Paldies, ka apmeklējāt vietni Nature.com.Jūsu izmantotajai pārlūkprogrammas versijai ir ierobežots CSS atbalsts.Lai nodrošinātu vislabāko pieredzi, ieteicams izmantot atjauninātu pārlūkprogrammu (vai atspējot saderības režīmu pārlūkprogrammā Internet Explorer).Tikmēr, lai nodrošinātu nepārtrauktu atbalstu, mēs atveidosim vietni bez stiliem un JavaScript.
Ir nepieciešama uzticama in vitro sistēma, kas var precīzi reproducēt sirds fizioloģisko vidi zāļu testēšanai.Cilvēka sirds audu kultūras sistēmu ierobežotā pieejamība ir radījusi neprecīzas sirds zāļu iedarbības interpretācijas.Šeit mēs esam izstrādājuši sirds audu kultūras modeli (CTCM), kas elektromehāniski stimulē sirds šķēles un tiek pakļauts fizioloģiskai stiepšanai sirds cikla sistoliskajā un diastoliskajā fāzē.Pēc 12 dienu kultivēšanas šī pieeja daļēji uzlaboja sirds sekciju dzīvotspēju, bet pilnībā nesaglabāja to strukturālo integritāti.Tāpēc pēc mazo molekulu skrīninga mēs atklājām, ka 100 nM trijodtironīna (T3) un 1 μM deksametazona (Dex) pievienošana mūsu barotnei saglabāja sekciju mikrostruktūru 12 dienas.Kombinācijā ar T3 / Dex ārstēšanu CTCM sistēma saglabāja transkripcijas profilus, dzīvotspēju, vielmaiņas aktivitāti un strukturālo integritāti tādā pašā līmenī kā svaigi sirds audi 12 dienas.Turklāt pārmērīga sirds audu stiepšanās kultūrā izraisa hipertrofisku sirds signālu pārraidi, sniedzot pierādījumus par CTCM spēju atdarināt hipertrofiskus apstākļus, ko izraisa sirds stiepšanās.Noslēgumā jāsaka, ka CTCM var modelēt sirds fizioloģiju un patofizioloģiju kultūrā ilgu laiku, nodrošinot drošu zāļu skrīningu.
Pirms klīniskās izpētes ir nepieciešamas uzticamas in vitro sistēmas, kas spēj precīzi reproducēt cilvēka sirds fizioloģisko vidi.Šādām sistēmām vajadzētu atdarināt mainītās mehāniskās stiepes, sirdsdarbības ātruma un elektrofizioloģiskās īpašības.Dzīvnieku modeļus parasti izmanto kā sirds fizioloģijas skrīninga platformu ar ierobežotu ticamību, atspoguļojot zāļu ietekmi uz cilvēka sirdi1, 2.Galu galā ideālais sirds audu kultūras eksperimentālais modelis (CTCM) ir modelis, kas ir ļoti jutīgs un specifisks dažādām terapeitiskām un farmakoloģiskām iejaukšanās darbībām, precīzi atveidojot cilvēka sirds fizioloģiju un patofizioloģiju3.Šādas sistēmas trūkums ierobežo jaunu sirds mazspējas ārstēšanas metožu atklāšanu4,5 un ir izraisījis zāļu kardiotoksicitāti kā galveno iemeslu aiziešanai no tirgus6.
Pēdējo desmit gadu laikā astoņas zāles, kas nav saistītas ar sirds un asinsvadu sistēmu, ir izņemtas no klīniskās lietošanas, jo tās izraisa QT intervāla pagarināšanos, izraisot kambaru aritmijas un pēkšņu nāvi7.Tādējādi pieaug nepieciešamība pēc uzticamām preklīniskām skrīninga stratēģijām, lai novērtētu kardiovaskulāro efektivitāti un toksicitāti.Nesenā cilvēka izraisīto pluripotento cilmes šūnu kardiomiocītu (hiPS-CM) izmantošana zāļu skrīningā un toksicitātes pārbaudēs nodrošina daļēju šīs problēmas risinājumu.Tomēr hiPS-CM nenobriedušais raksturs un sirds audu daudzšūnu sarežģītības trūkums ir galvenie šīs metodes ierobežojumi.Jaunākie pētījumi ir parādījuši, ka šo ierobežojumu var daļēji pārvarēt, izmantojot agrīnu hiPS-CM, lai veidotu sirds audu hidrogēlus neilgi pēc spontānu kontrakciju sākuma un laika gaitā pakāpeniski palielinot elektrisko stimulāciju.Tomēr šiem hiPS-CM mikroaudiem trūkst pieaugušā miokarda nobriedušu elektrofizioloģisko un saraušanās īpašību.Turklāt cilvēka sirds audiem ir sarežģītāka struktūra, kas sastāv no neviendabīga dažādu šūnu tipu maisījuma, tostarp endotēlija šūnām, neironiem un stromas fibroblastiem, kas ir savstarpēji savienoti ar specifiskiem ārpusšūnu matricas proteīnu komplektiem.Šī ne-kardiomiocītu populāciju 11, 12, 13 neviendabīgums pieaugušo zīdītāju sirdī ir galvenais šķērslis sirds audu modelēšanai, izmantojot atsevišķus šūnu tipus.Šie galvenie ierobežojumi uzsver, cik svarīgi ir izstrādāt metodes neskartu miokarda audu kultivēšanai fizioloģiskos un patoloģiskos apstākļos.
Kultivētas plānas (300 µm) cilvēka sirds daļas ir izrādījušās daudzsološs neskarta cilvēka miokarda modelis.Šī metode nodrošina piekļuvi pilnīgai 3D daudzšūnu sistēmai, kas ir līdzīga cilvēka sirds audiem.Tomēr līdz 2019. gadam kultivēto sirds sekciju izmantošanu ierobežoja īsais (24 h) kultūras izdzīvošanas ilgums.Tas ir saistīts ar vairākiem faktoriem, tostarp fizikāli mehāniskās stiepes trūkumu, gaisa un šķidruma saskarni un vienkāršu datu nesēju izmantošanu, kas neatbalsta sirds audu vajadzības.2019. gadā vairākas pētniecības grupas parādīja, ka mehānisko faktoru iekļaušana sirds audu kultūras sistēmās var pagarināt kultūras dzīvi, uzlabot sirds ekspresiju un atdarināt sirds patoloģiju.Divi eleganti pētījumi 17 un 18 liecina, ka vienpusējai mehāniskai slodzei ir pozitīva ietekme uz sirds fenotipu kultivēšanas laikā.Tomēr šajos pētījumos netika izmantota sirds cikla dinamiskā trīsdimensiju fizikāli mehāniskā slodze, jo sirds sekcijas tika noslogotas ar izometriskiem stiepes spēkiem 17 vai lineāru auksotonisku slodzi 18 .Šīs audu stiepšanas metodes izraisīja daudzu sirds gēnu nomākšanu vai gēnu pārmērīgu ekspresiju, kas saistīti ar patoloģiskām stiepšanās reakcijām.Jo īpaši Pitoulis et al.19 izstrādāja dinamisku sirds šķēles kultūras vannu sirds cikla rekonstrukcijai, izmantojot spēka devēja atgriezenisko saiti un spriedzes piedziņas.Lai gan šī sistēma ļauj precīzāk in vitro modelēt sirds ciklu, metodes sarežģītība un zemā caurlaidspēja ierobežo šīs sistēmas pielietojumu.Mūsu laboratorija nesen ir izstrādājusi vienkāršotu kultivēšanas sistēmu, izmantojot elektrisko stimulāciju un optimizētu barotni, lai saglabātu cūku un cilvēka sirds audu sekciju dzīvotspēju līdz 6 dienām20,21.
Pašreizējā manuskriptā mēs aprakstām sirds audu kultūras modeli (CTCM), izmantojot cūku sirds sadaļas, kas ietver humorālas norādes, lai apkopotu trīsdimensiju sirds fizioloģiju un patofizioloģisko izstiepšanos sirds cikla laikā.Šis CTCM var palielināt preklīnisko zāļu prognozēšanas precizitāti līdz tādam līmenim, kāds vēl nekad nav sasniegts, nodrošinot rentablu, vidējas caurlaidības sirds sistēmu, kas atdarina zīdītāju sirds fizioloģiju/patofizioloģiju pirmsklīniskai zāļu testēšanai.
Pašreizējā manuskriptā mēs esam izstrādājuši CTCM (1.a attēls), kas var atdarināt pieaugušo sirds vidi, izraisot gan elektrisku, gan mehānisku stimulāciju fizioloģiskās frekvencēs (1, 2 Hz, 72 sitieni minūtē).Lai izvairītos no pārmērīgas audu stiepšanās diastoles laikā, tika izmantota 3D drukas ierīce, lai palielinātu audu izmēru par 25% (1.b attēls).C-PACE sistēmas izraisītā elektriskā stimulācija tika iestatīta tā, lai tā sāktos 100 ms pirms sistoles, izmantojot datu iegūšanas sistēmu, lai pilnībā reproducētu sirds ciklu.Audu kultūras sistēma izmanto programmējamu pneimatisko izpildmehānismu (LB Engineering, Vācija), lai cikliski paplašinātu elastīgu silikona membrānu, izraisot sirds šķēlumu paplašināšanos augšējā kamerā.Sistēma tika savienota ar ārējo gaisa līniju caur spiediena devēju, kas ļāva precīzi regulēt spiedienu (± 1 mmHg) un laiku (± 1 ms) (1.c att.).
a Pievienojiet audu daļu 7 mm atbalsta gredzenam, kas parādīts zilā krāsā, ierīces kultivēšanas kameras iekšpusē.Kultivēšanas kamera ir atdalīta no gaisa kameras ar plānu elastīgu silikona membrānu.Ievietojiet starpliku starp katru kameru, lai novērstu noplūdes.Ierīces vākā ir grafīta elektrodi, kas nodrošina elektrisko stimulāciju.b Lielo audu ierīces, virzošā gredzena un atbalsta gredzena shematisks attēlojums.Audu sekcijas (brūnas) novieto uz lielizmēra ierīces, vadotnes gredzenu ievietojot ierīces ārējās malas rievā.Izmantojot vadotni, uzmanīgi novietojiet atbalsta gredzenu, kas pārklāts ar audu akrila līmi, virs sirds audu daļas.c Diagramma, kurā parādīts elektriskās stimulācijas laiks kā gaisa kameras spiediena funkcija, ko kontrolē programmējams pneimatiskais izpildmehānisms (PPD).Lai sinhronizētu elektrisko stimulāciju, izmantojot spiediena sensorus, tika izmantota datu ieguves ierīce.Kad spiediens kultivēšanas kamerā sasniedz iestatīto slieksni, uz C-PACE-EM tiek nosūtīts impulsa signāls, lai aktivizētu elektrisko stimulāciju.Četras ierīces ir savienotas ar vienu PPD, izmantojot pneimatisko ķēdi, un spiediena sensori tiek ievietoti hemostatiskajā vārstā, lai kontrolētu spiedienu pneimatiskajā ķēdē.Katrā ierīcē ir sešas audu sekcijas.
Izmantojot vienu pneimatisko izpildmehānismu, mēs varējām vadīt 4 CTCM ierīces, no kurām katrā varēja ievietot 6 audu sekcijas (1. d attēls).CTCM gaisa spiediens gaisa kamerā tiek pārveidots par sinhronu spiedienu šķidruma kamerā un izraisa sirds šķēles fizioloģisko izplešanos (2.a attēls un 1. papildu filma).Audu stiepes novērtējums pie 80 mm Hg.Art.Ir pierādīts, ka šis procentuālais stiepums atbilst fizioloģiskajam sarkomēra garumam 2, 2–2, 3 µm normālai sirds sekcijas kontraktilitātei17, 19, 25.Audu kustība tika novērtēta, izmantojot pielāgotus kameras iestatījumus (1. papildu attēls).Audu kustības amplitūda un ātrums (2.c, d. att.) atbilda stiepšanai sirds cikla laikā un laikam sistoles un diastoles laikā (2.b att.).Sirds audu stiepšanās un ātrums kontrakcijas un relaksācijas laikā kultūrā saglabājās nemainīgs 12 dienas (2. att.).Lai novērtētu elektriskās stimulācijas ietekmi uz kontraktilitāti kultivēšanas laikā, mēs izstrādājām metodi aktīvās deformācijas noteikšanai, izmantojot ēnojuma algoritmu (papildu att. 2a, b), un varējām atšķirt deformācijas ar elektrisko stimulāciju un bez tās.Tāda pati sirds daļa (2.f att.).Kustīgajā griezuma apgabalā (R6-9) spriegums elektriskās stimulācijas laikā bija par 20% lielāks nekā tad, ja nebija elektriskās stimulācijas, kas norāda uz elektriskās stimulācijas ieguldījumu kontraktilā funkcijā.
Reprezentatīvās gaisa kameras spiediena, šķidruma kameras spiediena un audu kustības mērījumu pēdas apstiprina, ka kameras spiediens maina šķidruma kameras spiedienu, izraisot atbilstošu audu šķēles kustību.b Audu sekciju procentuālas stiepšanās pēdas (zilas), kas atbilst stiepes procentam (oranža).c Sirds šķēles izmērītā kustība atbilst izmērītajam kustības ātrumam.e Cikla laika kvantitatīva noteikšana (n = 19 šķēles katrā grupā, no dažādām cūkām), kontrakcijas laiks (n = 19 šķēles grupā), relaksācijas laiks (n = 19 šķēles grupā, no dažādām cūkām), audu kustība (n = 25).šķēles)/grupa no dažādām cūkām), maksimālais sistoliskais ātrums (n = 24(D0), 25(D12) šķēles/grupa no dažādām cūkām) un maksimālais relaksācijas ātrums (n=24(D0), 25(D12) šķēles/grupa no dažādām cūkām).Divpusējs Stjudenta t tests neuzrādīja būtisku atšķirību nevienā parametrā.f Reprezentatīvās deformācijas analīzes pēdas audu sekcijām ar (sarkanu) un bez (zila) elektrisko stimulāciju, desmit reģionālās audu sekciju zonas no vienas un tās pašas sekcijas.Apakšējie paneļi parāda celmu procentuālās atšķirības kvantitatīvo noteikšanu audu sekcijās ar elektrisko stimulāciju un bez tās desmit apgabalos no dažādām sekcijām. (n = 8 šķēles/grupa no dažādām cūkām, tiek veikts Two-tailed Student t-tests; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 šķēles/grupa no dažādām cūkām, tiek veikts Two-tailed Student t-tests; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; ****p<0,0001, **p<0,01,5). (n = 8 sekcijas/grupa no dažādām cūkām, divpusējs Stjudenta t-tests; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0,0001，**p < 0,01,0*p < 0,01，*p （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0,0001，**p < 0,01,0*p < 0,01，*p (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = 8 sekcijas/grupa, no dažādām cūkām, divu astes Stjudenta t-tests; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05).Kļūdu joslas attēlo vidējo ± standarta novirzi.
Iepriekšējā statiskajā biomimētiskajā sirds šķēles kultūras sistēmā [20, 21] mēs saglabājām sirds šķēlumu dzīvotspēju, funkciju un strukturālo integritāti 6 dienas, piemērojot elektrisko stimulāciju un optimizējot barotnes sastāvu.Tomēr pēc 10 dienām šie skaitļi strauji samazinājās.Mēs atsauksimies uz sadaļām, kas kultivētas mūsu iepriekšējā statiskās biomimētiskās kultūras sistēmas 20, 21 kontroles apstākļos (Ctrl), un mēs izmantosim mūsu iepriekš optimizēto barotni kā MC apstākļus un kultūru vienlaicīgas mehāniskās un elektriskās stimulācijas (CTCM) laikā.sauca .Pirmkārt, mēs noteicām, ka mehāniskā stimulācija bez elektriskās stimulācijas bija nepietiekama, lai saglabātu audu dzīvotspēju 6 dienas (papildu attēls 3a, b).Interesanti, ka, ieviešot fiziomehānisko un elektrisko stimulāciju, izmantojot STCM, 12 dienu sirds sekciju dzīvotspēja saglabājās tāda pati kā svaigās sirds sekcijās MS apstākļos, bet ne Ctrl apstākļos, kā parādīts MTT analīzē (1. attēls).3a).Tas liek domāt, ka mehāniskā stimulācija un sirds cikla simulācija var saglabāt audu sekcijas dzīvotspējīgas divreiz ilgāk, nekā ziņots mūsu iepriekšējā statiskās kultūras sistēmā.Tomēr audu sekciju strukturālās integritātes novērtējums ar sirds troponīna T un konneksīna 43 imūnmarķēšanu parādīja, ka konneksīna 43 ekspresija MC audos bija ievērojami augstāka 12. dienā nekā kontroles grupā tajā pašā dienā.Tomēr vienmērīga konneksīna 43 ekspresija un Z-diska veidošanās netika pilnībā saglabāta (3.b att.).Mēs izmantojam mākslīgā intelekta (AI) sistēmu, lai kvantitatīvi noteiktu audu strukturālo integritāti26, uz attēlu balstītu dziļās mācīšanās cauruļvadu, kas balstīts uz troponīna-T un konneksīna krāsošanu43, lai automātiski kvantitatīvi noteiktu sirds šķēlumu strukturālo integritāti un fluorescenci lokalizācijas stipruma ziņā.Šī metode izmanto konvolucionālo neironu tīklu (CNN) un dziļas mācīšanās sistēmu, lai automātiski un objektīvi noteiktu sirds audu strukturālo integritāti, kā aprakstīts atsaucē.26. MC audiem bija uzlabota strukturālā līdzība ar 0. dienu, salīdzinot ar statiskām kontroles sekcijām.Turklāt Masona krāsojums ar trihromu atklāja ievērojami mazāku fibrozes procentuālo daudzumu MS apstākļos, salīdzinot ar kontroles apstākļiem 12. kultivēšanas dienā (3.c attēls).Lai gan CTCM palielināja sirds audu sekciju dzīvotspēju 12. dienā līdz līmenim, kas līdzīgs svaigu sirds audu līmenim, tas būtiski neuzlaboja sirds sekciju strukturālo integritāti.
joslu diagramma parāda MTT dzīvotspējas kvantitatīvo noteikšanu svaigām sirds šķēlītēm (D0) vai sirds šķēlēs 12 dienām vai nu statiskā kultūrā (D12 Ctrl), vai CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC), 12 (D12 MC) ir veikts < pigu # # p. 0001 salīdzinājumā ar D0 un **p < 0,01 salīdzinājumā ar D12 Ctrl). joslu diagramma parāda MTT dzīvotspējas kvantitatīvo noteikšanu svaigām sirds šķēlītēm (D0) vai sirds šķēlīšu kultūrai 12 dienas vai nu statiskā kultūrā (D12 Ctrl) vai CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl ), 12 (D12 Ctrl ), 12 (D12 MC) ir veikts < pig#s/group tests no ANO # slices; .0001 salīdzinājumā ar D0 un **p < 0,01 salīdzinājumā ar D12 Ctrl).histogramma parāda MTT svaigas sirds sekciju (D0) vai sirds sekciju kultūras dzīvotspējas kvantitatīvo noteikšanu 12 dienas statiskā kultūrā (D12 kontrole), vai CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 kontrole).####p < 0,0001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0,0001 salīdzinājumā ar D0 un **p < 0,01 salīdzinājumā ar D12 Ctrl). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl)天的MTT 活力的量化)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测行单向ANOVA 测行单向ANOVA 测试；缌10#0#0p. ，与D12 Ctrl 相比，**p < 0,01). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片(D0) (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，####p < 0,0001，与D12」めも 相比，**phistogramma, kas parāda MTT dzīvotspējas kvantitatīvo noteikšanu svaigās sirds sekcijās (D0) vai sirds sekcijās, kas kultivētas 12 dienas statiskā kultūrā (D12 kontrole) vai CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 kontrole)), 12 (D12 MC) sekcijas/grupa no dažādām cūkām;####p < 0,0001 по сравнению с D0, **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0,0001 salīdzinājumā ar D0, **p < 0,01 salīdzinājumā ar D12 Ctrl).b Troponīns-T (zaļš), konneksīns 43 (sarkans) un DAPI (zils) svaigi izolētās sirds sekcijās (D0) vai sirds sekcijās, kas kultivētas statiskos apstākļos (Ctrl) vai CTCM apstākļos (MC) 12 dienas) reprezentatīvos imūnfluorescences attēlus (tukšā skala = 100 µm). Sirds audu struktūras integritātes mākslīgā intelekta kvantitatīvā noteikšana (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) šķēles/grupa katra no dažādām cūkām, tiek veikts vienvirziena ANOVA tests; ####p < 0,0001 salīdzinājumā ar D0 un ****p < 0,0001). Sirds audu strukturālās integritātes mākslīgā intelekta kvantitatīvā noteikšana (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) šķēles/grupa katra no dažādām cūkām, tiek veikts vienvirziena ANOVA tests; ####p < 0,0001 salīdzinājumā ar D0 un ****p < 0,001, salīdzinot ar D1201). Количественная оценка структурной целостности сердечной ткани искусственным интеллектом (n = 7 (D0), 7 вгтзо Ctrl 2), (D12) (D12) разных свиней, проводится однофакторный тест ANOVA; ####p < 0,0001 по сравнению с D0 un ****p < 0,0001 по сравне12). Sirds audu strukturālās integritātes kvantitatīva noteikšana pēc mākslīgā intelekta (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) sekcijas/grupas no dažādām cūkām, veikts vienvirziena ANOVA tests; ####p < 0,0001 pretstatā ar D0 un ****p < 0,001).人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) šķēles/grupa katra no dažādām cūkām, vienvirziena 且 渔 00p10 #. ，****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）.人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) šķēles/grupa katra no dažādām cūkām, vienvirziena 丁渔 渔 ANOVAp0 #0.####D tests; ，****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）. Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной ткани (n = 7 (D0), MCппп, 7 (D1) (D1 2рес1) у каждой из разных свиней, односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001 pret D0 Для сравнения ****p < 0,0001 по сравнению2). Mākslīgais intelekts sirds audu strukturālās integritātes kvantitatīvai noteikšanai (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) sekcijas/grupa katra no dažādām cūkām, vienvirziena ANOVA tests; ####p<0,0001 pret .D0 Salīdzinājumam ****p < 0,0201, salīdzinot ar D1201). c Reprezentatīvi attēli (pa kreisi) un kvantitatīvā noteikšana (pa labi) sirds šķēlītēm, kas iekrāsotas ar Masona trihroma traipu (mērogs tukšs = 500 µm) (n = 10 šķēles/grupa katra no dažādām cūkām, tiek veikts vienvirziena ANOVA tests; Ctrl; ####p < 0,0001, salīdzinot ar D 0,001). c Reprezentatīvie attēli (pa kreisi) un kvantitatīvā noteikšana (pa labi) sirds šķēlītēm, kas iekrāsotas ar Masona trihroma traipu (Mērogs tukšs = 500 µm) (n = 10 šķēles/grupa katra no dažādām cūkām, tiek veikts vienvirziena ANOVA tests; #### p < 0,00 un 01, salīdzinot ar D1 un 0,1). c Репрезентативные изображения (слева) и количественная оценка (справа) срезов сердца, окрашенных трихром штаб без покрытия = 500 мкм) (n = 10 срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонний тени0 p1 поронний тени0 p1 поронний тени0 p1 поронний тесто# ANOVA; и ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Ar Masona trihroma traipu iekrāsotu sirds sekciju reprezentatīvie attēli (pa kreisi) un kvantitatīvie rādītāji (labajā pusē) (n = 10 sekcijas/grupa no dažādām cūkām, veikts vienvirziena ANOVA tests; #### p < 0 .0001, salīdzinot ar D0 un D0 ***1, salīdzinot ar D0 un .0001). c 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右））伈右）（裸尺0）（裸尺0）切片/组，每组来自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0,0001 伎D0 相比 ，***0p2 <丸比，*** . c Ar Masona trihroma traipu iekrāsotu sirds sekciju reprezentatīvie attēli (pa kreisi) un kvantitatīvie rādītāji (pa labi) (n = 10 sekcijas/grupā, katra no citas cūkas, pārbaudīta ar vienvirziena dispersijas analīzi ;### # p < 0,0001 *** 0, salīdzinot ar D0, 0, 2, salīdzinot ar D0).Kļūdu joslas attēlo vidējo ± standarta novirzi.
Mēs izvirzījām hipotēzi, ka, pievienojot barotnei mazas molekulas, CTCM kultūras laikā var uzlabot kardiomiocītu integritāti un samazināt fibrozes attīstību.Tāpēc mēs pārbaudījām mazas molekulas, izmantojot mūsu statiskās kontroles kultūras 20, 21 mazo mulsinošo faktoru dēļ.Šim ekrānam tika izvēlēts deksametazons (Dex), trijodtironīns (T3) un SB431542 (SB).Šīs mazās molekulas iepriekš tika izmantotas hiPSC-CM kultūrās, lai izraisītu kardiomiocītu nobriešanu, palielinot sarkomēra garumu, T-kanāliņus un vadīšanas ātrumu.Turklāt ir zināms, ka gan Dex (glikokortikoīds), gan SB nomāc iekaisumu29, 30.Tāpēc mēs pārbaudījām, vai vienas vai šo mazo molekulu kombinācijas iekļaušana uzlabos sirds sekciju strukturālo integritāti.Sākotnējai skrīningam katra savienojuma deva tika izvēlēta, pamatojoties uz koncentrācijām, ko parasti izmanto šūnu kultūras modeļos (1 μM Dex27, 100 nM T327 un 2, 5 μM SB31).Pēc 12 dienu kultivēšanas T3 un Dex kombinācija radīja optimālu kardiomiocītu strukturālo integritāti un minimālu šķiedru remodelāciju (4. un 5. papildu attēls).Turklāt šo T3 un Dex koncentrāciju dubultā vai dubultā izmantošana radīja kaitīgus efektus, salīdzinot ar normālām koncentrācijām (papildu 6.a, b attēls).
Pēc sākotnējās skrīninga mēs veicām 4 kultivēšanas apstākļu salīdzinājumu (4.a attēls): Ctrl: sirds sekcijas, kas kultivētas mūsu iepriekš aprakstītajā statiskajā kultūrā, izmantojot mūsu optimizēto barotni;20.21 TD: T3 un Ctrl s Pievienots Dex trešdien;MC: sirds sekcijas, kas kultivētas CTCM, izmantojot mūsu iepriekš optimizēto barotni;Pēc 12 dienu kultivēšanas MS un MT audu dzīvotspēja palika tāda pati kā svaigos audos, kas novērtēti ar MTT testu (4.b attēls).Interesanti, ka T3 un Dex pievienošana transwell kultūrām (TD) neizraisīja būtisku dzīvotspējas uzlabošanos salīdzinājumā ar Ctrl apstākļiem, norādot uz mehāniskās stimulācijas svarīgu lomu sirds sekciju dzīvotspējas uzturēšanā.
Eksperimentālā dizaina diagramma, kurā attēloti četri kultivēšanas apstākļi, kas izmantoti, lai novērtētu mehāniskās stimulācijas un T3/Dex papildināšanas ietekmi uz barotni 12 dienas. b Svītru diagramma parāda dzīvotspējas kvantitatīvo noteikšanu 12 dienas pēc kultivēšanas visos 4 kultivēšanas apstākļos (Ctrl, TD, MC un MT), salīdzinot ar svaigām sirds šķēlītēm (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD un D12 MT), 12 (D12 MC) ir veikts <ANOS #group, no dažādām šķēlēm #0#p. 0001, ###p < 0,001 salīdzinājumā ar D0 un **p < 0,01 salīdzinājumā ar D12 Ctrl). b Svītru diagramma parāda dzīvotspējas kvantitatīvo noteikšanu 12 dienas pēc kultivēšanas visos 4 kultivēšanas apstākļos (Ctrl, TD, MC un MT), salīdzinot ar svaigām sirds šķēlītēm (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD un D12 MT), 12 (D12 MC) ir veikts <ANOS #group, no dažādām šķēlēm #0#p. 0001, ###p < 0,001 salīdzinājumā ar D0 un **p < 0,01 salīdzinājumā ar D12 ctrl). b Гистограмма показывает количественную оценку жизнеспособности через 12 дней после культивирования культивирования во4вивирования во4 вания (контроль, TD, MC un MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD un D122 MT) разных свиней, проводится односторонний тест ANOVA; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 D0, пнеюю2) b Joslu diagramma parāda dzīvotspējas kvantitatīvo noteikšanu 12 dienas pēc kultivēšanas visos 4 kultivēšanas apstākļos (kontrole, TD, MC un MT), salīdzinot ar svaigas sirds sekcijām (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD un D12 MT), 12 (D12 MC), 12 (D12 MC) no dažādām sekcijām ANO #0 p. 01, ###p < 0,001 pret D0 un **p < 0,01, salīdzinot ar D12 Ctrl). b 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) (n = 18 (D215)D12D15) MT)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；####p < 0.0001，###p < 0.0001，###p < ** 0.0001，###p < 丌p01.0.0D01与D12控制）.b 4 12 (D12 MC) b Гистограмма, показывающая все 4 условия культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срез0дими срез0д8n), 15 (D12 Ctrl, D12 TD un D12 MT), от разных свиней 12 (D12 MC) срезы/группа, односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001, D12 вране <0, ##х1 p p <0,01 по сравнению с контролем D12). b Histogramma, kurā parādīti visi 4 kultivēšanas apstākļi (kontrole, TD, MC un MT), salīdzinot ar svaigas sirds sekcijām (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD un D12 MT), no dažādām cūkām 12 (D12 MC) sekcijas/grupa, vienvirziena ANOVA tests; D #.<##p1 **p<0,01 salīdzinājumā ar kontroli D12). c Joslu diagramma parāda glikozes plūsmas kvantitatīvo noteikšanu 12 dienas pēc kultivēšanas visos 4 kultivēšanas apstākļos (Ctrl, TD, MC un MT), salīdzinot ar svaigām sirds šķēlītēm (D0) (n = 6 šķēles/grupa no dažādām cūkām, tiek veikts vienvirziena ANOVA tests; ###p < 0,001, salīdzinot ar D0 un 1, salīdzinot ar D0 un 0,2 ***p < D0 un.2). c Joslu diagramma parāda glikozes plūsmas kvantitatīvo noteikšanu 12 dienas pēc kultivēšanas visos 4 kultivēšanas apstākļos (Ctrl, TD, MC un MT), salīdzinot ar svaigām sirds šķēlītēm (D0) (n = 6 šķēles/grupa no dažādām cūkām, tiek veikts vienvirziena ANOVA tests; ###p < 0,001, salīdzinot ar D0 un 1, salīdzinot ar D0 un 0,2 ***p < D0 un.2). c Гистограмма показывает количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования во вивавивирования во во4 все (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группу от разных светныйястопондыней, ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению с D0 un ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Histogramma parāda glikozes plūsmas kvantitatīvo noteikšanu 12 dienas pēc kultivēšanas visos 4 kultivēšanas apstākļos (kontrole, TD, MC un MT), salīdzinot ar svaigas sirds sekcijām (D0) (n = 6 sekcijas/grupa no dažādām cūkām, veikts vienvirziena ANOVA tests; ###p < 0,001, salīdzinot ar D0 un 21***p < ar D0 un 21***p <). c 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) 相掐褡儹褐2糖通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试；###***D < 0.001，与D0；001，与D0（相比）. c Гистограмма, показывающая количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования культивирования куличественную дченку рования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группа, от разныйстйполроводиных, сердца ены тесты ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 (контроль). c Histogramma, kas parāda glikozes plūsmas kvantitatīvo noteikšanu 12 dienas pēc kultivēšanas visiem 4 kultivēšanas apstākļiem (kontrole, TD, MC un MT), salīdzinot ar svaigas sirds sekcijām (D0) (n = 6 sekcijas/grupa, no dažādām cūkām, tika veikti vienpusēji Vai tika veikti ANOVA testi, ###p < 0,001, salīdzinot ar 1***p, salīdzinot ar 0,001).d Svaigu (zils), 12. dienas MC (zaļi) un 12. dienas MT (sarkanu) audu deformācijas analīzes diagrammas desmit reģionālajos audu sekciju punktos (n = 4 šķēles/grupa, vienvirziena ANOVA tests; starp grupām nebija būtisku atšķirību).e Vulkāna diagramma, kurā parādīti atšķirīgi izteikti gēni svaigās sirds sekcijās (D0), salīdzinot ar sirds sekcijām, kas kultivētas statiskos apstākļos (Ctrl) vai MT apstākļos (MT) 10–12 dienas.f Sarkomēru gēnu siltuma karte sirds sekcijām, kas kultivētas katrā no audzēšanas apstākļiem.Kļūdu joslas attēlo vidējo ± standarta novirzi.
Metaboliskā atkarība no pārejas no taukskābju oksidācijas uz glikolīzi ir kardiomiocītu dediferenciācijas pazīme.Nenobriedušie kardiomiocīti galvenokārt izmanto glikozi ATP ražošanai, un tiem ir hipoplastiski mitohondriji ar dažām kristām5, 32.Glikozes izmantošanas analīzes parādīja, ka MC un MT apstākļos glikozes izmantošana bija līdzīga kā 0. dienas audos (4.c attēls).Tomēr Ctrl paraugi uzrādīja ievērojamu glikozes izmantošanas pieaugumu, salīdzinot ar svaigiem audiem.Tas norāda, ka CTCM un T3 / Dex kombinācija uzlabo audu dzīvotspēju un saglabā 12 dienu kultivēto sirds sekciju metabolisko fenotipu.Turklāt celmu analīze parādīja, ka celmu līmenis saglabājās tāds pats kā svaigos sirds audos MT un MS apstākļos 12 dienas (4.d attēls).
Lai analizētu CTCM un T3 / Dex kopējo ietekmi uz sirds šķēles audu globālo transkripcijas ainavu, mēs veicām RNAseq sirds šķēlēs no visiem četriem dažādiem kultūras apstākļiem (1. papildu dati).Interesanti, ka MT sekcijām bija augsta transkripcijas līdzība ar svaigiem sirds audiem, tikai 16 atšķirīgi izteikti no 13 642 gēniem.Tomēr, kā mēs parādījām iepriekš, Ctrl šķēlēs pēc 10–12 dienām kultūrā tika parādīti 1229 atšķirīgi ekspresēti gēni (4.e attēls).Šos datus apstiprināja sirds un fibroblastu gēnu qRT-PCR (papildu 7.a-c attēls).Interesanti, ka Ctrl sadaļas parādīja sirds un šūnu cikla gēnu pazemināšanos un iekaisuma gēnu programmu aktivizēšanu.Šie dati liecina, ka dediferenciācija, kas parasti notiek pēc ilgstošas ​​kultivēšanas, ir pilnībā novājināta MT apstākļos (papildu 8.a, b attēls).Rūpīga sarkomēru gēnu izpēte parādīja, ka tikai MT apstākļos tiek saglabāti gēni, kas kodē sarkomēru (4.f att.) un jonu kanālu (papildu 9. att.), aizsargājot tos no nomākšanas Ctrl, TD un MC apstākļos.Šie dati parāda, ka ar mehāniskās un humorālās stimulācijas (T3/Dex) kombināciju sirds šķēles transkripts var palikt līdzīgs svaigām sirds šķēlītēm pēc 12 dienām kultūrā.
Šos transkripcijas atklājumus apstiprina fakts, ka kardiomiocītu strukturālā integritāte sirds sekcijās vislabāk tiek saglabāta MT apstākļos 12 dienas, kā to parāda neskarts un lokalizēts 43. konnexīns (5.a attēls).Turklāt fibroze sirds sekcijās MT apstākļos bija ievērojami samazināta salīdzinājumā ar Ctrl un līdzīgi svaigām sirds sekcijām (5.b att.).Šie dati parāda, ka mehāniskās stimulācijas un T3/Dex apstrādes kombinācija efektīvi saglabā sirds struktūru sirds sekcijās kultūrā.
a Reprezentatīvi troponīna-T (zaļš), konneksīna 43 (sarkans) un DAPI (zils) imunofluorescences attēli svaigi izolētās sirds sekcijās (D0) vai kultivēti 12 dienas visos četros sirds sekciju kultivēšanas apstākļos (mēroga josla = 100 µm).). Sirds audu strukturālās integritātes mākslīgā intelekta kvantitatīvā noteikšana (n = 7 (D0 un D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC un D12 MT) šķēles/grupa no dažādām cūkām, tiek veikts vienvirziena ANOVA tests; ####p < 0,0001, salīdzinot ar D0 un *5, salīdzinot ar D0 un *5.1, vai 0.0.0. ). Sirds audu strukturālās integritātes mākslīgā intelekta kvantitatīva noteikšana (n = 7 (D0 un D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC un D12 MT) šķēles/grupa no dažādām cūkām, tiek veikts vienvirziena ANOVA tests; #### p < 0,0001, salīdzinot ar D0 un *5, salīdzinot ar D0 un *5.1, vai 0.0.0. ). Количественная оценка структурной целостности ткани сердца с помощью искусственного интеллекта), Ctrl интеллекта (n = D51,2D10) D12 MT) срезов/группу от разных свиней, проведен однофакторный тест ANOVA; #### p < 0,0001 по сравнению <****и сравнению <****и сравнению с по 0,0 *p с D0,0 сравнению с D12 Ctrl). Sirds audu strukturālās integritātes kvantitatīva noteikšana, izmantojot mākslīgo intelektu (n = 7 (D0 un D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC un D12 MT) sekcijas/grupa no dažādām cūkām, veikts vienvirziena ANOVA tests; ##****## p < 0,0001 salīdzinājumā ar D0 un *p < 0,0001 salīdzinot ar D0 un *p < 0,0.1).对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、、5（D12 TD、D12 MC 和焺庇和盺臉和盺臉和D12 MT（工智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0,0001 与D0 和*p < 0,05 相比，或****p < 0,000112 䯎４0111对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 （n = 7 （d0 和 d12 ctrl） （5 （d12 td 、 d12 mc12 mc工 智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ########## p < 0,0001 与D0 和*p < 0,05 盔相比）.Sirds audu strukturālās integritātes kvantitatīva noteikšana, izmantojot mākslīgo intelektu dažādām cūkām (n = 7 (D0 un D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC un D12 MT) sekcijas/grupa) ar vienvirziena ANOVA testu;#### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). #### p < 0,0001 salīdzinājumā ar D0 un *p < 0,05 vai ****p < 0,0001 salīdzinājumā ar D12 Ctrl). b Reprezentatīvie attēli un kvantitatīvā noteikšana sirds šķēlītēm, kas iekrāsotas ar Masona trīskrāsas traipu (mēroga josla = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD un D12 MC), 9 (D12 MT) šķēles/grupa veiktas no dažādām cūkām; D0 un ***p < 0,001 vai ****p < 0,0001 salīdzinājumā ar D12 Ctrl). b Reprezentatīvie attēli un kvantitatīvā noteikšana sirds šķēlītēm, kas iekrāsotas ar Masona trīskrāsas traipu (mēroga josla = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD un D12 MC), 9 (D12 MT) šķēles/grupa veiktas no dažādām cūkām; D0 un ***p < 0,001 vai ****p < 0,0001 salīdzinājumā ar D12 Ctrl). b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромным красителеймомным красителены ка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD un D12 MC), 9 (D12 MT) срезов/группу от разных свиней, выполняется #0#0#0; по сравнению с D0 и ***p < 0,001 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b Reprezentatīvi attēli un to sirds sekciju kvantitatīvā noteikšana, kas iekrāsota ar Masona trihroma traipu (mēroga josla = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD un D12 MC), 9 (D12 MT) sekcijas/grupa no dažādām cūkām, veikta <*** v. 0,001 vai ****p < 0,0001 pret D12 Ctrl). b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺= 500 µm（D10＀D =1D010（n和D12 MC），来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方差分析，方差分析；#.0#p0D1４ 0,001，或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）. b 用 Mason 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 （比例 尺 d 尺 尺 = 500 µ0 n = 500 µ0 ctrl 、 d12 td 和 d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 片片 切片 ​​切片 切片 切切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 组，进行单因素方差 单因素方差 单因素方差 切片 0 0 ，***p < 0,001, 或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）. b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромом = Массца (тим00ромом Массца) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD un D12 MC), 9 (D12 MT) срезов от разных свиней / группы, один- способ *** ANOVA; ####p < не 0,0,0сра1 по 0, 0, 0 ,001 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b Reprezentatīvi attēli un sirds sekciju kvantitatīvā noteikšana, kas iekrāsota ar Masona trihromu (mēroga josla = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD un D12 MC), 9 (D12 MT) sekcijas no dažādām cūkām/grupā, viena ANOVA metode <***, 0, 0, 0, 0, 0. ****p < 0,0001 salīdzinājumā ar D12 Ctrl).Kļūdu joslas attēlo vidējo ± standarta novirzi.
Visbeidzot, CTCM spēja atdarināt sirds hipertrofiju tika novērtēta, palielinot sirds audu stiepšanu.CTCM maksimālais spiediens gaisa kamerā palielinājās no 80 mmHg līdz 80 mmHg.Art.(normāla stiepšanās) līdz 140 mmHg Art.(6.a att.).Tas atbilst stiepes palielinājumam par 32% (6.b att.), kas iepriekš tika parādīts kā atbilstošs procentuālais izstiepums, kas nepieciešams sirds sekcijām, lai sasniegtu sarkomēra garumu, kas līdzīgs hipertrofijas gadījumā novērotajam.Sirds audu stiepšanās un ātrums kontrakcijas un relaksācijas laikā palika nemainīgs sešu dienu kultivēšanas laikā (6.c attēls).Sirds audi no MT apstākļiem sešas dienas tika pakļauti normālai stiepšanās (MT (normāls)) vai pārmērīgas izstiepšanas apstākļiem (MT (OS)).Jau pēc četrām dienām kultūrā hipertrofiskais biomarķieris NT-ProBNP bija ievērojami paaugstināts barotnē MT (OS) apstākļos, salīdzinot ar MT (normāliem) apstākļiem (7.a attēls).Turklāt pēc sešu dienu kultivēšanas šūnu izmērs MT (OS) (7.b attēls) ievērojami palielinājās, salīdzinot ar MT sirds sekcijām (normālas).Turklāt NFATC4 kodola translokācija tika ievērojami palielināta pārmērīgi izstieptos audos (7.c attēls).Šie rezultāti liecina par pakāpenisku patoloģiskās remodelācijas attīstību pēc hipertensijas un atbalsta koncepciju, ka CTCM ierīci var izmantot kā platformu stiepes izraisītas sirds hipertrofijas signālu izpētei.
Reprezentatīvās gaisa kameras spiediena, šķidruma kameras spiediena un audu kustības mērījumu pēdas apstiprina, ka kameras spiediens maina šķidruma kameras spiedienu, izraisot atbilstošu audu šķēles kustību.b Reprezentatīvās stiepšanās procentuālās un stiepšanās ātruma līknes normāli izstieptām (oranžām) un pārstieptām (zilām) audu sekcijām.c Joslu diagramma, kurā parādīts cikla laiks (n = 19 šķēles vienā grupā, no dažādām cūkām), kontrakcijas laiks (n = 18-19 šķēles katrā grupā, no dažādām cūkām), relaksācijas laiks (n = 19 šķēles grupā, no dažādām cūkām) ), audu kustības amplitūda (n = 14 šķēles/grupa, no dažādām cūkām, ātrums = 1 cūkas, ātrums = 1 cūkas/grupa). cūkas) un maksimālais relaksācijas ātrums (n = 14 (D0), 15 (D6) ) sekcijas/grupas) no dažādām cūkām), divu astes Studenta t-tests neuzrādīja būtisku atšķirību nevienā parametrā, norādot, ka šie parametri palika nemainīgi 6 dienu kultivēšanas laikā ar pārspriegumu.Kļūdu joslas attēlo vidējo ± standarta novirzi.
NT-ProBNP koncentrācijas kvantitatīvais noteikšanas joslu diagramma barotnē no sirds šķēlītēm, kas kultivētas MT normālas stiepšanās (Norm) vai pārmērīgas stiepšanās (OS) apstākļos (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm un D4 MTOS) šķēles/grupa no dažādām cūkām, salīdzinot ar izstiepšanu līdz 0, **p ir veikta divvirzienu. NT-ProBNP koncentrācijas kvantitatīvais noteikšanas joslu diagramma barotnēs no sirds šķēlītēm, kas kultivētas MT normālas stiepšanās (Norm) vai pārmērīgas stiepšanās (OS) apstākļos (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm un D4 MTOS) šķēles/grupa, salīdzinot ar dažādām cūkām, **p ANO ir veikta <0;.0 normāla).NT-ProBNP koncentrācijas kvantitatīvā histogramma barotnē no sirds šķēlītēm, kas kultivētas normālas MT stiepes (normas) vai pārmērīgas stiepes (OS) apstākļos (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm un D4).MTOS) šķēles/grupa no dažādām cūkām, veikta divu faktoru dispersijas analīze;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0,01 salīdzinājumā ar parasto stiepšanu). a 在MT 正常拉伸(Norm) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP 浓庡(D2 MTNorm)、3（D2 MTOS、D4 MTNorm 和D4 MTOS）来自不同猪的切片/组，进行双向方差分析，p < 0,01）. NT-ProBNP koncentrācijas kvantitatīva noteikšana sirds šķēlēs, kas kultivētas MT normālas stiepes (Norm) vai pārmērīgas stiepes (OS) apstākļos (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm和D4 MTOS) no dažādiem 猪的幇牑䏐双幌叐叐动; **salīdzinot ar parasto stiepšanu, p < 0,01).histogramma NT-ProBNP koncentrācijas kvantitatīva noteikšana sirds šķēlēs, kas kultivētas normālas MT stiepes (normas) vai pārmērīgas stiepes (OS) apstākļos (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) un D4 MTOS) šķēles/grupa no dažādām cūkām, divvirzienu dispersijas analīze;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0,01 salīdzinājumā ar parasto stiepšanu). b Reprezentatīvi attēli sirds šķēlītēm, kas iekrāsotas ar troponīnu-T un WGA (pa kreisi) un šūnu lieluma kvantitatīvā noteikšana (pa labi) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) šūnas/grupa no 10 dažādām šķēlītēm no dažādām cūkām, Two-taled Student t-1 tests ir salīdzināts ar 0 normālu .****0 p1). b Reprezentatīvi attēli sirds šķēlītēm, kas iekrāsotas ar troponīnu-T un WGA (pa kreisi) un šūnu lieluma kvantitatīvo noteikšanu (pa labi) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) šūnas/grupa no 10 dažādām šķēlītēm no dažādām cūkām, Two-taled Student t-1 tests tiek salīdzināts ar 0 normālu .****0 p1). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и количествентивные количествеяпералмо ва) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клеток/группу из 10 разных срезов от разных свиней, два- проводится разных свиней, два- проводится ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b Reprezentatīvi attēli no sirds sekcijām, kas iekrāsotas ar troponīnu-T un AZP (pa kreisi) un šūnu lieluma kvantitatīvā noteikšana (pa labi) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) šūnas/grupa no 10 dažādām sekcijām no dažādām cūkām, tika veikts divu astes Studenta t-tests <salīdzinot b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的代脼切片的代脼切片的代表 揃30D ），来自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾学玌有尾学生t比，****p < 0,0001）. b Ar calcarein-T un WGA (pa kreisi) iekrāsotu sirds šķēlumu reprezentatīvi attēli un šūnu izmērs (pa labi) (n = 330 (D6 MTOS), 369 no 10 dažādām šķēlītēm (D6 MTNorm)). 0,0001). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т un АЗП (слева) и количественкаn (количественкаn) = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) из 10 различных срезов от разных свиней Клетки/группа, ****тьа, 0 двусторонние критю 0,0 критери; сравнению с нормальным растяжением). b Ar troponīnu-T un AZP krāsotu sirds sekciju reprezentatīvie attēli (pa kreisi) un šūnu lieluma kvantitatīva noteikšana (pa labi) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) no 10 dažādām sekcijām no dažādām cūkām) Šūnas/grupa, divpusīgs kritērijs Studenta t;****p < 0,0001 salīdzinājumā ar parasto deformāciju). c Reprezentatīvie attēli 0. un 6. dienai MTOS sirds šķēles, kas imunizētas ar troponīnu-T un NFATC4, un NFATC4 translokācijas kvantitatīva noteikšana uz CM kodoliem (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) šķēles/grupa no dažādām studentu cūkām, *t 0. ptests ir <ptests; c Reprezentatīvie attēli 0. un 6. dienai MTOS sirds šķēles, kas imūnmarķētas ar troponīnu-T un NFATC4, un NFATC4 translokācijas kvantitatīva noteikšana uz CM kodoliem (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) šķēles/grupa no dažādām cūkām, *t-ptai veikts0 <0; c Репрезентативные изображения для срезов сердца 0 и 6 дней MTOS, иммуномеченых для тропонина-Т инерастина-Т и NFATC4, слокации NFATC4 в ядра кавернозных клеток (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срезов/группу от разных свинеристодриврийстоясронниятсо ента; *p < 0,05). c Reprezentatīvi attēli sirds sekcijām 0 un 6 dienu MTOS, imūnmarķēti ar troponīnu-T un NFATC4, un NFATC4 translokācijas kvantitatīva noteikšana kavernozu šūnu kodolā (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) šķēles/grupa no dažādām cūkām) Studenta divu t-tai testu;*p < 0,05). c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天 和第 天 MTOS 心脏切片仼卪表性的NFATC4 易位至CM 细胞核的量化（n = 4 (D0)、3 (D6 MTOS) 切片/组, 进行双尾学生t 曂〼 5 p) c Reprezentatīvi attēli ar kalkanīna-T un NFATC4 imūnmarķējumu 第0天和第6天MTOS sirds šķēlītēm un NFATC4 no dažādiem NFATC4 易位至CM šūnu kodoliem的quantity化 (n = 4 (D0), 痴凤 3 (D6凤 3)双尾学生et 电影；*p < 0,05). c Репрезентативные изображения срезов сердца MTOS на 0 и 6 день для иммуномаркировки тропонином-Т и NFATC4нчения срезов сердца MTOS кации NFATC4 в ядра CM от разных свиней (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срез/группа, два- хвостатый t-критерий Стьюде <, Стьюде). c Reprezentatīvi attēli no MTOS sirds šķēlītēm 0. un 6. dienā troponīna-T un NFATC4 imunomarķēšanai un NFATC4 translokācijas kvantitatīvai noteikšanai CM kodolā no dažādām cūkām (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) šķēles/grupa, divpusēji t. 05 *studentu t.0.Kļūdu joslas attēlo vidējo ± standarta novirzi.
Translācijas kardiovaskulāro pētījumu veikšanai nepieciešami šūnu modeļi, kas precīzi atveido sirds vidi.Šajā pētījumā tika izstrādāta un raksturota CTCM ierīce, kas var stimulēt īpaši plānas sirds daļas.CTCM sistēma ietver fizioloģiski sinhronizētu elektromehānisko stimulāciju un T3 un Dex šķidruma bagātināšanu.Kad cūku sirds sekcijas tika pakļautas šiem faktoriem, to dzīvotspēja, strukturālā integritāte, vielmaiņas aktivitāte un transkripcijas ekspresija palika tāda pati kā svaigos sirds audos pēc 12 dienu kultivēšanas.Turklāt pārmērīga sirds audu stiepšanās var izraisīt sirds hipertrofiju, ko izraisa hiperekstensija.Kopumā šie rezultāti apstiprina fizioloģiskās kultūras apstākļu kritisko lomu normāla sirds fenotipa uzturēšanā un nodrošina platformu zāļu skrīningam.
Daudzi faktori veicina optimālas vides radīšanu kardiomiocītu funkcionēšanai un izdzīvošanai.Acīmredzamākie no šiem faktoriem ir saistīti ar (1) starpšūnu mijiedarbību, (2) elektromehānisko stimulāciju, (3) humorāliem faktoriem un (4) vielmaiņas substrātiem.Fizioloģiskai šūnu savstarpējai mijiedarbībai ir nepieciešami sarežģīti vairāku šūnu tipu trīsdimensiju tīkli, kurus atbalsta ārpusšūnu matrica.Šādas sarežģītas šūnu mijiedarbības ir grūti rekonstruēt in vitro, kopīgi kultivējot atsevišķus šūnu tipus, taču to var viegli panākt, izmantojot sirds sekciju organotipisko raksturu.
Kardiomiocītu mehāniskā stiepšanās un elektriskā stimulācija ir būtiska sirds fenotipa uzturēšanai 33, 34, 35.Lai gan mehāniskā stimulācija ir plaši izmantota hiPSC-CM kondicionēšanai un nobriešanai, vairāki eleganti pētījumi nesen ir mēģinājuši mehāniski stimulēt sirds šķēles kultūrā, izmantojot vienpusēju slodzi.Šie pētījumi liecina, ka 2D vienpusēja mehāniskā slodze labvēlīgi ietekmē sirds fenotipu kultivēšanas laikā.Šajos pētījumos sirds sekcijas tika noslogotas ar izometriskiem stiepes spēkiem17, lineāru auksotonisku slodzi18, vai arī sirds cikls tika atjaunots, izmantojot spēka devēja atgriezenisko saiti un spriedzes piedziņas.Tomēr šīs metodes izmanto vienpusēju audu stiepšanu bez vides optimizācijas, kā rezultātā tiek nomākti daudzi sirds gēni vai pārmērīga gēnu ekspresija, kas saistīti ar neparastām stiepšanās reakcijām.Šeit aprakstītais CTCM nodrošina 3D elektromehānisku stimulu, kas atdarina dabisko sirds ciklu cikla laika un fizioloģiskās stiepes ziņā (25% stiepšanās, 40% sistoles, 60% diastoles un 72 sitieni minūtē).Lai gan ar šo trīsdimensiju mehānisko stimulāciju vien nepietiek, lai saglabātu audu integritāti, ir nepieciešama humorālās un mehāniskās stimulācijas kombinācija, izmantojot T3/Dex, lai adekvāti uzturētu audu dzīvotspēju, funkciju un integritāti.
Humorālajiem faktoriem ir liela nozīme pieaugušo sirds fenotipa modulēšanā.Tas tika uzsvērts HiPS-CM pētījumos, kuros T3 un Dex tika pievienoti barotnei, lai paātrinātu šūnu nobriešanu.T3 var ietekmēt aminoskābju, cukuru un kalcija transportēšanu caur šūnu membrānām36.Turklāt T3 veicina MHC-α ekspresiju un MHC-β pazemināšanos, veicinot ātras raustīšanās miofibrilu veidošanos nobriedušos kardiomiocītos, salīdzinot ar lēnām raustīšanās miofibrilām augļa CM.T3 deficīts hipotireozes pacientiem izraisa miofibrilāro joslu zudumu un samazinātu tonusa attīstības ātrumu37.Dex iedarbojas uz glikokortikoīdu receptoriem, un ir pierādīts, ka tas palielina miokarda kontraktilitāti izolētās perfūzētās sirdīs;38 domājams, ka šis uzlabojums ir saistīts ar ietekmi uz kalcija nogulšņu izraisītu ieeju (SOCE) 39,40.Turklāt Dex saistās ar saviem receptoriem, izraisot plašu intracelulāru reakciju, kas nomāc imūno funkciju un iekaisumu30.
Mūsu rezultāti liecina, ka fiziskā mehāniskā stimulācija (MS) uzlaboja kopējo kultūras veiktspēju, salīdzinot ar Ctrl, bet nespēja saglabāt dzīvotspēju, strukturālo integritāti un sirds ekspresiju 12 dienu laikā kultūrā.Salīdzinot ar Ctrl, T3 un Dex pievienošana CTCM (MT) kultūrām uzlaboja dzīvotspēju un saglabāja līdzīgus transkripcijas profilus, strukturālo integritāti un vielmaiņas aktivitāti ar svaigiem sirds audiem 12 dienas.Turklāt, kontrolējot audu stiepes pakāpi, tika izveidots hiperekstensijas izraisītas sirds hipertrofijas modelis, izmantojot STCM, kas ilustrē STCM sistēmas daudzpusību.Jāatzīmē, ka, lai gan sirds remodelācija un fibroze parasti ietver neskartus orgānus, kuru cirkulējošās šūnas var nodrošināt atbilstošus citokīnus, kā arī fagocitozi un citus remodelācijas faktorus, sirds daļas joprojām var atdarināt fibrotisko procesu, reaģējot uz stresu un traumām.miofibroblastos.Tas ir iepriekš novērtēts šajā sirds šķēles modelī.Jāņem vērā, ka CTCM parametrus var modulēt, mainot spiedienu/elektrisko amplitūdu un frekvenci, lai modelētu daudzus apstākļus, piemēram, tahikardiju, bradikardiju un mehānisku asinsrites atbalstu (mehāniski nenoslogota sirds).Tas padara sistēmu par vidēju caurlaidspēju narkotiku testēšanai.CTCM spēja modelēt pārmērīgas slodzes izraisītu sirds hipertrofiju paver ceļu šīs sistēmas testēšanai personalizētai terapijai.Noslēgumā jāsaka, ka šis pētījums parāda, ka mehāniskā stiepšanās un humorālā stimulācija ir būtiska sirds audu sekciju kultūras uzturēšanai.
Lai gan šeit sniegtie dati liecina, ka CTCM ir ļoti daudzsološa platforma neskarta miokarda modelēšanai, šai kultūras metodei ir daži ierobežojumi.Galvenais CTCM kultūras ierobežojums ir tāds, ka tā uzliek šķēlēm nepārtrauktu dinamisku mehānisko spriegumu, kas izslēdz iespēju aktīvi uzraudzīt sirds šķēles kontrakcijas katra cikla laikā.Turklāt, ņemot vērā sirds sekciju mazo izmēru (7 mm), iespēja novērtēt sistolisko funkciju ārpus kultūras sistēmām, izmantojot tradicionālos spēka sensorus, ir ierobežota.Pašreizējā manuskriptā mēs daļēji pārvarām šo ierobežojumu, novērtējot optisko spriegumu kā saraušanās funkcijas indikatoru.Tomēr šim ierobežojumam būs vajadzīgs turpmāks darbs, un to var risināt nākotnē, ieviešot metodes sirds šķēlumu funkciju optiskai uzraudzībai kultūrā, piemēram, optisko kartēšanu, izmantojot kalciju un sprieguma jutīgas krāsvielas.Vēl viens CTCM ierobežojums ir tāds, ka darba modelis nemanipulē fizioloģisko stresu (priekšslodze un pēcslodze).CTCM gadījumā spiediens tika inducēts pretējos virzienos, lai ļoti lielos audos reproducētu 25% fizioloģisko izstiepšanos diastolā (pilna stiepšanās) un sistolē (kontrakcijas garums elektriskās stimulācijas laikā).Šis ierobežojums ir jānovērš turpmākajos CTCM projektos, nodrošinot atbilstošu spiedienu uz sirds audiem no abām pusēm un piemērojot precīzas spiediena un tilpuma attiecības, kas rodas sirds kambaros.
Šajā manuskriptā aprakstītā pārmērīgas stiepes izraisītā pārveidošana aprobežojas ar hipertrofisku hiperstrejas signālu atdarināšanu.Tādējādi šis modelis var palīdzēt izstiepšanas izraisītas hipertrofiskas signalizācijas izpētē bez nepieciešamības pēc humorāliem vai neironu faktoriem (kas šajā sistēmā nepastāv).Ir nepieciešami turpmāki pētījumi, lai palielinātu CTCM daudzveidību, piemēram, kopkultūra ar imūnsistēmas šūnām, cirkulējošie plazmas humorālie faktori un inervācija, kultivējot kopā ar neironu šūnām, uzlabos slimības modelēšanas iespējas ar CTCM.
Šajā pētījumā tika izmantotas trīspadsmit cūkas.Visas dzīvnieku procedūras tika veiktas saskaņā ar institucionālajām vadlīnijām, un tās apstiprināja Luisvilas Universitātes Institucionālā dzīvnieku aprūpes un lietošanas komiteja.Aortas arka tika saspiesta un sirds tika perfūzēta ar 1 L sterilu kardioplegiju (110 mM NaCl, 1,2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 U/mL heparīna, pH līdz 7,4); sirdis tika uzglabātas ledus aukstā kardiopleģiskā šķīdumā, līdz tās tika transportētas uz laboratoriju uz ledus, kas parasti ir <10 minūtes. sirdis tika uzglabātas ledus aukstā kardiopleģiskā šķīdumā, līdz tās tika transportētas uz laboratoriju uz ledus, kas parasti ir <10 minūtes. сердца хранили в ледяном кардиоплегическом растворе до транспортировки в лабораторию на льду, что обынично в лабораторию на льду. sirdis tika uzglabātas ledus aukstā kardiopleģiskā šķīdumā līdz transportēšanai uz laboratoriju uz ledus, kas parasti ilgst <10 minūtes.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钰将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钰 Держите сердца в ледяной кардиоплегии до транспортировки в лабораторию на льду, обычно <10 мин. Saglabājiet sirdis uz ledus kardiopleģiju līdz transportēšanai uz laboratoriju uz ledus, parasti <10 min.
CTCM ierīce tika izstrādāta SolidWorks datorizētās projektēšanas (CAD) programmatūrā.Kultūras kameras, sadalītāji un gaisa kameras ir izgatavotas no CNC caurspīdīgas akrila plastmasas.7 mm diametra atbalsta gredzens ir izgatavots no augsta blīvuma polietilēna (HDPE) centrā, un tam ir o-gredzena rieva, lai ievietotu silikona blīvgredzenu, ko izmanto materiāla blīvēšanai zem tā.Plāna silīcija dioksīda membrāna atdala kultivēšanas kameru no atdalīšanas plāksnes.Silikona membrāna ir ar lāzeru izgriezta no 0,02 collu biezas silikona loksnes, un tās cietība ir 35 A.Apakšējās un augšējās silikona blīves ir ar lāzeru izgrieztas no 1/16 collu biezas silikona loksnes, un to cietība ir 50 A.Bloka nostiprināšanai un hermētiska blīvējuma izveidošanai tiek izmantotas 316L nerūsējošā tērauda skrūves un spārnu uzgriežņi.
Īpaša iespiedshēmas plate (PCB) ir paredzēta integrēšanai ar C-PACE-EM sistēmu.Šveices mašīnas savienotāju ligzdas uz PCB ir savienotas ar grafīta elektrodiem ar sudrabotiem vara vadiem un bronzas 0-60 skrūvēm, kas ieskrūvētas elektrodos.Iespiedshēmas plate ir ievietota 3D printera vāciņā.
CTCM ierīci kontrolē programmējams pneimatiskais izpildmehānisms (PPD), kas rada kontrolētu asinsrites spiedienu, kas ir līdzīgs sirds ciklam.Palielinoties spiedienam gaisa kamerā, elastīgā silikona membrāna izplešas uz augšu, nospiežot vidi zem audu vietas.Pēc tam audu laukums tiks izstiepts ar šķidruma izvadīšanu, atdarinot sirds fizioloģisko izplešanos diastoles laikā.Relaksācijas pīķa brīdī caur grafīta elektrodiem tika pielietota elektriskā stimulācija, kas samazināja spiedienu gaisa kamerā un izraisīja audu sekciju kontrakciju.Caurules iekšpusē ir hemostatiskais vārsts ar spiediena sensoru, lai noteiktu spiedienu gaisa sistēmā.Spiediena sensora uztvertais spiediens tiek piemērots datu savācējam, kas savienots ar klēpjdatoru.Tas ļauj nepārtraukti kontrolēt spiedienu gāzes kamerā.Kad tika sasniegts maksimālais kameras spiediens (standarta 80 mmHg, 140 mmHg OS), datu ieguves ierīcei tika pavēlēts nosūtīt signālu uz C-PACE-EM sistēmu, lai ģenerētu divfāzu sprieguma signālu 2 ms, kas iestatīts uz 4 V.
Tika iegūtas sirds sekcijas un kultivēšanas apstākļi 6 iedobēs tika veikti šādi: novāktās sirdis pārnes no pārneses trauka uz paplāti, kas satur aukstu (4°C) kardiopleģiju.Kreisais kambaris tika izolēts ar sterilu asmeni un sagriezts 1-2 cm3 lielos gabalos.Šie audu bloki tika piestiprināti pie audu balstiem ar audu līmi un ievietoti vibrējošā mikrotomu audu vannā, kurā bija Tyrode šķīdums, un nepārtraukti piesātināti ar skābekli (3 g/l 2,3-butāndiona monooksīms (BDM), 140 mM NaCl (8,18 g) . ), 6 mM KCl (0,447 m, Glūze (0,447 m, 10 M1M), 2,38 g), 1 mM MgCl2 (1 ml 1 M šķīduma), 1,8 mM CaCl2 (1,8 ml 1 M šķīduma), līdz 1 L ddH2O).Vibrējošais mikrotoms tika iestatīts, lai sagrieztu 300 µm biezas šķēles ar frekvenci 80 Hz, horizontālās vibrācijas amplitūdu 2 mm un progresēšanas ātrumu 0, 03 mm/s.Audu vannu ieskauj ledus, lai šķīdums būtu vēss, un temperatūra tika uzturēta 4 ° C.Pārnes audu sekcijas no mikrotoma vannas uz inkubācijas vannu, kas satur nepārtraukti skābekli saturošu Tyrode šķīdumu uz ledus, līdz tiek iegūts pietiekami daudz sekcijas vienai kultivēšanas platei.Transwell kultūrām audu sekcijas tika piestiprinātas steriliem 6 mm platiem poliuretāna balstiem un ievietotas 6 ml optimizētā barotnē (199 barotne, 1x ITS papildinājums, 10% FBS, 5 ng/ml VEGF, 10 ng/ml FGF-sārma un 2x antibiotikas-pretsēnīšu).Caur C-Pace audu sekcijām tika piemērota elektriskā stimulācija (10 V, frekvence 1, 2 Hz).TD apstākļiem svaigs T3 un Dex tika pievienots pie 100 nM un 1 μM katrā barotnes maiņā.Pirms nomaiņas 3 reizes dienā barotne ir piesātināta ar skābekli.Audu sekcijas tika kultivētas inkubatorā 37 ° C temperatūrā un 5% CO2.
CTCM kultūrām audu sekcijas tika novietotas uz pēc pasūtījuma izgatavota 3D printera Petri trauciņā, kas satur modificētu Tyrode šķīdumu.Ierīce ir paredzēta, lai palielinātu sirds šķēles izmēru par 25% no atbalsta gredzena laukuma.Tas tiek darīts, lai sirds daļas neizstieptos pēc pārnešanas no Tyrode šķīduma uz barotni un diastoles laikā.Izmantojot histoakrila līmi, 300 µm biezas sekcijas tika fiksētas uz atbalsta gredzena 7 mm diametrā.Pēc audu sekcijas pievienošanas atbalsta gredzenam nogrieziet liekās audu sekcijas un ievietojiet pievienotās audu daļas atpakaļ Tyrode šķīduma vannā uz ledus (4°C), līdz ir sagatavots pietiekami daudz sekciju vienai ierīcei.Kopējais visu ierīču apstrādes laiks nedrīkst pārsniegt 2 stundas.Pēc tam, kad to atbalsta gredzeniem tika piestiprinātas 6 audu sekcijas, CTCM ierīce tika samontēta.CTCM kultivēšanas kamera ir iepriekš piepildīta ar 21 ml iepriekš skābekļa barotnes.Pārnesiet audu sekcijas uz kultivēšanas kameru un uzmanīgi noņemiet visus gaisa burbuļus ar pipeti.Pēc tam audu daļu ievada caurumā un viegli nospiež vietā.Visbeidzot uzlieciet elektroda vāciņu uz ierīces un pārnesiet ierīci uz inkubatoru.Pēc tam pievienojiet CTCM gaisa caurulei un C-PACE-EM sistēmai.Pneimatiskais izpildmehānisms atveras un gaisa vārsts atver CTCM.Sistēma C-PACE-EM tika konfigurēta tā, lai divfāzu stimulēšanas laikā 2 ms nodrošinātu 4 V spriegumu ar 1,2 Hz.Barotne tika mainīta divas reizes dienā, un elektrodi tika mainīti vienu reizi dienā, lai izvairītos no grafīta uzkrāšanās uz elektrodiem.Ja nepieciešams, audu sekcijas var izņemt no kultivēšanas iedobēm, lai izvadītu visus gaisa burbuļus, kas varētu būt nokrituši zem tām.MT apstrādes apstākļos T3 / Dex tika pievienots svaigs ar katru barotnes maiņu ar 100 nM T3 un 1 μM Dex.CTCM ierīces tika kultivētas inkubatorā 37 ° C temperatūrā un 5% CO2.
Sirds šķēlumu izstieptu trajektoriju iegūšanai tika izstrādāta īpaša kameru sistēma.SLR kamera (Canon Rebel T7i, Canon, Tokija, Japāna) tika izmantota ar Navitar Zoom 7000 18–108 mm makro objektīvu (Navitar, Sanfrancisko, CA).Vizualizācija tika veikta istabas temperatūrā pēc barotnes aizstāšanas ar svaigu barotni.Kamera ir novietota 51° leņķī, un video tiek ierakstīts ar ātrumu 30 kadri sekundē.Pirmkārt, kopā ar Image-J tika izmantota atvērtā koda programmatūra (MUSCLEMOTION43), lai kvantitatīvi noteiktu sirds šķēlumu kustību.Maska tika izveidota, izmantojot MATLAB (MathWorks, Natick, MA, ASV), lai noteiktu interesējošos reģionus pukstošām sirds šķēlītēm, lai izvairītos no trokšņa.Manuāli segmentētas maskas tiek lietotas visiem attēliem kadru secībā un pēc tam tiek nodotas spraudnim MUSCLEMOTION.Muscle Motion izmanto pikseļu vidējo intensitāti katrā kadrā, lai noteiktu tās kustību attiecībā pret atsauces kadru.Dati tika reģistrēti, filtrēti un izmantoti, lai kvantitatīvi noteiktu cikla laiku un novērtētu audu stiepšanos sirds cikla laikā.Ierakstītais video tika pēcapstrāde, izmantojot pirmās kārtas nulles fāzes digitālo filtru.Lai kvantitatīvi noteiktu audu stiepšanos (no maksimuma līdz maksimumam), tika veikta no maksimuma līdz maksimumam analīze, lai atšķirtu pīķus un zemākās vietas ierakstītajā signālā.Turklāt detrendēšana tiek veikta, izmantojot 6. kārtas polinomu, lai novērstu signāla novirzi.Programmas kods tika izstrādāts MATLAB, lai noteiktu globālo audu kustību, cikla laiku, relaksācijas laiku un kontrakcijas laiku (papildu programmas kods 44).
Sprieguma analīzei, izmantojot tos pašus videoklipus, kas izveidoti mehāniskai stiepes novērtēšanai, mēs vispirms izsekojām diviem attēliem, kas attēlo kustības maksimumus (augstāko (augšējo) un zemāko (apakšējo) kustības punktu) saskaņā ar MUSCLEMOTION programmatūru.Pēc tam mēs segmentējām audu reģionus un segmentētajiem audiem izmantojām ēnojuma algoritmu (papildu 2.a attēls).Pēc tam segmentētie audi tika sadalīti desmit apakšvirsmās, un katras virsmas spriegums tika aprēķināts, izmantojot šādu vienādojumu: deformācija = (Sup-Sdown)/Sdown, kur Sup un Sdown ir attiecīgi formas attālumi no auduma augšējās un apakšējās ēnas (papildu 2.b attēls).
Sirds sekcijas tika fiksētas 4% paraformaldehīdā 48 stundas.Fiksētie audi tika dehidrēti 10% un 20% saharozē 1 stundu, pēc tam 30% saharozē nakti.Pēc tam sekcijas tika iestrādātas optimālās griešanas temperatūras maisījumā (OCT savienojums) un pakāpeniski sasaldētas izopentāna / sausā ledus vannā.Uzglabājiet OCT iegulšanas blokus -80 °C līdz atdalīšanai.Priekšmetstikliņi tika sagatavoti kā sekcijas ar biezumu 8 μm.
Lai noņemtu OCT no sirds sekcijām, karsējiet priekšmetstikliņus uz sildīšanas bloka 95 °C 5 minūtes.Pievienojiet 1 ml PBS katram priekšmetstikliņam un inkubējiet 30 minūtes istabas temperatūrā, pēc tam caurlaidiet sekcijas, iestatot 0,1% Triton-X PBS 15 minūtes istabas temperatūrā.Lai novērstu nespecifisku antivielu saistīšanos ar paraugu, priekšmetstikliņiem pievieno 1 ml 3% BSA šķīduma un inkubē 1 stundu istabas temperatūrā.Pēc tam BSA tika noņemts un priekšmetstikliņi tika mazgāti ar PBS.Atzīmējiet katru paraugu ar zīmuli.Primārās antivielas (atšķaidītas attiecībā 1:200 ar 1% BSA) (konneksīns 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) un troponīns-T (Thermo Scientific; #MA5-12960) tika pievienotas 90 minūšu laikā, pēc tam sekundāri atšķaidīts 1:2% BSA. a Fluor 488 (Thermo Scientific; #A16079), pret trušu Alexa Fluor 594 (Thermo Scientific; #T6391) vēl 90 minūtes. Mazgāts 3 reizes ar PBS Lai atšķirtu mērķa krāsošanos no fona, mēs izmantojām tikai sekundāro antivielu kā kontroli. Visbeidzot tika pievienots DAPI un kodola slaidi (vektoru slaidi) ed ar nagu laku. -x palielinājums) un Keyence mikroskops ar 40x palielinājumu.
WGA krāsošanai tika izmantots WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) 5 μg/ml PBS un tika uzklāts uz fiksētām sekcijām 30 minūtes istabas temperatūrā.Pēc tam priekšmetstikliņus mazgā ar PBS un katram priekšmetstikliņam pievienoja Sudānas melno un inkubēja 30 minūtes.Pēc tam priekšmetstikliņus mazgā ar PBS un pievienoja vectashield iegulšanas barotni.Priekšmetstikliņi tika vizualizēti Keyence mikroskopā ar 40x palielinājumu.
AZT tika izņemta no paraugiem, kā aprakstīts iepriekš.Pēc OCT noņemšanas iegremdējiet priekšmetstikliņus Bouin šķīdumā uz nakti.Pēc tam priekšmetstikliņus 1 stundu skaloja ar destilētu ūdeni un pēc tam 10 minūtes ievietoja Bibrich alvejas skābes fuksīna šķīdumā.Pēc tam priekšmetstikliņus mazgā ar destilētu ūdeni un 10 minūtes ievieto 5% fosfomolibdēna/5% fosfovolframskābes šķīdumā.Bez skalošanas 15 minūtes pārnesiet priekšmetstikliņus tieši anilīna zilajā šķīdumā.Pēc tam priekšmetstikliņus mazgā ar destilētu ūdeni un ievietoja 1% etiķskābes šķīdumā uz 2 minūtēm.Priekšmetstikliņus žāvēja 200 N etanolā un pārnesa uz ksilolu.Krāsotie priekšmetstikliņi tika vizualizēti, izmantojot Keyence mikroskopu ar 10x objektīvu.Fibrozes laukuma procentuālais daudzums tika noteikts, izmantojot Keyence Analyzer programmatūru.
CyQUANT™ MTT šūnu dzīvotspējas tests (Invitrogen, Carlsbad, CA), kataloga numurs V13154, saskaņā ar ražotāja protokolu ar dažām modifikācijām.Jo īpaši tika izmantots ķirurģiskais perforators ar diametru 6 mm, lai MTT analīzes laikā nodrošinātu vienmērīgu audu izmēru.Audi tika atsevišķi izklāti 12 bedrīšu plāksnes iedobēs, kas satur MTT substrātu saskaņā ar ražotāja protokolu.Sekcijas inkubē 37°C temperatūrā 3 stundas, un dzīvie audi metabolizē MTT substrātu, veidojot purpursarkanu formazāna savienojumu.Nomainiet MTT šķīdumu ar 1 ml DMSO un inkubējiet 37 °C temperatūrā 15 minūtes, lai no sirds sekcijām ekstrahētu purpursarkano formazānu.Paraugi tika atšķaidīti 1:10 ar DMSO 96 bedrīšu caurspīdīgās dibena plāksnēs, un purpursarkanās krāsas intensitāte tika mērīta pie 570 nm, izmantojot Cytation plates lasītāju (BioTek).Rādījumi tika normalizēti atbilstoši katras sirds šķēles svaram.
Sirds šķēles barotne tika aizstāta ar barotni, kas satur 1 μCi/ml [5-3H]-glikozi (Moravek Biochemicals, Brea, CA, ASV), lai veiktu glikozes izmantošanas testu, kā aprakstīts iepriekš.Pēc 4 stundu ilgas inkubācijas pievienojiet 100 µl barotnes atvērtā mikrocentrifūgas mēģenē, kas satur 100 µl 0,2 N HCl.Pēc tam mēģeni ievietoja scintilācijas mēģenē, kas satur 500 μl dH2O, lai iztvaicētu [3H]2O 72 stundas 37 °C temperatūrā.Pēc tam izņemiet mikrocentrifūgas mēģeni no scintilācijas mēģenes un pievienojiet 10 ml scintilācijas šķidruma.Scintilācijas skaitīšana tika veikta, izmantojot Tri-Carb 2900TR šķidruma scintilācijas analizatoru (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, ASV).Pēc tam glikozes izmantošana tika aprēķināta, ņemot vērā [5-3H]-glikozes specifisko aktivitāti, nepilnīgu līdzsvaru un fonu, [5-3H] atšķaidīšanu ar nemarķētu glikozi un scintilācijas skaitītāja efektivitāti.Dati tiek normalizēti atbilstoši sirds sekciju masai.
Pēc audu homogenizācijas Trizolā RNS tika izolēta no sirds sekcijām, izmantojot Qiagen miRNeasy Micro Kit #210874 saskaņā ar ražotāja protokolu.RNAsec bibliotēkas sagatavošana, sekvencēšana un datu analīze tika veikta šādi:
1 μg RNS vienā paraugā tika izmantots kā izejmateriāls RNS bibliotēkas sagatavošanai.Sekvences bibliotēkas tika ģenerētas, izmantojot NEBNext UltraTM RNS bibliotēku sagatavošanas komplektu Illumina (NEB, ASV), ievērojot ražotāja ieteikumus, un katra parauga atribūtu sekvencēm tika pievienoti indeksu kodi.Īsumā, mRNS tika attīrīta no kopējās RNS, izmantojot magnētiskās lodītes, kas piestiprinātas ar poli-T oligonukleotīdiem.Fragmentēšana tiek veikta, izmantojot divvērtīgus katjonus augstā temperatūrā NEBNext pirmās virknes sintēzes reakcijas buferšķīdumā (5X).Pirmā cDNS virkne tika sintezēta, izmantojot nejaušus heksamēra praimerus un M-MuLV reverso transkriptāzi (RNase H-).Pēc tam otro virkni cDNS sintezē, izmantojot DNS polimerāzi I un RNāzi H. Atlikušās pārkares ar eksonukleāzes/polimerāzes aktivitāti pārvērš par neasiem galiem.Pēc DNS fragmenta 3′ gala adenilēšanas tam tiek pievienots NEBNext adapteris ar matadata cilpas struktūru, lai sagatavotu to hibridizācijai.Vēlamā garuma 150-200 bp cDNS fragmentu atlasei.bibliotēkas fragmenti tika attīrīti, izmantojot AMPure XP sistēmu (Beckman Coulter, Beverly, ASV).Pēc tam 3 μl USER Enzyme (NEB, ASV) ar pēc izmēra atlasītu cDNS, kas ligēts ar adapteri, tika izmantots 15 minūtes 37 ° C temperatūrā un pēc tam 5 minūtes 95 ° C temperatūrā pirms PCR.Pēc tam tika veikta PCR, izmantojot Phusion High-Fidelity DNS polimerāzi, universālos PCR primerus un indeksa (X) praimerus.Visbeidzot, PCR produkti tika attīrīti (AMPure XP sistēma) un bibliotēkas kvalitāte tika novērtēta ar Agilent Bioanalyzer 2100 sistēmu.Pēc tam cDNS bibliotēka tika sekvencēta, izmantojot Novaseq sekvencētāju.Neapstrādātu attēlu faili no Illumina tika pārveidoti par neapstrādātiem nolasījumiem, izmantojot CASAVA Base Calling.Neapstrādāti dati tiek glabāti FASTQ(fq) formāta failos, kas satur lasīšanas secības un atbilstošās bāzes kvalitātes.Atlasiet HISAT2, lai filtrētos sekvences nolasījumus saskaņotu ar Sscrofa11.1 atsauces genomu.Kopumā HISAT2 atbalsta jebkura izmēra genomus, tostarp genomus, kas lielāki par 4 miljardiem bāzu, un lielākajai daļai parametru ir iestatītas noklusējuma vērtības.Savienojuma nolasījumus no RNA Seq datiem var efektīvi izlīdzināt, izmantojot HISAT2, ātrāko pašlaik pieejamo sistēmu, ar tādu pašu vai labāku precizitāti nekā jebkura cita metode.
Transkriptu pārpilnība tieši atspoguļo gēnu ekspresijas līmeni.Gēnu ekspresijas līmeņi tiek novērtēti pēc transkriptu daudzuma (sekvences skaita), kas saistīti ar genomu vai eksoniem.Lasījumu skaits ir proporcionāls gēnu ekspresijas līmeņiem, gēnu garumam un secības dziļumam.Tika aprēķināts FPKM (fragmenti uz tūkstoš bāzes pāru transkripta sekvencētiem uz miljonu bāzes pāru) un, izmantojot DESeq2 paketi, tika noteiktas diferenciālās izteiksmes P vērtības.Pēc tam mēs aprēķinājām viltus atklāšanas ātrumu (FDR) katrai P vērtībai, izmantojot Benjamini-Hochberg metodi9, pamatojoties uz iebūvēto R-funkciju “p.adjust”.
RNS, kas izolēta no sirds sekcijām, tika pārveidota par cDNS koncentrācijā 200 ng/μl, izmantojot SuperScript IV Vilo Master maisījumu no Thermo (Thermo, kat. Nr. 11756050).Kvantitatīvā RT-PCR tika veikta, izmantojot Applied Biosystems Endura Plate Microamp 384 bedrīšu caurspīdīgu reakcijas plāksni (Thermo, kat. nr. 4483319) un mikroampēru optisko līmi (Thermo, kat. nr. 4311971).Reakcijas maisījums sastāvēja no 5 µl Taqman Fast Advanced Master maisījuma (Thermo, kat. Nr. 4444557), 0,5 µl Taqman Primer un 3,5 µl H2O, kas sajaukti katrā iedobē.Tika veikti standarta qPCR cikli un CT vērtības tika mērītas, izmantojot Applied Biosystems Quantstudio 5 reāllaika PCR instrumentu (384 iedobju modulis; produkts Nr. A28135).Taqman grunti tika iegādāti no Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06061) (Ss06061) mH), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss0424115588_m) visu paraugu saglabāšanas PDH vērtības tika normalizētas līdz PDH.
NT-ProBNP izdalīšanās vidē tika novērtēta, izmantojot NT-ProBNP komplektu (cūka) (kat. Nr. MBS2086979, MyBioSource) saskaņā ar ražotāja protokolu.Īsumā, katrai iedobei divos eksemplāros pievienoja 250 µl katra parauga un standarta.Tūlīt pēc parauga pievienošanas katrā iedobē pievienojiet 50 µl testa reaģenta A.Viegli sakratiet plāksni un noslēdziet ar hermētiķi.Pēc tam tabletes inkubēja 37 ° C temperatūrā 1 stundu.Pēc tam aspirējiet šķīdumu un 4 reizes mazgājiet iedobes ar 350 µl 1X mazgāšanas šķīduma, katru reizi inkubējot mazgāšanas šķīdumu 1-2 minūtes.Pēc tam katrai iedobei pievieno 100 µl testa reaģenta B un noslēdz ar plāksnes hermētiķi.Tableti viegli sakrata un inkubēja 37 °C temperatūrā 30 minūtes.Aspirējiet šķīdumu un mazgājiet iedobes 5 reizes ar 350 µl 1X mazgāšanas šķīduma.Katrai iedobei pievieno 90 µl substrāta šķīduma un noslēdz plāksni.Inkubējiet plāksni 37°C 10-20 minūtes.Katrai iedobei pievienojiet 50 µl apturēšanas šķīduma.Plāksne tika nekavējoties izmērīta, izmantojot Cytation (BioTek) plākšņu lasītāju, kas iestatīts uz 450 nm.
Tika veiktas jaudas analīzes, lai izvēlētos grupas lielumus, kas nodrošinās> 80% jaudu, lai noteiktu 10% absolūtās izmaiņas parametrā ar 5% I tipa kļūdu līmeni. Tika veiktas jaudas analīzes, lai izvēlētos grupas lielumus, kas nodrošinās> 80% jaudu, lai noteiktu 10% absolūtās izmaiņas parametrā ar 5% I tipa kļūdu līmeni. Анализ мощности был выполнен для выбора размеров групп, которые обеспечат >80% мощности для обнарусонялнен для обнарусожела параметра с 5% частотой ошибок типа I. Tika veikta jaudas analīze, lai atlasītu grupas lielumus, kas nodrošinātu> 80% jaudu, lai noteiktu 10% absolūto parametru izmaiņas ar 5% I tipa kļūdu līmeni.进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对瀍变化和5４诤 型进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对瀍变化和5４诤 型 Был проведен анализ мощности для выбора размера группы, который обеспечил бы > 80% мощности для обеспечелоѶне% ния параметров и 5% частоты ошибок типа I. Tika veikta jaudas analīze, lai izvēlētos grupas lielumu, kas nodrošinātu> 80% jaudu, lai noteiktu 10% absolūto parametru izmaiņas un 5% I tipa kļūdu līmeni.Audu sekcijas tika nejauši atlasītas pirms eksperimenta.Visas analīzes bija aklas, un paraugi tika atšifrēti tikai pēc visu datu analīzes.Visu statistisko analīžu veikšanai tika izmantota programmatūra GraphPad Prism (Sandjego, CA). Visai statistikai p-vērtības tika uzskatītas par nozīmīgām vērtībām <0,05. Visai statistikai p-vērtības tika uzskatītas par nozīmīgām vērtībām <0,05. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Visai statistikai p-vērtības tika uzskatītas par nozīmīgām vērtībām <0,05.对于所有统计数据，p 值在值<0,05 时被认为是显着的.对于所有统计数据，p 值在值<0,05 时被认为是显着的. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Visai statistikai p-vērtības tika uzskatītas par nozīmīgām vērtībām <0,05.Divpusējs Stjudenta t tests tika veikts datiem, izmantojot tikai 2 salīdzinājumus.Lai noteiktu nozīmīgumu starp vairākām grupām, tika izmantota vienvirziena vai divvirzienu ANOVA.Veicot post hoc testus, tika piemērota Tukey korekcija, lai ņemtu vērā vairākus salīdzinājumus.RNAsec datiem ir īpaši statistikas apsvērumi, aprēķinot FDR un p.adjust, kā aprakstīts sadaļā Metodes.
Lai iegūtu papildinformāciju par studiju plānošanu, skatiet dabas pētījumu ziņojuma kopsavilkumu, kas ir saistīts ar šo rakstu.