Paldies, ka apmeklējāt vietni Nature.com.Jūsu izmantotajai pārlūkprogrammas versijai ir ierobežots CSS atbalsts.Lai nodrošinātu vislabāko pieredzi, iesakām izmantot atjauninātu pārlūkprogrammu (vai izslēgt saderības režīmu pārlūkprogrammā Internet Explorer). Tikmēr, lai nodrošinātu nepārtrauktu atbalstu, vietne tiks rādīta bez stiliem un JavaScript.
Porainās silīcija dioksīda daļiņas tika sagatavotas ar sola-gēla metodi ar dažām modifikācijām, lai iegūtu makroporainas daļiņas.Šīs daļiņas tika atvasinātas ar atgriezeniskas pievienošanas fragmentācijas ķēdes pārneses (RAFT) polimerizāciju ar N-fenilmaleimīda-metilvinilizocianātu (PMI) un stirolu, lai sagatavotu N-fenilmaleimīda kolonnas fāzes (PMP-bezrindu tērauda interkalāciju). 00 × 1,8 mm id) tika iepakoti ar vircas iepakošanu. Novērtēta PMP kolonnas atdalīšana peptīdu maisījumā, kas sastāv no pieciem peptīdiem (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, cilvēka seruma un leicīna hromatogrāfijas un enkefalīna optimālās fermentācijas apstākļi)). , peptīdu maisījuma teorētiskais plākšņu skaits ir pat 280 000 plākšņu/m². Salīdzinot izstrādātās kolonnas atdalīšanas veiktspēju ar komerciālo Ascentis Express RP-Amide kolonnu, tika novērots, ka PMP kolonnas atdalīšanas veiktspēja bija pārāka par komerciālo kolonnu atdalīšanas efektivitātes un izšķirtspējas ziņā.
Pēdējos gados biofarmācijas nozare ir kļuvusi par globālu tirgu, kas paplašinās ar būtisku tirgus daļas pieaugumu. Biofarmācijas nozarei strauji augot1,2,3, ļoti vēlama ir peptīdu un proteīnu analīze. Papildus mērķa peptīdam peptīdu sintēzes laikā rodas vairāki piemaisījumi, līdz ar to ir nepieciešama fluīdu analīze, lai iegūtu hromatogrāfijas, peptīdu attīrīšanu un attīrīšanu. audi un šūnas ir ārkārtīgi sarežģīts uzdevums, jo vienā paraugā ir liels skaits potenciāli nosakāmu sugu. Lai gan masas spektrometrija ir efektīvs līdzeklis peptīdu un olbaltumvielu sekvencēšanai, ja šādus paraugus ievada masas spektrometrā vienā piegājienā, atdalīšana nebūs ideāla. Šo problēmu var mazināt, ieviešot šķidruma hromatogrāfijas (LC) analīzi, kas iepriekš samazina masas atdalīšanas (LC) analīzi. noteiktais laiks4,5,6.Turklāt šķidrās fāzes atdalīšanas laikā analīti var tikt fokusēti šauros apgabalos, tādējādi koncentrējot šos analītus un uzlabojot MS noteikšanas jutību. Šķidruma hromatogrāfija (LC) pēdējo desmit gadu laikā ir ievērojami attīstījusies un kļuvusi par populāru proteomiskās analīzes paņēmienu7,8,9,10.
Apgrieztās fāzes šķidruma hromatogrāfiju (RP-LC) plaši izmanto peptīdu maisījumu attīrīšanai un atdalīšanai, izmantojot oktadecilmodificētu silīcija dioksīdu (ODS) kā stacionāro fāzi. ir nepieciešams analizēt peptīdus un proteīnus ar polāriem un nepolāriem fragmentiem, lai mijiedarbotos ar šiem analītiem un saglabātu tos. ,20,21.Jauktā režīma stacionārās fāzes (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, polar intercalation/RPLC) ir piemērotas peptīdu un proteīnu atdalīšanai, jo tajās ir gan polārās, gan nepolārās grupas22,23,24,25,26,27,28 .Līdzīgi, unikālām polārajām jaudas grupām ar kopolāru jaudas selektivitāti un bonu selektivitāti tiek parādīta laba stacionārā jauda. -polārie analīti, jo atdalīšana ir atkarīga no mijiedarbības starp analizējamo vielu un stacionāro fāzi.Multimodāla mijiedarbība 29, 30, 31, 32. Nesen Zhang et al.30 sagatavoja dodecilgala poliamīna stacionāro fāzi un veiksmīgi atdalīja ogļūdeņražus, antidepresantus, flavonoīdus, nukleozīdus, estrogēnus un vairākas citas analizējamās vielas. Polārajā interkalatorā ir gan polāras, gan nepolāras grupas, tāpēc to var izmantot, lai atdalītu peptīdus un proteīnus, kuriem ir gan hidrofobās, gan hidrofilās kolonnas daļas. ir komerciāli pieejamas ar tirdzniecības nosaukumu Ascentis Express RP-Amide kolonnas, taču šīs kolonnas tiek izmantotas tikai amīna 33 analīzei.
Pašreizējā pētījumā tika sagatavota polāri iestrādāta stacionārā fāze (N-fenilmaleimīdā iestrādāts polistirols) un novērtēta HSA peptīdu un tripsīna sagremojuma atdalīšanai. Stacionārā fāze tika sagatavota, izmantojot šādu stratēģiju. Porainās silīcija dioksīda daļiņas tika sagatavotas saskaņā ar procedūru, kas sniegta mūsu iepriekšējā publikācijā ar dažām modifikācijām, polietilēna protokolu, polietilēna protokolu, TMOS. Tika pielāgota etiķskābe, lai sagatavotu silīcija dioksīda daļiņas ar lielu poru izmēru. Otrkārt, tika sintezēts jauns ligands, fenilmaleimīda-metilvinila izocianāts, un to izmantoja silīcija dioksīda daļiņu atvasināšanai, lai sagatavotu polāro iegulto stacionāro fāzi. Iegūtā stacionārā fāze tika iepakota mehāniskā iepakošanas shēmā ar nerūsējošā tērauda kolonnu (100 × 1 platums). kolonnas iekšienē veidojas viendabīga gultne. Novērtē peptīdu maisījumu, kas sastāv no pieciem peptīdiem, pildītās kolonnas atdalīšanu;(Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) un cilvēka seruma albumīna (HAS) sagremots tripsīns. Tika novērots, ka HSA peptīdu maisījums un tripsīna sagremots atdalās ar labu izšķirtspēju un efektivitāti. un tika novērots, ka proteīni ir labi izšķīdināti un efektīvi PMP kolonnā, kas bija efektīvāka nekā Ascentis Express RP-Amide kolonna.
PEG (polietilēnglikols), urīnviela, etiķskābe, trimetoksiortosilikāts (TMOS), trimetilhlorosilāns (TMCS), tripsīns, cilvēka seruma albumīns (HSA), amonija hlorīds, urīnviela, heksāns, metildisizāns (HMDS), metakriloiloksirolīds, benzoilhlorīds (MCTEHPOM), ), HPLC kvalitātes acetonitrils (ACN), metanols, 2-propanols un acetons, iegādāti no Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, ASV).
Urīnvielas (8 g), polietilēnglikola (8 g) un 8 ml 0,01 N etiķskābes maisījumu maisīja 10 minūtes, un pēc tam ledus aukstos apstākļos pievienoja 24 ml TMOS. Reakcijas maisījumu karsēja 40 °C temperatūrā 6 stundas un pēc tam 120 °C temperatūrā pēc tam 8 stundas tika izliets materiāls bez ūdens. žāvēja 70°C 12 stundas. Žāvēto mīksto masu gludi samala krāsnī un kalcinēja 550°C 12 stundas. Tika sagatavotas un raksturotas trīs partijas, lai pārbaudītu daļiņu izmēra, poru izmēra un virsmas laukuma reproducējamību.
Silīcija dioksīda daļiņu virsmu modificējot ar iepriekš sintezētu ligandu fenilmaleimīda-metilvinilizocianātu (PCMP), kam sekoja radiāla polimerizācija ar stirolu, tika sagatavots polāro grupu saturošs savienojums.Stacionārā fāze pildvielām un polistirola ķēdēm. Sagatavošanas process ir aprakstīts zemāk.
N-fenilmaleimīds (200 mg) un metilvinila izocianāts (100 mg) tika izšķīdināti sausā toluolā, un reakcijas kolbā tika pievienots 0,1 ml 2,2′-azoizobutironitrila (AIBN), lai sagatavotu fenilmaleimīda-metilvinila izocianāta maisījumu, un maisījums tika filtrēts 3 stundām 6, PM CP. cepeškrāsnī 40°C uz 3 stundām.
Žāvētas silīcija dioksīda daļiņas (2 g) disperģēja sausā toluolā (100 ml), maisīja un 10 minūtes apstrādāja ar ultraskaņu 500 ml apaļkolbā. PMCP (10 mg) tika izšķīdināts toluolā un pa pilināmā piltuvi tika pievienots reakcijas kolbai. Maisījumu karsēja ar atteci 100 °C temperatūrā un 6 stundas žāvēja 0 °C temperatūrā, filtrēja 6 stundas. .Pēc tam ar PMCP saistītās silīcija dioksīda daļiņas (100 g) izšķīdināja toluolā (200 ml) un pievienoja 4-hidroksi-TEMPO (2 ml) kā katalizatoru 100 µL dibutilalvas dilaurāta klātbūtnē. Maisījumu maisīja 50 °C temperatūrā un žāvēja 5 stundas 5 stundas, filtrēja 0.
Stirols (1 ml), benzoilperoksīds BPO (0,5 ml) un ar TEMPO-PMCP pievienotās silīcija dioksīda daļiņas (1,5 g) tika izkliedētas toluolā un iztīrītas ar slāpekli. Stirola polimerizācija tika veikta 100 °C temperatūrā 12 stundas. Iegūtais produkts tika nomazgāts 1 nakti 6 temperatūrā. Reakcija tika parādīta 6 temperatūrā.
Paraugus degazēja 393 K temperatūrā 1 stundu, lai iegūtu atlikušo spiedienu, kas mazāks par 10-3 Torr. Kopējā poru tilpuma noteikšanai tika izmantots N2 daudzums, kas adsorbēts pie relatīvā spiediena P/P0 = 0,99.Kailās un ar ligandu saistītās silīcija dioksīda daļiņu morfoloģija tika pārbaudīta ar skenējošo elektronisko paraugu tehnoloģiju (Jachncopyning electron, Tochiess Microncopynologis, Tochiessis) (bez silīcija dioksīda un ar ligandu saistītās silīcija dioksīda daļiņas) tika novietotas uz alumīnija kolonnas, izmantojot līmlenti. Uz paraugiem tika pārklāts zelts, izmantojot Q150T izsmidzināšanas pārklājumu, un uz paraugiem tika uzklāts 5 nm Au slānis. Tas uzlabo procesa efektivitāti, izmantojot zemu spriegumu, un nodrošina smalkgraudainu, aukstu analīzi, MA1A1. r tika izmantots elementu analīzei. Lai iegūtu daļiņu izmēru sadalījumu, tika izmantots Malvern (Worcestershire, UK) Mastersizer 2000 daļiņu izmēra analizators. Neapstrādātas silīcija dioksīda daļiņas un ar ligandu saistītās silīcija dioksīda daļiņas (katra 5 mg) tika izkliedētas 5 ml izopropanola, apstrādātas ar ultraskaņu 10 minūtes un pēc 5 min. ravimetriskā analīze tika veikta ar ātrumu 5 ° C minūtē temperatūras diapazonā no 30 līdz 800 ° C.
Ar stiklu izklātas nerūsējošā tērauda šaururbuma kolonnas ar izmēriem (100 × 1,8 mm id) tika iepakotas, izmantojot vircas iepakošanas metodi, izmantojot to pašu procedūru, kas izmantota atsaucē.31.Nerūsējošā tērauda kolonna (izklāta ar stiklu, 100 × 1,8 mm id) ar izplūdes veidgabalu, kas satur 1 µm friti, tika savienota ar vircas pakotāju (Alltech Deerfield, IL, ASV). Sagatavojiet stacionārās fāzes suspensiju, suspendējot 150 mg. kā vircas šķīdinātāju, kā arī virzošo šķīdinātāju. Aizpildiet kolonnu secīgi, pieliekot spiedienu 100 MP 10 minūtes, 80 MP 15 minūtes un 60 MP 30 minūtes. Iesaiņošanas laikā tika pielietota mehāniskā vibrācija ar diviem GC kolonnas kratītājiem (Alltech, Deerfield, IL, IL, lai nodrošinātu vienmērīgu kolonnas spiedienu. novērstu jebkādus bojājumus kolonnā. Atvienojiet kolonnu no suspensijas iepakošanas vienības un pievienojiet citu armatūru ieplūdes atverei un LC sistēmai, lai pārbaudītu tās veiktspēju.
Tika izveidots LC sūknis (10AD Shimadzu, Japāna), inžektors (Valco (ASV) C14 W.05) ar 50 nL iesmidzināšanas cilpu, membrānas degazētājs (Shimadzu DGU-14A), UV-VIS kapilārais logs. Pēc iepakošanas kapilāri (50 μm id 365 un reducējoši savienojošie kapilāri (50 μm) tika uzstādīti reducējošā savienojuma 1/16″ izejā. Datu vākšana un hromatogrāfiskā apstrāde tika veikta, izmantojot programmatūru Multichro 2000. Monitorings pie 254 nm (MANormalas tika pārbaudītas, izmantojot Chromatin, Pro8 UV absorbcijas datus).
Albumīns no cilvēka seruma, liofilizēts pulveris, ≥ 96% (agarozes gēla elektroforēze) 3 mg sajauc ar tripsīnu (1,5 mg), 4,0 M urīnvielu (1 ml) un 0,2 M amonija bikarbonātu (1 ml). Šķīdumu maisīja 10 minūtes, pēc tam 10 °C glabāja ūdens vannā 17 stundas. % TFA. Šķīdumu filtrē un uzglabā temperatūrā līdz 4 °C.
Peptīdu maisījumu un HSA tripsīna sagremojuma atdalīšana tika novērtēta atsevišķi PMP kolonnās.Pārbaudiet peptīdu maisījuma un HSA tripsīna sagremojuma atdalīšanu ar PMP kolonnu un salīdziniet rezultātus ar Ascentis Express RP-Amide kolonnu. Teorētiskais plāksnes numurs tiek aprēķināts šādi:
SEM attēli tukšām silīcija dioksīda daļiņām un ar ligandu saistītām silīcija dioksīda daļiņām ir parādīti attēlā.2. SEM attēli no tukšām silīcija dioksīda daļiņām (A, B) parāda, ka atšķirībā no mūsu iepriekšējiem pētījumiem šīs daļiņas ir sfēriskas, kurās daļiņas ir izstieptas vai tām ir neregulāra simetrija. Ar ligandu saistīto silīcija dioksīda daļiņu (C, D) virsma ir gludāka nekā silīcija dioksīda daļiņu virsma, kas var būt saistīta ar virknes polietilēna ķēdi.
Skenējošie elektronu mikroskopa attēli no tukšām silīcija dioksīda daļiņām (A, B) un ar ligandu saistītām silīcija dioksīda daļiņām (C, D).
Neapstrādātu silīcija dioksīda daļiņu un ar ligandu saistīto silīcija dioksīda daļiņu izmēru sadalījums ir parādīts 3(A) attēlā. Uz tilpumu balstītas daļiņu izmēru sadalījuma līknes parādīja, ka silīcija dioksīda daļiņu izmērs palielinājās pēc ķīmiskās modifikācijas (3.A attēls). Pašreizējā pētījuma un iepriekšējā pētījuma silīcija dioksīda daļiņu daļiņu izmēra sadalījuma dati ir salīdzināti tabulā P.,-1(AMP) izmērs ir P.3(AMP). 0,36 μm, salīdzinot ar mūsu iepriekšējo pētījumu ar ad(0,5) vērtību 3,05 μm (ar polistirolu saistītās silīcija dioksīda daļiņas)34. Šai partijai bija šaurāks daļiņu izmēru sadalījums, salīdzinot ar mūsu iepriekšējo pētījumu, jo iepriekš PEG, urīnvielas, TMOS un etiķskābes attiecības bija nedaudz lielākas nekā reakcijas maisījuma polietilēna fāze. Tas nozīmē, ka silīcija dioksīda daļiņu virsmas funkcionalizācija ar stirolu uz silīcija dioksīda virsmas uzklāja tikai polistirola slāni (0,97 µm), savukārt PMP fāzē slāņa biezums bija 1,38 µm.
Daļiņu izmēra sadalījums (A) un poru lieluma sadalījums (B) tukšām silīcija dioksīda daļiņām un ar ligandu saistītām silīcija dioksīda daļiņām.
Pašreizējā pētījuma silīcija dioksīda daļiņu poru izmērs, poru tilpums un virsmas laukums ir norādīts 1. tabulā (B). Neapstrādāto silīcija dioksīda daļiņu un ar ligandu saistīto silīcija dioksīda daļiņu PSD profili ir parādīti 3. (B) attēlā. Rezultāti ir salīdzināmi ar mūsu iepriekšējo pētījumu. Neapstrādāto un ar ligandu saistītā silīcija dioksīda daļiņu poru izmēri norāda, ka attiecīgie silīcija dioksīda daļiņu izmēri ir samazinājušies310 un attiecīgi par2. 69 pēc ķīmiskās modifikācijas, kā parādīts 1(B) tabulā, un līknes izmaiņas ir parādītas 3(B) attēlā. Tāpat arī silīcija daļiņu poru tilpums pēc ķīmiskās modifikācijas samazinājies no 0,67 līdz 0,58 cm3/g. Patlaban pētīto silīcija daļiņu īpatnējais virsmas laukums ir 116 m2/g, kas uzrādīts mūsu iepriekšējā pētījumā. 1.(B) tabulā arī silīcija daļiņu virsmas laukums (m2/g) pēc ķīmiskās modifikācijas samazinājās no 116 m2/g līdz 105 m2/g.
Stacionārās fāzes elementārās analīzes rezultāti ir parādīti 2. tabulā. Pašreizējās stacionārās fāzes oglekļa slodze ir 6,35%, kas ir mazāka nekā mūsu iepriekšējā pētījuma oglekļa slodze (ar polistirolu saistītās silīcija dioksīda daļiņas, attiecīgi 7,93%35 un 10,21%). tika izmantots, piemēram, fenilmaleimīda-metilvinilizocianāts (PCMP) un 4-hidroksi-TEMPO. Pašreizējās stacionārās fāzes slāpekļa masas procenti ir 2,21%, salīdzinot ar attiecīgi 0,1735 un 0,85% slāpekļa masas iepriekšējos pētījumos. Tas nozīmē, ka pašreizējās stacionārās fāzes slāpekļa slodzes dēļ ir lielāks masprocents no slāpekļa. produktu (4) un (5) bija attiecīgi 2,7% un 2,9%, savukārt galaprodukta (6) oglekļa slodze bija 6,35%, kā parādīts 2. tabulā. Svara zudums tika pārbaudīts ar PMP stacionāro fāzi, un TGA līkne parādīta 4. attēlā. TGA līkne parāda svara zudumu 8,6% apmērā, bet arī ogleklis nesakrīt ar 5%, jo nesakrīt tikai O, bet arī 3 saturs nesakrīt. un H.
Fenilmaleimīda-metilvinilizocianāta ligands tika izvēlēts silīcija daļiņu virsmas modificēšanai, jo tajā ir polāras fenilmaleimīda grupas un vinilizocianāta grupas. Vinila izocianātu grupas var tālāk reaģēt ar stirolu dzīvās radikālas polimerizācijas ceļā. Otrs iemesls ir ievietot grupu, kurai ir mērena mijiedarbība ar spēcīgu elektroanalītisko fāzi un stacionāro analītisko fāzi. ide daļai nav virtuāla lādiņa pie normāla pH.Stacionārās fāzes polaritāti var kontrolēt ar optimālo stirola daudzumu un brīvo radikāļu polimerizācijas reakcijas laiku.Pēdējais reakcijas posms (brīvo radikāļu polimerizācija) ir kritisks un var mainīt stacionārās fāzes polaritāti.Tika veikta elementu analīze, lai pārbaudītu šo stacionāro fāžu oglekļa slodzi un stacionārās fāzes slodzes palielināšanos. .SP, kas sagatavoti ar dažādu stirola koncentrāciju, ir dažādas oglekļa slodzes. Atkal ievietojiet šīs stacionārās fāzes nerūsējošā tērauda kolonnās un pārbaudiet to hromatogrāfisko veiktspēju (selektivitāti, izšķirtspēju, N vērtību utt.). Pamatojoties uz šiem eksperimentiem, tika izvēlēts optimizēts sastāvs, lai sagatavotu PMP stacionāro fāzi, lai nodrošinātu kontrolētu polaritāti un labu analīta aizturi.
Pieci peptīdu maisījumi (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leicīna enkefalīns) arī tika novērtēti, izmantojot PMP kolonnu, izmantojot kustīgo fāzi;60/40 (v/v) acetonitrils/ūdens (0,1% TFA) ar plūsmas ātrumu 80 μL/min. Optimālos eluēšanas apstākļos teorētiskais plāksnītes numurs (N) uz kolonnu (100 × 1,8 mm id) ir 20 000 ± 100 (200/m² T vērtības kolonnās trīs hroma platēs). Gramas ir parādītas 5.A attēlā. Ātra analīze PMP kolonnā ar lielu plūsmas ātrumu (700 μL/min), pieci peptīdi tika eluēti vienas minūtes laikā, N vērtības bija ļoti labas, 13 500 ± 330 vienā kolonnā (kolonnas diametrs 100 × 1,8 mm), atbilst 135,00 tre 135,00tre plāksnītei/m. 00 × 1,8 mm id) tika pildītas ar trim dažādām PMP stacionārās fāzes partijām, lai pārbaudītu reproducējamību. Katras kolonnas analizējamā viela tika reģistrēta, izmantojot optimālos eluēšanas apstākļus un teorētisko plākšņu skaitu N un aiztures laiku, lai katrā kolonnā atdalītu vienu un to pašu testa maisījumu. PMP kolonnu reproducējamības dati ir parādīti ar PMP kolonnu ļoti reproducējamības D vērtībām. Reproducējamības dati ir parādīti tabulā. 3. tabula.
Peptīdu maisījuma atdalīšana uz PMP kolonnas (B) un Ascentis Express RP-Amide kolonnas (A);mobilā fāze 60/40 ACN/H2O (TFA 0,1%), PMP kolonnas izmēri (100 × 1,8 mm id);analītiskā Savienojumu eluēšanas secība: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) un 5 (leicīns) skābes enkefalīns)).
PMP kolonna (100 × 1,8 mm id) tika novērtēta cilvēka seruma albumīna triptisku sagremoto fragmentu atdalīšanai augstas izšķirtspējas šķidruma hromatogrāfijā. 6. attēlā redzamā hromatogramma parāda, ka paraugs ir labi atdalīts un izšķirtspēja ir ļoti laba. HSA sagremojumi tika analizēti, izmantojot plūsmas ātrumu 100 µL/min, mobilā fāze 70 µL/min, parādīta mobilā fāze 70 A/3/0 % acetonitrile. gramā (6. attēls), HSA sagremojums ir sadalīts 17 pīķos, kas atbilst 17 peptīdiem. Katra HSA sagremojuma pīķa atdalīšanas efektivitāte tika aprēķināta, un vērtības ir norādītas 5. tabulā.
HSA (100 × 1,8 mm id) triptiskais sagremojums tika atdalīts uz PMP kolonnas;plūsmas ātrums (100 µL/min), kustīgā fāze 60/40 acetonitrils/ūdens ar 0,1% TFA.
kur L ir kolonnas garums, η ir kustīgās fāzes viskozitāte, ΔP ir kolonnas pretspiediens un u ir kustīgās fāzes lineārais ātrums. PMP kolonnas caurlaidība bija 2,5 × 10-14 m2, plūsmas ātrums bija 25 μL/min, un tika izmantota 60/40 v/v P.0 × ACN/ūdens. bija līdzīga mūsu iepriekšējā pētījuma 34. atsaucei. Kolonnas caurlaidība, kas pildīta ar virspusēji porainām daļiņām, ir: 1,7 × 10-15 1,3 μm daļiņām, 3,1 × 10-15 1,7 μm daļiņām, 5,2 × 10-15 un 0,2 × 10-15 daļiņām 2-5 μm s. μm daļiņas 43. Līdz ar to PMP fāzes caurlaidība ir līdzīga 5 μm kodols-čaulas daļiņām.
kur Wx ir ar hloroformu pildītas kolonnas svars, Wy ir ar metanolu pildītas kolonnas svars, un ρ ir šķīdinātāja blīvums. Metanola (ρ = 0,7866) un hloroforma (ρ = 1,484) blīvums. Kopējā SILDĪBA DAĻĻU porainība1 un C018 kolonnas1 (C018) Karbamīda kolonnas 31, ko mēs iepriekš pētījām, bija attiecīgi 0,63 un 0,55. Tas nozīmē, ka urīnvielas ligandu klātbūtne samazina stacionārās fāzes caurlaidību. No otras puses, kopējā PMP kolonnas porainība (100 × 1,8 mm id) ir 0,60. Caurlaidība PMP1 kolonnās8 ir zemāka nekā C1 kolonnās8, kas pildītas ar C1 kolonnām. tipa stacionārajās fāzēs C18 ligandi ir pievienoti silīcija dioksīda daļiņām kā lineāras ķēdes, savukārt polistirola tipa stacionārajās fāzēs ap to veidojas salīdzinoši biezs polimēra slānis. Tipiskā eksperimentā kolonnas porainību aprēķina šādi:
Attēlā 7A, B parādīta PMP kolonna (100 × 1,8 mm id) un Ascentis Express RP-Amide kolonna (100 × 1,8 mm id), izmantojot tos pašus eluēšanas apstākļus (ti, 60/40 ACN/H2O un 0,1% TFA).) no van Dēmtera zemes gabala.Atlasītie peptīdu maisījumi (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) tika sagatavoti 20 µL/ Minimālais plūsmas ātrums abām kolonnām ir 800 µL/min. Minimālās HETP vērtības kolonnā pie 8 µL plūsmas ātruma (8 µL) Centis Express RP-Amide kolonnas izmērs bija attiecīgi 2,6 µm un 3,9 µm. HETP vērtības norāda, ka PMP kolonnas (100 × 1,8 mm id) atdalīšanas efektivitāte ir daudz labāka nekā komerciāli pieejamā Ascentis Express N RP-Amide kolonna (100 × 1,8 mm id). nav nozīmīga salīdzinājumā ar mūsu iepriekšējo pētījumu. PMP kolonnas (100 × 1,8 mm id) augstāka atdalīšanas efektivitāte, salīdzinot ar Ascentis Express RP-Amide kolonnu, ir balstīta uz uzlabojumiem daļiņu formā, izmērā un sarežģītās kolonnas iepakošanas procedūrās, kas tiek izmantotas pašreizējā darbā34.
(A) van Dēmtera diagramma (HETP pret mobilās fāzes lineāro ātrumu), kas iegūta, izmantojot PMP kolonnu (100 × 1,8 mm id) 60/40 ACN/H2O ar 0,1% TFA. (B) van Dēmtera diagramma (HETP pret kustīgās fāzes lineāro ātrumu), kas iegūta, izmantojot Ascentis Express Ascentis Express ACN0 × 1 0,8 mm / 0 amīda kolonnu. ar 0,1% TFA.
Tika sagatavota un novērtēta polārā iegultā polistirola stacionārā fāze sintētisko peptīdu maisījumu un cilvēka seruma albumīna (HAS) tripsīna sagremojuma atdalīšanai augstas izšķirtspējas šķidruma hromatogrāfijā. PMP kolonnu peptīdu maisījumiem hromatogrāfiskā veiktspēja ir lieliska atdalīšanas efektivitātes un izšķirtspējas ziņā. PMP kolonnu uzlaboto atdalīšanas veiktspēju nosaka, piemēram, dažādu daļiņu izmēru, kontrolēta daļiņu izmēra un silīcija dēļ. sis stacionāro fāzi un kompleksu kolonnu iepakošanu. Papildus augstajai atdalīšanas efektivitātei zems kolonnas pretspiediens pie lieliem plūsmas ātrumiem ir vēl viena šīs stacionārās fāzes priekšrocība. PMP kolonnām ir laba reproducējamība, un tās var izmantot peptīdu maisījumu analīzei un dažādu proteīnu šķelšanai ar tripsīniem. Mēs plānojam šo kolonnu izmantot P kolonnā, lai atdalītu no dabīgiem produktiem, ārstniecības augiem un bioloģiski aktīviem savienojumiem šķidrie savienojumi. novērtēta olbaltumvielu un monoklonālo antivielu atdalīšanai.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Pētījumi par peptīdu atdalīšanas sistēmām ar reversās fāzes hromatogrāfiju I daļa: Kolonnu raksturojuma protokola izstrāde.J.Chromatography.1603, 113–129.https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038 (2019).
Gomez, B. et al.Uzlaboti aktīvi peptīdi, kas paredzēti infekcijas slimību ārstēšanai.Biotechnology.Advanced.36(2), 415-429.https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Sintētiskie terapeitiskie peptīdi: zinātne un tirgus.narkotiku atklājums.15 (1-2) šodien, 40-56.https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (201.009).
Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Advanced Proteomic Liquid Chromatography.J.Chromatography.A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. et al. Uzlabotā šķidruma hromatogrāfijas masas spektrometrija ļauj iekļaut plaši mērķtiecīgu metabolomiku un proteomiku.anus.Chim.Acta 1069, 89–97 (2019).
Chesnut, SM & Salisbury, JJ UHPLC loma zāļu izstrādē.J.Sep. Sci.30(8), 1183-1190 (2007).
Wu, N. & Clausen, AM Ultraaugstspiediena šķidruma hromatogrāfijas fundamentālie un praktiskie aspekti ātrai separācijai.J.Sep. Sci.30(8), 1167-1182.https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA & Tchelitcheff, P. Īpaši augstas veiktspējas šķidruma hromatogrāfijas pielietojums zāļu izstrādē.J.Chromatography.1119(1-2), 140-146.https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. et al.Monolīti makroporaini hidrogēli, kas pagatavoti no augstas iekšējās fāzes emulsijām eļļa ūdenī, efektīvai enterovīrusu attīrīšanai.Ķīmija.Lielbritānija.J.401, 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA The role of liquid chromatography in proteomics.J.Chromatography.A 1053(1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Veuthey, J.-L.& Guillarme, D. Emerging trends in reversed-phase liquid chromatography separations oftherapy peptides and proteins: theory and applications.J.Farmācija.Biomedicīnas zinātne.anus.69, 9-27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC Peptīdu divdimensiju atdalīšana, izmantojot RP-RP-HPLC sistēmu, izmantojot dažādas pH vērtības pirmajā un otrajā atdalīšanas dimensijā.J.Sep. Sci.28(14), 1694-1703 (2005).
Feletti, S. et al.Tika pētīti augstas efektivitātes hromatogrāfijas kolonnu masas pārneses raksturlielumi un kinētiskā veiktspēja, kas pildītas ar C18 sub-2 μm pilnībā un virspusēji porainām daļiņām.J.Sep. Sci.43 (9-10), 1737-1745 (2020).
Piovesana, S. et al. Jaunākās tendences un analītiskie izaicinājumi augu bioaktīvo peptīdu izolēšanā, identificēšanā un validācijā.anus.biological anus.Chemical.410(15), 3425–3444.https://doi.org/10.1007/s00216-028-08.
Mueller, JB et al. Dzīvības valstības proteomiskā ainava. Nature 582(7813), 592-596.https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
DeLuca, C. et al. Terapeitisku peptīdu pakārtota apstrāde ar preparatīvo šķidruma hromatogrāfiju. Molecule (Bāzele, Šveice) 26(15), 4688(2021).
Yang, Y. & Geng, X. Jauktā režīma hromatogrāfija un tās pielietojums biopolimēriem.J.Chromatography.A 1218(49), 8813–8825 (2011).
Zhao, G., Dong, X.-Y. & Sun, Y. Ligands for mix-mode proteīnu hromatogrāfijas: princips, raksturojums un dizains.J.Biotechnology.144(1), 3-11 (2009).