Paldies, ka apmeklējāt vietni Nature.com. Jūsu izmantotajai pārlūkprogrammas versijai ir ierobežots CSS atbalsts. Lai nodrošinātu vislabāko pieredzi, iesakām izmantot atjauninātu pārlūkprogrammu (vai atspējot saderības režīmu pārlūkprogrammā Internet Explorer). Tikmēr, lai nodrošinātu nepārtrauktu atbalstu, mēs atveidosim vietni bez stiliem un JavaScript.
Putnu auglība ir atkarīga no to spējas ilgstoši uzglabāt pietiekami daudz dzīvotspējīgu spermatozoīdu spermas uzglabāšanas kanāliņos (SST). Precīzs mehānisms, ar kuru spermatozoīdi iekļūst, atrodas SST un iziet no tās, joprojām ir strīdīgs. Šarkasi vistu spermai bija augsta aglutinācijas tendence, veidojot kustīgus pavedienveida saišķus, kas satur daudzas šūnas. Tā kā bija grūti novērot spermatozoīdu kustīgumu un uzvedību necaurspīdīgā olvados, mēs izmantojām mikrofluidikas ierīci ar mikrokanāla šķērsgriezumu, kas līdzīgs spermatozoīdu šķērsgriezumam, lai pētītu spermatozoīdu aglutināciju un kustīgumu. Šajā pētījumā ir aplūkots, kā veidojas spermatozoīdu saišķi, kā tie pārvietojas un to iespējamā loma spermatozoīdu uzturēšanās pagarināšanā SST. Mēs pētījām spermatozoīdu ātrumu un reoloģisko uzvedību, kad šķidruma plūsma mikrofluidikas kanālā tika ģenerēta ar hidrostatisko spiedienu (plūsmas ātrums = 33 µm/s). Spermatozoīdi mēdz peldēt pret straumi (pozitīva reoloģija), un spermatozoīdu saišķa ātrums ir ievērojami samazināts salīdzinājumā ar atsevišķiem spermatozoīdiem. Ir novērots, ka spermatozoīdu saišķi pārvietojas spirālē un palielinās garums un biezums, piesaistot vairāk atsevišķu spermatozoīdu. Tika novēroti spermatozoīdu saišķi, kas tuvojās un pieķērās mikrofluidisko kanālu sānu sienām, lai izvairītos no šķidruma plūsmas ātruma > 33 µm/s. Tika novēroti spermatozoīdu saišķi, kas tuvojās un pieķērās mikrofluidisko kanālu sānu sienām, lai izvairītos no šķidruma plūsmas ātruma > 33 µm/s. Было замечено, что пучки сперматозоидов приближаются и прилипают к боковым стенкам микрофлюиканачтов, избежать сметания со скоростью потока жидкости> 33 мкм / с. Ir novērots, ka spermas saišķi tuvojas un pielīp pie mikrofluidikas kanālu sānu sienām, lai izvairītos no aizslaucīšanas, ja šķidruma plūsmas ātrums ir > 33 µm/s.观察到精子束接近并粘附在微流体通道的侧壁上，以避免被流体流速> 流体流速> 33 流µm/s> 3333 µm/s 扫过. Было замечено, что пучки сперматозоидов приближаются и прилипают к боковым стенкам микрожидкатостного, избежать сметания потоком жидкости со скоростью > 33 мкм/с. Ir novērots, ka spermatozoīdu saišķi tuvojas un pielīp pie mikrofluidiskā kanāla sānu sienām, lai izvairītos no šķidruma plūsmas, kas pārsniedz 33 µm/s, aizslaucīšanas.Skenējošās un transmisijas elektronmikroskopijas rezultāti atklāja, ka spermatozoīdu saišķus balstīja bagātīgs blīvs materiāls. Iegūtie dati parāda Šarkazi vistu spermatozoīdu unikālo mobilitāti, kā arī spermatozoīdu spēju aglutinēt un veidot kustīgus saišķus, kas veicina labāku izpratni par spermatozoīdu ilgtermiņa uzglabāšanu SMT.
Lai cilvēkiem un lielākajai daļai dzīvnieku notiktu apaugļošanās, spermai un olšūnām ir jānonāk apaugļošanās vietā īstajā laikā. Tāpēc pārošanai jānotiek pirms ovulācijas vai tās laikā. No otras puses, daži zīdītāji, piemēram, suņi, kā arī nezīdītāju sugas, piemēram, kukaiņi, zivis, rāpuļi un putni, ilgstoši uzglabā spermu savos reproduktīvajos orgānos, līdz to olšūnas ir gatavas apaugļošanai (asinhronā apaugļošanās1). Putni spēj saglabāt olšūnas apaugļot spējīgu spermatozoīdu dzīvotspēju 2–10 nedēļas2.
Šī ir unikāla iezīme, kas atšķir putnus no citiem dzīvniekiem, jo ​​tā nodrošina augstu apaugļošanās varbūtību pēc vienas apsēklošanas vairākas nedēļas bez vienlaicīgas pārošanās un ovulācijas. Galvenais spermas uzglabāšanas orgāns, ko sauc par spermas uzglabāšanas kanāliņu (SST), atrodas iekšējās gļotādas krokās dzemdes un maksts savienojuma vietā. Līdz šim mehānismi, ar kuriem spermatozoīdi nonāk spermas bankā, atrodas tajā un iziet no tās, nav pilnībā izprasti. Pamatojoties uz iepriekšējiem pētījumiem, ir izvirzītas daudzas hipotēzes, taču neviena no tām nav apstiprināta.
Formans4 izvirzīja hipotēzi, ka spermatozoīdi saglabā savu atrašanās vietu SST dobumā, nepārtraukti svārstoties pretēji šķidruma plūsmas virzienam caur olbaltumvielu kanāliem, kas atrodas uz SST epitēlija šūnām (reoloģija). ATP ir samazināts pastāvīgās flagellu aktivitātes dēļ, kas nepieciešama, lai spermatozoīdus noturētu SST lūmenā, un kustīgums galu galā samazinās, līdz spermatozoīdi ar šķidruma plūsmu tiek iznesti no spermas bankas un sāk jaunu ceļojumu pa augšupejošo olvadu, lai apaugļotu spermu. Ola (Formans4). Šo spermas uzglabāšanas modeli apstiprina akvaporīnu 2, 3 un 9 noteikšana SST epitēlija šūnās ar imūnhistoķīmijas palīdzību. Līdz šim trūkst pētījumu par vistu spermas reoloģiju un tās lomu SST uzglabāšanā, vaginālajā spermatozoīdu atlasē un spermatozoīdu konkurencē. Vistām sperma nonāk makstī pēc dabiskas pārošanās, bet vairāk nekā 80% spermatozoīdu tiek izmesti no maksts neilgi pēc pārošanās. Tas liecina, ka maksts ir galvenā spermatozoīdu atlases vieta putniem. Turklāt ir ziņots, ka mazāk nekā 1% spermatozoīdu, kas apaugļoti makstī, nonāk SST2. Cāļu mākslīgās apsēklošanas laikā makstī spermatozoīdu skaits, kas sasniedz SST, parasti palielinās 24 stundas pēc apsēklošanas. Līdz šim spermatozoīdu atlases mehānisms šajā procesā nav skaidrs, un spermatozoīdu kustīgumam var būt svarīga loma spermatozoīdu uzņemšanā SST. Olvadu biezo un necaurspīdīgo sieniņu dēļ ir grūti tieši uzraudzīt spermatozoīdu kustīgumu putnu olvados. Tāpēc mums trūkst pamatzināšanu par to, kā spermatozoīdi pāriet uz SST pēc apaugļošanas.
Reoloģija nesen ir atzīta par svarīgu faktoru, kas kontrolē spermatozoīdu transportu zīdītāju dzimumorgānos. Pamatojoties uz kustīgo spermatozoīdu spēju migrēt pretplūsmā, Zaferani et al.8 izmantoja Corra mikrofluidikas sistēmu, lai pasīvi izolētu kustīgos spermatozoīdus no aploksnē ievietotiem spermas paraugiem. Šāda veida spermas šķirošana ir būtiska medicīniskai neauglības ārstēšanai un klīniskajiem pētījumiem, un tai tiek dota priekšroka salīdzinājumā ar tradicionālajām metodēm, kas ir laikietilpīgas un darbietilpīgas un var apdraudēt spermas morfoloģiju un strukturālo integritāti. Tomēr līdz šim nav veikti pētījumi par vistu dzimumorgānu sekrēciju ietekmi uz spermatozoīdu kustīgumu.
Neatkarīgi no mehānisma, kas uztur spermu uzglabātu SST, daudzi pētnieki ir novērojuši, ka vistu 9, 10, paipalu 2 un tītaru 11 SST rezident spermatozoīdi aglutinējas galviņa pret galvu, veidojot aglutinētus spermatozoīdu saišķus. Autori norāda, ka pastāv saikne starp šo aglutināciju un spermatozoīdu ilgstošu uzglabāšanu SST.
Tingari un Lake12 ziņoja par spēcīgu saistību starp spermatozoīdiem vistas spermas uztveršanas dziedzerī un apšaubīja, vai putnu spermatozoīdi aglutinējas tāpat kā zīdītāju spermatozoīdi. Viņi uzskata, ka dziļie savienojumi starp spermatozoīdiem sēklvadā var būt saistīti ar stresu, ko rada liels spermatozoīdu skaits nelielā telpā.
Novērtējot spermatozoīdu uzvedību uz svaigiem stikla preparātiem, var novērot pārejošas aglutinācijas pazīmes, īpaši spermas pilienu malās. Tomēr aglutināciju bieži traucēja rotācijas darbība, kas saistīta ar nepārtrauktu kustību, kas izskaidro šīs parādības pārejošo raksturu. Pētnieki arī pamanīja, ka, pievienojot spermai atšķaidītāju, parādījās iegareni, "diegam līdzīgi" šūnu agregāti.
Agrīnie mēģinājumi atdarināt spermatozoīdus tika veikti, noņemot plānu stiepli no piekārta piliena, kā rezultātā no spermas piliena izvirzījās iegarena spermatozoīdiem līdzīga pūslīte. Spermatozoīdi pūslīša iekšpusē nekavējoties sakārtojās paralēli, bet visa vienība ātri pazuda 3D ierobežojuma dēļ. Tāpēc, lai pētītu spermatozoīdu aglutināciju, ir jānovēro spermatozoīdu kustīgums un uzvedība tieši izolētos spermatozoīdu uzkrāšanas kanāliņos, ko ir grūti panākt. Tāpēc ir nepieciešams izstrādāt instrumentu, kas atdarina spermatozoīdus, lai atbalstītu spermatozoīdu kustīguma un aglutinācijas uzvedības pētījumus. Brillards un līdzautori13 ziņoja, ka pieaugušu cāļu spermatozoīdu uzkrāšanas kanāliņu vidējais garums ir 400–600 µm, bet daži SST var sasniegt pat 2000 µm. Mero un Ogasawara14 sadalīja sēklas dziedzerus palielinātos un nepalielinātos spermatozoīdu uzkrāšanas kanāliņos, kuriem abiem bija vienāds garums (~500 µm) un kakliņa platums (~38 µm), bet kanāliņu vidējais lūmena diametrs bija attiecīgi 56,6 un 56,6 µm, t.i., 11,2 μm. Pašreizējā pētījumā mēs izmantojām mikrofluidikas ierīci ar kanāla izmēru 200 µm × 20 µm (platums × augstums), kura šķērsgriezums ir nedaudz tuvs amplificētā SST šķērsgriezumam. Turklāt mēs pārbaudījām spermatozoīdu kustīgumu un aglutinācijas uzvedību plūstošā šķidrumā, kas atbilst Formana hipotēzei, ka SST epitēlija šūnu ražotais šķidrums notur spermatozoīdus lūmenā pretplūsmas (reoloģiskā) virzienā.
Šī pētījuma mērķis bija pārvarēt problēmas, kas saistītas ar spermatozoīdu kustīguma novērošanu olvados, un izvairīties no grūtībām, kas saistītas ar spermatozoīdu reoloģijas un uzvedības izpēti dinamiskā vidē. Tika izmantota mikrofluidikas ierīce, kas rada hidrostatisko spiedienu, lai simulētu spermatozoīdu kustīgumu vistas dzimumorgānos.
Kad mikrokanālu ierīcē tika ievietots piliens atšķaidīta spermas parauga (1:40), varēja identificēt divu veidu spermatozoīdu kustīgumu (izolētus spermatozoīdus un saistītus spermatozoīdus). Turklāt spermatozoīdi mēdza peldēt pret straumi (pozitīva reoloģija; 1., 2. video). Lai gan spermatozoīdu saišķiem bija mazāks ātrums nekā vientuļajiem spermatozoīdiem (p < 0,001), tie palielināja spermatozoīdu procentuālo daudzumu, kam bija pozitīva reotakse (p < 0,001; 2. tabula). Lai gan spermatozoīdu saišķiem bija mazāks ātrums nekā vientuļajiem spermatozoīdiem (p < 0,001), tie palielināja spermatozoīdu procentuālo daudzumu, kam bija pozitīva reotakse (p < 0,001; 2. tabula). Хотя пучки сперматозоидов имели более низкую скорость, чем у одиночных сперматозоидов (p < 0,0001), валичив процент сперматозоидов, демонстрирующих положительный реотаксис (p < 0,001; таблица 2). Lai gan spermatozoīdu saišķiem bija mazāks ātrums nekā atsevišķiem spermatozoīdiem (p < 0,001), tie palielināja spermatozoīdu procentuālo daudzumu, kuriem bija pozitīva reotakse (p < 0,001; 2. tabula).尽管精子束的速度低于孤独精子的速度（p < 0,001），但它们增加了显示阳性流变性的精子百分比（p < 0,001；表2）.尽管 精子束 的 速度 低于 孤独 的 速度 （p <0,001） ， 但 增加 浵 吟 昧 显羺 阳百分比 (p <0,001 ； 2。。。。。。)））））） Хотя скорость пучков сперматозоидов была ниже, чем у одиночных сперматозоидов (p < 0,001), они уверматозоидов они уверматозоидов сперматозоидов с положительной реологией (p < 0,001; таблица 2). Lai gan spermatozoīdu saišķu pārvietošanās ātrums bija zemāks nekā atsevišķu spermatozoīdu pārvietošanās ātrums (p < 0,001), tie palielināja spermatozoīdu ar pozitīvu reoloģiju procentuālo daudzumu (p < 0,001; 2. tabula).Pozitīva reoloģija atsevišķiem spermatozoīdiem un spermatozoīdu kušķiem tiek lēsta attiecīgi aptuveni 53% un 85% apmērā.
Ir novērots, ka šarkaši vistu spermatozoīdi tūlīt pēc ejakulācijas veido lineārus saišķus, kas sastāv no desmitiem īpatņu. Šie kušķi laika gaitā palielinās garumā un biezumā, un in vitro tie var palikt vairākas stundas, pirms izklīst (3. video). Šie pavedienveida saišķi ir veidoti kā ehidnas spermatozoīdi, kas veidojas sēklinieka piedēkļa galā. Šarkaši vistu spermai ir konstatēta augsta tendence aglutinēt un veidot tīklveida saišķi mazāk nekā vienas minūtes laikā pēc savākšanas. Šie stari ir dinamiski un spēj pielipt pie jebkurām tuvumā esošām sienām vai statiskiem objektiem. Lai gan spermatozoīdu saišķi samazina spermatozoīdu ātrumu, ir skaidrs, ka makroskopiski tie palielina to linearitāti. Saišķu garums mainās atkarībā no saišķos savākto spermatozoīdu skaita. Tika izolētas divas saišķa daļas: sākotnējā daļa, ieskaitot aglutinētā spermatozoīda brīvo galvu, un gala daļa, ieskaitot asti un visu spermatozoīda distālo galu. Izmantojot ātrgaitas kameru (950 kadri/s), saišķa sākotnējā daļā tika novērotas aglutinētu spermatozoīdu brīvas galviņas, kas to svārstīgo kustību dēļ ir atbildīgas par saišķa kustību, atlikušās ievelkot saišķī ar spirālveida kustību (4. video). Tomēr garos pušķos ir novērots, ka dažas brīvas spermatozoīdu galviņas ir pielipušas pie ķermeņa, un kušķa gala daļa darbojas kā lāpstiņas, kas palīdz virzīt kušķi.
Lēnā šķidruma plūsmā spermatozoīdu saišķi pārvietojas paralēli viens otram, tomēr tie sāk pārklāties un pielipt pie visa nekustīgā, lai, palielinoties plūsmas ātrumam, strāvas plūsma tos neaizskalotu. Saišķi veidojas, kad nedaudz spermatozoīdu tuvojas viens otram, tie sāk kustēties sinhroni un aptīties viens ap otru, un pēc tam pielipt pie lipīgas vielas. 1. un 2. attēlā parādīts, kā spermatozoīdi tuvojas viens otram, veidojot savienojumu, astītēm aptinot viena otru.
Pētnieki pielietoja hidrostatisko spiedienu, lai radītu šķidruma plūsmu mikrokanālā spermas reoloģijas izpētei. Tika izmantots mikrokanāls ar izmēru 200 µm × 20 µm (platums × augstums) un garumu 3,6 µm. Mikrokanāli tika ievietoti starp traukiem, kuru galos bija piestiprinātas šļirces. Lai kanāli būtu labāk redzami, tika izmantota pārtikas krāsviela.
Piesieniet savienojošos kabeļus un piederumus pie sienas. Video tika uzņemts ar fāzu kontrasta mikroskopu. Katram attēlam ir pievienoti fāzu kontrasta mikroskopijas un kartēšanas attēli. (A) Savienojums starp divām plūsmām pretojas plūsmai spirālveida kustības dēļ (sarkanā bultiņa). (B) Savienojums starp caurules saišķi un kanāla sienu (sarkanās bultiņas), vienlaikus savienojot ar diviem citiem saišķiem (dzeltenās bultiņas). (C) Spermas saišķi mikrofluidikas kanālā sāk savienoties viens ar otru (sarkanās bultiņas), veidojot spermas saišķu tīklu. (D) Spermas saišķu tīkla veidošanās.
Kad mikrofluidikas ierīcē tika ielādēts atšķaidītas spermas piliens un tika radīta plūsma, tika novērots, ka spermatozoīdu stars pārvietojas pretēji plūsmas virzienam. Saiņi cieši pieguļ mikrokanālu sienām, un brīvās galviņas saišķu sākotnējā daļā cieši pieguļ tām (5. video). Tie arī pielīp pie jebkurām nekustīgām daļiņām savā ceļā, piemēram, gružiem, lai pretotos strāvas aizslaucīšanai. Laika gaitā šie kušķi kļūst par gariem pavedieniem, kas iesprosto citus atsevišķus spermatozoīdus un īsākus kušķus (6. video). Plūsmai sākot palēnināties, garas spermatozoīdu rindas sāk veidot spermatozoīdu līniju tīklu (7. video; 2. attēls).
Pie liela plūsmas ātruma (V > 33 µm/s) pavedienu spirālveida kustības palielinās, mēģinot notvert daudzus atsevišķus spermatozoīdu veidojošos saišķus, lai labāk pretotos plūsmas dreifēšanas spēkam. Pie liela plūsmas ātruma (V > 33 µm/s) pavedienu spirālveida kustības palielinās, mēģinot notvert daudzus atsevišķus spermatozoīdu veidojošos saišķus, lai labāk pretotos plūsmas dreifēšanas spēkam. При высокой скорости потока (V > 33 мкм/с) спиралевидные движения нитей усиливаются, поскольку они пытаются отдельных сперматозоидов, образующих пучки, которые лучше противостоят дрейфующей силе потока. Pie lieliem plūsmas ātrumiem (V > 33 µm/s) pavedienu spirālveida kustības palielinās, jo tie mēģina notvert daudzus atsevišķus spermatozoīdus, veidojot saišķus, kas spēj labāk pretoties plūsmas dreifēšanas spēkam.在高流速 (V > 33 µm/s)时，螺纹的螺旋运动增加，以试图捕捉许多形成束的单个精子，从而更好地抵抗流动的漂移力.在 高 流速 (v> 33 µm/s) 时 ， 的 螺旋 运动 增加 ， 以 试图 箭多 形成 束 束从而 更 地 抵抗 的 漂移力。。。。。。。。。. При высоких скоростях потока (V > 33 мкм/с) спиральное движение нитей увеличивается в попытке захватесть захватить сперматозоидов, образующих пучки, чтобы лучше сопротивляться силам дрейфа потока. Pie lieliem plūsmas ātrumiem (V > 33 µm/s) pavedienu spirālveida kustība palielinās, mēģinot uztvert daudzus atsevišķus spermatozoīdus, kas veido saišķus, lai labāk pretotos plūsmas dreifēšanas spēkiem.Viņi arī mēģināja piestiprināt mikrokanālus pie sānu sienām.
Spermatozoīdu saišķi tika identificēti kā spermatozoīdu galviņu un saritinātu astīšu kopas, izmantojot gaismas mikroskopiju (LM). Spermatozoīdu saišķi ar dažādiem agregātiem ir identificēti arī kā savītas galviņas un flagelāru agregāti, vairākas saplūdušas spermatozoīdu astes, pie astes piestiprinātas spermatozoīdu galviņas un spermatozoīdu galviņas ar saliektiem kodoliem kā vairāki saplūduši kodoli. Transmisijas elektronu mikroskopija (TEM). Skenējošā elektronu mikroskopija (SEM) parādīja, ka spermatozoīdu saišķi bija apvalkoti spermatozoīdu galviņu agregāti, un spermatozoīdu agregātiem bija redzams piestiprināts aptītu astīšu tīkls.
Spermatozoīdu morfoloģija un ultrastruktūra, spermatozoīdu saišķu veidošanās tika pētīta, izmantojot gaismas mikroskopiju (pusgriezums), skenējošo elektronmikroskopiju (SEM) un transmisijas elektronmikroskopiju (TEM), spermatozoīdu uztriepes tika iekrāsotas ar akridīnoranžo krāsu un pārbaudītas, izmantojot epifluorescences mikroskopiju.
Spermas uztriepes iekrāsošana ar akridīnoranžo krāsu (3.B att.) parādīja, ka spermatozoīdu galviņas bija salipušas kopā un pārklātas ar sekrēcijas materiālu, kā rezultātā veidojās lieli kušķi (3.D att.). Spermatozoīdu saišķi sastāvēja no spermatozoīdu agregātiem ar piestiprinātu astes tīklu (4.A–C att.). Spermatozoīdu saišķi sastāv no daudzu spermatozoīdu astēm, kas salipušas kopā (4.D att.). Spermatozoīdu saišķu galviņas klāja sekrēti (4.E,F att.).
Spermatozoīdu saišķa veidošanās. Izmantojot fāzu kontrasta mikroskopiju un ar akridīnoranžo krāsu iekrāsotas spermatozoīdu uztriepes, tika parādīts, ka spermatozoīdu galviņas salīp kopā. (A) Agrīna spermatozoīdu kušķu veidošanās sākas ar spermatozoīdu (balts aplis) un trim spermatozoīdiem (dzeltens aplis), spirālei sākoties no astes un beidzot ar galviņu. (B) Ar akridīnoranžo krāsu iekrāsotas spermatozoīdu uztriepes fotomikroattēls, kurā redzamas pielipušas spermatozoīdu galviņas (bultiņas). Izdalījumi pārklāj galviņu(-as). Palielinājums × 1000. (C) Liela stara veidošanās, ko pārvieto plūsma mikrofluidikas kanālā (izmantojot ātrgaitas kameru ar 950 kadriem sekundē). (D) Ar akridīnoranžo krāsu iekrāsotas spermatozoīdu uztriepes mikroattēls, kurā redzami lieli kušķi (bultiņas). Palielinājums: × 200.
Spermatozoīdu stara un ar akridīnoranžo krāsu iekrāsotas spermatozoīdu uztriepes skenējošais elektronmikrogrāfijs. (A, B, D, E) ir spermatozoīdu digitālie krāsu skenējošie elektronmikrogrāfi, un C un F ir ar akridīnoranžo krāsu iekrāsotu spermatozoīdu uztriepju mikrogrāfi, kas parāda vairāku spermatozoīdu piestiprināšanos, kas aptinās ar astes tīklu. (AC) Spermatozoīdu agregāti ir parādīti kā piestiprinātu astīšu tīkls (bultiņas). (D) Vairāku spermatozoīdu (ar līmējošu vielu, rozā kontūra, bultiņa) adhēzija, kas aptinās ap asti. (E un F) Spermatozoīdu galviņu agregāti (rādītāji), kas pārklāti ar līmējošu materiālu (rādītāji). Spermatozoīdi veidoja saišķus ar vairākām virpuļveida struktūrām (F). (C) ×400 un (F) ×200 palielinājumi.
Izmantojot transmisijas elektronu mikroskopiju, mēs atklājām, ka spermatozoīdu saišķiem ir piestiprinātas astes (6A., C. att.), galviņas, kas piestiprinātas pie astēm (6B. att.), vai galviņas, kas piestiprinātas pie astēm (6D. att.). Spermatozoīdu galviņas saišķī ir izliektas, griezumā redzami divi kodola reģioni (6D. att.). Iegriezuma saišķī spermatozoīdiem bija savīta galviņa ar diviem kodola reģioniem un vairākiem flagelāriem reģioniem (5A. att.).
Digitāls krāsu elektronmikrogrāfijs, kurā redzamas savienojošās astes spermatozoīdu saišķī un aglutinējošais materiāls, kas savieno spermatozoīdu galviņas. (A) Piestiprināta liela skaita spermatozoīdu aste. Ievērojiet, kā aste izskatās gan portreta (bultiņa), gan ainavas (bultiņa) projekcijā. (B) Spermatozoīda galviņa (bultiņa) ir savienota ar asti (bultiņa). (C) Ir piestiprinātas vairākas spermatozoīdu astes (bultiņas). (D) Aglutinācijas materiāls (AS, zils) savieno četras spermatozoīdu galviņas (violets).
Skenējošā elektronu mikroskopija tika izmantota, lai noteiktu spermatozoīdu galviņas spermatozoīdu saišķos, kas pārklāti ar sekrētiem vai membrānām (6.B attēls), kas norāda, ka spermatozoīdu saišķi ir nostiprināti ar ekstracelulāru materiālu. Aglutinētais materiāls bija koncentrēts spermatozoīdu galviņā (medūzas galviņai līdzīgs veidojums; 5.B attēls) un izpletās distāli, iegūstot spilgti dzeltenu izskatu fluorescences mikroskopijā, iekrāsojot ar akridīnoranžo krāsu (6.C attēls). Šī viela ir skaidri redzama skenējošajā mikroskopā un tiek uzskatīta par saistvielu. Pusplānie griezumi (5.C attēls) un spermatozoīdu uztriepes, kas iekrāsotas ar akridīnoranžo krāsu, parādīja spermatozoīdu saišķus ar blīvi izvietotām galviņām un saritinātām astēm (5.D attēls).
Dažādi fotomikrogrāfi, kuros redzama spermatozoīdu galviņu un salocītu astes agregācija, izmantojot dažādas metodes. (A) Spermatozoīdu saišķa šķērsgriezuma digitālais krāsu transmisijas elektronu mikrogrāfs, kurā redzama saritināta spermatozoīdu galviņa ar divdaļīgu kodolu (zilā krāsā) un vairākām flagelāru daļām (zaļā krāsā). (B) Digitāls krāsu skenējošais elektronu mikrogrāfs, kurā redzams medūzai līdzīgu spermatozoīdu galviņu kopums (bultiņas), kas šķiet pārklātas. (C) Pusplāns šķērsgriezums, kurā redzamas agregētas spermatozoīdu galviņas (bultiņas) un saritinātas astes (bultiņas). (D) Ar akridīnoranžo krāsu iekrāsota spermatozoīdu uztriepes mikrogrāfs, kurā redzami spermatozoīdu galviņu agregāti (bultiņas) un saritinātas pielipušās astes (bultiņas). Ņemiet vērā, ka spermatozoīda galviņu klāj lipīga viela (S). (D) × 1000 palielinājums.
Izmantojot transmisijas elektronmikroskopiju (7.A att.), tika arī atzīmēts, ka spermatozoīdu galviņas ir savītas un kodoliem ir spirālveida forma, ko apstiprināja spermatozoīdu uztriepes, kas iekrāsotas ar akridīnoranžu un pārbaudītas, izmantojot fluorescences mikroskopiju (7.B att.).
(A) Digitāls krāsu transmisijas elektronmikrogrāfs un (B) ar akridīna oranžu krāsu krāsots spermatozoīdu uztriepes attēls, kurā redzamas savītas galviņas un spermatozoīdu galviņu un astes piestiprināšanās (bultiņas). (B) × 1000 palielinājums.
Interesants atklājums ir tas, ka Šarkazi spermatozoīdi agregējas, veidojot kustīgus pavedienveida saišķus. Šo saišķu īpašības ļauj mums izprast to iespējamo lomu spermatozoīdu absorbcijā un uzglabāšanā SST.
Pēc pārošanās spermatozoīdi nonāk makstī un tiek pakļauti intensīvam atlases procesam, kā rezultātā muguras smadzeņu tvertnē nonāk tikai ierobežots skaits spermatozoīdu15,16. Līdz šim mehānismi, ar kuriem spermatozoīdi nonāk muguras smadzeņu tvertnē un iziet no tās, nav skaidri. Mājputniem spermatozoīdi tiek uzglabāti muguras smadzeņu tvertnē ilgstoši – no 2 līdz 10 nedēļām – atkarībā no sugas6. Joprojām ir strīdi par spermas stāvokli uzglabāšanas laikā muguras smadzeņu tvertnē. Vai tās atrodas kustībā vai miera stāvoklī? Citiem vārdiem sakot, kā spermas šūnas tik ilgi saglabā savu pozīciju muguras smadzeņu tvertnē?
Formans4 ieteica, ka folikulu epitēlija (SST) uzturēšanās un izmešana varētu tikt izskaidrota ar spermatozoīdu kustīgumu. Autori izvirza hipotēzi, ka spermatozoīdi saglabā savu pozīciju, peldot pretēji SST epitēlija radītajai šķidruma plūsmai, un ka spermatozoīdi tiek izmesti no SST, kad to ātrums samazinās zem punkta, kurā tie sāk kustēties atpakaļ enerģijas trūkuma dēļ. Zaniboni5 apstiprināja akvaporīnu 2, 3 un 9 klātbūtni SST epitēlija šūnu apikālajā daļā, kas var netieši atbalstīt Formena spermatozoīdu uzglabāšanas modeli. Pašreizējā pētījumā mēs atklājām, ka gandrīz pusei Šarkaši spermatozoīdu plūstošajā šķidrumā ir pozitīva reoloģija un ka aglutinēti spermatozoīdu kūlīši palielina spermatozoīdu skaitu, kuriem ir pozitīva reoloģija, lai gan aglutinācija tos palēnina. Nav pilnībā izprasts, kā spermatozoīdi pārvietojas pa putna olvadu līdz apaugļošanās vietai. Zīdītājiem folikulu šķidrums ķīmoatrakcijas ceļā piesaista spermatozoīdus. Tomēr tiek uzskatīts, ka ķīmoatraktanti virza spermatozoīdus tuvoties lielos attālumos7. Tāpēc par spermatozoīdu transportēšanu ir atbildīgi citi mehānismi. Ir ziņots, ka spermatozoīdu spēja orientēties un plūst pret olvadu šķidrumu, kas izdalās pēc pārošanās, ir galvenais faktors spermas mērķauditorijas noteikšanā pelēm. Pārkers 17 ieteica, ka spermatozoīdi šķērso olvadus, peldot pretēji ciliārajām straumēm putniem un rāpuļiem. Lai gan tas nav eksperimentāli pierādīts putniem, Adolphi 18 bija pirmais, kas atklāja, ka putnu sperma dod pozitīvus rezultātus, ja starp segstiklu un priekšmetstikliņu ar filtrpapīra sloksni izveido plānu šķidruma slāni. Reoloģija. Hino un Yanagimachi [19] ievietoja peles olnīcu-olvadu-dzemdes kompleksu perfūzijas gredzenā un injicēja 1 µl tintes šaurumā, lai vizualizētu šķidruma plūsmu olvados. Viņi novēroja ļoti aktīvu kontrakcijas un relaksācijas kustību olvados, kurā visas tintes bumbiņas vienmērīgi virzījās uz olvadu ampulu. Autori uzsver olvadu šķidruma plūsmas nozīmi no apakšējām uz augšējām olvadu daļām spermatozoīdu pacelšanai un apaugļošanai. Brillard20 ziņoja, ka vistām un tītariem spermatozoīdi migrē, aktīvi pārvietojoties no maksts ieejas, kur tie tiek uzglabāti, uz dzemdes-vaginālo savienojumu, kur tie tiek uzglabāti. Tomēr šī kustība nav nepieciešama starp dzemdes-vaginālo savienojumu un infundibulu, jo spermatozoīdi tiek transportēti ar pasīvu pārvietošanos. Zinot šos iepriekšējos ieteikumus un pašreizējā pētījumā iegūtos rezultātus, var pieņemt, ka spermatozoīdu spēja pārvietoties augšup pa straumi (reoloģija) ir viena no īpašībām, uz kurām balstās atlases process. Tas nosaka spermatozoīdu iekļūšanu makstī un to iekļūšanu dzemdes kakla tvertnē uzglabāšanai. Kā ieteica Forman4, tas var arī atvieglot spermatozoīdu iekļūšanu dzemdes kakla tvertnē un tās dzīvotnē uz noteiktu laiku un pēc tam iziešanu, kad to ātrums sāk palēnināties.
No otras puses, Matsuzaki un Sasanami21 ieteica, ka putnu spermatozoīdi tēviņu un mātīšu reproduktīvajos traktos piedzīvo kustīguma izmaiņas no miera stāvokļa uz kustīgumu. Ir ierosināts, ka rezidentu spermatozoīdu kustīguma inhibīcija SST izskaidro spermatozoīdu ilgo uzglabāšanas laiku un pēc tam atjaunošanos pēc iziešanas no SST. Hipoksiskos apstākļos Matsuzaki et al.1 ziņoja par augstu laktāta veidošanos un izdalīšanos SST, kas var izraisīt rezidentu spermatozoīdu kustīguma inhibīciju. Šajā gadījumā spermatozoīdu reoloģijas nozīme atspoguļojas spermatozoīdu atlasē un absorbcijā, nevis to uzglabāšanā.
Spermatozoīdu aglutinācijas modelis tiek uzskatīts par ticamu skaidrojumu spermas ilgajam uzglabāšanas periodam olvadu caurulēs (SST), jo tas ir izplatīts spermas saglabāšanas modelis mājputniem2,22,23. Baksts et al.2 novēroja, ka lielākā daļa spermatozoīdu pielipa viens pie otra, veidojot saišķu agregātus, un atsevišķi spermatozoīdi paipalu CCM tika atrasti reti. No otras puses, Vens et al.24 novēroja vairāk izkaisītu spermatozoīdu un mazāk spermatozoīdu kušķu vistu SST lūmenā. Pamatojoties uz šiem novērojumiem, var pieņemt, ka spermatozoīdu aglutinācijas tieksme atšķiras starp putniem un starp spermatozoīdiem vienā ejakulātā. Turklāt Van Krejs et al.9 ieteica, ka aglutinēto spermatozoīdu nejauša disociācija ir atbildīga par pakāpenisku spermatozoīdu iekļūšanu olvadu lūmenā. Saskaņā ar šo hipotēzi vispirms no SST jāizvada spermatozoīdi ar zemāku aglutinācijas spēju. Šajā kontekstā spermatozoīdu spēja aglutinēt var būt faktors, kas ietekmē spermatozoīdu konkurences iznākumu netīriem putniem. Turklāt, jo ilgāk aglutinētie spermatozoīdi disociējas, jo ilgāk saglabājas auglība.
Lai gan spermatozoīdu agregācija un agregācija saišķos ir novērota vairākos pētījumos2,22,24, tās nav detalizēti aprakstītas to kinemātiskās novērošanas sarežģītības dēļ SST ietvaros. Ir veikti vairāki mēģinājumi pētīt spermatozoīdu aglutināciju in vitro. Plaša, bet pārejoša agregācija tika novērota, kad no karājošā sēklas piliena tika noņemta plānā stieple. Tas noved pie tā, ka no piliena izvirzās iegarens burbulis, kas imitē sēklas dziedzeri. 3D ierobežojumu un īsā pilināšanas žāvēšanas laika dēļ viss bloks ātri vien sabojājās9. Pašreizējā pētījumā, izmantojot Šarkaši vistas un mikrofluidikas mikroshēmas, mēs varējām aprakstīt, kā šie saišķi veidojas un kā tie pārvietojas. Spermatozoīdu saišķi izveidojās tūlīt pēc spermas savākšanas, un tika konstatēts, ka tie pārvietojas spirālē, uzrādot pozitīvu reoloģiju, atrodoties plūsmā. Turklāt, makroskopiski aplūkojot, ir novērots, ka spermatozoīdu saišķi palielina kustīguma linearitāti salīdzinājumā ar izolētiem spermatozoīdiem. Tas liek domāt, ka spermatozoīdu aglutinācija var notikt pirms SST iekļūšanas un ka spermatozoīdu producēšana stresa dēļ neaprobežojas tikai ar nelielu laukumu, kā iepriekš tika ieteikts (Tingari un Lake12). Kušķu veidošanās laikā spermatozoīdi sinhroni peld, līdz tie veido savienojumu, tad to astes aptinās viena ap otru un spermatozoīda galva paliek brīva, bet aste un spermatozoīda distālā daļa salīp kopā ar lipīgu vielu. Tādēļ saites brīvā galva ir atbildīga par kustību, velkot pārējo saiti. Spermatozoīdu saišķu skenējošā elektronu mikroskopija parādīja pielipušas spermatozoīdu galviņas, kas pārklātas ar lielu daudzumu lipīga materiāla, kas liek domāt, ka spermatozoīdu galviņas bija pielipušas miera stāvoklī esošos saišķos, kas, iespējams, notika pēc uzglabāšanas vietas (SST) sasniegšanas.
Kad spermas uztriepi iekrāso ar akridīnoranžo krāsu, fluorescences mikroskopā var redzēt ārpusšūnu līmējošo materiālu ap spermatozoīdiem. Šī viela ļauj spermatozoīdu saišķiem pielipt un pielipt pie jebkurām apkārtējām virsmām vai daļiņām, lai tie nedreifētu līdzi apkārtējai plūsmai. Tādējādi mūsu novērojumi parāda spermatozoīdu adhēzijas lomu kustīgu saišķu veidā. To spēja peldēt pret straumi un pielipt pie tuvumā esošajām virsmām ļauj spermatozoīdiem ilgāk uzturēties SST.
Rotšilds25 izmantoja hemocitometrijas kameru, lai pētītu liellopu spermas peldošo sadalījumu suspensijas pilienā, uzņemot fotomikrogrāfus caur kameru ar mikroskopa vertikālo un horizontālo optisko asi. Rezultāti parādīja, ka spermatozoīdus pievilka kameras virsma. Autori norāda, ka starp spermu un virsmu varētu pastāvēt hidrodinamiska mijiedarbība. Ņemot to vērā, kā arī Šarkaši cāļu spermas spēju veidot lipīgus kušķus, tas var palielināt iespējamību, ka sperma pielips pie SST sienas un tiks uzglabāta ilgu laiku.
Bccetti un Afzeliu26 ziņoja, ka spermas glikokalikss ir nepieciešams gametu atpazīšanai un aglutinācijai. Formans10 novēroja, ka α-glikozīdu saišu hidrolīze glikoproteīnu-glikolipīdu apvalkos, apstrādājot putnu spermu ar neiraminidāzi, izraisīja samazinātu auglību, neietekmējot spermatozoīdu kustīgumu. Autori norāda, ka neiraminidāzes ietekme uz glikokaliksu pasliktina spermatozoīdu sekvestrāciju dzemdes-vaginālajā savienojumā, tādējādi samazinot auglību. Viņu novērojumi nevar ignorēt iespēju, ka neiraminidāzes apstrāde var samazināt spermatozoīdu un olšūnu atpazīšanu. Formans un Engels10 atklāja, ka auglība samazinājās, kad vistas tika apsēklotas intravagināli ar spermu, kas apstrādāta ar neiraminidāzi. Tomēr IVF ar neiraminidāzi apstrādātu spermu neietekmēja auglību salīdzinājumā ar kontroles vistām. Autori secināja, ka izmaiņas glikoproteīnu-glikolipīdu apvalkā ap spermas membrānu samazināja spermas spēju apaugļoties, pasliktinot spermas sekvestrāciju dzemdes-vaginālajā savienojumā, kas savukārt palielināja spermatozoīdu zudumu dzemdes-vaginālās savienojuma ātruma dēļ, bet neietekmēja spermas un olšūnu atpazīšanu.
Tītariem Baksts un Bauhans11 atrada mazus pūslīšus un membrānas fragmentus SST lūmenā un novēroja, ka dažas no šīm granulām ir saplūdušas ar spermas membrānu. Autori norāda, ka šīs attiecības var veicināt spermatozoīdu ilgstošu uzglabāšanu SST. Tomēr pētnieki neprecizēja šo daļiņu avotu, vai tās izdala CCT epitēlija šūnas, tās ražo un izdala tēviņu reproduktīvā sistēma vai arī tās ražo pats spermatozoīds. Šīs daļiņas ir atbildīgas arī par aglutināciju. Grützners un līdzautori27 ziņoja, ka sēklinieka epitēlija šūnas ražo un izdala specifisku olbaltumvielu, kas nepieciešama vienas poras sēklas traktu veidošanai. Autori arī ziņo, ka šo saišķu izkliede ir atkarīga no sēklinieka olbaltumvielu mijiedarbības. Niksons un līdzautori28 atklāja, ka piedēkļi izdala olbaltumvielu - skābu cisteīnam bagātu osteonektīnu; SPARC ir iesaistīts spermatozoīdu kušķu veidošanā īsknābja ehidnās un pīļknābjos. Šo staru izkliede ir saistīta ar šī proteīna zudumu.
Pašreizējā pētījumā ultrastrukturālā analīze, izmantojot elektronmikroskopiju, parādīja, ka spermatozoīdi ir pielipuši lielam daudzumam blīva materiāla. Tiek uzskatīts, ka šīs vielas ir atbildīgas par aglutināciju, kas kondensējas starp un ap pielipušajām galviņām, bet zemākā koncentrācijā astes rajonā. Mēs pieņemam, ka šī aglutinējošā viela tiek izvadīta no tēviņu reproduktīvās sistēmas (sēklinieka piedēkļa vai sēklvada) kopā ar spermu, jo ejakulācijas laikā mēs bieži novērojam spermas atdalīšanos no limfas un sēklas plazmas. Ir ziņots, ka putnu spermatozoīdiem, izejot cauri sēklinieka piedēklim un sēklvadam, notiek ar nobriešanu saistītas izmaiņas, kas atbalsta to spēju saistīties ar olbaltumvielām un iegūt ar plazmas lemmu saistītus glikoproteīnus. Šo olbaltumvielu noturība uz spermatozoīdu membrānām SST liecina, ka šie proteīni var ietekmēt spermatozoīdu membrānu stabilitātes iegūšanu30 un noteikt to auglību31. Ahammad et al32 ziņoja, ka spermatozoīdi, kas iegūti no dažādām vīriešu reproduktīvās sistēmas daļām (no sēkliniekiem līdz distālajam sēklas vadam), uzrādīja pakāpenisku dzīvotspējas pieaugumu šķidrā uzglabāšanas apstākļos neatkarīgi no uzglabāšanas temperatūras, un vistu dzīvotspēja palielinās arī olvados pēc mākslīgās apsēklošanas.
Šarkaši vistu spermas saišķiem ir atšķirīgas īpašības un funkcijas nekā citām sugām, piemēram, ehidnām, pīļknābjiem, meža pelēm, briežu žurkām un jūrascūciņām. Šarkaši vistām spermatozoīdu saišķu veidošanās samazināja to peldēšanas ātrumu salīdzinājumā ar atsevišķiem spermatozoīdiem. Tomēr šie saišķi palielināja reoloģiski pozitīvo spermatozoīdu procentuālo daudzumu un palielināja spermatozoīdu spēju stabilizēties dinamiskā vidē. Tādējādi mūsu rezultāti apstiprina iepriekšējo pieņēmumu, ka spermatozoīdu aglutinācija SST ir saistīta ar ilgstošu spermatozoīdu uzglabāšanu. Mēs arī izvirzām hipotēzi, ka spermatozoīdu tieksme veidot saišķus var kontrolēt spermatozoīdu zuduma ātrumu SST, kas var mainīt spermatozoīdu konkurences iznākumu. Saskaņā ar šo pieņēmumu spermatozoīdi ar zemu aglutinācijas spēju vispirms atbrīvo SST, savukārt spermatozoīdi ar augstu aglutinācijas spēju rada lielāko daļu pēcnācēju. Vienporu spermatozoīdu saišķu veidošanās ir labvēlīga un ietekmē vecāku un bērnu attiecību, bet izmanto atšķirīgu mehānismu. Ehidnām un pīļknābjiem spermatozoīdi ir izvietoti paralēli viens otram, lai palielinātu stara kustības ātrumu uz priekšu. Ehidnu saišķi pārvietojas apmēram trīs reizes ātrāk nekā atsevišķi spermatozoīdi. Tiek uzskatīts, ka šādu spermatozoīdu kušķu veidošanās ehidnām ir evolucionāra adaptācija, lai saglabātu dominējošo stāvokli, jo mātītes ir juceklīgas un parasti pārojas ar vairākiem tēviņiem. Tāpēc dažādu ejakulātu spermatozoīdi sīvi konkurē par olšūnas apaugļošanu.
Šarkasi vistu aglutinētos spermatozoīdus ir viegli vizualizēt, izmantojot fāzu kontrasta mikroskopiju, kas tiek uzskatīta par priekšrocību, jo tā ļauj viegli pētīt spermatozoīdu uzvedību in vitro. Mehānisms, ar kuru spermatozoīdu kušķu veidošanās veicina vairošanos šarkasi vistām, atšķiras arī no tā, kas novērots dažiem placentas zīdītājiem, kas pārstāv kooperatīvu spermatozoīdu uzvedību, piemēram, meža pelēm, kur daži spermatozoīdi sasniedz olas, palīdzot citiem radniecīgiem īpatņiem sasniegt un sabojāt savas olas. pierādīt sevi. altruistiska uzvedība. pašapaugļošanās 34. Vēl viens spermatozoīdu kooperatīvās uzvedības piemērs tika atrasts briežu pelēm, kur spermatozoīdi spēja identificēt un apvienoties ar ģenētiski visradnieciskākajiem spermatozoīdiem un veidot kooperatīvas grupas, lai palielinātu savu ātrumu salīdzinājumā ar neradniecīgiem spermatozoīdiem 35.
Šajā pētījumā iegūtie rezultāti nav pretrunā ar Fomana teoriju par spermatozoīdu ilgstošu uzglabāšanu olvadu vadā (SWS). Pētnieki ziņo, ka spermatozoīdi ilgstoši turpina kustēties SST oderējošo epitēlija šūnu plūsmā, un pēc noteikta laika spermatozoīdu enerģijas krājumi tiek izsmelti, kā rezultātā samazinās ātrums, kas ļauj izspiest mazas molekulmasas vielas. Šajā pētījumā mēs novērojām, ka pusei no atsevišķajiem spermatozoīdiem bija spēja peldēt pret plūstošiem šķidrumiem, un to adhēzija kūlītī palielināja to spēju uzrādīt pozitīvu reoloģiju. Turklāt mūsu dati saskan ar Matsuzaki et al. 1 datiem, kuri ziņoja, ka palielināta laktāta sekrēcija SST var kavēt rezidentu spermatozoīdu kustīgumu. Tomēr mūsu rezultāti apraksta spermatozoīdu kustīgo saišu veidošanos un to reoloģisko uzvedību dinamiskā vidē mikrokanālā, mēģinot noskaidrot to uzvedību SST. Turpmākie pētījumi varētu būt vērsti uz aglutinējošā aģenta ķīmiskā sastāva un izcelsmes noteikšanu, kas neapšaubāmi palīdzēs pētniekiem izstrādāt jaunus veidus, kā uzglabāt šķidru spermu un palielināt auglības ilgumu.
Pētījumā par spermas donoriem tika atlasīti piecpadsmit 30 nedēļas veci kaila kakla tēviņi ar šarkasi (homozigoti dominējošie; Na Na). Putni tika audzēti Ašitas universitātes Lauksaimniecības fakultātes Pētniecības mājputnu fermā Ašitas guberņā, Ēģiptē. Putni tika izmitināti atsevišķos sprostos (30 x 40 x 40 cm), pakļauti gaismas programmai (16 stundas gaismas un 8 stundas tumsas) un baroti ar barību, kas saturēja 160 g neapstrādāta proteīna, 2800 kcal metabolizējamās enerģijas, 35 g kalcija katrā sprostā. 5 grami pieejamā fosfora uz kilogramu barības.
Saskaņā ar datiem 36, 37, sperma no tēviņiem tika savākta ar vēdera masāžas palīdzību. Kopumā 3 dienu laikā no 15 vīriešiem tika savākti 45 spermas paraugi. Sperma (n = 15/dienā) nekavējoties tika atšķaidīta 1:1 (v:v) ar Belsville mājputnu spermas atšķaidītāju, kas satur kālija difosfātu (1,27 g), mononātrija glutamāta monohidrātu (0,867 g), fruktozi (0,5 d), bezūdens nātrija acetātu (0,43 g), tris(hidroksimetil)aminometānu (0,195 g), kālija citrāta monohidrātu (0,064 g), kālija monofosfātu (0,065 g), magnija hlorīdu (0,034 g) un H2O (100 ml), pH = 7,5, osmolaritāte 333 mOsm/kg38. Atšķaidītus spermas paraugus vispirms pārbaudīja gaismas mikroskopā, lai nodrošinātu labu spermas kvalitāti (mitrumu), un pēc tam uzglabāja ūdens vannā 37°C temperatūrā līdz izmantošanai pusstundas laikā pēc savākšanas.
Spermatozoīdu kinemātika un reoloģija tiek aprakstīta, izmantojot mikrofluidikas ierīču sistēmu. Spermas paraugi tika tālāk atšķaidīti līdz 1:40 Beltsville putnu spermas atšķaidītājā, ielādēti mikrofluidikas ierīcē (skatīt zemāk), un kinētiskie parametri tika noteikti, izmantojot datorizētu spermas analīzes (CASA) sistēmu, kas iepriekš izstrādāta mikrofluidikas raksturošanai. par spermatozoīdu mobilitāti šķidrā vidē (Mašīnbūves katedra, Inženierzinātņu fakultāte, Asjūtas Universitāte, Ēģipte). Spraudni var lejupielādēt no: http://www.assiutmicrofluidics.com/research/casa39. Tika mērīts līknes ātrums (VCL, μm/s), lineārais ātrums (VSL, μm/s) un vidējais trajektorijas ātrums (VAP, μm/s). Spermatozoīdu videoieraksti tika uzņemti, izmantojot apgrieztu Optika XDS-3 fāzes kontrasta mikroskopu (ar 40x objektīvu), kas pievienots Tucson ISH1000 kamerai ar ātrumu 30 kadri sekundē 3 sekundes. Izmantojiet CASA programmatūru, lai izpētītu vismaz trīs apgabalus un 500 spermatozoīdu trajektorijas katrā paraugā. Ierakstītais video tika apstrādāts, izmantojot paštaisītu CASA programmatūru. Kustīguma definīcija CASA spraudnī ir balstīta uz spermatozoīdu peldēšanas ātrumu salīdzinājumā ar plūsmas ātrumu, un neietver citus parametrus, piemēram, kustību no vienas puses uz otru, jo ir konstatēts, ka tā ir uzticamāka šķidruma plūsmā. Reoloģiskā kustība tiek aprakstīta kā spermatozoīdu kustība pretēji šķidruma plūsmas virzienam. Spermatozoīdi ar reoloģiskām īpašībām tika dalīti ar kustīgo spermatozoīdu skaitu; spermatozoīdi, kas atradās miera stāvoklī, un konvektīvi kustīgie spermatozoīdi tika izslēgti no skaita.
Visas izmantotās ķīmiskās vielas tika iegūtas no Elgomhoria Pharmaceuticals (Kaira, Ēģipte), ja vien nav norādīts citādi. Ierīce tika ražota, kā aprakstīts El-sherry et al.40, ar dažām modifikācijām. Mikrokanālu izgatavošanai izmantotie materiāli ietvēra stikla plāksnes (Howard Glass, Worcester, MA), SU-8-25 negatīvo rezistoru (MicroChem, Newton, CA), diacetona spirtu (Sigma Aldrich, Steinheim, Vācija) un poliacetonu 0-184, Dow Corning, Midland, Mičigana). Mikrokanāli tiek izgatavoti, izmantojot mīksto litogrāfiju. Vispirms uz augstas izšķirtspējas printera (Prismatic, Cairo, Egypt and Pacific Arts and Design, Markham, ON) tika izdrukāta caurspīdīga aizsargmaska ​​ar vēlamo mikrokanālu dizainu. Meistari tika izgatavoti, izmantojot stikla plāksnes kā substrātus. Plāksnes tika tīrītas acetonā, izopropanolā un dejonizētā ūdenī un pēc tam pārklātas ar 20 µm SU8-25 slāni, izmantojot centrifūgas pārklāšanu (3000 apgr./min, 1 minūte). Pēc tam SU-8 slāņus uzmanīgi žāvēja (65°C, 2 minūtes un 95°C, 10 minūtes) un 50 sekundes pakļāva UV starojumam. Pēc ekspozīcijas cepeškrāsnī 65°C un 95°C temperatūrā 1 minūti un 4 minūtes, lai veidotu pakļauto SU-8 slāņu šķērssavienojumus, kam sekoja attīstīšana diacetona spirtā 6,5 minūtes. Vafeles cepeškrāsnī (200°C 15 minūtes), lai vēl vairāk sacietētu SU-8 slāni.
PDMS tika sagatavots, sajaucot monomēru un cietinātāju svara attiecībā 10:1, pēc tam degazēts vakuuma eksikatorā un ieliets uz SU-8 galvenā rāmja. PDMS tika sacietināta krāsnī (120 °C, 30 min), pēc tam kanāli tika izgriezti, atdalīti no pamatmateriāla un perforēti, lai caurules varētu piestiprināt pie mikrokanāla ieejas un izejas. Visbeidzot, PDMS mikrokanāli tika pastāvīgi piestiprināti mikroskopa stikliņiem, izmantojot pārnēsājamu koronas procesoru (Electro-Technic Products, Čikāga, IL), kā aprakstīts citur. Šajā pētījumā izmantotā mikrokanāla izmēri ir 200 µm × 20 µm (platums × augstums) un garums 3,6 cm.
Mikrokanāla iekšpusē esošā hidrostatiskā spiediena izraisītā šķidruma plūsma tiek panākta, uzturot šķidruma līmeni ieplūdes rezervuārā virs augstuma starpības Δh39 izplūdes rezervuārā (1. att.).
kur f ir berzes koeficients, kas definēts kā f = C/Re laminārai plūsmai taisnstūra kanālā, kur C ir konstante, kas atkarīga no kanāla malu attiecības, L ir mikrokanāla garums, Vav ir vidējais ātrums mikrokanāla iekšpusē, Dh ir kanāla hidrauliskais diametrs, g – brīvās krišanas paātrinājums. Izmantojot šo vienādojumu, vidējo kanāla ātrumu var aprēķināt, izmantojot šādu vienādojumu: