Misaotra anao nitsidika ny Nature.com.Mampiasa kinova mpitety tranonkala manana fanohanana CSS voafetra ianao.Mba hahazoana traikefa tsara indrindra, manoro hevitra anao izahay hampiasa navigateur nohavaozina (na esory ny Compatibility Mode amin'ny Internet Explorer).Ho fanampin'izany, mba hiantohana ny fanohanana mitohy, dia asehoy ny tranokala tsy misy fomba sy JavaScript.
Mampiseho carousel misy sary telo indray mandeha.Ampiasao ny bokotra teo aloha sy manaraka mba hivezivezena amin'ny slides telo amin'ny fotoana iray, na ampiasao ny bokotra slider amin'ny farany mba hivezivezena amin'ny slides telo isaky ny mandeha.
Ny sakana amin'ny ati-doha sy ny sakana amin'ny ati-doha dia manakana ny biotherapeutic agents tsy hahatratra ny tanjony ao amin'ny rafi-pitatitra foibe, ka manakana ny fitsaboana mahomby amin'ny aretina neurolojia.Mba hahitana ireo mpitatitra atidoha vaovao ao amin'ny vivo, dia nampiditra tranomboky peptide T7 phage izahay ary nanangona ra sy fluid cerebrospinal (CSF) tamin'ny alàlan'ny modely dobo lehibe misy voalavo voalavo.Ny clones phage manokana dia nanankarena be tao amin'ny CSF taorian'ny fihodinana efatra nisafidianana.Ny fitsapana ny peptides kandidà tsirairay dia nanambara fampitomboana mihoatra ny 1000 heny ao amin'ny CSF.Ny bioactivity amin'ny fandefasana peptide-mediated mankany amin'ny atidoha dia nohamafisin'ny fihenan'ny 40% amin'ny haavon'ny amyloid-β ao amin'ny fluid cerebrospinal amin'ny fampiasana peptide inhibitor BACE1 mifandray amin'ny peptide transit vaovao fantatra.Ireo vokatra ireo dia manoro hevitra fa ny peptides voamariky ny fomba fisafidianana in vivo phage dia mety ho fiara ilaina amin'ny fandefasana ny macromolecules amin'ny ati-doha misy fiantraikany ara-pahasalamana.
Ny fikarohana momba ny fitsaboana mikendry ny rafi-pitatitra foibe (CNS) dia nifantoka betsaka tamin'ny famantarana ny zava-mahadomelina sy ny mpiasan'ny optimized izay mampiseho toetra mikendry ny CNS, miaraka amin'ny ezaka kely kokoa amin'ny fitadiavana ireo mekanika izay mitondra fanafody mavitrika mankany amin'ny atidoha.Manomboka miova izany ankehitriny satria ny fandefasana zava-mahadomelina, indrindra ny molekiola lehibe, dia ampahany manan-danja amin'ny fivoaran'ny neuroscience maoderina.Ny tontolon'ny rafi-pitatitra foibe dia voaaro tsara amin'ny rafitra sakana cerebrovascular, misy ny sakana amin'ny ati-doha (BBB) ​​​​ary ny sakana amin'ny ati-doha (BCBB)1, ka mahatonga azy ho sarotra ny mandefa zava-mahadomelina amin'ny atidoha1,2.Tombanana fa saika ny zava-mahadomelina molekiola lehibe rehetra ary mihoatra ny 98% amin'ny zava-mahadomelina molekiola kely dia nesorina tao amin'ny atidoha3.Izany no antony maha-zava-dehibe ny mamantatra ny rafi-pitaterana atidoha vaovao izay manome fanafody fitsaboana mahomby sy manokana amin'ny CNS 4,5.Na izany aza, ny BBB sy ny BCSFB dia manolotra fotoana tsara ho an'ny fanaterana zava-mahadomelina rehefa miditra sy miditra amin'ny rafitry ny atidoha amin'ny alàlan'ny vasculature midadasika.Noho izany, ny ezaka amin'izao fotoana izao amin'ny fampiasana fomba tsy misy invasive amin'ny fandefasana any amin'ny atidoha dia mifototra indrindra amin'ny fomba fiasan'ny transport-mediated transport (PMT) amin'ny fampiasana ny endogenous BBB6 receptor.Na dia eo aza ny fandrosoana lehibe vao haingana amin'ny fampiasana ny lalan'ny receptor transferrin7,8, dia ilaina ny fampandrosoana bebe kokoa ny rafitra fanaterana vaovao miaraka amin'ny fananana nohatsaraina.Ho an'ity tanjona ity, ny tanjonay dia ny hamantatra ny peptides afaka manelanelana ny fitaterana CSF, satria azo ampiasaina amin'ny famoahana macromolecules amin'ny CNS izy ireo na hanokatra lalana vaovao.Indrindra indrindra, ireo mpandray sy mpitatitra manokana amin'ny rafitra cerebrovascular (BBB sy BSCFB) dia mety ho tanjona mety ho an'ny fandefasana mavitrika sy manokana amin'ny fanafody biotherapeutic.Ny fluid cerebrospinal (CSF) dia vokatra miafina ao amin'ny choroid plexus (CS) ary mifandray mivantana amin'ny fluid interstitial amin'ny atidoha amin'ny alàlan'ny habaka subarachnoid sy ventricular space4.Vao haingana no naseho fa ny fluid cerebrospinal subarachnoid dia miparitaka be loatra ao amin'ny interstitium amin'ny atidoha9.Manantena izahay fa hiditra amin'ny habaka parenchymal amin'ny alàlan'ity trakta fampidirana subarachnoid ity na mivantana amin'ny alàlan'ny BBB.Mba hahatratrarana izany, dia nampihatra paikadin'ny fifantenana vivo phage matanjaka izahay izay mamaritra tsara ny peptides entina amin'ny iray amin'ireo lalana roa miavaka ireo.
Izahay izao dia mamaritra ny fomba famandrihana amin'ny vivo phage miaraka amin'ny santionan'ny CSF miaraka amin'ny sequencing avo lenta (HTS) hanaraha-maso ny fihodinana voalohany miaraka amin'ny fahasamihafan'ny tranomboky avo indrindra.Ny fitiliana dia natao tamin'ny voalavo tonga saina miaraka amin'ny cannula cisterna (CM) apetraka maharitra mba hisorohana ny fandotoana ny rà.Ny tena zava-dehibe, ity fomba ity dia mifantina ny ati-doha sy ny peptides miaraka amin'ny hetsika fitaterana manerana ny sakana cerebrovascular.Nampiasa T7 phages izahay noho ny habeny kely (~ 60 nm) 10 ary nanolo-kevitra fa mety amin'ny fitaterana ny vesicles izay mamela ny fiampitana transcellular amin'ny sakana endothelial sy / na epithelial-medulla.Taorian'ny fihodinana efatra, dia nitoka-monina ny mponina phage izay mampiseho ny fanamafisana ny CSF amin'ny vivo sy ny fikambanan'ny microvessel cerebral.Ny tena zava-dehibe dia afaka nanamarina ny zavatra hitanay izahay tamin'ny fanehoana fa ny peptides kandida tsara indrindra novokarina sy simika dia afaka mitondra entana proteinina ao amin'ny fluid cerebrospinal.Voalohany, ny fiantraikan'ny pharmacodynamic amin'ny CNS dia natsangana tamin'ny fampifangaroana ny peptide transit iray miaraka amin'ny inhibitor ny peptide BACE1.Ho fanampin'ny fanehoana fa ny paikadin'ny screening amin'ny vivo dia afaka mamantatra ny peptides fitaterana ati-doha vaovao ho mpitatitra entana proteinina mahomby, manantena izahay fa ho lasa zava-dehibe ihany koa ny fomba fifantenana fiasa mitovy amin'ny famantarana ny lalan'ny fitaterana atidoha.
Miorina amin'ny singa mamorona takelaka (PFU), taorian'ny dingana famonosana phage, dia nisy tranomboky misy peptides 12-mer linear T7 phage 12-mer izay misy fahasamihafana eo amin'ny 109 eo ho eo no noforonina (jereo ny fitaovana sy ny fomba).Zava-dehibe ny manamarika fa nandinika tsara ity tranomboky ity izahay talohan'ny in vivo panning.Ny fanamafisan'ny PCR ny santionan'ny tranomboky phage amin'ny fampiasana primer novana dia niteraka amplicons izay azo ampiharina mivantana amin'ny HTS (sary fanampiny 1a).Noho ny a) HTS11 sequencing fahadisoana, b) fiantraikany amin'ny kalitaon'ny primers (NNK) 1-12, ary c) ny fisian'ny wild-type (wt) phage (skeleton inserts) ao amin'ny fitehirizam-boky standby, ny fomba fanivanana filaharana dia nampiharina mba hanesorana ny fampahalalam-baovao voamarina (fanampiny sary 1b).Ireo dingana sivana ireo dia mihatra amin'ny tranomboky filaharana HTS rehetra.Ho an'ny trano famakiam-boky mahazatra dia vakiana 233,868 no azo, ka ny 39% dia nandalo ny fepetra sivana ary nampiasaina ho an'ny famakafakana tranomboky sy fifantenana ho an'ny fihodinana manaraka (sary fanampiny 1c-e).Ny vakiteny dia betsaka indrindra amin'ny mpivady fototra 3 amin'ny halavany miaraka amin'ny tendrony amin'ny nucleotides 36 (sary fanampiny 1c), manamafy ny famolavolana tranomboky (NNK) 1-12.Marihina fa eo amin'ny 11% amin'ny mpikambana ao amin'ny tranomboky dia misy 12-dimensional-wild-type (wt) backbone PAGISRELVDKL, ary efa ho ny antsasaky ny filaharana (49%) dia misy fampidirana na famafana.Ny HTS ao amin'ny tranomboky famakiam-boky dia nanamafy ny fahasamihafan'ny peptides ao amin'ny tranomboky: mihoatra ny 81% ny fizotry ny peptide dia hita indray mandeha ary ny 1.5% ihany no nitranga tamin'ny ≥4 kopia (sary fanampiny 2a).Ny fatran'ny asidra amine (aa) amin'ny toerana 12 rehetra ao amin'ny repertoire dia mifamatotra tsara amin'ny matetika andrasana amin'ny isan'ny codons vokarin'ny repertoire NKK miharatsy (Fig. 2b fanampiny).Ny fatran'ny fatran'ny aa voarakitra ao anatin'ireo fampidirana ireo dia mifandray tsara amin'ny fatran'ny kajy (r = 0.893) (sary fanampiny 2c).Ny fanomanana ny trano famakiam-boky phage ho an'ny tsindrona dia ahitana ny dingana amin'ny fanamafisana sy ny fanesorana ny endotoxine.Izany dia naseho teo aloha fa mety hampihena ny fahasamihafan'ny tranomboky phage12,13.Noho izany, nandamina tranomboky phage nanamafy takelaka izahay izay nandalo ny fanesorana endotoxine ary nampitaha azy tamin'ny tranomboky tany am-boalohany mba hanombanana ny fatran'ny AA.Ny fifandraisana matanjaka (r = 0.995) dia voamarika teo anelanelan'ny dobo tany am-boalohany sy ny dobo nohamafisina sy voadio (Fig. 2d fanampiny), izay manondro fa ny fifaninanana eo amin'ny clones ampitomboina amin'ny takelaka mampiasa T7 phage dia tsy niteraka fitongilanana lehibe.Ity fampitahana ity dia mifototra amin'ny fatran'ny motif tripeptide ao amin'ny tranomboky tsirairay, satria ny fahasamihafan'ny tranomboky (~109) dia tsy azo alaina tanteraka na dia amin'ny HTS aza.Ny famakafakana matetika ny aa amin'ny toerana tsirairay dia naneho fitongilanana kely miankina amin'ny toerana amin'ny toerana telo farany amin'ny repertoire niditra (Fig. 2e fanampiny).Ho fehin-kevitra dia nanatsoaka hevitra izahay fa azo ekena ny kalitao sy ny fahasamihafan'ny tranomboky ary ny fiovana kely amin'ny fahasamihafana ihany no voamarika noho ny fanamafisana sy ny fanomanana ny tranomboky phage eo anelanelan'ny fihodinana maromaro.
Ny santionan'ny fluid cerebrospinal serial dia azo atao amin'ny alàlan'ny fametrahana cannula amin'ny CM amin'ny voalavo mahatsiaro tena mba hanamora ny famantarana ny T7 phage nampidirina intravenous (iv) amin'ny alàlan'ny BBB sy / na BCSFB (sary 1a-b).Nampiasa fitaovam-piadiana tsy miankina roa izahay (sandry A sy B) tamin'ny fihodinana telo voalohany tamin'ny fisafidianana in vivo (sary 1c).Nampitombo tsikelikely ny hamafin'ny fifantenana izahay tamin'ny fampihenana ny totalin'ny phage nampidirina tamin'ny fihodinana telo voalohany tamin'ny fifantenana.Ho an'ny fihodinana fahefatra, dia natambatray ny santionany avy amin'ny sampana A sy B ary nanao safidy mahaleo tena telo fanampiny.Mba handinihana ny toetran'ny vivo amin'ny poti-T7 phage amin'ity maodely ity, ny phage wild-type (PAGISRELVDKL master insert) dia natsindrona tamin'ny voalavo tamin'ny alàlan'ny rambony.Ny famerenana ny phages avy amin'ny fluid cerebrospinal sy ny ra amin'ny fotoana samy hafa dia nampiseho fa ny T7 icosahedral phages somary kely dia nanana dingana fivoahana haingana haingana avy amin'ny efitranon'ny rà (Fig. 3 fanampiny).Mifototra amin'ny titer nomena sy ny habetsahan'ny ràn'ny voalavo, dia kajy izahay fa eo amin'ny 1% eo ho eo ihany.phage avy amin'ny fatra nomena dia hita tao amin'ny ra 10 minitra taorian'ny fampidirana intravenous.Taorian'io fihenam-bidy haingana io dia norefesina ny fivoahana voalohany miadana kokoa miaraka amin'ny antsasaky ny fiainana 27.7 minitra.Ny zava-dehibe dia vitsy monja ny phages no nalaina tao amin'ny efitranon'ny CSF, izay manondro ny fiaviana ambany ho an'ny fifindran'ny phage wild-type ao amin'ny efitrano CSF ​​(sary fanampiny 3).Amin'ny ankapobeny, eo amin'ny 1 x 10-3% fotsiny ny titre T7 phage ao amin'ny ra ary 4 x 10-8% amin'ny phages voalohany no hita tao amin'ny fluid cerebrospinal nandritra ny vanim-potoana sampling (0-250 min).Marihina fa ny antsasaky ny fiainana (25.7 min) ny phage karazana bibidia ao amin'ny fluid cerebrospinal dia mitovy amin'ny hita ao amin'ny ra.Ireo angon-drakitra ireo dia mampiseho fa ny sakana manasaraka ny efitranon'ny CSF amin'ny ra dia tsy misy dikany amin'ny voalavo CM-cannulated, mamela ny fisafidianana ny tranomboky phage in vivo hamantatra ny klones izay mora entina avy amin'ny ra mankany amin'ny efitrano CSF.
(a) Fametrahana fomba iray hamerenana indray ny fluid cerebrospinal (CSF) avy amin'ny dobo lehibe iray.(b) Diagrama mampiseho ny toerana misy ny selan'ny sakana amin'ny rafi-pitatitra foibe (CNS) sy ny paikadin'ny fifantenana ampiasaina hamantarana ny peptides izay miampita ny sakana amin'ny ati-doha (BBB) ​​sy ny sakana amin'ny ati-doha.(c) In vivo phage fampisehoana screening flowchart.Isaky ny fihodinan'ny fifantenana, phages (famantarana biby ao anatin'ny zana-tsipìka) dia natsindrona tsindrona.Sampana hafa tsy miankina roa (A, B) no tazonina mitokana mandra-pahatongan'ny fihodinana faha-4 amin'ny fifantenana.Ho an'ny fihodinana 3 sy 4, ny clone phage tsirairay nalaina avy amin'ny CSF dia nofaritana tamin'ny tanana.(d) Kinetika ny phage mitoka-monina amin'ny rà (boribory mena) sy ny fluid cerebrospinal (triangolo maitso) mandritra ny fihodinana voalohany amin'ny fifantenana amin'ny voalavo roa voalavo taorian'ny fampidirana intravenous ny tranomboky peptide T7 (2 x 1012 phages / biby).Ny efamira manga dia manondro ny salan'isa voalohany amin'ny phage ao amin'ny ra, kajy amin'ny habetsahan'ny phage natsindrona, amin'ny fiheverana ny totalin'ny rà.Ny efamira mainty dia manondro ny teboka ifanenan'ny tsipika y nalaina avy amin'ny fatran'ny phage amin'ny rà.(e, f) Asehoy ny matetika sy ny fizarana ny motif tripeptide mifanipaka rehetra hita ao amin'ny peptide.Aseho ny isan'ny motif hita amin'ny vakiteny 1000.Misongadina (p <0.001) ny motifs manankarena dia voamarika amin'ny teboka mena.(e) Fifandraisana scatterplot mampitaha ny habetsan'ny motif tripeptide amin'ny tranomboky natsindrona miaraka amin'ny phage avy amin'ny ra avy amin'ny biby #1.1 sy #1.2.(f) Fifandraisana scatterplot mampitaha ny habetsan'ny biby phage tripeptide motifs #1.1 sy #1.2 mitoka-monina amin'ny rà sy ny fluid cerebrospinal.(g, h) Sequence ID fanehoana ny phage manankarena amin'ny rà (g) mifanohitra amin'ny tranomboky natsindrona sy ny phage manankarena amin'ny CSF (h) mifanohitra amin'ny rà taorian'ny fihodinana fifantenana in vivo amin'ny biby roa.Ny haben'ny kaody litera iray dia manondro hoe impiry ny fisian'io asidra amino io eo amin'io toerana io.Maitso = polar, volomparasy = neutre, manga = fototra, mena = asidra ary mainty = asidra amine hydrophobic.Ny sary 1a, b dia novolavolaina sy novokarin'i Eduard Urich.
Nasiana tranomboky peptide phage ho voalavo fitaovana CM roa (clades A sy B) ary phage mitoka-monina avy amin'ny fluid cerebrospinal sy ra (sary 1d).Ny fivoahana haingana voalohany amin'ny tranomboky dia tsy dia nambara loatra raha oharina amin'ny phage karazana.Ny antsasaky ny androm-piainan'ny tranomboky voatsindrona ao amin'ireo biby roa ireo dia 24.8 minitra amin'ny rà, mitovy amin'ny karazana phage, ary 38.5 minitra ao amin'ny CSF.Ny ra sy ny fluid cerebrospinal santionany phage avy amin'ny biby tsirairay dia niharan'ny HTS ary ny peptides rehetra fantatra dia nodinihina noho ny fisian'ny motif tripeptide fohy.Ny motifs tripeptide dia nofinidy satria manome fototra kely indrindra amin'ny fananganana rafitra sy ny fifandraisana amin'ny peptide-protein14,15.Nahita fifamatorana tsara izahay tamin'ny fizarana motifs teo amin'ny tranomboky phage voatsindrona sy ny clones nalaina tamin'ny ran'ny biby roa (sary 1e).Ny angon-drakitra dia manondro fa ny firafitry ny trano famakiam-boky dia manankarena kely fotsiny ao amin'ny efitranon'ny rà.Ny fatran'ny asidra amino sy ny filaharana marimaritra iraisana dia nodinihina bebe kokoa isaky ny toerana amin'ny fampiasana ny fampifanarahana amin'ny rindrambaiko Weblogo16.Mahaliana fa nahita fampitomboana mahery vaika ny sisa tavela amin'ny glycine ra (sary 1g).Rehefa nampitahaina tamin'ny clones voafantina avy amin'ny CSF ny ra, dia voamarika ny fifantenana matanjaka sy ny famotehana ny motif sasany (sary 1f), ary ny asidra amine sasany dia tsara indrindra amin'ny toerana efa voafaritra ao amin'ny mpikambana 12 (sary 1h).Marihina fa ny biby tsirairay dia samy hafa be amin'ny fluid cerebrospinal, fa ny fampitomboana ny glycine amin'ny rà dia voamarika amin'ny biby roa (Fig. 4a-j fanampiny).Taorian'ny fanivanana henjana ny angon-drakitra filaharana ao amin'ny fluid cerebrospinal ny biby # 1.1 sy # 1.2, dia nisy totalin'ny 964 sy 420 tsy manam-paharoa 12-mer peptides azo (fanampiny sary 1d-e).Nohamafisina ny clones phage mitoka-monina ary niharan'ny fifantenana in vivo fihodinana faharoa.Ny phage nalaina tamin'ny fihodinana faharoa dia niharan'ny HTS isaky ny biby ary ny peptides rehetra fantatra dia nampiasaina ho fampidirana amin'ny programa fanekena motif handinihana ny fisehoan'ny motif tripeptide (sary 2a, b, ef).Raha ampitahaina amin'ny tsingerina voalohany amin'ny phage azo avy amin'ny CSF, dia nahita fifantenana bebe kokoa sy famotsorana ireo motif maro ao amin'ny CSF amin'ny sampana A sy B (sary 2) izahay.Ny algorithm famantarana ny tambajotra dia nampiharina mba hamaritana raha maneho lamina samihafa amin'ny filaharana tsy miovaova izy ireo.Nisy fitoviana mazava hita teo amin'ny filaharana 12-dimensional nalain'ny CSF tamin'ny clade hafa A (sary 2c, d) sy ny clade B (sary 2g, h).Ny famakafakana natambatra tao amin'ny sampana tsirairay dia naneho ny mombamomba ny fifantenana samihafa ho an'ny peptides 12-mer (Fig. 5c, d) fanampiny ary ny fitomboan'ny tahan'ny CSF / blood titer rehefa mandeha ny fotoana ho an'ny clones mitambatra aorian'ny fihodinana faharoa amin'ny fifantenana raha oharina amin'ny fihodinana voalohany amin'ny fifantenana (Fig. 5e fanampiny).).
Fampitomboana ny motifs sy ny peptides amin'ny fluid cerebrospinal amin'ny fihodinana roa mifandimby amin'ny fisafidianana fampisehoana phage amin'ny vivo.
Ny phages fluid cerebrospinal rehetra azo avy amin'ny fihodinana voalohany amin'ny biby tsirairay (biby # 1.1 sy # 1.2) dia natambatra, nohamafisina, HT-sequenced ary nampidirina indray (2 x 1010 phages / biby) 2 SM cannulated rat (#1.1 → #).2.1 sy 2.2, 1.2 → 2.3 sy 2.4).(a, b, e, f) Ny fiparitahan'ny fifandraisana mampitaha ny fatran'ny tripeptide motifs amin'ny phages rehetra avy amin'ny CSF amin'ny fihodinana voalohany sy faharoa.Ny matetika sy ny fizarana motifs maneho ny tripeptides mifanipaka rehetra hita ao amin'ny peptides amin'ny orientation roa.Aseho ny isan'ny motif hita amin'ny vakiteny 1000.Asongadina amin'ny teboka mena ny motifs izay voafantina na nesorina tamin'ny iray amin'ireo tranomboky nampitahaina (p <0.001).(c, d, g, h) Sequence logo representation of all CSF-rich 12 amino acid sequence long sequence based on round 2 and 1 of in vivo selection.Ny haben'ny kaody litera iray dia manondro hoe impiry ny fisian'io asidra amino io eo amin'io toerana io.Mba hanehoana ny famantarana dia ampitahaina ny fatran'ny filaharan'ny CSF nalaina avy amin'ny biby tsirairay eo anelanelan'ny fihodinana fifantenana roa ary aseho ny filaharana manankarena amin'ny fihodinana faharoa: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 ary (h) #1.2–#2.4.Ny asidra amino manankarena indrindra amin'ny toerana nomena ao amin'ny (c, d) biby no.2.1 sy no.2.2 na (g, h) amin'ny biby no.2.3 sy no.2.4 dia aseho amin'ny loko.Maitso = polar, volomparasy = neutre, manga = fototra, mena = asidra ary mainty = asidra amine hydrophobic.
Taorian'ny fihodinana fahatelo tamin'ny fifantenana dia fantatray ny filaharan'ny peptide tokana 124 (#3.1 sy #3.2) avy amin'ny 332 CSF-reconstituted phage clones mitoka-monina amin'ny biby roa (Fig. 6a fanampiny).Ny filaharana LGSVS (18.7%) dia nanana ny ampahany ambony indrindra, arahin'ny karazana bibidia PAGISRELVDKL (8.2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2.2%), ary SARGSWREIVSLS (2.2%).Tamin'ny fihodinana fahefatra farany, nanangona sampana roa nofantenana tsy miankina avy amin'ny biby telo misaraka izahay (sary 1c).Amin'ireo clones phage 925 nalaina avy amin'ny CSF, tamin'ny fihodinana fahefatra dia nahita filaharan'ny peptide tokana 64 izahay (Fig.Ny clones CSF mahazatra indrindra amin'ny fihodinana fahefatra dia LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3.6%) ary RLSSVDSDLSGC (3, 2%).%)).Ny halavan'ny peptides voafantina dia noho ny fampidirana/famafana nucleotide na codons fiatoana aloha loatra ao amin'ny tranombokin'ny famakiam-boky rehefa mampiasa codon miharatsy ho an'ny famolavolana tranomboky NNK.Ny codons fiatoana aloha loatra dia miteraka peptides fohy kokoa ary voafantina satria misy motif aa tsara.Ny peptides lava kokoa dia mety ho vokatry ny fampidirana/famafana ao amin'ny voalohany amin'ny tranomboky synthetic.Izany dia mametraka ny codon fijanonana noforonina ivelan'ny frame ary mamaky azy mandra-pivoakan'ny codon fijanonana vaovao any ambany.Amin'ny ankapobeny, nanao kajy ny anton-javatra mampanankarena ho an'ny fihodinana fifantenana efatra izahay tamin'ny fampitahana ny angona fidirana amin'ny angon-drakitra vokatra santionany.Ho an'ny fihodinana voalohany amin'ny screening dia nampiasa titer phage karazana bibidia izahay ho fanondroana fototra tsy voafaritra.Mahaliana fa ny fifantenana phage ratsy dia tena natanjaka tamin'ny tsingerin'ny CSF voalohany, fa tsy tamin'ny rà (sary 3a), izay mety ho noho ny tsy fahampian'ny fiparitahan'ny passive an'ny ankamaroan'ny mpikambana ao amin'ny tranomboky peptide ao amin'ny efitranon'ny CSF na ny phages havanana dia mirona ho tazonina tsara kokoa na esorina amin'ny lalan-drà noho ny bacteriophages.Na izany aza, tamin'ny fihodinana faharoa amin'ny panning, ny fifantenana mafy ny phages ao amin'ny CSF dia voamarika tao amin'ny clades roa, nanoro hevitra fa ny fihodinana teo aloha dia nanan-karena tamin'ny phages mampiseho peptides izay mampiroborobo ny CSF uptake (sary 3a).Averina indray, tsy misy fampidiran-dra manan-danja.Tamin'ny fihodinana fahatelo sy fahefatra ihany koa, ny clones phage dia nanankarena be tao amin'ny CSF.Raha ampitahaina ny fatran'ny peptide tsy manam-paharoa tsirairay eo anelanelan'ny fihodinana roa farany amin'ny fifantenana, dia hitanay fa vao mainka nanankarena kokoa ny filaharana tamin'ny fihodinana fahefatra (sary 3b).Ny totalin'ny motif tripeptide 931 dia nalaina avy amin'ny filaharan'ny peptide tokana 64 mampiasa ny orientation peptide roa.Ny motif manankarena indrindra amin'ny fihodinana fahefatra dia nodinihina akaiky kokoa noho ny mombamomba ny fananan'izy ireo amin'ny fihodinana rehetra raha oharina amin'ny tranomboky natsindrona (tapa-doha: 10% enrichment) (Fig. 6c fanampiny).Ny lamina ankapobeny amin'ny fifantenana dia nampiseho fa ny ankamaroan'ny antony nianarana dia nanankarena tamin'ny fihodinana teo aloha tamin'ireo sampana fifantenana roa.Na izany aza, ny motif sasany (oh: SGL, VSG, LGS GSV) dia avy amin'ny clade hafa A, raha ny hafa (ohatra FGW, RTN, WGF, NTR) dia nanankarena tamin'ny clade B hafa.
Fanamarinana ny fitaterana CSF amin'ny peptides phage-nampiharihary ny CSF sy ny peptides mpitarika biotinylated mifamatotra amin'ny karama streptavidin.
(a) Ny taham-pampandrosoana nokajiana tamin'ny fihodinana efatra (R1-R4) mifototra amin'ny titer (input = I) phage (PFU) ary ny titer CSF phage (output = O).Ny lafin-javatra fanampiny ho an'ny fihodinana telo farany (R2-R4) dia nokajiana tamin'ny fampitahana tamin'ny fihodinana teo aloha sy ny fihodinana voalohany (R1) miaraka amin'ny angona lanja.Ny bara misokatra dia fluid cerebrospinal, ny bara misy alokaloka dia plasma.(***p<0.001, mifototra amin'ny fitsapa-t an'ny Mpianatra).(b) Lisitry ny peptides phage be dia be indrindra, voalahatra araka ny ampahan'izy ireo amin'ny phages rehetra nangonina tao amin'ny CSF taorian'ny fihodinana 4 tamin'ny fifantenana.Ny clones phage enina mahazatra indrindra dia asongadina amin'ny loko, ny isa ary ny fampitomboana azy ireo eo anelanelan'ny fihodinana 3 sy 4 amin'ny fifantenana (insets).(c, d) Ny clones phage enina manankarena indrindra, ny phage tsy misy na inona na inona ary ny tranomboky peptide phage ray aman-dreny avy amin'ny fihodinana 4 dia nodinihina tsirairay tao amin'ny maodely sampling CSF.Ny santionan'ny CSF sy ny ra dia nangonina tamin'ny fotoana voatondro.(c) Klone phage kandida 6 mitovy (2 x 1010 phages/biby), phages tsy misy na inona na inona (#1779) (2 x 1010 phages/biby) ary trano famakiam-boky phage phage (2 x 1012 phages/biby) Atsindrona farafahakeliny 3 CM amin'ny rambony ny biby.Ny pharmacokinetics CSF amin'ny clone phage tsirairay sy ny tranomboky peptide phage tsirairay dia aseho.(d) mampiseho ny salan'isa CSF/ra ho an'ny phages/mL sitrana rehetra nandritra ny fotoana nanaovana santionany.(e) Ny peptides mpitarika synthetic efatra ary ny fanaraha-maso iray voafandrika dia mifamatotra amin'ny biotin amin'ny streptavidin amin'ny alàlan'ny N-terminus (fampisehoana tetramer) arahin'ny tsindrona (vein rambo iv, 10 mg streptavidin / kg).Farafahakeliny voalavo intubated telo (N = 3).).Ny santionan'ny CSF dia nangonina tamin'ny fotoana voatondro ary ny fatran'ny streptavidin dia norefesiny tamin'ny CSF anti-streptavidin ELISA (nd = tsy hita).(* p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001, mifototra amin'ny fitsapana ANOVA).(f) Fampitahana ny filaharan'ny asidra amine amin'ny clone peptide phage manankarena indrindra #2002 (volomparasy) miaraka amin'ny clones peptide phage hafa voafantina avy amin'ny fihodinana faha-4 amin'ny fifantenana.Ny sombiny asidra amino mitovy sy mitovy dia misy loko.
Amin'ireo phages manankarena rehetra amin'ny fihodinana fahefatra (sary 3b), clones kandidà enina no nofantenana ho an'ny famakafakana tsirairay ao amin'ny maodely sampling CSF.Ny habetsaky ny phage kandidà enina, ny phage tsy misy na inona na inona (tsy misy insert) ary ny tranomboky peptide prophage dia natsindrona tamin'ny biby CM telo cannulated, ary ny pharmacokinetics dia nofaritana tao amin'ny CSF (sary 3c) sy ny ra (Fig. 7 fanampiny).Ny clones phage rehetra nosedraina dia nikendry ny efitranon'ny CSF amin'ny haavo 10-1000 avo kokoa noho ny an'ny phage fanaraha-maso foana (#1779).Ohatra, ny klones #2020 sy #2077 dia nanana titre CSF avo 1000 heny noho ny phage fanaraha-maso.Ny mombamomba ny pharmacokinetic amin'ny peptide voafantina tsirairay dia samy hafa, fa izy rehetra dia manana fahaiza-manao CSF ​​avo lenta.Hitanay ny fihenana tsy tapaka rehefa mandeha ny fotoana ho an'ny klones #1903 sy #2011, raha ho an'ny klones #2077, #2002 ary #2009 ny fitomboana mandritra ny 10 minitra voalohany dia mety manondro fitaterana mavitrika saingy mila hamarinina.Ny Clones #2020, #2002, ary #2077 dia niorina tamin'ny haavo avo, raha nihena tsikelikely ny CSF ny clone #2009 taorian'ny fiakarana voalohany.Avy eo dia nampitahainay ny faharetan'ny kandidà CSF tsirairay miaraka amin'ny fifantohana amin'ny ràny (sary 3d).Ny fifandraisan'ny titer saan'ny kandidà CSF tsirairay miaraka amin'ny titer-dra amin'ny fotoana rehetra anaovana santionany dia mampiseho fa ny telo amin'ireo kandidà enina dia nanankarena be tao amin'ny CSF ra.Mahaliana fa ny clone #2077 dia naneho ny fahamarinan-dra ambony kokoa (sary fanampiny 7).Mba hanamafisana fa ny peptides ny tenany dia afaka mazoto mitondra entana hafa ankoatry ny phage poti ho any amin'ny CSF efitra, dia natambatra efatra mpitarika peptides derivatized amin'ny biotine ao amin'ny N-terminus izay ny peptides miraikitra amin'ny phage poti.Ny peptides biotinylated (nos. 2002, 2009, 2020 ary 2077) dia nampifandraisina tamin'ny streptavidin (SA) mba hahazoana endrika multimérika somary maka tahaka ny géométrie phage.Ity endrika ity koa dia namela anay handrefesana ny fiparitahan'ny SA amin'ny ra sy ny fluid cerebrospinal ho peptides proteinina mitondra entana.Ny tena zava-dehibe dia azo averina matetika ny angon-drakitra phage rehefa nomena ny peptides synthetic amin'ity endrika SA-conjugated ity (sary 3e).Ny peptides nopotehina dia tsy dia nipoitra voalohany ary ny fivoahana CSF haingana kokoa miaraka amin'ny haavo tsy hita maso ao anatin'ny 48 ora.Mba hahazoana fahatakarana ny lalan'ny fanaterana ireo clones phage peptide ireo ao amin'ny habaka CSF, dia nandinika ny toerana misy ny peptide phage tsirairay avy amin'ny fampiasana immunohistochemistry (IHC) izahay mba hahitana mivantana ny poti-phage 1 ora aorian'ny fampidirana intravenous in vivo.Marihina fa ny clones #2002, #2077, ary #2009 dia azo tsikaritra amin'ny alàlan'ny fandotoana mafy ao amin'ny kapilara ao amin'ny atidoha, raha tsy hita ny phage control (#1779) sy ny clone #2020 (sary fanampiny 8).Izany dia manondro fa ireo peptides ireo dia mandray anjara amin'ny fiantraikany amin'ny atidoha amin'ny alàlan'ny fiampitana ny BBB.Ilaina ny famakafakana amin'ny antsipiriany bebe kokoa mba hitsapana an'io vinavina io, satria mety ho tafiditra ao koa ny lalana BSCFB.Raha ampitahaina ny filaharan'ny asidra amine amin'ny clone manankarena indrindra (#2002) amin'ny peptides hafa voafantina, dia voamarika fa ny sasany amin'izy ireo dia manana fanitarana asidra amine mitovy, izay mety manondro rafitra fitaterana mitovy (sary 3f).
Noho ny mombamomba ny plasma tsy manam-paharoa sy ny fitomboana lehibe amin'ny CSF rehefa mandeha ny fotoana, ny phage display clone #2077 dia nodinihina bebe kokoa nandritra ny 48 ora lava kokoa ary afaka namerina ny fitomboana haingana amin'ny CSF voamarika miaraka amin'ny haavon'ny SA maharitra (sary 4a).Mikasika ny clones phage hafa fantatra, ny #2077 dia voapoizina mafy ho an'ny capillaries amin'ny ati-doha ary nampiseho colocalization manan-danja miaraka amin'ny lectin marker capillary rehefa jerena amin'ny fanapahan-kevitra ambony kokoa ary mety misy fandotoana ao amin'ny habaka parenchymal (sary 4b).Mba hanadihadiana raha azo atao ao amin'ny CNS ny fiantraikan'ny pharmacological peptide-mediated, dia nanao fanandramana izahay izay nahitana dikan-teny biotinylated amin'ny i) ny peptide transit #2077 ary ii) ny peptide inhibitor BACE1 dia nifangaro tamin'ny SA tamin'ny ratios roa samihafa.Ho an'ny fitambarana iray dia tsy nampiasa afa-tsy ny peptide inhibitor BACE1 izahay ary ny iray hafa dia nampiasa ny tahan'ny 1: 3 amin'ny inhibitor peptide BACE1 amin'ny peptide #2077.Ireo santionany roa ireo dia nomena tsindrona ary ny rà sy ny fluid cerebrospinal amin'ny beta-amyloid peptide 40 (Abeta40) dia refesina rehefa mandeha ny fotoana.Ny Abeta40 dia refesina amin'ny CSF satria maneho ny fanakanana BACE1 ao amin'ny parenchyma atidoha.Araka ny efa nampoizina, ireo complexes roa ireo dia nampihena be ny haavon'ny ra Abeta40 (sary 4c, d).Na izany aza, santionany misy fifangaroan'ny peptide no.2077 sy ny inhibitor ny peptide BACE1 conjugated amin'ny SA dia niteraka fihenam-bidy lehibe amin'ny Abeta40 ao amin'ny fluid cerebrospinal (sary 4c).Ny angon-drakitra dia mampiseho fa ny peptide no.Ny 2077 dia afaka mitondra ny proteinina 60 kDa SA ho ao amin'ny CNS ary miteraka vokatra ara-panafody miaraka amin'ny inhibitor SA-conjugated amin'ny peptide BACE1.
(a) Clonal injection (2 × 10 phages / biby) an'ny T7 phage mampiseho ny mombamomba ny pharmacokinetic maharitra amin'ny CSF peptide #2077 (RLSSVDSSDLSGC) ary ny phage tsy misy tsindrona (#1779) amin'ny voalavo telo farafahakeliny CM-intubated.(b) Sarin'ny microscopique confocal amin'ny microvessels cortical solontenan'ny voalavo voalavo phage (2 × 10 10 phages / biby) mampiseho ny fanoherana ny peptide #2077 sy ny sambo (lectin).Ireo clone phage ireo dia nomena ny voalavo 3 ary navela hivezivezy mandritra ny adiny 1 alohan'ny perfusion.Ny ati-doha dia nozaraina ary nolokoina tamin'ny antibody polyclonal FITC misy marika manohitra ny T7 phage capsid.Folo minitra talohan'ny perfusion sy ny fanamboarana manaraka, ny lectin misy marika DyLight594 dia nomena intravenous.Sary fluorescent mampiseho fandokoana lectin (mena) amin'ny lafiny luminal amin'ny microvessels sy phages (maitso) ao amin'ny lumen ny capillaries sy ny sela ati-doha perivascular.Mifanaraka amin'ny 10 µm ny bara mizana.(c, d) Biotinylated BACE1 inhibitory peptide irery na miaraka amin'ny biotinylated transit peptide #2077 dia nampiarahina tamin'ny streptavidin arahin'ny tsindrona intravenous amin'ny voalavo CM telo farafahakeliny (10 mg streptavidin / kg).Ny fihenan'ny peptide inhibitor BACE1 amin'ny Aβ40 dia refesina amin'ny Aβ1-40 ELISA amin'ny rà (mena) sy ny fluid cerebrospinal (orange) amin'ny fotoana voatondro.Mba hanazavana tsara kokoa, misy tsipika misy teboka eo amin'ny grafika amin'ny maridrefy 100%.(c) Ny fihenan'ny isan-jaton'ny Aβ40 amin'ny rà (triangolo mena) sy ny fluid cerebrospinal (triangolo orange) amin'ny voalavo tsaboina amin'ny streptavidin conjugated amin'ny transit peptide #2077 sy BACE1 inhibitory peptide amin'ny 3: 1 ratio.(d) Ny fihenan'ny isan-jaton'ny rà Aβ40 (boribory mena) sy ny fluid cerebrospinal (boribory voasary) amin'ny voalavo tsaboina amin'ny streptavidin miaraka amin'ny peptide inhibitory BACE1 ihany.Ny fifantohana Aβ amin'ny fanaraha-maso dia 420 pg / ml (fanamafisana mahazatra = 101 pg / ml).
Fampiharana am-pahombiazana amin'ny sehatra maro amin'ny fikarohana biomedical17 ny fampisehoana Phage.Ity fomba ity dia nampiasaina ho an'ny fandalinana ny fahasamihafana amin'ny vivo vascular18,19 ary koa ny fandalinana mikendry ny sambo cerebral20,21,22,23,24,25,26.Ao anatin'ity fandalinana ity, dia nanitatra ny fampiharana ity fomba fifantenana ity izahay fa tsy ny famantarana mivantana ny peptides mikendry ny sambo cerebral, fa koa ny fahitana ireo kandidà manana fananana fitaterana mavitrika hiampita ny sakana amin'ny ati-doha.Manoritsoritra ny fivoaran'ny fomba fifantenana in vivo amin'ny voalavo CM intubated izahay ary mampiseho ny fahafahany hamantatra ny peptides miaraka amin'ny fananana CSF homing.Amin'ny fampiasana ny phage T7 mampiseho tranomboky misy peptides kisendrasendra 12-mer, dia afaka nampiseho izahay fa ny phage T7 dia kely (eo ho eo amin'ny 60 nm amin'ny savaivony)10 mba hampifanaraka ny sakana amin'ny ati-doha, ka miampita mivantana ny sakana amin'ny ati-doha na choroid plexus.Hitanay fa ny fijinjana CSF avy amin'ny voalavo CM cannulated dia fomba fanaraha-maso mahomby amin'ny vivo, ary ny phage nalaina dia tsy mifamatotra amin'ny vasculature ihany fa miasa ho toy ny mpitatitra manerana ny sakana amin'ny ati-doha.Ankoatr'izay, tamin'ny alàlan'ny fanangonana ra sy ny fampiharana HTS amin'ny CSF sy ny phages azo avy amin'ny ra, dia nanamafy izahay fa ny safidintsika ny CSF dia tsy voataonan'ny fampitomboana ny ra na ny fikolokoloana ny fanitarana eo anelanelan'ny fihodinana fifantenana.Na izany aza, anisan'ny fomba fifantenana ny fizaran-dra, satria ny phages afaka tonga ao amin'ny efitranon'ny CSF dia tsy maintsy velona sy mivezivezy ao amin'ny lalan-dra ampy tsara mba hampanan-karena ny tenany ao amin'ny atidoha.Mba hahazoana fampahalalana momba ny filaharana azo antoka avy amin'ny angon-drakitra HTS manta, dia nampihatra sivana namboarina tamin'ny hadisoana filaharana manokana amin'ny sehatra ao amin'ny rindranasan'ny famakafakana.Amin'ny fampidirana ireo mari-pamantarana kinetika amin'ny fomba fitiliana, dia nanamafy ny pharmacokinetics haingana amin'ny karazana T7 phages (t½ ~ 28 min) amin'ny rà24, 27, 28 izahay ary namaritra ny antsasaky ny androm-piainany amin'ny fluid cerebrospinal (t½ ~ 26 min) isa-minitra).Na dia eo aza ny mombamomba ny pharmacokinetic mitovy amin'ny ra sy ny CSF, dia ny 0.001% amin'ny fatran'ny phage amin'ny ra ihany no azo tsikaritra ao amin'ny CSF, izay manondro ny fivezivezena ambany amin'ny karazana T7 phage manerana ny sakana amin'ny ati-doha.Ity asa ity dia manasongadina ny maha-zava-dehibe ny fihodinana voalohany amin'ny fifantenana rehefa mampiasa ny paikadin'ny panning in vivo, indrindra ho an'ny rafitra phage izay esorina haingana amin'ny mivezivezy, satria vitsy ny clones afaka tonga any amin'ny efitranon'ny CNS.Noho izany, tamin'ny fihodinana voalohany, dia tena goavana ny fihenan'ny fahasamihafan'ny tranomboky, satria voafetra ihany ny isan'ny clones voaangona tamin'ity modely CSF henjana ity.Ity paikadin'ny panning in vivo ity dia nahitana dingana maromaro mifantina toy ny fanangonana mavitrika ao amin'ny efitranon'ny CSF, ny fahaveloman'ny clone ao amin'ny efitranon'ny rà, ary ny fanesorana haingana ny clones T7 phage amin'ny ra ao anatin'ny 10 minitra voalohany (sary 1d sy fanampiny 4M).).Noho izany, taorian'ny fihodinana voalohany, dia nisy clones phage samihafa hita tao amin'ny CSF, na dia ny dobo voalohany iray aza dia nampiasaina ho an'ny biby tsirairay.Midika izany fa ny dingana maro amin'ny fifantenana henjana ho an'ny tranomboky loharano misy mpikambana maro ao amin'ny tranomboky dia miteraka fihenam-bidy lehibe amin'ny fahasamihafana.Noho izany, ny hetsika kisendrasendra dia ho lasa ampahany manan-danja amin'ny fizotran'ny fifantenana voalohany, izay misy fiantraikany lehibe amin'ny vokatra.Azo inoana fa maro amin'ireo klones ao amin'ny tranomboky tany am-boalohany no nanana fironana hanankarena CSF tena mitovy.Na izany aza, na dia ao anatin'ny fepetra andrana mitovy aza dia mety tsy hitovy ny valin'ny fifantenana noho ny fahavitsian'ny klone tsirairay ao amin'ny dobo voalohany.
Tsy mitovy amin'ny ao amin'ny ra ny motifs manankarena ao amin'ny CSF.Mahaliana fa nanamarika ny fiovana voalohany mankany amin'ny peptides manankarena glycine ao amin'ny ran'ny biby tsirairay izahay.(sary 1g, sary fanampiny 4e, 4f).Ny phage misy peptides glycine dia mety ho marin-toerana kokoa ary tsy dia azo esorina amin'ny fivoahana.Na izany aza, ireo peptides manankarena glycine ireo dia tsy hita tao amin'ny santionan'ny fluid cerebrospinal, izay nanoro hevitra fa ny tranomboky voakarakara dia nandalo dingana roa samihafa: ny iray tao amin'ny ra ary ny iray hafa navela hiangona ao amin'ny fluid cerebrospinal.Ny klones manankarena CSF vokatry ny fifantenana fihodinana fahefatra dia notsapaina fatratra.Saika ny clones nosedraina tsirairay dia voamarina fa manankarena amin'ny CSF raha oharina amin'ny phage control blank.Nodinihina tamin'ny antsipiriany bebe kokoa ny peptide iray (#2077).Nampiseho ny antsasaky ny fiainana plasma lava kokoa izy io raha oharina amin'ny hitifitra hafa (sary 3d sy sary fanampiny 7), ary mahaliana, ity peptide ity dia misy sisa tavela amin'ny C-terminus.Vao haingana no naseho fa ny fampidirana cysteine ​​​​amin'ny peptides dia afaka manatsara ny toetrany amin'ny pharmacokinetic amin'ny alàlan'ny fatorana amin'ny albumin 29.Tsy fantatra amin'izao fotoana izao ny peptide #2077 ary mitaky fandalinana fanampiny.Ny peptides sasany dia naneho ny fiankinan-doha amin'ny fampivoarana CSF (data tsy aseho), izay mety misy ifandraisany amin'ny géométrie ambonin'ny T7 capsid.Ny rafitra T7 nampiasainay dia nampiseho dika mitovy 5-15 isaky ny peptide isaky ny ampahany phage.Ny IHC dia natao tamin'ny clones lead phage kandida nampidirina intravenously tao amin'ny cortex cerebral amin'ny voalavo (sary fanampiny 8).Ny angon-drakitra dia naneho fa telo farafahakeliny klones (No. 2002, No. 2009 ary No. 2077) no nifanerasera tamin'ny BBB.Mbola ho fantatra raha miteraka fivondronan'ny CSF na ny fifindran'ireo klone ireo mivantana amin'ny BCSFB ity fifandraisana BBB ity.Ny tena zava-dehibe dia asehontsika fa ny peptides voafantina dia mitazona ny fahafahany fitaterana CSF rehefa voatambatra sy mifamatotra amin'ny entana proteinina.Ny famatorana ny peptides biotinylated N-terminal amin'ny SA dia mamerina amin'ny ankapobeny ny valiny azo amin'ny clones phage tsirairay ao amin'ny ra sy ny fluid cerebrospinal (sary 3e).Farany, asehontsika fa ny peptide lead #2077 dia afaka mampiroborobo ny asan'ny ati-doha amin'ny peptide inhibitor biotinylated BACE1 mifandray amin'ny SA, ka miteraka vokatra pharmacodynamic ao amin'ny CNS amin'ny fampihenana ny haavon'ny Abeta40 amin'ny CSF (sary 4).Tsy afaka namantatra homologues tao amin'ny angon-drakitra izahay tamin'ny fanaovana fikarohana homolojia amin'ny filaharan'ny peptide amin'ny hitsimoka rehetra.Zava-dehibe ny manamarika fa eo amin'ny 109 eo ho eo ny haben'ny tranomboky T7, raha ny haben'ny tranomboky teorika ho an'ny 12-mers dia 4 x 1015. Noho izany, ny ampahany kely amin'ny habaka isan-karazany amin'ny tranomboky peptide 12-mer ihany no nofidinay, izay mety midika fa ny peptides tsara kokoa dia azo fantarina amin'ny fanombanana ny habaka mifanakaiky amin'ireo filaharana ireo.Raha ny marina, ny iray amin'ireo antony tsy nahitantsika homologue voajanahary amin'ireo peptides ireo dia ny famotsorana mandritra ny evolisiona mba hisorohana ny fidiran'ny motif peptide sasany ao amin'ny atidoha tsy voafehy.
Raha atambatra, ny valiny dia manome fototra ho an'ny asa ho avy hamantarana sy hamaritana ny rafi-pitaterana ny sakana cerebrovascular in vivo amin'ny antsipiriany bebe kokoa.Ny fametrahana fototra amin'ity fomba ity dia mifototra amin'ny paikady fifantenana miasa izay tsy vitan'ny hoe mamaritra ny clones manana fananana mamatotra vascular cerebral, fa misy ihany koa ny dingana manan-danja izay ahafahan'ny clones mahomby manana hetsika intrinsic hiampitana ny sakana biolojika ao amin'ny vivo ao amin'ny efitranon'ny CNS.dia ny hanazava ny fomba fitateran'ireo peptides ireo sy ny tiany hamehezana ny microvasculature manokana amin'ny faritry ny atidoha.Izany dia mety hitarika amin'ny fitadiavana lalana vaovao ho an'ny fitaterana ny BBB sy ny mpandray.Manantena izahay fa ny peptides fantatra dia afaka mifatotra mivantana amin'ny receptors cerebrovascular na amin'ny ligy mivezivezy amin'ny alàlan'ny BBB na BCSFB.Ny vectors peptide miaraka amin'ny hetsika fitaterana CSF hita amin'ity asa ity dia hohadihadiana bebe kokoa.Eo am-panadihadiana momba ny ati-doha amin'ireo peptides ireo izahay amin'izao fotoana izao noho ny fahaizany mamakivaky ny BBB sy / na BCSFB.Ireo peptides vaovao ireo dia ho fitaovana tena sarobidy amin'ny mety hahitana ireo mpandray na lalana vaovao ary ho an'ny fampivoarana sehatra vaovao tena mahomby amin'ny fandefasana macromolecules, toy ny biolojika, mankany amin'ny atidoha.
Ampidiro ny famorian-drano lehibe (CM) amin'ny alàlan'ny fanovana ny fomba voalaza teo aloha.Voalavo Wistar (200-350 g) natao ananesthesie dia napetraka tamin'ny fitaovana stereotaxic ary natao tetezana medianina teo amin'ny hodi-doha voaharatra sy voaomana tsara mba hampiharihary ny karandoha.Manaova lavaka roa eo amin'ny faritry ny fehikibo ambony ary apetaho ao anaty lavaka ny visy.Nisy lavaka fanampiny natao tao amin'ny crest occipital lateral ho an'ny fitarihana stereotactic amin'ny cannula vy tsy misy pentina ao amin'ny CM.Asio simenitra nify manodidina ny cannula ary arotsaho amin'ny visy.Taorian'ny fikarakarana sary sy ny fanamafisana ny simenitra, ny fery hoditra dia nohidiana tamin'ny 4/0 supramid suture.Ny fametrahana araka ny tokony ho izy ny cannula dia voamarina amin'ny fivoahana ho azy ny fluid cerebrospinal (CSF).Esory ny voalavo amin'ny fitaovana stereotaxic, alao ny fitsaboana sahaza aorian'ny fandidiana sy ny fitsaboana fanaintainana, ary avelao ho sitrana mandritra ny herinandro farafahakeliny mandra-pahitana famantarana misy ra ao amin'ny fluid cerebrospinal.Ny voalavo Wistar (Crl:WI/Han) dia azo avy amin'ny Reniranon'i Charles (France).Ny voalavo rehetra dia notazonina tao anatin'ny fepetra manokana tsy misy otrikaretina.Ny fanandramana biby rehetra dia nankatoavin'ny Biraon'ny Veterinera ao an-tanànan'i Basel, Soisa, ary natao mifanaraka amin'ny fahazoan-dàlana momba ny biby 2474 (fanombanana ny fitaterana ati-doha mavitrika amin'ny fandrefesana ny haavon'ny candidats fitsaboana ao amin'ny fluid cerebrospinal sy ny atidohan'ny voalavo).
Tazony moramora ilay voalavo miaraka amin'ny cannula CM eny an-tanana.Esory amin'ny cannula ny Datura ary manangona 10 µl fluide cerebrospinal mandeha ho azy.Koa satria ny patency ny cannula dia nivadika tamin'ny farany, ny santionan'ny fluid cerebrospinal mazava tsara izay tsy misy porofo momba ny fandotoana ny ra na ny fiovan'ny loko no nampidirina tamin'ity fanadihadiana ity.Mifanitsy amin'izany, manodidina ny 10-20 μl ny rà nalaina avy amin'ny tsipìka kely teo amin'ny tendron'ny rambony ho fantsona misy heparin (Sigma-Aldrich).Ny CSF sy ny ra dia nangonina tamin'ny fotoana samihafa taorian'ny fampidirana tsindrona T7 phage.Tokony ho 5-10 μl ny ranon-javatra nariana alohan'ny hanangonana ny santionan'ny CSF tsirairay, izay mifanandrify amin'ny habetsaky ny catheter maty.
Ny tranomboky dia noforonina tamin'ny fampiasana ny vector T7Select 10-3b araka ny voalaza ao amin'ny boky torolalana momba ny rafitra T7Select (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996).Raha fintinina, ny fampidirana ADN 12-mer kisendrasendra dia noforonina tamin'ny endrika manaraka:
Ny codon NNK dia nampiasaina mba hialana amin'ny codons fijanonana indroa sy ny fihoaram-pefy asidra amine ao amin'ny fampidirana.Ny N dia taham-pamokarana mifangaro amin'ny tanana amin'ny nucleotide tsirairay, ary ny K dia tahan'ny equimolar mifangaro amin'ny adenine sy cytosine nucleotides.Ny faritra mitongilana tokana dia niova ho ADN roa sosona tamin'ny alàlan'ny incubation fanampiny miaraka amin'ny dNTP (Novagen) sy Klenow enzyme (New England Biolabs) ao amin'ny buffer Klenow (New England Biolabs) mandritra ny 3 ora amin'ny 37 ° C.Taorian'ny fanehoan-kevitra, ny ADN misy tady roa dia nalaina tamin'ny rotsak'orana EtOH.Ny ADN vokatr'izany dia levonina miaraka amin'ny enzymes famerana EcoRI sy HindIII (samy avy any Roche).Ny fampidirana sy nodiovina (QIAquick, Qiagen) (T4 ligase, New England Biolabs) dia nafatotra tamin'ny frame ho lasa vector T7 efa nodiovina taorian'ny asidra amine 348 amin'ny fototarazo 10B capsid.Ny fanehoan-kevitry ny ligation dia natsipy tao amin'ny 16 ° C. nandritra ny 18 ora talohan'ny fonosana in vitro.Ny fonosana Phage in vitro dia natao araka ny toromarika nomena miaraka amin'ny kitapo kloning T7Select 10-3b (Novagen) ary ny vahaolana fonosana dia nohamafisina indray mandeha amin'ny lysis mampiasa Escherichia coli (BLT5615, Novagen).Ny lysate dia natao centrifuged, titrated ary nafafy tamin'ny -80 ° C. ho toy ny vahaolana tahiry glycerol.
Fanamafisana PCR mivantana ny faritra miovaova phage ampitomboina amin'ny ron-kena na lovia amin'ny fampiasana primer fusion 454/Roche-amplicon.Ny primer fusion mandroso dia misy filaharana manamorona ny faritra miovaova (NNK) 12 (marika manokana), GS FLX Titanium Adapter A, ary filaharan'ny famakiam-boky efatra fototra (TCAG) (sary fanampiny 1a):
Ny primer fusion mivadika koa dia misy biotine mifatotra amin'ny fisamborana vakana ary ny GS FLX Titanium Adapter B ilaina amin'ny fanamafisana clonal mandritra ny emulsion PCR:
Ny amplicons dia niharan'ny pyrosequencing 454 / Roche araka ny protocol 454 GS-FLX Titanium.Ho an'ny filaharan'ny Sanger manual (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA Analyzer), ny ADN T7 phage dia nohamafisin'ny PCR ary nozaraina tamin'ireto mpivady voalohany ireto:
Ny fampidirana avy amin'ny takelaka tsirairay dia niharan'ny fanamafisana PCR tamin'ny alàlan'ny Roche Fast Start DNA Polymerase Kit (araka ny torolalan'ny mpanamboatra).Manaova fanombohana mafana (10 min amin'ny 95 °C) ary 35 tsingerina fanamafisam-peo (50 s amin'ny 95 °C, 1 min amin'ny 50 °C, ary 1 min amin'ny 72 °C).
Ny phage avy amin'ny tranomboky, ny karazana phage, ny phage voavonjy tamin'ny CSF sy ny ra, na ny klone tsirairay dia nohamafisina tao amin'ny Escherichia coli BL5615 amin'ny ron-kena TB (Sigma Aldrich) na amin'ny lovia 500 cm2 (Thermo Scientific) mandritra ny 4 ora amin'ny 37 ° C.Ny phage dia nesorina tamin'ny takelaka tamin'ny fanasana ny takelaka tamin'ny Tris-EDTA buffer (Fluka Analytical) na tamin'ny fanangonana ny takelaka misy toro-hevitra pipette sterile.Ny Phage dia notokanana avy amin'ny kolontsaina supernatant na extraction buffer miaraka amin'ny rotsak'orana polyethylene glycol (PEG 8000) iray (Promega) ary naverina tamin'ny buffer Tris-EDTA.
Ny phage amplified dia niharan'ny fanesorana endotoxine 2-3 tamin'ny fampiasana vakana fanesorana endotoxine (Miltenyi Biotec) alohan'ny fampidirana intravenous (IV) (500 μl / biby).Tamin'ny fihodinana voalohany dia nampidirina 2×1012 phages;amin'ny faharoa, 2 × 1010 phages;amin'ny fihodinana fifantenana fahatelo sy fahefatra, 2×109 phages isaky ny biby.Ny votoatin'ny Phage ao amin'ny CSF sy ny santionan'ny ra voaangona amin'ny fotoana voatondro dia nofaritana tamin'ny fanisana takelaka araka ny torolalan'ny mpanamboatra (T7Select system manual).Ny fifantenana ny phage dia natao tamin'ny fampidirana tsindrona tranomboky voadio tao amin'ny rambony na tamin'ny famerenana indray ny phage nalaina avy amin'ny CSF tamin'ny fihodinana fifantenana teo aloha, ary ny fijinjana manaraka dia natao tao amin'ny 10 min, 30 min, 60 min, 90 min, 120 min, 180 min, ary 240 min santionany.Fihodinana in vivo efatra no natao izay nitehirizana sy nodinihina manokana ireo sampana roa voafantina nandritra ireo fihodinana telo voalohany nifidianana.Ny fampidirana phage rehetra nalaina tao amin'ny CSF tamin'ny fihodinana roa voalohany tamin'ny fifantenana dia niharan'ny 454 / Roche pyrosequencing, raha ny clones rehetra nalaina avy amin'ny CSF tamin'ny fihodinana roa farany tamin'ny fifantenana dia nalamina tamin'ny tanana.Niharan'ny pyrosequencing 454/Roche avokoa ny phages rehetra tamin'ny fihodinana voalohany.Ho an'ny tsindrona clones phage, dia nohamafisina ny phages voafantina ao amin'ny E. coli (BL5615) amin'ny takelaka 500 cm2 amin'ny 37 ° C mandritra ny 4 ora.Ny klones voafantina tsirairay sy nofantenana amin'ny tanana dia naparitaka tamin'ny fitaovana TB.Taorian'ny fanesorana ny phage, ny fanadiovana sy ny fanesorana ny endotoxine (araka ny voalaza etsy ambony), 2 × 1010 phages / biby ao amin'ny 300 μl dia nampidirina intravenous tao anaty rambony iray.
Preprocessing sy qualitative sivana ny angona filaharana.Ny angon-drakitra Raw 454/Roche dia niova fo avy amin'ny endrika sari-tany mahazatra (sff) ho an'ny endrika azo vakina (fasta) ho an'ny Pearson mampiasa rindrambaiko mpivarotra.Ny fanodinana bebe kokoa ny filaharan'ny nucleotide dia natao tamin'ny alàlan'ny programa C sy scripts (fonosana rindrambaiko tsy navoaka) araka ny voalaza etsy ambany.Ny famakafakana ny angon-drakitra fototra dia ahitana fomba fiasa hentitra amin'ny sivana maromaro.Mba hanivana ny vakiteny tsy misy filaharan'ny ADN insert 12mer manan-kery, ny famakiana dia nalamina mba hanombohana marika (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), marika fiatoana (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) ary insert background (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC) amin'ny alàlan'ny fitsapana manerantany Needleman-Wunsch.alignment mamela hatramin'ny 2 inconsistencies isaky ny alignment31.Noho izany dia nesorina tao amin'ny tranomboky ny vakiana tsy misy fanombohana sy fiatoana ary ny vakiteny misy asiana ambadika, izany hoe, fampifanarahana mihoatra ny isan'ny tsy mifanentana.Ho an'ireo vakiteny sisa, ny filaharan'ny ADN N-mer manomboka amin'ny marika fanombohana sy mifarana alohan'ny marika fiatoana dia nesorina tamin'ny filaharan'ny famakiana tany am-boalohany ary nokarakaraina bebe kokoa (antsoina hoe "insert").Aorian'ny fandikana ny fampidirana, ny ampahany aorian'ny codon fijanonana voalohany amin'ny faran'ny 5′ amin'ny primer dia esorina amin'ny fampidirana.Fanampin'izany, nesorina ihany koa ny nucleotides mitondra any amin'ny codons tsy feno amin'ny faran'ny 3′ amin'ny primer.Mba hanilihana ny fampidirana tsy misy filaharana ambadika fotsiny, dia nesorina ihany koa ny fampidirana voadika manomboka amin'ny lamina asidra amine "PAG".Peptides manana asidra amino latsaky ny 3 aorian'ny fandikana dia nesorina tao amin'ny tranomboky.Farany, esory ny famerana ao amin'ny dobo fampidirana ary fantaro ny fatran'ny tsindrona tokana tsirairay.Ny valin'ity famakafakana ity dia nahitana lisitr'ireo sequence nucleotide (insert) sy ny fatran'izy ireo (vakio) (sary fanampiny 1c sy 2).
Vondrona N-mer ADN miditra amin'ny filaharana fitoviana: Mba hanafoanana ny 454/Roche-specific sequence fahadisoana (toy ny olana amin'ny sequencing homopolymer fanitarana) sy hanaisotra tsy dia manan-danja redundancies, voasivana teo aloha N-mer ADN sequence insert (inserts) dia sokajiana araka ny fitoviana.fampidirana (hatramin'ny 2 fototra tsy mifanandrify azo atao) mampiasa algorithm iterative voafaritra toy izao manaraka izao: ny fampidirana dia sokajiana voalohany araka ny fahitany (ambony ka hatramin'ny ambany indrindra), ary raha mitovy izy ireo, amin'ny karazany faharoa amin'ny halavany (lava indrindra hatramin'ny fohy indrindra) ).Noho izany, ny fampidirana matetika sy lava indrindra dia mamaritra ny "vondrona" voalohany.Ny fatran'ny vondrona dia apetraka amin'ny faneken'ny fanalahidy.Avy eo, ny fampidirana tsirairay tavela ao amin'ny lisitra voafantina dia niezaka nampidirina tao amin'ny vondrona tamin'ny alàlan'ny fampifanarahana Needleman-Wunsch.Raha tsy mihoatra ny tokonam-baravaran'ny 2 ny isan'ny tsy mifanandrify, ny fampidirana, na ny famafana amin'ny fampifanarahana iray, dia ampidirina ao amin'ny vondrona ny fanisiana iray, ary ny fatran'ny vondrona manontolo dia ampitomboina amin'ny impiry ny fampidirana ny fampidirana.Voamarika ho efa nampiasaina ary tsy tafiditra ao anatin'ny fanodinana fanampiny ny fampidirana ampiana vondrona iray.Raha tsy azo ampidirina amina vondrona efa misy ny filaharana ampidirina, dia ampiasaina ny filaharana ampidirina mba hamoronana vondrona vaovao miaraka amin'ny fatran'ny fampidirana mifanaraka amin'izany ary marihina fa ampiasaina.Mifarana ny famerimberenana rehefa efa nampiasaina hamorona vondrona vaovao na azo ampidirina anaty vondrona efa misy ny filaharana fampidirana tsirairay.Rehefa dinihina tokoa, ny fampidirana mitambatra misy nucleotides dia adika amin'ny filaharan'ny peptide (tranomboky peptide).Ny vokatr'ity famakafakana ity dia andiana fampidirana sy ny habetsany mifanaraka aminy izay mahaforona ny isan'ny vakiteny misesy (sary fanampiny 2).
Famoronana motif: Mifototra amin'ny lisitry ny peptides tsy manam-paharoa, dia noforonina ny tranomboky iray ahitana karazana asidra amino rehetra (aa) araka ny aseho etsy ambany.Ny lamina mety ho an'ny halavany 3 dia nesorina tao amin'ny peptide ary nampiana ny lamina mifanohitra aminy miaraka amin'ny tranomboky motif mahazatra misy ny lamina rehetra (tripeptides).Ny trano famakiam-boky misy motif miverimberina dia nalahatra ary nesorina ny tsy fahampiana.Avy eo, ho an'ny tripeptide tsirairay ao amin'ny tranomboky motif, dia nanamarina ny fisiany tao amin'ny tranomboky izahay tamin'ny fampiasana fitaovana informatika.Amin'ity tranga ity, ny fatran'ny peptide misy ny tripeptide motif hita dia ampiana ary omena ny motif ao amin'ny tranomboky motif ("isan'ny motif").Ny vokatry ny famoronana motif dia laharan-droa misy ny fisehoana rehetra amin'ny tripeptides (motifs) sy ny sandany tsirairay avy, dia ny isan'ny famakian-dahatsoratra izay miteraka ny motif mifanaraka amin'izany rehefa voasivana, mivondrona ary nadika ny vakiteny.Metrika araka ny voalaza amin'ny antsipiriany etsy ambony.
Normalization ny isan'ny motif sy ny scatterplots mifanaraka amin'izany: Ny isan'ny motifs isaky ny santionany dia normalize amin'ny fampiasana
izay ni no isan'ny vakiteny misy lohahevitra i.Noho izany, ny vi dia maneho ny isan-jaton'ny famakian-teny (na peptides) misy motif i amin'ny santionany.Ny sanda P ho an'ny isan'ny motif tsy ara-dalàna dia nokajiana tamin'ny alàlan'ny fitsapana marina nataon'i Fisher.Mikasika ny correlograms amin'ny isan'ny antony, ny fifandraisan'i Spearman dia nokajiana tamin'ny fampiasana ny isan'ny antonony mahazatra miaraka amin'ny R.
Mba hampisehoana ny votoatin'ny asidra amino isaky ny toerana ao amin'ny tranomboky peptide, dia noforonina ny logograms web 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com).Voalohany, ny votoatin'ny asidra amine isaky ny toerana misy ny peptide 12-mer dia voatahiry ao anaty matrix 20 × 12.Avy eo, ny andiana peptides 1000 misy ny atiny asidra amine mitovy amin'ny toerana tsirairay dia amboarina amin'ny endrika filaharana haingana ary omena ho fampidirana amin'ny logo-web 3, izay miteraka fanehoana an-tsary ny votoatin'ny asidra amine amin'ny toerana tsirairay.ho an'ny tranomboky peptide nomena.Mba hanaovana sary an-tsaina ny angon-drakitra marobe, dia noforonina ny sarintany hafanana amin'ny alàlan'ny fitaovana novolavolaina anatiny ao amin'ny R (biosHeatmap, fonosana R mbola havoaka).Ny dendrograma aseho amin'ny sarintany hafanana dia nokajiana tamin'ny alàlan'ny fomba fivondronan'ny ambaratongan'ny Ward miaraka amin'ny metrika halavirana Euclidean.Ho an'ny famakafakana statistika momba ny angon-drakitra momba ny motif, ny sanda P ho an'ny isa tsy mahazatra dia nokajiana tamin'ny alàlan'ny fitsapana marina nataon'i Fisher.Ny sanda P ho an'ny angona hafa dia nokajiana tamin'ny R tamin'ny fampiasana ny t-test na ANOVA an'ny mpianatra.
Ny clones phage voafantina sy ny phages tsy misy fampidirana dia nampidirina intravenous tamin'ny alàlan'ny lalan-drambony (2 × 1010 phages / biby ao amin'ny 300 μl PBS).Folo minitra talohan'ny perfusion sy ny fanamboarana manaraka, ireo biby ireo dia natsindrona tsindrona 100 μl ny lectin misy marika DyLight594 (Vector Laboratories Inc., DL-1177).60 minitra taorian'ny tsindrona phage, voalavo ny fo miaraka amin'ny 50 ml PBS arahin'ny 50 ml 4% PFA / PBS.Ny santionan'ny ati-doha dia naorina indray alina tao amin'ny 4% PFA/PBS ary natsofoka tamin'ny sucrose 30% nandritra ny alina tamin'ny 4 ° C.Ny santionany dia tselatra mangatsiaka ao anaty fangaro OCT.Ny famakafakana immunohistochemical amin'ny santionany mangatsiaka dia natao tao amin'ny mari-pana amin'ny 30 µm cryosections voasakana amin'ny 1% BSA ary nampidirina tamin'ny antibody polyclonal FITC misy marika manohitra ny T7 phage (Novus NB 600-376A) amin'ny 4 ° C.Atsofohy mandritra ny alina.Farany, nosasana in-3 tamin'ny PBS ireo fizarana ary nodinihina tamin'ny mikroskopika laser confocal (Leica TCS SP5).
Ny peptides rehetra manana fahadiovana kely indrindra amin'ny 98% dia novolavolain'ny GenScript USA, biotinylated ary lyophilized.Ny biotine dia mifamatotra amin'ny alàlan'ny spacer glycine triple fanampiny ao amin'ny N-terminus.Hamarino ny peptides rehetra amin'ny alàlan'ny spectrometry faobe.
Streptavidin (Sigma S0677) dia nifangaro tamin'ny 5-fold equimolar mihoatra ny biotinylated peptide, biotinylated BACE1 inhibitory peptide, na ny fitambarana (3: 1 ratio) ny biotinylated BACE1 inhibitory peptide sy BACE1 inhibitory peptide ao amin'ny 5-10% DMSO / incubated in PBSO.1 ora amin'ny mari-pana amin'ny efitrano alohan'ny tsindrona.Ny peptides streptavidin-conjugated dia natsindrona tsindrona amin'ny fatra 10 mg / kg ao amin'ny iray amin'ireo lalan-dra amin'ny voalavo misy lavaka cerebral.
Ny fifantohana amin'ny streptavidin-peptide complexes dia nodinihina tamin'ny ELISA.Ny takelaka microtiter Nunc Maxisorp (Sigma) dia nofonosina nandritra ny alina tamin'ny 4 ° C miaraka amin'ny antibody anti-streptavidin 1.5 μg / ml (Thermo, MA1-20011).Aorian'ny fanakanana (fanakanana buffer: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0.05% NP40, 0.25% gelatin, 1% BSA) amin'ny mari-pana amin'ny efitrano mandritra ny 2 ora, sasao ny takelaka miaraka amin'ny 0.05% Tween-20 / PBS (buffer wash) ho an'ny 3 Faharoa, CSF sy santionany plasma0 samy hafa dia nampiana CSF sy plasma0 santionany. CSF 1:115).Ny takelaka dia natsipy nandritra ny alina tamin'ny 4 ° C miaraka amin'ny antibody detection (1 μg / ml, anti-streptavidin-HRP, Novus NB120-7239).Taorian'ny dingana fanasana telo, streptavidin dia hita tamin'ny alalan'ny incubation ao amin'ny TMB substrate solution (Roche) hatramin'ny 20 min.Aorian'ny fampitsaharana ny fivoaran'ny loko miaraka amin'ny 1M H2SO4, refesina amin'ny 450 nm ny absorbance.
Ny fiasan'ny streptavidin-peptide-BACE1 inhibitor complex dia nodinihina tamin'ny Aβ(1-40) ELISA araka ny protocole mpanamboatra (Wako, 294-64701).Raha fohifohy, ny santionan'ny CSF dia nopotehina tamin'ny diluent mahazatra (1:23) ary natsofoka nandritra ny alina tamin'ny 4 ° C tao amin'ny takelaka 96-lavaka voarakotra amin'ny antibody BNT77.Taorian'ny dingana fanasana dimy, dia nampiana antibody BA27 HRP-conjugated ary natsofoka nandritra ny 2 ora tamin'ny 4 ° C., narahin'ny dingana fanasana dimy.Ny Aβ (1-40) dia hita tamin'ny alàlan'ny incubation ao amin'ny vahaolana TMB mandritra ny 30 minitra amin'ny mari-pana amin'ny efitrano.Aorian'ny fampitsaharana ny fivoaran'ny loko amin'ny vahaolana mijanona, refesina amin'ny 450 nm ny fisondrotana.Ny santionan'ny plasma dia niharan'ny fitrandrahana dizitaly mafy alohan'ny Aβ (1-40) ELISA.Ny plasma dia nampiana 0.2% DEA (Sigma) tamin'ny takelaka 96-lavaka ary nampidirina tao amin'ny mari-pana mandritra ny 30 minitra.Rehefa avy nanasa nisesy ny takelaka SPE (Oasis, 186000679) tamin'ny rano sy methanol 100%, dia nampiana santionan'ny plasma ny takelaka SPE ary nesorina ny rano rehetra.Ny santionany dia nosasana (voalohany tamin'ny 5% methanol avy eo 30% methanol) ary nodiovina tamin'ny 2% NH4OH/90% methanol.Aorian'ny fanamainana ny eluate amin'ny 55 ° C mandritra ny 99 min amin'ny ankehitriny N2 tsy tapaka, dia nihena ny santionany tamin'ny diluent mahazatra ary ny Aβ (1-40) dia refesina araka ny voalaza etsy ambony.
Ahoana no ilazana ity lahatsoratra ity: Urich, E. et al.Fanaterana entana mankany amin'ny atidoha mampiasa peptides transit fantatra amin'ny vivo.ny siansa.5, 14104;doi:10.1038/srep14104 (2015).
Likhota J., Skjorringe T., Thomsen LB ary Moos T. Fanaterana fanafody macromolecular amin'ny atidoha amin'ny fampiasana fitsaboana kendrena.Journal of Neurochemistry 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C., ary Martinez-Martinez, P. Fanaterana fanafody peptide sy proteinina manerana ny sakana amin'ny ati-doha.Prog Neurobiol 87, 212–251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
Pardridge, WM Ny sakana amin'ny ati-doha amin'ny rà: tavoahangy amin'ny fivoaran'ny zava-mahadomelina ao amin'ny atidoha.NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
Johanson, KE, Duncan, JA, Stopa, EG, ary Byrd, A. Prospects amin'ny fanatsarana ny fanaterana zava-mahadomelina sy mikendry ny atidoha amin'ny alàlan'ny lalan'ny choroid plexus-CSF.Fikarohana momba ny fanafody 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
Pardridge, WM Fanavaozana ny biopharmaceuticals miaraka amin'ny soavaly Trojan molecular ho an'ny ati-doha.Bioconjug Chem 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008).
Pardridge, WM receptor-mediated peptide fitaterana manerana ny sakana amin'ny ati-doha.Endocr Rev. 7, 314–330 (1986).
Niewoehner, J. et al.Ampitomboy ny fidiran'ny ati-doha sy ny fahombiazan'ny antibody ara-pahasalamana amin'ny fampiasana molekiola monovalent.Neuron 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
Bien-Lee, N. et al.Ny fitaterana transferrin receptor (TfR) dia mamaritra ny fifindran'ny ati-doha amin'ny karazana firaisana amin'ny antibody TfR.J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).