Paldies, ka apmeklējāt vietni Nature.com. Jūsu izmantotajai pārlūkprogrammas versijai ir ierobežots CSS atbalsts. Lai nodrošinātu vislabāko pieredzi, iesakām izmantot atjauninātu pārlūkprogrammu (vai atspējot saderības režīmu pārlūkprogrammā Internet Explorer). Tikmēr, lai nodrošinātu nepārtrauktu atbalstu, mēs atveidosim vietni bez stiliem un JavaScript.
Jaunas imunoloģiskās un masas spektrometriskās metodes noturīgu oligosaharīdu kompleksai analīzei kukurūzas graudos, kas iepriekš apstrādāti ar AFEX. Lignocelulozes biomasa ir ilgtspējīga alternatīva fosilajam kurināmajam un tiek plaši izmantota biotehnoloģiju izstrādei tādu produktu kā pārtika, barība, degviela un ķīmiskās vielas ražošanai. Šo tehnoloģiju atslēga ir izmaksu ziņā konkurētspējīgu procesu izstrāde augu šūnu sieniņās esošo komplekso ogļhidrātu pārveidošanai par vienkāršiem cukuriem, piemēram, glikozi, ksilozi un arabinozi. Tā kā lignocelulozes biomasa ir ļoti izturīga, tā ir jāpakļauj termoķīmiskai apstrādei (piemēram, amonjaka šķiedru atdalīšanai (AFEX), atšķaidītām skābēm (DA), jonu šķidrumiem (IL)) un bioloģiskai apstrādei (piemēram, fermentatīvai hidrolīzei un mikrobiālai fermentācijai) kombinācijā, lai iegūtu vēlamo produktu. Tomēr, ja hidrolīzes procesā tiek izmantoti komerciāli sēnīšu fermenti, tikai 75–85% no veidotajiem šķīstošajiem cukuriem ir monosaharīdi, bet atlikušie 15–25% ir šķīstoši, grūti apstrādājami oligosaharīdi, kas ne vienmēr ir pieejami mikroorganismiem. Iepriekš mēs veiksmīgi izolējām un attīrījām šķīstošos spītīgos oligosaharīdus, izmantojot oglekļa un diatomīta zemes atdalīšanas un izmēru izslēgšanas hromatogrāfijas kombināciju, kā arī pētījām to enzīmu inhibējošās īpašības. Esam atklājuši, ka oligosaharīdus, kas satur augstākas polimerizācijas pakāpes (DP) metilētas uronskābes aizvietošanas, ir grūtāk apstrādāt ar komerciāliem enzīmu maisījumiem nekā zemas DP un neitrālus oligosaharīdus. Šeit mēs ziņojam par vairāku papildu metožu izmantošanu, tostarp glikāna profilēšanu, izmantojot monoklonālās antivielas (mAb), kas specifiskas augu biomasas glikāniem, lai raksturotu glikāna saites augu šūnu sieniņās un fermentatīvajos hidrolizātos, matricas asistētu lāzerdesorbcijas jonizāciju, lidojuma laika masas spektrometriju. MALDI-TOF-MS) izmanto struktūru informatīvus diagnostikas maksimumus, kas iegūti ar spektroskopiju pēc negatīvo jonu sekundāras sabrukšanas, gāzu hromatogrāfiju un masas spektrometriju (GC-MS), lai raksturotu oligosaharīdu saites ar un bez derivatizācijas. Oligosaharīdu mazā izmēra (DP 4–20) dēļ šīs molekulas ir grūti izmantot mAb saistīšanai un raksturošanai. Lai pārvarētu šo problēmu, mēs izmantojām jaunu biotīna konjugācijas oligosaharīdu imobilizācijas metodi, kas veiksmīgi iezīmēja lielāko daļu zema DP šķīstošo oligosaharīdu uz mikroplašu virsmas, un pēc tam to izmantoja augstas caurlaidības monoklonālo antivielu sistēmā specifiskai ligācijas analīzei. Šī jaunā metode nākotnē atvieglos modernāku augstas caurlaidības glikozes testu izstrādi, ko varēs izmantot, lai diagnostikas nolūkos izolētu un raksturotu biomarķieros esošos oligosaharīdus.
Lignocelulozes biomasa, kas sastāv no lauksaimniecības, mežsaimniecības, zāles un koksnes materiāliem, ir potenciāla izejviela bioloģiskas izcelsmes produktu, tostarp pārtikas, lopbarības, degvielas un ķīmisko prekursoru, ražošanai, lai iegūtu augstākas vērtības produktus1. Ogļhidrāti (piemēram, celuloze un hemiceluloze), kas atrodas augu šūnu sieniņās, tiek depolimerizēti monosaharīdos, izmantojot ķīmisko apstrādi un biotransformāciju (piemēram, fermentatīvu hidrolīzi un mikrobu fermentāciju). Izplatītākās pirmapstrādes metodes ietver amonjaka šķiedru izplešanos (AFEX), atšķaidītu skābi (DA), jonu šķidrumu (IL) un tvaika sprādzienu (SE), kurās izmanto ķīmisku vielu un siltuma kombināciju, lai samazinātu lignocelulozes ražošanu, atverot augu šūnu sieniņas3,4. vielas spītību, 5. Enzimātiskā hidrolīze tiek veikta ar lielu cietvielu daudzumu, izmantojot komerciālus aktīvos ogļhidrātus saturošus enzīmus (CAZīmus), un mikrobu fermentāciju, izmantojot transgēnus raugus vai baktērijas, lai ražotu bioloģiskas izcelsmes degvielu un ķīmiskas vielas6.
Komerciālos enzīmos esošie CAZīmi sastāv no sarežģīta enzīmu maisījuma, kas sinerģiski šķeļ kompleksās ogļhidrātu-cukuru saites, veidojot monosaharīdus2,7. Kā jau iepriekš ziņojām, sarežģītais lignīna aromātisko polimēru tīkls ar ogļhidrātiem padara tos ļoti grūti apstrādājamus, kas noved pie nepilnīgas cukura konversijas, uzkrājot 15–25 % dzimumligosaharīdu, kas netiek ražoti iepriekš apstrādātās biomasas fermentatīvās hidrolīzes laikā. Tā ir izplatīta problēma, izmantojot dažādas biomasas pirmapstrādes metodes. Daži no šīs sašaurinājuma iemesliem ir enzīmu inhibīcija hidrolīzes laikā vai būtisku būtisku enzīmu trūkums vai zems līmenis, kas nepieciešami, lai pārrautu cukura saites augu biomasā. Izpratne par cukuru sastāvu un strukturālajām īpašībām, piemēram, cukura saitēm oligosaharīdos, palīdzēs mums uzlabot cukura konversiju hidrolīzes laikā, padarot biotehnoloģiskos procesus izmaksu ziņā konkurētspējīgus ar no naftas iegūtiem produktiem.
Ogļhidrātu struktūras noteikšana ir sarežģīta un prasa tādu metožu kombināciju kā šķidruma hromatogrāfija (LC)11,12, kodolmagnētiskās rezonanses spektroskopija (NMR)13, kapilārā elektroforēze (CE)14,15,16 un masas spektrometrija (MS)17. ,18. MS metodes, piemēram, lidojuma laika masas spektrometrija ar lāzera desorbciju un jonizāciju, izmantojot matricu (MALDI-TOF-MS), ir daudzpusīga metode ogļhidrātu struktūru identificēšanai. Nesen nātrija jonu aduktu sadursmes izraisītas disociācijas (CID) tandēma MS ir visplašāk izmantota, lai identificētu pirkstu nospiedumus, kas atbilst oligosaharīdu piesaistes pozīcijām, anomēru konfigurācijām, sekvencēm un sazarojuma pozīcijām 20, 21.
Glikānu analīze ir lielisks instruments ogļhidrātu saišu padziļinātai identificēšanai22. Šī metode izmanto monoklonālās antivielas (mAb), kas vērstas pret augu šūnu sieniņas glikānu kā zondes, lai izprastu sarežģītās ogļhidrātu saites. Visā pasaulē ir pieejami vairāk nekā 250 mAb, kas izstrādāti pret dažādiem lineāriem un sazarotiem oligosaharīdiem, izmantojot dažādus saharīdus24. Vairāki mAb ir plaši izmantoti, lai raksturotu augu šūnu sieniņas struktūru, sastāvu un modifikācijas, jo pastāv būtiskas atšķirības atkarībā no augu šūnu veida, orgāna, vecuma, attīstības stadijas un augšanas vides25,26. Pavisam nesen šī metode ir izmantota, lai izprastu pūslīšu populācijas augu un dzīvnieku sistēmās un to attiecīgās lomas glikāna transportā, ko nosaka subcelulārie marķieri, attīstības stadijas vai vides stimuli, un lai noteiktu fermentatīvo aktivitāti. Dažas no identificētajām dažādajām glikānu un ksilānu struktūrām ir pektīns (P), ksilāns (X), mannāns (M), ksiloglikāni (XylG), jaukto saišu glikāni (MLG), arabinoksilāns (ArbX), galaktomanāns (GalG), glikuronskābes-arabinoksilāns (GArbX) un arabinogalaktāns (ArbG)29.
Tomēr, neskatoties uz visiem šiem pētniecības centieniem, tikai daži pētījumi ir pievērsušies oligosaharīdu uzkrāšanās raksturam augstas cietvielu slodzes (HSL) hidrolīzes laikā, tostarp oligosaharīdu atbrīvošanai, oligomēru ķēdes garuma izmaiņām hidrolīzes laikā, dažādiem zema DP polimēriem un to līknēm. sadalījumiem 30,31,32. Tikmēr, lai gan glikāna analīze ir izrādījusies noderīgs instruments visaptverošai glikāna struktūras analīzei, ir grūti novērtēt ūdenī šķīstošos zema DP oligosaharīdus, izmantojot antivielu metodes. Mazāki DP oligosaharīdi ar molekulmasu, kas mazāka par 5–10 kDa, nesaistās ar ELISA plāksnēm 33, 34 un tiek noskaloti pirms antivielu pievienošanas.
Šeit mēs pirmo reizi demonstrējam ELISA testu uz avidīna pārklātām plāksnēm, izmantojot monoklonālās antivielas, apvienojot vienas pakāpes biotinilēšanas procedūru šķīstošiem refraktāriem oligosaharīdiem ar glikozes analīzi. Mūsu glikozes analīzes pieeja tika apstiprināta ar MALDI-TOF-MS un GC-MS balstītu komplementāro oligosaharīdu saišu analīzi, izmantojot hidrolizētu cukura sastāvu trimetilsilil (TMS) derivatizāciju. Šo inovatīvo pieeju nākotnē var attīstīt kā augstas caurlaidības metodi un rast plašāku pielietojumu biomedicīniskajos pētījumos35.
Enzīmu un antivielu pēctranslācijas modifikācijas, piemēram, glikozilēšana,36 ietekmē to bioloģisko aktivitāti. Piemēram, seruma olbaltumvielu glikozilēšanas izmaiņām ir svarīga loma iekaisuma artrīta gadījumā, un glikozilēšanas izmaiņas tiek izmantotas kā diagnostikas marķieri37. Literatūrā ir ziņots, ka dažādi glikāni viegli parādās dažādās slimībās, tostarp hroniskās kuņģa-zarnu trakta un aknu iekaisuma slimībās, vīrusu infekcijās, olnīcu, krūts un prostatas vēža gadījumos38,39,40. Glikānu struktūras izpratne, izmantojot uz antivielām balstītas glikānu ELISA metodes, nodrošinās papildu pārliecību par slimību diagnostiku, neizmantojot sarežģītas MS metodes.
Mūsu iepriekšējais pētījums parādīja, ka spītīgi oligosaharīdi pēc pirmapstrādes un fermentatīvas hidrolīzes palika nehidrolizēti (1. attēls). Iepriekš publicētajā darbā mēs izstrādājām aktivētās ogles cietfāzes ekstrakcijas metodi oligosaharīdu izolēšanai no AFEX iepriekš apstrādāta kukurūzas stublāja hidrolizāta (ACSH)8. Pēc sākotnējās ekstrakcijas un atdalīšanas oligosaharīdi tika tālāk frakcionēti, izmantojot izmēru izslēgšanas hromatogrāfiju (SEC), un savākti molekulmasas secībā. Cukura monomēri un oligomēri, kas atbrīvoti no dažādām pirmapstrādes metodēm, tika analizēti, izmantojot cukura sastāva analīzi. Salīdzinot ar dažādām pirmapstrādes metodēm iegūto cukura oligomēru saturu, spītīgu oligosaharīdu klātbūtne ir izplatīta problēma biomasas pārvēršanā monosaharīdos un var izraisīt cukura ražas samazināšanos vismaz par 10–15% un pat līdz 18%. ASV. Šī metode tiek izmantota turpmākai oligosaharīdu frakciju ražošanai lielos apjomos. Iegūtais ACH un tā turpmākās frakcijas ar atšķirīgu molekulmasu tika izmantotas kā eksperimentāls materiāls oligosaharīdu raksturošanai šajā darbā.
Pēc pirmapstrādes un fermentatīvas hidrolīzes noturīgie oligosaharīdi palika nehidrolizēti. Šeit (A) ir oligosaharīdu atdalīšanas metode, kurā oligosaharīdi tiek izolēti no AFEX iepriekš apstrādāta kukurūzas stovera hidrolizāta (ACSH), izmantojot aktivētās ogles un diatomīta zemes pildītu slāni; (B) Oligosaharīdu atdalīšanas metode. Oligosaharīdi tika tālāk atdalīti ar izmēru izslēgšanas hromatogrāfiju (SEC); (C) Saharīdu monomēri un oligomēri, kas atbrīvoti no dažādām pirmapstrādēm (atšķaidīta skābe: DA, jonu šķidrums: IL un AFEX). Fermentatīvās hidrolīzes apstākļi: augsts cietvielu saturs 25% (m/m) (aptuveni 8% glikāna saturs), 96 stundu hidrolīze, 20 mg/g komerciālo enzīmu saturs (Ctec2:Htec2:MP-2:1:1 attiecība) un (D) Cukura monomēri un glikozes, ksilozes un arabinozes oligomēri, kas atbrīvoti no AFEX iepriekš apstrādāta kukurūzas stovera (ACS).
Glikānu analīze ir pierādījusi sevi kā noderīgu instrumentu visaptverošai glikānu strukturālai analīzei ekstraktos, kas izolēti no cietas biomasas atlikumiem. Tomēr ūdenī šķīstošie saharīdi, izmantojot šo tradicionālo metodi, ir nepietiekami pārstāvēti41, jo zemas molekulmasas oligosaharīdus ir grūti imobilizēt ELISA plāksnēs un tie tiek izskaloti pirms antivielu pievienošanas. Tāpēc antivielu saistīšanai un raksturošanai tika izmantota vienas pakāpes biotinilēšanas metode, lai pārklātu šķīstošos, nepakļāvīgos oligosaharīdus uz avidīna pārklātām ELISA plāksnēm. Šī metode tika pārbaudīta, izmantojot mūsu iepriekš ražoto ACSH un frakciju, kas balstīta uz tā molekulmasu (vai polimerizācijas pakāpi, DP). Vienas pakāpes biotinilēšana tika izmantota, lai palielinātu oligosaharīdu saistīšanās afinitāti, pievienojot biotīna-LC-hidrazīdu ogļhidrāta reducējošajam galam (2. att.). Šķīdumā hemiacetāla grupa reducējošajā galā reaģē ar biotīna-LC-hidrazīda hidrazīda grupu, veidojot hidrazona saiti. Reducētāja NaCNBH3 klātbūtnē hidrazona saite tiek reducēta līdz stabilam biotinilētam gala produktam. Modificējot cukura reducējošo galu, kļuva iespējams piesaistīties zema DP oligosaharīdiem pie ELISA plāksnēm, un mūsu pētījumā tas tika darīts uz avidīna pārklātām plāksnēm, izmantojot uz glikānu vērstas monoklonālās antivielas.
Monoklonālo antivielu skrīnings biotinilētu oligosaharīdu noteikšanai, pamatojoties uz ELISA metodi. Šeit (A) ir apvienota oligosaharīdu biotinilēšana un sekojoša ELISA skrīnings ar glikānu mērķētām monoklonālām antivielām uz NeutrAvidin pārklātām plāksnēm, un (B) ir parādīta vienas pakāpes procedūra reakcijas produktu biotinilēšanai.
Pēc tam primārajām un sekundārajām antivielām tika pievienotas ar avidīnu pārklātas plāksnes ar oligosaharīdu konjugētām antivielām un mazgātas gaismas un laika jutīgā vidē. Pēc antivielu saistīšanās pabeigšanas plāksnes inkubēšanai pievieno TMB substrātu. Reakciju beidzot apturēja ar sērskābi. Inkubētās plāksnes analizēja, izmantojot ELISA lasītāju, lai noteiktu katras antivielas saistīšanās stiprumu un atklātu antivielām specifisku šķērssaistīšanu. Sīkāku informāciju un eksperimenta parametrus skatiet atbilstošajā sadaļā “Materiāli un metodes”.
Mēs demonstrējam šīs jaunizstrādātās metodes lietderību specifiskiem pielietojumiem, raksturojot šķīstošos oligosaharīdus, kas atrodas ACSH, kā arī neapstrādātās un attīrītās oligosaharīdu frakcijās, kas izolētas no lignocelulozes hidrolizātiem. Kā parādīts 3. attēlā, visbiežāk epitopu aizvietotie ksilāni, kas identificēti ACSH, izmantojot bioacilētu glikozu noteikšanas metodes, parasti ir uronskābes (U) vai metiluronskābes (MeU) un pektīnskābes arabinogalaktāni. Lielākā daļa no tiem tika atrasti arī mūsu iepriekšējā pētījumā par nehidrolizētu cietvielu (UHS) glikānu analīzi43.
Nepieņemamu oligosaharīdu epitopu noteikšana, izmantojot monoklonālas antivielas, kas vērstas pret šūnas sienas glikānu. “Neitrālā” frakcija ir ACN frakcija, bet “skābā” frakcija ir FA frakcija. Spilgtāki sarkanie toņi siltuma kartē norāda uz augstāku epitopu saturu, bet spilgtāki zilie toņi norāda uz tukšu fonu. Krāsu vērtības skalā ir balstītas uz neapstrādātām OD vērtībām formulām N=2. Galvenās epitopes, ko atpazīst antivielas, ir parādītas labajā pusē.
Šīs necelulozes struktūras nevarēja sašķelt ar visbiežāk sastopamajām celulāzēm un hemicelulāzēm testētajā komerciālajā enzīmu maisījumā, kas ietver visbiežāk izmantotos komerciālos enzīmus. Tāpēc to hidrolīzei ir nepieciešami jauni palīgenzīmi. Bez nepieciešamajiem necelulozes palīgenzīmiem šīs necelulozes saites novērš pilnīgu pārvēršanos monosaharīdos, pat ja to mātes cukura polimēri tiek plaši hidrolizēti īsākos fragmentos un izšķīdināti, izmantojot komerciālos enzīmu maisījumus.
Turpmāki signāla sadalījuma un tā saistīšanās stipruma pētījumi parādīja, ka saistīšanās epitopu bija mazāk cukura frakcijās ar augstu DP (A, B, C, DP līdz 20+) nekā frakcijās ar zemu DP (D, E, F, DP) dimēros) (1. att.). Skābes fragmenti ir biežāk sastopami necelulozes epitopos nekā neitrālos fragmentos. Šīs parādības atbilst mūsu iepriekšējā pētījumā novērotajam modelim, kur augsta DP un skābju fragmenti bija izturīgāki pret fermentatīvu hidrolīzi. Tāpēc necelulozes glikāna epitopu un U un MeU aizvietojumu klātbūtne var ievērojami veicināt oligosaharīdu stabilitāti. Jāatzīmē, ka saistīšanās un noteikšanas efektivitāte var būt problemātiska oligosaharīdiem ar zemu DP, īpaši, ja epitops ir dimērisks vai trimērisks oligosaharīds. To var pārbaudīt, izmantojot dažāda garuma komerciālus oligosaharīdus, katrs no kuriem satur tikai vienu epitopu, kas saistās ar specifisku monoklonālo antivielu.
Tādējādi, izmantojot struktūrai specifiskas antivielas, tika atklāti noteikti nepakļāvīgu saišu veidi. Atkarībā no izmantotās antivielas veida, atbilstošā ligācijas modeļa un tās radītā signāla stipruma (visvairāk un vismazāk) var identificēt jaunus enzīmus un daļēji kvantitatīvi pievienot enzīmu maisījumam, lai panāktu pilnīgāku glikokonversiju. Ņemot par piemēru ACSH oligosaharīdu analīzi, mēs varam izveidot glikāna saišu datubāzi katram biomasas materiālam. Šeit jāatzīmē, ka jāņem vērā antivielu atšķirīgā afinitāte, un, ja to afinitāte nav zināma, tas radīs zināmas grūtības, salīdzinot dažādu antivielu signālus. Turklāt glikāna saišu salīdzināšana var vislabāk darboties starp vienas un tās pašas antivielas paraugiem. Šīs nepakļāvīgās saites pēc tam var saistīt ar CAZyme datubāzi, no kuras mēs varam identificēt enzīmus, atlasīt kandidātu enzīmus un pārbaudīt saites noārdošo enzīmu esamību vai izstrādāt mikrobu sistēmas šo enzīmu ekspresijai izmantošanai biorafinēšanas rūpnīcās44.
Lai novērtētu, kā imunoloģiskās metodes papildina alternatīvas metodes lignocelulozes hidrolizātos esošo zemas molekulmasas oligosaharīdu raksturošanai, mēs veicām MALDI (4. att., S1.–S8. lpp.) un TMS atvasinātu saharīdu analīzi, pamatojoties uz GC-MS, tajā pašā panelī (5. att.) oligosaharīdu daļā. MALDI tiek izmantots, lai salīdzinātu, vai oligosaharīdu molekulu masas sadalījums atbilst paredzētajai struktūrai. 4. attēlā parādīta neitrālo komponentu ACN-A un ACN-B MC. ACN-A analīze apstiprināja pentožu cukuru diapazonu no DP 4–8 (4. att.) līdz DP 22 (S1. att.), kuru svars atbilst MeU-ksilāna oligosaharīdiem. ACN-B analīze apstiprināja pentožu un glikoksilāna sērijas ar DP 8–15. Papildu materiālos, piemēram, S3. attēlā, FA-C skābo daļu masas sadalījuma kartes parāda (Me)U aizvietotu pentožu cukuru diapazonu ar DP no 8 līdz 15, kas atbilst aizvietotajiem ksilāniem, kas atrodami ELISA monoklonālo antivielu skrīningā. Epitopi ir konsekventi.
ACS esošo šķīstošo neatbilstošo oligosaharīdu MALDI-MS spektrs. Šeit (A) ACN-A zema svara diapazona frakcijas, kas satur metilētus uronskābes (DP 4-8) aizvietotus glikuroksilāna oligosaharīdus, un (B) ACN-B ksilāns un metilēti uronskābes oligosaharīdi, kas aizvietoti ar glikuroksilānu (DP 8-15).
Ugunsizturīgu oligosaharīdu glikāna atlikuma sastāva analīze. Šeit (A) ir dažādu oligosaharīdu frakciju TMS saharīdu sastāvs, kas iegūts, izmantojot GC-MS analīzi. (B) Oligosaharīdos esošo dažādu no TMS iegūtu cukuru struktūras. ACN – acetonitrila frakcija, kas satur neitrālus oligosaharīdus, un FA – ferulskābes frakcija, kas satur skābos oligosaharīdus.
Vēl viens interesants secinājums tika izdarīts no oligosaharīdu frakcijas LC-MS analīzes, kā parādīts S9. attēlā (metodes var redzēt elektroniskajā papildmateriālā). ACN-B frakcijas ligācijas laikā atkārtoti tika novēroti heksozes un -OAc grupu fragmenti. Šis atklājums ne tikai apstiprina glikozes un MALDI-TOF analīzē novēroto fragmentāciju, bet arī sniedz jaunu informāciju par iespējamiem ogļhidrātu atvasinājumiem iepriekš apstrādātā lignocelulozes biomasā.
Mēs arī analizējām oligosaharīdu frakcijas cukuru sastāvu, izmantojot TMS cukura derivatizāciju. Izmantojot GC-MS, mēs noteicām neironu (neatvasināto) un skābo cukuru (GluA un GalA) sastāvu oligosaharīdu frakcijā (5. att.). Glikuronskābe ir atrodama skābajos komponentos C un D, ​​savukārt galakturonskābe ir atrodama skābajos komponentos A un B, kas abi ir skābo cukuru komponenti ar augstu DP. Šie rezultāti ne tikai apstiprina mūsu ELISA un MALDI datus, bet arī atbilst mūsu iepriekšējiem oligosaharīdu uzkrāšanās pētījumiem. Tāpēc mēs uzskatām, ka mūsdienu imunoloģiskās metodes, izmantojot oligosaharīdu biotinilēšanu un sekojošu ELISA skrīningu, ir pietiekamas, lai dažādos bioloģiskajos paraugos noteiktu šķīstošos nepakļāvīgos oligosaharīdus.
Tā kā ELISA monoklonālo antivielu skrīninga metodes ir validētas ar vairākām dažādām metodēm, mēs vēlējāmies sīkāk izpētīt šīs jaunās kvantitatīvās metodes potenciālu. Tika iegādāti divi komerciāli oligosaharīdi, ksiloheksasaharīda oligosaharīds (XHE) un 23-α-L-arabinofuranozil-ksilotrioze (A2XX), un tie tika testēti, izmantojot jaunu monoklonālo antivielu pieeju, kas vērsta uz šūnu sienas glikānu. 6. attēlā redzama lineāra korelācija starp biotinilēto saistīšanās signālu un oligosaharīda koncentrācijas logaritmisko koncentrāciju, kas liecina par iespējamu Langmuira adsorbcijas modeli. Starp monoklonālajām antivielām CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148 un CCRC-M151 korelēja ar XHE, un CCRC-M108, CCRC-M109 un LM11 korelēja ar A2XX diapazonā no 1 nm līdz 100 nano. Sakarā ar ierobežoto antivielu pieejamību eksperimenta laikā, ar katru oligosaharīda koncentrāciju tika veikti ierobežoti eksperimenti. Šeit jāatzīmē, ka dažas antivielas reaģē ļoti atšķirīgi uz vienu un to pašu oligosaharīdu kā substrātu, iespējams, tāpēc, ka tās saistās ar nedaudz atšķirīgiem epitopiem un tām var būt ļoti atšķirīga saistīšanās afinitāte. Precīzas epitopu identificēšanas mehānismi un sekas būs daudz sarežģītākas, ja jaunā monoklonālo antivielu pieeja tiks piemērota reāliem paraugiem.
Lai noteiktu dažādu glikānu mērķējošu monoklonālu antivielu (mAb) noteikšanas diapazonu, tika izmantoti divi komerciāli oligosaharīdi. Šeit lineārās korelācijas ar oligosaharīdu koncentrācijas logaritmisko koncentrāciju norāda Langmuira adsorbcijas modeļus (A) XHE ar mAb un (B) A2XX ar mAb. Atbilstošie epitopi norāda komerciālo oligosaharīdu struktūras, kas izmantotas kā substrāti testā.
Glikānu mērķtiecīgu monoklonālu antivielu izmantošana (glikokomiskā analīze vai uz ELISA balstīta monoklonālo antivielu skrīnings) ir spēcīgs instruments, lai padziļināti raksturotu lielāko daļu galveno šūnu sieniņu glikānu, kas veido augu biomasu. Tomēr klasiskā glikānu analīze raksturo tikai lielākus šūnu sieniņu glikānus, jo lielākā daļa oligosaharīdu netiek efektīvi imobilizēti uz ELISA plāksnēm. Šajā pētījumā ar AFEX apstrādāta kukurūzas ciete tika fermentatīvi hidrolizēta ar augstu cietvielu saturu. Cukura analīze tika izmantota, lai noteiktu hidrolizātā esošo nepakļāvīgo šūnu sieniņu ogļhidrātu sastāvu. Tomēr mazāku oligosaharīdu monoklonālo antivielu analīze hidrolizātos ir nepietiekami novērtēta, un ir nepieciešami papildu instrumenti, lai efektīvi imobilizētu oligosaharīdus uz ELISA plāksnēm.
Šeit mēs ziņojam par jaunu un efektīvu oligosaharīdu imobilizācijas metodi monoklonālo antivielu skrīningam, apvienojot oligosaharīdu biotinilēšanu, kam seko ELISA skrīnings uz NeutrAvidin™ pārklātām plāksnēm. Imobilizētajiem biotinilētajiem oligosaharīdiem bija pietiekama afinitāte pret antivielām, lai nodrošinātu ātru un efektīvu nepakļāvīgu oligosaharīdu noteikšanu. Šo spītīgo oligosaharīdu sastāva analīze, pamatojoties uz masas spektrometriju, apstiprināja šīs jaunās imūnskrīninga pieejas rezultātus. Tādējādi šie pētījumi parāda, ka oligosaharīdu biotinilēšanas un ELISA skrīninga kombināciju ar glikānu mērķētām monoklonālām antivielām var izmantot, lai noteiktu šķērssaites oligosaharīdos, un to var plaši pielietot citos bioķīmiskos pētījumos, kas raksturo oligosaharīdu struktūru.
Šī uz biotīnu balstītā glikāna profilēšanas metode ir pirmais ziņojums, kas spēj izpētīt augu biomasā esošo šķīstošo oligosaharīdu nepakļāvīgās ogļhidrātu saites. Tas palīdz saprast, kāpēc dažas biomasas daļas ir tik nepieņemamas biodegvielas ražošanā. Šī metode aizpilda svarīgu robu glikozes analīzes metodēs un paplašina tās pielietojumu plašākam substrātu klāstam ārpus augu oligosaharīdiem. Nākotnē mēs varētu izmantot robotiku biotinilēšanai un izmantot mūsu izstrādāto metodi paraugu augstas caurlaidības analīzei, izmantojot ELISA.
No Pioneer 33A14 hibrīda sēklām audzēti kukurūzas salmi (KS) tika novākti 2010. gadā Kramer Farms saimniecībā Rejā, Kolorādo štatā. Ar zemes īpašnieka atļauju šo biomasu var izmantot pētniecībai. Paraugi tika uzglabāti sausā vietā ar mitrumu < 6% istabas temperatūrā rāvējslēdzēja maisiņos. Paraugi tika uzglabāti sausā vietā ar mitrumu < 6% istabas temperatūrā rāvējslēdzēja maisiņos. Образцы хранились сухими при влажности < 6% в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре. Paraugi tika uzglabāti sausā vietā istabas temperatūrā ar mitrumu <6% rāvējslēdzēja maisiņos.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中.样品在室温下以干燥< 6% Образцы хранят в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре с влажностью < 6%. Paraugi tiek uzglabāti maisiņos ar rāvējslēdzēju istabas temperatūrā ar mitrumu < 6%.Pētījums atbilda vietējām un nacionālajām vadlīnijām. Sastāva analīze tika veikta, izmantojot NREL protokolu. Sastāvā konstatēts 31,4 % glikāna, 18,7 % ksilāna, 3,3 % arabināna, 1,2 % galaktāna, 2,2 % acetilgrupas, 14,3 % lignīna, 1,7 % olbaltumvielu un 13,4 % pelnu.
Cellic® CTec2 (138 mg proteīna/ml, partija VCNI 0001) ir komplekss celulāzes, β-glikozidāzes un Cellic® HTec2 (157 mg proteīna/ml, partija VHN00001) maisījums no Novozymes (Franklinton, NC, ASV)). Multifect Pectinase® (72 mg proteīna/ml), komplekss pektīnu noārdošo enzīmu maisījums, tika ziedots no DuPont Industrial Biosciences (Palo Alto, CA, ASV). Enzīmu proteīnu koncentrācijas tika noteiktas, novērtējot proteīnu saturu (un atņemot neproteīnu slāpekļa ieguldījumu), izmantojot Kjeldāla slāpekļa analīzi (AOAC metode 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, ASV). Diatomīta zeme 545 tika iegādāta no EMD Millipore (Billerica, MA). Aktivētā ogle (DARCO, 100 mesh granulas), Avicel (PH-101), dižskābarža ksilāns un visas pārējās ķīmiskās vielas tika iegādātas no Sigma-Aldrich (Sentluisa, Misūri štats).
AFEX pirmapstrāde tika veikta GLBRC (Biomasas konversijas pētniecības laboratorija, MSU, Lansinga, MI, ASV). Pirmapstrāde tika veikta 140 °C temperatūrā 15 minūtes. 46 uzturēšanās laiks pie bezūdens amonjaka un biomasas attiecības 1:1 ar 60% (s/s) pildījumu nerūsējošā tērauda galda reaktorā (Parr Instruments Company). Tas ilga 30 minūtes. Reaktors tika uzkarsēts līdz 140 °C, un amonjaks tika ātri atbrīvots, ļaujot biomasai ātri atgriezties istabas temperatūrā. Ar AFEX iepriekš apstrādātās kukurūzas stovera (ACS) sastāvs bija līdzīgs neapstrādātas kukurūzas stovera (UT-CS) sastāvam.
Kā izejviela oligosaharīdu liela mēroga ražošanai tika sagatavots ACSH ar augstu cietvielu saturu 25% (s/s) (aptuveni 8% dekstrāna saturs). ACS fermentatīvā hidrolīze tika veikta, izmantojot komerciālu enzīmu maisījumu, kas ietver Cellic® Ctec2 10 mg proteīna/g glikāna (iepriekš apstrādātā biomasā), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 mg proteīna/g glikāna un Multifect Pectinase (Genencor Inc, ASV). ), 5 mg proteīna/g dekstrāna. Enzimātiskā hidrolīze tika veikta 5 litru bioreaktorā ar darba tilpumu 3 litri, pH 4,8, 50°C un 250 apgr./min. Pēc 96 stundu hidrolīzes hidrolizāts tika savākts, centrifugējot pie 6000 apgr./min 30 minūtes un pēc tam pie 14000 apgr./min 30 minūtes, lai atdalītu nehidrolizētās cietvielas. Pēc tam hidrolizāts tika sterili filtrēts caur 0,22 mm filtra vārglāzi. Filtrētais hidrolizāts tika uzglabāts sterilās pudelēs 4°C temperatūrā un pēc tam frakcionēts uz ogles.
Ekstraktu biomasas paraugu sastāva analīze saskaņā ar NREL laboratorijas analīzes procedūrām: paraugu sagatavošana sastāva analīzei (NREL/TP-510-42620) un strukturālo ogļhidrātu un lignīna noteikšana biomasā (NREL/TP-510–42618)47.
Hidrolizāta plūsmas oligosaharīdu analīze tika veikta 2 ml mērogā, izmantojot autoklāvā balstītu skābes hidrolīzes metodi. Hidrolizāta paraugu sajauc ar 69,7 µl 72% sērskābes 10 ml skrūvējama vāciņa kultūras mēģenē un inkubē 1 stundu uz galda virsmas 121 °C temperatūrā, atdzesē uz ledus un filtrē augstas veiktspējas šķidruma hromatogrāfijas (HPLC) flakonā. Oligosaharīdu koncentrāciju noteica, atņemot monosaharīdu koncentrāciju nehidrolizētajā paraugā no kopējās cukuru koncentrācijas ar skābi hidrolizētajā paraugā.
Glikozes, ksilozes un arabinozes koncentrācijas skābi hidrolizētā biomasā tika analizētas, izmantojot Shimadzu HPLC sistēmu, kas aprīkota ar automātisko paraugu ņemšanas ierīci, kolonnas sildītāju, izokrātisku sūkni un refrakcijas indeksa detektoru uz Bio-Rad Aminex HPX-87H kolonnas. Kolonna tika uzturēta 50°C temperatūrā un eluēta ar 0,6 ml/min 5 mM H2SO4 ūdens plūsmā.
Hidrolizāta supernatants tika atšķaidīts un analizēts, lai noteiktu monomēru un oligosaharīdu saturu. Pēc fermentatīvās hidrolīzes iegūtie monomēriskie cukuri tika analizēti ar HPLC, kas aprīkota ar Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P kolonnu un pelnu aizsargkolonnu. Kolonnas temperatūra tika uzturēta 80°C, ūdens tika izmantots kā mobilā fāze ar plūsmas ātrumu 0,6 ml/min. Oligosaharīdi tika noteikti ar hidrolīzi atšķaidītā skābē 121°C temperatūrā saskaņā ar metodēm, kas aprakstītas 41., 48., 49. atsaucē.
Saharīdu analīze tika veikta neapstrādātiem, ar AFEX iepriekš apstrādātiem un visiem nehidrolizētiem biomasas atlikumiem (ieskaitot sērijveida šūnu sieniņu ekstraktu ražošanu un to monoklonālo antivielu skrīningu), izmantojot iepriekš aprakstītās procedūras 27, 43, 50, 51. Glikoma analīzei no biomasas atlikumiem sagatavo spirtā nešķīstošos augu šūnu sieniņu materiāla atlikumus un veic sērijveida ekstrakciju ar arvien agresīvākiem reaģentiem, piemēram, amonija oksalātu (50 mM), nātrija karbonātu (50 mM un 0,5% w/v), CON. (1M un 4M, abi ar 1% w/v nātrija borohidrīdu) un skābo hlorītu, kā aprakstīts iepriekš 52,53. Pēc tam ekstrakti tika pakļauti ELISA analīzei pret kompleksu monoklonālo antivielu paneli, kas vērstas pret šūnu sieniņas glikānu, un monoklonālo antivielu saistīšanās reakcijas tika attēlotas kā siltuma karte. Monoklonālās antivielas, kas vērstas pret augu šūnu sieniņas glikānu, tika iegādātas no laboratorijas krājumiem (CCRC, JIM un MAC sērijas).
Oligosaharīdu vienas pakāpes biotinilēšana. Ogļhidrātu konjugācija ar biotīna-LC-hidrazīdu tika veikta, izmantojot šādu procedūru. Biotīna-LC-hidrazīds (4,6 mg/12 μmol) tika izšķīdināts dimetilsulfoksīdā (DMSO, 70 μl), enerģiski maisot un karsējot 65 °C temperatūrā 1 minūti. Pievienoja ledus etiķskābi (30 µl), un maisījumu ielēja nātrija ciānborohidrīdā (6,4 mg/100 µmol) un pilnībā izšķīdināja pēc karsēšanas 65 °C temperatūrā apmēram 1 minūti. Pēc tam žāvētajam oligosaharīdam (1–100 nmol) pievienoja no 5 līdz 8 μl reakcijas maisījuma, lai iegūtu 10 reizes vai vairāk iezīmētās vielas molāro pārpalikumu salīdzinājumā ar reducējošo galu. Reakcija tika veikta 65 °C temperatūrā 2 stundas, pēc tam paraugi tika nekavējoties attīrīti. Marķēšanas eksperimentos bez reducēšanas nātrija ciānborohidrīds netika izmantots, un paraugi tika reaģēti 65 °C temperatūrā 2,5 stundas.
Biotinilētu oligosaharīdu paraugu ELISA pārklāšana un mazgāšana. Katrā avidīna pārklātās plāksnes iedobē pievienoja 25 μl biotinilētu paraugu (100 μl katra koncentrēta parauga, atšķaidītu 5 ml 0,1 M Tris buferšķīduma (TBS)). Kontroles iedobes pārklāja ar 50 μl biotīna ar koncentrāciju 10 μg/ml 0,1 M TBS. Tukšajiem mērījumiem kā pārklājums tika izmantots dejonizēts ūdens. Tableti inkubēja 2 stundas istabas temperatūrā tumsā. Plāksni 3 reizes mazgāja ar 0,1% vājpiena 0,1 M TBS, izmantojot programmu Nr. 11 Grenier plaknei 3A.
Primāro antivielu pievienošana un mazgāšana. Katrā iedobē pievienojiet 40 µl primāro antivielu. Mikroplati inkubējiet 1 stundu istabas temperatūrā tumsā. Pēc tam plates 3 reizes mazgāja ar 0,1% pienu 0,1M TBS, izmantojot Grenier Flat 3A 11. mazgāšanas programmu.
Pievienojiet sekundāro antivielu un nomazgājiet. Katrā iedobē pievienojiet 50 µl peles/žurkas sekundārās antivielas (atšķaidītas 1:5000 0,1% pienā 0,1 M TBS). Inkubējiet mikroplati 1 stundu istabas temperatūrā tumsā. Pēc tam mikroplates 5 reizes mazgāja ar 0,1% pienu 0,1 M TBS, izmantojot Grenier Flat 5A plates mazgāšanas programmu Nr. 12.
Substrāta pievienošana. Pievienojiet 50 µl 3,3′,5,5′-tetrametilbenzidīna (TMB) bāzes substrātam (pievienojot 2 pilienus buferšķīduma, 3 pilienus TMB, 2 pilienus ūdeņraža peroksīda 15 ml dejonizēta ūdens). Sagatavojiet TMB substrātu un pirms lietošanas samaisiet. Inkubējiet mikroplati istabas temperatūrā 30 minūtes. Tumsā.
Pabeidziet šo soli un nolasiet tableti. Katrā iedobē pievienojiet 50 µl 1 N sērskābes un, izmantojot ELISA lasītāju, reģistrējiet absorbciju no 450 līdz 655 nm.
Sagatavojiet šo analītu 1 mg/ml šķīdumus dejonizētā ūdenī: arabinoze, ramnoze, fukoze, ksiloze, galakturonskābe (GalA), glikuronskābe (GlcA), mannoze, glikoze, galaktoze, laktoze, N-acetilmannozamīns (manNAc), N-acetilglikozamīns (glcNAc), N-acetilgalaktozamīns (galNAc), inozitols (iekšējais standarts). Divi standarti tika sagatavoti, pievienojot 1 mg/ml cukura šķīdumus, kas parādīti 1. tabulā. Paraugi tiek sasaldēti un liofilizēti -80° C temperatūrā, līdz viss ūdens ir atdalīts (parasti apmēram 12–18 stundas).
Analītisko svaru mēģenēs ar skrūvējamu vāciņu ievietojiet 100–500 µg parauga. Pierakstiet pievienoto daudzumu. Vislabāk paraugu izšķīdināt noteiktā šķīdinātāja koncentrācijā un pievienot to mēģenei kā šķidru alikvotu. Katrai parauga mēģenei kā iekšējo standartu izmantojiet 20 µl 1 mg/ml inozitola. Paraugam pievienotā iekšējā standarta daudzumam jābūt tādam pašam kā standarta mēģenei pievienotā iekšējā standarta daudzumam.
Pievienojiet 8 ml bezūdens metanola flakonam ar skrūvējamu vāciņu. Pēc tam pievienojiet 4 ml 3 N metanola HCl šķīduma, aizskrūvējiet un sakratiet. Šajā procesā netiek izmantots ūdens.
Oligosaharīdu paraugiem un standarta TMS mēģenēm pievieno 500 µl 1 M HCl metanola šķīduma. Paraugi tika inkubēti nakti (168 stundas) 80°C temperatūrā termoblokā. Metanolīzes produktu žāvē istabas temperatūrā, izmantojot žāvēšanas kolektoru. Pievieno 200 µl MeOH un vēlreiz žāvē. Šo procesu atkārto divas reizes. Paraugam pievieno 200 µl metanola, 100 µl piridīna un 100 µl etiķskābes anhidrīda un labi samaisa. Paraugi tika inkubēti istabas temperatūrā 30 minūtes un žāvēti. Pievieno 200 µl metanola un vēlreiz žāvē.
Pievienojiet 200 µl Tri-Sil un karsējiet mēģeni ar vāciņu 20 minūtes. Sasniedziet 80°C, pēc tam atdzesējiet līdz istabas temperatūrai. Izmantojiet žāvēšanas kolektoru, lai vēl vairāk izžāvētu paraugu līdz aptuveni 50 µl tilpumam. Ir svarīgi atzīmēt, ka mēs neļāvām paraugiem pilnībā izžūt.
Pievienojiet 2 ml heksāna un labi samaisiet, kratot. Piepildiet Pastēra pipešu (5–8 mm) galus ar stikla vates gabaliņu, ievietojot stikla vati 5-3/4 collas diametra pipetes augšpusē. Paraugi tika centrifugēti ar 3000 g 2 minūtes. Nešķīstošās atliekas tiek nogulsnētas. Paraugu izžāvējiet līdz 100–150 µl. Aptuveni 1 μl tilpums tika ievadīts GC-MS hromatogrāfā sākotnējā temperatūrā 80 °C un sākotnējā laikā 2,0 minūtes (2. tabula).