Paldies, ka apmeklējāt vietni Nature.com.Jūsu izmantotajai pārlūkprogrammas versijai ir ierobežots CSS atbalsts.Lai nodrošinātu vislabāko pieredzi, ieteicams izmantot atjauninātu pārlūkprogrammu (vai atspējot saderības režīmu pārlūkprogrammā Internet Explorer).Tikmēr, lai nodrošinātu nepārtrauktu atbalstu, mēs atveidosim vietni bez stiliem un JavaScript.
Mikrobu parazītu evolūcija ietver pretdarbību starp dabisko atlasi, kas izraisa parazītu uzlabošanos, un ģenētisko novirzi, kas izraisa parazītu gēnu zaudēšanu un kaitīgu mutāciju uzkrāšanos.Šeit, lai saprastu, kā šī pretdarbība notiek vienas makromolekulas mērogā, mēs aprakstām Encephalitozoon cuniculi, eikariotu organisma ar vienu no mazākajiem genomiem dabā, ribosomas krio-EM struktūru.Ārkārtējo rRNS samazināšanos E. cuniculi ribosomās pavada nepieredzētas strukturālas izmaiņas, piemēram, iepriekš nezināmu sapludinātu rRNS linkeru un rRNS bez izspiedumiem evolūcija.Turklāt E. cuniculi ribosoma pārdzīvoja rRNS fragmentu un proteīnu zudumu, attīstot spēju izmantot mazas molekulas kā degradētu rRNS fragmentu un proteīnu strukturālas imitācijas.Kopumā mēs parādām, ka molekulārajām struktūrām, kas jau sen tika uzskatītas par samazinātām, deģenerētām un pakļautām novājinošām mutācijām, ir vairāki kompensācijas mehānismi, kas saglabā tās aktīvas, neskatoties uz ārkārtējām molekulārām kontrakcijām.
Tā kā lielākajai daļai mikrobu parazītu grupu ir unikāli molekulāri rīki, lai izmantotu to saimniekus, mums bieži ir jāizstrādā dažādas terapijas dažādām parazītu grupām1, 2.Tomēr jauni pierādījumi liecina, ka daži parazītu evolūcijas aspekti ir konverģenti un lielā mērā paredzami, norādot uz potenciālu pamatu plašai terapeitiskai iejaukšanās mikrobu parazītiem 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9.
Iepriekšējais darbs ir identificējis kopīgu evolūcijas tendenci mikrobu parazītos, ko sauc par genoma samazināšanu vai genoma sabrukšanu 10, 11, 12, 13.Pašreizējie pētījumi liecina, ka tad, kad mikroorganismi atsakās no sava brīvā dzīvesveida un kļūst par intracelulāriem parazītiem (vai endosimbiontiem), to genomos notiek lēnas, bet pārsteidzošas metamorfozes miljoniem gadu9,11.Procesā, kas pazīstams kā genoma sabrukšana, mikrobu parazīti uzkrāj kaitīgas mutācijas, kas daudzus iepriekš svarīgus gēnus pārvērš pseidogēnos, izraisot pakāpenisku gēnu zudumu un mutāciju sabrukumu14,15.Šis sabrukums var iznīcināt līdz pat 95% gēnu vecākajos intracelulārajos organismos, salīdzinot ar cieši radniecīgām brīvi dzīvojošām sugām.Tādējādi intracelulāro parazītu evolūcija ir virves vilkšana starp diviem pretējiem spēkiem: Darvina dabisko atlasi, kas izraisa parazītu uzlabošanos, un genoma sabrukumu, izmetot parazītus aizmirstībā.Joprojām nav skaidrs, kā parazītam izdevās izkļūt no šīs virves vilkšanas un saglabāt savu molekulārās struktūras aktivitāti.
Lai gan genoma sabrukšanas mehānisms nav pilnībā izprotams, šķiet, ka tas galvenokārt notiek biežas ģenētiskās novirzes dēļ.Tā kā parazīti dzīvo mazās, aseksuālās un ģenētiski ierobežotās populācijās, tie nevar efektīvi novērst kaitīgās mutācijas, kas dažkārt rodas DNS replikācijas laikā.Tas noved pie neatgriezeniskas kaitīgu mutāciju uzkrāšanās un parazīta genoma samazināšanās.Tā rezultātā parazīts ne tikai zaudē gēnus, kas vairs nav nepieciešami tā izdzīvošanai intracelulārajā vidē.Tā ir parazītu populāciju nespēja efektīvi novērst sporādiskas kaitīgas mutācijas, kas izraisa šo mutāciju uzkrāšanos visā genomā, tostarp to svarīgākajos gēnos.
Liela daļa mūsu pašreizējās izpratnes par genoma samazināšanu ir balstīta tikai uz genoma secību salīdzinājumiem, mazāk uzmanības pievēršot izmaiņām faktiskajās molekulās, kas veic mājturības funkcijas un kalpo kā potenciālie narkotiku mērķi.Salīdzinoši pētījumi ir parādījuši, ka kaitīgo intracelulāro mikrobu mutāciju slodze, šķiet, predisponē olbaltumvielas un nukleīnskābju nepareizai salocīšanai un agregācijai, padarot tās atkarīgākas no chaperoniem un paaugstinātas jutības pret karstumu19, 20, 21, 22, 23.Turklāt dažādi parazīti — neatkarīga evolūcija, ko dažkārt atdala pat 2,5 miljardi gadu — piedzīvoja līdzīgu kvalitātes kontroles centru zudumu proteīnu sintēzē5,6 un DNS remonta mehānismos24.Tomēr maz ir zināms par intracelulārā dzīvesveida ietekmi uz visām citām šūnu makromolekulu īpašībām, tostarp molekulāro adaptāciju pieaugošajam kaitīgo mutāciju slogam.
Šajā darbā, lai labāk izprastu intracelulāro mikroorganismu proteīnu un nukleīnskābju evolūciju, noskaidrojām intracelulārā parazīta Encephalitozoon cuniculi ribosomu struktūru.E. cuniculi ir sēnēm līdzīgs organisms, kas pieder pie parazītisko mikrosporidiju grupas, kam ir neparasti mazi eikariotu genomi, un tāpēc tos izmanto kā paraugorganismus genoma sabrukšanas pētīšanai25,26,27,28,29,30.Nesen krio-EM ribosomu struktūra tika noteikta mēreni samazinātiem Microsporidia, Paranosema locustae un Vairimorpha necatrix31, 32 genomiem (~ 3, 2 Mb genoms).Šīs struktūras liecina, ka zināmu rRNS amplifikācijas zudumu kompensē jaunu kontaktu veidošanās starp blakus esošajiem ribosomu proteīniem vai jaunu msL131, 32 ribosomu proteīnu iegūšana.Encefalitozonu sugas (genoms ~ 2,5 miljoni bp) kopā ar to tuvāko radinieku ordosporu uzrāda vislielāko genoma samazināšanās pakāpi eikariotos - tiem ir mazāk nekā 2000 proteīnus kodējošu gēnu, un ir sagaidāms, ka to ribosomās ne tikai trūkst rRNS izplešanās fragmentu (rRNS ribosomu fragmenti, kas atšķir arī ribosomu baktērijas no ribosomu fragmentiem). mal proteīniem, jo ​​tiem nav homologu E. cuniculi genomā26,27,28.Tāpēc mēs secinājām, ka E. cuniculi ribosoma var atklāt iepriekš nezināmas stratēģijas molekulārajai adaptācijai genoma sabrukšanai.
Mūsu krio-EM struktūra ir mazākā eikariotu citoplazmas ribosoma, kas raksturojama, un sniedz ieskatu par to, kā galīgā genoma samazināšanas pakāpe ietekmē šūnā neatņemamās molekulārās iekārtas struktūru, montāžu un evolūciju.Mēs atklājām, ka E. cuniculi ribosoma pārkāpj daudzus plaši konservētos RNS locīšanas un ribosomu montāžas principus, un atklājām jaunu, iepriekš nezināmu ribosomu proteīnu.Diezgan negaidīti mēs parādām, ka mikrosporidiju ribosomas ir attīstījušas spēju saistīt mazas molekulas, un izvirzām hipotēzi, ka rRNS un proteīnu saīsinājumi izraisa evolūcijas jauninājumus, kas galu galā var piešķirt ribosomai noderīgas īpašības.
Lai uzlabotu mūsu izpratni par olbaltumvielu un nukleīnskābju evolūciju intracelulāros organismos, mēs nolēmām izolēt E. cuniculi sporas no inficētu zīdītāju šūnu kultūrām, lai attīrītu to ribosomas un noteiktu šo ribosomu struktūru.Ir grūti iegūt lielu skaitu parazitāro mikrosporidiju, jo mikrosporidijas nevar kultivēt uzturvielu barotnē.Tā vietā tie aug un vairojas tikai saimniekšūnā.Tāpēc, lai iegūtu E. cuniculi biomasu ribosomu attīrīšanai, mēs inficējām zīdītāju nieru šūnu līniju RK13 ar E. cuniculi sporām un kultivējām šīs inficētās šūnas vairākas nedēļas, lai ļautu E. cuniculi augt un vairoties.Izmantojot inficētu šūnu monoslāni aptuveni puskvadrātmetra platībā, mēs varējām attīrīt aptuveni 300 mg Microsporidia sporas un izmantot tās ribosomu izolēšanai.Pēc tam mēs izjauca attīrītās sporas ar stikla lodītēm un izolējām neapstrādātas ribosomas, izmantojot lizātu pakāpenisku polietilēnglikola frakcionēšanu.Tas ļāva iegūt aptuveni 300 µg neapstrādātu E. cuniculi ribosomu struktūras analīzei.
Pēc tam mēs savācām krio-EM attēlus, izmantojot iegūtos ribosomu paraugus, un apstrādājām šos attēlus, izmantojot maskas, kas atbilst lielajai ribosomu apakšvienībai, mazai apakšvienības galvai un mazai apakšvienībai.Šī procesa laikā mēs savācām aptuveni 108 000 ribosomu daļiņu attēlus un aprēķinājām krio-EM attēlus ar izšķirtspēju 2, 7 Å (papildu attēli 1-3).Pēc tam mēs izmantojām krioEM attēlus, lai modelētu rRNS, ribosomu proteīnu un hibernācijas faktoru Mdf1, kas saistīts ar E. cuniculi ribosomām (1.a, b att.).
a E. cuniculi ribosomas struktūra kompleksā ar hibernācijas faktoru Mdf1 (pdb id 7QEP).b Hibernācijas faktora Mdf1 karte, kas saistīta ar E. cuniculi ribosomu.c Sekundārās struktūras karte, kas salīdzina atgūto rRNS Microsporidian sugās ar zināmām ribosomu struktūrām.Paneļi parāda pastiprināto rRNS fragmentu (ES) un ribosomu aktīvo vietu atrašanās vietu, tostarp dekodēšanas vietu (DC), sarcicīna cilpu (SRL) un peptidiltransferāzes centru (PTC).d Elektronu blīvums, kas atbilst E. cuniculi ribosomas peptidiltransferāzes centram, liecina, ka šai katalītiskajai vietai ir tāda pati struktūra E. cuniculi parazītā un tā saimniekos, tostarp H. sapiens.e, f Atbilstošais dekodēšanas centra elektronu blīvums (e) un dekodēšanas centra shematiskā struktūra (f) norāda, ka daudzos citos eikariotos E. cuniculi ir atlikumi U1491, nevis A1491 (E. coli numerācija).Šīs izmaiņas liecina, ka E. cuniculi var būt jutīgs pret antibiotikām, kas ir vērstas uz šo aktīvo vietu.
Atšķirībā no iepriekš izveidotajām V. necatrix un P. locustae ribosomu struktūrām (abas struktūras pārstāv vienu un to pašu microsporidia dzimtu Nosematidae un ir ļoti līdzīgas viena otrai), 31,32 E. cuniculi ribosomas tiek pakļautas daudziem rRNS un olbaltumvielu fragmentācijas procesiem.Turpmāka denaturācija (papildu attēli 4-6).rRNS visspilgtākās izmaiņas ietvēra pilnīgu pastiprinātā 25S rRNS fragmenta ES12L zudumu un h39, h41 un H18 spirāles daļēju deģenerāciju (1.c att., 4. papildu attēls).Starp ribosomu proteīniem visspilgtākās izmaiņas ietvēra pilnīgu eS30 proteīna zudumu un eL8, eL13, eL18, eL22, eL29, eL40, uS3, uS9, uS14, uS17 un eS7 5. papildu attēlu saīsināšanu.
Tādējādi Encephalotozoon/Ordospora sugu genomu ārkārtējais samazinājums atspoguļojas to ribosomu struktūrā: E. cuniculi ribosomas piedzīvo visdramatiskāko olbaltumvielu satura zudumu eikariotu citoplazmas ribosomās, kas pakļautas strukturālajam raksturojumam, un tām pat nav to rRNS un proteīnu fragmentu, kas ir plaši konservēti ne tikai trīs dzīves jomās, bet arī plaši.E. cuniculi ribosomas struktūra nodrošina pirmo šo izmaiņu molekulāro modeli un atklāj evolūcijas notikumus, kas nav ņemti vērā gan salīdzinošajā genomikā, gan intracelulārās biomolekulārās struktūras pētījumos (7. papildu att.).Zemāk mēs aprakstām katru no šiem notikumiem, kā arī to iespējamo evolūcijas izcelsmi un to iespējamo ietekmi uz ribosomu funkciju.
Pēc tam mēs atklājām, ka papildus lieliem rRNS saīsinājumiem E. cuniculi ribosomām ir rRNS variācijas vienā no to aktīvajām vietām.Lai gan E. cuniculi ribosomas peptidiltransferāzes centram ir tāda pati struktūra kā citām eikariotu ribosomām (1.d att.), dekodēšanas centrs atšķiras secības variācijas dēļ pie 1491. nukleotīda (E. coli numerācija, 1.e, f attēls).Šis novērojums ir svarīgs, jo eikariotu ribosomu dekodēšanas vieta parasti satur atlikumus G1408 un A1491, salīdzinot ar baktēriju tipa atlikumiem A1408 un G1491.Šī variācija ir pamatā baktēriju un eikariotu ribosomu atšķirīgajai jutībai pret ribosomu antibiotiku aminoglikozīdu saimi un citām mazām molekulām, kas ir vērstas uz dekodēšanas vietu.E. cuniculi ribosomas dekodēšanas vietā atlikums A1491 tika aizstāts ar U1491, potenciāli radot unikālu saistīšanas interfeisu mazām molekulām, kas vērstas uz šo aktīvo vietu.Tas pats A14901 variants ir sastopams arī citās mikrosporidijās, piemēram, P. locustae un V. necatrix, kas liecina, ka tas ir plaši izplatīts starp mikrosporidiju sugām (1.f attēls).
Tā kā mūsu E. cuniculi ribosomu paraugi tika izolēti no metaboliski neaktīvām sporām, mēs pārbaudījām E. cuniculi krio-EM karti, lai noteiktu iepriekš aprakstīto ribosomu saistīšanos stresa vai bada apstākļos.Hibernācijas faktori 31, 32, 36, 37, 38. Mēs saskaņojām iepriekš izveidoto hibernācijas ribosomas struktūru ar E. cuniculi ribosomas krio-EM karti.Docking S. cerevisiae ribosomas tika izmantotas kompleksā ar hibernācijas faktoru Stm138, siseņu ribosomas kompleksā ar Lso232 faktoru un V. necatrix ribosomas kompleksā ar Mdf1 un Mdf231 faktoriem.Tajā pašā laikā mēs atradām krio-EM blīvumu, kas atbilst atpūtas koeficientam Mdf1.Līdzīgi kā Mdf1 saistās ar V. necatrix ribosomu, Mdf1 saistās arī ar E. cuniculi ribosomu, kur tas bloķē ribosomas E vietu, iespējams, palīdzot padarīt ribosomas pieejamas, kad parazītu sporas ķermeņa inaktivācijas laikā kļūst metaboliski neaktīvas (2. attēls).).
Mdf1 bloķē ribosomas E vietu, kas, šķiet, palīdz inaktivēt ribosomu, kad parazītu sporas kļūst metaboliski neaktīvas.E. cuniculi ribosomas struktūrā mēs atklājām, ka Mdf1 veido iepriekš nezināmu kontaktu ar L1 ribosomas stublāju, ribosomas daļu, kas veicina deacilētā tRNS izdalīšanos no ribosomas proteīna sintēzes laikā.Šie kontakti liecina, ka Mdf1 atdalās no ribosomas, izmantojot to pašu mehānismu kā deacetilētā tRNS, sniedzot iespējamu skaidrojumu tam, kā ribosoma noņem Mdf1, lai atkārtoti aktivizētu proteīnu sintēzi.
Tomēr mūsu struktūra atklāja nezināmu kontaktu starp Mdf1 un L1 ribosomas kāju (ribosomas daļu, kas proteīnu sintēzes laikā palīdz atbrīvot deacilētu tRNS no ribosomas).Jo īpaši Mdf1 izmanto tos pašus kontaktus kā deacilētās tRNS molekulas elkoņa segmentā (2. att.).Šī iepriekš nezināmā molekulārā modelēšana parādīja, ka Mdf1 atdalās no ribosomas, izmantojot to pašu mehānismu kā deacetilētā tRNS, kas izskaidro, kā ribosoma noņem šo hibernācijas faktoru, lai atkārtoti aktivizētu proteīnu sintēzi.
Konstruējot rRNS modeli, mēs atklājām, ka E. cuniculi ribosomā ir neparasti salocīti rRNS fragmenti, kurus nosaucām par sapludināto rRNS (3. att.).Ribosomās, kas aptver trīs dzīvības domēnus, rRNS salokās struktūrās, kurās lielākā daļa rRNS bāzu vai nu savienojas bāzu pāros un salokās viena ar otru, vai mijiedarbojas ar ribosomu proteīniem38, 39, 40.Tomēr šķiet, ka E. cuniculi ribosomās rRNS pārkāpj šo locīšanas principu, pārvēršot dažas to spirāles nesalocītās rRNS reģionos.
H18 25S rRNS spirāles struktūra S. cerevisiae, V. necatrix un E. cuniculi.Parasti ribosomās, kas aptver trīs dzīvības domēnus, šis linkeris savērpjas RNS spirālē, kas satur 24 līdz 34 atlikumus.Turpretī Microsporidia gadījumā šis rRNS linkeris tiek pakāpeniski samazināts līdz diviem vienpavedienu ar uridīnu bagātiem linkeriem, kas satur tikai 12 atlikumus.Lielākā daļa šo atlikumu tiek pakļauti šķīdinātāju iedarbībai.Attēlā parādīts, ka parazitārās mikrosporidijas, šķiet, pārkāpj vispārējos rRNS locīšanas principus, kur rRNS bāzes parasti tiek savienotas ar citām bāzēm vai iesaistītas rRNS-olbaltumvielu mijiedarbībā.Mikrosporīdijā daži rRNS fragmenti iegūst nelabvēlīgu kroku, kurā agrākā rRNS spirāle kļūst par vienpavediena fragmentu, kas izstiepts gandrīz taisnā līnijā.Šo neparasto reģionu klātbūtne ļauj mikrosporidiju rRNS saistīt attālus rRNS fragmentus, izmantojot minimālu RNS bāzu skaitu.
Spilgtāko šīs evolūcijas pārejas piemēru var novērot H18 25S rRNS spirālē (3. att.).Sugās no E. coli līdz cilvēkiem šīs rRNS spirāles pamatnes satur 24-32 nukleotīdus, veidojot nedaudz neregulāru spirāli.Iepriekš identificētajās ribosomu struktūrās no V. necatrix un P. locustae31,32 H18 spirāles pamatnes ir daļēji atritinātas, bet nukleotīdu bāzu pāri ir saglabāti.Tomēr E. cuniculi šis rRNS fragments kļūst par īsākajiem linkeriem 228UUUGU232 un 301UUUUUUUUUU307.Atšķirībā no tipiskiem rRNS fragmentiem, šie ar uridīnu bagātie linkeri nesaritinās un nesaskaras ar ribosomu proteīniem.Tā vietā tie izmanto šķīdinātājam atvērtas un pilnībā nesalocītas struktūras, kurās rRNS pavedieni ir izstiepti gandrīz taisni.Šī izstieptā konformācija izskaidro, kā E. cuniculi izmanto tikai 12 RNS bāzes, lai aizpildītu 33 Å atstarpi starp H16 un H18 rRNS spirālēm, savukārt citām sugām ir nepieciešams vismaz divreiz vairāk rRNS bāzu, lai aizpildītu spraugu.
Tādējādi mēs varam parādīt, ka, izmantojot enerģētiski nelabvēlīgu locīšanu, parazitārās mikrosporidijas ir izstrādājušas stratēģiju, lai sarautu pat tos rRNS segmentus, kas joprojām ir plaši konservēti visās sugās trīs dzīves jomās.Acīmredzot, uzkrājot mutācijas, kas pārveido rRNS spirāles īsos poli-U linkeros, E. cuniculi var veidot neparastus rRNS fragmentus, kas satur pēc iespējas mazāk nukleotīdu distālo rRNS fragmentu ligēšanai.Tas palīdz izskaidrot, kā mikrosporidijas panāca dramatisku to pamata molekulārās struktūras samazināšanos, nezaudējot savu strukturālo un funkcionālo integritāti.
Vēl viena neparasta E. cuniculi rRNS iezīme ir rRNS parādīšanās bez sabiezējumiem (4. att.).Izspiedumi ir nukleotīdi bez bāzu pāriem, kas izgriežas no RNS spirāles, nevis slēpjas tajā.Lielākā daļa rRNS izvirzījumu darbojas kā molekulārās līmvielas, palīdzot saistīt blakus esošos ribosomu proteīnus vai citus rRNS fragmentus.Daži izciļņi darbojas kā eņģes, ļaujot rRNS spirālei optimāli saliekties un salocīt produktīvai olbaltumvielu sintēzei41.
a rRNS izvirzījuma (S. cerevisiae numerācija) nav E. cuniculi ribosomu struktūrā, bet tas ir sastopams lielākajā daļā citu eikariotu b E. coli, S. cerevisiae, H. sapiens un E. cuniculi iekšējās ribosomas.parazītiem trūkst daudzu seno, ļoti konservēto rRNS izciļņu.Šie sabiezējumi stabilizē ribosomu struktūru;tāpēc to neesamība mikrosporidijās norāda uz samazinātu rRNS locīšanas stabilitāti mikrosporidiju parazītos.Salīdzinājums ar P kātiem (L7/L12 stublāji baktērijās) liecina, ka rRNS izciļņu zudums dažkārt sakrīt ar jaunu izciļņu parādīšanos blakus zaudētajiem izciļņiem.H42 spirālei 23S/28S rRNS ir sens izliekums (U1206 Saccharomyces cerevisiae), kas tiek lēsts vismaz 3,5 miljardu gadu vecs, pateicoties tā aizsardzībai trīs dzīves jomās.Mikrosporidijā šis izspiedums tiek novērsts.Taču blakus pazaudētajam izspiedumam (A1306 in E. cuniculi) parādījās jauns izspiedums.
Pārsteidzoši, mēs atklājām, ka E. cuniculi ribosomām trūkst lielākās daļas rRNS izspiedumu, kas atrodami citās sugās, tostarp vairāk nekā 30 izciļņu, kas saglabājušies citos eikariotos (4.a attēls).Šis zudums novērš daudzus kontaktus starp ribosomu apakšvienībām un blakus esošajām rRNS spirālēm, dažkārt ribosomā radot lielus dobus tukšumus, padarot E. cuniculi ribosomu poraināku salīdzinājumā ar tradicionālākām ribosomām (4.b att.).Konkrēti, mēs atklājām, ka lielākā daļa šo izspiedumu tika zaudēti arī iepriekš identificētajās V. necatrix un P. locustae ribosomu struktūrās, kas netika ņemtas vērā iepriekšējās struktūras analīzēs31, 32.
Dažreiz rRNS izspiedumu zudumu pavada jaunu izciļņu veidošanās blakus zaudētajam izliekumam.Piemēram, ribosomu P-stublājs satur U1208 izspiedumu (Saccharomyces cerevisiae), kas izdzīvoja no E. coli līdz cilvēkiem, un tāpēc tiek lēsts, ka tā vecums ir 3,5 miljardi gadu.Olbaltumvielu sintēzes laikā šis izspiedums palīdz P stumbram pārvietoties starp atvērtām un slēgtām konformācijām, lai ribosoma varētu piesaistīt translācijas faktorus un nogādāt tos aktīvajā vietā.E. cuniculi ribosomās šī sabiezējuma nav;tomēr jauns sabiezējums (G883), kas atrodas tikai trīs bāzes pāros, var veicināt P stumbra optimālās elastības atjaunošanos (4.c att.).
Mūsu dati par rRNS bez izliekumiem liecina, ka rRNS minimizēšana neaprobežojas tikai ar rRNS elementu zudumu uz ribosomas virsmas, bet var ietvert arī ribosomas kodolu, radot parazītiem raksturīgu molekulāro defektu, kas nav aprakstīts brīvi dzīvojošās šūnās.tiek novērotas dzīvas sugas.
Pēc kanonisko ribosomu proteīnu un rRNS modelēšanas mēs atklājām, ka parastie ribosomu komponenti nevar izskaidrot trīs krio-EM attēla daļas.Divi no šiem fragmentiem ir mazas molekulas (5. att., 8. papildu att.).Pirmais segments ir iestiprināts starp ribosomu proteīniem uL15 un eL18 pozīcijā, ko parasti aizņem eL18 C-gals, kas ir saīsināts E. cuniculi.Lai gan mēs nevaram noteikt šīs molekulas identitāti, šīs blīvuma salas lielums un forma ir labi izskaidrojama ar spermidīna molekulu klātbūtni.Tās saistīšanos ar ribosomu stabilizē mikrosporidijām specifiskās mutācijas uL15 proteīnos (Asp51 un Arg56), kas, šķiet, palielina ribosomas afinitāti pret šo mazo molekulu, jo ļauj uL15 ietīt mazo molekulu ribosomu struktūrā.Papildu 2. attēls).8, papildu dati 1, 2).
Krio-EM attēlveidošana, kas parāda nukleotīdu klātbūtni ārpus ribozes, kas saistīta ar E. cuniculi ribosomu.E. cuniculi ribosomā šis nukleotīds ieņem to pašu vietu kā 25S rRNS A3186 nukleotīds (Saccharomyces cerevisiae numerācija) lielākajā daļā citu eikariotu ribosomu.b E. cuniculi ribosomu struktūrā šis nukleotīds atrodas starp ribosomu proteīniem uL9 un eL20, tādējādi stabilizējot kontaktu starp abiem proteīniem.cd eL20 sekvences saglabāšanas analīze starp mikrosporidiju sugām.Microsporidia sugas filoģenētiskais koks (c) un eL20 proteīna (d) vairāku secību izlīdzināšana liecina, ka nukleotīdus saistošie atlikumi F170 un K172 ir konservēti vairumā tipisko Microsporidia, izņemot S. lophii, izņemot agri sazarotās Microsporidia, kas saglabāja rRNS paplašinājumu ES39L.e Šis attēls parāda, ka nukleotīdus saistošie atlikumi F170 un K172 atrodas tikai ļoti samazinātā mikrosporidiju genoma eL20, bet ne citos eikariotos.Kopumā šie dati liecina, ka Microsporidian ribosomas ir izveidojušas nukleotīdu saistīšanās vietu, kas, šķiet, saistās ar AMP molekulām un izmanto tās, lai stabilizētu proteīnu-olbaltumvielu mijiedarbību ribosomu struktūrā.Šīs saistīšanās vietas augstā saglabāšana Microsporidia un tās trūkums citos eikariotos liecina, ka šī vieta var nodrošināt selektīvu Microsporidia izdzīvošanas priekšrocību.Tādējādi nukleotīdus saistošā kabata mikrosporidiju ribosomā, šķiet, nav deģenerēta iezīme vai rRNS degradācijas beigu forma, kā aprakstīts iepriekš, bet drīzāk noderīgs evolucionārs jauninājums, kas ļauj mikrosporidiju ribosomai tieši saistīt mazas molekulas, izmantojot tās kā molekulāros celtniecības blokus.ribosomu celtniecības bloki.Šis atklājums padara mikrosporidiju ribosomu par vienīgo ribosomu, kas izmanto vienu nukleotīdu kā savu strukturālo bloku.f Hipotētisks evolūcijas ceļš, kas iegūts no nukleotīdu saistīšanās.
Otrs zemas molekulmasas blīvums atrodas saskarē starp ribosomu proteīniem uL9 un eL30 (5.a attēls).Šī saskarne iepriekš tika aprakstīta Saccharomyces cerevisiae ribosomas struktūrā kā saistīšanās vieta rRNS A3186 25S nukleotīdam (daļa no ES39L rRNS paplašinājuma)38.Tika parādīts, ka deģenerētās P. locustae ES39L ribosomās šī saskarne saistās ar nezināmu vienu nukleotīdu 31, un tiek pieņemts, ka šis nukleotīds ir reducēta galīgā rRNS forma, kurā rRNS garums ir ~130-230 bāzes.ES39L tiek reducēts līdz vienam nukleotīdam 32.43.Mūsu krio-EM attēli atbalsta domu, ka blīvumu var izskaidrot ar nukleotīdiem.Tomēr mūsu struktūras augstāka izšķirtspēja parādīja, ka šis nukleotīds ir ekstraribosomāla molekula, iespējams, AMP (5a, b att.).
Pēc tam mēs jautājām, vai nukleotīdu saistīšanās vieta parādījās E. cuniculi ribosomā, vai arī tā pastāvēja iepriekš.Tā kā nukleotīdu saistīšanos galvenokārt veicina Phe170 un Lys172 atlikumi eL30 ribosomu proteīnā, mēs novērtējām šo atlikumu saglabāšanos 4396 reprezentatīvos eikariotos.Tāpat kā iepriekš uL15 gadījumā, mēs noskaidrojām, ka Phe170 un Lys172 atlikumi ir ļoti konservēti tikai tipiskajos Microsporidia, bet nav citos eikariotos, tostarp netipiskajos Microsporidia Mitosporidium un Amphiamblys, kuros ES39L rRNS fragments nav samazināts (4F5,45c).-e).
Kopumā šie dati apstiprina domu, ka E. cuniculi un, iespējams, citas kanoniskās mikrosporidijas ir attīstījušas spēju efektīvi uztvert lielu skaitu mazu metabolītu ribosomu struktūrā, lai kompensētu rRNS un olbaltumvielu līmeņa pazemināšanos.To darot, viņi ir izstrādājuši unikālu spēju saistīt nukleotīdus ārpus ribosomas, parādot, ka parazitārās molekulārās struktūras to kompensē, uztverot bagātīgus mazus metabolītus un izmantojot tos kā degradētās RNS un olbaltumvielu fragmentu strukturālās imitācijas..
Trešā nemimulētā mūsu krio-EM kartes daļa, kas atrodama lielajā ribosomu apakšvienībā.Mūsu kartes salīdzinoši augstā izšķirtspēja (2,6 Å) liecina, ka šis blīvums pieder proteīniem ar unikālām lielu sānu ķēdes atlieku kombinācijām, kas ļāva mums identificēt šo blīvumu kā iepriekš nezināmu ribosomu proteīnu, ko identificējām kā msL2 (Microsporidia-specific protein L2) (metodes, 6. attēls).Mūsu homoloģijas meklēšana parādīja, ka msL2 ir saglabājies Encephaliter un Orosporidium ģints Microsporidia kladē, bet nav citās sugās, tostarp citās Microsporidia.Ribosomu struktūrā msL2 aizņem plaisu, ko veido paplašinātās ES31L rRNS zudums.Šajā tukšumā msL2 palīdz stabilizēt rRNS locīšanu un var kompensēt ES31L zudumu (6. attēls).
a E. cuniculi ribosomās atrastā Microsporidia specifiskā ribosomu proteīna msL2 elektronu blīvums un modelis.b Lielākajai daļai eikariotu ribosomu, ieskaitot Saccharomyces cerevisiae 80S ribosomu, ES19L rRNS amplifikācija ir zaudēta lielākajā daļā Microsporidian sugu.Iepriekš izveidotā V. necatrix microsporidia ribosomas struktūra liecina, ka ES19L zudumu šajos parazītos kompensē jaunā msL1 ribosomu proteīna evolūcija.Šajā pētījumā mēs atklājām, ka E. cuniculi ribosoma attīstīja arī papildu ribosomu RNS imitējošu proteīnu kā šķietamu kompensāciju par ES19L zudumu.Tomēr msL2 (pašlaik anotēts kā hipotētiskais ECU06_1135 proteīns) un msL1 ir atšķirīga strukturālā un evolūcijas izcelsme.c Šis atklājums par evolucionāli nesaistītu msL1 un msL2 ribosomu proteīnu veidošanos liecina, ka, ja ribosomas savā rRNS uzkrāj kaitīgas mutācijas, tās var sasniegt nepieredzētu sastāva daudzveidības līmeni pat nelielā cieši saistītu sugu apakškopā.Šis atklājums varētu palīdzēt noskaidrot mitohondriju ribosomas izcelsmi un evolūciju, kas ir pazīstama ar ļoti samazinātu rRNS un neparastu olbaltumvielu sastāva mainīgumu dažādās sugās.
Pēc tam mēs salīdzinājām msL2 proteīnu ar iepriekš aprakstīto msL1 proteīnu, vienīgo zināmo mikrosporīdijām specifisko ribosomu proteīnu, kas atrodams V. necatrix ribosomā.Mēs vēlējāmies pārbaudīt, vai msL1 un msL2 ir evolucionāri saistīti.Mūsu analīze parādīja, ka msL1 un msL2 ribosomu struktūrā ieņem vienu un to pašu dobumu, bet tām ir atšķirīgas primārās un terciārās struktūras, kas liecina par to neatkarīgo evolūcijas izcelsmi (6. att.).Tādējādi mūsu msL2 atklājums sniedz pierādījumus tam, ka kompaktu eikariotu sugu grupas var neatkarīgi attīstīt strukturāli atšķirīgus ribosomu proteīnus, lai kompensētu rRNS fragmentu zudumu.Šis atklājums ir ievērojams ar to, ka lielākā daļa citoplazmas eikariotu ribosomu satur nemainīgu proteīnu, tostarp to pašu 81 ribosomu proteīna ģimeni.MSL1 un msL2 parādīšanās dažādās mikrosporidiju kladēs, reaģējot uz paplašināto rRNS segmentu zudumu, liecina, ka parazīta molekulārās arhitektūras degradācija liek parazītiem meklēt kompensējošas mutācijas, kas galu galā var novest pie to iegūšanas dažādās parazītu populācijās.struktūras.
Visbeidzot, kad mūsu modelis bija pabeigts, mēs salīdzinājām E. cuniculi ribosomas sastāvu ar to, kas tika prognozēts no genoma secības.Iepriekš tika uzskatīts, ka E. cuniculi genomā trūkst vairāku ribosomu proteīnu, tostarp eL14, eL38, eL41 un eS30, jo acīmredzami nav to homologu E. cuniculi genomā.Daudzu ribosomu proteīnu zudums tiek prognozēts arī lielākajā daļā citu ļoti samazinātu intracelulāro parazītu un endosimbiontu.Piemēram, lai gan lielākā daļa brīvi dzīvojošo baktēriju satur vienu un to pašu 54 ribosomu proteīnu saimi, tikai 11 no šīm proteīnu ģimenēm ir nosakāmi homologi katrā analizētajā saimnieka ierobežoto baktēriju genomā.Lai pamatotu šo ideju, eksperimentāli ir novērots ribosomu proteīnu zudums V. necatrix un P. locustae microsporidia, kam trūkst eL38 un eL4131,32 proteīnu.
Tomēr mūsu struktūras liecina, ka tikai eL38, eL41 un eS30 faktiski tiek zaudēti E. cuniculi ribosomā.eL14 proteīns tika saglabāts, un mūsu struktūra parādīja, kāpēc šo proteīnu nevarēja atrast homoloģijas meklēšanā (7. att.).E. cuniculi ribosomās lielākā daļa eL14 saistīšanās vietas tiek zaudēta rRNS amplificētā ES39L degradācijas dēļ.Ja nebija ES39L, eL14 zaudēja lielāko daļu savas sekundārās struktūras, un tikai 18% no eL14 sekvences bija identiskas E. cuniculi un S. cerevisiae.Šī sliktā secības saglabāšana ir ievērojama, jo pat Saccharomyces cerevisiae un Homo sapiens — organismi, kas attīstījušies ar 1,5 miljardu gadu starpību — eL14 satur vairāk nekā 51% to pašu atlieku.Šis anomālais saglabāšanās zudums izskaidro, kāpēc E. cuniculi eL14 pašlaik tiek anotēts kā iespējamais M970_061160 proteīns, nevis kā eL1427 ribosomu proteīns.
un Microsporidia ribosoma zaudēja ES39L rRNS paplašinājumu, kas daļēji likvidēja eL14 ribosomu proteīna saistīšanās vietu.Ja nav ES39L, eL14 mikrosporu proteīns zaudē sekundāro struktūru, kurā bijušais rRNS saistošais α-spirāle deģenerējas minimāla garuma cilpā.b Vairāku secību saskaņošana parāda, ka eL14 proteīns ir ļoti konservēts eikariotu sugās (57% secības identitāte starp rauga un cilvēka homologiem), bet slikti konservēts un atšķirīgs mikrosporidijā (kurā ne vairāk kā 24% atlikumu ir identiski eL14 homologam).no S. cerevisiae vai H. sapiens).Šī sliktā secības saglabāšanās un sekundārās struktūras mainīgums izskaidro, kāpēc eL14 homologs nekad nav atrasts E. cuniculi un kāpēc tiek uzskatīts, ka šis proteīns ir pazudis E. cuniculi.Turpretim E. cuniculi eL14 iepriekš tika anotēts kā iespējamais M970_061160 proteīns.Šis novērojums liecina, ka šobrīd mikrosporidiju genoma daudzveidība ir pārvērtēta: daži gēni, kas pašlaik tiek uzskatīti par pazudušiem mikrosporidijās, patiesībā ir saglabāti, lai gan ļoti diferencētās formās;tā vietā tiek uzskatīts, ka daži kodē mikrosporidiju gēnus tārpiem raksturīgiem proteīniem (piemēram, hipotētiskais proteīns M970_061160) faktiski kodē ļoti daudzveidīgos proteīnus, kas atrodami citos eikariotos.
Šis atklājums liecina, ka rRNS denaturācija var izraisīt dramatisku secības saglabāšanas zudumu blakus esošajos ribosomu proteīnos, padarot šos proteīnus nenosakāmus homoloģijas meklējumos.Tādējādi mēs varam pārvērtēt faktisko molekulārās degradācijas pakāpi mazos genoma organismos, jo daži proteīni, kas tiek uzskatīti par zaudētiem, faktiski saglabājas, kaut arī ļoti mainītās formās.
Kā parazīti var saglabāt savu molekulāro mašīnu funkciju ārkārtējas genoma samazināšanas apstākļos?Mūsu pētījums atbild uz šo jautājumu, aprakstot E. cuniculi, organisma ar vienu no mazākajiem eikariotu genomiem, sarežģīto molekulāro struktūru (ribosomu).
Jau gandrīz divas desmitgades ir zināms, ka proteīnu un RNS molekulas mikrobu parazītos bieži atšķiras no to homologajām molekulām brīvi dzīvojošajās sugās, jo tām trūkst kvalitātes kontroles centru, brīvi dzīvojošos mikrobos tās ir samazinātas līdz 50% no to lieluma utt.daudzas novājinošas mutācijas, kas pasliktina locīšanu un darbību.Piemēram, sagaidāms, ka mazu genoma organismu, tostarp daudzu intracelulāru parazītu un endosimbiontu, ribosomām pietrūks vairāku ribosomu proteīnu un līdz pat vienai trešdaļai rRNS nukleotīdu, salīdzinot ar brīvi dzīvojošām sugām 27, 29, 30, 49. Tomēr veids, kādā šīs molekulas galvenokārt funkcionē, ​​galvenokārt tiek pētīts, izmantojot mysterycoms.
Mūsu pētījums parāda, ka makromolekulu struktūra var atklāt daudzus evolūcijas aspektus, kurus ir grūti iegūt no tradicionālajiem salīdzinošajiem intracelulāro parazītu un citu saimniekorganismu ierobežoto organismu genoma pētījumiem (7. papildu attēls).Piemēram, eL14 proteīna piemērs parāda, ka mēs varam pārvērtēt faktisko molekulārā aparāta degradācijas pakāpi parazītu sugās.Tagad tiek uzskatīts, ka encefalīta parazītiem ir simtiem mikrosporīdijām raksturīgu gēnu.Tomēr mūsu rezultāti liecina, ka daži no šiem šķietami specifiskajiem gēniem patiesībā ir tikai ļoti atšķirīgi gēnu varianti, kas ir izplatīti citos eikariotos.Turklāt msL2 proteīna piemērs parāda, kā mēs ignorējam jaunus ribosomu proteīnus un nepietiekami novērtējam parazītu molekulāro mašīnu saturu.Mazo molekulu piemērs parāda, kā mēs varam nepamanīt ģeniālākos jauninājumus parazītu molekulu struktūrās, kas var dot tām jaunu bioloģisko aktivitāti.
Kopumā šie rezultāti uzlabo mūsu izpratni par atšķirībām starp saimniekorganismu ierobežoto organismu molekulārajām struktūrām un to līdziniekiem brīvi dzīvojošos organismos.Mēs parādām, ka molekulārajām mašīnām, par kurām ilgu laiku tika uzskatīts, ka tās ir reducētas, deģenerētas un pakļautas dažādām novājinošām mutācijām, tā vietā ir virkne sistemātiski ignorētu neparastu strukturālu iezīmju.
No otras puses, neapjomīgie rRNS fragmenti un sapludinātie fragmenti, ko mēs atradām E. cuniculi ribosomās, liecina, ka genoma samazināšana var mainīt pat tās pamata molekulārās iekārtas daļas, kas ir saglabājušās trīs dzīves jomās – pēc gandrīz 3,5 miljardiem gadu .neatkarīga sugu evolūcija.
Ņemot vērā iepriekšējos pētījumus par RNS molekulām endosimbiotiskajās baktērijās, īpaši interesanti ir bezizspiedušies un sapludinātie rRNS fragmenti E. cuniculi ribosomās.Piemēram, laputu endosimbiontā Buchnera aphidicola ir pierādīts, ka rRNS un tRNS molekulām ir temperatūras jutīgas struktūras A + T sastāva novirzes un lielas nekanonisku bāzes pāru īpatsvara dēļ20, 50.Pašlaik tiek uzskatīts, ka šīs RNS izmaiņas, kā arī izmaiņas olbaltumvielu molekulās ir atbildīgas par endosimbiontu pārmērīgo atkarību no partneriem un endosimbiontu nespēju nodot siltumu 21, 23 .Lai gan parazītu mikrosporidiju rRNS ir strukturāli atšķirīgas izmaiņas, šo izmaiņu raksturs liek domāt, ka samazināta termiskā stabilitāte un lielāka atkarība no chaperona proteīniem var būt kopīgas RNS molekulu iezīmes organismos ar samazinātiem genomiem.
No otras puses, mūsu struktūras liecina, ka parazītu mikrosporidijas ir attīstījušas unikālu spēju pretoties plaši konservētiem rRNS un olbaltumvielu fragmentiem, attīstot spēju izmantot bagātīgus un viegli pieejamus mazus metabolītus kā deģenerētu rRNS un olbaltumvielu fragmentu strukturālus imitācijas.Molekulārās struktūras degradācija..Šo viedokli apstiprina fakts, ka mazas molekulas, kas kompensē proteīna fragmentu zudumu E. cuniculi rRNS un ribosomās, saistās ar mikrosporidijām specifiskiem atlikumiem uL15 un eL30 proteīnos.Tas liek domāt, ka mazu molekulu saistīšanās ar ribosomām var būt pozitīvas atlases produkts, kurā Microsporidia specifiskās mutācijas ribosomu proteīnos ir atlasītas, ņemot vērā to spēju palielināt ribosomu afinitāti pret mazām molekulām, kas var novest pie efektīvākiem ribosomu organismiem.Atklājums atklāj gudru jauninājumu mikrobu parazītu molekulārajā struktūrā un sniedz mums labāku izpratni par to, kā parazītu molekulārās struktūras saglabā savu funkciju, neskatoties uz reduktīvo evolūciju.
Pašlaik šo mazo molekulu identifikācija joprojām ir neskaidra.Nav skaidrs, kāpēc šo mazo molekulu izskats ribosomu struktūrā atšķiras starp mikrosporidiju sugām.Jo īpaši nav skaidrs, kāpēc nukleotīdu saistīšanās tiek novērota E. cuniculi un P. locustae ribosomās, nevis V. necatrix ribosomās, neskatoties uz F170 atlikuma klātbūtni V. necatrix eL20 un K172 proteīnos.Šo dzēšanu var izraisīt atlikums 43 uL6 (atrodas blakus nukleotīdu saistošajai kabatai), kas ir tirozīns V. necatrix, nevis treonīns E. cuniculi un P. locustae.Tyr43 apjomīgā aromātiskā sānu ķēde var traucēt nukleotīdu saistīšanos steriskās pārklāšanās dēļ.Alternatīvi, šķietamā nukleotīdu dzēšana var būt saistīta ar zemo krio-EM attēlveidošanas izšķirtspēju, kas kavē V. necatrix ribosomu fragmentu modelēšanu.
No otras puses, mūsu darbs liecina, ka genoma sabrukšanas process var būt izgudrojošs spēks.Jo īpaši E. cuniculi ribosomas struktūra liecina, ka rRNS un olbaltumvielu fragmentu zudums mikrosporidiju ribosomā rada evolūcijas spiedienu, kas veicina ribosomu struktūras izmaiņas.Šie varianti atrodas tālu no ribosomas aktīvās vietas un, šķiet, palīdz uzturēt (vai atjaunot) optimālu ribosomu komplektāciju, ko citādi izjauktu samazināta rRNS.Tas liecina, ka galvenais mikrosporidiju ribosomu jauninājums, šķiet, ir attīstījies par nepieciešamību buferēt gēnu novirzi.
Varbūt to vislabāk ilustrē nukleotīdu saistīšanās, kas līdz šim nekad nav novērota citos organismos.Fakts, ka nukleotīdus saistošās atliekas atrodas tipiskās mikrosporīdijās, bet ne citos eikariotos, liecina, ka nukleotīdu saistošās vietas nav tikai relikvijas, kas gaida pazušanu, vai galīgā vieta rRNS atjaunošanai atsevišķu nukleotīdu formā.Tā vietā šī vietne šķiet noderīga funkcija, kas varētu būt attīstījusies vairākās pozitīvas atlases kārtās.Nukleotīdu saistīšanās vietas var būt dabiskās atlases blakusprodukts: tiklīdz ES39L ir noārdījies, mikrosporidijas ir spiestas meklēt kompensāciju, lai atjaunotu optimālu ribosomu bioģenēzi, ja ES39L nav.Tā kā šis nukleotīds var atdarināt ES39L A3186 nukleotīda molekulāros kontaktus, nukleotīda molekula kļūst par ribosomas celtniecības bloku, kuras saistīšanos vēl vairāk uzlabo eL30 secības mutācija.
Attiecībā uz intracelulāro parazītu molekulāro evolūciju mūsu pētījums parāda, ka Darvina dabiskās atlases spēki un genoma sabrukšanas ģenētiskā novirze nedarbojas paralēli, bet svārstās.Pirmkārt, ģenētiskā novirze novērš svarīgas biomolekulu iezīmes, tāpēc kompensācija ir ļoti nepieciešama.Tikai tad, kad parazīti apmierinās šo vajadzību, izmantojot Darvina dabisko atlasi, viņu makromolekulām būs iespēja attīstīt savas iespaidīgākās un novatoriskākās īpašības.Svarīgi ir tas, ka nukleotīdu saistīšanās vietu evolūcija E. cuniculi ribosomā liek domāt, ka šis molekulārās evolūcijas modelis ar zaudējumiem un ieguvumiem ne tikai amortizē kaitīgas mutācijas, bet dažreiz piešķir pilnīgi jaunas funkcijas parazitārām makromolekulām.
Šī ideja saskan ar Sevela Raita kustīgā līdzsvara teoriju, kurā teikts, ka stingra dabiskās atlases sistēma ierobežo organismu spēju ieviest jauninājumus51,52,53.Tomēr, ja ģenētiskā novirze izjauc dabisko atlasi, šīs novirzes var radīt izmaiņas, kas pašas par sevi nav adaptīvas (vai pat kaitīgas), bet noved pie turpmākām izmaiņām, kas nodrošina augstāku piemērotību vai jaunu bioloģisko aktivitāti.Mūsu sistēma atbalsta šo ideju, ilustrējot, ka tāda paša veida mutācijas, kas samazina biomolekulas kroku un funkciju, šķiet, ir galvenais tās uzlabošanas ierosinātājs.Saskaņā ar abpusēji izdevīgo evolūcijas modeli mūsu pētījums parāda, ka genoma sabrukšana, kas tradicionāli tiek uzskatīta par deģeneratīvu procesu, ir arī galvenais inovāciju virzītājspēks, kas dažreiz un varbūt pat bieži ļauj makromolekulām iegūt jaunas parazitāras aktivitātes.var tās izmantot.