Paldies, ka apmeklējāt vietni Nature.com.Jūsu izmantotajai pārlūkprogrammas versijai ir ierobežots CSS atbalsts.Lai nodrošinātu vislabāko pieredzi, ieteicams izmantot atjauninātu pārlūkprogrammu (vai atspējot saderības režīmu pārlūkprogrammā Internet Explorer).Tikmēr, lai nodrošinātu nepārtrauktu atbalstu, mēs atveidosim vietni bez stiliem un JavaScript.
Putnu auglība ir atkarīga no to spējas spermas uzglabāšanas kanāliņos (SST) ilgstoši uzglabāt pietiekami daudz dzīvotspējīgas spermas.Precīzs mehānisms, ar kura palīdzību spermatozoīdi iekļūst SST, uzturas tajā un atstāj to, joprojām ir pretrunīgs.Šarkasi vistu spermai bija augsta aglutinācijas tendence, veidojot kustīgus pavedienu saišķus, kas satur daudzas šūnas.Sakarā ar grūtībām novērot spermatozoīdu kustīgumu un uzvedību necaurspīdīgā olvados, mēs izmantojām mikrofluidisku ierīci ar mikrokanālu šķērsgriezumu, kas ir līdzīgs spermatozoīdu šķērsgriezumam, lai pētītu spermatozoīdu aglutināciju un kustīgumu.Šajā pētījumā apskatīts, kā veidojas spermas saišķi, kā tie pārvietojas, un to iespējamā loma spermas dzīvesvietas paplašināšanā SST.Mēs pētījām spermas ātrumu un reoloģisko uzvedību, kad šķidruma plūsma tika ģenerēta mikrofluidiskā kanālā ar hidrostatisko spiedienu (plūsmas ātrums = 33 µm/s).Spermatozoīdi mēdz peldēt pret straumi (pozitīva reoloģija), un spermatozoīdu saišķa ātrums ir ievērojami samazināts, salīdzinot ar atsevišķiem spermatozoīdiem.Ir novērots, ka spermas saišķi pārvietojas pa spirāli un palielinās to garums un biezums, jo tiek piesaistīts vairāk atsevišķu spermatozoīdu. Tika novērots, ka spermas kūlīši tuvojas un pielīp pie mikrofluidisko kanālu sānu sienām, lai izvairītos no slaucīšanas ar šķidruma plūsmas ātrumu > 33 µm/s. Tika novērots, ka spermas kūlīši tuvojas un pielīp pie mikrofluidisko kanālu sānu sienām, lai izvairītos no slaucīšanas ar šķidruma plūsmas ātrumu > 33 µm/s. Было замечено, что пучки сперматозоидов приближаются и прилипают к боковым стенкам микрофлюикачх, икрофлюикачено, сметания со скоростью потока жидкости> 33 мкм / с. Ir novērots, ka spermas saišķi tuvojas un pielīp pie mikrofluidisko kanālu sānu sienām, lai izvairītos no to aizslaucīšanas ar šķidruma plūsmas ātrumu >33 µm/s.观察到精子束接近并粘附在微流体通道的侧壁上，以避免被流体流速> 流体流速> 33 态µm/s> 3333 µm/s 扫过. Было замечено, что пучки сперматозоидов приближаются и прилипают к боковым стенкам микрожидкастолго, тания потоком жидкости со скоростью > 33 мкм/с. Ir novērots, ka spermas kūlīši tuvojas mikrofluidiskā kanāla sānu sienām un pielīp pie tām, lai izvairītos no to aizplūšanas ar šķidruma plūsmu ar ātrumu >33 µm/s.Skenēšanas un transmisijas elektronu mikroskopija atklāja, ka spermas saišķus atbalstīja bagātīgs blīvs materiāls.Iegūtie dati parāda Šarkažu vistas spermatozoīdu unikālo mobilitāti, kā arī spermatozoīdu spēju aglutinēties un veidot kustīgus saišķus, kas veicina labāku izpratni par spermatozoīdu ilgtermiņa uzglabāšanu SMT.
Lai panāktu apaugļošanos cilvēkiem un lielākajai daļai dzīvnieku, spermai un olšūnām ir jānonāk apaugļošanas vietā īstajā laikā.Tāpēc pārošanai jānotiek pirms ovulācijas vai tās laikā.No otras puses, daži zīdītāji, piemēram, suņi, kā arī sugas, kas nav zīdītāji, piemēram, kukaiņi, zivis, rāpuļi un putni, uzglabā spermu savos reproduktīvajos orgānos ilgāku laiku, līdz to olas ir gatavas apaugļošanai (asinhronā apaugļošana 1 ).Putni spēj saglabāt spermatozoīdu dzīvotspēju, kas spēj apaugļot olas 2–10 nedēļas2.
Šī ir unikāla iezīme, kas atšķir putnus no citiem dzīvniekiem, jo ​​nodrošina lielu apaugļošanās iespējamību pēc vienas apsēklošanas vairākas nedēļas bez vienlaicīgas pārošanās un ovulācijas.Galvenais spermas uzglabāšanas orgāns, ko sauc par spermas uzglabāšanas kanāliņu (SST), atrodas iekšējās gļotādas krokās dzemdes vaginālā savienojuma vietā.Līdz šim mehānismi, ar kuriem spermatozoīdi nonāk spermas bankā, uzturas un iziet no tās, nav pilnībā izprotami.Pamatojoties uz iepriekšējiem pētījumiem, ir izvirzītas daudzas hipotēzes, taču neviena no tām nav apstiprināta.
Forman4 izvirzīja hipotēzi, ka spermatozoīdi saglabā savu uzturēšanos SST dobumā, nepārtraukti svārstoties pret šķidruma plūsmas virzienu caur proteīna kanāliem, kas atrodas uz SST epitēlija šūnām (reoloģija).ATP ir izsmelts sakarā ar pastāvīgu karogdziedzera aktivitāti, kas nepieciešama, lai spermu noturētu SST lūmenā, un kustība galu galā samazinās, līdz spermatozoīdi ar šķidruma plūsmu tiek izvadīti no spermas bankas un sāk jaunu ceļu lejup pa augšupejošu olvadu, lai apaugļotu spermu.Ola (Forman4).Šo spermas uzglabāšanas modeli atbalsta SST epitēlija šūnās esošo akvaporīnu 2, 3 un 9 noteikšana ar imūncitoķīmiju.Līdz šim trūkst pētījumu par vistas spermas reoloģiju un tās lomu SST uzglabāšanā, maksts spermas atlasē un spermas konkurencē.Cāļiem spermatozoīdi nokļūst makstī pēc dabiskās pārošanās, bet vairāk nekā 80% spermatozoīdu tiek izvadīti no maksts neilgi pēc pārošanās.Tas liek domāt, ka maksts ir galvenā putnu spermas atlases vieta.Turklāt ir ziņots, ka mazāk nekā 1% spermatozoīdu, kas apaugļoti makstī, nonāk SST2.Cāļu mākslīgās apsēklošanas gadījumā maksts spermatozoīdu skaitam, kas sasniedz SST, ir tendence palielināties 24 stundas pēc apsēklošanas.Līdz šim spermas atlases mehānisms šī procesa laikā ir neskaidrs, un spermatozoīdu kustībai var būt svarīga loma SST spermas uzņemšanā.Olvadu biezo un necaurspīdīgo sieniņu dēļ ir grūti tieši uzraudzīt spermas kustīgumu putnu olvados.Tāpēc mums trūkst pamatzināšanu par to, kā spermatozoīdi pāriet uz SST pēc apaugļošanas.
Reoloģija nesen tika atzīta par svarīgu faktoru, kas kontrolē spermas transportēšanu zīdītāju dzimumorgānos.Pamatojoties uz kustīgu spermatozoīdu spēju migrēt pretplūsmā, Zaferani et al8 izmantoja corra mikrofluidisko sistēmu, lai pasīvi izolētu kustīgos spermatozoīdus no aizbāztiem spermas paraugiem.Šis spermas šķirošanas veids ir būtisks medicīniskai neauglības ārstēšanai un klīniskiem pētījumiem, un tam ir priekšroka salīdzinājumā ar tradicionālajām metodēm, kas ir laikietilpīgas un darbietilpīgas un var apdraudēt spermas morfoloģiju un struktūras integritāti.Tomēr līdz šim nav veikti pētījumi par cāļu dzimumorgānu sekrēciju ietekmi uz spermas kustīgumu.
Neatkarīgi no mehānisma, kas uztur SST uzglabāto spermu, daudzi pētnieki ir novērojuši, ka cāļu 9., 10., paipalu 2 un tītaru 11 SST rezidenti spermatozoīdi aglutinējas viens pret otru, veidojot aglutinētus spermatozoīdus.Autori norāda, ka pastāv saikne starp šo aglutināciju un spermatozoīdu ilgstošu uzglabāšanu SST.
Tingari un Lake12 ziņoja par spēcīgu saistību starp spermatozoīdiem vistas spermu uztverošajā dziedzerī un apšaubīja, vai putnu spermatozoīdi aglutinējas tāpat kā zīdītāju spermatozoīdi.Viņi uzskata, ka dziļie savienojumi starp spermatozoīdiem asinsvadu zarnās var būt saistīti ar stresu, ko izraisa liela spermatozoīdu klātbūtne nelielā telpā.
Novērtējot spermatozoīdu uzvedību uz svaigiem piekārtiem stikla priekšmetstikliņiem, var novērot pārejošas aglutinācijas pazīmes, īpaši spermas pilienu malās.Tomēr aglutināciju bieži traucēja rotācijas darbība, kas saistīta ar nepārtrauktu kustību, kas izskaidro šīs parādības pārejošo raksturu.Pētnieki arī pamanīja, ka tad, kad šķīdinātājs tika pievienots spermai, parādījās iegareni "vītnei līdzīgi" šūnu agregāti.
Pirmie mēģinājumi atdarināt spermatozoīdu tika veikti, no karājas piliena noņemot tievu stiepli, kā rezultātā no spermas piliena izvirzījās iegarena spermai līdzīga pūslīša.Spermatozoīdi nekavējoties sarindojās paralēli vezikulā, bet visa vienība ātri pazuda 3D ierobežojuma dēļ.Tāpēc, lai pētītu spermatozoīdu aglutināciju, ir nepieciešams novērot spermatozoīdu kustīgumu un uzvedību tieši izolētās spermas uzglabāšanas kanāliņos, ko ir grūti sasniegt.Tāpēc ir nepieciešams izstrādāt instrumentu, kas atdarina spermatozoīdus, lai atbalstītu spermas kustīguma un aglutinācijas uzvedības pētījumus.Brilard et al13 ziņoja, ka vidējais spermas uzglabāšanas kanāliņu garums pieaugušiem cāļiem ir 400–600 µm, bet daži SST var būt pat 2000 µm gari.Mero un Ogasawara14 sadalīja sēklu dziedzerus palielinātos un nepalielinātos spermas uzglabāšanas kanāliņos, kuriem abiem bija vienāds garums (~ 500 µm) un kakla platums (~ 38 µm), bet kanāliņu vidējais lūmena diametrs bija 56, 6 un 56, 6 µm.., attiecīgi 11,2 μm.Pašreizējā pētījumā mēs izmantojām mikrofluidisku ierīci ar kanāla izmēru 200 µm × 20 µm (W × H), kuras šķērsgriezums ir nedaudz tuvs pastiprinātā SST šķērsgriezumam.Turklāt mēs pārbaudījām spermas kustīgumu un aglutinācijas uzvedību plūstošā šķidrumā, kas atbilst Formena hipotēzei, ka SST epitēlija šūnu radītais šķidrums notur spermu lūmenā pretstraumes (reoloģiskā) virzienā.
Šī pētījuma mērķis bija pārvarēt spermatozoīdu kustīguma novērošanas problēmas olvados un izvairīties no grūtībām pētīt spermatozoīdu reoloģiju un uzvedību dinamiskā vidē.Tika izmantota mikrofluidiska ierīce, kas rada hidrostatisko spiedienu, lai modelētu spermas kustīgumu vistas dzimumorgānos.
Kad mikrokanālu ierīcē tika ievietots atšķaidīta spermas parauga (1:40) piliens, varēja identificēt divu veidu spermas kustīgumu (izolētu spermu un saistīto spermu).Turklāt spermatozoīdiem bija tendence peldēt pret straumi (pozitīva reoloģija; video 1, 2). Lai gan spermatozoīdu saišķiem bija mazāks ātrums nekā vientuļajiem spermatozoīdiem (p < 0,001), tie palielināja to spermatozoīdu procentuālo daļu, kuriem bija pozitīva reotaksija (p < 0,001; 2. tabula). Lai gan spermatozoīdu saišķiem bija mazāks ātrums nekā vientuļajiem spermatozoīdiem (p < 0,001), tie palielināja to spermatozoīdu procentuālo daļu, kuriem bija pozitīva reotaksija (p < 0,001; 2. tabula). Хотя пучки сперматозоидов имели более низкую скорость, чем у одиночных сперматозоидов (p < 0,001, валончвидов) рматозоидов, демонстрирующих положительный реотаксис (p < 0,001; таблица 2). Lai gan spermatozoīdu saišķiem bija mazāks ātrums nekā atsevišķiem spermatozoīdiem (p < 0,001), tie palielināja to spermatozoīdu procentuālo daudzumu, kuriem bija pozitīva reotaksija (p < 0,001; 2. tabula).尽管精子束的速度低于孤独精子的速度（p < 0,001），但它们筐皞加了显羵逳加了显羵分比 (p < 0,001；表2）).尽管 精子束 的 速度 低于 孤独 的 速度 （p <0,001） ， 但 增加 束 昧 显羺 阁分比 (p <0,001 ； 2。。。。。。)）））））） Хотя скорость пучков сперматозоидов была ниже, чем у одиночных сперматозоидов (p < 0,001), они уверматозоидов они уверматозоидов они уверматозоидов в с положительной реологией (p < 0,001; таблица 2). Lai gan spermatozoīdu saišķu ātrums bija mazāks nekā atsevišķiem spermatozoīdiem (p < 0,001), tie palielināja spermatozoīdu ar pozitīvu reoloģiju procentuālo daudzumu (p < 0,001; 2. tabula).Tiek lēsts, ka pozitīvā reoloģija atsevišķiem spermatozoīdiem un saišķiem ir attiecīgi aptuveni 53% un 85%.
Novērots, ka šarkasi cāļu spermatozoīdi uzreiz pēc ejakulācijas veido lineārus saišķus, kas sastāv no desmitiem īpatņu.Šie saišķi laika gaitā palielinās garumā un biezumā un var palikt in vitro vairākas stundas, pirms tie izkliedējas (3. video).Šie pavedienu kūļi ir veidoti kā ehidnas spermatozoīdi, kas veidojas epididimijas galā.Ir konstatēts, ka Šarkaši vistu spermai ir augsta tendence aglutinēties un izveidot tīklveida saišķi mazāk nekā vienas minūtes laikā pēc savākšanas.Šīs sijas ir dinamiskas un spēj pieķerties jebkurām tuvumā esošajām sienām vai statiskiem objektiem.Lai gan spermas saišķi samazina spermas šūnu ātrumu, ir skaidrs, ka makroskopiski tie palielina to linearitāti.Saišķu garums mainās atkarībā no saišķos savākto spermatozoīdu skaita.Tika izolētas divas saišķa daļas: sākotnējā daļa, ieskaitot aglutinētās spermas brīvo galvu, un gala daļa, ieskaitot asti un visu spermas distālo galu.Izmantojot ātrgaitas kameru (950 kadri sekundē), saišķa sākotnējā daļā tika novērotas brīvas aglutinētu spermatozoīdu galvas, kas bija atbildīgas par saišķa kustību to svārstīgo kustību dēļ, atlikušās ar spirālveida kustību ievelkot saišķī (4. video).Tomēr garos saišķos ir novērots, ka dažas brīvas spermatozoīdu galviņas, kas pielipušas pie ķermeņa, un kušķa gala daļa darbojas kā lāpstiņas, kas palīdz virzīt kušķi.
Lēnā šķidruma plūsmā spermas kūlīši pārvietojas paralēli viens otram, tomēr tie sāk pārklāties un pielīp visam, kas ir nekustīgs, lai, palielinoties plūsmas ātrumam, tos neaizskalotu straume.Saiņi veidojas, kad spermas šūnu sauja tuvojas viena otrai, tās sāk kustēties sinhroni un aptīties viena ap otru, un tad pielīp pie lipīgas vielas.1. un 2. attēlā parādīts, kā spermatozoīdi tuvojas viens otram, veidojot savienojumu, kad astes apvij viena otru.
Pētnieki izmantoja hidrostatisko spiedienu, lai radītu šķidruma plūsmu mikrokanālā, lai pētītu spermas reoloģiju.Tika izmantots mikrokanāls ar izmēru 200 µm × 20 µm (W × H) un 3, 6 µm garumu.Izmantojiet mikrokanālus starp konteineriem ar šļircēm, kas piestiprinātas galos.Lai padarītu kanālus redzamākus, tika izmantota pārtikas krāsviela.
Piesieniet starpsavienojuma kabeļus un piederumus pie sienas.Video uzņemts ar fāzes kontrasta mikroskopu.Ar katru attēlu tiek parādīti fāzes kontrasta mikroskopijas un kartēšanas attēli.(A) Savienojums starp divām plūsmām pretojas plūsmai spirālveida kustības dēļ (sarkanā bultiņa).(B) Savienojums starp caurules saišķi un kanāla sienu (sarkanas bultiņas), tajā pašā laikā tie ir savienoti ar diviem citiem kūļiem (dzeltenas bultiņas).(C) Spermas saišķi mikrofluidiskajā kanālā sāk savienoties viens ar otru (sarkanas bultiņas), veidojot spermas saišķu tīklu.(D) Spermas saišķu tīkla veidošanās.
Kad mikrofluidiskajā ierīcē tika ievietots atšķaidītas spermas piliens un tika izveidota plūsma, tika novērots, ka spermas stars pārvietojas pretēji plūsmas virzienam.Saiņi cieši pieguļ mikrokanālu sieniņām, un brīvās galviņas saišķu sākotnējā daļā cieši pieguļ tām (5. video).Viņi arī pielīp pie jebkādām nekustīgām daļiņām savā ceļā, piemēram, atkritumiem, lai pretotos straumes aiznesšanai.Laika gaitā šie kūlīši kļūst par gariem pavedieniem, kas notver citus atsevišķus spermatozoīdus, un īsākus saišķus (6. video).Kad plūsma sāk palēnināties, garās spermas līnijas sāk veidot spermatozoīdu līniju tīklu (7. video; 2. attēls).
Pie liela plūsmas ātruma (V > 33 µm/s) vītņu spirālveida kustības tiek palielinātas, mēģinot noķert daudzus atsevišķus spermatozoīdus veidojošos saišķus, kas labāk pretojas plūsmas dreifējošajam spēkam. Pie liela plūsmas ātruma (V > 33 µm/s) vītņu spirālveida kustības tiek palielinātas, mēģinot noķert daudzus atsevišķus spermatozoīdus veidojošos saišķus, kas labāk pretojas plūsmas dreifējošajam spēkam. При высокой скорости потока (V > 33 мкм/с) спиралевидные движения нитей усиливаются, поскольку они пытепныйтся х сперматозоидов, образующих пучки, которые лучше противостоят дрейфующей силе потока. Pie lieliem plūsmas ātrumiem (V > 33 µm/s) dzīslu spirālveida kustības palielinās, cenšoties noķert daudzus atsevišķus spermatozoīdus, veidojot saišķus, kas spēj labāk pretoties plūsmas dreifējošajam spēkam.在高流速(V > 33 µm/s) 时，螺纹的螺旋运动增加，以试图捕捉仭囐多形成束的好地抵抗流动的漂移力.在 高 流速 (v> 33 µm/s) 时 ， 的 螺旋 运动 增加 ， 以 试图 训 多 形 成 束 束更 地 抵抗 的 漂移力。。。。。。。。。. При высоких скоростях потока (V > 33 мкм/с) спиральное движение нитей увеличивается в попытке захетатьстмононыте зоидов, образующих пучки, чтобы лучше сопротивляться силам дрейфа потока. Pie lieliem plūsmas ātrumiem (V > 33 µm/s) palielinās pavedienu spirālveida kustība, mēģinot notvert daudzus atsevišķus spermatozoīdus, kas veido kūlīši, lai labāk pretotos plūsmas novirzes spēkiem.Viņi arī mēģināja piestiprināt mikrokanālus sānu sienām.
Izmantojot gaismas mikroskopiju (LM), spermas saišķi tika identificēti kā spermas galviņu kopas un saritinātas astes.Spermas kūļi ar dažādiem agregātiem ir identificēti arī kā savītas galviņas un karogu agregāti, vairākas sapludinātas spermas astes, spermas galviņas, kas piestiprinātas astei, un spermas galviņas ar saliektiem kodoliem kā vairāki sapludināti kodoli.transmisijas elektronu mikroskopija (TEM).Skenējošā elektronu mikroskopija (SEM) parādīja, ka spermatozoīdu saišķi bija apvilkti spermatozoīdu galviņu agregāti, un spermas agregātiem bija pievienots iesaiņotu astes tīkls.
Spermatozoīdu morfoloģija un ultrastruktūra, spermatozoīdu saišķu veidošanās tika pētīta, izmantojot gaismas mikroskopiju (pusgriezums), skenējošo elektronu mikroskopiju (SEM) un transmisijas elektronu mikroskopiju (TEM), spermas uztriepes iekrāsoja ar akridīna oranžu un izmeklēja ar epifluorescences mikroskopiju.
Spermas uztriepes krāsošana ar akridīna apelsīnu (3.B att.) parādīja, ka spermatozoīdu galviņas bija salipušas kopā un pārklātas ar sekrēcijas materiālu, kas izraisīja lielu pušķu veidošanos (3.D att.).Spermas kūlīši sastāvēja no spermatozoīdu agregātiem ar pievienotu astes tīklu (4.A-C att.).Spermas saišķi sastāv no daudzu kopā salipušām spermatozoīdu astēm (4.D att.).Noslēpumi (4E, F att.) aptvēra spermatozoīdu saišķu galvas.
Spermatozoīdu saišķa veidošanās Izmantojot fāzes kontrasta mikroskopiju un spermas uztriepes, kas iekrāsotas ar akridīna oranžu, tika parādīts, ka spermatozoīdu galviņas salīp kopā.(A) Agrīna spermas saišķa veidošanās sākas ar spermu (balts aplis) un trim spermatozoīdiem (dzeltens aplis), un spirāle sākas no astes un beidzas ar galvu.(B) Spermas uztriepes, kas iekrāsota ar akridīna oranžu, mikrofotogrāfiju, kurā redzamas pielipušās spermas galviņas (bultiņas).Izlāde aptver galvu(-es).Palielinājums × 1000. (C) Liela stara attīstīšana, kas tiek transportēta ar plūsmu mikrofluidiskā kanālā (izmantojot ātrgaitas kameru ar ātrumu 950 kadri sekundē).(D) Spermas uztriepes mikrogrāfs, kas iekrāsots ar akridīna apelsīnu, kurā redzami lieli saišķi (bultiņas).Palielinājums: × 200.
Spermas stara skenējošā elektronu mikrogrāfija un spermas uztriepe, kas iekrāsota ar akridīna oranžu.(A, B, D, E) ir spermatozoīdu digitālie krāsu skenēšanas elektronu mikrogrāfi, un C un F ir ar akridīna oranžu krāsu krāsotu spermas uztriepes mikrogrāfi, kas parāda vairāku spermatozoīdu piestiprināšanos, kas aptver astes tīklu.(AC) Spermas agregāti ir parādīti kā pievienotu astes tīkls (bultiņas).(D) Vairāku spermatozoīdu (ar lipīgu vielu, rozā kontūru, bultiņu) adhēzija ap asti.(E un F) Spermas galviņu agregāti (rādītāji), kas pārklāti ar adhezīvu materiālu (rādītāji).Spermatozoīdi veidoja saišķus ar vairākām virpuļveida struktūrām (F).(C) × 400 un (F) × 200 palielinājumi.
Izmantojot transmisijas elektronu mikroskopiju, mēs atklājām, ka spermatozoīdu kūlīšiem bija piestiprinātas astes (6.A, C att.), astēm piestiprinātas galviņas (6.B att.) vai astēm piestiprinātas galvas (6.D att.).Spermatozoīdu galviņas kūlī ir izliektas, un tās atrodas divās daļās kodola apgabalos (6.D att.).Griezuma saišķī spermatozoīdiem bija savīta galva ar diviem kodola apgabaliem un vairākiem karogiem (5.A att.).
Digitālā krāsainā elektronu mikrogrāfija, kurā redzamas savienojošās astes spermas saišķī un aglutinējošais materiāls, kas savieno spermas galviņas.(A) Piestiprināta aste lielam skaitam spermatozoīdu.Ievērojiet, kā aste izskatās gan portreta (bultiņa), gan ainavas (bultiņa) projekcijās.(B) Spermas galva (bultiņa) ir savienota ar asti (bultiņa).(C) Ir pievienotas vairākas spermas astes (bultiņas).(D) Aglutinācijas materiāls (AS, zils) savieno četras spermas galvas (violeta).
Skenējošā elektronu mikroskopija tika izmantota, lai noteiktu spermatozoīdu galviņas spermatozoīdu saišķos, kas pārklāti ar sekrētiem vai membrānām (6.B attēls), norādot, ka spermas saišķi bija noenkuroti ar ārpusšūnu materiālu.Aglutinētais materiāls tika koncentrēts spermas galviņā (medūzas galviņai līdzīgs komplekts; 5.B att.) un paplašināts distāli, fluorescences mikroskopijā iegūstot izcili dzeltenu izskatu, krāsojot ar akridīna oranžu krāsu (6.C att.).Šī viela ir skaidri redzama skenējošā mikroskopā un tiek uzskatīta par saistvielu.Pusplānās sekcijas (5. C att.) un spermas uztriepes, kas iekrāsotas ar akridīna apelsīnu, parādīja spermatozoīdu saišķus ar blīvi saspiestām galviņām un krokainajām astēm (5. D att.).
Dažādas mikrofotogrāfijas, kas parāda spermatozoīdu galviņu un salocītu astes agregāciju, izmantojot dažādas metodes.(A) Spermas saišķa šķērsgriezuma digitālā krāsu pārraides elektronu mikrogrāfija, kurā redzama satīta spermas galva ar divdaļīgu kodolu (zilu) un vairākām karogu daļām (zaļa).(B) Digitālais krāsu skenēšanas elektronu mikrogrāfs, kurā redzams medūzai līdzīgu spermatozoīdu galviņu kopums (bultiņas), kas šķiet aizsegtas.(C) Daļēji plāna sadaļa, kurā redzamas apkopotas spermas galviņas (bultiņas) un krokainas astes (bultiņas).(D) Ar akridīna oranžu nokrāsotas spermas uztriepes mikrogrāfs, kurā redzami spermatozoīdu galviņu agregāti (bultiņas) un krokojušās pielipušās astes (bultiņas).Ņemiet vērā, ka spermatozoīda galvu pārklāj lipīga viela (S).(D) × 1000 palielinājums.
Izmantojot transmisijas elektronu mikroskopiju (7.A att.), tika arī konstatēts, ka spermatozoīdu galviņas bija savītas un kodoliem bija spirālveida forma, ko apstiprina spermas uztriepes, kas iekrāsotas ar akridīna oranžu un pārbaudītas, izmantojot fluorescences mikroskopiju (7.B att.).
(A) digitālais krāsu pārraides elektronu mikrogrāfs un (B) akridīna oranžā krāsā iekrāsota spermas uztriepe, kurā redzamas satītas galvas un spermas galviņu un astes piestiprināšana (bultiņas).(B) × 1000 palielinājums.
Interesants atklājums ir tāds, ka Šarkazi spermatozoīdi agregējas, veidojot kustīgus pavedienveida saišķus.Šo saišķu īpašības ļauj mums saprast to iespējamo lomu spermatozoīdu uzsūkšanā un uzglabāšanā SST.
Pēc pārošanās spermatozoīdi nonāk makstī un tiek pakļauti intensīvam atlases procesam, kā rezultātā SST15,16 nonāk tikai ierobežots spermatozoīdu skaits.Līdz šim mehānismi, ar kuriem spermatozoīdi iekļūst SST un iziet no tā, nav skaidri.Mājputniem spermatozoīdus SST uzglabā ilgāku laiku no 2 līdz 10 nedēļām atkarībā no sugas6.Joprojām pastāv strīdi par spermas stāvokli uzglabāšanas laikā SST.Vai viņi ir kustībā vai miera stāvoklī?Citiem vārdiem sakot, kā spermas šūnas tik ilgi saglabā savu pozīciju SST?
Forman4 ierosināja, ka SST uzturēšanos un izmešanu var izskaidrot ar spermas kustīgumu.Autori izvirza hipotēzi, ka spermatozoīdi saglabā savu pozīciju, peldot pret šķidruma plūsmu, ko rada SST epitēlijs, un ka spermatozoīdi tiek izmesti no SST, kad to ātrums nokrītas zem punkta, kurā tie sāk kustēties atpakaļ enerģijas trūkuma dēļ.Zaniboni5 apstiprināja akvaporīnu 2, 3 un 9 klātbūtni SST epitēlija šūnu apikālajā daļā, kas var netieši atbalstīt Formena spermas uzglabāšanas modeli.Pašreizējā pētījumā mēs atklājām, ka gandrīz pusei Šarkaši spermatozoīdu plūstošajā šķidrumā ir pozitīva reoloģija un ka aglutinētie spermatozoīdu saišķi palielina spermatozoīdu skaitu, kuriem ir pozitīva reoloģija, lai gan aglutinācija tos palēnina.Nav pilnībā izprotams, kā spermas šūnas pārvietojas pa putna olvadu uz apaugļošanas vietu.Zīdītājiem folikulārais šķidrums ķīmiski piesaista spermatozoīdus.Tomēr tiek uzskatīts, ka ķīmijatraktanti virza spermatozoīdus tuvoties lieliem attālumiem7.Tāpēc par spermas transportēšanu ir atbildīgi citi mehānismi.Ir ziņots, ka spermas spēja orientēties un plūst pret olvadu šķidrumu, kas izdalās pēc pārošanās, ir galvenais faktors, kas mērķtiecīgi ietekmē pelēm.Pārkers 17 ierosināja, ka spermatozoīdi šķērso olšūnas, peldot pret ciliāru straumi putniem un rāpuļiem.Lai gan tas nav eksperimentāli pierādīts ar putniem, Adolphi18 bija pirmais, kas atklāja, ka putnu sperma sniedz pozitīvus rezultātus, ja ar filtrpapīra sloksni starp pārklājošo stikliņu un priekšmetstikliņu izveido plānu šķidruma slāni.Reoloģija.Hino un Yanagimachi [19] ievietoja peles olnīcu-olvadu-dzemdes kompleksu perfūzijas gredzenā un injicēja 1 µl tintes zemesšaurumā, lai vizualizētu šķidruma plūsmu olvados.Viņi pamanīja ļoti aktīvu kontrakcijas un relaksācijas kustību olvados, kurā visas tintes bumbiņas vienmērīgi virzījās uz olvada ampulu.Autori uzsver olvadu šķidruma plūsmas nozīmi no apakšējām uz augšējiem olvados spermas pacelšanai un apaugļošanai.Brillard20 ziņoja, ka cāļiem un tītariem spermatozoīdi migrē, aktīvi pārvietojoties no maksts ieejas, kur tie tiek uzglabāti, uz dzemdes un maksts savienojumu, kur tie tiek uzglabāti.Tomēr šī kustība starp dzemdes vaginālo savienojumu un infundibulumu nav nepieciešama, jo spermatozoīdi tiek transportēti ar pasīvu pārvietošanu.Zinot šos iepriekšējos ieteikumus un pašreizējā pētījumā iegūtos rezultātus, var pieņemt, ka spermatozoīdu spēja pārvietoties augšup pa straumi (reoloģija) ir viena no īpašībām, uz kurām balstās atlases process.Tas nosaka spermatozoīdu pārvietošanos caur maksts un to iekļūšanu CCT uzglabāšanai.Kā ierosināja Forman4, tas var arī atvieglot spermatozoīdu iekļūšanu SST un tā dzīvotnē uz noteiktu laiku un pēc tam izkļūšanu, kad to ātrums sāk palēnināties.
No otras puses, Matsuzaki un Sasanami 21 ierosināja, ka putnu spermatozoīdu kustīgums mainās no miera stāvokļa uz kustīgumu vīriešu un sieviešu reproduktīvajos traktos.Ir ierosināta SST rezidentu spermas kustīguma kavēšana, lai izskaidrotu spermas ilgo uzglabāšanas laiku un pēc tam atjaunošanos pēc SST aiziešanas.Hipoksiskos apstākļos Matsuzaki et al.1 ziņoja par augstu laktāta veidošanos un izdalīšanos SST, kas var novest pie rezidējošās spermas kustīguma kavēšanas.Šajā gadījumā spermas reoloģijas nozīme izpaužas spermatozoīdu atlasē un uzsūkšanā, nevis to uzglabāšanā.
Spermas aglutinācijas modelis tiek uzskatīts par ticamu skaidrojumu spermas ilgstošajam uzglabāšanas periodam SST, jo tas ir izplatīts spermas aiztures modelis mājputniem 2, 22, 23.Baksts et al.2 novēroja, ka lielākā daļa spermatozoīdu pielipa viens otram, veidojot fascikulārus agregātus, un paipalu CCM reti tika konstatēti atsevišķi spermatozoīdi.No otras puses, Wen et al.24 novēroja vairāk izkliedētu spermatozoīdu un mazāk spermatozoīdu pušķu SST lūmenā cāļiem.Pamatojoties uz šiem novērojumiem, var pieņemt, ka spermas aglutinācijas tendence atšķiras starp putniem un starp spermatozoīdiem vienā un tajā pašā ejakulātā.Turklāt Van Krey et al.9 ierosināja, ka nejauša aglutinēto spermatozoīdu disociācija ir atbildīga par pakāpenisku spermatozoīdu iekļūšanu olvadu lūmenā.Saskaņā ar šo hipotēzi vispirms no SST ir jāizraida spermatozoīdi ar zemāku aglutinācijas spēju.Šajā kontekstā spermatozoīdu spēja aglutinēties var būt faktors, kas ietekmē netīro putnu spermas konkurences iznākumu.Turklāt, jo ilgāk aglutinētie spermatozoīdi disociējas, jo ilgāk tiek saglabāta auglība.
Lai gan vairākos pētījumos ir novērota spermatozoīdu agregācija un agregācija saišķos 2, 22, 24, tie nav detalizēti aprakstīti to kinemātiskā novērojuma sarežģītības dēļ SST ietvaros.Ir veikti vairāki mēģinājumi pētīt spermas aglutināciju in vitro.Plaša, bet pārejoša agregācija tika novērota, kad plānā stieple tika noņemta no karājošā sēklu piliena.Tas noved pie tā, ka no piliena izvirzās iegarens burbulis, kas imitē sēklu dziedzeri.3D ierobežojumu un īso pilienu žāvēšanas laiku dēļ viss bloks ātri nonāca nolaists9.Pašreizējā pētījumā, izmantojot Sharkashi cāļus un mikrofluidiskās mikroshēmas, mēs varējām aprakstīt, kā šie kušķi veidojas un kā tie pārvietojas.Spermas kūļi veidojās tūlīt pēc spermas savākšanas, un tika konstatēts, ka tie pārvietojas pa spirāli, parādot pozitīvu reoloģiju, kad tie atrodas plūsmā.Turklāt, makroskopiski aplūkojot, ir novērots, ka spermatozoīdu saišķi palielina kustīguma linearitāti salīdzinājumā ar izolētiem spermatozoīdiem.Tas liecina, ka spermas aglutinācija var notikt pirms SST iespiešanās un ka spermas ražošana neaprobežojas tikai ar nelielu apgabalu stresa dēļ, kā tika ieteikts iepriekš (Tingari un Lake12).Kušķu veidošanās laikā spermatozoīdi peld sinhroni, līdz tie veido savienojumu, tad to astes apvijas viena ap otru un spermatozoīda galva paliek brīva, bet spermatozoīda aste un distālā daļa salīp kopā ar lipīgu vielu.Tāpēc brīvā saites galva ir atbildīga par kustību, velkot pārējo saiti.Spermas saišķu skenējošā elektronu mikroskopija parādīja pievienotās spermatozoīdu galviņas, kas pārklātas ar daudz lipīga materiāla, kas liecina, ka spermas galviņas bija piestiprinātas atpūtas saišķos, kas varēja notikt pēc uzglabāšanas vietas (SST) sasniegšanas.
Kad spermas uztriepe ir iekrāsota ar akridīna apelsīnu, fluorescējošā mikroskopā ap spermas šūnām var redzēt ārpusšūnu adhezīvu materiālu.Šī viela ļauj spermatozoīdu kūlīšiem pieķerties un pieķerties apkārtējām virsmām vai daļiņām, lai tie nenokļūtu ar apkārtējo plūsmu.Tādējādi mūsu novērojumi parāda spermatozoīdu adhēzijas lomu mobilo saišķu veidā.Viņu spēja peldēt pret straumi un pieķerties tuvējām virsmām ļauj spermai ilgāk palikt SST.
Rothschild25 izmantoja hemocitometrijas kameru, lai pētītu liellopu spermas peldošo sadalījumu suspensijas pilē, fotografējot ar kameru gan ar vertikālo, gan horizontālo mikroskopa optisko asi.Rezultāti parādīja, ka spermatozoīdi tika piesaistīti kameras virsmai.Autori norāda, ka starp spermu un virsmu var būt hidrodinamiska mijiedarbība.Ņemot to vērā, kā arī Šarkaši cāļu spermas spēju veidot lipīgus pušķus, var palielināties iespējamība, ka sperma pieķersies SST sieniņai un tiks uzglabāta ilgu laiku.
Bccetti un Afzeliu26 ziņoja, ka spermas glikokalikss ir nepieciešams gametu atpazīšanai un aglutinācijai.Forman10 novēroja, ka α-glikozīdu saišu hidrolīze glikoproteīna-glikolipīdu pārklājumos, apstrādājot putnu spermu ar neiraminidāzi, izraisīja auglības samazināšanos, neietekmējot spermas kustīgumu.Autori norāda, ka neiraminidāzes ietekme uz glikokaliksu pasliktina spermas sekvestrāciju dzemdes un maksts savienojumā, tādējādi samazinot auglību.Viņu novērojumi nevar ignorēt iespēju, ka ārstēšana ar neiraminidāzi var samazināt spermas un olšūnu atpazīšanu.Formans un Engels10 atklāja, ka auglība tika samazināta, kad vistas tika apsēklotas intravagināli ar spermu, kas apstrādāta ar neiraminidāzi.Tomēr IVF ar neiraminidāzi apstrādātu spermu neietekmēja auglību salīdzinājumā ar kontroles cāļiem.Autori secināja, ka izmaiņas glikoproteīna-glikolipīdu pārklājumā ap spermas membrānu samazināja spermas spēju apaugļot, pasliktinot spermas sekvestrāciju dzemdes un maksts savienojuma vietā, kas savukārt palielināja spermas zudumu dzemdes un maksts savienojuma ātruma dēļ, bet neietekmē spermas un olšūnu atpazīšanu.
Tītariem Baksts un Bauchans 11 atrada mazus pūslīšus un membrānas fragmentus SST lūmenā un novēroja, ka dažas no šīm granulām bija saplūdušas ar spermas membrānu.Autori norāda, ka šīs attiecības var veicināt spermatozoīdu ilgstošu uzglabāšanu SST.Tomēr pētnieki nenorādīja šo daļiņu avotu, neatkarīgi no tā, vai tās izdalās CCT epitēlija šūnas, ko ražo un izdala vīriešu reproduktīvā sistēma, vai arī to ražo pati sperma.Arī šīs daļiņas ir atbildīgas par aglutināciju.Grützner et al27 ziņoja, ka epididimālās epitēlija šūnas ražo un izdala specifisku proteīnu, kas nepieciešams vienporu sēklas trakta veidošanai.Autori arī ziņo, ka šo saišķu izkliede ir atkarīga no epididimālo proteīnu mijiedarbības.Niksons et al28 atklāja, ka adnexa izdala proteīnu, skābo ar cisteīnu bagāto osteonektīnu;SPARC ir iesaistīts spermatozoīdu kušķu veidošanā īsknābju ehidnām un pīļknābjiem.Šo staru izkliede ir saistīta ar šī proteīna zudumu.
Pašreizējā pētījumā ultrastrukturālā analīze, izmantojot elektronu mikroskopiju, parādīja, ka spermatozoīdi pieķērās lielam blīva materiāla daudzumam.Tiek uzskatīts, ka šīs vielas ir atbildīgas par aglutināciju, kas kondensējas starp un ap tām, bet zemākā koncentrācijā astes reģionā.Mēs pieņemam, ka šī aglutinējošā viela kopā ar spermu tiek izvadīta no vīriešu reproduktīvās sistēmas (epididimijas vai vas deferens), jo mēs bieži novērojam, ka ejakulācijas laikā sperma atdalās no limfas un sēklu plazmas.Ir ziņots, ka, putnu spermatozoīdiem izejot cauri epididīmam un asinsvadiem, tajos notiek ar nobriešanu saistītas izmaiņas, kas atbalsta to spēju saistīt olbaltumvielas un iegūt ar lemmu saistītus glikoproteīnus plazmā.Šo proteīnu noturība uz SST rezidentu spermas membrānām liecina, ka šie proteīni var ietekmēt spermas membrānas stabilitātes iegūšanu 30 un noteikt to auglību 31 .Ahammad et al32 ziņoja, ka spermatozoīdi, kas iegūti no dažādām vīriešu reproduktīvās sistēmas daļām (no sēkliniekiem līdz distālajiem asinsvadu zarnām), uzrādīja pakāpenisku dzīvotspējas pieaugumu šķidruma uzglabāšanas apstākļos neatkarīgi no uzglabāšanas temperatūras, un cāļu dzīvotspēja palielinās arī olvados pēc mākslīgās apsēklošanas.
Šarkaši cāļu spermas pušķiem ir atšķirīgas īpašības un funkcijas nekā citām sugām, piemēram, ehidnām, pīļknām, meža pelēm, briežu žurkām un jūrascūciņām.Šarkasi cāļiem spermatozoīdu saišķu veidošanās samazināja peldēšanas ātrumu, salīdzinot ar atsevišķiem spermatozoīdiem.Tomēr šie saišķi palielināja reoloģiski pozitīvo spermatozoīdu procentuālo daudzumu un palielināja spermatozoīdu spēju stabilizēties dinamiskā vidē.Tādējādi mūsu rezultāti apstiprina iepriekšējo ieteikumu, ka spermas aglutinācija SST ir saistīta ar ilgstošu spermas uzglabāšanu.Mēs arī izvirzām hipotēzi, ka spermas tieksme veidot kušķus var kontrolēt spermas zuduma ātrumu SST, kas var mainīt spermas konkurences iznākumu.Saskaņā ar šo pieņēmumu spermatozoīdi ar zemu aglutinācijas spēju vispirms izdala SST, savukārt spermatozoīdi ar augstu aglutinācijas spēju rada lielāko daļu pēcnācēju.Vienporu spermatozoīdu saišķu veidošanās ir labvēlīga un ietekmē vecāku un bērnu attiecību, bet izmanto citu mehānismu.Ehidnām un pīļknābjiem spermatozoīdi ir izvietoti paralēli viens otram, lai palielinātu stara virzīšanas ātrumu.Ehidnu kūļi pārvietojas apmēram trīs reizes ātrāk nekā atsevišķi spermatozoīdi.Tiek uzskatīts, ka šādu spermas saišķu veidošanās ehidnās ir evolucionāra adaptācija, lai saglabātu dominējošo stāvokli, jo mātītes ir izlaidīgas un parasti pārojas ar vairākiem tēviņiem.Tāpēc spermatozoīdi no dažādiem ejakulātiem sīvi sacenšas par olšūnas apaugļošanu.
Sharkasi cāļu aglutinētos spermatozoīdus ir viegli vizualizēt, izmantojot fāzes kontrasta mikroskopiju, kas tiek uzskatīta par izdevīgu, jo ļauj viegli izpētīt spermatozoīdu uzvedību in vitro.Mehānisms, ar kuru spermatozoīdu pušķu veidošanās veicina Sharkasi cāļu vairošanos, arī atšķiras no tā, kas novērots dažiem placentas zīdītājiem, kas pārstāv spermas uzvedību, piemēram, meža pelēm, kur daži spermatozoīdi sasniedz olas, palīdzot citiem radniecīgiem indivīdiem sasniegt un sabojāt savas olas.lai pierādītu sevi.altruistiska uzvedība.Pašapaugļošanās 34. Vēl viens spermatozoīdu kooperatīvās uzvedības piemērs tika atrasts briežu pelēm, kur spermatozoīdi spēja identificēt un apvienoties ar ģenētiski vistuvākajiem spermatozoīdiem un veidot kooperatīvas grupas, lai palielinātu to ātrumu salīdzinājumā ar nesaistītiem spermatozoīdiem35.
Šajā pētījumā iegūtie rezultāti nav pretrunā ar Fomana teoriju par spermatozoīdu ilgstošu uzglabāšanu SWS.Pētnieki ziņo, ka spermas šūnas ilgstoši turpina kustēties epitēlija šūnu plūsmā, kas pārklāj SST, un pēc noteikta laika spermas šūnu enerģijas krājumi tiek izsmelti, kā rezultātā samazinās ātrums, kas ļauj izvadīt mazas molekulmasas vielas.spermatozoīdu enerģija ar šķidruma plūsmu no SST lūmena Olvada dobums.Pašreizējā pētījumā mēs novērojām, ka puse no viena spermatozoīda uzrādīja spēju peldēt pret plūstošiem šķidrumiem, un to saķere saišķī palielināja to spēju uzrādīt pozitīvu reoloģiju.Turklāt mūsu dati atbilst Matsuzaki et al.1, kurš ziņoja, ka palielināta laktāta sekrēcija SST var kavēt rezidentu spermas kustīgumu.Tomēr mūsu rezultāti apraksta spermatozoīdu kustīgo saišu veidošanos un to reoloģisko uzvedību dinamiskas vides klātbūtnē mikrokanālā, mēģinot noskaidrot to uzvedību SST.Turpmākie pētījumi var koncentrēties uz aglutinējošā līdzekļa ķīmiskā sastāva un izcelsmes noteikšanu, kas neapšaubāmi palīdzēs pētniekiem izstrādāt jaunus veidus, kā uzglabāt šķidru spermu un palielināt auglības ilgumu.
Kā spermas donori pētījumā tika atlasīti 15 30 nedēļas veci šarkasi tēviņi ar kailu kaklu (homozigots dominējošs; Na Na).Putni tika audzēti Ašitas universitātes Lauksaimniecības fakultātes pētnieciskajā putnu fermā, Ašitas gubernatorā, Ēģiptē.Putni tika izmitināti atsevišķos būros (30 x 40 x 40 cm), pakļauti gaismas programmai (16 stundas gaismas un 8 stundas tumsas) un baroti ar diētu, kas satur 160 g kopproteīna, 2800 kcal metabolizējamas enerģijas un 35 g kalcija katrā.5 grami pieejamā fosfora uz kilogramu diētas.
Saskaņā ar datiem 36, 37 sperma tika savākta no vīriešiem ar vēdera masāžu.Kopumā 3 dienu laikā no 15 vīriešiem tika savākti 45 spermas paraugi.Sperma (n = 15/dienā) tika nekavējoties atšķaidīta 1:1 (v:v) ar Belsville Poultry Semen Diluent, kas satur kālija difosfātu (1,27 g), mononātrija glutamāta monohidrātu (0,867 g), fruktozi (0,5 d) bezūdens nātrija sāls.acetāts (0,43 g), tris(hidroksimetil)aminometāns (0,195 g), kālija citrāta monohidrāts (0,064 g), kālija monofosfāts (0,065 g), magnija hlorīds (0,034 g) un H2O (100 ml), pH = 7, 5, osmolarity 3/33 m.Atšķaidītos spermas paraugus vispirms pārbaudīja gaismas mikroskopā, lai nodrošinātu labu spermas kvalitāti (mitrumu), un pēc tam uzglabāja ūdens vannā 37 °C temperatūrā līdz lietošanai pusstundas laikā pēc savākšanas.
Spermatozoīdu kinemātika un reoloģija ir aprakstīta, izmantojot mikrofluidisko ierīču sistēmu.Spermas paraugus tālāk atšķaidīja līdz 1:40 Beltsville Avian Semen Diluent, ievietoja mikrofluidiskā ierīcē (skatīt zemāk), un kinētiskie parametri tika noteikti, izmantojot datorizētu spermas analīzes (CASA) sistēmu, kas iepriekš izstrādāta mikrofluidikas raksturošanai.par spermatozoīdu mobilitāti šķidrā vidē (Assiut universitātes Inženierzinātņu fakultātes Mašīnzinību katedra, Ēģipte).Spraudni var lejupielādēt vietnē: http://www.assiutmicrofluidics.com/research/casa39.Tika izmērīts līknes ātrums (VCL, μm/s), lineārais ātrums (VSL, μm/s) un vidējais trajektorijas ātrums (VAP, μm/s).Spermatozoīdu video tika uzņemti, izmantojot apgrieztu Optika XDS-3 fāzes kontrasta mikroskopu (ar 40x objektīvu), kas savienots ar Tucson ISH1000 kameru ar ātrumu 30 kadri sekundē 3 sekundes.Izmantojiet CASA programmatūru, lai izpētītu vismaz trīs apgabalus un 500 spermas trajektorijas katrā paraugā.Ierakstītais video tika apstrādāts, izmantojot paštaisītu CASA.CASA spraudņa kustīguma definīcija ir balstīta uz spermas peldēšanas ātrumu salīdzinājumā ar plūsmas ātrumu, un tajā nav iekļauti citi parametri, piemēram, kustība no vienas puses uz otru, jo ir konstatēts, ka tas ir ticamāks šķidruma plūsmā.Reoloģiskā kustība tiek raksturota kā spermas šūnu kustība pret šķidruma plūsmas virzienu.Spermatozoīdus ar reoloģiskām īpašībām dala ar kustīgo spermatozoīdu skaitu;no uzskaites tika izslēgti spermatozoīdi, kas atradās miera stāvoklī un konvektīvi kustējās.
Visas izmantotās ķīmiskās vielas tika iegūtas no Elgomhoria Pharmaceuticals (Kaira, Ēģipte), ja vien nav norādīts citādi.Ierīce tika ražota, kā aprakstīja El-sherry et al.40 ar dažām izmaiņām.Mikrokanālu izgatavošanai izmantotie materiāli ietvēra stikla plāksnes (Howard Glass, Worcester, MA), SU-8-25 negatīvo pretestību (MicroChem, Newton, CA), diacetona spirtu (Sigma Aldrich, Steinheim, Vācija) un poliacetonu.-184, Dow Corning, Midlenda, Mičigana).Mikrokanāli tiek izgatavoti, izmantojot mīkstu litogrāfiju.Pirmkārt, uz augstas izšķirtspējas printera (Prismatic, Kaira, Ēģipte un Pacific Arts and Design, Markham, ON) tika izdrukāta caurspīdīga sejas aizsargmaska ​​ar vēlamo mikrokanālu dizainu.Meistari tika izgatavoti, kā pamatnes izmantojot stikla plāksnes.Plāksnes tika notīrītas acetonā, izopropanolā un dejonizētā ūdenī un pēc tam pārklātas ar 20 µm SU8-25 slāni ar griešanās pārklājumu (3000 apgr./min, 1 min).Pēc tam SU-8 slāņi tika viegli žāvēti (65 ° C, 2 minūtes un 95 ° C, 10 minūtes) un pakļauti UV starojumam 50 sekundes.Pēcekspozīcijas cep 65°C un 95°C 1 min un 4 min, lai sasaistītu atklātos SU-8 slāņus, kam seko attīstīšana diacetona spirtā 6,5 minūtes.Cieti cepiet vafeles (200°C 15 minūtes), lai vēl vairāk nostiprinātu SU-8 slāni.
PDMS tika sagatavots, sajaucot monomēru un cietinātāju svara attiecībā 10:1, pēc tam degazējot vakuumeksikatorā un uzlejot uz SU-8 galvenā rāmja.PDMS tika sacietēts krāsnī (120 ° C, 30 minūtes), pēc tam kanāli tika izgriezti, atdalīti no galvenā un perforēti, lai varētu piestiprināt caurules pie mikrokanāla ieejas un izejas.Visbeidzot, PDMS mikrokanāli tika pastāvīgi pievienoti mikroskopa priekšmetstikliņiem, izmantojot pārnēsājamu korona procesoru (Electro-Technic Products, Chicago, IL), kā aprakstīts citur.Šajā pētījumā izmantotais mikrokanāls ir 200 µm × 20 µm (W × H) un ir 3, 6 cm garš.
Hidrostatiskā spiediena izraisītā šķidruma plūsma mikrokanāla iekšpusē tiek panākta, uzturot šķidruma līmeni ieplūdes rezervuārā virs augstuma starpības Δh39 izplūdes rezervuārā (1. att.).
kur f ir berzes koeficients, kas definēts kā f = C/Re laminārai plūsmai taisnstūra kanālā, kur C ir konstante atkarībā no kanāla malu attiecības, L ir mikrokanāla garums, Vav ir vidējais ātrums mikrokanāla iekšpusē, Dh ir kanāla hidrauliskais diametrs, g – gravitācijas paātrinājums.Izmantojot šo vienādojumu, vidējo kanāla ātrumu var aprēķināt, izmantojot šādu vienādojumu: