Paldies, ka apmeklējāt vietni Nature.com. Jūs izmantojat pārlūkprogrammas versiju ar ierobežotu CSS atbalstu. Lai nodrošinātu vislabāko pieredzi, iesakām izmantot atjauninātu pārlūkprogrammu (vai atspējot saderības režīmu pārlūkprogrammā Internet Explorer). Turklāt, lai nodrošinātu nepārtrauktu atbalstu, vietne tiek rādīta bez stiliem un JavaScript.
Vienlaikus parāda trīs slaidu karuseli. Izmantojiet pogas Iepriekšējais un Nākamais, lai vienlaikus pārvietotos starp trim slaidiem, vai arī izmantojiet slīdņa pogas galā, lai vienlaikus pārvietotos starp trim slaidiem.
Poraini silīcija dioksīda daļiņas tika sagatavotas ar sol-gēla metodi ar dažām modifikācijām, lai iegūtu platporu daļiņas. Šīs daļiņas tika derivatizētas ar N-fenilmaleimīda-metilvinilizocianātu (PMI) un stirolu, izmantojot reversās ķēdes pārneses fragmentācijas (RAFT) polimerizāciju, lai iegūtu ar N-fenilmaleimīdu interkalētus poliamīdus. Stirola (PMP) stacionārā fāze. Šaura diametra nerūsējošā tērauda kolonnas (iekšējais diametrs 100 × 1,8 mm) tika pildītas ar suspensijas pildījumu. PMP kolonnas hromatogrāfiskā veiktspēja tika novērtēta, lai atdalītu sintētisko peptīdu maisījumu, kas sastāv no pieciem peptīdiem (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leu aminoskābes enkefalīns) un cilvēka seruma albumīna (HAS) triptiskās hidrolizāta. Optimālos eluēšanas apstākļos teorētiskais plākšņu skaits ar peptīdu maisījumu sasniedza 280 000 plākšņu/kv.m. Salīdzinot izstrādātās kolonnas atdalīšanas veiktspēju ar komerciālo Ascentis Express RP-Amide kolonnu, tika novērots, ka PMP kolonnas atdalīšanas efektivitāte bija pārāka par komerciālo kolonnu atdalīšanas efektivitātes un izšķirtspējas ziņā.
Biofarmaceitiskā nozare pēdējos gados ir kļuvusi par augošu globālu tirgu ar ievērojamu tirgus daļas pieaugumu. Līdz ar biofarmaceitiskās nozares eksplozīvo izaugsmi1,2,3 ir liela nepieciešamība pēc peptīdu un olbaltumvielu analīzes. Papildus mērķa peptīdam peptīdu sintēzes laikā veidojas dažādi piemaisījumi, tāpēc, lai iegūtu vēlamo peptīda tīrību, ir nepieciešama hromatogrāfiskā attīrīšana. Olbaltumvielu analīze un raksturojums ķermeņa šķidrumos, audos un šūnās ir ārkārtīgi sarežģīts uzdevums, jo vienā paraugā ir liels skaits potenciāli nosakāmu sugu. Lai gan masas spektrometrija ir efektīvs instruments peptīdu un olbaltumvielu sekvencēšanai, ja šādi paraugi tiek tieši ievadīti masas spektrometrā, atdalīšana būs neapmierinoša. Šo problēmu var atrisināt, veicot šķidruma hromatogrāfiju (LC) pirms MS analīzes, kas samazinās analītu daudzumu, kas nonāk masas spektrometrā noteiktā laikā4,5,6. Turklāt šķidrās fāzes atdalīšanas laikā analīti var koncentrēties šaurā apgabalā, tādējādi koncentrējot šos analītus un palielinot MS noteikšanas jutību. Šķidruma hromatogrāfija (LC) pēdējās desmitgades laikā ir ievērojami attīstījusies un kļuvusi par plaši izmantotu proteomikas analīzes metodi .
Apgrieztās fāzes šķidruma hromatogrāfija (RP-LC) tiek plaši izmantota peptīdu maisījumu attīrīšanai un atdalīšanai, izmantojot oktadecil-modificētu silīcija dioksīdu (ODS) kā stacionāro fāzi11,12,13. Tomēr to sarežģītās struktūras un amfotēriskās dabas dēļ14,15 RP stacionārās fāzes nevar nodrošināt apmierinošu peptīdu un olbaltumvielu atdalīšanu. Tāpēc peptīdu un olbaltumvielu ar polāriem un nepolāriem fragmentiem analīzei ir nepieciešamas speciāli izstrādātas stacionārās fāzes, lai mijiedarbotos un saglabātu šīs analītas16. Jauktā hromatogrāfija, kas piedāvā multimodālu mijiedarbību, var būt alternatīva RP-LC peptīdu, olbaltumvielu un citu sarežģītu maisījumu atdalīšanai. Tika sagatavotas vairākas jaukta tipa stacionārās fāzes, un peptīdu un olbaltumvielu atdalīšanai tika izmantotas kolonnas, kas piepildītas ar šīm stacionārajām fāzēm17,18,19,20,21. Polāro un nepolāro grupu klātbūtnes dēļ jauktā režīma stacionārās fāzes (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, polārā interkalācija/RPLC) ir piemērotas peptīdu un olbaltumvielu atdalīšanai22,23,24,25,26,27,28. Polāri iestarpkalētas stacionārās fāzes ar kovalenti saistītām polārām grupām uzrāda labas atdalīšanas spējas un unikālu selektivitāti polāriem un nepolāriem analītiem, jo ​​atdalīšana ir atkarīga no mijiedarbības starp analītu un stacionāro fāzi. Multimodālas mijiedarbības 29,30,31,32. Nesen Džans un līdzautori 30 ieguva behenilgrupu terminētas poliamīnu stacionārās fāzes un veiksmīgi atdalīja ogļūdeņražus, antidepresantus, flavonoīdus, nukleozīdus, estrogēnus un dažus citus analītus. Polāri iestrādātajam stacionārajam materiālam ir gan polāras, gan nepolāras grupas, tāpēc to var izmantot peptīdu un olbaltumvielu atdalīšanai hidrofobās un hidrofilās daļās. Polāras iekšējās kolonnas (piemēram, C18 kolonnas ar amīda iekšējo līniju) ir pieejamas ar tirdzniecības nosaukumu Ascentis Express RP-Amide kolonnas, taču šīs kolonnas ir izmantotas tikai amīna 33 analīzei.
Pašreizējā pētījumā tika sagatavota polāra iegulšanas stacionārā fāze (N-fenilmaleimīds, iegulšanas polistirols) un novērtēta tās peptīdu atdalīšanai un triptiskai HSA šķelšanai. Stacionārās fāzes sagatavošanai tika izmantota šāda stratēģija. Porainas silīcija dioksīda daļiņas tika sagatavotas saskaņā ar procedūrām, kas aprakstītas mūsu iepriekšējās publikācijās, ar dažām izmaiņām sagatavošanas shēmās 31, 34, 35, 36, 37, 38, 39. Urīnvielas, polietilēnglikola (PEG), TMOS un ūdens etiķskābes attiecības tika pielāgotas, lai iegūtu silīcija dioksīda daļiņas ar lieliem poru izmēriem. Otrkārt, tika sintezēts jauns fenilmaleimīda-metilvinilizocianāta ligands, un tā derivatizētās silīcija dioksīda daļiņas tika izmantotas polāru iegulto stacionāro fāžu sagatavošanai. Iegūtā stacionārā fāze tika iepakota nerūsējošā tērauda kolonnā (iekšējais diametrs 100 × 1,8 mm) saskaņā ar optimizētu iepakošanas shēmu. Kolonnas iepakošanu veicina mehāniskā vibrācija, lai nodrošinātu vienmērīgu slāni kolonnā. Iepakotā kolonna tika novērtēta peptīdu maisījuma, kas sastāv no pieciem peptīdiem (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leicīna-enkefalīna peptīds), un cilvēka seruma albumīna (HSA) triptisko hidrolizātu atdalīšanai. Tika novērots, ka peptīdu maisījums un HSA triptiskais hidrolizāts atdalījās ar labu izšķirtspēju un efektivitāti. PMP kolonnas atdalīšanas efektivitāte tika salīdzināta ar Ascentis Express RP-Amide kolonnas atdalīšanas efektivitāti. Tika novērots, ka peptīdiem un olbaltumvielām PMP kolonnā ir laba izšķirtspēja un augsta atdalīšanas efektivitāte, un PMP kolonnas atdalīšanas efektivitāte ir augstāka nekā Ascentis Express RP-Amide kolonnai.
PEG (polietilēnglikols), urīnviela, etiķskābe, trimetoksiortosilikāts (TMOS), trimetilhlorosilāns (TMCS), tripsīns, cilvēka seruma albumīns (HSA), amonija hlorīds, urīnviela, heksametilmetakrililoildisilazāns (HMDS), metakriloilhlorīds (MC), stirols, 4-hidroksi-TEMPO, benzoilperoksīds (BPO), acetonitrils (ACN) AŠH hromatogrāfijai, metanols, 2-propanols un acetons. Sigma-Aldrich Company (Sentluisa, Misūri, ASV).
Urīnvielas (8 g), polietilēnglikola (8 g) un 8 ml 0,01 N etiķskābes maisījumu maisīja 10 minūtes, un tam, dzesējot ar ledu, pievienoja 24 ml TMOS. Reakcijas maisījumu karsēja 40°C temperatūrā 6 stundas un pēc tam 120°C temperatūrā 8 stundas nerūsējošā tērauda autoklāvā. Ūdens tika dekantēts, un atlikumu žāvēja 70°C temperatūrā 12 stundas. Žāvētos mīkstos blokus gludi samala un kalcinēja krāsnī 550°C temperatūrā 12 stundas. Tika sagatavotas un raksturotas trīs partijas, lai pārbaudītu daļiņu izmēru, poru izmēra un virsmas laukuma reproducējamību.
Polārā grupa un stacionārā fāze polistirola ķēdēm. Sagatavošanas procedūra ir aprakstīta turpmāk.
N-fenilmaleimīds (200 mg) un metilvinilizocianāts (100 mg) tika izšķīdināti bezūdens toluolā, un pēc tam reakcijas kolbā pievienoja 0,1 ml 2,2′-azoizobutironitrila (AIBN), lai iegūtu fenilmaleimīda un metilvinilizocianāta (PMCP) kopolimēru. ) Maisījumu 3 stundas karsēja 60 °C temperatūrā, filtrēja un žāvēja cepeškrāsnī 40 °C temperatūrā 3 stundas.
Žāvētas silīcija dioksīda daļiņas (2 g) tika disperģētas sausā toluolā (100 ml), maisītas un apstrādātas ar ultraskaņu 10 minūtes 500 ml apaļkolbā. PMCP (10 mg) tika izšķīdināts toluolā un pilienveidā pievienots reakcijas kolbai caur pievienošanas piltuvi. Maisījumu 8 stundas vārīja ar atplūdi 100 °C temperatūrā, filtrēja, mazgāja ar acetonu un žāvēja 60 °C temperatūrā 3 stundas. Pēc tam ar PMCP saistītās silīcija dioksīda daļiņas (100 g) tika izšķīdinātas toluolā (200 ml) un tām pievienoja 4-hidroksi-TEMPO (2 ml) 100 μl dibutilalvas dilaurāta kā katalizatora klātbūtnē. Maisījumu 8 stundas maisīja 50 °C temperatūrā, filtrēja un žāvēja 3 stundas 50 °C temperatūrā.
Stirolu (1 ml), benzoilperoksīdu BPO (0,5 ml) un pie TEMPO-PMCP (1,5 g) piestiprinātas silīcija dioksīda daļiņas disperģēja toluolā un attīrīja ar slāpekli. Stirola polimerizāciju veica 100°C temperatūrā 12 stundas. Iegūto produktu mazgāja ar metanolu un žāvēja nakti 60°C temperatūrā. Reakcijas vispārējā shēma parādīta 1. attēlā.
Paraugi tika degazēti 393 K temperatūrā 1 stundu, līdz tika iegūts atlikušais spiediens, kas mazāks par 10–3 Torr. Kopējā poru tilpuma noteikšanai tika izmantots relatīvajā spiedienā P/P0 = 0,99 adsorbētā N2 daudzums. Tīra un ar ligandu saistīta silīcija dioksīda daļiņu morfoloģija tika pārbaudīta, izmantojot skenējošo elektronu mikroskopu (Hitachi High Technologies, Tokija, Japāna). Sausie paraugi (tīrs silīcija dioksīds un ar ligandu saistītas silīcija dioksīda daļiņas) tika novietoti uz alumīnija stieņiem, izmantojot oglekļa lenti. Zelts tika uzklāts uz parauga, izmantojot Q150T izsmidzināšanas ierīci, un uz parauga tika uzklāts 5 nm biezs Au slānis. Tas uzlabo zemsprieguma procesa efektivitāti un nodrošina smalku aukstu izsmidzināšanu. Elementu analīze tika veikta, izmantojot Thermo Electron (Waltham, MA, ASV) Flash EA1112 elementu sastāva analizatoru. Daļiņu izmēra sadalījuma iegūšanai tika izmantots Malvern daļiņu izmēra analizators (Worcestershire, Apvienotā Karaliste) Mastersizer 2000. Nepārklātas silīcija dioksīda daļiņas un ar ligandu saistītas silīcija dioksīda daļiņas (katra 5 mg) tika disperģētas 5 ml izopropanolā, apstrādātas ar ultraskaņu 10 minūtes, kratītas 5 minūtes un novietotas uz Mastersizer optiskā galda. Termogravimetriskā analīze tiek veikta ar ātrumu 5 °C minūtē temperatūras diapazonā no 30 līdz 800 °C.
Ar stikla šķiedru izklātas šaura diametra nerūsējošā tērauda kolonnas ar izmēriem (ID 100 × 1,8 mm) tika pildītas ar suspensijas pildīšanas metodi, ievērojot to pašu procedūru, kas aprakstīta 31. atsaucē. Nerūsējošā tērauda kolonna (ar stikla pārklājumu, ID 100 × 1,8 mm) un izeja ar 1 µm fritu tika pievienota suspensijas iepakošanas iekārtai (Alltech Deerfield, IL, ASV). Sagatavojiet stacionārās fāzes suspensiju, suspendējot 150 mg stacionārās fāzes 1,2 ml metanola un ievadot to rezervuāra kolonnā. Metanols tika izmantots kā suspensijas šķīdinātājs un kontroles šķīdinātājs. Pildiet kolonnu, pielietojot spiediena secību 100 MP 10 minūtes, 80 MP 15 minūtes un 60 MP 30 minūtes. Pildīšanas procesā tika izmantoti divi gāzu hromatogrāfijas kolonnas vibratori (Alltech, Deerfield, IL, ASV) mehāniskai vibrācijai, lai nodrošinātu vienmērīgu kolonnas iepildīšanu. Aizveriet suspensijas iepakotāju un lēnām atbrīvojiet spiedienu, lai nesabojātu auklu. Kolonna tika atvienota no suspensijas sprauslas, un pie ieplūdes atveres tika pievienots cits savienojums, kas tika savienots ar LC sistēmu, lai pārbaudītu tās darbību.
Pielāgota MLC tika konstruēta, izmantojot LC sūkni (10AD Shimadzu, Japāna), paraugu ņemšanas ierīci ar 50 nL injekcijas cilpu (Valco (ASV) C14 W.05), membrānas degazatoru (Shimadzu DGU-14A) un UV-VIS kapilāro logu. Detektora ierīce (UV-2075) un emaljēta mikrokolonna. Izmantojiet ļoti šauras un īsas savienojošās caurules, lai samazinātu papildu kolonnas izplešanās ietekmi. Pēc kolonnas piepildīšanas 1/16″ reducējošā savienojuma izejā uzstādiet kapilāru (50 µm ar diametru 365) un uzstādiet reducējošā savienojuma kapilāru (50 µm). Datu vākšana un hromatogrammas apstrāde tiek veikta, izmantojot Multichro 2000 programmatūru. Pie 254 nm tika kontrolēta analītu UV absorbcija pie 0. Hromatogrāfiskie dati tika analizēti, izmantojot OriginPro8 (Northampton, MA).
Cilvēka seruma albumīns, liofilizēts pulveris, ≥ 96% (agarozes gela elektroforēze) 3 mg sajaukts ar tripsīnu (1,5 mg), 4,0 M urīnvielu (1 ml) un 0,2 M amonija bikarbonātu (1 ml). Šķīdumu maisīja 10 minūtes un turēja ūdens vannā 37°C temperatūrā 6 stundas, pēc tam pievienoja 1 ml 0,1% TFA. Šķīdumu filtrēja un uzglabāja temperatūrā zem 4°C.
Peptīdu un triptiski sagremota HSA maisījuma atdalīšana PMP kolonnā tika novērtēta atsevišķi. Pārbaudiet peptīdu un HSA maisījuma triptisko hidrolīzi, kas atdalīta ar PMP kolonnu, un salīdziniet rezultātus ar Ascentis Express RP-Amide kolonnu. Teorētisko plākšņu skaits tiek aprēķināts, izmantojot šādu vienādojumu:
Tīra silīcija dioksīda daļiņu un ar ligandu saistītu silīcija dioksīda daļiņu SEM attēli ir parādīti 2. attēlā. Tīra silīcija dioksīda daļiņu (A, B) SEM attēlos ir redzama sfēriska forma, kurā daļiņas ir iegarenas vai tām ir neregulāra simetrija, salīdzinot ar mūsu iepriekšējiem pētījumiem. Ar ligandu saistīto silīcija dioksīda daļiņu (C, D) virsma ir gludāka nekā tīra silīcija dioksīda daļiņu virsma, kas var būt saistīts ar polistirola ķēdēm, kas pārklāj silīcija dioksīda daļiņu virsmu.
Tīru silīcija dioksīda daļiņu (A, B) un ar ligandu saistītu silīcija dioksīda daļiņu (C, D) skenējošie elektronmikroskopiskie attēli.
Tīra silīcija dioksīda daļiņu un ar ligandu saistītu silīcija dioksīda daļiņu daļiņu izmēra sadalījums ir parādīts 2.3.(A) attēlā. Tilpuma daļiņu izmēra sadalījuma līknes parādīja, ka silīcija dioksīda daļiņu izmērs palielinājās pēc ķīmiskās modifikācijas (3.A att.). Silīcija dioksīda daļiņu izmēra sadalījuma dati no pašreizējā pētījuma un iepriekšējā pētījuma ir salīdzināti 1.(A) tabulā. PMP tilpuma daļiņu izmērs d(0,5) bija 3,36 µm, salīdzinot ar ad(0,5) vērtību 3,05 µm mūsu iepriekšējā pētījumā (ar polistirolu saistītas silīcija dioksīda daļiņas)34. PEG, urīnvielas, TMOS un etiķskābes attiecības izmaiņu dēļ reakcijas maisījumā šīs partijas daļiņu izmēra sadalījums bija šaurāks salīdzinājumā ar mūsu iepriekšējo pētījumu. PMP fāzes daļiņu izmērs ir nedaudz lielāks nekā ar polistirolu saistītās silīcija dioksīda daļiņu fāzes, ko pētījām iepriekš, izmērs. Tas nozīmē, ka silīcija dioksīda daļiņu virsmas funkcionalizācija ar stirolu uz silīcija dioksīda virsmas nogulsnēja tikai polistirola slāni (0,97 µm), savukārt PMP fāzē slāņa biezums bija 1,38 µm.
Tīra silīcija dioksīda daļiņu un ar ligandu saistītu silīcija dioksīda daļiņu daļiņu izmēru sadalījums (A) un poru izmēru sadalījums (B).
Šajā pētījumā izmantoto silīcija dioksīda daļiņu poru izmērs, poru tilpums un virsmas laukums ir parādīts 1. tabulā (B). Tīru silīcija dioksīda daļiņu un ar ligandu saistītu silīcija dioksīda daļiņu PSD profili ir parādīti 3. attēlā (B). Rezultāti bija salīdzināmi ar mūsu iepriekšējo pētījumu34. Tīru un ar ligandu saistītu silīcija dioksīda daļiņu poru izmēri bija attiecīgi 310 Å un 241 Å, kas norāda, ka pēc ķīmiskās modifikācijas poru izmērs samazinājās par 69 Å, kā parādīts 1. tabulā (B), un nobīdes līkne ir parādīta attēlā. Silīcija dioksīda daļiņu īpatnējā virsma pašreizējā pētījumā ir 116 m²/g, kas ir salīdzināma ar mūsu iepriekšējo pētījumu (124 m²/g). Kā parādīts 1. tabulā (B), silīcija dioksīda daļiņu virsmas laukums (m²/g) pēc ķīmiskās modifikācijas arī samazinājās no 116 m²/g līdz 105 m²/g.
Stacionārās fāzes elementanalīzes rezultāti ir parādīti 2. tabulā. Pašreizējās stacionārās fāzes oglekļa saturs ir 6,35 %, kas ir zemāks nekā mūsu iepriekšējā pētījumā (ar polistirolu saistītās silīcija dioksīda daļiņas attiecīgi 7,93 %35 un 10,21 %)42. Pašreizējās stacionārās fāzes oglekļa saturs ir norādīts zemāk, jo SP sagatavošanā papildus stirolam ir izmantoti daži polāri ligandi, piemēram, fenilmaleimīda metilvinilizocianāts (PCMP) un 4-hidroksi-TEMPO. Slāpekļa svara procentuālā daļa pašreizējā stacionārajā fāzē ir 2,21 %, salīdzinot ar 0,1735 un 0,85 % iepriekšējos pētījumos42. Tas nozīmē, ka pašreizējai stacionārajai fāzei ir augsts slāpekļa svara procentuālais daudzums fenilmaleimīda dēļ. Līdzīgi, produktiem (4) un (5) ir attiecīgi 2,7% un 2,9% oglekļa saturs, savukārt gala produktam (6) ir 6,35% oglekļa saturs, kā parādīts 2. tabulā. Svara zuduma pārbaudei PMP stacionārajā fāzē tika izmantota termogravimetriskā analīze (TGA), un TGA līkne ir parādīta 4. attēlā. TGA līkne uzrāda 8,6% svara zudumu, kas labi atbilst oglekļa saturam (6,35%), jo ligandi satur ne tikai C, bet arī N, O un H.
Lai modificētu silīcija dioksīda daļiņu virsmu, tika izvēlēts ligands fenilmaleimīda-metilvinilizocianāts tā polāro fenilmaleimīda un vinilizocianāta grupu dēļ. Vinilizocianāta grupas var tālāk reaģēt ar stirolu, izmantojot dzīvo radikāļu polimerizāciju. Otrais iemesls ir ievietot grupu, kurai ir mērena mijiedarbība ar analītu un nav spēcīgas elektrostatiskas mijiedarbības starp analītu un stacionāro fāzi, jo fenilmaleimīda daļai normālā pH līmenī nav virtuāla lādiņa. Stacionārās fāzes polaritāti var kontrolēt ar optimālu stirola daudzumu un brīvo radikāļu polimerizācijas reakcijas laiku. Reakcijas pēdējais solis (brīvo radikāļu polimerizācija) ir kritisks, jo tas maina stacionārās fāzes polaritāti. Lai pārbaudītu oglekļa saturu šajās stacionārajās fāzēs, tika veikta elementanalīze. Ir novērots, ka, palielinot stirola daudzumu un reakcijas laiku, palielinās stacionārās fāzes oglekļa saturs un otrādi. Ar dažādām stirola koncentrācijām sagatavotiem SP ir atšķirīga oglekļa slodze. Līdzīgi šīs stacionārās fāzes tika novietotas uz nerūsējošā tērauda kolonnām, un tika pārbaudītas to hromatogrāfiskās īpašības (selektivitāte, izšķirtspēja, N vērtība utt.). Pamatojoties uz šiem eksperimentiem, tika izvēlēts optimizēts sastāvs PMP stacionārās fāzes sagatavošanai, lai nodrošinātu kontrolētu polaritāti un labu analīta aizturi.
PMP kolonna tika novērtēta arī piecu peptīdu maisījumu (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leicīns-enkefalīns) analīzei, izmantojot mobilās fāzes ietilpību. 60/40 (v/v) ACN/ūdens (0,1% TFA) ar plūsmas ātrumu 80 µl/min. Optimālos eluēšanas apstākļos (200 000 plākšņu/m2) teorētisko plākšņu (N) skaits uz kolonnu (100 × 1,8 mm) ir 20 000 ± 100. N vērtības trim PMP kolonnām ir parādītas 3. tabulā, un hromatogrammas ir parādītas 5.A attēlā. Ātra analīze ar lielu plūsmas ātrumu (700 µl/min) PMP kolonnā, pieci peptīdi eluējās vienas minūtes laikā, lieliska N vērtība 13 500 ± 330 uz kolonnu (100 x 1,8 mm diametrs), kas atbilst 135 000 plāksnēm/m (5.B att.). Trīs vienāda izmēra kolonnas (iekšējais diametrs 100 x 1,8 mm) tika piepildītas ar trim dažādām PMP stacionārās fāzes partijām, lai pārbaudītu atkārtojamību. Analīti tika reģistrēti katrā kolonnā, atdalot vienu un to pašu testa maisījumu katrā kolonnā, izmantojot optimālus eluēšanas apstākļus, teorētisko plākšņu skaitu N un aiztures laiku. PMP kolonnu atkārtojamības dati ir parādīti 4. tabulā. PMP kolonnas atkārtojamība labi korelēja ar ļoti zemām %RSD vērtībām, kā parādīts 3. tabulā.
Peptīdu maisījumu atdalīšana PMP kolonnā (B) un Ascentis Express RP-Amide kolonnā (A), mobilā fāze 60/40 ACN/H2O (TFA 0,1%), PMP kolonnas izmēri (100 x 1,8 mm iekšējais diametrs), analīze. Savienojumu eluēšanas secība: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) un 5 (leicīnskābes enkefalīns).
Cilvēka seruma albumīna triptiskās hidrolizāta atdalīšanai ar AŠH (Aukštā šķidruma hromatogrāfijas) metodi tika novērtēta PMP kolonna (iekšējais diametrs 100 x 1,8 mm). 6. attēlā redzamā hromatogramma parāda, ka paraugi ir labi atdalīti ar ļoti labu izšķirtspēju. HSA šķīdumi tika analizēti, izmantojot plūsmas ātrumu 100 μl/min, mobilo fāzi 70/30 acetonitrila/ūdens un 0,1% TFA. HSA šķelšanās tika sadalīta 17 pīķos, kā parādīts hromatogrammā (6. att.), kas atbilst 17 peptīdiem. Tika aprēķināta atsevišķu pīķu atdalīšanas efektivitāte no HSA hidrolizāta, un vērtības ir parādītas 5. tabulā.
HSA triptiskie hidrolizāti tika atdalīti PMP kolonnā (iekšējais diametrs 100 x 1,8 mm), plūsmas ātrums (100 μl/min), kustīgā fāze 60/40 acetonitrila/ūdens un 0,1% TFA.
kur L ir kolonnas garums, η ir mobilās fāzes viskozitāte, ΔP ir kolonnas pretspiediens un u ir mobilās fāzes lineārais ātrums. PMP kolonnas caurlaidība bija 2,5 × 10–14 m2, plūsmas ātrums bija 25 µl/min, tika izmantots 60/40 v/v. ACN/ūdens. PMP kolonnas (ID 100 × 1,8 mm) caurlaidība bija līdzīga mūsu iepriekšējā Ref.34 pētījumā noteiktajai. Ar virspusēji porainām daļiņām piepildītas kolonnas caurlaidība ir 1,7 × 10,6 µm, 2,5 × 10-14 m2 5 µm daļiņām43. Tāpēc PMP fāzes caurlaidība ir līdzīga serdeņa-apvalka daļiņu ar izmēru 5 μm caurlaidībai.
kur Wx ir ar hloroformu pildītās kolonnas masa, Wy ir ar metanolu pildītās kolonnas masa un ρ ir šķīdinātāja blīvums. Metanola (ρ = 0,7866) un hloroforma (ρ = 1,484) blīvums. Silīcija dioksīda-C18 daļiņu kolonnas (100 × 1,8 mm ID)34 un mūsu iepriekš pētītās C18-urīnvielas31 kolonnas kopējā porainība bija attiecīgi 0,63 un 0,55. Tas nozīmē, ka urīnvielas ligandu klātbūtne samazina stacionārās fāzes caurlaidību. No otras puses, PMP kolonnas (iekšējais diametrs 100 × 1,8 mm) kopējā porainība ir 0,60. PMP kolonnas ir mazāk caurlaidīgas nekā kolonnas, kas pildītas ar C18 saistītām silīcija dioksīda daļiņām, jo ​​C18 tipa stacionārajās fāzēs C18 ligandi ir piesaistīti silīcija dioksīda daļiņām lineārās ķēdēs, savukārt polistirola tipa stacionārajās fāzēs ap daļiņām veidojas relatīvi biezs polimērs. Tipiskā eksperimentā kolonnas porainību aprēķina šādi:
7A. un 7B. attēlā redzamas Van Dēmtera diagrammas PMP kolonnai (id 100 x 1,8 mm) un Ascentis Express RP-Amide kolonnai (id 100 x 1,8 mm) vienādos eluēšanas apstākļos, 60/40 ACN/H2O un 0,1% TFA, no 20 µl/min līdz 800 µl/min abās kolonnās. Minimālās HETP vērtības pie optimālā plūsmas ātruma (80 µl/min) bija attiecīgi 2,6 µm un 3,9 µm PMP kolonnai un Ascentis Express RP-Amide kolonnai. HETP vērtības liecina, ka PMP kolonnas (100 x 1,8 mm id) atdalīšanas efektivitāte ir daudz augstāka nekā komerciāli pieejamajai Ascentis Express RP-Amide kolonnai (100 x 1,8 mm id). Van Dēmtera grafiks 7. attēlā (A) parāda, ka N vērtības samazināšanās, palielinoties plūsmai, nav būtiski lielāka salīdzinājumā ar mūsu iepriekšējo pētījumu. PMP kolonnas (id 100 × 1,8 mm) augstākā atdalīšanas efektivitāte salīdzinājumā ar Ascentis Express RP-Amide kolonnu ir balstīta uz uzlabotu daļiņu formu un izmēru, kā arī uz sarežģīto kolonnas iepakošanas procedūru, kas tiek izmantota pašreizējā darbā34.
(A) Van Dēmtera grafiks (HETP pret mobilās fāzes lineāro ātrumu), iegūts PMP kolonnā (id 100 x 1,8 mm) 60/40 ACN/H2O ar 0,1% TFA. (B) Van Dēmtera grafiks (HETP pret mobilās fāzes lineāro ātrumu), iegūts Ascentis Express RP-Amide kolonnā (id 100 x 1,8 mm) 60/40 ACN/H2O ar 0,1% TFA.
Tika sagatavota un novērtēta interkalēta polistirola polārā stacionārā fāze sintētisko peptīdu maisījuma un cilvēka seruma albumīna (HSA) triptiskās hidrolizāta atdalīšanai augstas veiktspējas šķidruma hromatogrāfijā. PMP kolonnu hromatogrāfiskā veiktspēja peptīdu maisījumiem ir lieliska atdalīšanas efektivitātes un izšķirtspējas ziņā. Uzlabotā PMP kolonnu atdalīšanas efektivitāte ir saistīta ar vairākiem iemesliem, piemēram, silīcija dioksīda daļiņu izmēru un poru izmēru, kontrolētu stacionāro fāžu sintēzi un sarežģītiem kolonnu pildījuma materiāliem. Papildus augstajai atdalīšanas efektivitātei, vēl viena šīs stacionārās fāzes priekšrocība ir zems kolonnas pretspiediens pie lieliem plūsmas ātrumiem. PMP kolonnas ir ļoti reproducējamas un tās var izmantot peptīdu maisījumu analīzei un dažādu olbaltumvielu triptiskai šķelšanai. Mēs plānojam izmantot šo kolonnu bioaktīvo savienojumu atdalīšanai no dabīgiem produktiem, ārstniecības augu ekstraktiem un sēnēm šķidruma hromatogrāfijā. Nākotnē PMP kolonnas tiks novērtētas arī olbaltumvielu un monoklonālo antivielu atdalīšanai.
Fīlds, Dž. K., Eierbijs, M. R., Lau, Dž., Tēgersens, H. un Pētersons, P. Apgrieztās fāzes hromatogrāfijas peptīdu atdalīšanas sistēmu izpēte, I daļa: kolonnu raksturošanas protokola izstrāde. Fīlds, Dž. K., Eierbijs, M. R., Lau, Dž., Tēgersens, H. un Pētersons, P. Apgrieztās fāzes hromatogrāfijas peptīdu atdalīšanas sistēmu izpēte, I daļa: kolonnu raksturošanas protokola izstrāde.Fīlds, Dž. K., Overbijs, M. R., Lau, Dž., Togersens, H. un Pētersons, P. Peptīdu atdalīšanas sistēmu izpēte ar apgrieztās fāzes hromatogrāfiju, I daļa: Kolonnas raksturošanas protokola izstrāde. Fīlds, Dž. K., Eierbijs, M. R., Lau, Dž., Tēgersens, H. un Pētersons, P. Apgrieztās fāzes hromatogrāfijas peptīdu atdalīšanas sistēmu izpēte, I daļa: kolonnu raksturlielumu protokola izstrāde. Fīlds, Dž. K., Eierbijs, M. R., Lau, Dž., Tēgersens, H. un Pētersons, P. Apgrieztās fāzes hromatogrāfijas peptīdu atdalīšanas sistēmu izpēte, I daļa: kolonnu raksturlielumu protokola izstrāde.Fīlds, Dž. K., Overbijs, M. R., Lau, Dž., Togersens, H. un Pētersons, P. Peptīdu atdalīšanas sistēmu izpēte ar apgrieztās fāzes hromatogrāfiju, I daļa: Kolonnas raksturošanas protokola izstrāde.J.色谱法。 1603，113-129。 https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038(2019).
Gomez, B. et al. Uzlabotu aktīvo peptīdu radīšanas metodes infekcijas slimību ārstēšanai. Biotechnology. Achievements 36(2), 415–429. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. un Khrestchatisky, M. Sintētiskie terapeitiskie peptīdi: zinātne un tirgus. Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. un Khrestchatisky, M. Sintētiskie terapeitiskie peptīdi: zinātne un tirgus.Vliege P., Lisowski V., Martinez J. un Chreschatyski M. Sintētiskie terapeitiskie peptīdi: zinātne un tirgus.Vliege P., Lisowski V., Martinez J. un Khreschatsky M. Sintētiskie terapeitiskie peptīdi: zinātne un tirgus. Zāļu atklāšana. Today 15 (1–2), 40–56. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Uzlabotā proteomiskā šķidruma hromatogrāfija. Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Uzlabotā proteomiskā šķidruma hromatogrāfija.Skatīt F., Smith RD un Shen Yu. Uzlabotā proteomiskā šķidruma hromatogrāfija. Xie, F., Smith, RD un Shen, Y. 高级蛋白质组液相色谱. Xie, F., Smith, RD un Shen, Y. Uzlabots olbaltumvielu sastāvs 液相色谱.Skatīt F., Smith RD un Shen Yu. Uzlabotā proteomiskā šķidruma hromatogrāfija.J. Hromatogrāfija. A 1261, 78.–90. lpp. (2012. g.).
Liu, W. et al. Uzlabotā šķidruma hromatogrāfijas-masas spektrometrijas metode spēj apvienot plaša mēroga metabolomiku un proteomiku. anus. Chim. Acta 1069, 89–97 (2019).
Česnuts, SM un Solsberijs, Dž. Dž. UHPLC loma farmaceitiskajā izstrādē. Česnuts, SM un Solsberijs, Dž. Dž. UHPLC loma farmaceitiskajā izstrādē.Česnuts, SM un Solsberijs, Dž. Dž. UHPLC loma farmaceitiskajā izstrādē.Chesnut, SM un Salisbury, JJ UHPLC loma zāļu izstrādē. J. Sept Science. 30(8), 1183–1190 (2007).
Vu, N. un Klausens, AM. Īpaši augsta spiediena šķidruma hromatogrāfijas fundamentālie un praktiskie aspekti ātrai atdalīšanai. Vu, N. un Klausens, AM. Īpaši augsta spiediena šķidruma hromatogrāfijas fundamentālie un praktiskie aspekti ātrai atdalīšanai.Vu, N. un Klausens, AM. Augstspiediena šķidruma hromatogrāfijas pamatelementi un praktiskie aspekti ātrai atdalīšanai. Wu, N. & Clausen, AM 用于快速分离的超高压液相色谱的基础和实践方面. Vu, N. un Klausens, AM. Īpaši augsta spiediena šķidruma hromatogrāfijas pamata un praktiskie aspekti ātrai atdalīšanai.Vu, N. un Klausens, AM. Augstspiediena šķidruma hromatogrāfijas pamatelementi un praktiskie aspekti ātrai atdalīšanai.Žurnāls “Sept. Zinātne”. 30(8), 1167.–1182. lpp. https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Rens, SA un Čeličefs, P. Ultraizcilās šķidruma hromatogrāfijas izmantošana farmaceitiskajā izstrādē. Rens, SA un Čeličefs, P. Ultraizcilās šķidruma hromatogrāfijas izmantošana farmaceitiskajā izstrādē.Ren, SA un Chelischeff, P. Ultra augstas veiktspējas šķidruma hromatogrāfijas izmantošana farmaceitiskajā izstrādē. Wren, SA & Tchelitcheff, P. 超高效液相色谱在药物开发中的应用. Rens, SA un Čeličevs, P.Ren, SA un Chelischeff, P. Ultraperformance šķidruma hromatogrāfijas pielietojums zāļu izstrādē.J. Hromatogrāfija. 1119(1–2), 140.–146. lpp. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006. g.).
Gu, H. et al. Monolīts makroporains hidrogels, kas iegūts no eļļas-ūdenī emulsijas ar augstu iekšējo fāzi, efektīvai enterovīrusa 71 attīrīšanai. Ķīmiskais projekts. Žurnāls 401, 126051 (2020).
Ši, J., Sjans, R., Horvāts, K. un Vilkinss, Dž.A. Šķidrumhromatogrāfijas loma proteomikā. Ši, J., Sjans, R., Horvāts, K. un Vilkinss, Dž.A. Šķidrumhromatogrāfijas loma proteomikā.Ši, J., Sjans, R., Horvāts, C. un Vilkinss, Dž.A. Šķidruma hromatogrāfijas loma proteomikā. Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA 液相色谱在蛋白质组学中的作用. Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JAŠi, J., Sjans, R., Horvāts, C. un Vilkinss, Dž.A. Šķidruma hromatogrāfijas loma proteomikā.J. Hromatogrāfija. A 1053 (1–2), 27–36 (2004).
Fekete, S., Vutey, J.-L. & Guillarme, D. Jaunas tendences terapeitisko peptīdu un olbaltumvielu atdalīšanā ar apgrieztās fāzes šķidruma hromatogrāfijas metodi: teorija un pielietojums. & Guillarme, D. Jaunas tendences terapeitisko peptīdu un olbaltumvielu atdalīšanā ar apgrieztās fāzes šķidruma hromatogrāfijas metodi: teorija un pielietojums. & Guillarme, D. Новые тенденции в разделении терапевтических пептидов и белков с помощью жидкостной хромора фазой: теория и приложения. & Guillarme, D. Jaunas tendences terapeitisko peptīdu un olbaltumvielu atdalīšanā ar reversās fāzes šķidruma hromatogrāfiju: teorija un pielietojumi. & Guillarme, D. 治疗性肽和蛋白质的反相液相色谱分离的新趋势：理论和应用. & Guillarme, D.un Guillarmé, D. Jaunas tendences terapeitisko peptīdu un olbaltumvielu atdalīšanā ar reversās fāzes šķidruma hromatogrāfiju: teorija un pielietojums.J. Pharm. Biomedicīnas zinātne. tūpļa atvere. 69, 9–27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE un Gebler, JC Divdimensiju peptīdu atdalīšana, izmantojot RP-RP-HPLC sistēmu ar atšķirīgu pH pirmajā un otrajā atdalīšanas dimensijā. Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE un Gebler, JC Divdimensiju peptīdu atdalīšana, izmantojot RP-RP-HPLC sistēmu ar atšķirīgu pH pirmajā un otrajā atdalīšanas dimensijā.Gilar M., Olivova P., Dali AE un Gebler JK Divdimensiju peptīdu atdalīšana, izmantojot RP-RP-HPLC sistēmu ar atšķirīgu pH pirmajā un otrajā atdalīšanas dimensijā.Gilar M., Olivova P., Dali A. E. un Gebler J. K. Divdimensiju peptīdu atdalīšana, izmantojot dažādas pH vērtības pirmajā un otrajā atdalīšanas dimensijā, izmantojot RP-RP-HPLC sistēmu. J. Sept Science. 28 (14), 1694–1703 (2005).
Fellitti, S. et al. Augstas veiktspējas hromatogrāfijas kolonnu, kas pildītas ar pilnībā porainām un virspusēji porainām C18 daļiņām, kas mazākas par 2 µm, masas pārneses un kinētisko raksturlielumu pētījums. J. Sept Science. 43 (9–10), 1737–1745 (2020).
Piovesana, S. u.c. Jaunākās tendences un analītiskie izaicinājumi augu bioaktīvo peptīdu izolēšanā, identificēšanā un validācijā. anus. Creature anal. Chemical. 410(15), 3425–3444. https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Mullers, Dž. B. u.c. Dzīvības valstības proteomiskā ainava. Nature 582 (7813), 592.–596. lpp. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
De Luca, K. et al. Terapeitisko peptīdu pēcapstrāde ar preparatīvo šķidruma hromatogrāfiju. Molecules (Bāzele, Šveice) 26(15), 4688 (2021).
Yang, Y. un Geng, X. Jaukta režīma hromatogrāfija un tās pielietojums biopolimēros. Yang, Y. un Geng, X. Jaukta režīma hromatogrāfija un tās pielietojums biopolimēros.Yang, Yu. un Geng, X. Jauktā režīma hromatogrāfija un tās pielietojums biopolimēriem. Yang, Y. & Geng, X. 混合模式色谱及其在生物聚合物中的应用. Yang, Y. un Geng, X. Jauktā režīma hromatogrāfija un tās pielietojums biopolimēros.Jangs, Ju. un Džīns, S. Jauktā režīma hromatogrāfija un tās pielietojums biopolimēros.Žurnāls “Hromatogrāfija”. A 1218(49), 8813.–8825. lpp. (2011. g.).