Paldies, ka apmeklējāt vietni Nature.com.Jūsu izmantotajai pārlūkprogrammas versijai ir ierobežots CSS atbalsts.Lai nodrošinātu vislabāko pieredzi, ieteicams izmantot atjauninātu pārlūkprogrammu (vai atspējot saderības režīmu pārlūkprogrammā Internet Explorer).Tikmēr, lai nodrošinātu nepārtrauktu atbalstu, mēs atveidosim vietni bez stiliem un JavaScript.
Angustifolius lupīna (NLL, Lupinus angustifolius L.) ir pākšaugs, ko izmanto pārtikas ražošanā un augsnes uzlabošanā.NLL kā kultūrauga globālā izplatība ir piesaistījusi daudzas patogēnas sēnītes, tostarp lupīnas antracnozi, kas izraisa postošo antracnozes slimību.NLL audzēšanā ir izmantotas divas alēles, Lanr1 un AnMan, kas nodrošina paaugstinātu rezistenci, taču pamatā esošie molekulārie mehānismi joprojām nav zināmi.Šajā pētījumā Lanr1 un AnMan marķieri tika izmantoti, lai pārbaudītu Eiropas NLL paraugus.Vakcīnas testēšana kontrolētā vidē apstiprināja abu rezistentu donoru efektivitāti.Diferenciālā gēnu ekspresijas profilēšana tika veikta reprezentatīvām rezistentām un jutīgām līnijām.Rezistence pret antracnozi bija saistīta ar gēnu ontoloģijas terminu “GO:0006952 Defense Response”, “GO:0055114 Redox Process” un “GO:0015979 Photosinthesis” pārmērīgu ekspresiju.Turklāt līnija Lanr1 (83A: 476) uzrādīja ievērojamu transkripta pārprogrammēšanu ātri pēc inokulācijas, savukārt pārējās līnijas uzrādīja šīs atbildes aizkavēšanos par aptuveni 42 stundām.Aizsardzības reakcijas ir saistītas ar TIR-NBS, CC-NBS-LRR un NBS-LRR gēniem, 10 proteīniem, kas iesaistīti patoģenēzē, lipīdu pārneses proteīniem, endoglikāna-1,3-β-glikozidāzi, ar glicīnu bagātiem šūnu sienas proteīniem un gēniem no reaktīvā skābekļa ceļa.Agrīnas atbildes reakcijas uz 83A:476, tostarp rūpīga ar fotosintēzi saistīto gēnu nomākšana, sakrita ar veiksmīgu aizsardzību sēnīšu bioloģijas veģetatīvās augšanas fāzē, kas liecina, ka efektors izraisa imunitāti.Mandeloop reakcija ir palēnināta, tāpat kā vispārējā horizontālā pretestība.
Šaurlapu lupīna (NLL, Lupinus angustifolius L.) ir labība ar augstu proteīna saturu, kuras izcelsme ir Vidusjūras rietumu reģionā1,2.Pašlaik to audzē kā pārtikas kultūru dzīvniekiem un cilvēkiem.To uzskata arī par zaļmēslojumu augsekas sistēmās, jo slāpekli piesaista simbiotiskās slāpekli fiksējošās baktērijas un kopumā uzlabojas augsnes struktūra.Pagājušajā gadsimtā NLL ir piedzīvojis strauju pieradināšanas procesu un joprojām ir pakļauts lielam vairošanās spiedienam3,4,5,6,7,8,9,10,11,12.Plaši audzējot LLL, patogēno sēņu pēctecība attīstīja jaunas lauksaimniecības nišas un izraisīja jaunas ražu postošas ​​slimības. Lupīnu audzētājiem un audzētājiem visievērojamākā bija antracnozes parādīšanās, ko izraisīja patogēnā sēne Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Lupīnu audzētājiem un audzētājiem visievērojamākā bija antracnozes parādīšanās, ko izraisīja patogēnā sēne Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Наиболее примечательным для фермеров и селекционеров люпина было появление антракноза, вызванногоныrich памто Nirenbergs, Feilers un Hagedorns13. Visvairāk lupīnu audzētāju un audzētāju vidū bija antracnozes parādīšanās, ko izraisīja patogēnā sēne Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是由病tondarum) enberg, Feiler un Hagedorn13 引起的. Наиболее поразительным для фермеров и селекционеров люпина является появление антракмриотерих, вызбонкопигогогомионеров Bondars) Nirenbergs, Feilers un Hagedorns13. Visvairāk lupīnu audzētājus un audzētājus pārsteidz antracnozes parādīšanās, ko izraisa patogēnā sēne Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.Pirmie ziņojumi par šo slimību tika saņemti no Brazīlijas un ASV, un tipiski simptomi parādījās attiecīgi 1912. un 1929. gadā.Tomēr pēc aptuveni 30 gadiem patogēns tika apzīmēts kā Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc., teleomorfs Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorfs Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., телеоморф Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld teleomorfs. & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld в Целенаправленной морфологии. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld in Targeted Morphology. Sākotnējā slimības fenotipēšana, kas veikta 20. gadsimta vidū, uzrādīja zināmu rezistenci pret NLL un dzeltenās lupīnas (L. luteus L.) augiem, bet visas pārbaudītās baltās lupīnas (L. albus L.) bija ļoti jutīgas15,16.Pētījumi liecina, ka antracnozes attīstība ir saistīta ar paaugstinātu nokrišņu daudzumu (gaisa mitrumu) un temperatūru (diapazonā no 12-28°C), izraisot pretestības pārkāpumu augstākās temperatūrās17, 18. Faktiski laiks, kas nepieciešams, lai konidijas uzdīgtu un sāktos slimība, bija četras reizes īsāks 24°C temperatūrā pie augsta mitruma (16 12 stundas)9.Tādējādi notiekošā globālā sasilšana ir izraisījusi antracnozes izplatīšanos.Tomēr slimība tika novērota Francijā (1982. gadā) un Ukrainā (1983. gadā) kā gaidāmo draudu priekšvēstnesis, taču tolaik lupīnu rūpniecība to acīmredzot ignorēja20,21.Dažus gadus vēlāk šī postošā slimība izplatījās visā pasaulē un skāra arī tādas lielākās lupīnu ražotājvalstis kā Austrālija, Polija un Vācija22,23,24.Pēc antracnozes uzliesmojuma 90. gadu vidū, plašā skrīninga rezultātā NLL19 paraugos tika identificēti vairāki rezistenti donori.NLL rezistenci pret antracnozi kontrolē divas atsevišķas dominējošās alēles, kas atrodamas dažādos germplazmas avotos: Lanr1 šķirnē Tanjil un Wonga un AnMan šķirnē.Mandalay 25, 26. Šīs alēles papildina molekulāros marķierus, kas atbalsta rezistentas germplazmas selekciju selekcijas programmās25,26,27,28,29,30.Rezistentā vaislas līnija 83A:476, kas satur Lanr1 alēli, tika šķērsota ar jutīgo savvaļas līniju P27255, lai iegūtu RIL populāciju, kas segregētu pēc antracnozes rezistences, kas ļāva piešķirt Lanr1 lokusu hromosomai NLL-1131, 32, 33. Genomātiskā rezistences marķieri ar antllh-saites kartēšanu. atklāja visu trīs alēļu atrašanās vietu tajā pašā hromosomā (NLL-11), bet dažādās pozīcijās 29, 34, 35.Tomēr, ņemot vērā nelielo RIL skaitu un lielo ģenētisko attālumu starp marķieriem un atbilstošajām alēlēm, nevar izdarīt ticamus secinājumus par to pamatā esošajiem gēniem.No otras puses, apgrieztās ģenētikas izmantošana lupīnām ir sarežģīta to ļoti zemā reģenerācijas potenciāla dēļ, kas padara ģenētisko manipulāciju apgrūtinošu37.
Pieradinātas dīgļu plazmas attīstība, kas homozigotā stāvoklī satur vēlamo alēli, piemēram, 83A: 476 (Lanr1) un Mandelup (AnMan), ir pavērusi iespēju pētīt rezistenci pret antracnozi, ņemot vērā pretēju alēļu kombināciju klātbūtni savvaļas populācijās.Molekulāro mehānismu iespējas.Salīdziniet aizsardzības reakcijas, ko rada konkrēti genotipi.Šajā pētījumā tika novērtēta NLL agrīna transkripta reakcija uz C. lupini vakcināciju.Pirmkārt, tika pārbaudīts Eiropas NLL germplazmas panelis, kurā bija 215 līnijas, izmantojot molekulāros marķierus, kas iezīmē Lanr1 un AnMan alēles.Pēc tam kontrolētos apstākļos antracnozes fenotipēšana tika veikta 50 NLL līnijām, kas iepriekš tika atlasītas molekulārajiem marķieriem.Pamatojoties uz šiem eksperimentiem, diferenciālai aizsardzības gēnu ekspresijas profilēšanai tika atlasītas četras līnijas, kas atšķiras ar antracnozes rezistenci un Lanr1 / AnMan alēļu sastāvu, izmantojot divas komplementāras pieejas: augstas caurlaidības RNS sekvencēšanu un reāllaika PCR kvantitatīvo noteikšanu.
Trīspadsmit līnijas radīja divas Lanr1 marķiera “rezistentas” alēles, un 8 līnijas radīja Lanr1 “izturīgas” alēles.AnMan marķiera “pretestības” alēle (papildu tabula S1).Divas līnijas bija heterozigotas Anseq3 marķierim un viena heterozigotas AnManM1 marķierim.42 līnijās (19, 5%) bija pretējas Anseq3 un Anseq4 alēļu fāzes, kas norāda uz augstu rekombinācijas biežumu starp šiem diviem lokusiem.Antracnozes fenotipi kontrolētos apstākļos (S2 papildu tabula) atklāja pārbaudīto genotipu rezistences mainīgumu, kas atspoguļojās antracnozes smaguma pakāpē.Vidējo punktu atšķirības svārstījās no 1,8 (vidēji izturīgs) līdz 6,9 (jutīgs), un augu svara atšķirības svārstījās no 0,62 (jutīgs) līdz 4,45 g (izturīgs). Bija nozīmīga korelācija starp vērtībām, kas novērotas divās eksperimenta atkārtojumos (0,51 slimības smaguma pakāpei, P = 0,00017 un 0,61 augu svaram, P < 0,0001), kā arī starp šiem diviem parametriem (-0,59 un -0,77, P <0,0001). Bija nozīmīga korelācija starp vērtībām, kas novērotas divās eksperimenta atkārtojumos (0,51 slimības smaguma rādītājiem, P = 0,00017 un 0,61 augu svaram, P < 0,0001), kā arī starp šiem diviem parametriem (-0,59 un -0,77, P <0,0001). Выявлена ​​достоверная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностях эксперимента (0,51 тбизбялдоле , P = 0,00017 un 0,61 для массы растения, P < 0,0001), а также между этими двумя параметрами (-0,59 un -0,7,0,0 Р0,7,0). Tika konstatēta būtiska korelācija starp vērtībām, kas novērotas divos eksperimenta atkārtojumos (0,51 slimības smaguma pakāpei, P = 0,00017 un 0,61 augu svaram, P < 0,0001), kā arī starp šiem diviem parametriem (- 0,59 un -0,77, P < 0,0000)1).在两次重复实验中观察到的值之间存在显着相关性（疾病严重复实验中观察到的值之间存在显着相关性（疾病严重复实验中观察度评分1︌物重量为0,61, P < 0,0001）以及这两个参数之间（- 0,59 和- 0,77，P < 0,0001).在 两 次 重复 实验 中 观察 的 值 之间 存在 相关性 （疾病 严 庍 程 円 证. 1 ， p = 0,00017 ， 植物 为 为 0,61 ， p < 0,0001） 以及 两 个 参数 之 间 （（（，和和 和 5-9-5-5-0.和 – 0,59 和 – 0,77, P < 0,0001). Наблюдалась значительная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностях, = ваз0, P010, P01,0 0017 un масса растения 0,61, P <0,0001), и между этими двумя параметрами (-0,59 un -0,0001) 0,77, P <0,0001. Bija nozīmīga korelācija starp vērtībām, kas novērotas divos eksemplāros (slimības smaguma pakāpe 0,51, P = 0,00017 un auga svars 0,61, P < 0,0001) un starp šiem diviem parametriem (-0,59 un -0 ,0001) 0,77, P <0,0001. ).Tipiski simptomi, kas novēroti uzņēmīgiem augiem, ir stublāja saliekšanās un sagriešanās, kas atgādina “ganu loka” struktūru, kam seko ovāli bojājumi ar oranžiem/rozā sporozoītiem (1. papildu attēls).Austrālijas pievienojumi, kas satur Lanr1 (83A: 476 un Tanjil) un AnMan (Mandelup) gēnus, ir vidēji izturīgi, 0, 0331 un 0, 0036.Dažām līnijām, kurās ir arī “rezistentas” Lanr1 un/vai AnMan alēles, ir slimības simptomi.
Interesanti, ka dažas NLL līnijas, kurām nebija nekādu “rezistentu” marķiera alēļu, atklāja augstu antracnozes rezistences līmeni (salīdzināmu vai augstāku nekā Lanr1 vai AnMan genotipiem), piemēram, Boregine (P vērtība < 0,0001 abiem parametriem), Bojar (P vērtība < 0,0001 punktu skaitam un 0,001 populāciju vērtība B-9b/7 augam) un 0,001 P9b/7. 1 punktu skaitam un nenozīmīga svaram). Interesanti, ka dažas NLL līnijas, kurām nebija nekādu “rezistentu” marķiera alēļu, atklāja augstu antracnozes rezistences līmeni (salīdzināmu vai augstāku nekā Lanr1 vai AnMan genotipiem), piemēram, Boregine (P vērtība < 0,0001 abiem parametriem), Bojar (P vērtība < 0,0001 punktu skaitam un 0,001 populāciju vērtība B-9b/7 augam) un 0,001 P9b/7. 1 punktu skaitam un nenozīmīga svaram). Интересно, что несколько линий NLL, лишенных какого-либо «резистентного» маркерного аллеля, показали высовейх высколько высокий кнозу (сопоставимый или более высокий, чем для генотипов Lanr1 или AnMan), таких как Boregine (значение P <0,00001 длхерона) е P < 0,0001 для оценки и 0,001 для массы растения) un популяции B-549/79b (значение P <0,0001 для для оценесломоцен). Interesanti, ka vairākām NLL līnijām, kurām nebija nekādu “rezistentu” marķiera alēļu, bija augsts rezistences līmenis pret antracnozi (salīdzināms ar Lanr1 vai AnMan genotipiem vai augstāks par to), piemēram, Boregine (P vērtība < 0,0001 abiem parametriem ), Bojar (P vērtība < 0,0001 novērtējumam un B vērtība < 0,0001 novērtējumam un B vērtība < 0,0001 populācijai (auga svaram — 0, 0,0) un 7,0 b) 01 novērtēšanai un nav nozīmīga svaram).有趣的是，一些缺乏任何“抗性”标记等位基因的NLL 系显示出高気平示出高気平的炭爊気平的玁基因型相当或更高），例如Boregine（两个参数的P 值< 0,0001）、Bojar（P 值、伩麏001＇0.0 .001）和种群B-549/79b（得分P 值< 0,0001，重量不显着）. Interesanti, ka dažām NLL sistēmām, kurām nav “antigēnu” marķieru, ir augsta horizontālā pretestība (ekvivalents Lanr1 vai AnMan gēniem vai augstāks), piemēram, Boregine (abi parametri P < 0,0001), Bojar (P vērtība < 0,0001, auga svars 0,001) un celms B-549/0,00, svars nav nozīmīga. Интересно, что некоторые линии NLL, лишенные каких-либо маркерных аллелей «резистентности», показали высочвистеустусок ракнозу (сравнимые или выше, чем у генотипов Lanr1 или AnMan), такие как Boregine (значение P для обоих параметров, <0,00,001), Boчja 0,000 са растения 0,001) un популяция B-549/79b (оценка P-значение <0,0001, масса незначительна). Interesanti, ka dažām NLL līnijām, kurām nebija nekādu “rezistences” marķieru alēļu, bija augsts antracnozes rezistences līmenis (salīdzināms ar Lanr1 vai AnMan genotipiem vai lielāks par tiem), piemēram, Boregine (P vērtība abiem parametriem <0,0001) , Bojar (P vērtība < 0,0001, augu svars <0,0001, augu svars < 0,0-04) un P70-04 populācija. 01, svars nav būtisks).Šī parādība liecina par jauna ģenētiska rezistences avota iespējamību, izskaidrojot novēroto korelācijas trūkumu starp marķieru genotipiem un slimības fenotipiem (P vērtības no ~ 0, 42 līdz ~ 0, 98).Tādējādi Kolmogorova-Smirnova tests parādīja, ka dati par rezistenci pret antracnozi bija aptuveni normāli sadalīti rādītājiem (P vērtības 0,25 un 0,11) un augu masa (P vērtības 0,47 un 0,55), kas liek domāt, ka ir iesaistīti vairāk alēļu nekā Lanr1 un AnMan.
Pamatojoties uz antracnozes rezistences skrīninga rezultātiem, transkripta analīzei tika atlasītas 4 līnijas: 83A:476, Boregine, Mandelup un Population 22660. Šīs līnijas tika atkārtoti pārbaudītas uz Sibīrijas mēra rezistenci inokulācijas eksperimentos ar RNS sekvencēšanu, ja tās bija tādas pašas kā iepriekšējā testā.Punktu vērtības bija šādas: Boregin (1,71 ± 1,39), 83A: 476 (2,09 ± 1,38), Mandelup (3,82 ± 1,42) un 22 660 populācijas (6,11 ± 1,29).
Protokols Illumina NovaSeq 6000 sasniedza vidēji 40,5 Mread pārus vienā paraugā (29,7–54,4 Mreads) (papildu tabula S3).Izlīdzināšanas rādītāji atsauces secībā svārstījās no 75,5% līdz 88,6%.Nolasījumu skaita datu vidējā korelācija starp eksperimentālajiem variantiem starp bioloģiskajiem atkārtojumiem bija robežās no 0,812 līdz 0,997 (vidēji 0,959). No 35 170 analizētajiem gēniem 2917 neatklāja ekspresiju, un pārējie 4785 gēni tika izteikti nenozīmīgā līmenī (bāzes vidējais rādītājs < 5). No 35 170 analizētajiem gēniem 2917 neatklāja ekspresiju, un pārējie 4785 gēni tika izteikti nenozīmīgā līmenī (bāzes vidējais rādītājs < 5). No 35 170 analizētajiem gēniem 2917 neuzrādīja ekspresiju, un pārējie 4785 gēni tika izteikti nenozīmīgā līmenī (bāzes vidējais rādītājs <5). No 35 170 analizētajiem gēniem 2917 nebija izteikti, un pārējiem 4785 gēniem bija nenozīmīga ekspresija (bāzes vidējais rādītājs <5).Tādējādi eksperimenta laikā tika uzskatīts, ka izteikts gēnu skaits (bāzes vidējais ≥ 5) bija 27 468 (78, 1%) (papildu tabula S4).
No pirmā laika punkta visas NLL līnijas reaģēja uz C. lupini (celms Col-08) inokulāciju, pārprogrammējot transkriptu (1. tabula), tomēr starp līnijām tika novērotas būtiskas atšķirības.Tādējādi rezistences līnija 83A:476 (kas nes Lanr1 gēnu) uzrādīja būtisku transkripta pārprogrammēšanu pirmajā laika punktā (6 hpi) ar 31-69 reizes lielāku izolēto augšup un lejup vērsto gēnu skaitu, salīdzinot ar citiem laika punktiem šajā laika punktā.Turklāt šis maksimums bija īslaicīgs, jo otrajā laika punktā (12 hpi) būtiski mainījās tikai dažu gēnu ekspresija.Interesanti, ka Boregine, kas arī transplantāta testā uzrādīja augstu pretestības līmeni, eksperimenta laikā netika pakļauts tik lielai transkripcijas pārprogrammēšanai.Tomēr diferenciāli ekspresēto gēnu (DEG) skaits bija vienāds Boregine un 83A:476 pie 12 HPI.Gan Mandelup, gan populācija 22660 uzrādīja DEG maksimumus pēdējā laika punktā (48 l/s), kas norāda uz relatīvu aizsardzības reakciju aizkavi.
Tā kā 83A:476 tika veikta masveida transkripta pārprogrammēšana, reaģējot uz C. lupini pie 6 HPI, salīdzinot ar visām pārējām līnijām, ~91% no šajā laika punktā novērotajiem DEG bija ciltsraksti (1. att.).Tomēr agrīnās atbildes daļēji pārklājās starp pētījuma līnijām, jo ​​attiecīgi 68,5%, 50,9% un 52,6% DEG Boregine, Mandelup un populācijā 22660, noteiktos laika punktos pārklājās ar 83A:476.Tomēr šie DEG veidoja tikai nelielu daļu (0, 97–1, 70%) no visiem DEG, kas pašlaik tika atklāti, izmantojot 83A: 476.Turklāt 11 DEG no visām līnijām šajā laikā bija saskaņoti (papildu tabulas S4-S6), ieskaitot kopīgus augu aizsardzības reakciju komponentus: lipīdu pārneses proteīnu (TanjilG_32225), endoglikāna-1,3-β-glikozīda enzīmu (TanjilG_23384), divus stresa izraisītus proteīnus (TanjilG_23384), divus stresa izraisītus proteīnus S4AMl22, piemēram, T5AMl2. 31), pamata lateksa proteīns (TanjilG_32352) un divi ar glicīnu bagāti strukturālie šūnu sienas proteīni (TanjilG_19701 un TanjilG_19702).Bija arī relatīvi liela transkripta reakciju pārklāšanās starp 83A:476 un Boregine pie 24 HPI (kopā 16–38% G) un starp Mandelup un Population 22660 pie 48 HPI (kopā 14–20% DEG).
Venna diagramma, kas parāda diferenciāli ekspresēto gēnu (DEG) skaitu šaurlapu lupīnas (NLL) līnijās, kas inokulētas ar Colletotrichum lupini (celms Col-08, kas iegūts no lupīnu laukiem Wierzhenice, Polijā, 1999).Analizētās NLL līnijas bija: 83A:476 (rezistenta, ar Lanr1 alēli), Boregine (rezistents, ģenētiskais fons nav zināms), Mandelup (vidēji rezistenta, ar AnMan alēli) un populācija 22660 (ļoti jutīga).Saīsinājums hpi apzīmē stundas pēc vakcinācijas.Nulles vērtības ir noņemtas, lai vienkāršotu grafiku.
Pārmērīgi ekspresētu gēnu komplekts pie 6 hpi tika analizēts, lai noteiktu kanonisko R gēnu domēnu klātbūtni (S7 papildu tabula).Šis pētījums atklāja klasisko slimību rezistences gēnu transkripta indukciju ar NBS-LRR domēniem tikai pie 83A: 476.Šis komplekts sastāvēja no viena TIR-NBS-LRR gēna (tanjilg_05042), pieciem CC-NBS-LRR gēniem (tanjilg_06165, tanjilg_06162, tanjilg_22773, tanjilg_22640 un tanjilg_16162) un četriem NBS_LR (tanjilg_LR un Tanjilg6LR (Tanjilg6,16162). 162), kā arī Four NBS-Lrr (tanjilg_16162) un Four NBS-LRR (TANJILG_16162).Visiem šiem gēniem ir kanoniski domēni, kas sakārtoti konservētās sekvencēs.
Gēni ar ievērojami mainītu ekspresiju, reaģējot uz inokulāciju ar C. lupini (celms Col-08), tika pakļauti gēnu ontoloģijas (GO) bagātināšanas analīzei (papildu tabula S8). Visbiežāk pārspīlētais bioloģiskā procesa termins bija “GO:0006952 aizsardzības reakcija”, kas parādījās 6 no 16 (laiks × līnija) kombinācijām ar augstu nozīmīgumu (P vērtība < 0,001) (2. attēls). Visbiežāk pārspīlētais bioloģiskā procesa termins bija “GO:0006952 aizsardzības reakcija”, kas parādījās 6 no 16 (laiks × līnija) kombinācijām ar augstu nozīmīgumu (P vērtība < 0,001) (2. attēls). Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 защикятный», потвсятный 6 из 16 (время × линия) комбинаций с высокой значимостью (значение P <0,001) (рис. 2). Visbiežāk pārspīlētais bioloģiskā procesa termins bija “GO:0006952 aizsardzības reakcija”, kas parādījās 6 no 16 (laiks × līnija) kombinācijām ar augstu nozīmīgumu (P vērtība < 0,001) (2. attēls).最常被过度代表的生物过程术语是"GO:0006952 防御反应"，它出现在16 个（现在16 丶个中，具有高显着性(P 值< 0,001）（图2）). Visreprezentatīvākais bioloģiskā procesa termins ir “GO:0006952 aizsardzības reakcija”, kas parādās 6 no 16 (时间×线) kombinācijām ar augstu nozīmīgumu (P vērtība < 0,001) (图2) . Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 Defense Response», копяр1, копяры инаций (время × линия) с высокой значимостью (значение P <0,001) (рис. 2). Visbiežāk pārspīlētais bioloģiskā procesa termins bija 'GO:0006952 Defense Response', kas parādījās 6 no 16 kombinācijām (laiks × līnija) ar augstu nozīmīgumu (P vērtība < 0,001) (2. attēls).Šis termins bija pārāk pārstāvēts divos laika punktos 83A: 476 un Boregine (6 un 24 hpi) un vienā laika punktā Mandelup un Population 22660 (attiecīgi 12 un 6 hpi).Tas ir sagaidāms rezultāts, izceļot rezistento līniju pretsēnīšu reakciju.Turklāt 83A:476 reaģēja uz C. lupini, strauji ierosinot gēnus, kas saistīti ar oksidatīvo sprādzienu, ko apzīmē ar terminu “GO:0055114 redox process”, norādot uz īpašu aizsardzības reakciju, savukārt Boregine atklāja specifiskas aizsardzības reakcijas, kas saistītas ar terminu “GO”.:0006950 Stresa reakcija”.Populācija 22660 aktivizēja horizontālo rezistences reakciju, iesaistot sekundāros metabolītus, izceļot pārmērīgu skaitu terminu “GO:0016104 Triterpēna biosintēzes process” un “GO:0006722 Triterpēna metabolisma process” (abi termini pieder vienam un tam pašam gēnu kopumam ), ņemot vērā Boregēna bagātināšanas reakcijas2 stabilitātes analīzes rezultātus, GO6 termins. 60. Turklāt agrīnā reakcija 83A:476 (6 hpi) un aizkavētā reakcija Mandelup un populācija 22660 ietver terminu GO:0015979 “fotosintēze” un citus saistītos bioloģiskos procesus.
Bioprocesa gēnu ontoloģijas termini, kas atlasīti diferenciāli ekspresētu gēnu anotācijā šaurlapu lupīnas (NLL) transkripta reakciju laikā, kas inokulēta ar Sibīrijas mēra lupīnu (Col-08 celms, kas iegūts no lupīnu laukiem Wierzhenice, Polijā, 1999. gadā), ir stipri pārspīlēti.Analizētās NLL līnijas bija: 83A:476 (rezistenta, ar homozigotu Lanr1 alēli), Boregine (rezistents, nezināms ģenētiskais fons), Mandelup (vidēji rezistenta, ar homozigotu AnMan alēli) un populācija 22660 (jutīga).
Tā kā šī pētījuma mērķis bija identificēt gēnus, kas veicina rezistenci pret antracnozi, gēni, kas piešķirti terminiem GO “GO: 0006952 Defensive responses” un “GO: 0055114 Redox process”, tika analizēti ar robežvērtībām, jo ​​sākotnējā vērtība ir ≥ 30 ar vismaz vienu līniju.× laika punkts, apvienojot statistiski nozīmīgas log2 vērtības (reizes izmaiņas).Gēnu skaits, kas atbilst šiem kritērijiem, bija 65 GO:0006952 un 524 GO:0055114.
83A:476 atklāja divus DEG maksimumus, kas anotēti ar terminu GO:0006952, pirmais ar 6 gēniem collā (64 gēni, augšup un lejup) un otrais ar 24 gēniem collā (15 gēni, tikai uz augšu regulēšana).Mandeloop uzrādīja divus GO:0006952 maksimumus pie 12 un 48 HPI, abos bija 12 gēni (pirmais ar aktivizējošiem gēniem, bet otrais ar tikai nomācošiem gēniem), savukārt 22660 populācijai pie 6 HPI (13 gēni) bija lielāks pieauguma maksimums.regulējumu.Jāatzīmē, ka 96, 4% no GO: 0006952 DEG šajās virsotnēs bija tāda paša veida reakcija (augšup vai lejup), kas norāda uz būtisku aizsardzības reakciju pārklāšanos, neskatoties uz iesaistīto gēnu skaita atšķirībām.Lielākā secību grupa, kas saistīta ar terminu GO:0006952, kodē ar bada stresu saistīto ziņojumu proteīnu 22 (SAM22 līdzīgu), kas pieder pie 10. klases ar patoģenēzi saistītā proteīna (PR-10) proteīna klades un galvenā proteīna lateksa.līdzīgu (MLP līdzīgu) proteīnu) proteīnu (3. att.).Gēni, kas kodē SAM22 līdzīgos proteīnus, uzrādīja konsekventu un nozīmīgu indukciju agrīnos laika punktos (6 vai 12 hpi) un parasti nereaģēja eksperimenta beigās (48 hpi), savukārt MLP līdzīgie proteīni uzrādīja koordināciju pie 6 hpi.hpi.Turklāt SAM22 līdzīgu proteīnu gēnu ekspresijas profilu atšķirības sekoja novērotajai antracnozes rezistences mainīgumam, jo ​​izturīgākām līnijām bija vairāk laika punktu, kas ievērojami inducēja šos gēnus nekā jutīgākiem gēniem.
Tika identificētas bioloģiskā procesa termina “GO:0006952 Defense Response” galvenās sastāvdaļas un Lanr1 un AnMan alēļu kandidātgēnu ekspresijas modeļi.Log2 skala attēlo log2 vērtības (izmaiņas reizes) starp inokulētajiem (Colletotrichum lupini, celms Col-08, iegūts no lupīnu laukiem, Wizhenica, Polija, 1999) un kontroles (fiktīvi inokulēti) augi vienā un tajā pašā laika punktā.Tika analizētas šādas šaurlapu lupīnas līnijas: 83A:476 (rezistenta, ar homozigotu Lanr1 alēli), Boregine (rezistents, ģenētiskais fons nav zināms), Mandelup (vidēji rezistenta, ar homozigotu AnMan alēli) un populācija 22660 (jutīga).
Turklāt tika novērtēti RNS-seq kandidātgēnu Lanr1 (TanjilG_05042) un AnMan (TanjilG_12861) ekspresijas profili (3. att.).TanjilG_05042 gēns uzrādīja nozīmīgu reakciju (aktivizēšanu) pie 83A:476 tikai pirmajā laika punktā (6 hpi), savukārt TanjilG_12861 bija nozīmīgs Mandeloop tikai divos laika punktos: 6 hpi (uz leju regulēšana) un 24 hpi (6 hpi).
Visvairāk pārmērīgi izteiktie gēni terminā GO:0055114 “redoksprocess” bija gēni, kas kodē citohroma P450 proteīnus un peroksidāzi (4. att.).Paraugiem, kas izolēti no 83A:476 pie 6 HPI, maksimālās vai minimālās log2 (izmaiņas reizes) vērtības (86,6% gēnu) parasti tika novērotas starp inokulētajiem un kontroles augiem, izceļot šī genotipa augsto reakciju uz inokulācijas dzimumu.83A:476 uzrādīja visnozīmīgāko GO: 0055114 DEG pie 6 hpi (503 gēni), bet pārējās līnijas pie 48 hpi (Boregine, 31 gēns; Mandelup, 85 gēni; un populācija 22660, 78 gēni)).Lielākajā daļā GO:0055114 ģimenes gēnu tika novērotas divu veidu atbildes reakcijas uz vakcināciju (aktivizēšana un inhibīcija).Interesanti, ka līdz 97,6% no DEG, kas identificēti terminam GO: 0055114 Mandelupē pie 48 ZS Šie novērojumi liecina, ka, neraugoties uz ievērojami mazāku mērogu (ti, mutēto redoksgēnu skaitu, 85 pret 503), aizkavētās transkripta atbildes reakcijas modelis agrīnai mandelozei ir līdzīga 6:4 mandelozei.
Tika atklāti bioloģiskā procesa termina “GO:0055114 Redox process” galveno komponentu izpausmes modeļi.Log2 skala attēlo log2 vērtības (izmaiņas reizes) starp inokulētajiem (Colletotrichum lupini, celms Col-08, iegūts no lupīnu laukiem, Wizhenica, Polija, 1999) un kontroles (fiktīvi inokulēti) augi vienā un tajā pašā laika punktā.Tika analizētas šādas šaurlapu lupīnas līnijas: 83A:476 (rezistenta, ar homozigotu Lanr1 alēli), Boregine (rezistents, ģenētiskais fons nav zināms), Mandelup (vidēji rezistenta, ar homozigotu AnMan alēli) un populācija 22660 (jutīga).
83A:476 Transkriptomiskās reakcijas uz inokulāciju ar C. lupini (celms Col-08) ietvēra arī koordinētu gēnu klusēšanu, ko attiecina uz terminu GO:0015979 “fotosintēze” un citiem saistītiem bioloģiskiem procesiem (5. attēls).Šajā apakškopā 37 gēni arī tika pazemināti Mandelupā pie 48 HPI un 35 tajā pašā laikā 22660 populācijā, ieskaitot 19 DEG, kas ir kopīgi abiem genotipiem.
Tika atklāti bioloģiskā procesa termina “GO:0015979 Fotosintēze” galveno komponentu izpausmes modeļi.Log2 skala attēlo log2 vērtības (izmaiņas reizes) starp inokulētajiem (Colletotrichum lupini, celms Col-08, iegūts no lupīnu laukiem, Wizhenica, Polija, 1999) un kontroles (fiktīvi inokulēti) augi vienā un tajā pašā laika punktā.Tika analizētas šādas šaurlapu lupīnas līnijas: 83A:476 (rezistenta, ar homozigotu Lanr1 alēli), Boregine (rezistents, ģenētiskais fons nav zināms), Mandelup (vidēji rezistenta, ar homozigotu AnMan alēli) un populācija 22660 (jutīga).
Pamatojoties uz diferenciālās ekspresijas analīzes rezultātiem un, iespējams, iesaistīts aizsardzības reakcijās pret patogēnām sēnītēm, šis septiņu gēnu komplekts tika izvēlēts ekspresijas profilu kvantitatīvai noteikšanai ar reāllaika PCR (papildu tabula S9).
Iespējamais proteīna gēns TanjilG_10657 tika ievērojami inducēts visās pētītajās līnijās un laika punktos, salīdzinot ar kontroles (mīmiskajiem) augiem (papildu tabulas S10, S11).Turklāt TanjilG_10657 izteiksmes profils uzrādīja pieaugošu tendenci eksperimenta laikā visām līnijām.22660. populācija uzrādīja vislielāko TanjilG_10657 jutību pret inokulāciju ar 114-kārtīgu aktivāciju un augstāko relatīvo ekspresijas līmeni (4,4 ± 0,4) pie 24 HPI (6.a attēls).PR10 LlR18A proteīna gēns TanjilG_27015 arī uzrādīja aktivāciju visās līnijās un laika punktos ar statistisku nozīmīgumu lielākajā daļā datu punktu (6.b attēls).Līdzīgi kā TanjilG_10657, augstākais relatīvais TanjilG_27015 ekspresijas līmenis tika novērots 22660 inokulētajā populācijā pie 24 HPI (19,5 ± 2,4).Skābās endohitināzes gēns TanjilG_04706 tika ievērojami paaugstināts visās līnijās un visos laika punktos, izņemot Boregine 6 hpi (6.c attēls).Tas tika spēcīgi ierosināts pirmajā laika punktā (6 HPI) pie 83A:476 (par 10,5 reizes) un mēreni palielinājās citās līnijās (par 6,6-7,5 reizes).Eksperimenta laikā TanjilG_04706 ekspresija saglabājās līdzīgos līmeņos 83A:476 un Boregine, savukārt Mandelup un Population 22660 ievērojami palielinājās, sasniedzot salīdzinoši augstas vērtības (attiecīgi 5,9 ± 1,5 un 6,2 ± 1,5).Endoglikāna-1,3-β-glikozidāzei līdzīgais gēns TanjilG_23384 uzrādīja augstu aktivāciju pirmajos divos laika punktos (6 un 12 hpi) visās līnijās, izņemot populāciju 22660 (6.d attēls).Augstākie TanjilG_23384 relatīvie ekspresijas līmeņi tika novēroti otrajā laika punktā (12 hpi) Mandelupā (2,7 ± 0,3) un 83A:476 (1,5 ± 0,1).Pie 24 HPI TanjilG_23384 ekspresija bija salīdzinoši zema visās pētītajās līnijās (no 0,04 ± 0,009 līdz 0,44 ± 0,12).
Atlasīto gēnu (ag) ekspresijas profili, kas atklāti ar kvantitatīvu PCR.Cipari 6, 12 un 24 apzīmē stundas pēc vakcinācijas.Gēni LanDExH7 un LanTUB6 tika izmantoti normalizēšanai, un LanTUB6 tika izmantoti starpsēriju kalibrēšanai. Ekspresijas līmeņu atšķirību statistiskais nozīmīgums starp inokulētajiem (Colletotrichum lupini, celms Col-08, iegūts 1999. gadā no lupīnas lauka Wierzenica, Polijā) un kontroles (izmēģinājuma inokulētajiem) augiem ir atzīmēts virs datu punktiem (*P vērtība < 0,05, **P vērtība ≤ 01, 0,0.0). Ekspresijas līmeņu atšķirību statistiskais nozīmīgums starp inokulētajiem (Colletotrichum lupini, celms Col-08, iegūts 1999. gadā no lupīnas lauka Wierzenica, Polijā) un kontroles (izmēģinājuma inokulētajiem) augiem ir atzīmēts virs datu punktiem (*P vērtība < 0,05, **P vērtība ≤ 01, 0,0.0). Statistiski nozīmīgas ekspresijas līmeņu atšķirības starp inokulētajiem (Colletotrichum lupini, celms Col-08, iegūts 1999. gadā no lupīnu lauka Wierzhenice, Polijā) un kontroles (fiktīvi inokulētiem) augiem ir atzīmētas virs datu punktiem (*P vērtība < 0,05, **P-vērtība ≤ ***0.01, 0,0.0). Statistiski nozīmīgas ekspresijas līmeņu atšķirības starp inokulētajiem (Colletotrichum lupini, celms Col-08, iegūts no lupīnu laukiem Veržeņicē, Polijā, 1999. gadā) un kontroles (fiktīvi inokulētiem) augiem ir atzīmētas virs datu punktiem (*P vērtība < 0,05 , **P vērtība ≤ 01, 01,0 ***P 0.0.).Analizētās NLL līnijas bija: 83A:476 (rezistenta, ar homozigotu Lanr1 alēli), Mandelup (vidēji izturīga, ar homozigotu AnMan alēli), Boregine (rezistenta, nezināms ģenētiskais fons) un populācija 22660 (jutīga).
Kandidātgēns TanjilG_05042 Lanr1 lokusā uzrādīja izteikti atšķirīgu ekspresijas modeli no profiliem, kas iegūti RNS-seq pētījumos (6.e attēls).Ievērojama šī gēna aktivācija tika novērota Mandelupā un 22660 populācijā (attiecīgi līdz 39,7 un 11,7 reizēm), kā rezultātā tika iegūti salīdzinoši augsti ekspresijas līmeņi (attiecīgi līdz 1,4 ± 0,14 un 7,2 ± 1,3).83A:476 atklāja arī zināmu TanjilG_05042 gēna regulējumu (līdz 3, 8 reizēm), tomēr sasniegtie relatīvie ekspresijas līmeņi (0, 044 ± 0, 002) bija vairāk nekā 30 reizes zemāki nekā Mandelupā un 22 660 populācijā.analizēti ar qPCR uzrādīja būtiskas atšķirības ekspresijas līmeņos starp genotipiem viltotajos (kontroles) variantos, sasniedzot 58-kārtīgu atšķirību starp populācijām 22660 un 83A:476, kā arī starp populācijām 22660 un 22660. Tika panākta divkārša atšķirība starp Boregine un Mandalup.
Kandidāta gēns AnMan lokusā TanjilG_12861 tika aktivizēts, reaģējot uz vakcināciju 83A:476 un Mandelup, bija neitrāls 22660 populācijā un tika pazemināts Boregine (6. att.).17,4 kDa I klases karstuma šoka proteīna gēns TanjilG_05080 HSP17.4 uzrādīja zemākus relatīvās ekspresijas līmeņus visos pētītajos celmos un laika punktos (6.g attēls).
Salīdzinot gēnu ekspresijas profilus (7. att.), atklājās augsta korelācija starp TanjilG_10657 un četriem citiem gēniem: TanjilG_27015 (r = 0,89), TanjilG_05080 (r = 0,85), TanjilG_05042 (r = 0,80) un 4 TanjilG_10657 (r = 0,80) un 4 TanjilG_7 (.9).Šādi rezultāti var norādīt uz šo gēnu kopregulāciju aizsardzības reakciju laikā.Gēni TanjilG_12861 un TanjilG_23384 uzrādīja atšķirīgus ekspresijas profilus ar zemākām Pīrsona korelācijas koeficienta vērtībām (attiecīgi no 0,08 līdz 0,43 un -0,19 līdz 0,28), salīdzinot ar citiem gēniem.
Korelācijas starp gēnu ekspresijas profiliem tika noteiktas, izmantojot kvantitatīvo PCR.Tika analizētas šādas šaurlapu lupīnas līnijas: 83A:476 (rezistenta, ar homozigotu Lanr1 alēli), Mandelup (vidēji izturīga, ar homozigotu AnMan alēli), Boregine (rezistenta, ģenētiskais fons nav zināms) un populācija 22660 (jutīga).Tika aprēķināti trīs laika punkti (6, 12 un 24 stundas pēc inokulācijas), ieskaitot inokulētos (Colletotrichum lupini, celms Col-08, kas iegūts no lupīnu laukiem Wierzhenice, Polijā, 1999. gadā) un kontroles (viltus inokulētus) augus.Skala parāda Pīrsona korelācijas koeficienta vērtību.
Pamatojoties uz datiem, kas iegūti ar jaudu 6 zirgspēki uz collu, WGCNA tika veikta ar 9981 DEG, kas identificēta, salīdzinot inokulētos un kontroles augus, lai koncentrētos uz agrīnām aizsardzības reakcijām (papildu tabula S12).Tika atrasti divdesmit divi gēnu moduļi (klasteri) ar korelētiem (pozitīviem vai negatīviem) ekspresijas profiliem starp genotipiem un eksperimentālajiem variantiem. Vidēji gēnu ekspresijas līmeņi samazinājās secībā 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 (tomēr abos variantos šī tendence bija spēcīgāka kontroles augiem). Vidēji gēnu ekspresijas līmeņi samazinājās secībā 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 (tomēr abos variantos šī tendence bija spēcīgāka kontroles augiem). В среднем уровни экспрессии генов снижались в порядке 83A:476 > Mandelup > Boregine > Iedzīvotāji 22660 (в обоих вариантац, элеац, нотац, нотентах, сильнее у контрольных растений). Vidēji gēnu ekspresijas līmeņi samazinājās secībā 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 (tomēr abos variantos šī tendence bija spēcīgāka kontroles augiem).平均而言，基因表达水平按83A:476 > Mandelup > Boregine > Iedzīvotāju skaits 22660 的顺序下降Ｍ然而，佶下势在对照植物中更强）.平均 而 言 ， 基因 水平 按 按 83a: 476> mandelup> boregine> iedzīvotāji 22660 的 顺序 伋 鿍 （Ｇ 伍 在 在在 植物 中 更）。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。. В среднем уровни экспрессии генов снижались в ряду 83A:476 > Mandelup > Boregine > Iedzīvotāji 22660 (однако в обоих варианенентахлианэбильтах е у контрольных растений). Vidēji gēnu ekspresijas līmenis samazinājās sērijā 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 (tomēr abos variantos šī tendence bija spēcīgāka kontroles augiem).Vakcinācija izraisīja gēnu ekspresijas augšupregulāciju, īpaši 18., 19., 14., 6. un 1. modulī (dilstošā secībā pēc ietekmes), negatīvu regulējumu (piemēram, 9. un 20. modulis) vai ar neitrāliem efektiem (piemēram, 11., 22., 8. un 13. modulī).GO terminu bagātināšanas analīze (papildu tabula S13) atklāja "GO: 0006952 Aizsardzības reakcijas" inokulētajam modulim (18) ar maksimālu aktivāciju, ieskaitot gēnus, kas analizēti ar qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_016p), kā arī Tanjil257 un many7 Injil57. presēti fotosintēzes moduļi (9).18. moduļa koncentrators (8. att.) tika identificēts kā TanjilG_26536 gēns, kas kodē PR-10 līdzīgo LlR18B proteīnu, un 9. moduļa koncentrators tika identificēts kā TanjilG_28955 gēns, kas kodē fotosistēmas II PsbQ proteīnu.Antracnozes rezistences kandidāts Lanr1, TanjilG_05042, tika atrasts 22. modulī (9. attēls), un tas ir saistīts ar terminiem “GO:0044260 Šūnu makromolekulārie vielmaiņas procesi” un “GO:0006355 Transkripcijas regulēšana, DNS veidne”, kas satur TanjilG hub_01212.gēns kodē karstuma stresa transkripcijas faktoru A-4a (HSFA4a).
Moduļu gēnu koekspresijas svērtā tīkla analīze ar pārspīlētiem bioloģiskā procesa terminiem “GO: 0006952 Aizsardzības atbildes”.Ligācija tika vienkāršota, lai izceltu četrus gēnus, kas analizēti ar qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 un TanjilG_27015).
Moduļa gēnu koekspresijas svērtā tīkla analīze ar pārspīlēti pārstāvētu bioloģiskā procesa terminu “GO: 0006355: Transkripcijas regulēšana, DNS veidne” un kas satur kandidāta antracnozes rezistences gēnu Lanr1 TanjilG_05042.Ligācija tika vienkāršota, lai izolētu TanjilG_05042 gēnu un centrālo TanjilG_01212 gēnu.
Austrālijā veiktā rezistences pret antracnozi skrīnings parādīja, ka lielākā daļa agri atbrīvoto šķirņu bija uzņēmīgas;Kalya, Coromup un Mandelup ir aprakstīti kā vidēji izturīgi, savukārt Wonga, Tanjil un 83A:476 ir aprakstīti kā ļoti izturīgi26,27,31.bija viena un tā pati rezistences alēle, apzīmēta ar Lanr1, un Coromup un Mandelup bija atšķirīga alēle, apzīmēta ar AnMan10, 26, 39, savukārt Kalja nodeva citu alēli., Lanr2.Veicot antracnozes rezistences skrīningu Vācijā, tika identificēta rezistenta līnija Bo7212 ar kandidāta alēli, kas nav Lanr1, ar nosaukumu LanrBo36.
Mūsu pētījums atklāja ļoti zemu Lanr1 alēles biežumu (apmēram 6%) pārbaudītajā germplazmā.Šis novērojums atbilst Austrumeiropas germplazmas skrīninga rezultātiem, izmantojot Anseq3 un Anseq4 marķierus, kas parādīja, ka Lanr1 alēle ir tikai divās Baltkrievijas līnijās.Tas liecina, ka Lanr1 alēle vēl netiek plaši izmantota vietējās audzēšanas programmās, atšķirībā no Austrālijas, kur tā ir viena no galvenajām alēlēm audzēšanai ar marķieru palīdzību.Tas var būt saistīts ar zemāku rezistences līmeni, ko nodrošina Lanr1 alēle Eiropas lauka apstākļos, salīdzinot ar Austrālijas ziņojumu.Turklāt pētījumi par antracnozi Austrālijas apgabalos ar augstu nokrišņu daudzumu ir parādījuši, ka rezistences reakcijas, ko izraisa Lanr1 alēle, var nebūt efektīvas laika apstākļos, kas veicina patogēna augšanu un strauju attīstību19, 42.Faktiski šajā pētījumā daži antracnozes simptomi tika novēroti arī genotipos ar Lanr1 alēli, kas liecina, ka rezistence var izzust optimālos apstākļos C. lupini attīstībai.Turklāt ir iespējamas kļūdaini pozitīvas Anseq3 un Anseq4 marķieru klātbūtnes interpretācijas, kas atrodas aptuveni 1 cM attālumā no Lanr1 lokusa 28, 30, 43 .
Mūsu pētījums parādīja, ka 83A:476, kas satur Lanr1 alēli, reaģēja uz C. lupini inokulāciju ar liela mēroga transkripta pārprogrammēšanu pirmajā analizētajā laika punktā (6 hpi), savukārt Mandelupā, kurā bija AnMan alēle, transkriptomiskās reakcijas tika novērotas daudz vēlāk.(no 24 līdz 48 ZS).Šīs aizsardzības reakcijas laika variācijas ir saistītas ar slimību simptomu atšķirībām, uzsverot agrīnas patogēnu atpazīšanas nozīmi veiksmīgai reakcijai uz rezistenci.Lai inficētu augu audus, Sibīrijas mēra sporām uz saimnieka virsmas ir jāiziet vairāki attīstības posmi, tostarp dīgtspēja, šūnu dalīšanās un appresorija veidošanās.Pielikums ir infekcioza struktūra, kas piestiprināta pie saimnieka virsmas un atvieglo iespiešanos saimnieka audos.Tādējādi C. gloeosporioides sporas zirņu ekstraktā uzrādīja pirmo kodola dalīšanos pēc 75–90 minūšu inkubācijas, dīgļa caurulītes veidošanos pēc 90–120 minūtēm un nomākšanu pēc 4 stundām45.Mango C. gloeosporioides uzrādīja vairāk nekā 40% konidiju dīgtspēju pēc 3 stundu inkubācijas un aptuveni 20% appresoru veidošanos pēc 4 stundām.Ar virulenci saistītais C. gloeosporioides CAP20 gēns uzrādīja transkripcijas aktivitāti epifītus veidojošajos konīdijās pēc 3,5 h inkubācijas avokado virsmas vaskā ar augstu CAP20 proteīna koncentrāciju pēc 4 h 46 min.Līdzīgi melanīna biosintēzes gēnu aktivitāte C. trifolii tika ierosināta 2 stundu inkubācijas laikā, kam sekoja appresorija veidošanās pēc 1 stundas.Lapu audu pētījumi ir parādījuši, ka zemenēm, kas inokulētas ar C. acutatum, pirmā nomākšana ir 8 hpi, savukārt tomātiem, kas inokulēti ar C. coccodes, pirmais nomākums ir 4 hpi48,49.lielā mērā atbilst Colletotrichum spp.infekcijas process.Ātrās aizsardzības reakcijas uz 83A:476 liecina par augu rezistences un efektoru izraisītas imunitātes (ETI) gēnu iesaistīšanos šajā līnijā, savukārt Mandelupa aizkavētās reakcijas atbalsta mikro-asociētās molekulārā modeļa izraisītās imunitātes (MTI) hipotēzi 50. Agrīnas reakcijas uz 83A: 476 un Mandelup.Daļēja pārklāšanās starp augšup vai lejup regulētiem gēniem aizkavētā reakcijā arī atbalsta šo koncepciju, jo ETI bieži tiek uzskatīta par paātrinātu un pastiprinātu MTI reakciju, kas beidzas ar ieprogrammētu šūnu nāvi infekcijas vietā, kas pazīstama kā anafilaktiskais šoks51,52.
Lielākā daļa gēnu, kas tiek attiecināti uz pārāk pārstāvēto terminu Gēnu ontoloģija GO:0006952 “Aizsardzības reakcija”, ir 11 homologi stresa izraisītajam badošanās ziņojuma 22. proteīnam (līdzīgi kā SAM22) un septiņiem galvenajiem lateksa proteīnu līdzīgiem (MLP).līdzīgi proteīni 31, 34, 43 un 423 uzrādīja secību līdzību.SAM22 līdzīgie gēni uzrādīja ievērojamu aktivāciju, kas ilga ilgāk, parādot paaugstinātu antracnozes rezistences līmeni (83A: 476 un Boregine).Tomēr MLP līdzīgi gēni tika pazemināti tikai līnijās, kurās bija kandidāta rezistences alēle (83A: 476/Lanr1 pie 6 hpi un Mandelup/AnMan pie 24 hpi).Jāņem vērā, ka visi identificētie SAM22 līdzīgie homologi nāk no gēnu kopas, kas aptver aptuveni 105 kb, savukārt MLP līdzīgie gēni nāk no atsevišķiem genoma reģioniem.Šādu SAM22 līdzīgu gēnu koordinēta aktivizēšana tika konstatēta arī mūsu iepriekšējā pētījumā par NLL rezistenci pret Diaporthetoxica inokulāciju, kas liecina, ka tie ir iesaistīti aizsardzības reakcijas horizontālajos komponentos.Šo secinājumu apstiprina arī ziņojumi par SAM22 līdzīgu gēnu pozitīvu reakciju uz traumām vai ārstēšanu ar salicilskābi, sēnīšu induktoriem vai ūdeņraža peroksīdu.
Ir pierādīts, ka MLP līdzīgi gēni reaģē uz dažādiem abiotiskiem un biotiskiem spriegumiem, tostarp baktēriju, vīrusu un patogēnām sēnīšu infekcijām daudzās augu sugās55.Reakcijas virzieni uz noteiktu mijiedarbību starp augiem un patogēniem svārstījās no stipri pieaugošas (ti, kokvilnas invāzijas ar Verticillium dahliae laikā) līdz ievērojami samazinošam (ti, pēc ābeles inficēšanās ar Alternaria spp.)56,57.Ievērojama MLP līdzīgā gēna 423 pazemināšanās ir novērota avokado aizsardzības pret F. niger infekciju un ābeles Botryosphaeria berengeriana f. infekcijas laikā.cn.piricola un Alternaria alternata ir ābolu patotipi58,59.Turklāt ābolu kauliem, kas pārmērīgi ekspresē MLP līdzīgo 423 gēnu, bija zemāka ar rezistenci saistītu gēnu ekspresija un tie bija jutīgāki pret sēnīšu infekciju59.Pēc Fusarium oxysporum f rezistentā parasto pupiņu dīgļu plazmā tika nomākts arī MLP līdzīgais 423 gēns.cn.Pupiņu infekcija 60.
Citi PR-10 ģimenes locekļi, kas identificēti mūsu RNS-seq pētījumā, bija LlR18A un LlR18B gēni, reaģējot uz augšupregulāciju, kā arī paaugstināts (1 gēns) vai pazemināts (3 gēni) gēns lipīdu pārneses proteīnam DIR1..Turklāt WGCNA izceļ LlR18B gēnu kā centru šajā modulī, kas ir ļoti jutīgs pret vakcināciju un satur vairākus aizsardzības reakcijas gēnus.LLR18A un LLR18B gēni tika inducēti dzeltenās lupīna lapās, reaģējot uz patogēnām baktērijām, kā arī NLL kātiem pēc D. toksikas inokulācijas, savukārt šo gēnu rīsu homologs, RSOSPR10, ātri izraisīja sfergāls infekcija, kas paredzēta jasmonskābes signālmateriālu 53,61. kas nepieciešami sistēmiskas iegūtas pretestības (SAR) sākšanai.Attīstoties aizsargreakcijām, DIR1 proteīns tiek transportēts no infekcijas fokusa caur floēmu, lai izraisītu SAR attālos orgānos.Interesanti, ka TanjilG_02313 DIR1 gēns tika būtiski inducēts pirmajā laika punktā 84A:476 un populācijā 22660, bet rezistence pret antracnozi veiksmīgi attīstījās tikai 84A:476 rindā.Tas var norādīt uz zināmu DIR1 gēna subfunkcionalizāciju NLL, jo atlikušie trīs homologi reaģēja uz inokulāciju tikai 83A:476 līnijā pie 6 hpi, un šī reakcija bija vērsta uz leju.
Mūsu pētījumā visizplatītākie komponenti, kas atbilst bioloģiskajam procesam, ko sauc par “GO:0055114 Redox process”, bija citohroma P450 proteīns, peroksidāze, linolskābes 9S-/13S-lipoksigenāze un 1-aminociklopropān-1-karbonskābes oksidāze.Turklāt mūsu WGCNA HSFA4a homologu definē kā centrmezglu, kurā ir moduļi, piemēram, Lanr1 rezistences gēna kandidāts TanjilG_05042.HSFA4a ir no redoksatkarīgās kodoltranskripcijas regulēšanas sastāvdaļa augos.
Citohroma P450 proteīni ir oksidoreduktāzes, kas katalizē NADPH un/vai O2 atkarīgās hidroksilēšanas reakcijas primārajā un sekundārajā metabolismā, tostarp ksenobiotiku, kā arī hormonu, taukskābju, sterīnu, šūnu sieniņu komponentu, biopolimēru un aizsargsavienojumu biosintēzē. 0,6 log2 (izmaiņas reizes) līdz 5,7 sakarā ar lielu skaitu izmainītu homologu (37) un atšķirību reakcijas modeļos starp konkrētiem gēniem, kas atspoguļo augšupejošu pārskatīšanu..Izmantojot tikai RNS-seq datus, lai noskaidrotu NLL gēnu iespējamo bioloģisko funkciju tik lielā olbaltumvielu superģimenē, būtu ļoti spekulatīvi.Tomēr ir vērts atzīmēt, ka daži citohroma P450 gēni ir saistīti ar paaugstinātu rezistenci pret patogēnām sēnītēm vai baktērijām, tostarp veicinot alerģiskas reakcijas69, 70, 71.
III klases peroksidāzes ir daudzfunkcionāli augu fermenti, kas iesaistīti plašā vielmaiņas procesos augu augšanas un attīstības laikā, kā arī reaģējot uz vides stresu, piemēram, sāļumu, sausumu, augstu gaismas intensitāti un patogēnu uzbrukumu72.Peroksidāzes ir iesaistītas vairāku augu sugu mijiedarbībā ar Anthracis, tostarp Stylosanthes humilis un C. gloeosporioides, Lens culinaris un C. truncatum, Phaseolus vulgaris un C. lindemuthianum, Cucumis sativus un C. lagenarium73,74,75,76.Reakcija ir ļoti ātra, dažreiz pat pie 4 HPI, pirms sēne iekļūst augu audos73.Peroksidāzes gēns reaģēja arī uz D. toxica NLL inokulāciju.Papildus savām tipiskajām funkcijām, lai regulētu oksidatīvo sprādzienu vai likvidētu oksidatīvo stresu, peroksidāzes var traucēt patogēnu augšanu, radot fiziskus šķēršļus, kuru pamatā ir šūnu sieniņu nostiprināšana lignifikācijas, apakšvienību vai specifisku savienojumu šķērssaistīšanas laikā.Šo funkciju in silico var attiecināt uz TanjilG_03329 gēnu, kas kodē iespējamo lignīnu veidojošo anjonu peroksidāzi, kas mūsu pētījumā tika ievērojami paaugstināts 83A:476 rezistentajā līnijā pie 6 HPI, bet ne citos celmos un laika punktos, kas nereaģēja.
Linolskābes 9S-/13S-lipoksigenāze ir pirmais solis lipīdu biosintēzes oksidatīvajā ceļā78.Šī ceļa produktiem ir vairākas funkcijas augu aizsardzībā, tostarp šūnu sieniņu nostiprināšana, veidojot kalozes un pektīna nogulsnes, un oksidatīvā stresa regulēšana, veidojot reaktīvas skābekļa sugas79, 80, 81, 82, 83.Šajā pētījumā linolskābes 9S-/13S-lipoksigenāzes ekspresija tika mainīta visos celmos, bet jutīgajā populācijā 22660 dažādos laika punktos dominēja regulēšana, savukārt celmos, kas satur rezistentu Lanr1 un AnMan alēli, tas uzsver oksilipīna reakcijas dažādošanu starp šiem anthrax aizsargājošajiem genotipa slāņiem.
1-aminociklopropān-1-karboksilāta oksidāzes (ACO) homologs tika ievērojami paaugstināts (9 gēni) vai pazemināts (2 gēni), kad to inokulēja ar lupīnu.Ar diviem izņēmumiem visas šīs atbildes notika 6 ZS.83A:476.Fermentatīvā reakcija, ko mediē ACO olbaltumvielas, ir ātrumu ierobežojoša pakāpe etilēna ražošanā, un tāpēc tā ir ļoti regulēta84.Etilēns ir augu hormons, kam ir dažādas lomas augu attīstības regulēšanā un reakcijā uz abiotisko un biotisko stresa apstākļiem.ACO transkripcijas indukcija un etilēna signalizācijas ceļa aktivizēšana ir iesaistīta rīsu rezistences palielināšanā pret hemibiotrofo sēnīti oryzae oryzae, regulējot reaktīvo skābekļa sugu un fitoaleksīnu veidošanos.Ļoti līdzīgs lapu infekcijas process, kas konstatēts starp M. oryzae un C. lupini88,89, ņemot vērā šajā pētījumā aprakstīto ACO homologu ievērojamo paaugstināšanos līnijā 83A:476, maina iespēju piešķirt rezistenci pret NLL antracnozi etilēnu par signālu centrālo posmu molekulārajos ceļos.
Šajā pētījumā liela mēroga daudzu ar fotosintēzi saistīto gēnu nomākšana tika novērota pie 6 hpi 83A:476 un pie 48 hpi Mandeloop un 22660 populācijā.Šo izmaiņu apjoms un progresēšana ir proporcionāla līmenim.Šajā eksperimentā tika novērota rezistence pret antracnozi.Nesen ir ziņots par spēcīgu un agrīnu ar fotosintēzi saistīto transkriptu apspiešanu vairākos augu un patogēnu mijiedarbības modeļos, ieskaitot patogēnās baktērijas un sēnītes.Steiga (no 2 HPI dažās mijiedarbībās) un globāla ar fotosintēzi saistīto gēnu nomākšana, reaģējot uz infekciju, var izraisīt augu imunitāti, pamatojoties uz reaktīvo skābekļa sugu izvietošanu un to mijiedarbību ar salicilskābes ceļu, lai veicinātu alerģiskas reakcijas 90,94.
Visbeidzot, aizsardzības reakcijas mehānismi, kas ierosināti visizturīgākajai līnijai (83A: 476), ietver ātru patogēna atpazīšanu ar R gēna palīdzību (iespējams, TIR-NBS-LRR TanjilG_05042) un alerģiskas reakcijas izraisītu salicilskābes un etilēna signālu pārraidi, kam seko liela attāluma SAR noteikšana.darbību atbalsta DIR-1 proteīns.Jāatzīmē, ka C. lupini infekcijas biotrofiskais periods ir ļoti īss (aptuveni 2 dienas), kam seko nekrotiskā augšana95.Pāreja starp šiem posmiem var būt saistīta ar nekrozi un etilēna inducējamu proteīnu ekspresiju, kas saimniekaugos darbojas kā paaugstinātas jutības reakciju izraisītāji.Tāpēc laika logs veiksmīgai C. lupini sagūstīšanai biotrofiskajā posmā ir ļoti šaurs.Ar redoksu un fotosintēzi saistīto gēnu pārprogrammēšana, kas novērota 83A:476 pie 6 hpi, atbilst sēnīšu hifu progresēšanai un vēsta par veiksmīgas aizsardzības reakcijas attīstību biotrofiskajā stadijā.Mandelup un 22660 populācijas transkriptomiskās reakcijas var būt pārāk aizkavētas, lai notvertu sēnīti pirms pārejas uz nekrotisku augšanu, tomēr Mandelup var būt efektīvāka nekā 22660 populācija, jo PR-10 proteīna salīdzinoši ātra regulēšana veicina horizontālo pretestību.
ETI, ko virza kanoniskais R gēns, šķiet, ir izplatīts mehānisms pupiņu rezistencei pret antracnozi.Tādējādi pākšaugiem Medicago truncatula rezistenci pret antracnozi nodrošina RCT1 gēns, kas ir TIR-NBS-LRR97 auga R gēnu klases loceklis.Šis gēns arī piešķir lucernai plaša spektra rezistenci pret antracnozi, kad to pārnes uz uzņēmīgiem augiem.Parastajā pupiņā (P. vulgaris) līdz šim ir identificēti vairāk nekā divi desmiti rezistences pret antracnozi gēnu.Daži no šiem gēniem ir atrodami reģionos, kuros nav nekādu kanonisku R gēnu, taču daudzi citi atrodas hromosomu malās, kas satur NBS-LRR gēnu kopu, tostarp TIR-NBS-LRRs99.Genoma mēroga SSR pētījums arī apstiprināja NBS-LRR gēna saistību ar antracnozes rezistenci parastajā pupiņā.Kanoniskais R gēns tika atrasts arī genoma reģionā, kas satur galveno antracnozes rezistences lokusu baltajā lupīnā 101.
Mūsu darbs liecina, ka tūlītēja rezistences reakcija, kas tiek aktivizēta augu infekcijas agrīnā stadijā (vēlams ne vēlāk kā 12 hpi), efektīvi aizsargā šaurlapu lupīnu no antracnozes, ko izraisa patogēnā sēne Collelotrichum lupini.Izmantojot augstas caurlaidspējas sekvencēšanu, mēs parādījām antracnozes rezistences gēnu diferenciālos ekspresijas profilus NLL augos, ko mediē Lanr1 un AnMan rezistences gēni.Veiksmīga aizsardzība ietver rūpīgu redoksā, fotosintēzē un patoģenēzē iesaistīto proteīnu gēnu izstrādi dažu stundu laikā pēc auga pirmā kontakta ar patogēnu.Līdzīgas aizsardzības reakcijas, bet aizkavētas laikā, ir daudz mazāk efektīvas, lai aizsargātu augus no slimībām.Sibīrijas mēra rezistence, ko mediē Lanr1 gēns, atgādina R gēna tipisku ātro reakciju (efektora izraisīta imunitāte), savukārt AnMan gēns, visticamāk, nodrošina horizontālu reakciju (imunitāti, ko izraisa ar mikrobiem saistīts molekulārais modelis), nodrošinot mērenu ilgtspējības līmeni.
215 NLL līnijas, ko izmantoja antracnozes marķieru skrīningam, sastāvēja no 74 šķirnēm, 60 līnijām, kas iegūtas krustojot vai pavairojot, 5 mutantiem un 76 savvaļas vai oriģinālām dīgļu plazmām.Līnijas nāca no 17 valstīm, galvenokārt no Polijas (58), Spānijas (47), Vācijas (27), Austrālijas (26), Krievijas (19), Baltkrievijas (7), Itālijas (5) un citām līnijām.no 10 valstīm.Komplektā ietilpst arī atsauces izturīgas līnijas: 83a: 476, Tanjil, Wonga, kas pārvadā LANR1 alēli, un Mandelup, kas pārvadā Anmana alēli.Līnijas tika iegūtas no Eiropas lupīnu ģenētisko resursu datu bāzes, ko uztur Poznań Plant Breeding Ltd., Wiatrowo, Polija (papildu tabula S1).
Augi audzēja kontrolētos apstākļos (fotoperiods 16 stundas, temperatūra 25 ° C dienas laikā un 18 ° C naktī).Tika analizēti divi bioloģiskie atkārtojumi.DNS tika izolēts no trīs nedēļu vecām lapām, izmantojot DNEASY augu mini komplektu (Qiagen, Hilden, Vācija) saskaņā ar protokolu.Izolētās DNS kvalitāte un koncentrācija tika novērtēta ar spektrofotometriskām metodēm (NanoDrop 2000; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ASV).Tika analizēts AnManM1 marķieris, kas iezīmē antracnozes rezistences gēnu AnMan (atvasināts no cv. Mandelup) un marķieri Anseq3 un Anseq4, kas atrodas blakus gēnam Lanr1 (atvasināts no cv. Tanjil) 11, 26, 28.Homozigoti izturīgajai alēlei tika vērtēti kā “1 ″, jutīgi - kā“ 0 ″ un heterozigoti - kā 0,5.
Pamatojoties uz AnManM1, AnSeq3 un AnSeq4 marķieru skrīninga rezultātiem un sēklu pieejamību galīgajiem pēcpārbaudes eksperimentiem, antracnozes rezistences fenotipēšanai tika atlasītas 50 NLL līnijas.Analīze tika veikta divos eksemplāros datorizētā siltumnīcā ar 14 stundu fotoperiodu ar temperatūras diapazonu 22 ° C dienā un 19 ° C naktī.Pirms sēšanas sēklas noskrāpē (ar asu asmeni nogriež sēklas apvalku embrija pretējā pusē), lai novērstu sēklu snaudu, jo sēklas apvalks ir pārāk ciets, un nodrošinātu vienmērīgu dīgtspēju.Augi audzēja podos (11 × 11 × 21 cm) ar sterilu augsni (TS-1 Rec 085 vidēja pamata, Klasmann-Deilmann Polska, Varšava, Polija).Inokulācija tika veikta ar Colletotrichum lupini Col-08 celmu, kas izaudzēts 1999. gadā no šaurlapu lupīnas augu stublājiem, kas audzēti laukā Verženicā, Lielpolijā (52° 27′ 42″ N 17° 04′ 05″ E).Iegūstiet apgabalu.Izolāti tika kultivēti SNA barotnē 20 ° C temperatūrā melnā gaismā 21 dienu, lai izraisītu sporulāciju.Četras nedēļas pēc sēšanas, kad augi bija sasnieguši 4-6 lapu stadiju, inokulāciju veica, apsmidzinot ar konidiju suspensiju koncentrācijā 0,5 x 106 konidijas uz ml.Pēc inokulācijas augus 24 stundas turēja tumsā aptuveni 98% mitrumā un 25°C temperatūrā, lai veicinātu konidiju dīgšanu un infekcijas procesu.Pēc tam augus audzēja 14 stundu fotoperiodā 22 ° C dienā / 19 ° C naktī un 70% mitrumā.Slimības punktu skaits tika noteikts 22 dienas pēc inokulācijas, un tas bija no 0 (imūns) līdz 9 (ļoti jutīgs) atkarībā no nekrotisku bojājumu esamības vai neesamības uz kātiem un lapām.Turklāt pēc punktu noteikšanas tika izmērīts augu svars.Attiecības starp marķieru genotipiem un slimības fenotipiem tika aprēķinātas kā punktu divu secību korelācijas (heterozigotu marķieru trūkums antracnozes rezistences fenotipa analīzes līniju komplektā).