Misaotra anao nitsidika ny Nature.com.Ny kinova browser ampiasainao dia manana fanohanana CSS voafetra.Mba hahazoana traikefa tsara indrindra, manoro hevitra anao izahay hampiasa navigateur nohavaozina (na esory ny Compatibility Mode amin'ny Internet Explorer).Mandritra izany fotoana izany, mba hiantohana ny fanohizana ny fanohanana, dia hanolotra ny tranokala tsy misy fomba sy JavaScript izahay.
Ny biopsy rano (LB) dia foto-kevitra izay miha-malaza haingana eo amin'ny sehatry ny biomedical.Ny foto-kevitra dia mifototra indrindra amin'ny fitadiavana ny sombin'ny ADN extracellular mivezivezy (ccfDNA), izay avoaka amin'ny ankapobeny ho sombintsombiny kely aorian'ny fahafatesan'ny sela amin'ny tavy isan-karazany.Ny ampahany kely amin'ireo sombiny ireo dia avy amin'ny tavy na zavamananaina vahiny (vahiny).Amin'ny asa amin'izao fotoana izao, nampiharinay tamin'ny betsimitsitekiteky io foto-kevitra io, karazam-biby iray fantatra amin'ny fahaizany manasivana rano an-dranomasina.Ampiasainay ny fahaizan'ny betsimitsitekiteky ho toy ny sivana voajanahary hisambotra ny sombintsombin'ny ADN momba ny tontolo iainana avy amin'ny loharano isan-karazany mba hanomezana vaovao momba ny fahasamihafan'ny zavamananaina amin'ny tontolo iainana amoron-dranomasina.Asehon'ny vokatray fa ny hemolymph mussel dia misy sombiny ADN izay miovaova be ny habeny, manomboka amin'ny 1 ka hatramin'ny 5 kb.Nasehon'ny filaharan'ny basim-borona fa betsaka ny sombiny ADN avy any ivelany.Anisan'izy ireo, nahita ny sombintsombin'ny ADN avy amin'ny bakteria, archaea ary viriosy izahay, anisan'izany ny viriosy fantatra fa mitondra otrikaretina isan-karazany hita matetika amin'ny tontolo iainana an-dranomasina.Ho fehin-kevitra, ny fandinihanay dia mampiseho fa ny foto-kevitry ny LB ampiharina amin'ny betsimitsitekiteky dia maneho loharanom-pahalalana manankarena nefa mbola tsy fantatra momba ny fahasamihafan'ny mikraoba ao amin'ny tontolo iainana amoron-dranomasina.
Ny fiantraikan'ny fiovan'ny toetr'andro (CC) amin'ny fahasamihafan'ny tontolo iainana an-dranomasina dia sehatra fikarohana mitombo haingana.Ny fiakaran'ny maripanan'izao tontolo izao dia tsy miteraka adin-tsaina ara-batana ihany, fa koa manosika ny fetran'ny evolisiona amin'ny fahamarinan-toerana mafana amin'ny zavamananaina an-dranomasina, izay misy fiantraikany amin'ny fonenan'ny karazam-biby maromaro, manosika azy ireo hitady toe-javatra tsara kokoa [1, 2].Ankoatra ny fiantraikany amin'ny fahasamihafan'ny zavamananaina amin'ny metazoans, ny CC dia manakorontana ny fifandanjana marefo amin'ny fifaneraserana amin'ny micro micro-organisms.Ity dysbacteriose mikraoba ity dia miteraka loza mitatao ho an'ny tontolo iainana an-dranomasina satria mahatonga ny zavamananaina an-dranomasina ho mora voan'ny areti-mifindra [3, 4].Inoana fa ny SS dia manana anjara toerana lehibe amin'ny fahafatesan'olona marobe, izay olana goavana amin'ny fitantanana ny tontolo iainana an-dranomasina [5, 6].Olana lehibe izany noho ny fiantraikany ara-toekarena, ara-tontolo iainana ary ara-tsakafo ateraky ny karazan-dranomasina maro.Marina indrindra izany ho an'ny bivalves miaina any amin'ny faritra polar, izay misy ny fiantraikan'ny CK eo noho eo sy mahery kokoa [6, 7].Raha ny marina, ny bivalves toy ny Mytilus spp.dia ampiasaina betsaka hanaraha-maso ny fiantraikan'ny CC amin'ny tontolo iainana an-dranomasina.Tsy mahagaga raha be dia be ny biomarkers novolavolaina mba hanaraha-maso ny fahasalamany, matetika mampiasa fomba roa sosona ahitana biomarkers miasa mifototra amin'ny asa enzymatic na sela sela toy ny viability sela sy ny phagocytic asa [8].Ireo fomba ireo ihany koa dia ahitana ny fandrefesana ny fifantohan'ny tondro fanerena manokana izay miangona ao amin'ny tavy malefaka aorian'ny fidiran'ny ranon-dranomasina be dia be.Na izany aza, ny fahafahan'ny sivana avo lenta sy ny rafi-pitantanana semi-misokatra amin'ny bivalves dia manome fahafahana hamorona biomarker hemolymph vaovao amin'ny fampiasana ny foto-kevitra momba ny biopsy ranoka (LB), fomba fiasa tsotra sy kely indrindra amin'ny fitantanana ny marary.santionan-dra [9, 10].Na dia misy karazana molekiola mivezivezy maromaro aza dia hita ao amin'ny LB olombelona, ​​​​io hevitra io dia mifototra indrindra amin'ny famakafakana ny fizotry ny ADN amin'ny sombintsombin'ny ADN extracellular (ccfDNA) mivezivezy ao anaty plasma.Raha ny marina, ny fisian'ny ADN mivezivezy ao amin'ny plasma olombelona dia efa fantatra hatramin'ny tapaky ny taonjato faha-20 [11], saingy tao anatin'ny taona vitsivitsy izay ny fahatongavan'ny fomba filaharana avo lenta dia nitarika ny fitiliana klinika mifototra amin'ny ccfDNA.Ny fisian'ireo sombintsombiny ADN mivezivezy ireo dia noho ny ampahany amin'ny famotsorana ny ADN genomika (nokleary sy mitochondrial) aorian'ny fahafatesan'ny sela. Ao amin'ny olona salama, ny fifantohana amin'ny ccfDNA dia ambany (<10 ng/mL) saingy azo ampitomboina in-5-10 amin'ny marary voan'ny aretina isan-karazany na iharan'ny adin-tsaina, ka miteraka fahasimban'ny sela. Ao amin'ny olona salama, ny fifantohana amin'ny ccfDNA dia ambany (<10 ng/mL) saingy azo ampitomboina in-5-10 amin'ny marary voan'ny aretina isan-karazany na iharan'ny adin-tsaina, ka miteraka fahasimban'ny sela. У здоровых людей концентрация вккДНК в норме низкая (<10 нг/мл), но может повышаться в 5–10 раз глет или подвергающихся стрессу, приводящему к повреждению тканей. Ao amin'ny olona salama, ny fifantohan'ny cccDNA dia ambany (<10 ng/mL), saingy mety hitombo in-5-10 izany amin'ny marary manana aretina isan-karazany na ao anatin'ny adin-tsaina izay mitarika ho amin'ny fahasimban'ny sela.在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/mL），但在患有各种病理或承受压受受压加的5-下力倍，从而导致组织损伤。在 健康 个体 中 ， ccfdna 的 浓度 较 低 （（<10 ng/ml） 但 在 各 种 病理 或 承叛 或 承受加 5-10 从而 组织。。 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤Концентрации ccfDNA обычно низкие (<10 нг/мл) у здоровых людей, но могут быть увеличены в 5-10 раз у плица ями или стрессом, что приводит к повреждению тканей. Ny fatran'ny ccfDNA dia matetika ambany (<10 ng/ml) amin'ny olona salama, saingy azo ampitomboina in-5-10 heny amin'ny marary manana aretina na adin-tsaina isan-karazany, ka miteraka fahasimban'ny sela.Ny haben'ny sombintsombin'ny ccfDNA dia miovaova be, saingy matetika dia eo amin'ny 150 ka hatramin'ny 200 bp.[12].Ny famakafakana ny ccfDNA avy amin'ny tena, izany hoe, ny ccfDNA avy amin'ny selan'ny mpampiantrano mahazatra na niova, dia azo ampiasaina hamantarana ny fiovan'ny fototarazo sy ny epigenetika misy ao amin'ny genome nokleary sy / na mitochondrial, ka manampy ny mpitsabo hifidy fitsaboana manokana momba ny molekiola [13].Na izany aza, ny ccfDNA dia azo avy amin'ny loharano vahiny toy ny ccfDNA avy amin'ny sela foetus mandritra ny fitondrana vohoka na avy amin'ny taova nafindra [14,15,16,17].Ny ccfDNA dia loharanom-baovao manan-danja ihany koa mba hamantarana ny fisian'ny asidra nukleika amin'ny otrikaretina (vahiny), izay ahafahan'ny tsimokaretina tsy miparitaka amin'ny areti-mifindra tsy fantatra amin'ny kolontsaina ra, manalavitra ny biopsy invasive amin'ny tavy voan'ny aretina [18].Ny fandinihana vao haingana dia naneho tokoa fa ny ran'olombelona dia misy loharanom-baovao manankarena azo ampiasaina hamantarana ireo otrikaretina virosy sy bakteria, ary manodidina ny 1% amin'ny ccfDNA hita ao amin'ny plasma olombelona dia avy any ivelany [19].Asehon'ireo fanadihadiana ireo fa azo tombanana amin'ny alalan'ny famakafakana ccfDNA ny fahasamihafan'ny zavamananaina amin'ny microbiome mivezivezy.Na izany aza, hatramin'ny vao haingana, io hevitra io dia nampiasaina irery ihany tamin'ny olombelona ary, amin'ny ampahany kely, amin'ny vertebrates hafa [20, 21].
Amin'ity lahatsoratra ity dia mampiasa ny mety ho LB izahay handinihana ny ccfDNA an'ny Aulacomya atra, karazana tatsimo hita matetika ao amin'ny Nosy Kerguelen subantarctic, vondrona nosy eo an-tampon'ny lembalemba lehibe iray izay niforona 35 tapitrisa taona lasa izay.fipoahana volkano.Amin'ny fampiasana rafitra andrana in vitro, hitanay fa ny sisan'ny ADN ao anaty rano an-dranomasina dia alain'ny betsimitsitekiteky haingana ary miditra ao amin'ny efitrano hemolymph.Nasehon'ny filaharan'ny basim-borona fa ny hemolymph ccfDNA mossel dia misy sombiny ADN avy amin'ny fiaviany manokana sy tsy avy amin'ny tena, anisan'izany ny bakteria symbiotika sy ny sisan'ny ADN avy amin'ny biomes mahazatra ny tontolo iainana amoron-dranomasina volkano mangatsiaka.Ny hemolymph ccfDNA koa dia misy filaharan'ny viriosy nalaina avy amin'ny viriosy misy salan'isa mpampiantrano samihafa.Nahita sombiny ADN avy amin'ny biby maro sela toy ny trondro taolana, anemone an-dranomasina, ahidrano ary bibikely ihany koa izahay.Ho fehin-kevitra, ny fandinihanay dia mampiseho fa ny foto-kevitra LB dia azo ampiharina tsara amin'ny tsy fahampian-tsakafo an-dranomasina mba hamoronana repertoire génomika manankarena amin'ny tontolo iainana an-dranomasina.
Ny olon-dehibe (55-70 mm ny halavany) Mytilus platensis (M. platensis) sy Aulacomya atra (A. atra) dia nangonina avy amin’ny morontsiraka be vato intertidal any Port-au-France (049°21.235 S, 070°13.490 E.).Nosy Kerguelen tamin'ny Desambra 2018. Ny betsimitsitekiteky manga lehibe hafa (Mytilus spp.) dia azo avy amin'ny mpamatsy ara-barotra (PEI Mussel King Inc., Prince Edward Island, Canada) ary napetraka tao amin'ny fitoeran-drano misy rivotra voafehy (4°C) misy 10–20 L amin'ny brine artifisialy 32‰.(Siran-dranomasina artifisialy Reef Crystal, Ranomasimbe Instant, Virginia, Etazonia).Isaky ny fanandramana dia norefesina ny halavany sy ny lanjan'ny akorandriaka tsirairay.
Misy protocole malalaka malalaka ho an'ity programa ity dia hita amin'ny aterineto (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1).Raha fohifohy, ny hemolymph LB dia nangonina avy amin'ny hozatry ny mpaka an-keriny araka ny voalaza [22].Ny hemolymph dia nohazavaina tamin'ny centrifugation tamin'ny 1200 × g nandritra ny 3 minitra, ny supernatant dia nivaingana (-20 ° C) mandra-pampiasaina.Ho an'ny fitokanana sy fanadiovana ny cfDNA, ny santionany (1.5-2.0 ml) dia nalevina sy nokarakaraina tamin'ny alàlan'ny kitapo NucleoSnap cfDNA (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) araka ny torolalan'ny mpanamboatra.ccfDNA dia voatahiry ao amin'ny -80 ° C mandra-panadihadiana fanampiny.Tamin'ny andrana sasany, natokana sy nodiovina ny ccfDNA tamin'ny alalan'ny QIAamp DNA Investigator Kit (QIAGEN, Toronto, Ontario, Canada).Ny ADN voadio dia nofaritana tamin'ny alàlan'ny fitiliana PicoGreen mahazatra.Ny fizarana sombintsombiny amin'ny ccfDNA mitoka-monina dia nodinihina tamin'ny alàlan'ny electrophoresis capillary amin'ny alàlan'ny bioanalyzer Agilent 2100 (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) amin'ny alàlan'ny Kit ADN High Sensitivity.Ny assay dia natao tamin'ny fampiasana 1 µl ny santionan'ny ccfDNA araka ny torolalan'ny mpanamboatra.
Ho an'ny filaharan'ireo sombintsombin'ny hemolymph ccfDNA, Génome Québec (Montreal, Quebec, Canada) dia nanomana tranomboky basy vita amin'ny basy tamin'ny alàlan'ny kitapo Illumina DNA Mix an'ny kitapo Illumina MiSeq PE75.Adapter mahazatra (BioO) no nampiasaina.Ny rakitra data manta dia azo alaina ao amin'ny NCBI Sequence Read Archive (SRR8924808 sy SRR8924809).Ny kalitaon'ny famakiana fototra dia nodinihina tamin'ny fampiasana FastQC [23].Trimmomatic [24] dia nampiasaina tamin'ny fametahana adaptatera sy ny famakiana tsy dia tsara.Ny vakin'ny basy miaraka amin'ny faran'ny mpivady dia FLASH natambatra ho vakiteny tokana lava kokoa miaraka amin'ny 20 bp farafahakeliny mba hisorohana ny tsy fifankahazoana [25]. Ny famakiana mitambatra dia notaterina tamin'ny BLASTN tamin'ny alàlan'ny angon-drakitra NCBI Taxonomy bivalve (e value <1e−3 sy 90% homology), ary ny fametahana ny fizotry ny fahasarotana ambany dia natao tamin'ny DUST [26]. Ny famakiana mitambatra dia notaterina tamin'ny BLASTN tamin'ny alàlan'ny angon-drakitra NCBI Taxonomy bivalve (e value <1e−3 sy 90% homology), ary ny fametahana ny fizotry ny fahasarotana ambany dia natao tamin'ny DUST [26]. Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием базы данных таксономии двустворчорчослылюх 1 3 и 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с использованием DUST [26]. Ny vakiteny voarakitra dia nosoratana tamin'ny BLASTN tamin'ny fampiasana ny angon-drakitra taxonomy bivalve NCBI (e value <1e-3 sy 90% homology), ary ny saron-tava ambany be pitsiny dia natao tamin'ny DUST [26].使用双壳类 NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90% 同源性）用BLASTN 注释合并的读敽，年使，并使，并使用用 BLASTN 注释合并的读数，使用广，并使，年年复杂度序列的掩蔽。使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 90% 同源） 用 用 用 注释 合并 读数 ， 使数 ，复杂度 序列 的。。。 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽蔽Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием таксономической базы данных двузлехничать <1e-3 и 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с использованием DUST [26]. Ny vakiteny voarakitra dia nosoratana tamin'ny BLASTN tamin'ny fampiasana ny angon-drakitra taxonomic bivalve NCBI (e value <1e-3 sy 90% homology), ary ny saron-tava ambany be pitsiny dia natao tamin'ny DUST [26].Nizara roa ny vakiteny: mifandraika amin'ny filaharan'ny bivalve (antsoina hoe self-reads) sy tsy mifandray (tsy mamaky tena).Vondrona roa no nivondrona misaraka tamin'ny fampiasana MEGAHIT hamokatra contigs [27].Mandritra izany fotoana izany, ny fizarana taksonômika amin'ny vakiteny mikraoba vahiny dia nosokajiana tamin'ny fampiasana Kraken2 [28] ary nasehon'ny tabilao pie Krona ao amin'ny Galaxy [29, 30].Ny kmers tsara indrindra dia tapa-kevitra ho kmers-59 avy amin'ny andrana santatra nataonay. Ny contigs dia avy eo dia fantatra amin'ny alàlan'ny fampifanarahana amin'ny BLASTN (bivalve NCBI database, e value <1e−10 ary 60% homology) ho an'ny fanamarihana farany. Ny contigs dia avy eo dia fantatra amin'ny alàlan'ny fampifanarahana amin'ny BLASTN (bivalve NCBI database, e value <1e−10 ary 60% homology) ho an'ny fanamarihana farany. Затем собственные контиги были идентифицированы путем сопоставления с BLASTN (база данных двустворчатых моллюбиск, 1 мозлюбиск, 1 ология 60%) для окончательной аннотации. Ny self-contigs dia nofaritana tamin'ny alàlan'ny fifanandrinana amin'ny BLASTN (database bivalve NCBI, e value <1e-10 ary 60% homology) ho an'ny fanamarihana farany.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）对齐来识庫美自他终注释。然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% Затем были идентифицированы собственные контиги для окончательной аннотации путем сопоставления с BLASTN (базал хдмун) оллюсков, значение e <1e-10 и гомология 60%). Ny self-contigs dia fantatra avy eo ho an'ny fanamarihana farany amin'ny alàlan'ny fifanandrinana amin'ny BLASTN (database bivalve NCBI, sanda <1e-10 ary 60% homology). Mifanaraka amin'izany, ny contigs vondrona tsy misy dia nofaritana tamin'ny BLASTN (nt NCBI database, e value <1e−10 ary 60% homology). Mifanaraka amin'izany, ny contigs vondrona tsy misy dia nofaritana tamin'ny BLASTN (nt NCBI database, e value <1e−10 ary 60% homology). Параллельно чужеродные групповые контиги были аннотированы с помощью BLASTN (база данных nt NCBI, значение e <1g-10 % . Mifanaraka amin'izany, ny contigs vondrona vahiny dia notaterina tamin'ny BLASTN (database NT NCBI, e value <1e-10 ary 60% homology).平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群。平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群。 Параллельно контиги, не относящиеся к собственной группе, были аннотированы с помощью BLASTN (база данныгых nt 1 60%). Mifanohitra amin'izany, ny contigs tsy misy tena dia notaterina tamin'ny BLASTN (nt NCBI database, e value <1e-10 ary 60% homology). Ny BLASTX dia natao ihany koa amin'ny contigs tsy misy dikany amin'ny fampiasana ny angona nr sy RefSeq proteinina NCBI (e value <1e-10 sy 60% homology). Ny BLASTX dia natao ihany koa amin'ny contigs tsy misy dikany amin'ny fampiasana ny angona nr sy RefSeq proteinina NCBI (e value <1e-10 sy 60% homology). BLASTX также был проведен на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr и RefSeq NCBI (значогение e <1e. Ny BLASTX dia natao ihany koa amin'ny contigs tsy tena mampiasa ny angona proteinina nr sy RefSeq NCBI (e value <1e-10 sy 60% homology).还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和） 怌 同 。还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和） 怌 同 。 BLASTX также выполняли на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr и RefSeq NCBI (значение e <1e-10 %) Ny BLASTX dia natao ihany koa amin'ny contigs tsy tena mampiasa ny angona proteinina nr sy RefSeq NCBI (e value <1e-10 sy 60% homology).Ny dobo BLASTN sy BLASTX tsy misy contigs dia maneho ny contigs farany (jereo ny rakitra fanampiny).
Ny primer ampiasaina amin'ny PCR dia voatanisa ao amin'ny Table S1.Taq DNA polymerase (Bio Basic Canada, Markham, ON) dia nampiasaina mba hanamafisana ny fototarazo kendrena ccfDNA.Ireto fepetra manaraka ireto no nampiasaina: denaturation amin'ny 95 ° C mandritra ny 3 minitra, 95 ° C mandritra ny 1 minitra, mametraka ny mari-pana annealing mandritra ny 1 minitra, elongation amin'ny 72 ° C mandritra ny 1 minitra, 35 cycles, ary farany 72 ° C ao anatin'ny 10 minitra..Ny vokatra PCR dia nosarahan'ny electrophoresis amin'ny gel agarose (1.5%) misy SYBRTM Safe DNA Gel Stain (Invitrogen, Burlington, ON, Canada) amin'ny 95 V.
Ny betsimitsitekiteky (Mytilus spp.) dia natao acclimatized tao anaty rano 500 ml misy oksizenina (32 PSU) mandritra ny 24 ora amin'ny 4°C.Ny ADN Plasmid misy insert encoding ny filaharan'ny cDNA galectin-7 olombelona (NCBI accession number L07769) dia nampidirina tao amin'ny vial amin'ny fifantohana farany amin'ny 190 μg / μl.Ny betsimitsitekiteky ao anatin'ny toe-javatra mitovy amin'izany tsy misy fanampiana ADN no voafehy.Ny tanky fanaraha-maso fahatelo dia nahitana ADN tsy misy sifotra.Mba hanaraha-maso ny kalitaon'ny ADN amin'ny rano an-dranomasina, dia nalaina ny santionan'ny rano an-dranomasina (20 μl; famerimberenana in-telo) isaky ny tanky amin'ny fotoana voatondro.Ho an'ny traceability ADN plasmid, ny betsimitsitekiteky LB dia nojinjaina tamin'ny fotoana voatondro ary nodinihina tamin'ny qPCR sy ddPCR.Noho ny habetsahan'ny sira amin'ny rano an-dranomasina, ny aliquots dia nalevina tamin'ny rano kalitao PCR (1:10) talohan'ny fitiliana PCR rehetra.
Notanterahina tamin'ny alàlan'ny protocol BioRad QX200 (Mississauga, Ontario, Canada) ny PCR digital droplet (ddPCR).Ampiasao ny mombamomba ny mari-pana mba hamaritana ny mari-pana tsara indrindra (Table S1).Namboarina tamin'ny alàlan'ny famokarana QX200 drops (BioRad).Ny ddPCR dia natao toy izao manaraka izao: 95 ° C nandritra ny 5 min, 50 cycles of 95 ° C nandritra ny 30 s ary ny mari-pana fanalefahana nomena nandritra ny 1 min ary 72 ° C nandritra ny 30 s, 4 ° C nandritra ny 5 minitra ary 90 ° C tao anatin'ny 5 minitra.Ny isan'ny nilatsaka sy ny fanehoan-kevitra tsara (isan'ny kopia/µl) dia norefesina tamin'ny alalan'ny QX200 drop reader (BioRad).Ny santionany misy tsimokaretina latsaky ny 10.000 dia nolavina.Tsy natao ny fanaraha-maso ny lamina isaky ny mandeha ny ddPCR.
Ny qPCR dia natao tamin'ny fampiasana Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Sydney, Australia) sy LGALS7 manokana.Ny PCR quantitative rehetra dia natao tamin'ny 20 µl tamin'ny fampiasana ny QuantiFast SYBR Green PCR Kit (QIAGEN).qPCR dia natomboka tamin'ny 15 min incubation amin'ny 95 ° C arahin'ny 40 cycles amin'ny 95 ° C mandritra ny 10 segondra ary amin'ny 60 ° C mandritra ny 60 segondra miaraka amin'ny fanangonana angona iray.Namboarina tamin'ny fampiasana fandrefesana nifanesy tamin'ny 95 ° C nandritra ny 5 s, 65 ° C nandritra ny 60 s, ary 97 ° C tamin'ny faran'ny qPCR.Ny qPCR tsirairay dia natao tamin'ny triplicate, afa-tsy ny santionany fanaraha-maso.
Koa satria malaza amin'ny tahan'ny sivana avo lenta ny betsimitsitekiteky, dia nanadihady aloha izahay raha afaka manivana sy mitazona ireo sombin-tsolika ADN ao anaty rano an-dranomasina.Nahaliana anay koa raha miangona ao amin'ny rafitra lymphatic semi-open ireo sombiny ireo.Namaha ity olana ity tamin'ny andrana izahay tamin'ny alàlan'ny fanarahana ny anjaran'ireo sombintsombin'ny ADN azo levona nampidirina tamin'ny tanky manga.Mba hanamorana ny fanaraha-maso ny sombintsombin'ny ADN dia nampiasa ADN plasmid vahiny (fa tsy tena) misy ny fototarazon'olombelona galectin-7 izahay.Ny ddPCR dia manara-maso ny sombintsombin'ny ADN plasmid amin'ny rano an-dranomasina sy ny sifotra.Ny vokatra azonay dia mampiseho fa raha toa ka mijanona tsy miova ny habetsaky ny ADN ao anaty rano an-dranomasina rehefa mandeha ny fotoana (hatramin'ny 7 andro) raha tsy misy betsimitsitekiteky, dia saika nanjavona tanteraka ao anatin'ny 8 ora izany ambaratonga izany eo anatrehan'ny betsimitsitekiteky (sary 1a,b).Ny ampahany amin'ny ADN exogenous dia mora hita tao anatin'ny 15 min tao amin'ny fluid intravalvular sy hemolymph (sary 1c).Mbola mety ho hita hatramin'ny 4 ora aorian'ny fiposahan'ny masoandro ireo sombiny ireo.Ity hetsika fanivanana momba ny sombintsombiny ADN ity dia azo ampitahaina amin'ny asa fanivanana ny bakteria sy ny ahidrano [31].Ireo vokatra ireo dia manondro fa ny betsimitsitekiteky dia afaka manivana sy manangona ADN vahiny ao amin'ny efi-tranony.
Ny fifantohana amin'ny ADN plasmid amin'ny rano an-dranomasina amin'ny fisian'ny (A) na ny tsy fisian'ny betsimitsitekiteky, refesina amin'ny ddPCR.Ao amin'ny A, ny valiny dia aseho amin'ny isan-jato, miaraka amin'ny sisin'ny boaty maneho ny isan-jato faha-75 sy faha-25.Ny curve logarithmic napetraka dia aseho amin'ny mena, ary ny faritra alokaloka amin'ny volondavenona dia maneho ny elanelan'ny fahatokisana 95%.Ao amin'ny B, ny tsipika mena dia maneho ny mean ary ny tsipika manga dia maneho ny elanelan'ny fahatokisana 95% ho an'ny fifantohana.C Fiangonan'ny ADN plasmid ao amin'ny hemolymph sy ny fluidin'ny valvular amin'ny betsimitsitekiteky amin'ny fotoana samihafa aorian'ny fampidirana ADN plasmid.Ny valiny dia aseho ho dika mitovy tanteraka hita/mL (± SE).
Manaraka izany, nanadihady ny niandohan'ny ccfDNA tamin'ny sifotra nangonina avy amin'ny fandriana betsimitsitekiteky ao amin'ny Nosy Kerguelen, vondron-nosy lavitra izay misy fiantraikany amin'ny anthropogenic voafetra.Ho an'ity tanjona ity, ny cccDNA avy amin'ny hemolymphs mussel dia natokana sy nodiovina tamin'ny fomba mahazatra ampiasaina hanadiovana ny cccDNA olombelona [32, 33].Hitanay fa ny salan'isa hemolymph ccfDNA amin'ny betsimitsitekiteky dia ao anatin'ny mikrograma ambany isaky ny ml hemolymph (jereo ny tabilao S2, Fampahalalana fanampiny).Ity karazana fifantohana ity dia lehibe lavitra noho ny amin'ny olona salama (nanograma ambany isaky ny milliliter), fa amin'ny tranga tsy fahita firy, amin'ny mararin'ny homamiadana, ny haavon'ny ccfDNA dia mety hahatratra micrograma isaky ny milliliter [34, 35].Ny famakafakana ny haben'ny fizaran'ny hemolymph ccfDNA dia nampiseho fa miovaova be ny haben'ireo sombiny ireo, manomboka amin'ny 1000 bp ka hatramin'ny 1000 bp.hatramin'ny 5000 bp (sary 2).Ny vokatra mitovy amin'izany dia azo tamin'ny fampiasana ny QIAamp Investigator Kit mifototra amin'ny silica, fomba iray ampiasaina matetika amin'ny siansa forensika mba hanavahana haingana sy hanadiovana ny ADN genomika amin'ny santionany ADN ambany, anisan'izany ny ccfDNA [36].
Electrophoregram ccfDNA solontenan'ny hemolymph mussel.Nalaina niaraka tamin'ny NucleoSnap Plasma Kit (ambony) sy QIAamp DNA Investigator Kit.B Sarin'ny lokanga mampiseho ny fizarazaran'ny ccfDNA hemolymph (± SE) amin'ny sifotra.Ny tsipika mainty sy mena dia maneho ny median ary ny quartile voalohany sy fahatelo.
Manodidina ny 1% amin'ny ccfDNA amin'ny olombelona sy primates no manana loharano vahiny [21, 37].Raha jerena ny rafi-pitantanana semi-open an'ny bivalves, ny rano an-dranomasina manankarena mikraoba, ary ny haben'ny fizarana ccfDNA, dia nihevitra izahay fa mety misy dobo ADN mikraoba manankarena sy isan-karazany ny hemolymph ccfDNA.Mba hitsapana an'io petra-kevitra io, dia nalahatray ny hemolymph ccfDNA avy amin'ny santionany Aulacomya atra nangonina avy any amin'ny Nosy Kerguelen, ka namoaka vakiana maherin'ny 10 tapitrisa, 97.6% tamin'ireo no nandalo fanaraha-maso ny kalitao.Ny vakiteny dia nosokajiana araka ny loharanon-tena manokana sy tsy miankina amin'ny fampiasana ny tahiry bivalve BLASTN sy NCBI (sary S1, Fampahalalana fanampiny).
Ao amin'ny olombelona, ​​ny ADN nokleary sy mitochondrial dia azo avoaka ao anaty rà [38].Na izany aza, tamin'ity fanadihadiana ity dia tsy azo natao ny namaritra amin'ny antsipiriany ny ADN génomika nokleary an'ny betsimitsitekiteky, satria ny A. atra génôme dia tsy mbola nofaritana na nofaritana.Na izany aza, afaka namantatra sombiny ccfDNA maromaro avy amin'ny fiavianay izahay tamin'ny fampiasana ny bivalve library (sary S2, Fampahalalana fanampiny).Nohamafisinay ihany koa ny fisian'ny sombiny ADN avy amin'ny fiaviantsika manokana amin'ny alàlan'ny fanamafisan'ny PCR mivantana an'ireo fototarazo A. atra izay nalahatra (sary 3).Torak'izany koa, raha jerena fa hita ao amin'ny tahiry ho an'ny daholobe ny génome mitochondrial an'ny A. atra, dia afaka mahita porofo momba ny fisian'ny sombiny ccfDNA mitochondrial ao amin'ny hemolymph ny A. atra.Ny fisian'ny sombintsombin'ny ADN mitochondrial dia nohamafisin'ny fanamafisana PCR (sary 3).
Ny fototarazo mitochondrial isan-karazany dia hita tao amin'ny hemolymph A. atra (teboka mena - laharan'ny tahiry: SRX5705969) sy M. platensis (teboka manga - laharan'ny tahiry: SRX5705968) nohamafisin'ny PCR.Sary nalaina avy amin'i Breton et al., 2011 B Fanamafisana ny supernatant hemolymph avy amin'ny A. atra Tehirizina amin'ny taratasy FTA.Mampiasà totohondry 3 mm mba hanampiana mivantana ny fantsona PCR misy ny fangaro PCR.
Noho ny fisian'ny votoaty mikraoba be dia be ao anaty rano an-dranomasina, dia nifantoka tamin'ny famaritana ny filaharan'ny ADN mikraoba ao amin'ny hemolymph izahay.Mba hanaovana izany dia mampiasa paikady roa samy hafa izahay.Ny tetika voalohany dia nampiasa Kraken2, programa fanasokajiana filaharana mifototra amin'ny algorithm izay afaka mamantatra ny filaharana mikraoba miaraka amin'ny fahamendrehana azo oharina amin'ny BLAST sy ny fitaovana hafa [28].Maherin'ny 6719 ny famakiana no tapa-kevitra fa avy amin'ny bakteria, raha 124 sy 64 kosa avy amin'ny archaea sy viriosy (sary 4).Ny ampahany betsaka indrindra amin'ny ADN bakteria dia Firmicutes (46%), Proteobacteria (27%), ary Bacteroidetes (17%) (sary 4a).Ity fizarana ity dia mifanaraka amin'ny fandalinana teo aloha momba ny microbiome mussel manga an-dranomasina [39, 40].Ny Gammaproteobacteria no kilasy lehibe amin'ny Proteobacteria (44%), anisan'izany ny Vibrionales maro (sary 4b).Ny fomba ddPCR dia nanamafy ny fisian'ny vibrio ADN ao amin'ny ccfDNA an'ny A. atra hemolymph (sary 4c) [41].Mba hahazoana fampahalalana bebe kokoa momba ny niandohan'ny bakteria ccfDNA, dia nisy fomba fanampiny noraisina (sary S2, Fampahalalana fanampiny). Amin'ity tranga ity, dia mamaky fa ny fifandimbiasana dia natambatra ho toy ny vakiteny mifamatotra ary nosokajiana ho an'ny tena (bivalves) na tsy miankina amin'ny fampiasana BLASTN ary ny sandan'ny 1e−3 ary tapaka miaraka amin'ny> 90% homology. Amin'ity tranga ity, dia mamaky fa ny fifandimbiasana dia natambatra ho toy ny vakiteny mifamatotra ary nosokajiana ho an'ny tena (bivalves) na tsy miankina amin'ny fampiasana BLASTN ary ny sandan'ny 1e−3 ary tapaka miaraka amin'ny> 90% homology. В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и были классифицированысто каквланыство юски) или чужие по происхождению с использованием BLASTN и значения e 1e-3 и отсечения с гомологией> 90%. Amin'ity tranga ity, ny famakiana mifanindry dia nangonina ho toy ny vakiteny mifarana ary nosokajiana ho teratany (bivalve) na tsy tany am-boalohany amin'ny fampiasana BLASTN sy ny sandan'ny 1e-3 ary tapaka miaraka amin'ny> 90% homology.在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN 和1e-3 的e 会咐>90% 我們和>90%为自身（双壳类）或非自身来源。在 这 种 情况 下 ， 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 ， 使用 使用 使用 的 使用 1 % 和 和 1 % 和同源性 的 分类 自身 （双 壳类） 非 自身。。。。。。 В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и классифицированы как собстолоство и) или несобственные по происхождению с использованием значений e BLASTN и 1e-3 и порога гомологии> 90%. Amin'ity tranga ity, ny vakiteny mifanindry dia nangonina ho vakiteny mifarana miaraka ary sokajiana ho azy manokana (bivalves) na tsy tany am-boalohany amin'ny fampiasana ny sanda e BLASTN sy 1e-3 ary ny tokonam-baravarana homolojia> 90%.Koa satria mbola tsy nisy filaharana ny génome A. atra dia nampiasa ny paikadin'ny fivoriambe de novo an'ny assembler MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS).Miisa 147.188 ny contigs fantatra fa miankina (bivalve) niaviany.Ireo contigs ireo dia nipoaka tamin'ny e-values ​​1e-10 tamin'ny fampiasana BLASTN sy BLASTX.Io tetika io dia nahafahanay hamantatra ireo sombin-javatra tsy bivalve 482 misy ao amin'ny A. atra ccfDNA.Maherin'ny antsasany (57%) amin'ireo sombiny ADN ireo dia azo avy amin'ny bakteria, indrindra avy amin'ny symbionts gill, anisan'izany ny symbionts sulfotrophic, ary avy amin'ny symbionts gill Solemya velum (sary 5).
Ny habetsahana mitovitovy amin'ny haavon'ny karazana.B Fahasamihafana mikraoba amin'ny fila roa lehibe (Firmicutes sy Proteobacteria).Fanamafisana solontena ny ddPCR C Vibrio spp.A. Sombiny amin'ny fototarazo 16S rRNA (manga) amin'ny hemolymph atra telo.
482 ny fitambaran'ny contigs voaangona no nodinihina.Profile ankapoben'ny fitsinjarana taksonomika amin'ny fanamarihan'ny contig metagenomika (prokaryotes sy eukaryotes).B Fizarana amin'ny antsipiriany ny sombintsombin'ny ADN bakteria fantatry ny BLASTN sy BLASTX.
Ny famakafakana Kraken2 dia nampiseho ihany koa fa ny mossel ccfDNA dia misy sombintsombin'ny ADN archaeal, ao anatin'izany ny ADN Euryarchaeota (65%), Crenarchaeota (24%), ary Thaurmarcheota (11%) (sary 6a).Tsy tokony hahagaga ny fisian'ny sombintsombiny ADN avy amin'ny Euryarchaeota sy Crenarchaeota, izay hita teo aloha tao amin'ny vondrom-piarahamonina mikraoba an'ny sifotra Kalifornia [42].Na dia matetika mifandray amin'ny toe-javatra faran'izay henjana aza ny Euryarchaeota, dia fantatra izao fa ny Euryarchaeota sy Crenarcheota dia anisan'ireo prokaryotes mahazatra indrindra ao amin'ny tontolo cryogenic an-dranomasina [43, 44].Tsy mahagaga ny fisian'ny zavamiaina bitika dia bitika metanôgène ao amin'ny betsimitsitekiteky, raha jerena ny tatitra vao haingana momba ny fivoahan'ny metanina be dia be avy amin'ny fivoahana ambany ao amin'ny Lembalemba Kerguelen [45] sy ny mety ho famokarana metana mikraoba hita any amin'ny morontsirak'ireo Nosy Kerguelen [46].
Nitodika tany amin'ny famakiana avy amin'ny viriosy ADN ny saintsika avy eo.Raha ny fahalalantsika indrindra dia ity no fianarana tsy lasibatra voalohany momba ny votoatin'ny viriosy amin'ny betsimitsitekiteky.Araka ny efa nampoizina dia hitanay ny sombiny ADN misy bacteriophages (Caudovirales) (sary 6b).Na izany aza, ny ADN viriosy mahazatra indrindra dia avy amin'ny phylum of nucleocytoviruses, fantatra ihany koa amin'ny hoe virus nokleary cytoplasmic large DNA (NCLDV), izay manana genome lehibe indrindra amin'ny viriosy rehetra.Ao anatin'io phylum io, ny ankamaroan'ny filaharan'ny ADN dia an'ny fianakaviana Mimimidoviridae (58%) sy Poxviridae (21%), izay misy vertebrates sy arthropods ny mpampiantrano voajanahary, fa ny ampahany kely amin'ireo filaharan'ny ADN ireo dia an'ny algôma virolojika fantatra.Manimba ny alga eukaryotic an-dranomasina.Ny filaharana dia azo avy amin'ny viriosy Pandora ihany koa, ilay viriosy goavam-be manana haben'ny génome lehibe indrindra amin'ireo karazana viriosy fantatra.Mahaliana fa ny isan'ny mpampiantrano fantatra fa voan'ny otrik'aretina, araka ny famaritana ny hemolymph ccfDNA sequencing, dia somary lehibe (sary S3, Fampahalalana fanampiny).Tafiditra ao anatin'izany ny viriosy mamindra bibikely toy ny Baculoviridae sy Iridoviridae, ary koa ny viriosy izay mitondra ny amoeba, ny ahidrano ary ny vertebrates.Nahita filaharana mifanaraka amin'ny génom Pithovirus sibericum ihany koa izahay.Ny Pitoviruses (fantatra ihany koa amin'ny hoe "virosy zombie") dia natokana voalohany tamin'ny permafrost 30.000 taona tany Siberia [47].Noho izany, ny valiny dia mifanaraka amin'ny tatitra teo aloha izay mampiseho fa tsy ny karazam-biby maoderina rehetra amin'ireo viriosy ireo no lany tamingana [48] ary ireo viriosy ireo dia mety ho hita any amin'ny tontolo iainana an-dranomasina subarctic lavitra.
Farany, nanao fitsapana izahay mba hahitana raha afaka mahita sombiny ADN avy amin'ny biby maro samihafa.Contigs vahiny 482 no voamarik'i BLASTN sy BLASTX miaraka amin'ny tranomboky nt, nr ary RefSeq (genomic sy proteinina).Ny vokatra azonay dia mampiseho fa anisan'ny ampahany vahiny amin'ny ccfDNA an'ny biby multicellular ADN amin'ny taolana taolana no mibahan-toerana (sary 5).Hita ihany koa ny sisan’ny ADN avy amin’ny bibikely sy ny karazana hafa.Ny ampahany betsaka amin'ny sombintsombin'ny ADN dia tsy fantatra, angamba noho ny tsy fisian'ny karazan-javamaniry an-dranomasina marobe amin'ny angon-drakitra genomika raha oharina amin'ny karazana terestrialy [49].
Amin'ity taratasy ity, ampiharintsika amin'ny betsimitsitekiteky ny foto-kevitra LB, amin'ny filazana fa ny filaharan'ny tifitra hemolymph ccfDNA dia afaka manome fanazavana momba ny firafitry ny tontolo iainana amoron-dranomasina.Indrindra indrindra, hitanay fa 1) ny hemolymph mussel dia misy santionan'ny ADN miparitaka be (~1-5 kb) somary avo be;2) Sady mahaleo tena no tsy mahaleo tena ireo sombiny ADN ireo.4) Mitranga haingana ny fivondronan'ireo potipolin'ny ccfDNA vahiny ireo ao amin'ny hemolymph ary manampy amin'ny asa fanasivanana anatiny ny betsimitsitekiteky.Ho fehin-kevitra, ny fandinihanay dia mampiseho fa ny foto-kevitry ny LB, izay nampiharina indrindra teo amin'ny sehatry ny biomedicine hatramin'izao, dia mandika loharanom-pahalalana manankarena nefa tsy fantatra izay azo ampiasaina mba hahatakarana bebe kokoa ny fifandraisana misy eo amin'ny karazana sentinel sy ny tontolo iainany.
Ho fanampin'ny primates, ny fitokana-monina ccfDNA dia notaterina tamin'ny biby mampinono, anisan'izany ny totozy, alika, saka, ary soavaly [50, 51, 52].Na izany aza, araka ny fahafantaranay, ny fandinihanay no voalohany mitatitra ny fahitana sy ny filaharan'ny ccfDNA amin'ny karazam-biby an-dranomasina misy rafitra mivezivezy malalaka.Io endri-javatra anatomika io sy ny fahaizan'ny sivana ny betsimitsitekiteky dia mety hanazava ny haben'ny haben'ny sombintsombiny ADN raha oharina amin'ny karazana hafa.Ao amin'ny olombelona, ​​ny ankamaroan'ny sombintsombin'ny ADN mivezivezy ao amin'ny ra dia sombintsombiny kely manomboka amin'ny 150 ka hatramin'ny 200 bp.miaraka amin'ny fara tampony 167 bp [34, 53].Ny ampahany kely nefa manan-danja amin'ny sombintsombin'ny ADN dia eo anelanelan'ny 300 sy 500 bp ny habeny, ary eo amin'ny 5% eo ho eo no lava mihoatra ny 900 bp.[54].Ny anton'io fizarana habe io dia ny loharanon'ny ccfDNA ao amin'ny plasma dia vokatry ny fahafatesan'ny sela, na noho ny fahafatesan'ny sela na noho ny necrosis amin'ny sela hematopoietika mivezivezy amin'ny olona salama na noho ny apoptose amin'ny sela fivontosana amin'ny mararin'ny homamiadana (fantatra amin'ny hoe ADN tumor mivezivezy).,ctDNA).Ny haben'ny fizarana ny hemolymph ccfDNA hitanay tao amin'ny betsimitsitekiteky dia eo amin'ny 1000 ka hatramin'ny 5000 bp, izay milaza fa manana fiaviana hafa ny ccfDNA.Hevitra lojika izany, satria manana rafitra vascular semi-open ny betsimitsitekiteky ary miaina amin'ny tontolo anaty rano an-dranomasina misy ADN genomika mikraoba be dia be.Raha ny marina, ny andrana nataonay tamin'ny laboratoara mampiasa ADN exogenous dia naneho fa ny betsimitsitekiteky dia manangona sombin-tsolika ADN ao anaty rano an-dranomasina, fara fahakeliny, aorian'ny ora vitsivitsy dia simba izy ireo aorian'ny fisintonana sela sy/na navoaka sy/na voatahiry any amin'ny fikambanana samihafa.Noho ny fahasamihafan'ny sela (na prokaryotic na eukaryotic), ny fampiasana ny efitrefitra intravalvular dia hampihena ny habetsaky ny ccfDNA avy amin'ny loharanon-tena sy avy any ivelany.Raha jerena ny maha-zava-dehibe ny hery fiarovana voajanahary bivalve sy ny hamaroan'ny phagocytes mivezivezy, dia nihevitra izahay fa na ny ccfDNA vahiny aza dia manankarena amin'ny phagocytes mivezivezy izay manangona ADN avy any ivelany amin'ny fihinanana microorganisms sy / na fako sela.Raha atambatra, ny valiny dia mampiseho fa ny bivalve hemolymph ccfDNA dia fitehirizana tsy manam-paharoa amin'ny fampahalalana molekiola ary manamafy ny maha-karazan'izy ireo azy ireo.
Ny angon-drakitray dia manondro fa ny filaharana sy ny famakafakana ireo sombintsombiny hemolymph ccfDNA avy amin'ny bakteria dia afaka manome fampahalalana fototra momba ny flora bakteria mpampiantrano sy ny bakteria misy ao amin'ny tontolo iainana an-dranomasina manodidina.Ny teknikan'ny filaharan'ny tifitra dia nanambara ny filaharan'ny bakteria commensal A. atra gill izay mety ho tsy hita raha toa ka nampiasaina ny fomba famantarana 16S rRNA mahazatra, noho ny fitongilanan'ny tranomboky reference.Raha ny marina, ny fampiasanay ny angon-drakitra LB nangonina avy amin'ny M. platensis ao amin'ny sosona betsimitsitekiteky ao Kerguelen dia nampiseho fa ny firafitry ny symbionts bakteria mifandray amin'ny gill dia mitovy amin'ny karazam-biby roa (sary S4, Fampahalalana fanampiny).Ity fitovizan'ny sifotra roa samy hafa amin'ny fototarazo ity dia mety hitaratra ny firafitry ny vondrom-piarahamonina bakteria ao amin'ny toerana mangatsiaka, solifara ary volkano ao Kerguelen [55, 56, 57, 58].Nolazaina tsara ny habetsahan'ny zavamiaina bitika mampidina solifara avo kokoa rehefa mijinja betsimitsitekiteky avy amin'ny morontsiraka misy bioturbate [59], toy ny morontsirak'i Port-au-France.Mety hisy fiantraikany amin'ny fifindran'ny horizontaly ny flora commensal mussel [60, 61].Ilaina ny fikarohana bebe kokoa mba hamaritana ny fifandraisana misy eo amin'ny tontolo an-dranomasina, ny fanambanin'ny ranomasina, ary ny firafitry ny bakteria symbiotika ao anaty sifotra.Mbola mitohy ireo fianarana ireo amin’izao fotoana izao.
Ny halavany sy ny fifantohana amin'ny hemolymph ccfDNA, ny fahatsorana amin'ny fanadiovana azy, ary ny kalitao avo lenta ahafahana manara-maso haingana ny basy dia ny sasany amin'ireo tombony maro amin'ny fampiasana mossel ccfDNA hanombanana ny zavamananaina ao amin'ny tontolo iainana amoron-dranomasina.Ity fomba fiasa ity dia mahomby indrindra amin'ny famaritana ireo vondrom-piarahamonina virosy (virosy) ao amin'ny tontolo iainana iray [62, 63].Tsy sahala amin'ny bakteria, archaea ary eukaryotes, ny génome viriosy dia tsy misy fototarazo voatahiry phylogenetically toy ny sequences 16S.Ny vokatra azonay dia manondro fa ny biopsies ranon-javatra avy amin'ny karazana famantarana toy ny betsimitsitekiteky dia azo ampiasaina hamantarana ny ampahany betsaka amin'ny viriosy ccfDNA fantatra amin'ny fifindran'ny mpampiantrano izay matetika monina amin'ny tontolo iainana an-dranomasina.Anisan'izany ny viriosy fantatra fa mitondra protozoa, arthropods, bibikely, zavamaniry ary viriosy bakteria (oh: bacteriophages).Nisy fizarana mitovy amin'izany hita rehefa nandinika ny hemolymph ccfDNA virome amin'ny betsimitsitekiteky manga (M. platensis) nangonina tao anatin'ilay sosona betsimitsitekiteky tao Kerguelen (Table S2, Fampahalalana fanampiny).Ny filaharan'ny basy ccfDNA dia fomba fiasa vaovao mahazo vahana kokoa amin'ny fandalinana ny virome amin'ny olombelona na karazana hafa [21, 37, 64].Ity fomba fiasa ity dia tena ilaina indrindra amin'ny fandalinana ny viriosy ADN mitongilana roa, satria tsy misy fototarazo tokana voatahiry amin'ireo viriosy ADN mipetaka roa, izay maneho ny karazana viriosy isan-karazany sy midadasika indrindra ao Baltimore [65].Na dia mijanona ho tsy voasokajy aza ny ankamaroan'ireo viriosy ireo ary mety ahitana viriosy avy amin'ny faritra tsy fantatra tanteraka amin'ny tontolon'ny viriosy [66], dia hitanay fa ny virome sy ny faritra mpampiantrano ny sifotra A. atra sy M. platensis dia latsaka eo anelanelan'ireo karazana roa ireo.mitovy (jereo ny sary S3, fampahalalana fanampiny).Tsy mahagaga izany fitoviana izany, satria mety ho taratry ny tsy fahampian'ny fifantenana amin'ny fandraisana ny ADN eo amin'ny tontolo iainana.Ny fianarana ho avy mampiasa RNA voadio dia ilaina amin'izao fotoana izao mba hamaritana ny virome RNA.
Tao anatin'ny fandalinanay, dia nampiasa fantsona tena henjana namboarina avy amin'ny asan'i Kowarski sy ny mpiara-miasa [37] izahay, izay nampiasa dingana roa famafana ny vakiteny sy ny contigs mialoha sy aorian'ny fivorian'ny ccfDNA teratany, ka nahatonga ny ampahany betsaka amin'ny famakiana tsy voatanisa.Noho izany, tsy azontsika atao ny manilika fa ny sasany amin'ireo vakiteny tsy voatanisa ireo dia mety mbola manana ny fiaviany manokana, indrindra fa noho ny tsy fisian'ny fototarazo momba an'io karazana sifotra io.Nampiasa ity fantsona ity ihany koa izahay satria niahiahy momba ny chimeras eo amin'ny tena sy ny tsy mamaky tena ary ny halavan'ny famakiana novokarin'ny Illumina MiSeq PE75.Ny antony iray hafa mahatonga ny ankamaroan'ny vakiteny tsy voatanisa dia ny ankamaroan'ny mikraoba an-dranomasina, indrindra any amin'ny faritra lavitra toa an'i Kerguelen, dia tsy voamarika.Nampiasa Illumina MiSeq PE75 izahay, raha mihevitra ny halavan'ny sombiny ccfDNA mitovy amin'ny ccfDNA olombelona.Ho an'ny fanadihadiana ho avy, raha jerena ny valin'ny fikarohanay fa ny hemolymph ccfDNA dia mamaky lava kokoa noho ny olombelona sy/na ny biby mampinono, dia manoro hevitra izahay ny hampiasa sehatra filaharana mety kokoa amin'ny sombiny ccfDNA lava kokoa.Ity fomba fanao ity dia hanamora kokoa ny famantarana famantarana bebe kokoa ho an'ny fanadihadiana lalindalina kokoa.Ny fahazoana ny filaharan'ny genome nokleary A. atra tsy misy amin'izao fotoana izao dia hanamora be ny fanavakavahana ny ccfDNA avy amin'ny loharanon-tena sy tsy miankina.Raha jerena fa ny fikarohana nataontsika dia nifantoka tamin'ny mety hampiharana ny foto-kevitra momba ny biopsy ranoka amin'ny betsimitsitekiteky, manantena izahay fa satria io hevitra io no ampiasaina amin'ny fikarohana ho avy, dia hisy fitaovana sy fantsona vaovao hamolavola mba hampitomboana ny mety ho an'ity fomba ity hianarana ny fahasamihafan'ny mikraoba amin'ny betsimitsitekiteky.tontolo iainana an-dranomasina.
Amin'ny maha biomarker klinika tsy misy invasive, ny haavon'ny plasma olombelona amin'ny ccfDNA dia mifandray amin'ny aretina isan-karazany, ny fahasimbana amin'ny tavy, ary ny toetry ny adin-tsaina [67,68,69].Io fitomboana io dia mifandray amin'ny famotsorana ny sombintsombin'ny ADN avy amin'ny fiaviany manokana aorian'ny fahasimban'ny sela.Niresaka an'io olana io izahay tamin'ny alàlan'ny adin-tsaina mahery vaika, izay nipoitra vetivety tamin'ny hafanana 30 ° C ny betsimitsitekiteky.Nanao fanadihadiana momba ny karazana betsimoka telo izahay tamin'ny andrana tsy miankina telo.Na izany aza, tsy nahita fiovana teo amin'ny haavon'ny ccfDNA izahay taorian'ny adin-tsaina mahery vaika (jereo ny sary S5, fampahalalana fanampiny).Ity fikarohana ity dia mety hanazava, farafaharatsiny amin'ny ampahany, ny zava-misy fa ny betsimitsitekiteky dia manana rafitra mivezivezy semi-open ary manangona ADN vahiny be dia be noho ny asa sivana avo lenta.Amin'ny lafiny iray, ny betsimitsitekiteky, toy ny tsy fahita firy, dia mety hahatohitra kokoa ny fahasimban'ny sela vokatry ny adin-tsaina, ka mametra ny famoahana ny ccfDNA ao amin'ny hemolymph azy [70, 71].
Hatramin'izao, ny famakafakana ADN momba ny zavamananaina ao amin'ny tontolo iainana anaty rano dia nifantoka indrindra tamin'ny metabarcode ADN (eDNA) momba ny tontolo iainana.Na izany aza, io fomba io dia matetika voafetra amin'ny fanadihadiana momba ny biodiversity rehefa ampiasaina ny primer.Ny fampiasana ny filaharan'ny basim-borona dia mandingana ny fetran'ny PCR sy ny fifantenana mitongilana amin'ireo andiany voalohany.Noho izany, amin'ny lafiny iray, ny fombantsika dia manakaiky kokoa ny fomba fampandehanana eDNA Shotgun vao haingana, izay afaka mametaka mivantana ny ADN voazarazara ary manadihady saika ny zavamananaina rehetra [72, 73].Na izany aza, misy olana fototra maromaro izay manavaka ny LB amin'ny fomba eDNA mahazatra.Mazava ho azy, ny fahasamihafana lehibe eo amin'ny eDNA sy LB dia ny fampiasana mpampiantrano sivana voajanahary.Ny fampiasana karazana an-dranomasina toy ny sponjy sy bivalve (Dresseina spp.) ho toy ny sivana voajanahary amin'ny fandalinana ny eDNA dia notaterina [74, 75].Na izany aza, ny fandalinana nataon'i Dreissena dia nampiasa biopsies amin'ny sela izay nalaina tamin'ny ADN.Ny famakafakana ny ccfDNA avy amin'ny LB dia tsy mitaky biopsy amin'ny tissue, fitaovana manokana ary indraindray lafo vidy mifandray amin'ny eDNA na biopsy tissue.Raha ny marina, vao haingana izahay no nitatitra fa ny ccfDNA avy amin'ny LB dia azo tehirizina sy hodinihina miaraka amin'ny fanohanan'ny FTA raha tsy mitazona rojo mangatsiaka, izay fanamby lehibe ho an'ny fikarohana any amin'ny faritra lavitra [76].Tsotra ihany koa ny fitrandrahana ny ccfDNA avy amin'ny biopsies ranoka ary manome ADN kalitao avo lenta ho an'ny filaharan'ny basy sy famakafakana PCR.Tombontsoa lehibe izany raha jerena ny sasany amin'ireo fetra ara-teknika mifandraika amin'ny famakafakana eDNA [77].Ny fahatsorana sy ny vidiny ambany amin'ny fomba fanaovana santionany dia mety indrindra ho an'ny programa fanaraha-maso maharitra.Ho fanampin'ny fahaizan'izy ireo sivana avo lenta, ny endri-javatra malaza iray hafa amin'ny bivalves dia ny firafitry ny mucopolysaccharide simika amin'ny mucus, izay mampiroborobo ny fidiran'ny viriosy [78, 79].Izany no mahatonga ny bivalve ho sivana voajanahary tsara indrindra hamaritana ny zavamananaina sy ny fiantraikan'ny fiovaovan'ny toetr'andro amin'ny tontolo iainana anaty rano.Na dia azo jerena ho fetran'ny fomba fiasa raha oharina amin'ny eDNA ny fisian'ny sombintsombin'ny ADN avy amin'ny mpampiantrano, ny vidiny mifandraika amin'ny fananana ccfDNA teratany toy izany raha oharina amin'ny eDNA dia azo takarina miaraka amin'ny fampahalalana be dia be ho an'ny fandalinana ara-pahasalamana.offset mpampiantrano.Tafiditra ao anatin'izany ny fisian'ny filaharan'ny viriosy tafiditra ao anatin'ny fototarazon'ilay mpampiantrano.Zava-dehibe indrindra izany ho an'ny betsimitsitekiteky, noho ny fisian'ny retrovirus leukemia mitsivalana amin'ny bivalve [80, 81].Ny tombony hafa amin'ny LB amin'ny eDNA dia ny manararaotra ny hetsika phagocytic amin'ny sela ra mivezivezy ao amin'ny hemolymph, izay mandevona ny microorganisms (sy ny génome).Ny phagocytosis no tena asan'ny selan'ny ra ao amin'ny bivalves [82].Farany, ny fomba dia manararaotra ny fahafahan'ny sivana avo lenta (1,5 l/h eo ho eo amin'ny rano an-dranomasina) sy ny fiverimberenan'ny roa andro, izay mampitombo ny fifangaroan'ny ranon-dranomasina samihafa, mamela ny fisamborana ny eDNA heterologous.[83, 84].Noho izany, fomba mahaliana ny fanadihadiana momba ny ccfDNA momba ny sakafo, ny toekarena ary ny tontolo iainana.Mitovy amin'ny famakafakana ny LB nangonina avy amin'ny olombelona, ​​ity fomba ity koa dia manokatra ny mety handrefesana ny fiovan'ny fototarazo sy ny epigenetika amin'ny ADN mpampiantrano ho setrin'ny zavatra exogenous.Ohatra, ny teknolojia fandrindrana taranaka fahatelo dia azo vinavinaina hanao famakafakana methylation amin'ny genome-wide amin'ny ccfDNA teratany amin'ny fampiasana ny filaharana nanopore.Ity dingana ity dia tokony hohamafisin'ny zava-misy fa ny halavan'ny sombintsombiny ccfDNA dia mifanaraka tsara amin'ny sehatra filaharana efa ela be izay mamela ny famakafakana methylation ADN amin'ny genome-wide avy amin'ny hazakazaka tokana tsy mila fanovana simika.Noho izany, afaka manome fahatakarana manan-danja amin'ny rafitra fototra mifehy ny valinteny aorian'ny fiparitahan'ny fiovan'ny toetr'andro na ny loto [87].Na izany aza, ny fampiasana ny LB dia tsy misy fetra.Tsy ilaina ny milaza fa izany dia mitaky ny fisian'ny karazana famantarana ao amin'ny tontolo iainana.Araka ny voalaza etsy ambony, ny fampiasana ny LB hanombanana ny fahasamihafan'ny zavamananaina amin'ny tontolo iainana iray dia mitaky fantsona bioinformatics henjana izay mandinika ny fisian'ny sombintsombin'ny ADN avy amin'ny loharano.Ny olana lehibe iray hafa dia ny fisian'ny génome reference ho an'ny karazana an-dranomasina.Antenaina fa hanamora ny famakafakana toy izany amin'ny ho avy ny hetsika toy ny Tetikasa Genomes Mammal Marine sy ny tetikasa Fish10k vao naorina [88].Ny fampiharana ny foto-kevitry ny LB amin'ny zavamananaina famahanana sivana an-dranomasina dia mifanaraka amin'ny fandrosoana farany amin'ny teknolojia filaharana, ka mety tsara amin'ny fampivoarana biomarker multi-ohm mba hanomezana fampahalalana manan-danja momba ny fahasalaman'ny toeram-ponenana an-dranomasina ho setrin'ny adin-tsaina ara-tontolo iainana.
Ny angon-drakitra momba ny genome dia napetraka ao amin'ny NCBI Sequence Read Archive https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 ambanin'ny Bioprojects SRR8924808.
Brierley AS, Kingsford MJ Ny fiantraikan'ny fiovan'ny toetr'andro eo amin'ny fiainana an-dranomasina sy ny tontolo iainana.Cole Biology.2009;19: P602–P614.
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Almpanidou V, Bevilacqua S, et al.Diniho ny fiantraikan'ny fiovaovan'ny toetr'andro sy ny adin-tsaina hafa eo an-toerana amin'ny tontolo an-dranomasina.tontolo siantifika ankapobeny.2021;755:142564.
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P, et al.).Science ny voalohan'ny volana martsa.2020;7:48.
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. Ny fihenan'ny fandeferana amin'ny hafanana amin'ny toe-javatra miverimberina amin'ny hafanana dia manazava ny fahafatesan'ny moka manga amin'ny fahavaratra.Tatitry ny siantifika 2019;9:17498.
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER, et al.Fiovana vao haingana momba ny matetika, ny antony ary ny halehiben'ny fahafatesan'ny biby.Proc Natl Acad Sci USA.2015;112:1083-8.
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mugheti D, Cerruti F, Hosseini S, et al.Ny otrikaretina marobe tsy voafaritra manokana dia mety nahatonga ny fahafatesan'ny Pinna nobilis faobe.Fiainana.2020;10:238.
Bradley M, Coutts SJ, Jenkins E, O'Hara TM.Ny fiantraikan'ny fiovan'ny toetr'andro amin'ny aretina zoonotika Arctic.Int J Circumpolar fahasalamana.2005;64:468–77.
Beyer J., Greene NW, Brooks S., Allan IJ, Ruus A., Gomez T. et al.Blue Mussels (Mytilus edulis spp.) ho zavamananaina famantarana amin'ny fanaraha-maso ny fandotoana ny morontsiraka: famerenana.Mar Environ Res 2017;130:338-65.
Siravegna G, Marsoni S, Siena S, Bardelli A. Fampidirana ny biopsy rano amin'ny fitsaboana homamiadana.Nat Rev Clean Oncol.2017;14:531–48.
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C, et al.Fahamatorana biopsy ranon-javatra: mamela ny ADN hivezivezy.Nat Rev Cancer.2017;17:223–38.
Mandel P., Metais P. Ny asidra nucleic amin'ny plasma olombelona.Minisiteran'ny fivorian'ny orinasa Soc Biol.1948;142:241-3.
Bronkhorst AJ, Ungerer W, Holdenrieder S. Andraikitra vaovao ho an'ny ADN tsy misy sela ho marika molekiola ho an'ny fitsaboana homamiadana.Famaritana ny famakafakana biomolar.2019;17:100087.
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS Liquid biopsy dia miditra amin'ny toeram-pitsaboana - olana amin'ny fampiharana sy fanamby ho avy.Nat Rev Clin Oncol.2021;18:297–312.
Lo YM, Corbetta N., Chamberlain PF, Rai W., Sargent IL, Redman CW ary ny hafa.Ny ADN foetal dia hita ao amin'ny plasma sy ny serum reny.Lancet.1997;350:485-7.
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR Fandalinana ny fizotran'ny fitondrana vohoka sy ny fahasarotana amin'ny fampiasana RNA extracellular mivezivezy amin'ny ran'ny vehivavy mandritra ny fitondrana vohoka.Dopediatrics.2020;8:605219.
Ollerich M, Sherwood K, Keown P, Schütz E, Beck J, Stegbauer J, et al.Biopsy ranon-javatra: ADN tsy misy sela mpanome no ampiasaina hamantarana ireo ratra allogeneika amin'ny grefy voa.Nat Rev Nephrol.2021;17:591–603.
Juan FC, Lo YM Innovations in prenatal diagnostics: maternal plasma genome sequencing.Anna MD.2016;67:419-32.
Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D, et al.Famantarana haingana ny pathogen miaraka amin'ny filaharan'ny metagenomika taranaka manaraka ny fluidin'ny vatana.Nat Medicine.2021;27:115-24.