences vai epitēlija slāņa šūnu augšanas sekvences. hibrīda mikroshēmas tiek novāktas ar tripsinizāciju un pēc tam tiek izmantotas molekulārai vai ģenētiskai analīzei.
a, Workflow for the induction of intestinal morphogenesis in a hybrid chip.Caco-2 un zarnu organoīdi šajā protokolā tiek izmantoti, lai demonstrētu 3D morfoģenēzi hibrīda mikroshēmas platformā.Disociētās epitēlija šūnas tika iesētas sagatavotos Transvela ieliktņos (TW prep; skatīt attēlu zemāk). Kad šūnas tika iesētas statiskās membrānas apstākļos (visas tika pievienotas transwell-estera apstākļos) W kultūra).Pēc 7 dienām viens Transvela ieliktnis, kas satur epitēlija šūnu 2D monoslāni, tika integrēts hibrīda mikroshēmā, lai ieviestu bazolaterālo plūsmu (Flow, BL), kas galu galā noveda pie 3D epitēlija slāņa ģenerēšanas (morfoģenēze). Fāzes kontrasta mikrogrāfi, kas parāda cilvēka orgānu epitēlija šūnu morfoloģiskās iezīmes katrā donora laika posmā. s augšējos slāņos ilustrē katras darbības eksperimentālo konfigurāciju.b, Hibrīda mikroshēmas (shēma pa kreisi) var izraisīt organoīdu epitēlija šūnu 3D morfoģenēzi ar konfokālās mikroskopijas skatiem no augšas uz leju, kas uzņemti dažādās Z pozīcijās (augšējā, vidējā un apakšējā;skatīt labās puses shēmu un atbilstošās punktētās līnijas).uzrādīja acīmredzamas morfoloģiskās īpašības.F-aktīns (ciāns), kodols (pelēks).c, Fluorescences konfokālās mikrogrāfijas (3D leņķiskais skats) no organoīdiem atvasinātām epitēlija šūnām, kas kultivētas statiskā Transvelā (TW; ielikts baltā punktētā lodziņā) pret hibrīda mikroshēmu (lielākais pilnais kadrs), salīdzinot 2D morfoloģiju (attiecīgos 2D skatījumus pret 3D morfoloģiju). augšējā labajā stūrī; “XZ”) parāda arī 2D un 3D funkcijas.Mēroga josla, 100 µm.c Pārdrukāts ar atļauju no atsauces.4.Elsevier.
Kontroles var sagatavot, kultivējot tās pašas šūnas (CACO-2 vai zarnu organoīdu epitēlija šūnas) divdimensiju vienslāņos parastajās statiskās kultūras apstākļos. Ja, iespējams, barības vielu samazināšanās var rasties, pateicoties ierobežotai tilpuma spējai mikrokanālos (ti, ~ 4 µl augšējā kanālā pēc tam, kad tiek uzklāts arī pēc tam, kā arī pēc tam, kad ir pagatavots zarnās.
Mīkstais litogrāfijas process jāveic tīrā telpā. Katram mikroshēmas slānim (augšējais un apakšējais slānis un membrānas) un hibrīda mikroshēmām tika izmantotas un izgatavotas dažādas fotomaskas, kas izgatavotas uz atsevišķām silīcija plāksnēm, jo ​​mikrokanālu augstumi bija atšķirīgi. Mikrokanālu augšējo un apakšējo mikrokanālu mērķa augstums, mikroshēmas mērķa mikroshēmas mērķa augstums ir attiecīgi 500 µm200 µm un µm. µm.
Ievietojiet 3 collu silīcija vafeles traukā ar acetonu. Viegli virpiniet plāksni 30 sekundes, pēc tam nosusiniet vafeles gaisā. Pārnesiet vafeles uz šķīvja ar IPA, pēc tam grieziet plāksni 30 s, lai notīrītu.
Piranha šķīdumu (ūdeņraža peroksīda un koncentrētas sērskābes maisījumu, 1:3 (tilpums/tilpums)) var izmantot, lai maksimāli palielinātu organisko atlikumu noņemšanu no silīcija vafeles virsmas.
Piranha šķīdums ir ārkārtīgi kodīgs un rada siltumu.Ir nepieciešami papildu drošības pasākumi.Lai atbrīvotos no atkritumiem, ļaujiet šķīdumam atdzist un pārnest uz tīru, sausu atkritumu konteineru.Izmantojiet sekundāros konteinerus un pareizi marķējiet atkritumu konteinerus.Lūdzu, ievērojiet objekta drošības vadlīnijas, lai iegūtu detalizētākas procedūras.
Dehidrējiet vafeles, novietojot tās uz 200 °C karstās plāksnes uz 10 minūtēm. Pēc dehidratācijas vafeles piecas reizes sakrata gaisā, lai tās atdziest.
Ielejiet ~10 g fotorezista SU-8 2100 uz iztīrītās silīcija vafeles vidus.Izmantojiet pinceti, lai fotorezistu vienmērīgi izkliedētu uz vafeles.Ik pa laikam novietojiet vafeles uz 65°C karstās plāksnes, lai fotorezists būtu mazāk lipīgs un vieglāk klājas.Nenovietojiet vafeles tieši uz karstās plāksnes.
SU-8 tika vienmērīgi sadalīts uz vafeles, izmantojot griešanās pārklājumu. Ieprogrammējiet SU-8 ienākošo rotāciju uz 5–10 sekundēm, lai tas virzītos pie 500 apgr./min ar paātrinājumu 100 apgr./s. Iestatiet galveno centrifūgu uz 200 µm biezuma zīmējumu uz 1500 µm, biezumu 50ma sasniedz 1500 µm20 mikroshēmas zarnu augšējam slānim; skatiet sadaļu “Kritiskie soļi” zemāk), iestatīts uz paātrinājumu 300 apgr./min. 30 sekundes pie 1200 apgr./min.
Galveno centrifūgas ātrumu var noregulēt atbilstoši SU-8 raksta mērķa biezumam uz silīcija plāksnītes.
Lai izveidotu SU-8 modeļus 500 µm augstumā mikroshēmas zarnu augšējam slānim, šīs kastes vērpšanas pārklājuma un mīkstās cepšanas darbības (7. un 8. darbība) tika secīgi atkārtotas (skatiet 9. darbību), lai iegūtu divus slāņus ar 250 µm. Biezs SU-8 slānis, kas var tikt slāņots ar 0 µm augstu UV iedarbības pakāpi un 0 slānis. .
Cepiet mīkstās vafeles ar SU-8 pārklājumu, uzmanīgi novietojot vafeles uz karstās plāksnes 65 °C uz 5 minūtēm, pēc tam pārslēdziet iestatījumu uz 95 °C un inkubējiet vēl 40 minūtes.
Lai sasniegtu 500 μm SU-8 raksta augstumu augšējā mikrokanālā, atkārtojiet 7. un 8. darbību, lai izveidotu divus 250 μm biezus SU-8 slāņus.
Izmantojot UV maskas izlīdzinātāju, veiciet lampas pārbaudi saskaņā ar ražotāja norādījumiem, lai aprēķinātu plāksnītes ekspozīcijas laiku.(ekspozīcijas laiks, ms) = (ekspozīcijas deva, mJ/cm2)/(lampas jauda, ​​mW/cm2).
Pēc ekspozīcijas laika noteikšanas novietojiet fotomasku uz UV maskas līdzinātāja maskas turētāja un novietojiet fotomasku uz vafeles ar SU-8 pārklājumu.
Novietojiet fotomaskas apdrukāto virsmu tieši uz SU-8 pārklātās silīcija vafeles puses, lai samazinātu UV dispersiju.
Iepriekš noteiktajam ekspozīcijas laikam pakļaujiet SU-8 pārklājumu vafelei un fotomasku vertikāli 260 mJ/cm2 UV gaismai (skatiet šī lodziņa 10. darbību).
Pēc UV iedarbības ar SU-8 pārklātas silīcija vafeles tika ceptas 65 °C 5 minūtes un 95 °C 15 min uz katras sildvirsmas, lai izveidotu rakstus ar augstumu 200 μm. Pagariniet pēccepšanas laiku 95 °C temperatūrā līdz 30 minūtēm, lai izveidotu rakstus ar 500 µm augstumu.
Izstrādātāju ielej stikla traukā, un traukā ievieto izceptās vafeles.Izstrādātāja SU-8 tilpums var atšķirties atkarībā no stikla plāksnes izmēra.Izmantojiet pietiekami daudz attīstītāja SU-8, lai pilnībā noņemtu neeksponētu SU-8. Piemēram, ja izmantojat 150 mm diametra stikla trauku ar 1 L ietilpību.Izmantojiet apmēram 20 SU-8 minūtes. rotācija.
Izskalojiet izstrādāto veidni ar ~ 10 ml svaiga attīstītāja, kam seko IPA, izsmidzinot šķīdumu, izmantojot pipeti.
Novietojiet vafeles plazmas tīrītājā un pakļaujiet skābekļa plazmai (atmosfēras gāze, mērķa spiediens 1 × 10–5 Torr, jauda 125 W) 1,5 minūtes.
Novietojiet vafeles vakuumeksikatorā ar stikla priekšmetstikliņu iekšpusē.Vafeles un priekšmetstikliņus var novietot blakus.Ja vakuumeksikators ir sadalīts vairākos slāņos ar plāksni, novietojiet priekšmetstikliņus apakšējā kamerā, bet vafeles - augšējā kamerā.Piliniet 100 μL trihloro, stikla un fluoro slīdvielas (1H, 1H) uzklājiet vakuumu silanizācijai.
Atkausējiet saldētu Caco-2 šūnu flakonu 37 °C ūdens vannā, pēc tam pārnesiet atkausētās šūnas uz T75 kolbu, kas satur 15 ml 37 °C iepriekš uzsildītas Caco-2 barotnes.
Lai Caco-2 šūnas izietu pie ~90% saplūšanas, vispirms sasildiet Caco-2 barotni, PBS un 0,25% tripsīna/1 mM EDTA 37°C ūdens vannā.
Aspirējiet barotni ar vakuuma aspirāciju. Divreiz mazgājiet šūnas ar 5 ml silta PBS, atkārtojot vakuuma aspirāciju un pievienojot svaigu PBS.