Misaotra anao nitsidika ny Nature.com.Ny dikan-teny navigateur ampiasainao dia manana fanohanana voafetra ho an'ny CSS. Ho an'ny traikefa tsara indrindra dia manoro hevitra anao izahay hampiasa navigateur nohavaozina (na vonoy ny fomba fampifanarahana amin'ny Internet Explorer).
Ny morphogenesis amin'ny tsinay dia mametraka ny endri-javatra crypt-villus amin'ny microarchitecture 3D epithelial microarchitecture sy spatial organization. Noho izany, ny famerenana ny rafitra epithelial 3D dia tena ilaina amin'ny fananganana modely in vitro tsinay. Marihina fa ny gut-on-a-chip mimetika organika dia afaka miteraka morphogenesis 3D ho azy amin'ny epithelium intestinal miaraka amin'ny fiasa ara-batana sy biomechanika nohatsaraina. Ny tsinay amin'ny chip microfluidic ary koa ao amin'ny chip hybride Transwell. Manoritsoritra ny fomba amin'ny antsipiriany amin'ny fanamboarana fitaovana izahay, ny fambolena Caco-2 na ny selan'ny epithelial organoid intestinal amin'ny toe-javatra mahazatra ary koa amin'ny sehatra microfluidic, induction ny morphogenesis 3D, ary ny famaritana ny epithelia 3D efa napetraka amin'ny alàlan'ny fampandehanana ny epithelia 3D voaorina. mifehy ny fikorianan'ny fluid basolateral ho an'ny 5 d.Ny fomba morphogenesis in vitro dia mampiasa ny fihenjanana ara-batana mifandraika amin'ny fihenjanana sy ny hetsika mekanika ary tsy mitaky teknika na fanodikodinana sela sarotra, izay mety hihoatra ny teknika hafa efa misy. Mieritreritra izahay fa ny protocol narosonay dia mety hisy fiantraikany lehibe amin'ny vondrom-piarahamonina fikarohana biomedical, manome fomba iray hamerenana indray ny 3D intestinal epithelial, biomedical layers ho an'ny epithelial biomedical. fampiharana.
Ny fanandramana dia mampiseho fa ny sela Caco-2 epithelial intestinal kolontsaina ao amin'ny tsinay-on-a-chip1,2,3,4,5 na bilayer microfluidic devices6,7 dia afaka mandalo morphogenesis 3D in vitro tsy misy fahatakarana mazava ny mekanika fototra. morphogenesis epithelial in vitro, izay nasehon'ny Caco-2 sy ny organoids tsinay azo avy amin'ny marary. Ny sela epithelial dia nohamarinina. Tamin'ity fanadihadiana ity dia nifantoka manokana tamin'ny famokarana sela sy ny fizarana fifantohana amin'ny antagonista Wnt mahery, Dickkopf-1 (DKK-1), amin'ny gut-on-a-chip sy fitaovana microfluidic novaina misy Transwell inserts, antsoina hoe "Hybrid Chip" izahay. Ny proteinina mifandraika amin'ny frizzled 1, na Soggy-1) mankany amin'ny tsinay amin'ny chip dia manakana ny morphogenesis na manakorontana ny sosona epithelial 3D efa voaomana mialoha, izay manoro hevitra fa ny antagonista antagonista mandritra ny kolontsaina dia tompon'andraikitra amin'ny morphogenesis intestinal in vitro. amin'ny alalan'ny fandroahana mavitrika (ohatra, amin'ny gut-on-a-chip na hybrid-on-a-chip platforms) na diffusion .Basolateral media (oh: avy amin'ny Transwell miditra ao anaty fitahirizana basolateral lehibe ao anaty lavadrano).
Ao anatin'ity protocol ity dia manome fomba iray amin'ny antsipiriany amin'ny famolavolana microdevices tsinay-on-a-chip sy ny chips hybrid Transwell-insertable (dingana 1-5) izahay mba hamolavola sela epithelial intestinal amin'ny polydimethylsiloxane (PDMS) mifototra amin'ny porous membranes (dingana 6A, 7A, 8, 9) na polyesterBs amin'ny 8, 9) 9) ary nampirisika ny morphogenesis 3D in vitro (dingana 10) .Isika ihany koa dia namaritra ny endri-javatra sela sy molekiola izay manondro ny histogenesis manokana amin'ny tavy sy ny fanavahana sela miankina amin'ny rohim-pirazanana amin'ny alàlan'ny fampiharana fomba fiasa maromaro (dingana 11-24). Ny fanovana ny membranes porous, ny famoronana monolayers 2D, ary ny biochimique intestinal ary ny Famokarana ny microenvironment biomechanika.in vitro. Ny sosona epithelial izay azo ampiasaina amin'ny famolavolana ny fitomboan'ny epithelial miankina amin'ny morphogen, ny fiaraha-miombon'antoka amin'ny micro microbiome longitudinal, ny fihanaky ny pathogen, ny ratra amin'ny inflammatoire, ny tsy fahampian'ny sakana amin'ny epithelial, ary ny fitsaboana mifototra amin'ny probiotic Example.influences.
Ny protocole ataontsika dia mety ilaina amin'ny mpahay siansa marobe amin'ny fototra (ohatra, biolojia mucosal intestinal, biolojia selan'ny sela, ary biolojia fampandrosoana) ary fikarohana ampiharina (ohatra, fitiliana zava-mahadomelina preclinical, modelin'ny aretina, injeniera amin'ny tissue, ary gastroenterology). azo aparitaka amin'ny mpihaino mianatra ny dinamikan'ny famantarana ny sela mandritra ny fivoaran'ny tsinay, fanavaozana na homeostasis .Ankoatra izany, ny protocole dia ilaina amin'ny famotopotorana ny otrikaretina amin'ny alàlan'ny areti-mifindra isan-karazany toy ny Norovirus 8, Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2), Clostridium difficile, Salmonella Typhoae na Salmonella Ny fampiasana ny rafitra microphysiology amin'ny tsinay dia mety hamela ny fiaraha-miombon'antoka 10 sy ny fanombanana ny fiarovan'ny mpampiantrano, ny valin'ny immune ary ny fanamboarana ratra mifandraika amin'ny pathogen ao amin'ny gastrointestinal (GI) tract 11 . Ny aretina GI hafa mifandraika amin'ny aretin'ny tsinay, ny aretin'ny selia, ny aretin'i Crohn, ny aretin'ny tsinaibe, ny aretin'i Crohn dia mety ho voan'ny aretim-pivalanana. Ny sosona epithelial intestinal 3D dia voaomana amin'ny fampiasana ny sosona epithelial intestinal 3D an'ny marary, ireo aretina ireo dia ahitana ny atrophy villous, ny fanafohezana ny crypt, ny fahasimbana mucosal, na ny sakana epithelial impaired. Ny sela mononuklear peripheral peripheral (PBMCs), ho an'ny modely misy microarchitectures 3D intestinal villus-crypt. sela-sela immunité manokana, 5.
Koa satria ny microstructure 3D epithelial dia azo amboarina sy jerena raha tsy misy ny fizotry ny fizarana, ny mpijery miasa amin'ny transcriptomic spatial sy ny sary avo lenta na super-resolution dia mety ho liana amin'ny sarintany momba ny dinamika spatiotemporal ny fototarazo sy ny proteinina amin'ny niches epithelial. Liana amin'ny teknolojia.Famaliana ny stimuli microbial na immune.Ankoatra izany, longitudinal host-microbiome crosstalk 10, 14 izay mandrindra ny homeostasis tsinay dia azo apetraka ao amin'ny 3D intestinal mucosal layer amin'ny alàlan'ny fiaraha-miombon'antoka karazana mikraoba isan-karazany, vondrom-piarahamonina mikraoba na microbiota fecal, indrindra ao amin'ny tsinay. Ity fomba fiasa ity dia manintona manokana ny mpihaino mianatra ny immunology mucosal, gastroenterology, microbiome olombelona, ​​culturomics ary microbiology klinika mitady hamboly microbiota tsinay tsy voakolokolo teo aloha ao amin'ny laboratoara. Ny protocole dia azo aparitaka ihany koa amin'ireo izay mamolavola pharmaceutical, biomedical Na sehatra fitiliana na fanamarinana avo lenta ho an'ny indostrian'ny sakafo. Ho porofon'ny fitsipika, vao haingana no nanehoanay ny fahafahan'ny rafitra morphogenesis avo lenta amin'ny multiplex azo atao amin'ny endrika takelaka 24-well. Ny fomba morphogenesis in vitro dia azo ahafaingana ary mety horaisin'ny laboratoara fikarohana maro, indostria na sampan-draharaham-panjakana ary sampan-draharaha misahana ny fanaraha-maso mba hahatakarana ny fandrindrana ny sela ny morphogenesis in vitro gut amin'ny ambaratonga transcriptomic mba hitsapana zava-mahadomelina na biotherapeutics. dingana morphogenesis.
Modely andrana maromaro mifandraika amin'ny olombelona no nampiasaina handinihana ny morphogenesis epithelial intestinal, indrindra noho ny tsy fisian'ny protocole azo ampiharina mba hamporisihana ny morphogenesis 3D in vitro. Raha ny marina, ny ankamaroan'ny fahalalana amin'izao fotoana izao momba ny morphogenesis amin'ny tsinay dia mifototra amin'ny fandalinana biby (ohatra, zebrafish20, mice21 na chickens22). mampametra-panontaniana, ary ny tena zava-dehibe indrindra, dia tsy mamaritra mazava tsara ny fizotran'ny fivoaran'ny olombelona. Ireo modely ireo ihany koa dia voafetra ihany amin'ny fahafahany hotsapaina amin'ny fomba maro azo esorina. localization ny sela samihafa ao amin'ny crypt-villus axis ho setrin'ny mucosal na immune stimuli. ny fomba firafitry ny mikrôbiota tsinay ny vondrom-piarahamonina misy azy ary hamokatra metabolites mikraoba (ohatra, asidra matavy fohy rojo) izay mamolavola ny fikambanan'ny sela sy ny niches cellule ao amin'ny crypts basal ireo endri-javatra ireo.
Ho fanampin'ny fomba ataontsika amin'ny famoronana rafitra epithelial intestinal 3D, dia misy fomba in vitro maromaro. Ny lumen intestinal dia voahidy ao anatin'ny organoid ary, noho izany, ny fampidirana ireo singa luminal toy ny sela mikraoba na antigène exogenous dia voafetra. Ny fidirana amin'ny lumens organoïde dia azo hatsaraina amin'ny fampiasana microinjector,26,27 fa ity fomba ity dia invasive sy miasa mafy ary mitaky fahalalana manokana mba hanatanterahana.Ankoatra izany, ny kolontsaina organoid nentim-paharazana voatazona ao amin'ny scaffolds hydrogel amin'ny toe-javatra static dia tsy maneho mazava tsara ny biomechanika mavitrika amin'ny vivo.
Ny fomba fiasa hafa ampiasain'ny vondrona mpikaroka maromaro dia mampiasa scaffolds hydrogel 3D efa namboarina mialoha mba haka tahaka ny firafitry ny epithelial tsinay amin'ny alàlan'ny fambolena sela tsinain'olombelona mitoka-monina eo amin'ny tampon'ny gel. Ny gradients morphogen, ny fametrahana ny rafitra epithelial avo lenta sy ny crosstalk stroma-epithelial amin'ny fampidirana sela stromal ao amin'ny scaffold. Ny fandinihana iray hafa vao haingana dia nampiasa scaffolds hydrogel amin'ny sehatra microfluidic ary ny rafitra epithelial intestinal amin'ny fampiasana teknika laser-etching.Ny organoids tsinay amin'ny totozy dia manaraka lamina voasokitra mba hamoronana rafitra tubular tsinay, ary ny fikorianan'ny fluid intraluminal dia azo averina amin'ny fampiasana modely microfluidics tsy misy modely. Mechanobiological movements.3D teknika fanontam-pirinty avy amin'ny vondrona iray ihany dia afaka namorona fantsona tsinay kely miaraka amin'ny dingana morphogenetic ho azy. morphogenesis tsinay, adin-tsaina ara-batana mifandraika amin'ny fizika, biomechanika izay manahaka ny fihetsehan'ny tsinay, ny fahafahana miditra amin'ny faritra apical sy basolateral tsy miankina, ary ny famoronana indray ny tontolo bitika biolojika sarotra amin'ny modularity.
Ny protocole dia mifantoka tanteraka amin'ny morphogenesis epithelial 3D, miaraka amin'ny sela epithelial ihany amin'ny kolontsaina ary tsy misy karazana sela hafa manodidina toy ny sela mesenchymal, sela endothelial, ary sela immune. gut-on-a-chip sy hybrid-on-a-chip dia ahafahantsika mamerina ny sosona epithelial 3D mihodinkodina, ny fahasarotana biolojika fanampiny toy ny fifaneraserana epithelial-mesenchymal33,34, extracellular Matrix (ECM) deposition 35 ary, ao amin'ny modely misy antsika, ny endri-javatra crypt-villus izay mampita ny niches cellule stem dia mijanona ao amin'ny crypteblasts bebe kokoa. Ny mesenchyme dia mitana anjara toerana lehibe amin'ny famokarana proteinina ECM sy ny fandrindrana ny morphogenesis amin'ny tsinay ao amin'ny vivo35,37,38. Ny fanampiana ny sela mesenchymal amin'ny modely misy antsika dia nanatsara ny fizotran'ny morphogenetic sy ny fahombiazan'ny fametahana sela. Ny endothelial layer (izany hoe, capillaries na lymphatics) dia mitana anjara toerana lehibe amin'ny fandrindrana ny fitaterana molekiola 30 Ny microenvironment.Ankoatra izany, ny singa vasculature izay azo ampifandraisina amin'ny modelin'ny tissue dia fepetra takiana rehefa natao ny modelin'ny tissue mba hampisehoana ny fifandraisana amin'ny taova maro. tsimatimanota ao anatin'ny tontolon'ny maka tahaka ny aretin'ny tsinay.
Ny fampiasana puce hybrida dia mahitsy kokoa noho ny gut-on-a-chip satria tsotra ny fametrahana ny fitaovana ary ny fampiasana ny fampidirana Transwell dia mamela ny kolontsaina mivelatra amin'ny epithelium tsinay. eo amin'ny lafiny apical.Mazava ho azy fa ny fananana static ao amin'ny efitrano apical dia mahalana no ahafahan'ny bakteria miara-maharitra maharitra amin'ny chips hybrid. Na dia afaka mampirisika mafy ny morphogenesis 3D amin'ny fampidirana Transwell isika rehefa mampiasa chips hybrid, ny tsy fahampian'ny biomechanika mifandraika amin'ny physiologically sy ny fikorianan'ny fluid apical dia mety hametra ny fahafahan'ny sehatra fampiharana hybride.
Ny fanamboarana feno amin'ny axe crypt-villus olombelona amin'ny kolontsaina gut-on-a-chip sy hybrid-on-a-chip dia mbola tsy tafaorina tanteraka. 3D epithelium, ny crypt sy ny villous faritra dia tsy voafaritra mazava tsara. Ny haavon'ny villi tsinay kely dia ~600 µm41.
Avy amin'ny fomba fijery imaging, in situ super-resolution imaging of 3D microarchitectures dia mety ho voafetra amin'ny tsinay amin'ny chip iray, satria ny halaviran'ny asa ilaina avy amin'ny fakan-tsary tanjona mankany amin'ny sosona epithelial dia eo amin'ny filaharana milimetatra vitsivitsy. PDMS.Ankoatra izany, satria ny microfabrication sosona amin'ny tsinay amin'ny puce dia misy adhesion maharitra eo anelanelan'ny sosona tsirairay, dia tena sarotra ny manokatra na manala ny sosona ambony mba handinihana ny firafitry ny epithelial layer. Ohatra, amin'ny fampiasana microscope electron scanning (SEM).
Ny hydrophobicity an'ny PDMS dia singa mametra amin'ny fandalinana mifototra amin'ny microfluidic mifandraika amin'ny molekiola kely hydrophobic, satria ny PDMS dia afaka misoroka ny molekiola hydrophobic toy izany. Ny hafa amin'ny PDMS dia azo raisina amin'ny fitaovana polymeric hafa. mampihena ny adsorption ny hydrophobic molekiola.
Farany, ny fomba fiasantsika dia tsy voamarika tsara amin'ny resaka fanomezana screening avo lenta na "iray habe-mifanaraka amin'ny rehetra" sehatra fanandramana amin'ny mpampiasa. 384-fampidirana porous tsara izay mamela ny famenoana mitohy sy ny fanesorana ny media basolateral).
Mba hahatonga ny morphogenesis 3D amin'ny epithelium tsinain'ny olombelona in vitro, dia nampiasa fitaovana tsinay microfluidic chip misy microchannels roa mifanitsy ary membrane porous elastika eo anelanelany mba hamoronana interface tsara lumen-capillary. sehatra, morphogenesis ny sela epithelial tsinay isan-karazany ny olombelona dia azo aseho amin'ny alalan'ny fampiharana ny fanodinkodinana directional ny fikorianan'ny hanesorana morphogen antagonists avy amin'ny basolateral compartment.Ny fomba andrana iray manontolo (sary 1) dia ahitana ampahany dimy: (i) microfabrication ny tsinay chip na Transwell insertable hybrid chip (dingana 1-5; Box test fanomanana ny cellule 1-5; (sela Caco-2) na organoïde intestinal olombelona; boaty 2-5), (iii) kolontsaina sela epithelial intestinal amin'ny chips intestinal na chips hybride (dingana 6-9), (iv) induction ny morphogenesis 3D in vitro (dingana 10) ary (v)) mba hamaritana ny microstructure 3D epithelial (dingana 11-24). vitro morphogenesis amin'ny fampitahana ny morphogenesis epithelial amin'ny fanaraha-maso ara-potoana, ara-nofo, fepetra, na fomba fiasa.
Nampiasa sehatra kolontsaina roa samihafa izahay: gut-on-a-chip misy fantsona mahitsy na fantsona tsy mitongilana tsy mitongilana, na chips hybrid misy fampidirana Transwell (TW) ao anaty fitaovana microfluidic, noforonina araka ny voalaza ao amin'ny Box 1, ary dingana 1 -5. organoids intestinal olombelona) sy ny fomba kolontsaina ampiasaina amin'ity protocole ity. "In vitro morphogenesis" dia mampiseho ny dingana ankapobeny izay ny Caco-2 na ny sela epithelial azo avy amin'ny organoid dia kolontsaina amin'ny chip intestinal na amin'ny fampidirana Transwell amin'ny chip hybrid, arahin'ny induction ny morphogenesis 3D ary ny fananganana rafitra epithelial miavaka iray. Ny sosona epithelial intestinal dia azo ampiasaina, ohatra, amin'ny famaritana ny fanavakavahana sela, ny fandalinana ny physiologie ny tsinay, ny fametrahana ny tontolo iainana micro-mikrobioma, ary ny modeling aretina. Ny sela goblet sy ny mucus miafina avy amin'ny moka. coli maneho proteinina fluorescent maitso (GFP) miaraka amin'ny sela epithelial 3D Caco-2 microengineer. miaraka amin'ny antigène bakteria (ohatra, lipopolysaccharide, LPS) sy cellules immune (ohatra, PBMC; maitso) .Ny sela Caco-2 dia novolavolaina mba hananganana sosona epithelial 3D. Scale bar, 50 µm. Sary eo amin'ny laharana ambany: "Differentiation of cell" adjustment with permission from reference.2. Oxford University Press; Naverina naverina nahazoana alalana avy amin'ny Ref.5. NAS; "Host-Microbe Co-Culture" namboarina nahazoana alalana avy amin'ny ref.3. NAS; “Modely Aretina” namboarina nahazoana alalana avy amin'ny reference.5. NAS.
Ny gut-on-chip sy ny hybrid chips dia noforonina tamin'ny fampiasana kopia PDMS izay nopotehina tamin'ny lasitra silisiôma tamin'ny alàlan'ny lithography malefaka1,44 ary namboarina tamin'ny SU-8. microchannels mahitsy mifanandrify mifanandrify, dia nivoatra ho gut-on-a-chip sarotra (Data Extended Fig. 1b) izay ahitana fantsona bitika miolikolika roa mba hamporisihana ny fitomboan'ny fotoana ipetrahan'ny ranon-javatra, ny lamina tsy mikoriana, ary ny fiovan'ny multiaxial amin'ny sela kolontsaina (sary 2a-f) mila sarotra kokoa ny biomechanika. Ny gut-on-a-chips dia azo fidina. Nasehonay fa ny Gut-Chip mikorontana koa dia mampirisika mafy ny morphogenesis 3D amin'ny fe-potoana mitovy amin'ny fitomboan'ny epithelial mitovy amin'ny Gut-Chip tany am-boalohany, na inona na inona karazana sela kolontsaina. Ny modely SU-8 dia nanome endri-javatra ratsy taorian'ny demolding (sary 2a). Mba hamoronana ny tsinay amin'ny chip, ny sosona PDMS ambony voaomana dia nafatony tamin'ny sarimihetsika PDMS porous ary avy eo dia nifanaraka tamin'ny sosona PDMS ambany tamin'ny alàlan'ny fatorana tsy azo ovaina amin'ny fampiasana corona treater (sary 2b-f). izay afaka mametraka ny fampidirana Transwell (sary 2h sy Data Extended Fig. 2). Ny fizotran'ny fatorana dia atao amin'ny fikarakarana ny tampon'ny replica PDMS sy ny vera miaraka amin'ny plasma oksizenina na ny fitsaboana corona. Taorian'ny sterilization ny fitaovana microfabricated mifatotra amin'ny fantsona silicone, dia vonona ny fametrahana ny fitaovana 3D morphlogenesis epithelium intestinagogenesis.
a, Skema fanoharana momba ny fanomanana ny ampahany PDMS avy SU-8 lasitra silisiôma modely. Ny vahaolana PDMS tsy voatsabo dia nararaka tamin'ny lasitra silisiôma (ankavia), sitrana tamin'ny 60 ° C (afovoany) ary nopotehina (ankavanana). manamboatra ny PDMS porous membrane.d, Sarin'ny sarin'ny singa PDMS ambony sy ambany ary ny fitaovana tsinay mivondrona amin'ny chip.e, Schematic ny fampifanarahana ny singa ambony, membrane ary ambany PDMS. Ny sosona tsirairay dia mifamatotra amin'ny plasma na fitsaboana corona. chambers.g, Fametrahana ny gut-on-a-chip ho an'ny kolontsain'ny sela microfluidic.Ny tsinay namboarina tamin'ny puce nivory niaraka tamin'ny fantsona silikônina sy ny syringe dia napetraka teo amin'ny fonony. Ny fitaovana chip dia napetraka teo amin'ny fonon'ny lovia Petri 150 mm ho an'ny fanodinana. Ny kolontsaina 2D monolayers amin'ny sela epithelial intestinal dia nampidirina tao amin'ny puce hybride mba hamporisihana ny morphogenesis 3D amin'ny tsinay. Ny medium dia miparitaka amin'ny alàlan'ny microchannels eo ambanin'ny soson'ny sela napetraka amin'ny fampidirana Transwell.Scale bar, 1 cm.h Naverina nahazoana alalana avy amin'ny reference.4. Elsevier.
Ao anatin'ity protocol ity, ny tsipika sela Caco-2 sy ny organoids amin'ny tsinay dia nampiasaina ho loharanon'ny epithelial (sary 3a). 10 sy 50) ao amin'ny T-tavoahangy dia alaina mba hanomanana ny fampiatoana sela misaraka amin'ny ranon-tsavony trypsinization (boaty 2) R-spondin, ary Noggin) ary ny fitomboan'ny fitomboana voaomana araka ny voalaza ao amin'ny Box 3 dia nampiana isan'andro mandra-pahatongan'ny organoids hatramin'ny ~ 500 µm amin'ny savaivony. Ny organoids efa lehibe dia alaina ary misaraka amin'ny sela tokana ho an'ny famafazana amin'ny tsinay na ny fampidirana Transwell amin'ny chip (Boaty 5). colitis, aretin'i Crohn, kanseran'ny koloro, na mpanome ara-dalàna), toerana misy ratra (ohatra, lesion versus faritra tsy misy ratra) ary ny toerana misy ny gastrointestinal ao amin'ny taratasy mivalona (ohatra, duodenum, jejunum, ileum, cecum, colon, na rectum). organoids.
a, Workflow ho an'ny induction ny morphogenesis tsinay ao amin'ny tsinay chip.Caco-2 tsinain'ny olombelona epithelial sy ny tsinay organoids dia ampiasaina amin'ity protocole ity mba hanehoana ny 3D morphogenesis. Ireo sela epithelial mitoka-monina dia voafafy ao amin'ny fitaovana gut-on-a-chip efa voaomana (fiomanana chip). (D0), ny fikorianan'ny apical (AP) dia atomboka sy voatazona mandritra ny 2 andro voalohany (flow, AP, D0-D2). Ny fikorianan'ny Basolateral (BL) koa dia atomboka miaraka amin'ny fihetsiketsehana manenjana cyclic (mihintsana, mikoriana, AP ary BL) rehefa misy monolayer 2D feno. morphologie solontenan'ny sela Caco-2 isaky ny dingana andrana na teboka (sary bar, 100 µm). Diagrame schematic efatra mampiseho ny cascades mifanaraka amin'ny morphogenesis tsinay (ambony havanana). (boaty fotsy fotsy) dia mampiseho ny microvilli regenerated amin'ny sosona 3D Caco-2 (ankavanana). Asehoy ny toerana misy ny fiaramanidina ifotony ho an'ny fomba fijery confocal tsirairay. sary immunofluorescence mampiseho marika ho an'ny sela stem (LGR5; magenta), sela goblet (MUC2; maitso), F-actin (volomparasy) ary ny nuclei (cyan) mitombo amin'ny tsinay chips mandritra ny 3 andro, tsirairay avy (Ankavia) ary 13 andro (afovoany) organoids amin'ny epithelial layer. signaling.Fluorescence sary mampiseho ny epithelial microstructure (ankavanana) ny 3D organoid épithélium napetraka ao amin'ny tsinay amin'ny chip amin'ny alalan'ny fandotoana ny plasma membrane amin'ny CellMask loko (ankavanana) amin'ny andro 13 ny kolontsaina. Scale bar dia 50 μm raha tsy misy fanamarihana hafa.b Naverina navoaka nahazo alalana avy amin'ny reference.2. Oxford University Press; c Namboarina nahazoana alalana avy amin'ny Reference.2. Oxford University Press; e sy f namboarina nahazoana alalana tamin'ny fanondroana.12 eo ambanin'ny lisansa Creative Commons CC BY 4.0.
Ao amin'ny tsinay amin'ny chip dia ilaina ny manova ny hydrophobic surface amin'ny PDMS porous membrane ho an'ny ECM coating mahomby. Amin'ity protocol ity dia mampihatra fomba roa samihafa izahay hanovana ny hydrophobicity ny membranes PDMS. Na izany aza, ny kolontsaina microfluidic amin'ny epithelium organoid dia mitaky fampihetseham-batana mifototra amin'ny simika mba hahatratrarana ny fametrahana ny proteinina ECM amin'ny alàlan'ny fampiharana ny polyethyleneimine (PEI) sy ny glutaraldehyde amin'ny PDMS microchannels. mifamatotra, ny kolontsaina sela microfluidic dia manomboka amin'ny alalan'ny perfusing afa-tsy ny mpanelanelana amin'ny mpanelanelana amin'ny microchannel ambony mandra-mamorona ny sela monolayer tanteraka, raha ny ambany ambany microchannel mihazona static fepetra.
Ny kolontsaina Transwell koa dia mitaky ny fanosotra ECM alohan'ny famafazana sela; Na izany aza, ny kolontsaina Transwell dia tsy mitaky dingana mialoha ny fitsaboana sarotra mba hampavitrika ny endrik'ireo inserts porous.Ho an'ny fitomboan'ny sela Caco-2 amin'ny fampidirana Transwell, ny coating ECM amin'ny fampidirana porous dia manafaingana ny fametahana ny sela Caco-2 misaraka (<1 ora) ary ny fananganana sakana amin'ny junction (<1-2 andro). Fampidirana mifono ECM, mipetaka amin'ny fonon'ny membrane (<3 h) ary tazomina mandra-pahatongan'ny organoids mamorona monolayer feno miaraka amin'ny fahamendrehana sakana .Ny kolontsaina Transwell dia atao amin'ny takelaka 24-lavaka tsy misy fampiasana chips hybrid.
Ny morphogenesis in vitro 3D dia azo atomboka amin'ny fampiharana ny fikorianan'ny fluid amin'ny lafiny basolateral amin'ny sosona epithelial napetraka. Ao amin'ny tsinay amin'ny chip iray, dia nanomboka ny morphogenesis epithelial rehefa nipoitra tao amin'ny microchannels ambony sy ambany ny medium (sary 3a). Mba hanomezana otrikaina sy serum ampy ho an'ny sela mifatotra amin'ny fonon'ny porous ary miteraka adin-tsaina amin'ny luminal, dia matetika isika no mampihatra ny fikorianan'ny roa ao amin'ny tsinay amin'ny chip. Ao amin'ny chips hybrid, ny fampidirana Transwell misy monolayers epithelial dia natsofoka tao amin'ny chips hybrid. ny fikorianan'ny basolateral amin'ny sehatra kolontsaina roa.
Ny endri-javatra morphological amin'ny microengineered 3D epithelial layers dia azo dinihina amin'ny fampiharana fomba imaging isan-karazany, anisan'izany ny microscopy phase contrast, microscopy difference interference contrast (DIC), SEM, na immunofluorescence confocal microscopy (sary 3 sy 4) . layers.Noho ny mangarahara optique ny PDMS sy ny sarimihetsika polyester, na ny tsinay-on-a-chip sy ny hybrid chip sehatra dia afaka manome tena-fotoana in situ imaging tsy mila ny sectioning na disassembly ny fitaovana. Rehefa manao immunofluorescence imaging (sary 1, 3c, f sy 4b, c), sela dia paratypely 4b, c) (PFA), arahin'ny Triton X-100 sy 2% (wt/vol)) bovine serum albumin (BSA), araka ny filaharany. Miankina amin'ny karazana sela dia azo ampiasaina ny fixatives, permeabilizers ary ny fanakanana. (ohatra, 4′, 6-diamidino-2-phenylene) indole, DAPI) na F-actin (ohatra, phalloidin misy marika fluorescently). Ny sary mivantana mifototra amin'ny fluorescence dia azo atao amin'ny toerana ihany koa mba hamantarana ny famokarana mucus (sary 1, "Differentiation cell" ary "Gut physiology"), ny fanjanahan-tany mikraoba (Fig. co-culture"), ny fandraisana ny sela immune (sary 1, 'Modely aretina') na ny contours ny 3D epithelial morphology (sary 3c, f ary 4b, c). Rehefa manova ny tsinay eo amin'ny chip mba hanasaraka ny sosona ambony amin'ny ambany microchannel sosona, araka ny voalaza ao amin'ny ref.Araka ny aseho ao amin'ny sary 3D evillimorphology tsara. Ny sisin'ny borosy apical dia azo jerena amin'ny SEM (sary 3b). Ny fanehoana ny marika fanavakavahana dia azo tombanana amin'ny fanaovana quantitative PCR5 na sequencing RNA sela tokana. Amin'ity tranga ity, ny sosona 3D amin'ny sela epithelial mitombo ao amin'ny chips tsinay na ny chips hybrid dia alaina amin'ny trypsinization ary avy eo ampiasaina amin'ny fanadihadiana molekiola na génétique.
a, Workflow ho an'ny induction ny tsinay morphogenesis amin'ny hybrid chip.Caco-2 sy tsinay organoids dia ampiasaina amin'ity protocole ity mba hanehoana 3D morphogenesis amin'ny hybride chip sehatra. Dissociated epithelial sela dia voafafy ao amin'ny voaomana Transwell inserts (TW prep; jereo ny sary etsy ambany) . Raha vao ny sela dia voafafy (voafafy) ary niraikitra tao ambanin'ny kolontsaina Transwell rehetra ao amin'ny cellules. fepetra (kolontsaina TW) .Taorian'ny andro 7, ny fampidirana Transwell tokana misy monolayer 2D amin'ny sela epithelial dia nampidirina tao anaty puce hybride mba hampidirana fikorianan'ny basolateral (Flow, BL), izay nitarika ho amin'ny famoronana sosona epithelial 3D (morphogenesis) . dingana andrana na teboka fotoana.Ny skematika eo amin'ny sosona ambony dia mampiseho ny fanamafisam-panandramana isaky ny dingana.b, Ny chips Hybrid (skema ankavia) dia mety hitarika amin'ny morphogenesis 3D amin'ny sela epithelial organoïde miaraka amin'ny fijery mikroskopika confocal ambony midina amin'ny toeran'ny Z samihafa (ambony, afovoany ary ambany; jereo ny tsipika havanana sy teboka mifanandrify). nampiseho toetra morphological mazava. F-actin (cyan), nucleus (voankazo).c, Fluorescence confocal micrographs (3D zoro fijery) ny organoid-nalaina épithelial sela kolontsaina ao amin'ny static Transwell (TW; ampidirina ao anaty boaty fotsy) versus hybrid chip (lehibe indrindra tifitra feno) mampitaha 2D versus 3D morphology tsirairay avy amin'ny morphologie mitsangana. zoro havanana; “XZ”) dia mampiseho endri-javatra 2D sy 3D koa. Elsevier.
Ny fanaraha-maso dia azo omanina amin'ny alàlan'ny fambolena ireo sela mitovy (Caco-2 na sela epithelial organoid intestinal) ho monolayers roa dimensions eo ambanin'ny fepetra kolontsaina static mahazatra. ampitahaina.
Ny fizotry ny lithography malefaka dia tokony hatao ao amin'ny efitrano madio. Ho an'ny sosona tsirairay amin'ny puce (sosona ambony sy ambany ary membranes) ary poti hybrid, dia nampiasaina ny saron-tava samihafa ary natao tamin'ny wafers silisiôma samihafa satria ny haavon'ny microchannels dia samy hafa. 200 µm.
Apetraho ao anaty lovia misy acetone ny wafer silisiôma 3-inch. Ahodina moramora ny takelaka mandritra ny 30 segondra, avy eo maina amin'ny rivotra ny wafer. Afindrao amin'ny takelaka misy IPA ny wafer, dia mihodina ny takelaka mandritra ny 30 s mba hodiovina.
Ny vahaolana piranha (fangaroana ny peroxyde hydrogène sy ny asidra solifara mivondrona, 1: 3 (vol/vol)) dia azo ampiasaina mba hanamafisana ny fanesorana ny sisa tavela amin'ny tavy silisiôma.
Ny vahaolana Piranha dia tena manimba ary miteraka hafanana. Ilaina ny fitandremana fanampiny. Raha ny fanariana fako dia avelao ny vahaolana hampangatsiatsiaka ary afindra any amin'ny fitoeran-javatra madio sy maina. Mampiasà kaontenera faharoa ary asio marika tsara ny fitoeran-javatra fako. Araho azafady ny torolàlana momba ny fiarovana ny trano ho an'ny fomba fiasa amin'ny antsipiriany bebe kokoa.
Atsaharo ny ranom-boasary amin'ny alàlan'ny fametrahana azy ireo eo amin'ny takelaka mafana 200 ° C mandritra ny 10 minitra. Taorian'ny tsy fahampian-drano, dia nihozongozona in-dimy tamin'ny rivotra ny wafer mba hampangatsiaka.
Araraka ~10 g ny photoresist SU-8 2100 eo afovoan'ny wafer silisiôma voadio. Mampiasà tweezers mba hanaparitahana ny photoresist mitovy amin'ny wafer.Apetraho amin'ny takelaka mafana 65°C indraindray ny wafer mba hahatonga ny photoresist tsy hipetaka sy ho mora kokoa ny hiparitaka. Aza apetraka mivantana eo amin'ny takelaka mafana ny wafer.
Ny SU-8 dia nozaraina mitovy amin'ny wafer tamin'ny alàlan'ny fametahana spin coating. Fandaharana fihodinana miditra amin'ny SU-8 mandritra ny 5-10 s mba hiparitaka amin'ny 500 rpm amin'ny hafainganam-pandeha 100 rpm / s. Haavo µm ho an'ny sosona ambony amin'ny tsinay eo amin'ny puce; jereo ny “Diesy kritika” etsy ambany) napetraka amin'ny hafainganam-pandeha 300 rpm/s 30 segondra amin'ny 1.200 rpm.
Ny hafainganam-pandehan'ny fihodinana lehibe dia azo amboarina araka ny hatevin'ny lasibatra SU-8 amin'ny wafer silisiôma.
Mba hamoronana modely SU-8 amin'ny haavon'ny 500 µm ho an'ny sosona ambony amin'ny tsinay eo amin'ny chip, dia naverina nisesy (jereo ny dingana 9) ny fametahana kofehy sy ny dingan'ny mofo malefaka amin'ity Boaty ity (dingana 7 sy 8) mba hamokatra roa sosona 250 µm Sosona matevina SU-8, izay azo apetraka ao anaty boaty 10 µm, izay azo atambatra amin'ny 10 µm. avo.
Mofomamy malefaka ny wafera mifono SU-8 amin'ny fametrahana amim-pitandremana ny wafers eo amin'ny takelaka mafana amin'ny 65 ° C mandritra ny 5 minitra, avy eo avereno amin'ny 95 ° C ny hafanana ary atsangano mandritra ny 40 minitra fanampiny.
Mba hahazoana haavo 500 μm amin'ny lamina SU-8 ao amin'ny microchannel ambony, avereno ny dingana 7 sy 8 mba hamoronana sosona roa SU-8 matevina 250 μm.
Amin'ny fampiasana ny UV Mask Aligner, manaova andrana jiro araka ny torolalan'ny mpanamboatra kajy ny fotoana fiposahan'ny ovy.
Aorian'ny famaritana ny fotoana fiposahan'ny masoandro dia apetraho eo amin'ny fitoeran'ny saron-tava amin'ny aligner saron-tava UV ny saron-tava ary apetraho eo amin'ny wafer mifono SU-8 ny saron-tava.
Apetraho mivantana eo amin'ny lafin'ny wafer silisiôma ny saron-tava vita pirinty mba hampihenana ny fiparitahan'ny UV.
Asehoy mitsangana amin'ny 260 mJ/cm2 amin'ny hazavana UV ny wafer mifono SU-8 sy ny saron-tsary mipetaka amin'ny fotoana voatondro mialoha (jereo ny dingana faha-10 amin'ity boaty ity).
Taorian'ny fiposahan'ny UV, ny wafers silisiôma vita amin'ny SU-8 dia nendasina tamin'ny 65 ° C nandritra ny 5 min ary 95 ° C nandritra ny 15 min teo amin'ny takelaka mafana tsirairay mba hamoronana lamina miaraka amin'ny haavon'ny 200 μm. Halavany ny fotoana aorian'ny fandoroana amin'ny 95 ° C hatramin'ny 30 min mba hamoronana modely amin'ny haavon'ny 500 µm.
Arotsaka ao anaty vilia vera ny developer, ary apetraka ao anaty lovia ilay wafer nendasina. Mety hiovaova arakaraka ny haben'ny takelaka fitaratra ny habetsaky ny developer SU-8. Ataovy azo antoka fa mampiasa developer SU-8 ampy mba hanesorana tanteraka ny SU-8 tsy hita.
Kobanina miaraka amin'ny ~10 mL amin'ny developer vaovao ny lasitra efa novolavolaina arahin'ny IPA amin'ny famafazana ny vahaolana amin'ny alalan'ny pipette.
Apetraho ao anaty mpanadio plasma ny wafer ary apetaho amin'ny plasma oksizenina (gazy atmosfera, tsindry kendrena 1 × 10−5 Torr, hery 125 W) mandritra ny 1,5 min.
Apetraho amin'ny desiccator vacuum ny wafer miaraka amin'ny fitaratra fitaratra ao anatiny.Azo apetraka mifanila ny wafers sy ny slides.Raha zaraina ho sosona maromaro ny desiccator vacuum amin'ny takelaka, dia apetraho ao amin'ny efitrano ambany kokoa ny slides ary ao amin'ny efitrano ambony ny wafers. Alefaso 100 μL ny trichloro (1H, 1H, 2H-2H, lids solution) amin'ny vahaolana vera. vacuum ho an'ny silanization.
Atsofohy ao anaty rano fandroana 37°C ny vilia misy sela Caco-2 mangatsiaka, avy eo afindrao ao anaty tavoahangy T75 misy 15 mL amin'ny 37°C efa nafanaina mialoha ireo sela ireo.
Mba handefasana ny sela Caco-2 amin'ny ~90% confluency, voalohany mafana Caco-2 medium, PBS, ary 0.25% trypsin/1 mM EDTA ao anaty rano fandroana 37°C.
Sasao amin'ny alàlan'ny aspiraka ny fitaovana. Sasao indroa miaraka amin'ny PBS mafana 5 mL amin'ny alàlan'ny famerimberenana ny aspiration vacuum ary ampiana PBS vaovao.