Dažas LC problēmu novēršanas tēmas nekad nav novecojušas, jo pastāv problēmas LC praksē, pat ja instrumentu tehnoloģija laika gaitā uzlabojas. Ir daudzi veidi, kā problēmas var rasties LC sistēmā un nonākt sliktā pīķa formā. Ja rodas problēmas, kas saistītas ar pīķa formu, īss šo rezultātu iespējamo cēloņu saraksts palīdz vienkāršot mūsu problēmu novēršanas pieredzi.
Bija jautri rakstīt šo sleju “LC Troubleshooting” un katru mēnesi domāt par tēmām, jo ​​dažas tēmas nekad neiziet no modes. Lai gan hromatogrāfijas izpētes jomā noteiktas tēmas vai idejas kļūst novecojušas, jo tās aizstāj jaunākas un labākas idejas, problēmu novēršanas jomā, kopš šajā žurnālā parādījās pirmais problēmu novēršanas raksts (kopš LC Journal joprojām ir dažas tēmas, kas tajā laikā ir 19)3. Vairākas LC problēmu novēršanas sadaļas esmu koncentrējis uz mūsdienu tendencēm, kas ietekmē šķidruma hromatogrāfiju (LC) (piemēram, relatīvais mūsu izpratnes par spiediena ietekmi uz aizturi salīdzinājums [2] Jauni sasniegumi) Mūsu LC rezultātu interpretācija un to, kā novērst problēmas ar moderniem LC instrumentiem.Šī mēneša daļā es turpinu, kura tēma ir 21. gada decembrī. LC problēmu novēršana — elementi, kas ir lieliski piemēroti jebkuram problēmu novēršanas rīkam, ir būtiski neatkarīgi no izmantotās sistēmas vecuma.Šīs sērijas pamattēma ir ļoti saistīta ar LCGC slaveno “LC Troubleshooting Guide” sienas diagrammu (4), kas karājas daudzās laboratorijās.Šīs sērijas trešajai daļai es izvēlējos koncentrēties uz problēmām, kas saistītas ar pīķa formas, iespējamās diagrammas raksturīgās pazīmes4 pīķa forma4. Mēs nevaram visus šos jautājumus detalizēti aplūkot vienā rakstā, tāpēc šajā tēmas pirmajā daļā es koncentrēšos uz dažiem no tiem, kurus redzu visbiežāk. Ceru, ka jauni un veci LC lietotāji atradīs dažus noderīgus padomus un atgādinājumus par šo svarīgo tēmu.
Es arvien biežāk uz problēmu novēršanas jautājumiem atbildu ar vārdiem "viss ir iespējams". Šī atbilde var šķist vienkārša, ņemot vērā novērojumus, kurus ir grūti interpretēt, taču man tā bieži šķiet piemērota. Tā kā ir daudzi iespējamie sliktas pīķa formas cēloņi, ir svarīgi saglabāt atvērtu prātu, apsverot, kāda varētu būt problēma, un spēt noteikt prioritāti potenciālajiem cēloņiem, lai sāktu mūsu problēmu novēršanas centienus, koncentrējoties uz visbiežāk sastopamajām iespējām.
Galvenais solis jebkurā problēmu novēršanas uzdevumā — bet tas, kas, manuprāt, ir nepietiekami novērtēts — ir apzināties, ka pastāv problēma, kas ir jāatrisina. Atzīstot, ka problēma pastāv, bieži vien ir jāatzīst, ka tas, kas notiek ar rīku, atšķiras no mūsu cerībām, kuras nosaka teorija, empīriskās zināšanas un pieredze (5). mala, astes u.c.), bet arī uz platumu. Mūsu cerības uz pīķa faktisko formu ir vienkāršas. Teorija (6) labi atbalsta mācību grāmatā izvirzīto cerību, ka vairumā gadījumu hromatogrāfiskajām virsotnēm jābūt simetriskām un jāatbilst Gausa sadalījuma formai, kā parādīts 1.a attēlā. Tas, ko mēs sagaidām no novēroto pīķu platuma, ir sarežģītāks jautājums par citu formu, un par šo tēmu mēs varētu runāt nākamajā rakstā. — citiem vārdiem sakot, daži veidi, kā lietas var noiet greizi. Šīs daļas atlikušajā daļā mēs pavadīsim laiku, lai apspriestu dažus konkrētus piemērus situācijām, kas var novest pie šiem formas veidiem.
Dažreiz pīķi vispār netiek novēroti hromatogrammā, kur tos paredzēts eluēt. Iepriekš redzamā sienas diagramma norāda, ka pīķa neesamība (pieņemot, ka paraugs patiešām satur mērķa analītu tādā koncentrācijā, kas nodrošina detektora reakciju pietiekamu, lai to redzētu virs trokšņa) parasti ir saistīts ar kādu instrumenta problēmu vai nepareiziem mobilās fāzes apstākļiem (ja vispār tiek novērots).virsotnes, parasti pārāk “vāji”). Īss iespējamo problēmu un risinājumu saraksts šajā kategorijā ir atrodams I tabulā.
Kā minēts iepriekš, jautājums par to, cik liela pīķa paplašināšanās ir pieļaujama, pirms pievērst uzmanību un mēģināt to labot, ir sarežģīts temats, par kuru es runāšu nākamajā rakstā. Mana pieredze liecina, ka ievērojamu pīķu paplašināšanos bieži pavada būtiskas pīķa formas izmaiņas, un pīķa astes paplašināšanās ir biežāka nekā pirmspīķa vai sadalīšanās. Tomēr nomināli: simetriskas virsotnes var palielināties arī dažu iemeslu dēļ.
Katrs no šiem jautājumiem ir detalizēti apspriests iepriekšējos LC problēmu novēršanas izdevumos, un lasītāji, kurus interesē šīs tēmas, var atsaukties uz šiem iepriekšējiem rakstiem, lai iegūtu informāciju par šo problēmu galvenajiem cēloņiem un iespējamiem risinājumiem.Skatīt vairāk.
Pīķa atkāpšanos, pīķu fronti un šķelšanos var izraisīt ķīmiskas vai fizikālas parādības, un šo problēmu iespējamo risinājumu saraksts ir ļoti atšķirīgs atkarībā no tā, vai mēs saskaramies ar ķīmisku vai fizikālu problēmu. Bieži vien, salīdzinot dažādas hromatogrammas virsotnes, varat atrast svarīgus norādījumus par to, kura ir vaininiece. virsotnes tiek ietekmētas, bet pārējās izskatās labi, iemesls, visticamāk, ir ķīmisks.
Pīķa astes veidošanās ķīmiskie cēloņi ir pārāk sarežģīti, lai tos šeit īsi apspriestu. Ieinteresētais lasītājs tiek aicināts uz neseno “LC Troubleshooting” numuru, lai iegūtu padziļinātu diskusiju (10). Tomēr ir viegli mēģināt samazināt injicētās analizējamās vielas masu un pārbaudīt, vai pīķa forma uzlabojas. Ja tā, tad šī ir laba norāde, ka problēma ir “maza pārslodzes gadījumā, ja problēma ir ierobežota. es, vai jāmaina hromatogrāfiskie apstākļi, lai varētu iegūt labas pīķu formas pat ar lielāku injicēšanas masu.
Ir arī daudz potenciālu fizisku iemeslu maksimālai atstarpei. Lasītāji, kas interesējas par detalizētu iespēju iztirzāšanu, ir skatīti citā nesenā izdevuma “LC Troubleshooting” numurā (11). Viens no biežākajiem fiziskajiem pīķa atskurbšanas cēloņiem ir slikts savienojums punktā starp inžektoru un detektoru (12). Ekstrēms piemērs ir parādīts 1.d attēlā, kas iegūts manā laboratorijā, pirms dažām nedēļām tika uzstādīta sistēma ar nelielu iesmidzināšanu. p ar uzgali, kas bija izliets uz nerūsējošā tērauda kapilāra.Pēc dažiem sākotnējiem traucējummeklēšanas eksperimentiem mēs sapratām, ka pieslēgvietas dziļums iesmidzināšanas vārsta statorā bija daudz dziļāks, nekā mēs bijām pieraduši, kā rezultātā porta apakšā ir liels tukšais tilpums.Šo problēmu var viegli atrisināt, nomainot iesmidzināšanas cilpu ar citu cauruli, mēs varam noregulēt pareizu porta tilpumu, lai novērstu portu.
Pīķu frontes, piemēram, tās, kas parādītas 1.e attēlā, var izraisīt arī fiziskas vai ķīmiskas problēmas. Izplatīts priekšējās malas fiziskais cēlonis ir tas, ka kolonnas daļiņu slānis nav labi noblīvēts vai daļiņas laika gaitā ir pārkārtojušās. Tāpat kā šīs fiziskās parādības izraisītās pīķa atslāņošanās gadījumā, labākais veids, kā to novērst, ir nomainīt kolonnu un turpināt. (lineāros) apstākļos analizējamās vielas daudzums, ko aiztur stacionārā fāze (tātad aiztures koeficients), ir lineāri saistīts ar analizējamās vielas koncentrāciju kolonnā. Hromatogrāfiski tas nozīmē, ka, palielinoties kolonnā ievadītās analizējamās vielas masai, pīķis kļūst augstāks, bet ne platāks. Šī sakarība tiek pārtraukta, ja aizture kļūst ne tikai garāka, bet arī lielāka masa ir ne tikai lielāka. Turklāt nelineāras formas nosaka hromatogrāfisko pīķu formu, kā rezultātā veidojas priekšējās vai beigu malas. Tāpat kā ar masas pārslodzi, kas izraisa pīķa astes veidošanos (10), arī nelineāras aiztures izraisīto pīķa izvirzīšanu var diagnosticēt, samazinot ievadītās analizējamās vielas masu. Ja pīķa forma uzlabojas, metode ir jāmaina, lai nepārsniegtu injekcijas kvalitāti, vai ir jāmaina šīs hromatogrāfijas nosacījumi, kas samazina priekšējās malas stāvokli.
Dažreiz mēs novērojam to, kas, šķiet, ir “sadalīts” maksimums, kā parādīts 1.f attēlā. Pirmais solis šīs problēmas risināšanā ir noteikt, vai pīķa forma ir saistīta ar daļēju koeluciju (ti, divu atšķirīgu, bet cieši eluējošu savienojumu klātbūtne). Ja patiesībā ir divas dažādas analizējamās vielas, kas eluējas tuvu viena otrai, tad ir jāuzlabo to izšķirtspēja, ar to saistītās pīķa izšķirtspējas, pīķu izgaismošana vai atkārtota skaitīšana. formai nav nekāda sakara ar pašu kolonnu. Bieži vien vissvarīgākais norāde uz šo lēmumu ir tas, vai visiem hromatogrammas virsotnēm ir sadalītas formas vai tikai vienai vai divām. Ja tas ir tikai viens vai divi, iespējams, ka tā ir kopīgas eluēšanas problēma;ja visas virsotnes ir sadalītas, iespējams, tā ir fiziska problēma, kas, visticamāk, saistīta ar pašu kolonnu.
Sadalītās virsotnes, kas saistītas ar pašas kolonnas fizikālajām īpašībām, parasti rodas daļēji bloķētu ieplūdes vai izplūdes frites vai daļiņu reorganizācijas dēļ kolonnā, ļaujot kustīgajai fāzei plūst ātrāk nekā kustīgajai fāzei noteiktos kolonnas kanāla veidošanās apgabalos .citos reģionos (11). Daļēji aizsērējušu fritu dažkārt var notīrīt, mainot plūsmu caur kolonnu;tomēr, pēc manas pieredzes, tas parasti ir īstermiņa, nevis ilgtermiņa risinājums. Mūsdienu kolonnām tas bieži ir liktenīgs, ja daļiņas kolonnā rekombinējas. Šajā brīdī vislabāk ir nomainīt kolonnu un turpināt.
Pīķis 1.g attēlā, arī no nesena gadījuma manā laboratorijā, parasti norāda, ka signāls ir tik augsts, ka tas ir sasniedzis reakcijas diapazona augstāko robežu. Optiskās absorbcijas detektoriem (šajā gadījumā UV-redzamajā gadījumā), kad analizējamā vielas koncentrācija ir ļoti augsta, analizējamā viela absorbē lielāko daļu gaismas, kas iet cauri detektora plūsmas šūnai, atstājot ļoti maz gaismas, ko uztvert no šiem elektriskajiem signāliem. , piemēram, izkliedēta gaisma un “tumšā strāva”, padarot signālu ļoti “izplūdušu” pēc izskata un neatkarīgi no analizējamās vielas koncentrācijas.Ja tas notiek, problēmu bieži var viegli atrisināt, samazinot analizējamās vielas injekcijas tilpumu — samazinot injekcijas tilpumu, atšķaidot paraugu vai abus.
Hromatogrāfijas skolā mēs izmantojam detektora signālu (ti, y asi hromatogrammā) kā analizējamās vielas koncentrācijas indikatoru paraugā. Tāpēc šķiet dīvaini redzēt hromatogrammu ar signālu zem nulles, jo vienkārša interpretācija ir tāda, ka tas norāda uz negatīvu analīta koncentrāciju – kas, protams, nav fiziski iespējams. Mana pieredze liecina, ka visbiežāk tiek novēroti optiskie detektori, izmantojot negatīvus detektorus.
Šajā gadījumā negatīvs maksimums vienkārši nozīmē, ka molekulas, kas eluē no kolonnas, absorbē mazāk gaismas nekā pati kustīgā fāze tieši pirms un pēc maksimuma.Tas var notikt, piemēram, ja tiek izmantoti salīdzinoši zemi noteikšanas viļņu garumi (<230 nm) un mobilās fāzes piedevas, kas absorbē lielāko daļu gaismas šajos viļņu garumos. Šādas piedevas var būt tādas mobilās fāzes sastāvdaļas kā šķīdinātāja vai acetāta komponenti. negatīvas virsotnes, lai sagatavotu kalibrēšanas līkni un iegūtu precīzu kvantitatīvu informāciju, tāpēc nav pamata iemesla izvairīties no tām pašām (šo metodi dažkārt dēvē par "netiešo UV noteikšanu") (13). Taču, ja mēs patiešām vēlamies izvairīties no negatīvām virsotnēm vispār, absorbcijas noteikšanas gadījumā vislabākais risinājums ir izmantot atšķirīgu noteikšanas viļņa garumu, nevis mobilās fāzes viļņa garumu, lai mobilā fāze absorbētu mazāk, lai mazāk absorbētu fāzi, lai tās vairāk mainītu analīzi. lytes.
Negatīvie maksimumi var parādīties arī tad, ja izmanto refrakcijas indeksa (RI) noteikšanu, ja citu komponentu, kas nav analizējamā viela paraugā, piemēram, šķīdinātāja matricas, refrakcijas indekss atšķiras no kustīgās fāzes refrakcijas indeksa. Tas notiek arī ar UV-redzes noteikšanu, taču šim efektam ir tendence būt vājinātam attiecībā pret RI noteikšanu. Abos gadījumos negatīvo paraugu matricas pīķus var līdz minimumam samazināt, līdz minimumam samazinot mobilās fāzes sastāvu.
Trešajā daļā par LC problēmu novēršanas pamattēmu es apspriedu situācijas, kurās novērotā pīķa forma atšķiras no paredzamās vai parastās pīķa formas. Efektīva šādu problēmu problēmu novēršana sākas ar sagaidāmo pīķu formu zināšanām (pamatojoties uz teoriju vai iepriekšējo pieredzi ar esošajām metodēm), tāpēc novirzes no šīm cerībām ir acīmredzamas.Pīķa formas problēmām ir daudz dažādu iespējamo iemeslu cēloņi (pārāk plaši aplūkoju šo instalāciju, u.c.). .Šīs detaļas ir laba vieta, kur sākt traucējummeklēšanu, bet neaptver visas iespējas.Lasītāji, kurus interesē padziļināts cēloņu un risinājumu saraksts, var skatīt LCGC “LC Troubleshooting Guide” sienas diagrammu.
(4) LCGC “LC Troubleshooting Guide” sienas diagramma. https://www.chromatographyonline.com/view/troubleshooting-wallchart (2021).
(6) A. Felinger, Data Analysis and Signal Processing in Chromatography (Elsevier, New York, NY, 1998), 43.–96. lpp.
(8) Wahab MF, Dasgupta PK, Kadjo AF un Armstrong DW, Anal.Chim.Journal.Rev.907, 31–44 (2016).https://doi.org/10.1016/j.aca.2015.11.043.