Paldies, ka apmeklējāt vietni Nature.com. Jūs izmantojat pārlūkprogrammas versiju ar ierobežotu CSS atbalstu. Lai nodrošinātu vislabāko pieredzi, iesakām izmantot atjauninātu pārlūkprogrammu (vai atspējot saderības režīmu pārlūkprogrammā Internet Explorer). Turklāt, lai nodrošinātu nepārtrauktu atbalstu, vietne tiek rādīta bez stiliem un JavaScript.
Nesen tika izstrādāta ķīmiski nesaturoša antimikrobiāla platforma, kuras pamatā ir nanotehnoloģija, izmantojot mākslīgās ūdens nanostruktūras (EWNS). EWNS ir augsts virsmas lādiņš un bagātas ar reaktīvām skābekļa sugām (ROS), kas var mijiedarboties ar vairākiem mikroorganismiem, tostarp pārtikas izraisītiem patogēniem, un tos inaktivēt. Šeit parādīts, ka to īpašības sintēzes laikā var precīzi noregulēt un optimizēt, lai vēl vairāk uzlabotu to antibakteriālo potenciālu. EWNS laboratorijas platforma tika izstrādāta, lai precīzi noregulētu EWNS īpašības, mainot sintēzes parametrus. EWNS īpašību raksturojums (lādiņš, izmērs un ROS saturs) tika veikts, izmantojot modernas analītiskās metodes. Turklāt pārtikas mikroorganismi, piemēram, Escherichia coli, Salmonella enterica, Listeria innocua, Mycobacterium para fortitum un Saccharomyces cerevisiae, tika inokulēti uz bioloģisko vīnogu tomātu virsmas, lai novērtētu to mikrobu inaktivācijas potenciālu. Šeit sniegtie rezultāti parāda, ka EWNS īpašības var precīzi noregulēt sintēzes laikā, kā rezultātā eksponenciāli palielinās inaktivācijas efektivitāte. Jo īpaši virsmas lādiņš palielinājās četras reizes, un ROS saturs palielinājās. Mikrobu izvadīšanas ātrums bija atkarīgs no mikrobiem un svārstījās no 1,0 līdz 3,8 log pēc 45 minūšu ilgas aerosola devas 40 000 #/cm3 EWNS iedarbības.
Mikrobu piesārņojums ir galvenais pārtikas izraisītu slimību cēlonis, ko izraisa patogēnu vai to toksīnu uzņemšana. Pārtikas izraisītas slimības katru gadu tikai Amerikas Savienotajās Valstīs ir aptuveni 76 miljonu slimību, 325 000 hospitalizāciju un 5000 nāves gadījumu cēlonis1. Turklāt Amerikas Savienoto Valstu Lauksaimniecības departaments (USDA) lēš, ka palielināts svaigu produktu patēriņš ir atbildīgs par 48 procentiem no visām Amerikas Savienotajās Valstīs ziņotajām pārtikas izraisītajām slimībām2. Slimību un nāves gadījumu izmaksas, ko rada pārtikas izraisīti patogēni, Amerikas Savienotajās Valstīs ir ļoti augstas, un Slimību kontroles un profilakses centri (CDC) tās lēš vairāk nekā 15,6 miljardu ASV dolāru apmērā gadā3.
Pašlaik ķīmiskās4, radiācijas5 un termiskās6 antimikrobiālās intervences pārtikas nekaitīguma nodrošināšanai galvenokārt tiek īstenotas ierobežotos kritiskajos kontroles punktos (KKP) ražošanas ķēdē (parasti pēc ražas novākšanas un/vai iepakošanas laikā), nevis nepārtraukti tā, lai svaigi produkti būtu pakļauti savstarpējai piesārņošanai7. Antimikrobiālās intervences ir nepieciešamas, lai labāk kontrolētu ar pārtiku saistītas slimības un pārtikas bojāšanos, un tās varētu piemērot visā procesā no lauka līdz galdam. Mazāka ietekme un izmaksas.
Nesen ir izstrādāta uz nanotehnoloģijām balstīta ķīmiski nesaturoša antimikrobiāla platforma, lai inaktivētu baktērijas uz virsmām un gaisā, izmantojot mākslīgās ūdens nanostruktūras (EWNS). EVNS sintēzei tika izmantoti divi paralēli procesi: elektroizsmidzināšana un ūdens jonizācija (1.a att.). Iepriekš ir pierādīts, ka EWNS piemīt unikāls fizikālo un bioloģisko īpašību kopums8,9,10. EWNS vidēji ir 10 elektroni uz struktūru un vidējais nanometra izmērs ir 25 nm (1.b,c att.)8,9,10. Turklāt elektronu spina rezonanse (ESR) parādīja, ka EWNS satur lielu daudzumu reaktīvo skābekļa sugu (ROS), galvenokārt hidroksilradikāļus (OH•) un superoksīda (O2-) radikāļus (1.c att.)8. EWNS ilgstoši atradās gaisā un varēja sadurties ar gaisā suspendētiem un uz virsmām esošiem mikrobiem, piegādājot savu ROS lietderīgo kravu un izraisot mikrobu inaktivāciju (1.d att.). Šie agrākie pētījumi arī parādīja, ka EWNS var mijiedarboties ar dažādām sabiedrības veselībai nozīmīgām gramnegatīvām un grampozitīvām baktērijām, tostarp mikobaktērijām, uz virsmām un gaisā8,9, un inaktivēt tās. Transmisijas elektronu mikroskopija parādīja, ka inaktivāciju izraisīja šūnu membrānas bojājumi. Turklāt akūtas ieelpošanas pētījumi ir parādījuši, ka lielas EWNS devas neizraisa plaušu bojājumus vai iekaisumu8.
(a) Elektroizsmidzināšana notiek, kad starp kapilāru, kas satur šķidrumu, un pretelektrodu tiek pielikts augstspriegums. (b) Augstsprieguma pielietošana rada divas dažādas parādības: (i) ūdens elektroizsmidzināšanu un (ii) reaktīvo skābekļa sugu (jonu) veidošanos, kas iesprostoti EWNS. (c) EWNS unikālā struktūra. (d) EWNS ir ļoti mobili to nanoskalas rakstura dēļ un var mijiedarboties ar gaisā esošiem patogēniem.
Nesen ir pierādīta arī EWNS antimikrobiālās platformas spēja inaktivēt pārtikas izraisītus mikroorganismus uz svaigas pārtikas virsmas. Ir arī pierādīts, ka EWNS virsmas lādiņu var izmantot kombinācijā ar elektrisko lauku mērķtiecīgai piegādei. Vēl svarīgāk ir tas, ka daudzsološs sākotnējais rezultāts - aptuveni 1,4 log samazinājums organisko tomātu aktivitātē pret dažādiem pārtikas mikroorganismiem, piemēram, E. coli un Listeria, tika novērots 90 minūšu laikā pēc iedarbības ar EWNS koncentrāciju aptuveni 50 000#/cm311. Turklāt provizoriskie organoleptiskās novērtēšanas testi neuzrādīja organoleptisku efektu salīdzinājumā ar kontroles tomātu. Lai gan šie sākotnējie inaktivācijas rezultāti sola pārtikas drošību pat pie ļoti zemām EWNS devām 50 000#/cc (sk.), ir skaidrs, ka augstāks inaktivācijas potenciāls būtu labvēlīgāks, lai vēl vairāk samazinātu infekcijas un bojāšanās risku.
Šeit mēs koncentrēsimies uz EWNS ģenerēšanas platformas izstrādi, lai precīzi noregulētu sintēzes parametrus un optimizētu EWNS fizikāli ķīmiskās īpašības, lai uzlabotu to antibakteriālo potenciālu. Optimizācija ir īpaši vērsta uz to virsmas lādiņa palielināšanu (lai uzlabotu mērķtiecīgu piegādi) un ROS satura palielināšanu (lai uzlabotu inaktivācijas efektivitāti). Optimizēto fizikāli ķīmisko īpašību (izmērs, lādiņš un ROS saturs) raksturošana, izmantojot modernas analītiskās metodes un tādus izplatītus pārtikas mikroorganismus kā E. coli, S. enterica, L. innocua, S. cerevisiae un M. parafortuitum.
EVNS tika sintezēts, vienlaikus izmantojot augstas tīrības pakāpes ūdens (18 MΩ cm–1) elektroizsmidzināšanu un jonizāciju. Elektrisko atomizatoru 12 parasti izmanto šķidrumu, sintētisko polimēru un keramikas daļiņu 13 un kontrolēta izmēra šķiedru 14 atomizēšanai.
Kā detalizēti aprakstīts iepriekšējās publikācijās 8, 9, 10, 11, tipiskā eksperimentā starp metāla kapilāru un iezemētu pretelektrodu tiek pielikts augstspriegums. Šī procesa laikā notiek divas dažādas parādības: 1) elektroizsmidzināšana un 2) ūdens jonizācija. Spēcīgs elektriskais lauks starp abiem elektrodiem izraisa negatīvu lādiņu uzkrāšanos uz kondensētā ūdens virsmas, kā rezultātā veidojas Teilora konusi. Rezultātā veidojas ļoti lādēti ūdens pilieni, kas turpina sadalīties mazākās daļiņās saskaņā ar Releja teoriju16. Vienlaikus spēcīgs elektriskais lauks izraisa dažu ūdens molekulu sadalīšanos un elektronu atdalīšanos (jonizācija), tādējādi radot lielu daudzumu reaktīvo skābekļa sugu (ROS)17. Vienlaikus ģenerētās ROS18 paketes tika iekapsulētas EWNS (1.c attēls).
2.a attēlā redzama šajā pētījumā izstrādātā un izmantotā EWNS ģenerēšanas sistēma. Attīrīts ūdens, kas uzglabāts slēgtā pudelē, tika padots caur teflona caurulīti (2 mm iekšējais diametrs) uz 30G nerūsējošā tērauda adatu (metāla kapilāru). Kā parādīts 2.b attēlā, ūdens plūsmu kontrolē gaisa spiediens pudeles iekšpusē. Adata ir piestiprināta pie teflona konsoles, kuru var manuāli regulēt noteiktā attālumā no pretelektroda. Pretelektrods ir pulēts alumīnija disks ar caurumu vidū paraugu ņemšanai. Zem pretelektroda atrodas alumīnija paraugu ņemšanas piltuve, kas ir savienota ar pārējo eksperimentālo iekārtu caur paraugu ņemšanas portu (2.b attēls). Visas paraugu ņemšanas ierīces sastāvdaļas ir elektriski iezemētas, lai izvairītos no lādiņa uzkrāšanās, kas varētu pasliktināt daļiņu paraugu ņemšanu.
(a) Inženierijas ceļā iegūta ūdens nanostruktūras ģenerēšanas sistēma (EWNS). (b) Paraugu ņemšanas ierīces un elektrosmidzināšanas iekārtas šķērsgriezums, kurā parādīti svarīgākie parametri. (c) Eksperimentāla iekārta baktēriju inaktivācijai.
Iepriekš aprakstītā EWNS ģenerēšanas sistēma spēj mainīt galvenos darbības parametrus, lai atvieglotu EWNS īpašību precīzu regulēšanu. Pielāgojiet pielietoto spriegumu (V), attālumu starp adatu un pretelektrodu (L) un ūdens plūsmu (φ) caur kapilāru, lai precīzi noregulētu EWNS raksturlielumus. Simboli [V (kV), L (cm)] tiek izmantoti, lai apzīmētu dažādas kombinācijas. Pielāgojiet ūdens plūsmu, lai iegūtu stabilu Teilora konusu ar noteiktu kopu [V, L]. Šī pētījuma vajadzībām pretelektroda (D) apertūra tika iestatīta uz 0,5 collām (1,29 cm).
Ierobežotās ģeometrijas un asimetrijas dēļ elektriskā lauka stiprumu nevar aprēķināt, pamatojoties uz pirmajiem principiem. Tā vietā elektriskā lauka aprēķināšanai tika izmantota QuickField™ programmatūra (Svendborga, Dānija)19. Elektriskais lauks nav vienmērīgs, tāpēc elektriskā lauka vērtība kapilāra galā tika izmantota kā atsauces vērtība dažādām konfigurācijām.
Pētījuma laikā tika novērtētas vairākas sprieguma un attāluma starp adatu un pretelektrodu kombinācijas, ņemot vērā Teilora konusa veidošanos, Teilora konusa stabilitāti, EWNS ražošanas stabilitāti un reproducējamību. Dažādas kombinācijas ir parādītas 1. papildtabulā.
EWNS ģenerēšanas sistēmas izeja bija tieši savienota ar skenējošās mobilitātes daļiņu izmēru noteicēju (SMPS, modelis 3936, TSI, Shoreview, Minesota), lai mērītu daļiņu skaita koncentrāciju, un tika izmantota kopā ar Faraday aerosola elektrometru (TSI, modelis 3068B, Shoreview, ASV). MN), lai mērītu aerosola plūsmas, kā aprakstīts mūsu iepriekšējā publikācijā9. Gan SMPS, gan aerosola elektrometra paraugi tika ņemti ar plūsmas ātrumu 0,5 L/min (kopējā parauga plūsma 1 L/min). Daļiņu koncentrācijas un aerosola plūsmas tika mērītas 120 sekundes. Mērījumu atkārtojiet 30 reizes. Kopējais aerosola lādiņš tiek aprēķināts no strāvas mērījumiem, un vidējais EWNS lādiņš tiek novērtēts no kopējā ņemto EWNS daļiņu skaita. EWNS vidējās izmaksas var aprēķināt, izmantojot (1) vienādojumu:
kur IEl ir izmērītā strāva, NSMPS ir ar SMPS izmērītā skaitliskā koncentrācija un φEl ir plūsmas ātrums uz elektrometru.
Tā kā relatīvais mitrums (RH) ietekmē virsmas lādiņu, eksperimenta laikā temperatūra un (RH) tika uzturēti nemainīgi attiecīgi 21 °C un 45 % līmenī.
EWNS izmēra un dzīves ilguma mērīšanai tika izmantota atomspēka mikroskopija (AFM), Asylum MFP-3D (Asylum Research, Santa Barbara, Kalifornija) un AC260T zonde (Olympus, Tokija, Japāna). AFM skenēšanas frekvence ir 1 Hz, un skenēšanas laukums ir 5 µm × 5 µm ar 256 skenēšanas līnijām. Visiem attēliem tika veikta pirmās kārtas attēlu izlīdzināšana, izmantojot Asylum programmatūru (maska ​​ar diapazonu 100 nm un slieksni 100 pm).
Noņemiet paraugu ņemšanas piltuvi un novietojiet vizlas virsmu 2,0 cm attālumā no pretelektroda vidēji uz 120 s, lai izvairītos no daļiņu saplūšanas un neregulāru pilienu veidošanās uz vizlas virsmas. EWNS tika uzklāts tieši uz svaigi grieztām vizlas virsmām (Ted Pella, Redding, CA). Tūlīt pēc izsmidzināšanas vizlas virsma tika vizualizēta, izmantojot AFM. Svaigi grieztas nemodificētas vizlas virsmas saskares leņķis ir tuvu 0°, tāpēc EWNS izplatās pa vizlas virsmu kupolveida formā20. Difūzējošo pilienu diametrs (a) un augstums (h) tika mērīti tieši no AFM topogrāfijas un izmantoti, lai aprēķinātu kupolveida difūzijas tilpumu EWNS, izmantojot mūsu iepriekš validēto metodi8. Pieņemot, ka iebūvētajam EVNS ir tāds pats tilpums, ekvivalento diametru var aprēķināt no vienādojuma (2):
Saskaņā ar mūsu iepriekš izstrādāto metodi, īslaicīgu radikāļu starpproduktu klātbūtnes noteikšanai EWNS tika izmantots elektronu spina rezonanses (ESR) spina slazds. Aerosoli tika izlaisti caur šķīdumu, kas saturēja 235 mM DEPMPO (5-(dietoksifosforil)-5-metil-1-pirolīn-N-oksīdu) (Oxis International Inc., Portlenda, Oregona). Visi EPR mērījumi tika veikti, izmantojot Bruker EMX spektrometru (Bruker Instruments Inc. Billerica, MA, ASV) un plakanās šūnas. Datu apkopošanai un analīzei tika izmantota Acquisit programmatūra (Bruker Instruments Inc. Billerica, MA, ASV). ROS raksturojums tika veikts tikai noteiktam darbības apstākļu kopumam [-6,5 kV, 4,0 cm]. EWNS koncentrācijas tika mērītas, izmantojot SMPS, ņemot vērā EWNS zudumu impaktorā.
Ozona līmenis tika kontrolēts, izmantojot 205 Dual Beam Ozone Monitor™ (2B Technologies, Boulder, Colorado)8,9,10.
Visiem EWNS rekvizītiem mērījuma vērtība ir mērījumu vidējā vērtība, un mērījuma kļūda ir standartnovirze. Lai salīdzinātu optimizētā EWNS atribūta vērtību ar atbilstošo bāzes EWNS vērtību, tika veikts t-tests.
2.c attēlā redzama iepriekš izstrādāta un raksturota elektrostatiskās nogulsnēšanās caurlaidības sistēma (EPES), ko var izmantot, lai mērķētu EWNS11 uz virsmām. EPES izmanto EWNS lādiņu kombinācijā ar spēcīgu elektrisko lauku, lai “norādītu” tieši uz mērķa virsmu. Sīkāka informācija par EPES sistēmu ir sniegta nesenā Pyrgiotakis et al.11 publikācijā. Tādējādi EPES sastāv no 3D drukātas PVC kameras ar konusveida galiem, kuru vidū ir divas paralēlas nerūsējošā tērauda (304 nerūsējošais tērauds, spoguļpulēts) metāla plāksnes 15,24 cm attālumā viena no otras. Plātnes bija savienotas ar ārēju augstsprieguma avotu (Bertran 205B-10R, Spellman, Hauppauge, NY), apakšējā plātne vienmēr bija pozitīva, bet augšējā plātne vienmēr bija iezemēta (peldoša). Kameras sienas ir pārklātas ar alumīnija foliju, kas ir elektriski iezemēta, lai novērstu daļiņu zudumu. Kamerai ir noslēgtas priekšējās ielādes durvis, kas ļauj novietot testa virsmas uz plastmasas statīviem, paceļot tās no apakšējās metāla plāksnes, lai izvairītos no augstsprieguma traucējumiem.
EWNS nogulsnēšanās efektivitāte EPES tika aprēķināta saskaņā ar iepriekš izstrādātu protokolu, kas sīki aprakstīts S111. papildattēlā.
Kā vadības kamera otrā plūsma caur cilindrisko kameru ir savienota virknē ar EPES sistēmu, izmantojot starpposma HEPA filtru, lai noņemtu EWNS. Kā parādīts 2.c attēlā, EWNS aerosols tika sūknēts caur divām virknē savienotām kamerām. Filtrs starp vadības telpu un EPES noņem visus atlikušos EWNS, kā rezultātā tiek saglabāta tāda pati temperatūra (T), relatīvais mitrums (RH) un ozona līmenis.
Ir konstatēti svarīgi pārtikas mikroorganismi, kas piesārņo svaigus produktus, piemēram, Escherichia coli (ATCC #27325), fekāliju indikators, Salmonella enterica (ATCC #53647), pārtikas patogēns, Listeria innocua (ATCC #33090), alternatīva patogēnajai Listeria monocytogenes. No ATCC (Manasasa, Virdžīnija) iegādātas dzīvas baktērijas Saccharomyces cerevisiae (ATCC #4098) kā alternatīva bojāšanās raugam un Mycobacterium parafortuitous (ATCC #19686) kā izturīgāka baktērija.
Nejauši izvēlētās kastēs iegādājieties bioloģisko vīnogu tomātu no vietējā tirgus un uzglabājiet ledusskapī 4°C temperatūrā līdz lietošanai (līdz 3 dienām). Eksperimentam izvēlieties viena izmēra tomātus, apmēram 1,25 cm diametrā.
Inkubācijas, inokulācijas, iedarbības un koloniju skaitīšanas protokoli ir detalizēti aprakstīti mūsu iepriekšējās publikācijās un detalizēti izskaidroti 11. papilddatos. EWNS veiktspēja tika novērtēta, inokulētos tomātus 45 minūtes pakļaujot 40 000 #/cm3 iedarbībai. Īsumā, laikā t = 0 min, izdzīvojušo mikroorganismu novērtēšanai tika izmantoti trīs tomāti. Trīs tomāti tika ievietoti EPES un pakļauti EWNS iedarbībai ar 40 000 #/cc (EWNS pakļautie tomāti), bet trīs citi tika ievietoti kontroles kamerā (kontroles tomāti). Neviena no tomātu grupām netika pakļauta papildu apstrādei. Ar EWNS pakļautie tomāti un kontroles grupas tika izņemtas pēc 45 minūtēm, lai novērtētu EWNS ietekmi.
Katrs eksperiments tika veikts trīs eksemplāros. Datu analīze tika veikta saskaņā ar protokolu, kas aprakstīts Papildu datos.
E. coli, Enterobacter un L. innocua baktēriju paraugi, kas tika pakļauti EWNS (45 min, EWNS aerosola koncentrācija 40 000 #/cm3) un nepakļauti, tika sapresēti, lai novērtētu inaktivācijas mehānismus. Nogulsnes tika fiksētas 2 stundas istabas temperatūrā 0,1 M nātrija kakodilāta šķīdumā (pH 7,4) ar fiksatoru, kas sastāvēja no 2,5% glutaraldehīda, 1,25% paraformaldehīda un 0,03% pikrīnskābes. Pēc mazgāšanas tās tika fiksētas ar 1% osmija tetroksīdu (OsO4)/1,5% kālija ferocianīdu (KFeCN6) 2 stundas, 3 reizes mazgātas ar ūdeni un inkubētas 1% uranilacetātā 1 stundu, pēc tam divas reizes mazgātas ar ūdeni. Pēc tam dehidratācija 10 minūtes katru ar 50%, 70%, 90%, 100% spirtu. Pēc tam paraugus uz 1 stundu ievietoja propilēnoksīdā un piesūcināja ar propilēnoksīda un TAAP Epon (Marivac Canada Inc. St. Laurent, CA) maisījumu attiecībā 1:1. Paraugi tika iestrādāti TAAB Epon un polimerizēti 60°C temperatūrā 48 stundas. Sacietējušo granulēto sveķu šķiedras materiālu sagrieza un vizualizēja ar TEM, izmantojot JEOL 1200EX (JEOL, Tokija, Japāna) — parastu transmisijas elektronmikroskopu, kas aprīkots ar AMT 2k CCD kameru (Advanced Microscopy Techniques, Corp., Woburn, MA, ASV).
Visi eksperimenti tika veikti trīs eksemplāros. Katram laika punktam baktēriju mazgāšanas paraugi tika uzklāti trīs reizes, iegūstot kopumā deviņus datu punktus katrā punktā, kuru vidējais rādītājs tika izmantots kā baktēriju koncentrācija konkrētajam organismam. Standartnovirze tika izmantota kā mērījumu kļūda. Visi punkti tiek skaitīti.
Baktēriju koncentrācijas samazinājuma logaritms, salīdzinot ar t = 0 min, tika aprēķināts, izmantojot šādu formulu:
kur C0 ir baktēriju koncentrācija kontroles paraugā laika momentā 0 (t. i., pēc virsmas nožūšanas, bet pirms ievietošanas kamerā) un Cn ir baktēriju koncentrācija uz virsmas pēc n minūšu iedarbības.
Lai ņemtu vērā baktēriju dabisko degradāciju 45 minūšu iedarbības periodā, logaritmiskā samazinājuma vērtība tika aprēķināta arī, salīdzinot ar kontroli 45 minūtēs:
Kur Cn ir baktēriju koncentrācija kontroles paraugā laikā n un Cn-Control ir kontroles baktēriju koncentrācija laikā n. Dati ir attēloti kā logaritmiska samazinājuma attiecība salīdzinājumā ar kontroli (bez EWNS iedarbības).
Pētījuma laikā tika novērtētas vairākas sprieguma un attāluma starp adatu un pretelektrodu kombinācijas, ņemot vērā Teilora konusa veidošanos, Teilora konusa stabilitāti, EWNS veidošanās stabilitāti un reproducējamību. Dažādas kombinācijas ir parādītas 1. papildtabulā. Pilnīgam pētījumam tika izvēlēti divi gadījumi, kas parāda stabilas un reproducējamas īpašības (Teilora konuss, EWNS veidošanās un stabilitāte laika gaitā). 3. attēlā ir parādīti divu gadījumu rezultāti par ROS lādiņu, izmēru un saturu. Rezultāti ir apkopoti arī 1. tabulā. Atsaucei 3. attēlā un 1. tabulā ir iekļautas iepriekš sintezēto neoptimizēto EWNS8, 9, 10, 11 (bāzes līnija — EWNS) īpašības. Statistiskās nozīmības aprēķini, izmantojot divpusēju t-testu, ir atkārtoti publicēti 2. papildtabulā. Turklāt papildu dati ietver pētījumus par pretelektroda paraugu ņemšanas atveres diametra (D) un attāluma starp zemējuma elektrodu un adatas galu (L) ietekmi (2. un 3. papildattēli).
(a–c) AFM izmēru sadalījums. (d–f) Virsmas lādiņa raksturlielums. (g) ROS un ESR raksturojums.
Svarīgi arī atzīmēt, ka visos iepriekš minētajos apstākļos izmērītās jonizācijas strāvas bija 2–6 µA diapazonā, un spriegumi bija no -3,8 līdz -6,5 kV, kā rezultātā šī viena termināļa EWNS enerģijas patēriņš bija mazāks par 50 mW. Lai gan EWNS tika sintezēts augstā spiedienā, ozona līmenis bija ļoti zems, nekad nepārsniedzot 60 ppb.
Papildu S4. attēlā parādīti simulētie elektriskie lauki attiecīgi [-6,5 kV, 4,0 cm] un [-3,8 kV, 0,5 cm] scenārijiem. Lauki saskaņā ar scenārijiem [-6,5 kV, 4,0 cm] un [-3,8 kV, 0,5 cm] ir aprēķināti attiecīgi kā 2 × 10⁶ V/m un 4,7 × 10⁶ V/m. Tas ir sagaidāms, jo otrajā gadījumā sprieguma un attāluma attiecība ir daudz lielāka.
3.a un 3.b attēlā redzams ar AFM8 izmērītais EWNS diametrs. Vidējie EWNS diametri scenārijos [-6,5 kV, 4,0 cm] un [-3,8 kV, 0,5 cm] tika aprēķināti attiecīgi kā 27 nm un 19 nm. Sadalījumu ģeometriskās standartnovirzes gadījumos [-6,5 kV, 4,0 cm] un [-3,8 kV, 0,5 cm] ir attiecīgi 1,41 un 1,45, kas norāda uz šauru izmēru sadalījumu. Gan vidējais izmērs, gan ģeometriskā standartnovirze ir ļoti tuvas bāzes EWNS, attiecīgi 25 nm un 1,41. 3.c attēlā redzams bāzes EWNS izmēru sadalījums, kas izmērīts, izmantojot to pašu metodi un tādos pašos apstākļos.
3.d,e attēlā parādīti lādiņa raksturojuma rezultāti. Dati ir 30 vienlaicīgu koncentrācijas (#/cm3) un strāvas (I) mērījumu vidējie mērījumi. Analīze rāda, ka vidējais lādiņš uz EWNS ir 22 ± 6 e- un 44 ± 6 e- attiecīgi [-6,5 kV, 4,0 cm] un [-3,8 kV, 0,5 cm]. Salīdzinot ar bāzes EWNS (10 ± 2 e-), to virsmas lādiņš ir ievērojami lielāks, divreiz lielāks nekā [-6,5 kV, 4,0 cm] scenārijā un četras reizes lielāks nekā [-3,8 kV, 0,5 cm]. 3.f attēlā parādīti EWNS pamata maksājumu dati.
No EWNS skaitļa koncentrācijas kartēm (S5. un S6. papildattēli) var redzēt, ka ainā [-6,5 kV, 4,0 cm] ir ievērojami lielāks daļiņu skaits nekā ainā [-3,8 kV, 0,5 cm]. Jāatzīmē arī, ka EWNS skaitļa koncentrācijas tika uzraudzītas līdz pat 4 stundām (S5. un S6. papildattēli), kur EWNS ģenerēšanas stabilitāte abos gadījumos uzrādīja vienādu daļiņu skaita koncentrācijas līmeni.
3.g attēlā redzams EPR spektrs pēc kontroles (fona) atņemšanas optimizētam EWNS pie [-6,5 kV, 4,0 cm]. ROS spektrs ir salīdzināts arī ar EWNS bāzes līniju iepriekš publicētā rakstā. Aprēķinātais EWNS skaits, kas reaģē ar spina slazdu, ir 7,5 × 104 EWNS/s, kas ir līdzīgs iepriekš publicētajam Baseline-EWNS8. EPR spektri skaidri norādīja uz divu veidu ROS klātbūtni, kur dominēja O2-, bet OH• bija mazākā daudzumā. Turklāt tieša pīķu intensitātes salīdzināšana parādīja, ka optimizētajam EWNS bija ievērojami augstāks ROS saturs salīdzinājumā ar bāzes EWNS.
4. attēlā redzama EWNS nogulsnēšanās efektivitāte EPES. Dati ir apkopoti arī I tabulā un salīdzināti ar sākotnējiem EWNS datiem. Abos EUNS gadījumos nogulsnēšanās bija tuvu 100% pat pie zema 3,0 kV sprieguma. Parasti 3,0 kV ir pietiekams, lai sasniegtu 100% nogulsnēšanos neatkarīgi no virsmas lādiņa izmaiņām. Tādos pašos apstākļos Baseline-EWNS nogulsnēšanās efektivitāte bija tikai 56% zemākā lādiņa dēļ (vidēji 10 elektroni uz EWNS).
5. attēlā un 2. tabulā ir apkopota uz tomātu virsmas inokulēto mikroorganismu inaktivācijas pakāpe pēc aptuveni 40 000 #/cm3 EWNS iedarbības 45 minūtes optimālā scenārijā [-6,5 kV, 4,0 cm]. Inokulētās E. coli un L. innocua uzrādīja ievērojamu samazinājumu par 3,8 log pēc 45 minūšu iedarbības. Tādos pašos apstākļos S. enterica uzrādīja mazāku logaritmisko samazinājumu par 2,2 logaritmiskajiem elementiem, savukārt S. cerevisiae un M. parafortuitum uzrādīja 1,0 logaritmisko samazinājumu.
Elektronmikrogrāfijas (6. attēls), kurās attēlotas EWNS izraisītās fizikālās izmaiņas E. coli, Salmonella enterica un L. innocua šūnās, kas noved pie inaktivācijas. Kontroles baktērijām bija neskartas šūnu membrānas, savukārt atklātajām baktērijām bija bojātas ārējās membrānas.
Kontroles un pakļauto baktēriju elektronmikroskopiskā attēlveidošana atklāja membrānas bojājumus.
Optimizēto EWNS fizikāli ķīmisko īpašību dati kopumā liecina, ka EWNS īpašības (virsmas lādiņš un ROS saturs) ir ievērojami uzlabojušās, salīdzinot ar iepriekš publicētajiem EWNS bāzes datiem8,9,10,11. No otras puses, to izmērs saglabājās nanometru diapazonā, kas ir ļoti līdzīgi iepriekš publicētajiem rezultātiem, ļaujot tiem ilgstoši uzturēties gaisā. Novēroto polidispersitāti var izskaidrot ar virsmas lādiņa izmaiņām, kas nosaka Releja efekta lielumu, nejaušību un EWNS iespējamo apvienošanos. Tomēr, kā detalizēti aprakstījis Nīlsens et al.22, augsts virsmas lādiņš samazina iztvaikošanu, efektīvi palielinot ūdens piliena virsmas enerģiju/spriegumu. Šī teorija tika eksperimentāli apstiprināta mikropilieniem22 un EWNS mūsu iepriekšējā publikācijā8. Laika gaitā radušies zudumi var ietekmēt arī izmēru un veicināt novēroto izmēru sadalījumu.
Turklāt lādiņš uz vienu struktūru ir aptuveni 22–44 e-, atkarībā no apstākļiem, kas ir ievērojami augstāks salīdzinājumā ar pamata EWNS, kuras vidējais lādiņš ir 10 ± 2 elektroni uz struktūru. Tomēr jāatzīmē, ka šis ir EWNS vidējais lādiņš. Seto et al. Ir pierādīts, ka lādiņš nav vienmērīgs un atbilst log-normālajam sadalījumam21. Salīdzinot ar mūsu iepriekšējo darbu, virsmas lādiņa dubultošana divkāršo nogulsnēšanas efektivitāti EPES sistēmā līdz gandrīz 100%11.