Paldies, ka apmeklējāt vietni Nature.com.Jūsu izmantotajai pārlūkprogrammas versijai ir ierobežots CSS atbalsts.Lai nodrošinātu vislabāko pieredzi, ieteicams izmantot atjauninātu pārlūkprogrammu (vai atspējot saderības režīmu pārlūkprogrammā Internet Explorer).Tikmēr, lai nodrošinātu nepārtrauktu atbalstu, mēs atveidosim vietni bez stiliem un JavaScript.
Šķidruma biopsija (LB) ir jēdziens, kas strauji iegūst popularitāti biomedicīnas jomā.Koncepcija galvenokārt balstās uz cirkulējošās ārpusšūnu DNS (ccfDNS) fragmentu noteikšanu, kas galvenokārt tiek atbrīvoti kā nelieli fragmenti pēc šūnu nāves dažādos audos.Neliela daļa šo fragmentu rodas no svešiem (svešiem) audiem vai organismiem.Pašreizējā darbā mēs esam piemērojuši šo koncepciju gliemenei - kontrolpunktam, kas pazīstams ar savu lielo jūras ūdens filtrēšanas spēju.Mēs izmantojam gliemeņu spēju darboties kā dabiskiem filtriem, lai uztvertu vides DNS fragmentus no dažādiem avotiem, lai sniegtu informāciju par jūras piekrastes ekosistēmu bioloģisko daudzveidību.Mūsu rezultāti rāda, ka gliemenes hemolimfs satur DNS fragmentus, kuru lielums ir ļoti atšķirīgs, no 1 līdz 5 kb.Bises secība parādīja, ka liels skaits DNS fragmentu ir svešu mikrobu izcelsme.Starp tiem mēs atradām DNS fragmentus no baktērijām, arhejām un vīrusiem, tostarp vīrusus, par kuriem zināms, ka tie inficē dažādus saimniekus, kas parasti sastopami piekrastes jūras ekosistēmās.Noslēgumā jāsaka, ka mūsu pētījums parāda, ka gliemenēm lietotā LB koncepcija ir bagātīgs, bet vēl neizpētīts zināšanu avots par mikrobu daudzveidību jūras piekrastes ekosistēmās.
Klimata pārmaiņu (CC) ietekme uz jūras ekosistēmu bioloģisko daudzveidību ir strauji augoša pētniecības joma.Globālā sasilšana rada ne tikai svarīgus fizioloģiskus stresus, bet arī nospiež jūras organismu termiskās stabilitātes evolūcijas robežas, ietekmējot vairāku sugu dzīvotni, mudinot tās meklēt labvēlīgākus apstākļus [1, 2].Papildus tam, ka CC ietekmē metazoānu bioloģisko daudzveidību, tas izjauc saimnieka un mikrobu mijiedarbības smalko līdzsvaru.Šī mikrobu disbakterioze nopietni apdraud jūras ekosistēmu, jo tā padara jūras organismus uzņēmīgākus pret infekcijas patogēniem [3, 4].Tiek uzskatīts, ka SS ir nozīmīga loma masveida nāves gadījumos, kas ir nopietna problēma globālo jūras ekosistēmu pārvaldībā [5, 6].Tas ir svarīgs jautājums, ņemot vērā daudzu jūras sugu ekonomisko, ekoloģisko un uztura ietekmi.Tas jo īpaši attiecas uz gliemenēm, kas dzīvo polārajos reģionos, kur CK ietekme ir tūlītējāka un smagāka [6, 7].Faktiski gliemeži, piemēram, Mytilus spp.tiek plaši izmantoti, lai uzraudzītu CC ietekmi uz jūras ekosistēmām.Nav pārsteidzoši, ka ir izstrādāts salīdzinoši liels skaits biomarķieru, lai uzraudzītu viņu veselību, bieži izmantojot divu līmeņu pieeju, kas ietver funkcionālos biomarķierus, kuru pamatā ir fermentatīvā aktivitāte vai šūnu funkcijas, piemēram, šūnu dzīvotspēja un fagocītiskā aktivitāte [8].Šīs metodes ietver arī specifisko spiediena indikatoru koncentrācijas mērīšanu, kas uzkrājas mīkstos audos pēc liela daudzuma jūras ūdens absorbcijas.Tomēr gliemeņu lielā filtrācijas jauda un daļēji atvērtā asinsrites sistēma sniedz iespēju izstrādāt jaunus hemolimfas biomarķierus, izmantojot šķidrās biopsijas (LB) koncepciju, kas ir vienkārša un minimāli invazīva pieeja pacientu pārvaldībā.asins paraugi [9, 10].Lai arī cilvēka LB var atrast vairākus cirkulējošo molekulu veidus, šī koncepcija galvenokārt balstās uz cirkulējošo ārpusšūnu DNS (ccfDNS) fragmentu cirkulējošo ārpusšūnu DNS (CCFDNS) fragmentu DNS sekvencēšanas analīzi plazmā.Faktiski cirkulējošās DNS klātbūtne cilvēka plazmā ir zināma kopš 20. gadsimta vidus [11], bet tikai pēdējos gados augstas caurlaides secības secības metožu parādīšanās ir izraisījusi klīnisko diagnozi, pamatojoties uz ccfDNS.Šo cirkulējošo DNS fragmentu klātbūtne daļēji ir saistīta ar genoma DNS pasīvo izdalīšanos (kodola un mitohondriju) pēc šūnu nāves. Veseliem indivīdiem ccfDNS koncentrācija parasti ir zema (<10 ng/mL), bet pacientiem, kuri cieš no dažādām patoloģijām vai ir pakļauti stresam, to var palielināt 5–10 reizes, izraisot audu bojājumus. Veseliem indivīdiem ccfDNS koncentrācija parasti ir zema (<10 ng/mL), bet pacientiem, kuri cieš no dažādām patoloģijām vai ir pakļauti stresam, to var palielināt 5–10 reizes, izraisot audu bojājumus. Ззоровых ююей концентрация ¡ккнк в норме низзз (<10 н/мл), но может повышать в в в в р р р р р р р р р р р р р р р р р р р р р р р р р р р р р рз в р р р р р р р р р р р р р р н м р р й с р р р р р р р р р р р с р р р р р р р р р р р р р р р р р р р р р р р с сз иild подвергающихся стресу, приводщем повреждению т ... Veseliem cilvēkiem cccDNS koncentrācija parasti ir zema (<10 ng/mL), bet pacientiem ar dažādām patoloģijām vai stresam, kas izraisa audu bojājumus, tā var palielināties 5–10 reizes.在 个体 中 ， ， ccfDna 的 浓度 通常 较 低 （<10 ng/ml） ， 但 在 患有 各 病理 病理 或 承受 压力 的 患者 中 可 增加 5-10 倍 ， 从而 导致 损伤。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。在 健康 个体 中 ， ccfdna 的 浓度 较 低 （（<10 ng/ml） 但 在 各 种 病理 各 种 病理 或 扥可 增加 5-10 倍 ， 从而 组织。。。 损伤 损伤 损伤 损伤 似 损伤 损伤 损伤 损伤Концентрации ccfDna оычно низзие (<10 нг/мл) здоровых ююей, но мог ы юелены м з л с с с с с с с с с с с с с с с с с с с л л л л л л л л л л л л л л л л л л л л л л л л л л л л л з з з з л л л л л л л з з з л з з з з с с с с с с с с с с с с с с с м м ю с с оими ил стрессом, что приворит повреждению т тай. Veseliem indivīdiem ccfDNS koncentrācija parasti ir zema (<10 ng/ml), bet pacientiem ar dažādām patoloģijām vai stresu to var palielināt 5-10 reizes, kā rezultātā rodas audu bojājumi.ccfDNS fragmentu lielums ir ļoti atšķirīgs, bet parasti tas svārstās no 150 līdz 200 bp.[12].Pašatvasinātas ccfDNS, ti, ccfDNS no normālām vai transformētām saimniekšūnām, analīzi var izmantot, lai noteiktu ģenētiskās un epiģenētiskās izmaiņas kodolā un/vai mitohondriju genomā, tādējādi palīdzot ārstiem izvēlēties specifiskas molekulāras terapijas [13].Tomēr ccfDNS var iegūt no ārvalstu avotiem, piemēram, ccfDNS no augļa šūnām grūtniecības laikā vai no transplantētiem orgāniem [14,15,16,17].ccfDNS ir arī nozīmīgs informācijas avots infekcijas izraisītāja (svešzemju) nukleīnskābju klātbūtnes noteikšanai, kas ļauj neinvazīvi atklāt plaši izplatītas infekcijas, kuras nav identificētas ar asins kultūrām, izvairoties no inficēto audu invazīvas biopsijas [18].Jaunākie pētījumi patiešām ir parādījuši, ka cilvēka asinis satur bagātīgu informācijas avotu, ko var izmantot vīrusu un baktēriju patogēnu identificēšanai, un ka aptuveni 1% no cilvēka plazmā atrodamās ccfDNS ir svešas izcelsmes [19].Šie pētījumi parāda, ka organisma cirkulējošā mikrobioma bioloģisko daudzveidību var novērtēt, izmantojot ccfDNS analīzi.Tomēr vēl nesen šī koncepcija tika izmantota tikai cilvēkiem un mazākā mērā citiem mugurkaulniekiem [20, 21].
Šajā rakstā mēs izmantojam LB potenciālu, lai analizētu Aulacomya atra ccfDNS, dienvidu sugas, kas parasti sastopamas subantarktiskajās Kergelen salās, salu grupā, kas atrodas uz liela plato, kas veidojās pirms 35 miljoniem gadu.vulkāna izvirdums.Izmantojot in vitro eksperimentālo sistēmu, mēs noskaidrojām, ka DNS fragmentus jūras ūdenī ātri uzņem gliemenes un nokļūst hemolimfas nodalījumā.Bises sekvencēšana ir parādījusi, ka gliemeņu hemolimfas ccfDNS satur savas un ne-pašas izcelsmes DNS fragmentus, tostarp simbiotiskas baktērijas un DNS fragmentus no biomiem, kas raksturīgi aukstajām vulkāniskajām jūras piekrastes ekosistēmām.Hemolimfas ccfDNS satur arī vīrusu sekvences, kas iegūtas no vīrusiem ar dažādiem saimnieku diapazoniem.Mēs atradām arī DNS fragmentus no daudzšūnu dzīvniekiem, piemēram, kaulainām zivīm, jūras anemonēm, aļģēm un kukaiņiem.Visbeidzot, mūsu pētījums parāda, ka LB koncepciju var veiksmīgi izmantot jūras bezmugurkaulniekiem, lai radītu bagātīgu genoma repertuāru jūras ekosistēmās.
Pieaugušie (55-70 mm gari) Mytilus platensis (M. platensis) un Aulacomya atra (A. atra) tika savākti no Port-au-France klinšainajiem krastiem (049°21.235 S, 070°13.490 E .).Kergelenas salas 2018. gada decembrī. Citas pieaugušas zilās mīdijas (Mytilus spp.) tika iegūtas no komerciāla piegādātāja (PEI Mussel King Inc., Prinča Edvarda sala, Kanāda) un ievietotas kontrolētā temperatūrā (4°C) gāzētā tvertnē, kurā bija 10–20 l 32‰ mākslīgā sālījuma.(mākslīgais jūras sāls Reef Crystal, Instant Ocean, Virdžīnija, ASV).Katram eksperimentam tika izmērīts atsevišķu čaulu garums un svars.
Šīs programmas bezmaksas atvērtās piekļuves protokols ir pieejams tiešsaistē (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1).Īsumā, LB hemolimfa tika savākta no nolaupītāja muskuļiem, kā aprakstīts [22].Hemolimfa tika notīrīta, centrifugējot pie 1200 × g 3 minūtes, supernatants tika sasaldēts (-20 ° C) līdz lietošanai.CfDNS izolēšanai un attīrīšanai paraugi (1,5–2,0 ml) tika atkausēti un apstrādāti, izmantojot NucleoSnap cfDNA komplektu (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) saskaņā ar ražotāja norādījumiem.CCFDNA tika glabāta -80 ° C temperatūrā līdz turpmākai analīzei.Dažos eksperimentos ccfDNA tika izolēta un attīrīta, izmantojot QIAAMP DNS izmeklētāju komplektu (Qiagen, Toronto, Ontario, Kanāda).Attīrīta DNS tika kvantitatīvi noteikta, izmantojot standarta Picogreen testu.Izolētās ccfDNS fragmentu sadalījums tika analizēts ar kapilāro elektroforēzi, izmantojot Agilent 2100 bioanalizatoru (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA), izmantojot augstas jutības DNS komplektu.Pārbaude tika veikta, izmantojot 1 µl ccfDNS parauga saskaņā ar ražotāja norādījumiem.
Hemolimfas ccfDNS fragmentu sekvencēšanai Génome Québec (Monreāla, Kvebeka, Kanāda) sagatavoja bises bibliotēkas, izmantojot Illumina DNA Mix komplektu no Illumina MiSeq PE75 komplekta.Tika izmantots standarta adapteris (BioO).Neapstrādātu datu faili ir pieejami no NCBI secības lasīšanas arhīva (SRR8924808 un SRR8924809).Pamata lasīšanas kvalitāte tika novērtēta, izmantojot FASTQC [23].Trimomatic [24] ir izmantots adapteru un sliktas kvalitātes nolasījumu izgriezšanai.Bises nolasījumi ar pārī savienotiem galiem tika FLASH sapludināti garākos atsevišķos nolasījumos ar minimālo pārklāšanos 20 bp, lai izvairītos no neatbilstībām [25]. Apvienotie nolasījumi tika anotēti ar BLASTN, izmantojot divvāku NCBI taksonomijas datubāzi (e vērtība < 1e-3 un 90% homoloģija), un zemas sarežģītības secību maskēšana tika veikta, izmantojot DUST [26]. Apvienotie nolasījumi tika anotēti ar BLASTN, izmantojot divvāku NCBI taksonomijas datubāzi (e vērtība < 1e-3 un 90% homoloģija), un zemas sarežģītības secību maskēšana tika veikta, izmantojot DUST [26]. Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием базы данных таксономии двусты таксономии двусты чение e < 1e-3 un 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с использо Apvienotie nolasījumi tika anotēti ar BLASTN, izmantojot NCBI divvāku taksonomijas datubāzi (e vērtība < 1e-3 un 90% homoloģija), un zemas sarežģītības secību maskēšana tika veikta, izmantojot DUST [26].使用 壳类 壳类 ncbi 分类 数据库 （e 值 <1e-3 和 90% 同源 性） 用 blastn 注释 合并 读数 ， ， 并 使用 Putekļi [26] 进行 低 复杂度 序列 的。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。 掩蔽使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 90% 同源） 用 用 用 注释 合并 读数 6复杂度 序列 的。。。。 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽蔽 掩蔽 掩蔽Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием таксономической базы данскотлорхдвуных BI (значение e <1e-3 и 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с испом Джустолнено с испо Apvienotie nolasījumi tika anotēti ar BLASTN, izmantojot NCBI divvāku taksonomijas datubāzi (e vērtība <1e-3 un 90% homoloģija), un zemas sarežģītības secību maskēšana tika veikta, izmantojot DUST [26].Lasījumi tika iedalīti divās grupās: saistīti ar divvāku secībām (šeit saukti par pašlasīšanu) un nesaistīti (ne-pašlasīti).Divas grupas tika atsevišķi saliktas, izmantojot MEGAHIT, lai ģenerētu kontigus [27].Tikmēr svešzemju mikrobiomu lasījumu taksonomiskais sadalījums tika klasificēts, izmantojot Kraken2 [28], un grafiski attēlots ar Krona sektora diagrammu par galaktiku [29, 30].Mūsu sākotnējos eksperimentos tika noteikts, ka optimālie kmers ir kmers-59. Pēc tam paškontigi tika identificēti, saskaņojot ar BLASTN (divvāku NCBI datubāze, e vērtība < 1e-10 un 60% homoloģija), lai iegūtu galīgo anotāciju. Pēc tam paškontigi tika identificēti, saskaņojot ar BLASTN (divvāku NCBI datubāze, e vērtība < 1e-10 un 60% homoloģija), lai iegūtu galīgo anotāciju. Затем собственные контиги были идентифицированы путем сопоставления с BLASTN e <1e-10 un гомология 60%) для окончательной аннотации. Pēc tam paškontigi tika identificēti, saskaņojot ar BLASTN (NCBI divvāku datubāze, e vērtība <1e-10 un 60% homoloģija) galīgajai anotācijai.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）对齐来自諆别最终注释.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% Затем ыли иентифицированы сabal устворчатых молюсков, значение e <1e-10 и гомогия 60%). Pēc tam galīgajai anotācijai tika identificēti paškontigi, saskaņojot ar BLASTN (NCBI divvāku datubāze, e vērtība <1e-10 un 60% homoloģija). Paralēli ne-grupu kontigi tika anotēti ar BLASTN (nt NCBI datu bāze, e vērtība < 1e-10 un 60% homoloģija). Paralēli ne-grupu kontigi tika anotēti ar BLASTN (nt NCBI datu bāze, e vērtība < 1e-10 un 60% homoloģija). Паралельно чжеродные груовые контиги ыыли анотированы с по пщюю blastn (база даных Nt ncbi, значч из д 1e-10 и-10 и. Paralēli ārvalstu grupu kontigi tika anotēti ar BLASTN (NT NCBI datu bāze, e vērtība <1e-10 un 60% homoloģija).平行 地 ， 用 blastn （nt ncbi 数据库 ， e 值 <1e-10 和 60% 同源 性） 注释 非 自身 组 重叠群。。。。。。。。。。。。。。。。。。。 重叠群 重叠群 重叠群 重叠群 重叠群 重叠群 重叠群平行 地 ， 用 blastn （nt ncbi 数据库 ， e 值 <1e-10 和 60% 同源 性） 注释 非 自身 组 重叠群。。。。。。。。。。。。。。。。。。。 重叠群 重叠群 重叠群 重叠群 重叠群 重叠群 重叠群 Параллельно контиги, не относящиеся к собственной группе, были аннотированы с помощью BLASTN (база даннч1,-е1 зntнач1хе1 гомология 60%). Paralēli ne-pašgrupas kontigi tika anotēti ar BLASTN (nt NCBI datu bāze, e vērtība <1e-10 un 60% homoloģija). BLASTX tika veikts arī nekontigiem, izmantojot nr un RefSeq proteīna NCBI datu bāzes (e vērtība < 1e-10 un 60% homoloģija). BLASTX tika veikts arī nekontigiem, izmantojot nr un RefSeq proteīna NCBI datu bāzes (e vērtība < 1e-10 un 60% homoloģija). BLASTX также был проведен на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr и RefSeq NCBI (значело 6 e) %). BLASTX tika veikts arī ne-paškontigiem, izmantojot nr un RefSeq NCBI proteīnu datu bāzes (e vērtība < 1e-10 un 60% homoloģija).还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 咧ﺐ 傌源 倧ﺐ 傌 60%还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 咧ﺐ 傌源 倧ﺐ 傌 60% BLASTX также выполняли на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr и RefSeq NCBI (значение e <1e-10 и гомология 60%). BLASTX tika veikts arī ne-paškontigiem, izmantojot nr un RefSeq NCBI proteīnu datu bāzes (e vērtība <1e-10 un 60% homoloģija).Ne-paškontigu BLASTN un BLASTX kopas ir galīgie kontigi (skatiet Papildu failu).
PCR izmantotie praimeri ir uzskaitīti S1 tabulā.Taq DNS polimerāze (Bio Basic Canada, Markham, ON) tika izmantota, lai pastiprinātu ccfDNS mērķa gēnus.Tika izmantoti šādi reakcijas apstākļi: denaturēšana 95 ° C temperatūrā 3 minūtes, 95 ° C 1 minūti, iestatītā atlaidināšanas temperatūra 1 minūti, pagarināšana 72 ° C temperatūrā 1 minūti, 35 cikli un visbeidzot 72 ° C 10 minūšu laikā..PCR produkti tika atdalīti ar elektroforēzi agarozes gēlos (1, 5%), kas satur SYBRTM Safe DNS Gel Stain (Invitrogen, Burlington, ON, Kanāda) pie 95 V.
Mīdijas (Mytilus spp.) Aclimatizēja 500 ml skābekļa ūdenī (32 PSU) 24 stundas 4 ° C temperatūrā.Plazmīdas DNS, kas satur ieliktni, kas kodē cilvēka galektīna-7 cDNS secību (NCBI piekļuves numurs L07769), tika pievienota flakonam ar galīgo koncentrāciju 190 μg/μl.Kontrole bija gliemenes, kas inkubētas tādos pašos apstākļos bez DNS pievienošanas.Trešajā kontroles tvertnē bija DNS bez gliemenēm.Lai uzraudzītu DNS kvalitāti jūras ūdenī, norādītajā laikā no katras tvertnes tika ņemti jūras ūdens paraugi (20 μl; trīs atkārtojumi).Plazmīdu DNS izsekojamībai LB gliemenes tika novāktas norādītajos laikos un analizētas ar qPCR un ddPCR.Tā kā jūras ūdenī ir liels sāls saturs, pirms visiem PCR testiem alikvotas tika atšķaidītas PCR kvalitātes ūdenī (1:10).
Digitālā pilienu PCR (ddPCR) tika veikta, izmantojot BioRad QX200 protokolu (Misisuga, Ontario, Kanāda).Izmantojiet temperatūras profilu, lai noteiktu optimālo temperatūru (S1 tabula).Pilieni tika ģenerēti, izmantojot QX200 pilienu ģeneratoru (BioRad).DDPCR tika veikts šādi: 95 ° C 5 minūtes, 50 cikli 95 ° C 30 sekundes un doto atkvēlināšanas temperatūru 1 min un 72 ° C 30 sekundes, 4 ° C 5 minūtes un 90 ° C 5 minūšu laikā.Pilienu un pozitīvo reakciju skaits (kopiju skaits/µl) tika mērīts, izmantojot QX200 pilienu lasītāju (BioRad).Paraugi ar mazāk nekā 10 000 pilienu tika noraidīti.Modeļa kontrole netika veikta katru reizi, kad tika palaists ddPCR.
qPCR tika veikta, izmantojot Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Sidneja, Austrālija) un LGALS7 specifiskos primerus.Visi kvantitatīvie PCR tika veikti 20 µl, izmantojot QuantiFast SYBR Green PCR komplektu (QIAGEN).qPCR tika sākta ar 15 minūšu inkubāciju 95 ° C temperatūrā, kam sekoja 40 cikli 95 ° C temperatūrā 10 sekundes un 60 ° C temperatūrā 60 sekundes ar vienu datu vākšanu.Kušanas līknes tika izveidotas, izmantojot secīgus mērījumus 95 ° C temperatūrā 5 sekundes, 65 ° C temperatūrā 60 sekundes un 97 ° C qPCR beigās.Katrs qPCR tika veikts trīs eksemplāros, izņemot kontroles paraugus.
Tā kā gliemenes ir pazīstamas ar savu augsto filtrēšanas ātrumu, mēs vispirms izpētījām, vai tās var filtrēt un saglabāt DNS fragmentus, kas atrodas jūras ūdenī.Mūs arī interesēja, vai šie fragmenti uzkrājas viņu daļēji atvērtajā limfātiskajā sistēmā.Mēs eksperimentāli atrisinājām šo problēmu, izsekojot zilo gliemeņu tvertnēm pievienoto šķīstošo DNS fragmentu likteni.Lai atvieglotu DNS fragmentu izsekošanu, mēs izmantojām svešu (nevis pašu) plazmīdu DNS, kas satur cilvēka galektīna-7 gēnu.ddPCR izseko plazmīdu DNS fragmentus jūras ūdenī un gliemenēs.Mūsu rezultāti rāda, ka, ja DNS fragmentu daudzums jūras ūdenī laika gaitā (līdz 7 dienām) palika salīdzinoši nemainīgs, ja nebija gliemeņu, tad gliemeņu klātbūtnē šis līmenis gandrīz pilnībā pazuda 8 stundu laikā (1.A, B att.).Eksogēnās DNS fragmenti tika viegli atklāti 15 minūšu laikā intravalvulārajā šķidrumā un hemolimfā (1.c att.).Šos fragmentus joprojām varēja noteikt līdz pat 4 stundām pēc iedarbības.Šī filtrēšanas aktivitāte attiecībā uz DNS fragmentiem ir salīdzināma ar baktēriju un aļģu filtrēšanas aktivitāti [31].Šie rezultāti liecina, ka gliemenes var filtrēt un uzkrāt svešās DNS savos šķidruma nodalījumos.
Plazmīdu DNS relatīvā koncentrācija jūras ūdenī gliemeņu klātbūtnē (A) vai bez tās (B), mēra ar ddPCR.A daļā rezultāti ir izteikti procentos, un lodziņu apmales attēlo 75. un 25. procentili.Pielāgotā logaritmiskā līkne ir parādīta sarkanā krāsā, un pelēkā krāsā iekrāsotais laukums ir 95% ticamības intervāls.B attēlā sarkanā līnija apzīmē vidējo vērtību un zilā līnija norāda koncentrācijas 95% ticamības intervālu.C Plazmīdas DNS uzkrāšanās gliemeņu hemolimfā un vārstuļu šķidrumā dažādos laikos pēc plazmīdas DNS pievienošanas.Rezultāti tiek parādīti kā absolūtās atklātās kopijas/ml (± SE).
Pēc tam mēs pētījām ccfDNS izcelsmi gliemenēs, kas savāktas no mīdiju gultām Kergelen salās, attālā salu grupā ar ierobežotu antropogēno ietekmi.Šim nolūkam cccDNS no gliemeņu hemolimfām tika izolēta un attīrīta ar metodēm, ko parasti izmanto cilvēka cccDNS attīrīšanai [32, 33].Mēs noskaidrojām, ka vidējā hemolimfas ccfDNA koncentrācija gliemenēs ir zemos mikrogrosā uz ml hemolimfu diapazonu (sk. S2 tabulu, papildinformāciju).Šis koncentrācijas diapazons ir daudz lielāks nekā veseliem cilvēkiem (zemas nanogrammas uz mililitru), bet retos gadījumos vēža pacientiem ccfDNS līmenis var sasniegt vairākus mikrogrusus mililitrā [34, 35].Hemolimfas ccfDNS lieluma sadalījuma analīze parādīja, ka šo fragmentu izmērs ir ļoti atšķirīgs, sākot no 1000 bp līdz 1000 bp.līdz 5000 bp (2. att.).Līdzīgi rezultāti tika iegūti, izmantojot silīcija dioksīda bāzes QIAAMP pētnieka komplektu-metodi, ko parasti izmanto kriminālistikā, lai ātri izolētu un attīrītu genoma DNS no zemas koncentrācijas DNS paraugiem, ieskaitot ccfDNA [36].
Mīdiju hemolimfas reprezentatīva ccfDNS elektroforegramma.Ekstrahēts ar NucleoSnap plazmas komplektu (augšā) un QIAamp DNS izmeklētāja komplektu.B Vijoles grafiks, kas parāda hemolimfas ccfDNS koncentrāciju (± SE) sadalījumu gliemenēs.Melnās un sarkanās līnijas apzīmē attiecīgi vidējo un pirmo un trešo kvartili.
Aptuveni 1% ccfDNS cilvēkiem un primātiem ir svešs avots [21, 37].Ņemot vērā gliemeņu daļēji atvērto asinsrites sistēmu, ar mikrobiem bagātu jūras ūdeni un gliemeņu ccfDNS izmēru sadalījumu, mēs izvirzījām hipotēzi, ka gliemeņu hemolimfa ccfDNS var saturēt bagātīgu un daudzveidīgu mikrobu DNS kopumu.Lai pārbaudītu šo hipotēzi, mēs sekvencējām hemolimfas ccfDNS no Aulacomya atra paraugiem, kas savākti no Kergelen salām, iegūstot vairāk nekā 10 miljonus nolasījumu, no kuriem 97, 6% izturēja kvalitātes kontroli.Pēc tam rādījumi tika klasificēti pēc paša un ne-pašavotiem, izmantojot BLASTN un NCBI divvāku datu bāzes (S1 att., Papildinformācija).
Cilvēkiem gan kodola, gan mitohondriju DNS var izdalīties asinsritē [38].Tomēr šajā pētījumā nebija iespējams sīki aprakstīt gliemeņu kodola genoma DNS, ņemot vērā, ka A. atra genoms nav secināts vai aprakstīts.Tomēr mēs varējām identificēt vairākus mūsu pašu izcelsmes ccfDNA fragmentus, izmantojot divvāku bibliotēku (S2 att., Papildinformācija).Mēs arī apstiprinājām mūsu pašu izcelsmes DNS fragmentu klātbūtni ar virzītu PCR amplifikāciju tiem A. ATRA gēniem, kas tika secīgi (3. att.).Tāpat, ņemot vērā, ka A. atra mitohondriju genoms ir pieejams publiskās datubāzēs, var atrast pierādījumus par mitohondriju ccfDNS fragmentu klātbūtni A. atra hemolimfā.Mitohondriju DNS fragmentu klātbūtne tika apstiprināta ar PCR amplifikāciju (3. att.).
A. atra (sarkani punkti – krājuma numurs: SRX5705969) un M. platensis (zili punkti – krājuma numurs: SRX5705968) hemolimfā bija klāt dažādi mitohondriju gēni, kas pastiprināti ar PCR.Attēls, kas pielāgots no Breton et al., 2011. gada b Hemolimfa supernatanta pastiprināšana no A. atras, kas glabājas uz FTA papīra.Izmantojiet 3 mm perforatoru, lai pievienotu tieši PCR caurulei, kurā ir PCR maisījums.
Ņemot vērā bagātīgo mikrobu saturu jūras ūdenī, mēs sākotnēji koncentrējāmies uz mikrobu DNS sekvenču raksturojumu hemolimfā.Lai to izdarītu, mēs izmantojam divas dažādas stratēģijas.Pirmajā stratēģijā tika izmantota Kraken2, uz algoritmu balstīta secību klasifikācijas programma, kas var identificēt mikrobu secības ar precizitāti, kas salīdzināma ar sprādzienu un citiem rīkiem [28].Vairāk nekā 6719 nolasījumu tika konstatēti kā baktēriju izcelsmes, savukārt 124 un 64 bija attiecīgi no arhejām un vīrusiem (4. att.).Visbiežāk sastopamie baktēriju DNS fragmenti bija Firmicutes (46%), Proteobacteria (27%) un Bacteroidetes (17%) (4.a attēls).Šis sadalījums atbilst iepriekšējiem pētījumiem par jūras gliemeņu mikrobiomu [39, 40].Gammaproteobaktērijas bija galvenā proteobaktēriju klase (44%), ieskaitot daudzas Vibrionales (4.b att.).Ar ddPCR metodi tika apstiprināta Vibrio DNS fragmentu klātbūtne A. atra hemolimfas ccfDNS (4.c att.) [41].Lai iegūtu vairāk informācijas par ccfDNS baktēriju izcelsmi, tika izmantota papildu pieeja (S2 att., Papildinformācija). Šajā gadījumā lasījumi, kas pārklājās, tika salikti kā pāra gala nolasījumi un klasificēti kā no sevis (gliemenes) vai nepamatoti, izmantojot BLASTN un E vērtību 1e-3 un nogriezni ar> 90% homoloģiju. Šajā gadījumā lasījumi, kas pārklājās, tika salikti kā pāra gala nolasījumi un klasificēti kā no sevis (gliemenes) vai nepamatoti, izmantojot BLASTN un E vērtību 1e-3 un nogriezni ar> 90% homoloģiju. В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и были классировафиц орчатые моллюски) или чужие по происхождению с использованием BLASTN и значения e 1e-3 и отсечемия>9. Šajā gadījumā pārklājošie nolasījumi tika savākti kā pārī savienoti nolasījumi un tika klasificēti kā vietējie (divvāku) vai neoriģinālie, izmantojot BLASTN un e vērtību 1e-3 un robežvērtību ar> 90% homoloģiju.在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN 和1e-3 梌和愚值暄 倚 值值分类为自身（双壳类）或非自身来源.在 这 种 情况 下 ， 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 ， 使缍 用 使用 使用 使用 使用 使用 使用和> 90% 同源性 的 分类 自身 （双 壳类） 非 自身。。。。。。。. В ээ с лчае перекрывающиеся ччения ыыи собраны ччения с парныи концам и иeikt (дибро д apdraudētu ( чатые молюски) и< несобственые по происхождению с исолззованием значен e blastn и 1e-3 ио гч г Blastn и 1 Šajā gadījumā pārklājošie nolasījumi tika savākti kā pārīši nolasīti un klasificēti kā savi (gliemenes) vai neorigināli, izmantojot E blastn un 1E-3 vērtības un homoloģijas slieksni> 90%.Tā kā A. atra genoms vēl nav secināts, mēs izmantojām Megahit nākamās paaudzes sekvencēšanas (NGS) montāžas De novo montāžas stratēģiju.Kopumā 147 188 kontigi ir identificēti kā atkarīgi (divvāku dzimtas dzīvnieki).Pēc tam šie kontigi tika eksplodēti ar e-vērtībām 1e-10, izmantojot BLASTN un BLASTX.Šī stratēģija ļāva mums identificēt 482 ne-divvāku fragmentus, kas atrodas A. atra ccfDNS.Vairāk nekā puse (57%) no šiem DNS fragmentiem iegūti no baktērijām, galvenokārt no žaunu simbiontiem, tai skaitā sulfotrofiskajiem simbiontiem, un no žaunu simbiontiem Solemya velum (5. att.).
Relatīvais pārpilnība tipa līmenī.B Divu galveno cilšu mikrobu daudzveidība (Firmicutes un Proteobacteria).Reprezentatīva ddPCR C Vibrio spp.A. 16S rRNS gēna fragmenti (zils) trīs atra hemolimfās.
Kopumā tika analizēti 482 savākti kontigi.Metagenomisko kontig anotāciju (prokarioti un eikarioti) taksonomiskā sadalījuma vispārīgs profils.B Detalizēts baktēriju DNS fragmentu sadalījums, kas identificēts ar BLASTN un BLASTX.
Kraken2 analīze arī parādīja, ka gliemeņu ccfDNS saturēja arheālus DNS fragmentus, tostarp Euryarchaeota (65%), Crenarchaeota (24%) un Thaurmarcheota (11%) DNS fragmentus (6.a attēls).DNS fragmentu klātbūtnei, kas iegūti no Euryarchaeota un Crenarchaeota, kas iepriekš tika atrasti Kalifornijas gliemeņu mikrobu kopienā, nevajadzētu būt pārsteigumam [42].Lai gan Euryarchaeota bieži tiek saistīta ar ekstremāliem apstākļiem, tagad ir atzīts, ka gan Euryarchaeota, gan Crenarcheota ir vieni no visizplatītākajiem prokariotiem jūras kriogēnajā vidē [43, 44].Metanogēno mikroorganismu klātbūtne gliemenēs nav pārsteidzoša, ņemot vērā nesenos ziņojumus par plašām metāna noplūdēm no grunts noplūdēm Kergelenas plato [45] un iespējamu mikrobu metāna veidošanos, kas novērota pie Kergelenas salu krastiem [46].
Pēc tam mūsu uzmanība tika pievērsta DNS vīrusu rādījumiem.Cik mums ir zināms, šis ir pirmais ārpusmērķa pētījums par vīrusu saturu gliemenēs.Kā gaidīts, mēs atradām bakteriofāgu (Caudovirales) DNS fragmentus (6.b att.).Tomēr visizplatītākā vīrusu DNS nāk no nukleocitovīrusu kopuma, kas pazīstams arī kā kodolieroču citoplazmas lielā DNS vīruss (NCLDV), kuram ir lielākais jebkura vīrusa genoms.Šajā patversmē lielākā daļa DNS sekvenču pieder Mimimidoviridae (58%) un Poxviridae (21%) ģimenēm, kuru dabiskie saimnieki ir mugurkaulnieki un posmkāji, savukārt neliela daļa no šīm DNS sekvencēm pieder zināmām virusoloģiskām aļģēm.Inficē jūras eikariotu aļģes.Sekvences tika iegūtas arī no Pandora vīrusa, milzu vīrusa ar lielāko genoma izmēru no visām zināmajām vīrusu ģintīm.Interesanti, ka saimnieku loks, par kuriem zināms, ka tie ir inficēti ar vīrusu, kā noteikts ar hemolimfas ccfDNS sekvencēšanu, bija salīdzinoši liels (S3 attēls, papildu informācija).Tas ietver vīrusus, kas inficē kukaiņus, piemēram, Baculoviridae un Iridoviridae, kā arī vīrusus, kas inficē amēbas, aļģes un mugurkaulniekus.Mēs arī atradām sekvences, kas atbilst Pithovirus sibericum genomam.Pitovīrusi (pazīstami arī kā "zombiju vīrusi") pirmo reizi tika izolēti no 30 000 gadus veca mūžīgā sasaluma Sibīrijā [47].Tādējādi mūsu rezultāti saskan ar iepriekšējiem ziņojumiem, kas liecina, ka ne visas mūsdienu šo vīrusu sugas ir izmirušas [48] un ka šie vīrusi var atrasties attālās subarktiskās jūras ekosistēmās.
Visbeidzot, mēs pārbaudījām, vai mēs varam atrast DNS fragmentus no citiem daudzšūnu dzīvniekiem.BLASTN un BLASTX kopā ar nt, nr un RefSeq bibliotēkām (genomisko un proteīnu) identificēja 482 ārvalstu kontigus.Mūsu rezultāti liecina, ka starp daudzšūnu dzīvnieku ccfDNS svešajiem fragmentiem dominē kaulaudu DNS (5. att.).Ir atrasti arī DNS fragmenti no kukaiņiem un citām sugām.Salīdzinoši liela DNS fragmentu daļa nav identificēta, iespējams, tāpēc, ka genomiskajās datu bāzēs ir nepietiekami pārstāvēta liela daļa jūras sugu, salīdzinot ar sauszemes sugām [49].
Šajā rakstā mēs izmantojam LB koncepciju gliemenēm, apgalvojot, ka hemolimfas ccfDNS šāvienu sekvencēšana var sniegt ieskatu jūras piekrastes ekosistēmu sastāvā.Konkrēti, mēs noskaidrojām, ka 1) gliemeņu hemolimfa satur salīdzinoši augstu koncentrāciju (mikrogramu līmeni) relatīvi lielu (~1-5 kb) cirkulējošo DNS fragmentu;2) šie DNS fragmenti ir gan neatkarīgi, gan neatkarīgi 3) Starp šo DNS fragmentu svešavotiem mēs atradām baktēriju, arheālu un vīrusu DNS, kā arī citu daudzšūnu dzīvnieku DNS;4) Šo svešo ccfDNS fragmentu uzkrāšanās hemolimfā notiek ātri un veicina gliemeņu iekšējo filtrēšanas aktivitāti.Noslēgumā mūsu pētījums parāda, ka LB jēdziens, kas līdz šim tika izmantots galvenokārt biomedicīnas jomā, kodē bagātīgu, bet neizpētītu zināšanu avotu, ko var izmantot, lai labāk izprastu kontrolsugu un to vides mijiedarbību.
Papildus primātiem ir ziņots par ccfDNS izolāciju zīdītājiem, tostarp pelēm, suņiem, kaķiem un zirgiem [50, 51, 52].Tomēr, cik mums zināms, mūsu pētījums ir pirmais, kas ziņo par ccfDNS noteikšanu un sekvencēšanu jūras sugās ar atvērtas cirkulācijas sistēmu.Šī gliemeņu anatomiskā iezīme un filtrēšanas spēja vismaz daļēji var izskaidrot cirkulējošo DNS fragmentu atšķirīgās izmēra īpašības salīdzinājumā ar citām sugām.Cilvēkiem lielākā daļa DNS fragmentu, kas cirkulē asinīs, ir mazi fragmenti, kuru izmērs ir no 150 līdz 200 bp.ar maksimālo maksimumu 167 bp [34, 53].Neliela, bet ievērojama DNS fragmentu daļa ir no 300 līdz 500 bp izmēram, un apmēram 5% ir garāki par 900 bp.[54].Šāda lieluma sadalījuma iemesls ir tas, ka galvenais ccfDNS avots plazmā rodas šūnu nāves rezultātā, vai nu šūnu nāves dēļ, vai cirkulējošo hematopoētisko šūnu nekrozes dēļ veseliem indivīdiem vai audzēja šūnu apoptozes dēļ vēža slimniekiem (pazīstama kā cirkulējošā audzēja DNS)., ctDNS).Hemolimfas ccfDNS lieluma sadalījums, ko mēs atradām gliemenēs, svārstījās no 1000 līdz 5000 bp, kas liecina, ka gliemeņu ccfDNS izcelsme ir atšķirīga.Tā ir loģiska hipotēze, jo gliemenēm ir daļēji atvērta asinsvadu sistēma un tās dzīvo jūras ūdens vidē, kurā ir augsta mikrobu genoma DNS koncentrācija.Faktiski mūsu laboratorijas eksperimenti, izmantojot eksogēnu DNS, ir parādījuši, ka gliemenes uzkrāj DNS fragmentus jūras ūdenī, vismaz pēc dažām stundām tie tiek degradēti pēc šūnu uzņemšanas un/vai atbrīvoti un/vai uzglabāti dažādās organizācijās.Ņemot vērā šūnu retumu (gan prokariotu, gan eikariotu), intravalvulāro nodalījumu izmantošana samazinās ccfDNS daudzumu no pašavotiem, kā arī no svešiem avotiem.Ņemot vērā gliemenes iedzimtas imunitātes nozīmi un lielo cirkulējošo fagocītu skaitu, mēs arī izvirzījām hipotēzi, ka pat ārvalstu ccfDNA ir bagātināta cirkulējošos fagocītos, kas uzkrāj svešu DNS, uzņemot mikroorganismus un/vai šūnu atlūzas.Kopumā mūsu rezultāti liecina, ka divvāku hemolimfa ccfDNS ir unikāla molekulārās informācijas krātuve un pastiprina to kā kontrolsugas statusu.
Mūsu dati liecina, ka baktēriju izcelsmes hemolimfas ccfDNS fragmentu sekvencēšana un analīze var sniegt galveno informāciju par saimniekbaktēriju floru un baktērijām, kas atrodas apkārtējā jūras ekosistēmā.Šāvienu sekvencēšanas paņēmieni ir atklājuši komensālo baktēriju A. atra žaunu sekvences, kuras būtu izlaistas, ja būtu izmantotas parastās 16S rRNS identifikācijas metodes, daļēji atsauces bibliotēkas novirzes dēļ.Faktiski, izmantojot LB datus, kas savākti no M. platensis tajā pašā gliemeņu slānī Kerguelenā, tika parādīts, ka ar žaunām saistīto baktēriju simbiontu sastāvs bija vienāds abām gliemeņu sugām (S4. att., Papildinformācija).Šī divu ģenētiski atšķirīgo gliemeņu līdzība var atspoguļot baktēriju kopienu sastāvu Kergelenas aukstajos, sērainās un vulkāniskajos nogulumos [55, 56, 57, 58].Augstāks sēru samazinošo mikroorganismu līmenis ir labi aprakstīts, ievācot mīdijas no bioturbētām piekrastes zonām [59], piemēram, Porto-France piekrastē.Vēl viena iespēja ir, ka komensālo gliemeņu floru var ietekmēt horizontālā transmisija [60, 61].Ir vajadzīgi vairāk pētījumu, lai noteiktu korelāciju starp jūras vidi, jūras dibena virsmu un simbiotisko baktēriju sastāvu gliemenēs.Šie pētījumi pašlaik turpinās.
Hemolimfas ccfDNS garums un koncentrācija, tās attīrīšanas vienkāršība un augstā kvalitāte, kas nodrošina ātru bises sekvencēšanu, ir dažas no daudzajām priekšrocībām, ko sniedz gliemeņu ccfDNS izmantošana, lai novērtētu bioloģisko daudzveidību jūras piekrastes ekosistēmās.Šī pieeja ir īpaši efektīva vīrusu kopienu (viromu) raksturošanai noteiktā ekosistēmā [62, 63].Atšķirībā no baktērijām, arhejām un eikariotiem, vīrusu genomi nesatur filoģenētiski konservētus gēnus, piemēram, 16S sekvences.Mūsu rezultāti liecina, ka šķidrās biopsijas no indikatorsugām, piemēram, gliemenēm, var izmantot, lai identificētu salīdzinoši lielu skaitu ccfDNS vīrusa fragmentu, par kuriem zināms, ka tie inficē saimniekus, kas parasti apdzīvo piekrastes jūras ekosistēmas.Tas ietver vīrusus, par kuriem zināms, ka tie inficē vienšūņus, posmkājus, kukaiņus, augus un baktēriju vīrusus (piemēram, bakteriofāgus).Līdzīgs sadalījums tika konstatēts, kad mēs pārbaudījām zilo gliemeņu (M. platensis) hemolimfas ccfDNS viromu, kas savākts tajā pašā gliemeņu slānī Kergelenā (S2 tabula, papildinformācija).ccfDNS bises sekvencēšana patiešām ir jauna pieeja, kas iegūst impulsu cilvēku vai citu sugu viroma pētījumos [21, 37, 64].Šī pieeja ir īpaši noderīga divpavedienu DNS vīrusu pētīšanai, jo starp visiem divpavedienu DNS vīrusiem nav saglabāts neviens gēns, kas pārstāv visdažādāko un plašāko vīrusu klasi Baltimorā [65].Lai gan lielākā daļa šo vīrusu paliek neklasificēti un var ietvert vīrusus no pilnīgi nezināmas vīrusu pasaules daļas [66], mēs atklājām, ka gliemeņu A. atra un M. platensis viromi un saimnieku diapazoni atrodas starp abām sugām.līdzīgi (sk. S3 attēlu, papildu informācija).Šī līdzība nav pārsteidzoša, jo tā var atspoguļot selektivitātes trūkumu vidē esošās DNS uzņemšanā.Pašlaik ir nepieciešami turpmāki pētījumi, izmantojot attīrītu RNS, lai raksturotu RNS viromu.
Mūsu pētījumā mēs izmantojām ļoti stingru cauruļvadu, kas pielāgots Kowarski un kolēģu darbam [37], kuri izmantoja divpakāpju apvienoto nolasījumu un kontigu dzēšanu pirms un pēc vietējās ccfDNS montāžas, kā rezultātā tika iegūta liela nekartēto lasījumu daļa.Tāpēc mēs nevaram izslēgt, ka dažiem no šiem nekartētajiem lasījumiem joprojām var būt sava izcelsme, galvenokārt tāpēc, ka mums nav šīs gliemeņu sugas atsauces genoma.Mēs izmantojām arī šo konveijeru, jo bijām noraizējušies par himerām starp pašnolasījumiem un ne-pašlasījumiem un Illumina MiSeq PE75 ģenerētajiem lasīšanas garumiem.Vēl viens iemesls lielākajai daļai neatklātu rādījumu ir tas, ka liela daļa jūras mikrobu, īpaši attālos apgabalos, piemēram, Kergelenā, nav anotēti.Mēs izmantojām Illumina MiSeq PE75, pieņemot, ka ccfDNS fragmentu garums ir līdzīgs cilvēka ccfDNS.Turpmākajos pētījumos, ņemot vērā mūsu rezultātus, kas liecina, ka hemolimfas ccfDNS lasāmība ir ilgāka nekā cilvēkiem un/vai zīdītājiem, mēs iesakām izmantot sekvencēšanas platformu, kas ir piemērotāka garākiem ccfDNS fragmentiem.Šī prakse ļaus daudz vieglāk noteikt vairāk norāžu dziļākai analīzei.Pašlaik nepieejamās pilnīgas A. atra kodola genoma secības iegūšana arī ievērojami atvieglotu ccfDNS diskrimināciju no pašavotiem un citiem avotiem.Ņemot vērā, ka mūsu pētījums ir vērsts uz iespēju piemērot šķidrās biopsijas koncepciju gliemenēm, mēs ceram, ka, tā kā šī koncepcija tiks izmantota turpmākajos pētījumos, tiks izstrādāti jauni instrumenti un cauruļvadi, lai palielinātu šīs metodes potenciālu gliemeņu mikrobu daudzveidības pētīšanai.jūras ekosistēma.
Kā neinvazīvs klīnisks biomarķieris, paaugstināts ccfDNS līmenis cilvēka plazmā ir saistīts ar dažādām slimībām, audu bojājumiem un stresa apstākļiem [67, 68, 69].Šis pieaugums ir saistīts ar savas izcelsmes DNS fragmentu izdalīšanos pēc audu bojājumiem.Mēs šo problēmu risinājām, izmantojot akūtu karstuma stresu, kurā mīdijas īslaicīgi tika pakļautas 30 ° C temperatūrai.Trīs neatkarīgos eksperimentos mēs veica šo analīzi par trim dažādiem gliemeņu veidiem.Tomēr mēs neatradām nekādas izmaiņas ccfDNS līmeņos pēc akūta karstuma stresa (sk. S5 attēlu, papildu informācija).Šis atklājums vismaz daļēji var izskaidrot faktu, ka gliemenēm ir daļēji atvērta asinsrites sistēma un tās uzkrāj lielu daudzumu svešas DNS, pateicoties to augstajai filtrēšanas aktivitātei.No otras puses, gliemenes, tāpat kā daudzi bezmugurkaulnieki, var būt izturīgākas pret stresa izraisītiem audu bojājumiem, tādējādi ierobežojot ccfDNS izdalīšanos hemolimfā [70, 71].
Līdz šim ūdens ekosistēmu bioloģiskās daudzveidības DNS analīze galvenokārt ir vērsta uz vides DNS (eDNS) metabarkodēšanu.Tomēr šī metode parasti ir ierobežota bioloģiskās daudzveidības analīzē, ja tiek izmantoti grunti.Izmantojot bises sekvencēšanu, tiek apieti PCR ierobežojumi un neobjektīva primer komplektu izvēle.Tādējādi savā ziņā mūsu metode ir tuvāk nesen izmantotajai augstas caurlaides spējas EDNA bise sekvencēšanas metodei, kas spēj tieši secīgi sadrumstalot DNS un analizēt gandrīz visus organismus [72, 73].Tomēr ir vairākas būtiskas problēmas, kas atšķir LB no standarta eDNA metodēm.Protams, galvenā atšķirība starp eDNA un LB ir dabisko filtru saimnieku izmantošana.Ir ziņots par jūras sugu, piemēram, sūkļu un gliemeņu (Dresseina spp.) izmantošanu kā dabisku filtru eDNS pētīšanai [74, 75].Tomēr Drīsenas pētījumā tika izmantotas audu biopsijas, no kurām tika iegūta DNS.LB ccfDNS analīzei nav nepieciešama audu biopsija, specializēta un dažreiz dārga iekārta un loģistika, kas saistīta ar eDNS vai audu biopsiju.Faktiski mēs nesen ziņojām, ka CCFDNA no LB var uzglabāt un analizēt ar FTA atbalstu, neuzturot auksto ķēdi, kas ir būtisks izaicinājums pētījumiem attālos rajonos [76].Arī ccfDNS ekstrakcija no šķidrām biopsijām ir vienkārša un nodrošina augstas kvalitātes DNS bises sekvencēšanai un PCR analīzei.Tā ir liela priekšrocība, ņemot vērā dažus tehniskos ierobežojumus, kas saistīti ar eDNS analīzi [77].Paraugu ņemšanas metodes vienkāršība un zemās izmaksas ir īpaši piemērotas arī ilgtermiņa monitoringa programmām.Papildus augstajai filtrēšanas spējai vēl viena plaši pazīstama gliemeņu īpašība ir to gļotu ķīmiskais mukopolisaharīdu sastāvs, kas veicina vīrusu absorbciju [78, 79].Tas padara gliemenes par ideālu dabisko filtru, lai raksturotu bioloģisko daudzveidību un klimata pārmaiņu ietekmi uz noteiktu ūdens ekosistēmu.Lai gan no saimniekorganisma iegūto DNS fragmentu klātbūtni var uzskatīt par metodes ierobežojumu salīdzinājumā ar eDNS, izmaksas, kas saistītas ar šādas native ccfDNS, salīdzinot ar eDNS, ir vienlaikus saprotamas, ņemot vērā milzīgo informācijas daudzumu, kas pieejams veselības pētījumiem.ofseta saimniekdators.Tas ietver vīrusa sekvenču klātbūtni, kas integrētas saimnieksaimnieka genomā.Tas ir īpaši svarīgi gliemenēm, ņemot vērā horizontāli transmisīvo leikēmisko retrovīrusu klātbūtni gliemenēs [80, 81].Vēl viena LB priekšrocība salīdzinājumā ar EDNA ir tā, ka tā izmanto cirkulējošo asins šūnu fagocītisko aktivitāti hemolimfā, kas piesaista mikroorganismus (un to genomus).Fagocitoze ir gliemeņu galvenā asins šūnu funkcija [82].Visbeidzot, metode izmanto lielo gliemeņu filtrēšanas spēju (vidēji 1,5 l/h jūras ūdens) un divu dienu cirkulāciju, kas palielina dažādu jūras ūdens slāņu sajaukšanos, ļaujot uztvert heterologu eDNS.[83, 84].Tādējādi gliemeņu ccfDNS analīze ir interesants ceļš, ņemot vērā gliemeņu ietekmi uz uzturu, ekonomiku un vidi.Līdzīgi kā no cilvēkiem savāktā LB analīze, šī metode arī paver iespēju izmērīt saimnieka DNS ģenētiskās un epiģenētiskās izmaiņas, reaģējot uz eksogēnām vielām.Piemēram, var paredzēt trešās paaudzes sekvencēšanas tehnoloģijas, lai veiktu genoma mēroga metilēšanas analīzi native ccfDNS, izmantojot nanoporu sekvencēšanu.Šo procesu vajadzētu atvieglot faktam, ka gliemeņu ccfDNS fragmentu garums ir ideāli savietojams ar ilgi nolasāmām sekvencēšanas platformām, kas ļauj veikt genoma mēroga DNS metilēšanas analīzi no vienas sekvencēšanas reizes, neizmantojot ķīmiskas transformācijas.85,86] Šī ir interesanta iespēja, jo ir pierādīts, ka DNS metilēšanas modeļi atspoguļo daudzus vides stresa faktorus.Tāpēc tas var sniegt vērtīgu ieskatu pamatā esošajos mehānismos, kas regulē reakciju pēc klimata pārmaiņu vai piesārņotāju iedarbības [87].Tomēr LB izmantošana nav bez ierobežojumiem.Lieki piebilst, ka tas prasa indikatorsugu klātbūtni ekosistēmā.Kā minēts iepriekš, izmantojot LB, lai novērtētu noteiktas ekosistēmas bioloģisko daudzveidību, ir nepieciešams arī stingrs bioinformātikas cauruļvads, kurā ņemta vērā DNS fragmentu klātbūtne no avota.Vēl viena liela problēma ir jūras sugu atsauces genomu pieejamība.Cerams, ka tādas iniciatīvas kā jūras zīdītāju genomu projekts un nesen izveidotais Fish10k projekts [88] veicinās šādu analīzi nākotnē.LB koncepcijas pielietojums jūras organismiem, kas barojas ar filtru, ir saderīgs arī ar jaunākajiem sasniegumiem sekvencēšanas tehnoloģijā, padarot to labi piemērotu vairāku omu biomarķieru izstrādei, lai sniegtu svarīgu informāciju par jūras biotopu veselību, reaģējot uz vides stresu.
Genoma sekvencēšanas dati ir deponēti NCBI secību lasīšanas arhīvā https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 sadaļā Bioprojects SRR8924808.
Brierley AS, Kingsford MJ Klimata pārmaiņu ietekme uz jūras dzīvi un ekosistēmām.Kola bioloģija.2009. gads;19: P602 - P614.
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Almpanidou V, Bevilacqua S u.c.Apsveriet klimata pārmaiņu un citu vietējo stresa izraisīto ietekmi uz jūras vidi.vispārējā zinātniskā vide.2021;755:142564.
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P u.c.).Zinātne par pirmo martu.2020; 7: 48.
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. Samazināta siltuma tolerance atkārtota karstuma stresa apstākļos izskaidro zilo mīdiju augsto vasaras mirstību.2019. gada zinātniskais ziņojums;9:17498.
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Servantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER u.c.Nesenās izmaiņas dzīvnieku nāves biežumā, cēloņos un apmēros.Proc Natl Acad Sci USA.2015; 112: 1083-8.
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mughetti D, Cerruti F, Hosseini S u.c.Vairāki sugai nespecifiski patogēni var būt izraisījuši Pinna nobilis masveida mirstību.Dzīve.2020; 10: 238.
Bredlijs M, Coutts SJ, Dženkinss E, O'Hara TM.Klimata pārmaiņu iespējamā ietekme uz Arktikas zoonozēm.Int J Circumpolārā veselība.2005;64: 468–77.
Beyer J., Greene NW, Brooks S., Allan IJ, Ruus A., Gomez T. u.c.Zilās mīdijas (Mytilus edulis spp.) kā signālorganismi piekrastes piesārņojuma monitoringā: pārskats.Mar Environ Res 2017;130:338-65.
Siravegna G, Marsoni S, Siena S, Bardelli A. Šķidrās biopsijas integrācija vēža ārstēšanā.Nat Rev Clean Oncol.2017;14: 531–48.
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C u.c.Šķidrās biopsijas nobriešana: ļauj cirkulēt audzēja DNS.Nat Rev vēzis.2017;17:223–38.
Mandel P., Metais P. Nukleīnskābes cilvēka plazmā.Soc Biol meitas uzņēmumu sanāksmju protokoli.1948. gads;142:241-3.
Bronkhorst AJ, Ungerer W, Holdenrieder S. Jauna loma bezšūnu DNS kā molekulāra marķiera vēža ārstēšanai.Biomolārās analīzes kvantitatīva noteikšana.2019;17:100087.
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS Klīnikā ienāk šķidrā biopsija – ieviešanas jautājumi un nākotnes izaicinājumi.Nat Rev Clin Oncol.2021. gads;18:297–312.
Lo YM, Corbetta N., Chamberlain PF, Rai W., Sargent IL, Redman CW un citi.Augļa DNS atrodas mātes plazmā un serumā.Lancete.1997. gads;350:485-7.
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR Grūtniecības norises un tās komplikāciju pētījums, izmantojot cirkulējošo ārpusšūnu RNS sieviešu asinīs grūtniecības laikā.Dopediatrija.2020;8:605219.
Ollerich M, Sherwood K, Keown P, Schütz E, Beck J, Stegbauer J u.c.Šķidruma biopsija: no donora šūnām nesaturošu DNS izmanto, lai atklātu alogēnus bojājumus nieres transplantātā.Nat Rev Nefrols.2021. gads;17:591–603.
Juan FC, Lo YM Inovācijas pirmsdzemdību diagnostikā: mātes plazmas genoma sekvencēšana.Anna MD.2016;67:419-32.
Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D u.c.Ātra patogēnu noteikšana ar inficēto ķermeņa šķidrumu nākamās paaudzes metagenomisko secību.Nat Medicīna.2021;27:115-24.