Dažas LC problēmu novēršanas tēmas nekad nav novecojušas, jo LC praksē pastāv problēmas, pat ja instrumentu tehnoloģija laika gaitā uzlabojas. LC sistēmā var rasties problēmas un rasties slikta pīķa forma. Ja rodas problēmas, kas saistītas ar pīķa formu, īss iespējamo šo rezultātu cēloņu saraksts palīdz vienkāršot mūsu problēmu novēršanas pieredzi.
Ir bijis jautri rakstīt šo “Šķidruma hromatogrāfijas problēmu novēršanas” sleju un katru mēnesi domāt par tēmām, jo ​​dažas tēmas nekad neiziet no modes. Lai gan hromatogrāfijas pētījumu jomā noteiktas tēmas vai idejas noveco, jo tās aizstāj jaunākas un labākas idejas, problēmu novēršanas jomā kopš pirmā problēmu novēršanas raksta parādīšanās šajā žurnālā (tolaik LC Journal) 1983. gadā (1), jo dažas tēmas joprojām ir aktuālas. Pēdējo gadu laikā esmu pievērsis vairākas LC problēmu novēršanas sadaļas mūsdienu tendencēm, kas ietekmē šķidruma hromatogrāfiju (ŠH) (piemēram, mūsu izpratnes relatīvais salīdzinājums par spiediena ietekmi uz aizturi [2] New Advances), mūsu ŠH rezultātu interpretācija un to, kā novērst problēmas ar modernām ŠH instrumentiem. Šī mēneša daļā es turpinu savu sēriju (3), kas sākās 2021. gada decembrī un kurā uzmanība tika pievērsta dažām ŠH problēmu novēršanas “dzīvības un nāves” tēmām — elementi, kas ir lieliski piemēroti jebkuram problēmu risinātājam, ir būtiski neatkarīgi no izmantotās sistēmas vecuma. Šīs sērijas galvenā tēma ir ļoti atbilstoša LCGC slavenajai “ŠH problēmu novēršanas rokasgrāmatai” (4), kas karājas... daudzas laboratorijas. Šīs sērijas trešajā daļā es izvēlējos pievērsties jautājumiem, kas saistīti ar pīķa formu vai pīķa raksturlielumiem. Neticami, bet sienas diagrammā ir uzskaitīti 44 dažādi iespējamie sliktas pīķa formas cēloņi! Mēs nevaram visas šīs problēmas detalizēti aplūkot vienā rakstā, tāpēc šajā pirmajā daļā par šo tēmu es pievērsīšos dažām no tām, kuras redzu visbiežāk. Es ceru, ka jauni un veci LC lietotāji atradīs noderīgus padomus un atgādinājumus par šo svarīgo tēmu.
Arvien biežāk uz problēmu novēršanas jautājumiem atbildu ar vārdiem: "Viss ir iespējams". Šī atbilde var šķist vienkārša, ņemot vērā grūti interpretējamus novērojumus, taču es to bieži uzskatu par atbilstošu. Ņemot vērā daudzos iespējamos sliktas pīķa formas cēloņus, ir svarīgi saglabāt atvērtu prātu, apsverot problēmas cēloni, un spēt noteikt prioritātes potenciālajiem cēloņiem, lai sāktu problēmu novēršanu, koncentrējoties uz visbiežāk sastopamajām iespējām, un šis punkts ir ļoti svarīgs.
Jebkura problēmu novēršanas vingrinājuma galvenais solis, taču, manuprāt, nepietiekami novērtēts, ir atzīt, ka pastāv problēma, kas jāatrisina. Atzīt, ka pastāv problēma, bieži vien nozīmē atzīt, ka ar rīku notiekošais atšķiras no mūsu cerībām, kuras veido teorija, empīriskās zināšanas un pieredze (5). Šeit minētā "pīķa forma" patiesībā attiecas ne tikai uz pīķa formu (simetriska, asimetriska, gluda, pūkaina, ar priekšējo malu, ar asti utt.), bet arī uz platumu. Mūsu cerības attiecībā uz faktisko pīķa formu ir vienkāršas. Teorija (6) labi apstiprina mācību grāmatā minēto cerību, ka vairumā gadījumu hromatogrāfiskajiem pīķiem jābūt simetriskiem un jāatbilst Gausa sadalījuma formai, kā parādīts 1.a attēlā. Tas, ko mēs sagaidām no pīķa platumiem, ir sarežģītāks jautājums, un mēs šo tēmu apspriedīsim nākamajā rakstā. Citas pīķa formas 1. attēlā parāda dažas citas iespējas, ko varētu novērot, citiem vārdiem sakot, dažus veidus, kā lietas varētu noiet greizi. Atlikušajā šīs daļas daļā mēs veltīsim laiku dažu konkrētu situāciju piemēru apspriešanai, kas var novest pie šīm formām. veidi.
Dažreiz pīķi hromatogrammā vispār netiek novēroti vietā, kur tiem vajadzētu eluēties. Iepriekš redzamā sienas diagramma norāda, ka pīķa neesamība (pieņemot, ka paraugs faktiski satur mērķa analītu koncentrācijā, kas detektora reakcijai vajadzētu būt pietiekamai, lai to redzētu virs trokšņa) parasti ir saistīta ar kādu instrumenta problēmu vai nepareiziem mobilās fāzes apstākļiem (ja tie vispār tiek novēroti). Pīķi parasti ir pārāk “vāji”. Īss iespējamo problēmu un risinājumu saraksts šajā kategorijā ir atrodams I tabulā.
Kā minēts iepriekš, jautājums par to, cik liela pīķa paplašināšanās būtu pieļaujama, pirms pievērst tai uzmanību un mēģināt to labot, ir sarežģīta tēma, ko es apspriedīšu nākamajā rakstā. Mana pieredze liecina, ka ievērojama pīķa paplašināšanās bieži vien ir saistīta ar ievērojamām pīķa formas izmaiņām, un pīķa "astes" veidošanās ir biežāk sastopama nekā pirmspīķa paplašināšanās vai sadalīšanās. Tomēr arī nomināli simetriskās virsotnes tiek paplašinātas, ko var izraisīt daži dažādi iemesli:
Katra no šīm problēmām ir detalizēti apspriesta iepriekšējos Troubleshooting LC numuros, un lasītāji, kurus interesē šīs tēmas, var iepazīties ar šiem iepriekšējiem rakstiem, lai iegūtu informāciju par šo problēmu pamatcēloņiem un iespējamiem risinājumiem. Plašāka informācija.
Pīķu "astes" veidošanos, pīķu "frontes" veidošanos un sadalīšanos var izraisīt ķīmiskas vai fizikālas parādības, un iespējamo risinājumu saraksts šīm problēmām ir ļoti atšķirīgs atkarībā no tā, vai mēs strādājam ar ķīmisku vai fizisku problēmu. Bieži vien, salīdzinot dažādus pīķus hromatogrammā, var atrast svarīgas norādes par to, kurš ir vaininieks. Ja visiem hromatogrammas pīķiem ir līdzīga forma, visticamāk, cēlonis nav fizisks. Ja ir ietekmēts tikai viens vai daži pīķi, bet pārējie izskatās labi, visticamāk, cēlonis ir ķīmisks.
Pīķa "astes" ķīmiskie cēloņi ir pārāk sarežģīti, lai tos šeit īsi apspriestu. Ieinteresētajam lasītājam padziļinātāku diskusiju var atrast jaunākajā žurnāla "LC Troubleshooting" numurā (10). Tomēr ir viegli mēģināt samazināt injicētās analīta masu un redzēt, vai pīķa forma uzlabojas. Ja tā, tad tā ir laba norāde, ka problēma ir "masas pārslodze". Šajā gadījumā metodei jābūt ierobežotai ar mazu analīta masu injicēšanu vai arī jāmaina hromatogrāfijas apstākļi, lai labas pīķa formas varētu iegūt pat ar lielākām masām.
Pastāv arī daudzi potenciāli fiziski iemesli pīķa "astes" veidošanās procesam. Lasītājiem, kurus interesē detalizēta iespēju apspriešana, ieteicams iepazīties ar citu nesen izdotu "LC Troubleshooting" numuru (11). Viens no biežākajiem pīķa "astes" veidošanās fiziskajiem cēloņiem ir slikts savienojums punktā starp injektoru un detektoru (12). Ekstrēms piemērs ir parādīts 1.d attēlā, kas iegūts manā laboratorijā pirms dažām nedēļām. Šajā gadījumā mēs izveidojām sistēmu ar jaunu iesmidzināšanas vārstu, ko iepriekš nebijām izmantojuši, un uzstādījām maza tilpuma iesmidzināšanas cilpu ar uzgali, kas bija uzliets uz nerūsējošā tērauda kapilāra. Pēc dažiem sākotnējiem problēmu novēršanas eksperimentiem mēs sapratām, ka atveres dziļums iesmidzināšanas vārsta statorā bija daudz lielāks, nekā bijām pieraduši, kā rezultātā atveres apakšā bija liels tukšs tilpums. Šo problēmu var viegli atrisināt, aizstājot iesmidzināšanas cilpu ar citu cauruli, mēs varam noregulēt uzgali pareizajā pozīcijā, lai novērstu tukšo tilpumu atveres apakšā.
Pīķu frontes, piemēram, tās, kas parādītas 1.e attēlā, var izraisīt arī fiziskas vai ķīmiskas problēmas. Bieži sastopams vadošās malas fizisks cēlonis ir tas, ka kolonnas daļiņu slānis nav labi iepakots vai ka daļiņas laika gaitā ir reorganizējušās. Tāpat kā ar pīķu atlieku veidošanos, ko izraisa šī fizikālā parādība, labākais veids, kā to novērst, ir nomainīt kolonnu un turpināt darbu. Būtībā vadošās malas pīķu formas ar ķīmisku izcelsmi bieži rodas no tā, ko mēs saucam par "nelineāriem" aiztures apstākļiem. Ideālos (lineāros) apstākļos stacionārajā fāzē aizturētā analīta daudzums (tātad aiztures koeficients) ir lineāri proporcionāls analīta koncentrācijai kolonnā. Hromatogrāfiski tas nozīmē, ka, palielinoties kolonnā ievadītās analīta masai, pīķis kļūst garāks, bet ne platāks. Šī saistība tiek pārtraukta, ja aiztures uzvedība ir nelineāra, un pīķi ne tikai kļūst garāki, bet arī platāki, jo tiek ievadīta lielāka masa. Turklāt nelineāras formas nosaka hromatogrāfisko pīķu formu, kā rezultātā rodas vadošās vai aizmugurējās malas. Tāpat kā masas pārslodzes gadījumā, kas izraisa pīķa atlieku veidošanos (10), nelineāras aiztures izraisīta pīķa atlieku veidošanās var... var diagnosticēt arī, samazinot injicētās analīta masu. Ja pīķa forma uzlabojas, metode ir jāmaina, lai nepārsniegtu injicēšanas kvalitāti, kas izraisa priekšējo malu, vai arī jāmaina hromatogrāfijas apstākļi, lai samazinātu šo uzvedību.
Dažreiz mēs novērojam šķietami "sadalītu" pīķi, kā parādīts 1.f attēlā. Pirmais solis šīs problēmas risināšanā ir noteikt, vai pīķa forma ir saistīta ar daļēju koelūciju (t.i., divu atšķirīgu, bet cieši eluējošu savienojumu klātbūtni). Ja faktiski ir divas dažādas analītas, kas eluējas tuvu viena otrai, tad ir jāuzlabo to izšķirtspēja (piemēram, palielinot selektivitāti, aizturi vai plākšņu skaitu), un šķietamie "sadalītie" pīķi ir saistīti ar fizikālām īpašībām. Veiktspējai nav nekāda sakara ar pašu kolonnu. Bieži vien vissvarīgākais pavediens šajā lēmumā ir tas, vai visiem hromatogrammas pīķiem ir sadalītas formas vai tikai vienam vai diviem. Ja tas ir tikai viens vai divi, tā, iespējams, ir koelūcijas problēma; ja visi pīķi ir sadalīti, tā, iespējams, ir fiziska problēma, visticamāk, saistīta ar pašu kolonnu.
Sadalītie pīķi, kas saistīti ar pašas kolonnas fizikālajām īpašībām, parasti rodas daļēji bloķētu ieplūdes vai izplūdes fritu vai daļiņu reorganizācijas kolonnā dēļ, kas ļauj mobilajai fāzei plūst ātrāk nekā mobilajai fāzei noteiktās kolonnas kanāla veidošanās vietās, citās zonās (11). Daļēji aizsērējušu fritu dažreiz var notīrīt, mainot plūsmas virzienu caur kolonnu; tomēr, pēc manas pieredzes, tas parasti ir īstermiņa, nevis ilgtermiņa risinājums. Mūsdienu kolonnās tas bieži vien ir liktenīgi, ja daļiņas rekombinējas kolonnā. Šajā brīdī vislabāk ir nomainīt kolonnu un turpināt.
1.g attēlā redzamais maksimums, kas arī ir iegūts nesenā piemērā manā laboratorijā, parasti norāda, ka signāls ir tik augsts, ka tas ir sasniedzis atbildes diapazona augšējo robežu. Optiskajiem absorbcijas detektoriem (šajā gadījumā UV-Vis), kad analīta koncentrācija ir ļoti augsta, analīts absorbē lielāko daļu gaismas, kas iet caur detektora plūsmas šūnu, atstājot ļoti maz gaismas, ko detektēt. Šādos apstākļos fotodetektora elektrisko signālu spēcīgi ietekmē dažādi trokšņa avoti, piemēram, izkliedētā gaisma un "tumšā strāva", padarot signālu ļoti "neskaidra" un neatkarīgu no analīta koncentrācijas. Šādā gadījumā problēmu bieži vien var viegli atrisināt, samazinot analīta injekcijas tilpumu — samazinot injekcijas tilpumu, atšķaidot paraugu vai abus.
Hromatogrāfijas skolā mēs izmantojam detektora signālu (t. i., y asi hromatogrammā) kā analīta koncentrācijas indikatoru paraugā. Tāpēc šķiet dīvaini redzēt hromatogrammu ar signālu zem nulles, jo vienkārša interpretācija ir tāda, ka tas norāda uz negatīvu analīta koncentrāciju, kas, protams, fiziski nav iespējams. Pēc manas pieredzes, negatīvi pīķi visbiežāk tiek novēroti, izmantojot optiskos absorbcijas detektorus (piemēram, UV-Vis).
Šajā gadījumā negatīvs maksimums vienkārši nozīmē, ka no kolonnas eluējošās molekulas absorbē mazāk gaismas nekā pati mobilā fāze tieši pirms un pēc maksimuma. Tas var notikt, piemēram, izmantojot relatīvi zemus detektēšanas viļņu garumus (<230 nm) un mobilās fāzes piedevas, kas absorbē lielāko daļu gaismas šajos viļņu garumos. Šādas piedevas var būt mobilās fāzes šķīdinātāja komponenti, piemēram, metanols, vai bufera komponenti, piemēram, acetāts vai formiāts. Negatīvus maksimumus faktiski var izmantot, lai sagatavotu kalibrēšanas līkni un iegūtu precīzu kvantitatīvu informāciju, tāpēc nav pamata no tiem izvairīties (šo metodi dažreiz sauc par "netiešo UV detekciju") (13). Tomēr, ja mēs patiešām vēlamies pilnībā izvairīties no negatīviem maksimumiem, absorbcijas detekcijas gadījumā labākais risinājums ir izmantot citu detektēšanas viļņa garumu, lai analīts absorbētu vairāk nekā mobilā fāze, vai mainīt mobilās fāzes sastāvu tā, lai tie absorbētu mazāk gaismas nekā analīti.
Negatīvi pīķi var parādīties arī, izmantojot refrakcijas indeksa (RI) noteikšanu, ja citu parauga komponentu, nevis analīta, piemēram, šķīdinātāja matricas, refrakcijas indekss atšķiras no mobilās fāzes refrakcijas indeksa. Tas notiek arī ar UV-Vis noteikšanu, taču šis efekts parasti ir vājāks salīdzinājumā ar RI noteikšanu. Abos gadījumos negatīvos pīķus var samazināt, precīzāk saskaņojot parauga matricas sastāvu ar mobilās fāzes sastāvu.
Trešajā daļā par LC problēmu novēršanas pamattēmu es apspriedu situācijas, kurās novērotā pīķa forma atšķiras no paredzētās vai normālās pīķa formas. Šādu problēmu efektīva novēršana sākas ar zināšanām par paredzamajām pīķa formām (pamatojoties uz teoriju vai iepriekšēju pieredzi ar esošajām metodēm), tāpēc novirzes no šīm cerībām ir acīmredzamas. Pīķa formas problēmām ir daudz dažādu iespējamo iemeslu (pārāk plata, astes, priekšējās malas utt.). Šajā daļā es detalizēti apspriežu dažus no iemesliem, ko redzu visbiežāk. Šo detaļu zināšana nodrošina labu vietu problēmu novēršanas sākšanai, taču tā neaptver visas iespējas. Lasītāji, kurus interesē padziļinātāks cēloņu un risinājumu saraksts, var iepazīties ar LCGC “LC problēmu novēršanas rokasgrāmatas” sienas diagrammu.
(4) LCGC “LC problēmu novēršanas rokasgrāmata” sienas diagramma. https://www.chromatographyonline.com/view/troubleshooting-wallchart (2021).
(6) A. Felinger, Datu analīze un signālu apstrāde hromatogrāfijā (Elsevier, Ņujorka, Ņujorka, 1998), 43.–96. lpp.
(8) Vahabs M. F., Dasgupta P. K., Kadžo A. F. un Ārmstrongs D. V., Anal.Chim.Journal.Rev. 907, 31.–44. lpp. (2016). https://doi.org/10.1016/j.aca.2015.11.043.