Paldies, ka apmeklējāt vietni Nature.com. Jūsu izmantotajai pārlūkprogrammas versijai ir ierobežots CSS atbalsts. Lai nodrošinātu vislabāko pieredzi, iesakām izmantot atjauninātu pārlūkprogrammu (vai atspējot saderības režīmu pārlūkprogrammā Internet Explorer). Tikmēr, lai nodrošinātu nepārtrauktu atbalstu, mēs atveidosim vietni bez stiliem un JavaScript.
Šķidrā biopsija (LB) ir koncepcija, kas strauji iegūst popularitāti biomedicīnas jomā. Koncepcija galvenokārt balstās uz cirkulējošās ekstracelulārās DNS (ccfDNS) fragmentu noteikšanu, kas galvenokārt tiek atbrīvoti kā mazi fragmenti pēc šūnu nāves dažādos audos. Neliela daļa šo fragmentu ir iegūti no svešiem (svešiem) audiem vai organismiem. Pašreizējā darbā mēs esam pielietojuši šo koncepciju gliemenēm, kontrolsugai, kas pazīstama ar savu augsto jūras ūdens filtrācijas spēju. Mēs izmantojam gliemju spēju darboties kā dabiskiem filtriem, lai uztvertu vides DNS fragmentus no dažādiem avotiem, lai sniegtu informāciju par jūras piekrastes ekosistēmu bioloģisko daudzveidību. Mūsu rezultāti liecina, ka gliemeņu hemolimfa satur DNS fragmentus, kuru izmērs ir ļoti atšķirīgs - no 1 līdz 5 kb. Sekvencēšana ar bisi parādīja, ka liels skaits DNS fragmentu ir svešas mikrobiālas izcelsmes. Starp tiem mēs atradām DNS fragmentus no baktērijām, arhejām un vīrusiem, tostarp vīrusiem, kas zināmi kā inficējoši dažādus saimniekus, kas parasti sastopami piekrastes jūras ekosistēmās. Noslēgumā mūsu pētījums parāda, ka LB koncepcijas piemērošana mīdijām ir bagātīgs, bet vēl neizpētīts zināšanu avots par mikrobu daudzveidību jūras piekrastes ekosistēmās.
Klimata pārmaiņu (KK) ietekme uz jūras ekosistēmu bioloģisko daudzveidību ir strauji augoša pētījumu joma. Globālā sasilšana ne tikai rada nozīmīgu fizioloģisko stresu, bet arī paplašina jūras organismu termiskās stabilitātes evolūcijas robežas, ietekmējot daudzu sugu dzīvotni, mudinot tās meklēt labvēlīgākus apstākļus [1, 2]. Papildus ietekmei uz metazoānu bioloģisko daudzveidību, KK izjauc saimnieka un mikrobu mijiedarbības trauslo līdzsvaru. Šī mikrobiālā disbakterioze rada nopietnus draudus jūras ekosistēmām, jo ​​padara jūras organismus uzņēmīgākus pret infekcijas izraisītājiem [3, 4]. Tiek uzskatīts, ka SS ir svarīga loma masveida nāves gadījumos, kas ir nopietna problēma globālo jūras ekosistēmu pārvaldībā [5, 6]. Šis ir svarīgs jautājums, ņemot vērā daudzu jūras sugu ekonomisko, ekoloģisko un uztura ietekmi. Tas jo īpaši attiecas uz gliemenēm, kas dzīvo polārajos reģionos, kur KK ietekme ir tiešāka un smagāka [6, 7]. Faktiski gliemenes, piemēram, Mytilus spp., tiek plaši izmantotas, lai uzraudzītu KK ietekmi uz jūras ekosistēmām. Nav pārsteidzoši, ka ir izstrādāts relatīvi liels skaits biomarķieru, lai uzraudzītu to veselību, bieži izmantojot divlīmeņu pieeju, kurā iesaistīti funkcionālie biomarķieri, kuru pamatā ir fermentatīvā aktivitāte vai šūnu funkcijas, piemēram, šūnu dzīvotspēja un fagocītu aktivitāte [8]. Šīs metodes ietver arī specifisku spiediena indikatoru koncentrācijas mērīšanu, kas uzkrājas mīkstajos audos pēc liela daudzuma jūras ūdens absorbcijas. Tomēr gliemeņu augstā filtrācijas spēja un daļēji atvērtā asinsrites sistēma sniedz iespēju izstrādāt jaunus hemolimfas biomarķierus, izmantojot šķidrās biopsijas (LB) koncepciju, kas ir vienkārša un minimāli invazīva pieeja pacientu aprūpei. asins paraugi [9, 10]. Lai gan cilvēka LB var atrast vairāku veidu cirkulējošas molekulas, šī koncepcija galvenokārt balstās uz cirkulējošo ekstracelulāro DNS (ccfDNS) fragmentu DNS sekvencēšanas analīzi plazmā. Faktiski cirkulējošās DNS klātbūtne cilvēka plazmā ir zināma kopš 20. gadsimta vidus [11], taču tikai pēdējos gados augstas caurlaidības sekvencēšanas metožu parādīšanās ir novedusi pie klīniskās diagnozes, kuras pamatā ir ccfDNS. Šo cirkulējošo DNS fragmentu klātbūtne daļēji ir saistīta ar genoma DNS (kodola un mitohondriju) pasīvo atbrīvošanos pēc šūnu nāves. Veseliem cilvēkiem ccfDNS koncentrācija parasti ir zema (<10 ng/ml), bet pacientiem, kuri cieš no dažādām patoloģijām vai ir pakļauti stresam, tā var palielināties 5–10 reizes, kā rezultātā rodas audu bojājumi. Veseliem cilvēkiem ccfDNS koncentrācija parasti ir zema (<10 ng/ml), bet pacientiem, kuri cieš no dažādām patoloģijām vai ir pakļauti stresam, tā var palielināties 5–10 reizes, kā rezultātā rodas audu bojājumi. У здоровых людей концентрация вккДНК в норме низкая (<10 нг/мл), но может повышаться в 5-10 разнрачы патологией или подвергающихся стрессу, приводящему к повреждению тканей. Veseliem cilvēkiem cccDNS koncentrācija parasti ir zema (<10 ng/ml), bet pacientiem ar dažādām patoloģijām vai stresa apstākļos, kas izraisa audu bojājumus, tā var palielināties 5–10 reizes.在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/mL），但在患有各种病理或承受压力的患者中可增加5-10 倍㼌从而寄致瀍在 健康 个体 中 ， ccfdna 的 浓度 较 低 （（<10 ng/ml）中 可 增加 5-10 倍 ， 从而 组织。。。 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤损伤Концентрации ccfDNA обычно низкие (<10 нг/мл) у здоровых людей, no могут быть увеличены в 5.-10.працинто различными патологиями или стрессом, что приводит к повреждению тканей. ccfDNS koncentrācija veseliem indivīdiem parasti ir zema (<10 ng/ml), bet pacientiem ar dažādām patoloģijām vai stresu tā var palielināties 5–10 reizes, kā rezultātā rodas audu bojājumi.ccfDNS fragmentu lielums ir ļoti atšķirīgs, bet parasti svārstās no 150 līdz 200 bp. [12]. Pašiegūtas ccfDNS, t.i., ccfDNS no normālām vai transformētām saimniekšūnām, analīzi var izmantot, lai atklātu ģenētiskas un epigenetiskas izmaiņas kodola un/vai mitohondriju genomā, tādējādi palīdzot klīnicistiem izvēlēties specifiskas molekulāri mērķētas terapijas [13]. Tomēr ccfDNS var iegūt no svešiem avotiem, piemēram, ccfDNS no augļa šūnām grūtniecības laikā vai no transplantētiem orgāniem [14,15,16,17]. ccfDNS ir arī svarīgs informācijas avots infekcijas izraisītāja (sveša) nukleīnskābju klātbūtnes noteikšanai, kas ļauj neinvazīvi atklāt plaši izplatītas infekcijas, kas nav identificētas ar asins kultūrām, izvairoties no inficētu audu invazīvas biopsijas [18]. Jaunākie pētījumi patiešām ir parādījuši, ka cilvēka asinīs ir bagātīgs informācijas avots, ko var izmantot vīrusu un baktēriju patogēnu identificēšanai, un ka aptuveni 1% no cilvēka plazmā atrastās ccfDNS ir svešas izcelsmes [19]. Šie pētījumi pierāda, ka organisma cirkulējošā mikrobioma bioloģisko daudzveidību var novērtēt, izmantojot ccfDNS analīzi. Tomēr līdz nesenam laikam šis jēdziens tika izmantots tikai cilvēkiem un mazākā mērā citiem mugurkaulniekiem [20, 21].
Šajā rakstā mēs izmantojam LB potenciālu, lai analizētu Aulacomya atra ccfDNS, dienvidu sugas, kas bieži sastopama subantarktiskajās Kergelēna salās, salu grupā, kas atrodas uz liela plato, kas izveidojās pirms 35 miljoniem gadu. Izmantojot in vitro eksperimentālo sistēmu, mēs atklājām, ka jūras ūdenī esošos DNS fragmentus ātri uzņem mīdijas un tie nonāk hemolimfas nodalījumā. Sekvencēšana ar bisi ir parādījusi, ka mīdiju hemolimfas ccfDNS satur savas un svešas izcelsmes DNS fragmentus, tostarp simbiotiskas baktērijas un DNS fragmentus no biomām, kas raksturīgas aukstām vulkāniskām jūras piekrastes ekosistēmām. Hemolimfas ccfDNS satur arī vīrusu sekvences, kas iegūtas no vīrusiem ar dažādu saimnieku diapazonu. Mēs atradām arī DNS fragmentus no daudzšūnu dzīvniekiem, piemēram, kaulainām zivīm, jūras anemonēm, aļģēm un kukaiņiem. Noslēgumā mūsu pētījums parāda, ka LB koncepciju var veiksmīgi pielietot jūras bezmugurkaulniekiem, lai radītu bagātīgu genoma repertuāru jūras ekosistēmās.
Pieaugušas (55–70 mm garas) Mytilus platensis (M. platensis) un Aulacomya atra (A. atra) īpatņi tika savākti Kergelēna salu paisuma un bēguma klinšainajos krastos (049°21.235 S, 070°13.490 E.) 2018. gada decembrī. Citas pieaugušas zilās mīdijas (Mytilus spp.) tika iegūtas no komerciāla piegādātāja (PEI Mussel King Inc., Prinča Edvarda sala, Kanāda) un ievietotas temperatūras kontrolētā (4°C) aerētā tvertnē, kas saturēja 10–20 l 32‰ mākslīgā sālsūdens (mākslīgais jūras sāls Reef Crystal, Instant Ocean, Virdžīnija, ASV). Katram eksperimentam tika mērīts atsevišķu gliemežvāku garums un svars.
Šīs programmas bezmaksas atvērtās piekļuves protokols ir pieejams tiešsaistē (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1). Īsumā, LB hemolimfa tika savākta no abduktoru muskuļiem, kā aprakstīts [22]. Hemolimfa tika attīrīta, centrifugējot ar 1200×g 3 minūtes, supernatants tika sasaldēts (-20°C) līdz lietošanai. cfDNS izolēšanai un attīrīšanai paraugi (1,5–2,0 ml) tika atkausēti un apstrādāti, izmantojot NucleoSnap cfDNA komplektu (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) saskaņā ar ražotāja norādījumiem. ccfDNS tika uzglabāta -80°C temperatūrā līdz turpmākai analīzei. Dažos eksperimentos ccfDNS tika izolēta un attīrīta, izmantojot QIAamp DNA Investigator komplektu (QIAGEN, Toronto, Ontario, Kanāda). Attīrītā DNS tika kvantitatīvi noteikta, izmantojot standarta PicoGreen testu. Izolētās ccfDNS fragmentu sadalījums tika analizēts ar kapilāro elektroforēzi, izmantojot Agilent 2100 bioanalizatoru (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) un augstas jutības DNS komplektu. Tests tika veikts, izmantojot 1 µl ccfDNS parauga saskaņā ar ražotāja norādījumiem.
Hemolimfas ccfDNS fragmentu sekvencēšanai Génome Québec (Monreāla, Kvebeka, Kanāda) sagatavoja "shotgun" bibliotēkas, izmantojot Illumina DNA Mix komplektu no Illumina MiSeq PE75 komplekta. Tika izmantots standarta adapteris (BioO). Neapstrādātu datu faili ir pieejami NCBI secības lasīšanas arhīvā (SRR8924808 un SRR8924809). Pamata lasīšanas kvalitāte tika novērtēta, izmantojot FastQC [23]. Trimmomatic [24] tika izmantots adapteru apgriešanai un sliktas kvalitātes lasīšanai. "Shotgun" lasīšanas dati ar pāra galiem tika FLASH apvienoti garākos atsevišķos lasīšanas datos ar minimālu 20 bp pārklāšanos, lai izvairītos no neatbilstībām [25]. Apvienotie nolasījumi tika anotēti ar BLASTN, izmantojot divvāku gliemeņu NCBI taksonomijas datubāzi (e vērtība < 1e−3 un 90% homoloģija), un zemas sarežģītības secību maskēšana tika veikta, izmantojot DUST [26]. Apvienotie nolasījumi tika anotēti ar BLASTN, izmantojot divvāku gliemeņu NCBI taksonomijas datubāzi (e vērtība < 1e−3 un 90% homoloģija), un zemas sarežģītības secību maskēšana tika veikta, izmantojot DUST [26]. Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием базы данных таксономии двуство NCBI (значение e < 1e-3 и 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с иваспольнено с PUTEKĻI [26]. Apvienotie nolasījumi tika anotēti ar BLASTN, izmantojot NCBI divvāku gliemeņu taksonomijas datubāzi (e vērtība < 1e-3 un 90% homoloģija), un zemas sarežģītības secības maskēšana tika veikta, izmantojot DUST [26].使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90% 同源性）用BLASTN 注释吼并的读数 [使类数并的读数]进行低复杂度序列的掩蔽.使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 90% 同源） 用 用 用 注释 合并 读数 6 ]（进行 复杂度 序列 的。。。。 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием таксономической базы дануных моллюсков NCBI (значение e <1e-3 un 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности былне выспологии использованием PUTEKĻI [26]. Apvienotie nolasījumi tika anotēti ar BLASTN, izmantojot NCBI divvāku gliemeņu taksonomijas datubāzi (e vērtība <1e-3 un 90% homoloģija), un zemas sarežģītības secības maskēšana tika veikta, izmantojot DUST [26].Nolasījumi tika iedalīti divās grupās: saistītie ar divvāku sekvencēm (šeit saukti par pašnolasījumiem) un nesaistītie (nepašnolasījumi). Divas grupas tika atsevišķi apkopotas, izmantojot MEGAHIT, lai ģenerētu kontigus [27]. Tikmēr svešzemju mikrobiomu nolasījumu taksonomiskais sadalījums tika klasificēts, izmantojot Kraken2 [28], un grafiski attēlots ar Krona sektoru diagrammu uz Galaxy [29, 30]. No mūsu sākotnējiem eksperimentiem tika noteikts, ka optimālie kmeri ir kmeri-59. Paškontigi pēc tam tika identificēti, saskaņojot tos ar BLASTN (gliemenes NCBI datubāze, e vērtība <1e−10 un 60% homoloģija), lai iegūtu galīgo anotāciju. Paškontigi pēc tam tika identificēti, saskaņojot tos ar BLASTN (gliemenes NCBI datubāze, e vērtība <1e−10 un 60% homoloģija), lai iegūtu galīgo anotāciju. Затем собственные контиги были идентифицированы путем сопоставления с BLASTN (база данных, двустворюсмолчаты значение e <1e-10 и гомология 60%) для окончательной аннотации. Paškontigi pēc tam tika identificēti, salīdzinot tos ar BLASTN (NCBI divvāku datubāze, e vērtība <1e-10 un 60% homoloģija) galīgajai anotācijai.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60%同源性）对齐来识别自身重叠群以进行最终注释.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% Затем были идентифицированы собственные контиги для окончательной аннотации путем сопоставления с BLASTN двустворчатых моллюсков, значение e <1e-10 un гомология 60%). Pēc tam paškontigi tika identificēti galīgajai anotācijai, salīdzinot tos ar BLASTN (NCBI divvāku datubāze, e vērtība <1e-10 un 60% homoloģija). Paralēli, ne-pašgrupas kontigi tika anotēti ar BLASTN (nt NCBI datubāze, e vērtība <1e−10 un 60% homoloģija). Paralēli, ne-pašgrupas kontigi tika anotēti ar BLASTN (nt NCBI datubāze, e vērtība <1e−10 un 60% homoloģija). Параллельно чужеродные групповые контиги были аннотированы с помощью BLASTN (база данных nt NCBI, значение-10 60%). Paralēli ārvalstu grupu kontigi tika anotēti ar BLASTN (NT NCBI datubāze, e vērtība <1e-10 un 60% homoloģija).平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重参平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重参 Параллельно контиги, не относящиеся к собственной группе, были аннотированы с помощью BLASTN (база даннчхе <1e-10 un гомология 60%). Paralēli, ne-pašgrupu kontigi tika anotēti ar BLASTN (nt NCBI datubāze, e vērtība <1e-10 un 60% homoloģija). BLASTX tika veikts arī ar ne-paškontigiem, izmantojot nr un RefSeq proteīnu NCBI datubāzes (e vērtība <1e−10 un 60% homoloģija). BLASTX tika veikts arī ar ne-paškontigiem, izmantojot nr un RefSeq proteīnu NCBI datubāzes (e vērtība <1e−10 un 60% homoloģija). BLASTX также был проведен на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr un RefSeq NCBI (знач1e) гомология 60%). BLASTX tika veikts arī ar ne-paškontigiem, izmantojot nr un RefSeq NCBI proteīnu datubāzes (e vērtība <1e-10 un 60% homoloģija).还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 咧ﺐ 傌源 倧ﺐ 傌 60%还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 咧ﺐ 傌源 倧ﺐ 傌 60% BLASTX также выполняли на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr un RefSeq NCBI (значени-10 60%). BLASTX tika veikts arī ar ne-paškontigiem, izmantojot nr un RefSeq NCBI proteīnu datubāzes (e vērtība <1e-10 un 60% homoloģija).BLASTN un BLASTX nekontigu kopas attēlo galīgos kontus (skatiet papildu failu).
PCR izmantotie primeri ir uzskaitīti S1 tabulā. CcfDNS mērķa gēnu amplifikācijai tika izmantota Taq DNS polimerāze (Bio Basic Canada, Markham, ON). Tika izmantoti šādi reakcijas apstākļi: denaturācija 95°C temperatūrā 3 minūtes, 95°C temperatūrā 1 minūti, iestatīta piejaukšanas temperatūra 1 minūti, elongācija 72°C temperatūrā 1 minūti, 35 cikli un visbeidzot 72°C 10 minūšu laikā. PCR produkti tika atdalīti ar elektroforēzi agarozes želejās (1,5%), kas satur SYBRTM Safe DNA Gel Stain (Invitrogen, Burlington, ON, Kanāda) pie 95 V.
Mīdijas (Mytilus spp.) 24 stundas 4°C temperatūrā aklimatizēja 500 ml skābekli piesātinātā jūras ūdenī (32 PSU). Flakonam pievienoja plazmīdas DNS, kas satur cilvēka galektīna-7 cDNS secību kodējošu ieliktni (NCBI piekļuves numurs L07769), ar galīgo koncentrāciju 190 μg/μl. Kontrolei izmantoja mīdijas, kas tika inkubētas tādos pašos apstākļos bez DNS pievienošanas. Trešajā kontroles tvertnē bija DNS bez mīdijām. Lai uzraudzītu DNS kvalitāti jūras ūdenī, norādītajā laikā no katras tvertnes tika ņemti jūras ūdens paraugi (20 μl; trīs atkārtojumi). Plazmīdu DNS izsekojamības nodrošināšanai LB mīdijas tika ievāktas norādītajos laikos un analizētas ar kvantitatīvās PĶR un ddPCR. Jūras ūdens augstā sāls satura dēļ pirms visām PCR analīzēm alikvotas tika atšķaidītas PCR kvalitātes ūdenī (1:10).
Digitālā pilienu PCR (ddPCR) tika veikta, izmantojot BioRad QX200 protokolu (Misisauga, Ontārio, Kanāda). Optimālās temperatūras noteikšanai izmantojiet temperatūras profilu (S1 tabula). Pilieni tika ģenerēti, izmantojot QX200 pilienu ģeneratoru (BioRad). ddPCR tika veikta šādi: 95°C 5 minūtes, 50 cikli 95°C temperatūrā 30 sekundes un noteiktā atkvēlināšanas temperatūrā 1 minūti un 72°C temperatūrā 30 sekundes, 4°C temperatūrā 5 minūtes un 90°C temperatūrā 5 minūšu laikā. Pilienu skaits un pozitīvās reakcijas (kopiju skaits/µl) tika mērītas, izmantojot QX200 pilienu lasītāju (BioRad). Paraugi ar mazāk nekā 10 000 pilieniem tika noraidīti. Raksta kontrole netika veikta katru reizi, kad tika palaista ddPCR.
qPCR tika veikta, izmantojot Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Sidneja, Austrālija) un LGALS7 specifiskus praimerus. Visas kvantitatīvās PCR tika veiktas 20 µl, izmantojot QuantiFast SYBR Green PCR komplektu (QIAGEN). qPCR tika uzsākta ar 15 minūšu inkubāciju 95°C temperatūrā, kam sekoja 40 cikli 95°C temperatūrā 10 sekundes un 60°C temperatūrā 60 sekundes ar vienu datu vākšanu. Kušanas līknes tika ģenerētas, izmantojot secīgus mērījumus 95°C temperatūrā 5 sekundes, 65°C temperatūrā 60 sekundes un 97°C temperatūrā qPCR beigās. Katra qPCR tika veikta trīs reizes, izņemot kontroles paraugus.
Tā kā mīdijas ir pazīstamas ar savu augsto filtrācijas ātrumu, mēs vispirms pētījām, vai tās var filtrēt un saglabāt jūras ūdenī esošos DNS fragmentus. Mūs interesēja arī tas, vai šie fragmenti uzkrājas to daļēji atvērtajā limfātiskajā sistēmā. Mēs šo problēmu atrisinājām eksperimentāli, izsekojot zilo mīdiju tvertnēm pievienoto šķīstošo DNS fragmentu likteni. Lai atvieglotu DNS fragmentu izsekošanu, mēs izmantojām svešu (nevis pašu) plazmīdu DNS, kas satur cilvēka galektīna-7 gēnu. ddPCR izseko plazmīdu DNS fragmentus jūras ūdenī un mīdijās. Mūsu rezultāti liecina, ka, ja DNS fragmentu daudzums jūras ūdenī laika gaitā (līdz 7 dienām) bez mīdijām saglabājās relatīvi nemainīgs, tad mīdiju klātbūtnē šis līmenis gandrīz pilnībā izzuda 8 stundu laikā (1.a,b att.). Eksogēnās DNS fragmentus varēja viegli noteikt 15 minūšu laikā intravalvulārajā šķidrumā un hemolimfā (1.c att.). Šos fragmentus joprojām varēja noteikt līdz pat 4 stundām pēc iedarbības. Šī filtrēšanas aktivitāte attiecībā uz DNS fragmentiem ir salīdzināma ar baktēriju un aļģu filtrēšanas aktivitāti [31]. Šie rezultāti liecina, ka gliemenes var filtrēt un uzkrāt svešas DNS savos šķidruma nodalījumos.
Plazmīdu DNS relatīvās koncentrācijas jūras ūdenī mīdiju klātbūtnē (A) vai bez tās (B), mērītas ar ddPCR. A attēlā rezultāti ir izteikti procentos, un lodziņu robežas apzīmē 75. un 25. procentīles. Pielāgotā logaritmiskā līkne ir parādīta sarkanā krāsā, un pelēkā krāsā iekrāsotais laukums apzīmē 95% ticamības intervālu. B attēlā sarkanā līnija apzīmē koncentrācijas vidējo vērtību, bet zilā līnija - 95% ticamības intervālu. C Plazmīdu DNS uzkrāšanās mīdiju hemolimfā un vārstuļu šķidrumā dažādos laikos pēc plazmīdu DNS pievienošanas. Rezultāti ir parādīti kā absolūtās noteiktās kopijas/ml (±SE).
Pēc tam mēs pētījām ccfDNS izcelsmi gliemenēs, kas savāktas no gliemeņu audzēm Kergelēna salās, attālā salu grupā ar ierobežotu antropogēno ietekmi. Šim nolūkam ccfDNS no gliemeņu hemolimfām tika izolēta un attīrīta, izmantojot metodes, ko parasti izmanto cilvēka cccDNS attīrīšanai [32, 33]. Mēs atklājām, ka vidējā hemolimfas ccfDNS koncentrācija gliemenēs ir zemā mikrogramu uz ml hemolimfas diapazonā (sk. S2 tabulu, Papildinformācija). Šis koncentrācijas diapazons ir daudz lielāks nekā veseliem cilvēkiem (zems nanograms uz mililitru), bet retos gadījumos vēža slimniekiem ccfDNS līmenis var sasniegt vairākus mikrogramus uz mililitru [34, 35]. Hemolimfas ccfDNS izmēru sadalījuma analīze parādīja, ka šo fragmentu izmērs ievērojami atšķiras, sākot no 1000 bp līdz 1000 bp, līdz pat 5000 bp (2. att.). Līdzīgi rezultāti tika iegūti, izmantojot uz silīcija dioksīda bāzes izgatavoto QIAamp Investigator Kit — metodi, ko parasti izmanto kriminālistikā, lai ātri izolētu un attīrītu genoma DNS no zemas koncentrācijas DNS paraugiem, tostarp ccfDNS [36].
Reprezentatīva gliemeņu hemolimfas ccfDNS elektroforogramma. Iegūta ar NucleoSnap Plasma Kit (augšā) un QIAamp DNA Investigator Kit. B Vijoles diagramma, kurā parādīts hemolimfas ccfDNS koncentrāciju sadalījums (±SE) gliemenēs. Melnās un sarkanās līnijas attiecīgi attēlo mediānu un pirmo un trešo kvartili.
Aptuveni 1% ccfDNS cilvēkiem un primātiem ir no svešķermeņa [21, 37]. Ņemot vērā gliemeņu daļēji atvērto asinsrites sistēmu, mikrobiem bagāto jūras ūdeni un gliemeņu ccfDNS izmēru sadalījumu, mēs izvirzījām hipotēzi, ka gliemeņu hemolimfas ccfDNS var saturēt bagātīgu un daudzveidīgu mikrobiālās DNS kopumu. Lai pārbaudītu šo hipotēzi, mēs sekvencējām hemolimfas ccfDNS no Aulacomya atra paraugiem, kas savākti Kergelēnas salās, iegūstot vairāk nekā 10 miljonus nolasījumu, no kuriem 97,6% izturēja kvalitātes kontroli. Pēc tam nolasījumi tika klasificēti atbilstoši pašu un svešķermeņiem, izmantojot BLASTN un NCBI gliemeņu datubāzes (S1 attēls, Papildinformācija).
Cilvēkiem asinsritē var nonākt gan kodola, gan mitohondriju DNS [38]. Tomēr šajā pētījumā nebija iespējams detalizēti aprakstīt mīdiju kodola genoma DNS, ņemot vērā, ka A. atra genoms nav sekvencēts vai aprakstīts. Tomēr, izmantojot divvāku gliemeņu bibliotēku, mēs varējām identificēt vairākus mūsu pašu izcelsmes ccfDNS fragmentus (S2. att., Papildinformācija). Mēs arī apstiprinājām mūsu pašu izcelsmes DNS fragmentu klātbūtni, veicot tiešu PCR amplifikāciju tiem A. atra gēniem, kas tika sekvencēti (3. att.). Līdzīgi, ņemot vērā, ka A. atra mitohondriju genoms ir pieejams publiskās datubāzēs, var atrast pierādījumus par mitohondriju ccfDNS fragmentu klātbūtni A. atra hemolimfā. Mitohondriju DNS fragmentu klātbūtne tika apstiprināta ar PCR amplifikāciju (3. att.).
Ar PCR amplificētās A. atra (sarkanie punkti — krājuma numurs: SRX5705969) un M. platensis (zilie punkti — krājuma numurs: SRX5705968) hemolimfā tika konstatēti dažādi mitohondriju gēni. Attēls pielāgots no Breton et al., 2011. B A. atra hemolimfas supernatanta amplifikācija. Uzglabāts uz FTA papīra. Izmantojiet 3 mm perforatoru, lai pievienotu tieši PCR mēģenē, kurā atrodas PCR maisījums.
Ņemot vērā bagātīgo mikrobu saturu jūras ūdenī, mēs sākotnēji koncentrējāmies uz mikrobu DNS sekvenču raksturošanu hemolimfā. Lai to izdarītu, mēs izmantojam divas dažādas stratēģijas. Pirmajā stratēģijā tika izmantota Kraken2, uz algoritmiem balstīta sekvenču klasifikācijas programma, kas var identificēt mikrobu sekvences ar precizitāti, kas salīdzināma ar BLAST un citiem rīkiem [28]. Vairāk nekā 6719 lasījumi tika atzīti par baktēriju izcelsmes, savukārt 124 un 64 bija attiecīgi no arhejām un vīrusiem (4. att.). Visizplatītākie baktēriju DNS fragmenti bija Firmicutes (46%), Proteobacteria (27%) un Bacteroidetes (17%) (4.a att.). Šis sadalījums atbilst iepriekšējiem jūras zilo mīdiju mikrobioma pētījumiem [39, 40]. Gammaproteobaktērijas bija galvenā proteobaktēriju klase (44%), tostarp daudzas Vibrionales (4.b att.). ddPCR metode apstiprināja Vibrio DNS fragmentu klātbūtni A. atra hemolimfas ccfDNS (4.c att.) [41]. Lai iegūtu vairāk informācijas par ccfDNS baktēriju izcelsmi, tika izmantota papildu pieeja (S2. att., Papildinformācija). Šajā gadījumā pārklājošies lasījumi tika salikti kā pārī savienoti lasījumi un, izmantojot BLASTN un e vērtību 1e−3, un robežvērtību ar >90% homoloģiju, tika klasificēti kā pašu (gliemeņu) vai nesavīgas izcelsmes. Šajā gadījumā pārklājošies lasījumi tika salikti kā pārī savienoti lasījumi un, izmantojot BLASTN un e vērtību 1e−3, un robežvērtību ar >90% homoloģiju, tika klasificēti kā pašu (gliemeņu) vai nesavīgas izcelsmes. В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и были классиронсоныц (двустворчатые моллюски) или чужие по происхождению с использованием BLASTN и значения e 1e-3 и отсечечеюсесе homologija > 90%. Šajā gadījumā pārklājošie nolasījumi tika apkopoti kā pārī savienoti nolasījumi un, izmantojot BLASTN un e vērtību 1e-3, un robežvērtību ar >90% homoloģiju, tika klasificēti kā dabiskie (gliemenes) vai neoriģinālie.在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN 和1e-3 的e 值% 值同源性的截止值分类为自身（双壳类）或非自身来源.在 这 种 情况 下 ， 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 ， 使用 使用 使用 使用 使用 使用 使用 皁 blast1ne 用 为 配 末端值 和> 90% 同源性 的 分类 自身 （双 壳类） 非 自身。。。。。。. В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и классифицавсткныныны (двустворчатые моллюски) или несобственные по происхождению с использованием значений e BLASTN и 1e-3 порога и homologija > 90%. Šajā gadījumā pārklājošie lasījumi tika apkopoti kā pārotie lasījumi un klasificēti kā pašu (gliemenes) vai neoriģināli, izmantojot e BLASTN un 1e-3 vērtības un homoloģijas slieksni >90%.Tā kā A. atra genoms vēl nav sekvencēts, mēs izmantojām MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS) asemblera de novo montāžas stratēģiju. Kopumā 147 188 kontigi ir identificēti kā izcelsmes atkarīgie (gliemenes). Šie kontigi pēc tam tika sadalīti eksplodēti ar e-vērtībām 1e-10, izmantojot BLASTN un BLASTX. Šī stratēģija ļāva mums identificēt 482 ne-gliemenes fragmentus, kas atrodas A. atra ccfDNS. Vairāk nekā puse (57%) no šiem DNS fragmentiem tika iegūti no baktērijām, galvenokārt no žaunu simbiontiem, tostarp sulfotrofiskajiem simbiontiem, un no žaunu simbiontiem Solemya velum (5. att.).
Relatīvais daudzums tipa līmenī. B Divu galveno filu (Firmicutes un Proteobacteria) mikrobu daudzveidība. DdPCR reprezentatīva amplifikācija C Vibrio spp. A. 16S rRNS gēna fragmenti (zilā krāsā) trīs atra hemolimfās.
Kopumā tika analizēti 482 savāktie kontigi. Metagenomisko kontigu anotāciju taksonomiskā sadalījuma vispārīgs profils (prokarioti un eikarioti). B Ar BLASTN un BLASTX identificēto baktēriju DNS fragmentu detalizēts sadalījums.
Kraken2 analīze arī parādīja, ka gliemeņu ccfDNS saturēja arheju DNS fragmentus, tostarp Euryarchaeota (65%), Crenarchaeota (24%) un Thaurmarcheota (11%) DNS fragmentus (6.a att.). No Euryarchaeota un Crenarchaeota iegūtu DNS fragmentu klātbūtne, kas iepriekš tika atrasti Kalifornijas gliemeņu mikrobu kopienā, nevajadzētu būt pārsteigums [42]. Lai gan Euryarchaeota bieži tiek saistīta ar ekstremāliem apstākļiem, tagad ir atzīts, ka gan Euryarchaeota, gan Crenarcheota ir vieni no visizplatītākajiem prokariotiem jūras kriogēnajā vidē [43, 44]. Metanogēno mikroorganismu klātbūtne gliemenēs nav pārsteidzoša, ņemot vērā nesenos ziņojumus par plašu metāna noplūdi no grunts noplūdēm Kergelēnas plato [45] un iespējamu mikrobiālu metāna ražošanu, kas novērota pie Kergelēnas salu krastiem [46].
Pēc tam mūsu uzmanība tika pievērsta DNS vīrusu lasījumiem. Cik mums zināms, šis ir pirmais pētījums par gliemeņu vīrusu saturu ārpus mērķa. Kā paredzēts, mēs atradām bakteriofāgu (Caudovirales) DNS fragmentus (6.b att.). Tomēr visbiežāk vīrusu DNS nāk no nukleocitovīrusu tipa, kas pazīstams arī kā kodola citoplazmas lielais DNS vīruss (NCLDV), kam ir lielākais genoms no visiem vīrusiem. Šajā tipā lielākā daļa DNS sekvenču pieder pie dzimtām Mimimidoviridae (58%) un Poxviridae (21%), kuru dabisko saimnieku vidū ir mugurkaulnieki un posmkāji, savukārt neliela daļa šo DNS sekvenču pieder zināmām virusoloģiskām aļģēm. Infekcijas jūras eikariotu aļģes. Sekvences tika iegūtas arī no Pandora vīrusa, milzu vīrusa ar lielāko genoma izmēru no visām zināmajām vīrusu ģintīm. Interesanti, ka saimnieku loks, kas, kā zināms, ir inficēti ar vīrusu, ko noteica ar hemolimfas ccfDNS sekvencēšanu, bija salīdzinoši liels (S3. attēls, Papildinformācija). Tas ietver vīrusus, kas inficē kukaiņus, piemēram, Baculoviridae un Iridoviridae, kā arī vīrusus, kas inficē amēbas, aļģes un mugurkaulniekus. Mēs atradām arī sekvences, kas atbilst Pithovirus sibericum genomam. Pitovīrusi (pazīstami arī kā “zombiju vīrusi”) pirmo reizi tika izolēti no 30 000 gadus veca mūžīgā sasaluma Sibīrijā [47]. Tādējādi mūsu rezultāti atbilst iepriekšējiem ziņojumiem, kas liecina, ka ne visas mūsdienu šo vīrusu sugas ir izmirušas [48] un ka šie vīrusi var būt sastopami attālās subarktiskās jūras ekosistēmās.
Visbeidzot, mēs pārbaudījām, vai varam atrast DNS fragmentus no citiem daudzšūnu dzīvniekiem. Ar BLASTN un BLASTX palīdzību, izmantojot nt, nr un RefSeq bibliotēkas (genoma un olbaltumvielu), tika identificēti kopumā 482 svešķermeņi. Mūsu rezultāti liecina, ka starp daudzšūnu dzīvnieku ccfDNS svešķermeņiem dominē kaulaudu DNS (5. att.). Ir atrasti arī kukaiņu un citu sugu DNS fragmenti. Salīdzinoši liela daļa DNS fragmentu nav identificēti, iespējams, tāpēc, ka genoma datubāzēs ir nepietiekami pārstāvēts liels skaits jūras sugu, salīdzinot ar sauszemes sugām [49].
Šajā rakstā mēs piemērojam LB koncepciju mīdijām, apgalvojot, ka hemolimfas ccfDNS šāvienu sekvencēšana var sniegt ieskatu jūras piekrastes ekosistēmu sastāvā. Konkrēti, mēs atklājām, ka 1) mīdiju hemolimfā ir relatīvi augsta relatīvi lielu (~1-5 kb) cirkulējošu DNS fragmentu koncentrācija (mikrogramu līmenī); 2) šie DNS fragmenti ir gan neatkarīgi, gan neatkarīgi; 3) Starp šo DNS fragmentu svešķermeņiem mēs atradām baktēriju, arheju un vīrusu DNS, kā arī citu daudzšūnu dzīvnieku DNS; 4) Šo svešķermeņu ccfDNS fragmentu uzkrāšanās hemolimfā notiek strauji un veicina mīdiju iekšējās filtrēšanas aktivitāti. Noslēgumā jāsaka, ka mūsu pētījums parāda, ka LB koncepcija, kas līdz šim galvenokārt ir pielietota biomedicīnas jomā, kodē bagātīgu, bet neizpētītu zināšanu avotu, ko var izmantot, lai labāk izprastu sargziežu sugu un to vides mijiedarbību.
Papildus primātiem, ccfDNS izolācija ir ziņota arī zīdītājiem, tostarp pelēm, suņiem, kaķiem un zirgiem [50, 51, 52]. Tomēr, cik mums zināms, mūsu pētījums ir pirmais, kurā ziņots par ccfDNS noteikšanu un sekvencēšanu jūras sugās ar atvērtu asinsrites sistēmu. Šī gliemeņu anatomiskā īpašība un filtrēšanas spēja var vismaz daļēji izskaidrot cirkulējošo DNS fragmentu atšķirīgās izmēru īpašības salīdzinājumā ar citām sugām. Cilvēkiem lielākā daļa asinīs cirkulējošo DNS fragmentu ir mazi fragmenti, kuru izmērs svārstās no 150 līdz 200 bp, maksimālais maksimums ir 167 bp [34, 53]. Neliela, bet nozīmīga DNS fragmentu daļa ir no 300 līdz 500 bp, un aptuveni 5% ir garāki par 900 bp [54]. Šī izmēru sadalījuma iemesls ir tas, ka galvenais ccfDNS avots plazmā rodas šūnu nāves rezultātā, kas rodas vai nu šūnu nāves, vai cirkulējošo hematopoētisko šūnu nekrozes dēļ veseliem indivīdiem, vai audzēja šūnu apoptozes dēļ vēža pacientiem (pazīstama kā cirkulējošā audzēja DNS). , ctDNS). Hemolimfas ccfDNS izmēru sadalījums, ko mēs atradām gliemenēs, svārstījās no 1000 līdz 5000 bp, kas liecina, ka gliemenes ccfDNS ir cita izcelsme. Šī ir loģiska hipotēze, jo gliemenēm ir daļēji atvērta asinsvadu sistēma un tās dzīvo jūras ūdens vidē, kurā ir augsta mikrobiālās genoma DNS koncentrācija. Faktiski mūsu laboratorijas eksperimenti, izmantojot eksogēnu DNS, ir parādījuši, ka gliemenes uzkrāj DNS fragmentus jūras ūdenī, vismaz pēc dažām stundām tie tiek noārdīti pēc uzņemšanas šūnās un/vai atbrīvoti un/vai uzglabāti dažādās organizācijās. Ņemot vērā šūnu (gan prokariotu, gan eikariotu) reto sastopamību, intravalvulāro nodalījumu izmantošana samazinās ccfDNS daudzumu gan no pašu avotiem, gan no svešiem avotiem. Ņemot vērā gliemeņu iedzimtās imunitātes nozīmi un lielo cirkulējošo fagocītu skaitu, mēs izvirzījām arī hipotēzi, ka pat sveša ccfDNS ir bagātināta ar cirkulējošiem fagocītiem, kas uzkrāj svešu DNS, uzņemot mikroorganismus un/vai šūnu atliekas. Kopumā mūsu rezultāti liecina, ka gliemeņu hemolimfas ccfDNS ir unikāla molekulārās informācijas krātuve un pastiprina to statusu kā kontrolsugas.
Mūsu dati liecina, ka no baktērijām iegūtu hemolimfas ccfDNS fragmentu sekvencēšana un analīze var sniegt svarīgu informāciju par saimnieka baktēriju floru un apkārtējā jūras ekosistēmā esošajām baktērijām. Šāvienu sekvencēšanas metodes ir atklājušas komensālo baktēriju A. atra žaunu sekvences, kas būtu palaistas garām, ja tiktu izmantotas tradicionālās 16S rRNS identifikācijas metodes, daļēji atsauces bibliotēkas neobjektivitātes dēļ. Faktiski, mūsu izmantotie LB dati, kas savākti no M. platensis tajā pašā mīdiju slānī Kergelenā, parādīja, ka ar žaunām saistīto baktēriju simbiontu sastāvs abām mīdiju sugām bija vienāds (S4. att., Papildinformācija). Šī divu ģenētiski atšķirīgu mīdiju līdzība var atspoguļot baktēriju kopienu sastāvu Kergelenas aukstajos, sērainajos un vulkāniskajos nogulumos [55, 56, 57, 58]. Augstāks sēra reducējošo mikroorganismu līmenis ir labi aprakstīts, ievācot mīdijas no bioturbētām piekrastes zonām [59], piemēram, Portofransas piekrastes. Cita iespēja ir tāda, ka komensālo gliemju floru var ietekmēt horizontālā pārnešana [60, 61]. Ir nepieciešami vairāk pētījumu, lai noteiktu korelāciju starp jūras vidi, jūras gultnes virsmu un simbiotisko baktēriju sastāvu gliemenēs. Šie pētījumi pašlaik turpinās.
Hemolimfas ccfDNS garums un koncentrācija, tās vienkāršā attīrīšana un augstā kvalitāte, kas ļauj veikt ātru sekvencēšanu ar pistoles metodi, ir dažas no daudzajām priekšrocībām, ko sniedz gliemeņu ccfDNS izmantošana bioloģiskās daudzveidības novērtēšanai jūras piekrastes ekosistēmās. Šī pieeja ir īpaši efektīva vīrusu kopienu (viromu) raksturošanai noteiktā ekosistēmā [62, 63]. Atšķirībā no baktērijām, arhejām un eikariotiem, vīrusu genomi nesatur filoģenētiski konservētus gēnus, piemēram, 16S sekvences. Mūsu rezultāti liecina, ka šķidrās biopsijas no indikatorsugām, piemēram, gliemenēm, var izmantot, lai identificētu relatīvi lielu skaitu ccfDNS vīrusu fragmentu, par kuriem zināms, ka tie inficē saimniekus, kas parasti apdzīvo piekrastes jūras ekosistēmas. Tas ietver vīrusus, kas zināmi, ka inficē vienšūņus, posmkājus, kukaiņus, augus un baktēriju vīrusus (piemēram, bakteriofāgus). Līdzīgs sadalījums tika konstatēts, pārbaudot zilo gliemeņu (M. platensis) hemolimfas ccfDNS viromu, kas savākts tajā pašā gliemeņu slānī Kergelenā (S2 tabula, Papildinformācija). ccfDNS sekvencēšana ar bise tipa metodi patiešām ir jauna pieeja, kas uzņem apgriezienus cilvēku vai citu sugu viroma pētījumos [21, 37, 64]. Šī pieeja ir īpaši noderīga divpavedienu DNS vīrusu pētīšanai, jo starp visiem divpavedienu DNS vīrusiem, kas pārstāv visdaudzveidīgāko un plašāko vīrusu klasi Baltimorā, nav saglabājies neviens atsevišķs gēns [65]. Lai gan lielākā daļa šo vīrusu joprojām nav klasificēti un var ietvert vīrusus no pilnīgi nezināmas vīrusu pasaules daļas [66], mēs atklājām, ka mīdiju A. atra un M. platensis viromi un saimnieku diapazoni atrodas starp šīm divām sugām. Līdzīgi (sk. S3. attēlu, papildu informācija). Šī līdzība nav pārsteidzoša, jo tā var atspoguļot selektivitātes trūkumu vidē esošās DNS uzņemšanā. Pašlaik ir nepieciešami turpmāki pētījumi, izmantojot attīrītu RNS, lai raksturotu RNS viromu.
Savā pētījumā mēs izmantojām ļoti stingru procesu plūsmu, kas pielāgota no Kovarska un kolēģu darba [37], kurā tika izmantota divpakāpju apkopoto lasījumu un kontigu dzēšana pirms un pēc dabiskās ccfDNS salikšanas, kā rezultātā liela daļa no kartētajiem lasījumiem bija nesakārtoti. Tāpēc mēs nevaram izslēgt iespēju, ka dažiem no šiem kartētajiem lasījumiem joprojām varētu būt sava izcelsme, galvenokārt tāpēc, ka mums nav atsauces genoma šai gliemeņu sugai. Mēs izmantojām šo procesu plūsmu arī tāpēc, ka mūs uztrauca himēras starp pašnovērtētajiem un nesaprotamajiem lasījumiem un Illumina MiSeq PE75 ģenerētie lasījumu garumi. Vēl viens iemesls lielākajai daļai kartētajiem lasījumiem ir tas, ka liela daļa jūras mikrobu, īpaši attālos apgabalos, piemēram, Kergelenā, nav anotēti. Mēs izmantojām Illumina MiSeq PE75, pieņemot, ka ccfDNS fragmentu garums ir līdzīgs cilvēka ccfDNS garumam. Turpmākiem pētījumiem, ņemot vērā mūsu rezultātus, kas liecina, ka hemolimfas ccfDNS ir garāki lasījumi nekā cilvēkiem un/vai zīdītājiem, mēs iesakām izmantot sekvencēšanas platformu, kas ir piemērotāka garākiem ccfDNS fragmentiem. Šī prakse ievērojami atvieglos vairāk indikāciju identificēšanu padziļinātai analīzei. Pašlaik nepieejamās pilnās A. atra kodola genoma sekvences iegūšana arī ievērojami atvieglotu ccfDNS atšķiršanu no pašu un ne-pašavotiem. Ņemot vērā, ka mūsu pētījums ir vērsts uz iespēju piemērot šķidrās biopsijas koncepciju mīdijām, mēs ceram, ka, izmantojot šo koncepciju turpmākajos pētījumos, tiks izstrādāti jauni rīki un kanāli, lai palielinātu šīs metodes potenciālu mīdiju mikrobu daudzveidības pētīšanā jūras ekosistēmā.
Kā neinvazīvs klīniskais biomarķieris, paaugstināts ccfDNS līmenis cilvēka plazmā ir saistīts ar dažādām slimībām, audu bojājumiem un stresa apstākļiem [67,68,69]. Šis pieaugums ir saistīts ar pašu DNS fragmentu izdalīšanos pēc audu bojājumiem. Mēs risinājām šo problēmu, izmantojot akūtu karstuma stresu, kurā mīdijas tika īslaicīgi pakļautas 30 °C temperatūrai. Šo analīzi veicām ar trīs dažādu veidu mīdijām trīs neatkarīgos eksperimentos. Tomēr pēc akūta karstuma stresa mēs neatradām nekādas izmaiņas ccfDNS līmeņos (sk. S5. attēlu, papildu informācija). Šis atklājums varētu vismaz daļēji izskaidrot faktu, ka mīdijām ir daļēji atvērta asinsrites sistēma un tās uzkrāj lielu daudzumu svešas DNS, pateicoties to augstajai filtrēšanas aktivitātei. No otras puses, mīdijas, tāpat kā daudzi bezmugurkaulnieki, var būt izturīgākas pret stresa izraisītiem audu bojājumiem, tādējādi ierobežojot ccfDNS izdalīšanos to hemolimfā [70, 71].
Līdz šim ūdens ekosistēmu bioloģiskās daudzveidības DNS analīze galvenokārt ir koncentrējusies uz vides DNS (eDNS) metabarkodēšanu. Tomēr šī metode parasti ir ierobežota bioloģiskās daudzveidības analīzē, ja tiek izmantoti primeri. Shotgun sekvencēšanas izmantošana apiet PCR ierobežojumus un primeru komplektu neobjektīvo atlasi. Tādējādi savā ziņā mūsu metode ir tuvāka nesen izmantotajai augstas caurlaidības eDNA Shotgun sekvencēšanas metodei, kas spēj tieši sekvencēt fragmentētu DNS un analizēt gandrīz visus organismus [72, 73]. Tomēr pastāv vairākas fundamentālas problēmas, kas atšķir LB no standarta eDNS metodēm. Protams, galvenā atšķirība starp eDNS un LB ir dabisko filtrējošo saimnieku izmantošana. Ir ziņots par jūras sugu, piemēram, sūkļu un gliemeņu (Dresseina spp.), izmantošanu kā dabisku filtru eDNS pētīšanai [74, 75]. Tomēr Dreissena pētījumā tika izmantotas audu biopsijas, no kurām tika ekstrahēta DNS. ccfDNS analīzei no LB nav nepieciešama audu biopsija, specializēts un dažreiz dārgs aprīkojums un loģistika, kas saistīta ar eDNS vai audu biopsiju. Patiesībā mēs nesen ziņojām, ka ccfDNS no LB var uzglabāt un analizēt ar FTA atbalstu, neuzturot aukstuma ķēdi, kas ir liels izaicinājums pētījumiem attālos apgabalos [76]. Arī ccfDNS ekstrakcija no šķidrajām biopsijām ir vienkārša un nodrošina augstas kvalitātes DNS sekvencēšanai ar pistoles metodi un PCR analīzei. Tā ir liela priekšrocība, ņemot vērā dažus tehniskos ierobežojumus, kas saistīti ar eDNS analīzi [77]. Paraugu ņemšanas metodes vienkāršība un zemās izmaksas ir īpaši piemērotas arī ilgtermiņa uzraudzības programmām. Papildus augstajai filtrēšanas spējai, vēl viena labi zināma gliemeņu īpašība ir to gļotu ķīmiskais mukopolisaharīdu sastāvs, kas veicina vīrusu absorbciju [78, 79]. Tas padara gliemenes par ideālu dabisko filtru bioloģiskās daudzveidības un klimata pārmaiņu ietekmes raksturošanai noteiktā ūdens ekosistēmā. Lai gan no saimnieka iegūto DNS fragmentu klātbūtni var uzskatīt par metodes ierobežojumu salīdzinājumā ar eDNS, izmaksas, kas saistītas ar šādas dabīgas ccfDNS iegūšanu salīdzinājumā ar eDNS, ir vienlaikus saprotamas, ņemot vērā milzīgo informācijas apjomu, kas pieejams veselības pētījumiem. Tas ietver vīrusu sekvenču klātbūtni, kas integrētas saimnieka genomā. Tas ir īpaši svarīgi gliemenēm, ņemot vērā horizontāli pārnesto leikēmisko retrovīrusu klātbūtni gliemenēs [80, 81]. Vēl viena LB priekšrocība salīdzinājumā ar eDNS ir tā, ka tā izmanto cirkulējošo asins šūnu fagocītu aktivitāti hemolimfā, kas absorbē mikroorganismus (un to genomus). Fagocitoze ir galvenā asins šūnu funkcija gliemenēs [82]. Visbeidzot, metode izmanto gliemeņu augsto filtrēšanas spēju (vidēji 1,5 l/h jūras ūdens) un divu dienu cirkulāciju, kas palielina dažādu jūras ūdens slāņu sajaukšanos, ļaujot uztvert heterologu eDNS. [83, 84]. Tādējādi gliemeņu ccfDNS analīze ir interesanta joma, ņemot vērā gliemeņu ietekmi uz uzturvērtību, ekonomiku un vidi. Līdzīgi kā no cilvēkiem savāktā LB analīze, šī metode paver iespēju izmērīt ģenētiskās un epigenetiskās izmaiņas saimnieka DNS, reaģējot uz eksogēnām vielām. Piemēram, var paredzēt trešās paaudzes sekvencēšanas tehnoloģijas, lai veiktu genoma mēroga metilēšanas analīzi dabiskā ccfDNS, izmantojot nanoporu sekvencēšanu. Šo procesu atvieglo fakts, ka gliemeņu ccfDNS fragmentu garums ir ideāli saderīgs ar garas lasīšanas sekvencēšanas platformām, kas ļauj veikt genoma mēroga DNS metilēšanas analīzi no vienas sekvencēšanas reizes bez nepieciešamības veikt ķīmiskas transformācijas.85,86] Šī ir interesanta iespēja, jo ir pierādīts, ka DNS metilēšanas modeļi atspoguļo reakciju uz vides stresu un saglabājas daudzas paaudzes. Tāpēc tā var sniegt vērtīgu ieskatu pamatā esošajos mehānismos, kas regulē reakciju pēc klimata pārmaiņu vai piesārņotāju iedarbības [87]. Tomēr LB izmantošana nav bez ierobežojumiem. Lieki piebilst, ka tas prasa indikatorsugu klātbūtni ekosistēmā. Kā minēts iepriekš, LB izmantošanai, lai novērtētu dotās ekosistēmas bioloģisko daudzveidību, ir nepieciešams arī stingrs bioinformātikas process, kas ņem vērā DNS fragmentu klātbūtni no avota. Vēl viena būtiska problēma ir references genomu pieejamība jūras sugām. Cerams, ka tādas iniciatīvas kā Jūras zīdītāju genomu projekts un nesen izveidotais Fish10k projekts [88] nākotnē atvieglos šādu analīzi. LB koncepcijas piemērošana jūras filtrējošiem organismiem ir saderīga arī ar jaunākajiem sasniegumiem sekvencēšanas tehnoloģijā, padarot to labi piemērotu daudzomu biomarķieru izstrādei, lai sniegtu svarīgu informāciju par jūras dzīvotņu veselību, reaģējot uz vides stresu.
Genoma sekvencēšanas dati ir deponēti NCBI secības lasīšanas arhīvā https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 sadaļā Bioprojects SRR8924808.
Brierley AS, Kingsford MJ Klimata pārmaiņu ietekme uz jūras dzīvību un ekosistēmām. Cole Biology. 2009; 19: P602–P614.
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Almpanidou V, Bevilacqua S u.c. Apsveriet klimata pārmaiņu un citu vietējo stresa faktoru kopējo ietekmi uz jūras vidi. Vispārīgā zinātniskā vide. 2021;755:142564.
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P u.c. ). Pirmā marta zinātne. 2020; 7:48.
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. Samazināta karstuma tolerance atkārtota karstuma stresa apstākļos izskaidro zilo mīdiju augsto vasaras mirstību. Zinātniskais ziņojums 2019; 9:17498.
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER u.c. Jaunākās izmaiņas dzīvnieku nāves biežumā, cēloņos un apjomā. Proc Natl Acad Sci USA. 2015;112:1083-8.
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mughetti D, Cerruti F, Hosseini S u.c. Vairāki sugai nespecifiski patogēni var būt izraisījuši Pinna nobilis masveida mirstību. Dzīve. 2020; 10:238.
Bredlijs M., Koutss SJ., Dženkinss E., O'Hara T. M. Klimata pārmaiņu iespējamā ietekme uz Arktikas zoonozēm. Int J Circumpolar health. 2005; 64:468–77.
Beyer J., Greene NW, Brooks S., Allan IJ, Ruus A., Gomez T. et al. Zilās mīdijas (Mytilus edulis spp.) kā signālorganismi piekrastes piesārņojuma monitoringā: apskats. Mar Environ Res 2017; 130:338-65.
Siravegna G., Marsoni S., Siena S., Bardelli A. Šķidrās biopsijas integrācija vēža ārstēšanā. Nat Rev Clean Oncol. 2017; 14:531–48.
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C u.c. Šķidrās biopsijas nobriešana: ļauj audzēja DNS cirkulēt. Nat Rev Cancer. 2017;17:223–38.
Mandel P., Metais P. Nukleīnskābes cilvēka plazmā. Soc Biol meitasuzņēmumu sanāksmju protokoli. 1948; 142:241-3.
Bronkhorst AJ, Ungerer W, Holdenrieder S. Jauna loma bezšūnu DNS kā molekulāram marķierim vēža ārstēšanā. Biomolārās analīzes kvantitatīvā noteikšana. 2019;17:100087.
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS Šķidrās biopsijas ieviešana klīnikā – ieviešanas problēmas un nākotnes izaicinājumi. Nat Rev Clin Oncol. 2021; 18:297–312.
Lo YM, Corbetta N., Chamberlain PF, Rai W., Sargent IL, Redman CW un citi. Augļa DNS ir atrodama mātes plazmā un serumā. Lancet. 1997; 350:485-7.
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR. Grūtniecības gaitas un tās komplikāciju pētījums, izmantojot sieviešu asinīs cirkulējošo ekstracelulāro RNS grūtniecības laikā. Dopediatrics. 2020;8:605219.
Ollerich M., Sherwood K., Keown P., Schütz E., Beck J., Stegbauer J. u. c. Šķidrā biopsija: donora šūnu nesaturoša DNS tiek izmantota, lai atklātu allogēnu bojājumus nieres transplantātā. Nat Rev Nephrol. 2021; 17:591–603.
Juan FC, Lo YM Inovācijas pirmsdzemdību diagnostikā: mātes plazmas genoma sekvencēšana. Anna MD. 2016;67:419-32.
Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D u.c. Ātra patogēnu noteikšana ar nākamās paaudzes metagenomisko sekvencēšanu inficētos ķermeņa šķidrumos. Nat Medicine. 2021;27:115-24.