Mauruuru koe mo te toro ki Nature.com.Kei te whakamahi koe i tetahi putanga tirotiro me te tautoko CSS iti.Mo te wheako pai rawa atu, e taunaki ana matou me whakamahi koe i tetahi kaitirotiro kua whakahoutia (me monohia ranei te Aratau Hototahi ki Internet Explorer).I tua atu, hei whakarite i te tautoko tonu, ka whakaatuhia e matou te waahi kaore he momo me te JavaScript.
Ka whakaatu i te carousel o nga kiriata e toru i te wa kotahi.Whakamahia nga paatene o mua me te Panuku ki te neke i roto i nga kiriata e toru i te wa kotahi, ka whakamahi ranei i nga patene rereti i te mutunga ki te neke i roto i nga kiriata e toru i te wa kotahi.
Ko te arai toto-roro me te arai toto-roro ka aukati i nga kaihoko koiora kia eke ki o raatau whaainga i roto i te punaha nerve matua, na reira ka aukati i te maimoatanga whai hua o nga mate neurological.Hei kite i nga kaikawe roro hou i roto i te vivo, i whakauruhia e matou he whare pukapuka T7 phage peptide me te kohi toto me te wai cerebrospinal (CSF) ma te whakamahi i te tauira poka wai nui o te kiore.I tino whakarangatirahia nga karaka phage motuhake i te CSF i muri i nga wahanga e wha o te kowhiringa.Ko nga whakamatautau o nga peptides kaitono takitahi i whakaatu neke atu i te 1000-fold te whakarangatira i roto i te CSF.Ko te koiora o te tuku peptide-mediated ki te roro i whakapumauhia e te 40% te whakaheke i te taumata o te amyloid-β i roto i te wai cerebrospinal ma te whakamahi i te aukati peptide BACE1 e hono ana ki te peptide whakawhiti pukapuka kua tautuhia.Ko enei hua e kii ana ko nga peptide kua tohua e nga tikanga whiriwhiringa in vivo phage he waka whaihua mo te tuku punaha o nga macromolecules ki te roro me te whai hua whakaora.
Ko nga rangahau rongoa e whaaia ana e te punaha nerve matua (CNS) kua aro nui ki te tautuhi i nga raau taero me nga apiha e whakaatu ana i nga taonga e whaaia ana ki te CNS, me te iti ake o te kaha ki te kimi i nga tikanga e akiaki ana i te tuku tarukino kaha ki te roro.Kua timata tenei ki te huri inaianei na te mea ko te tuku raau taero, ina koa ko nga ngota nui, he waahanga nui o te whanaketanga tarukino neuroscience hou.Ko te taiao o te punaha nerve matua e tiakina paitia ana e te punaha arai cerebrovascular, kei roto ko te arai toto-roro (BBB) ​​​​me te arai toto-roro (BCBB)1, he uaua ki te tuku raau taero ki te roro1,2.E kiia ana ko te tata ki te katoa o nga raau taero ngota nui me te neke atu i te 98% o nga raau taero iti ka whakakorehia i te roro3.Koinei te take he mea tino nui ki te tautuhi i nga punaha kawe roro hou e whakarato ana i te pai me te motuhake o nga rongoa rongoa ki te CNS 4,5.Heoi ano, ko te BBB me te BCSFB he waahi pai mo te tuku tarukino i a ratau ka uru ki roto ka uru ki roto i nga hanganga katoa o te roro na roto i te whanui o te kiko.Na, ko nga mahi o naianei ki te whakamahi i nga tikanga kore-ahuru o te tuku ki te roro kei te nuinga o te waa i runga i te tikanga o te kawe kawe-whakawhitiwhiti (PMT) ma te whakamahi i te kaikawe BBB6 endogenous.Ahakoa nga ahu whakamuatanga matua tata nei ma te whakamahi i te ara whakawhiwhi whakawhitirin7,8, me whakawhanake tonu nga punaha tuku hou me nga rawa pai ake.I tenei mutunga, ko ta matou whainga ko te tautuhi i nga peptides e kaha ana ki te takawaenga i te kawe CSF, na te mea ka taea te whakamahi ki te tuku macromolecules ki te CNS, ki te whakatuwhera i nga huarahi hou.Ina koa, ka taea e nga kaikawe me nga kaikawe o te punaha cerebrovascular (BBB me te BSCFB) te whai waahi mo te tuku kaha me te motuhake o nga raau taero koiora.Ko te wai cerebrospinal (CSF) he hua huna o te choroid plexus (CS) me te hono tika ki te wai interstitial o te roro na roto i te waahi subarachnoid me te waahi ventricular4.No na tata nei kua whakaatuhia ko te subarachnoid cerebrospinal fluid e tino rere ana ki roto i te interstitium o te roro9.Te ti'aturi nei matou ki te uru atu ki te waahi parenchymal ma te whakamahi i tenei waahanga whakaurunga subarachnoid, ma te BBB ranei.Hei whakatutuki i tenei, i whakatinanahia e matou he rautaki whiriwhiri i roto i te vivo phage e tohu pai ana i nga peptides e kawea ana e tetahi o enei huarahi e rua.
Ka whakaahuahia e matou he tikanga tirotiro whakaatu i roto i te vivo phage me te tauira CSF i honoa me te raupapatanga puta teitei (HTS) ki te aro turuki i nga rauna kowhiringa tuatahi me te tino kanorau o te whare pukapuka.I mahia te tirotiro ki nga kiore mohio me te kaanao nui (CM) i whakatōngia kia kore ai e poke te toto.Ko te mea nui, ko tenei huarahi ka kowhiri i te roro-arotahi me nga peptides me nga mahi kawe waka puta noa i te arai cerebrovascular.I whakamahia e matou nga T7 phages na te iti o te rahi (~ 60 nm) 10 me te whakaaro he pai mo te kawe i nga vesicles e taea ai te whakawhiti whakawhiti o te arai endothelial me / ranei epithelial-medulla.Whai muri i nga rauna e wha o te panning, ka wehea nga taupori phage e whakaatu ana i te kaha o te whakarangatira o te CSF me te hononga microvessel cerebral.Ko te mea nui, i taea e matou te whakau i o maatau kitenga ma te whakaatu ko nga peptides kaitono pai rawa atu me te whakahiato matū ka taea te kawe i nga uta pūmua ki roto i te wai cerebrospinal.Tuatahi, ko nga hua rongoa o te CNS i whakapumautia ma te whakakotahi i te peptide whakawhiti matua me te aukati o te peptide BACE1.Hei taapiri atu ki te whakaatu ka taea e nga rautaki tirotiro mahi i roto i te vivo te tautuhi i nga peptides kawe roro hou hei kaikawe uta uta pūmua, e tumanako ana matou he mea nui ano nga huarahi whiriwhiri mahi ki te tautuhi i nga huarahi kawe roro hou.
I runga i nga waeine hanga tohu (PFU), i muri mai i te takahanga whakangao phage, ka hangaia he whare pukapuka o te 12-mer linear T7 phage peptides me te kanorau tata ki te 109 (tirohia nga Rauemi me nga Tikanga).He mea nui ki te mahara i ata tirotirohia e matou tenei whare pukapuka i mua i te panning in vivo.Ko te whakakaha PCR o nga tauira whare pukapuka phage ma te whakamahi i nga mea tuatahi kua whakarereketia i hangaia nga amplicons e tika ana ki te HTS (Taupiri Fig. 1a).Na te a) HTS11 hapa raupapa, b) te paanga ki te kounga o nga primers (NNK)1-12, me c) te aroaro o te momo mohoao (wt) phage (whakauru kōiwi) i roto i te whare pukapuka tūtatari, i whakatinanahia he tikanga tātari raupapa ki te tango i nga korero raupapa kua whakamanahia (Taupiri Pikitia 1b).Ka pa enei mahi tātari ki nga whare pukapuka raupapa HTS katoa.Mo te whare pukapuka paerewa, 233,868 katoa nga panui i whiwhi, 39% i eke ki nga paearu tātari, ka whakamahia mo te tātari whare pukapuka me te kowhiringa mo nga rauna ka whai ake (Whakaahua 1c–e taapiri).Ko te nuinga o nga panui he maha o nga takirua turanga 3 te roa me te tihi i te 36 nucleotides (Taupiri Fig. 1c), e whakau ana i te hoahoa whare pukapuka (NNK) 1-12.Ko te mea nui, tata ki te 11% o nga mema o te wharepukapuka kei roto he whakaurunga PAGISRELVDKL momo mohoao ahu-12, me te tata ki te haurua o nga raupapa (49%) he whakauru, he whakakore ranei.I whakapumautia e te HTS o te whare pukapuka te rereketanga nui o nga peptides i roto i te whare pukapuka: neke atu i te 81% o nga raupapa peptide i kitea kotahi anake, a ko te 1.5% anake i puta i roto i nga kape ≥4 (Taupiri 2a).Ko nga iarere o nga waikawa amino (aa) i nga waahi 12 katoa i roto i te repertoire he pai te hono ki nga iarere e tumanakohia ana mo te maha o nga codons i hangaia e te repertoire NKK whakahekeheke (Taupiri Fig. 2b).Ko te auau i kitea o nga toenga aa kua whakawaeheretia e enei whakaurunga he pai te hono ki te auau kua tatauhia (r = 0.893) (Taupiri Pikitia 2c).Ko te whakaritenga o nga whare pukapuka phage mo te werohanga ko nga hikoinga o te whakanui me te tango i te endotoxin.Kua whakaatuhia tenei i mua ki te whakaiti i te rereketanga o nga whare pukapuka phage12,13.Na reira, i whakaraupapahia e matou he whare pukapuka phage kua whakahiatohia i te pereti kua tangohia te endotoxin me te whakataurite ki te whare pukapuka taketake hei whakatau i te auau o te AA.He hononga kaha (r = 0.995) i kitea i waenga i te puna taketake me te puna kaukau whakakaha me te purea (Taupiri Fig. 2d), e tohu ana ko te whakataetae i waenga i nga iramahe kua whakanuia i runga i nga papaa ma te whakamahi i te T7 phage kaore i puta te kino nui.Ko tenei whakataurite i runga i te auau o nga kaupapa tripeptide i ia whare pukapuka, i te mea kaore e taea te hopu i te kanorau o nga whare pukapuka (~109) ahakoa ki te HTS.Ko te wetewete auau o te aa i ia tuunga i kitea he iti nei te ti'aturi o te tuunga i roto i nga tuunga whakamutunga e toru o te repertoire kua uru mai (Taapiri Pikitia 2e).Hei whakamutunga, i whakatau matou he pai te kounga me te kanorau o te whare pukapuka, a, he iti noa nga huringa o te kanorau i kitea i runga i te whakakaha me te whakarite o nga whare pukapuka phage i waenga i nga rauna whiriwhiri.
Ka taea te whakatau i te wai cerebrospinal rangatū ma te whakato i te kano ki roto i te CM o nga kiore mohio kia pai ai te tautuhi i te T7 phage i werohia ki roto (iv) ma te BBB me/ranei BCSFB (Fig. 1a-b).I whakamahia e matou nga ringaringa whiriwhiri motuhake e rua (nga ringa A me B) i nga wahanga tuatahi e toru o te whiriwhiringa in vivo (Fig. 1c).Ka piki haere te kaha o te kowhiringa ma te whakaheke i te tapeke o te phage i whakauruhia ki nga wahanga tuatahi e toru o te kowhiringa.Mo te rauna tuawha o te panning, i whakakotahihia e matou nga tauira mai i nga manga A me B ka mahia e toru etahi atu whiringa motuhake.Hei ako i nga ahuatanga in vivo o nga matūriki T7 phage i tenei tauira, i werohia te momo momo mohoao (PAGISRELVDKL master insert) ki nga kiore ma te uaua hiku.Ko te whakaoranga o nga phages mai i te wai cerebrospinal me te toto i nga waahi rereke i whakaatu he iti noa nga T7 icosahedral phages he tere te waahi tuatahi mai i te wahanga toto (Taupiri Fig. 3).I runga i nga tohu i tukuna me te nui o te toto o nga kiore, i tatauhia e matou ko te 1% wt anake.Ko te phage mai i te horopeta i tukuna i kitea i roto i te toto 10 meneti i muri i te werohanga i roto i te toto.Whai muri i tenei paheketanga tere tuatahi, i inehia te maatanga tuatahi me te haurua o te 27.7 meneti.Ko te mea nui, he iti noa nga phages i tangohia mai i te wahanga CSF, e tohu ana he iti te papamuri mo te hekenga momo mohoao ki roto i te wahanga CSF (Taupiri Pikitia 3).I te toharite, tata ki te 1 x 10-3% noa nga tohu o te T7 phage i roto i te toto me te 4 x 10-8% o nga phages i whakauruhia i te tuatahi ka kitea i roto i te wai cerebrospinal i roto i te waa whakatauira katoa (0-250 min).Otirā, ko te haurua o te ora (25.7 min) o te momo mohoao i roto i te wai cerebrospinal he rite ki tera i kitea i roto i te toto.Ko enei raraunga e whakaatu ana ko te arai e wehe ana i te wahanga CSF mai i te toto kei te mau tonu i roto i nga kiore CM-cannulated, ka taea te kowhiri i roto i te vivo o nga whare pukapuka phage ki te tautuhi i nga karaehe ka haria mai i te toto ki roto i te waahanga CSF.
(a) Whakaritea he tikanga mo te whakahoki ano i te wai o te roro (CSF) mai i te puna nui.(b) Hoahoa e whakaatu ana i te waahi pūkoro o te arai o te punaha nerve matua (CNS) me te rautaki whiriwhiri i whakamahia hei tautuhi i nga peptide e whakawhiti ana i te arai toto-roro (BBB) ​​me te arai toto-roro.(c) I roto i te vivo phage whakaatu mata rere tūtohi.I ia rauna kowhiringa, ka werohia nga phages (whakaahua kararehe kei roto i nga pere) ka werohia ki roto i te toto.E rua nga peka rereke motuhake (A, B) ka noho motuhake kia tae noa ki te rauna tuawha o te whiringa.Mo nga rauna whiriwhiri 3 me te 4, ko ia karaehe phage i tangohia mai i te CSF i raupapa-a-ringatia.(d) Kinetics o te phage i wehea mai i te toto (whero porowhita) me te wai cerebrospinal (taitoru matomato) i te wahanga tuatahi o te kowhiringa i nga kiore e rua kua oti te werohia o te whare pukapuka peptide T7 (2 x 1012 phages/kararehe).Ko nga tapawha kikorangi e tohu ana i te kuhanga tuatahi o te phage i roto i te toto, ka tatauhia mai i te nui o te phage i werohia, me te whakaaro ki te nui o te toto.Ko nga tapawha pango e tohu ana i te waahi o te whitinga o te raina y i tangohia mai i te kuhanga toto.(e,f) Whakaatuhia te auautanga me te tohatoha o nga motika tripeptide inaki katoa ka kitea i roto i te peptide.Ka whakaatuhia te maha o nga kaupapa i kitea i roto i te 1000 panui.Ko te mea nui (p < 0.001) kua tohua ki nga tohu whero nga kaupapa whakarangatira.(e) Te marara honohono e whakatairite ana i te auautanga o te kaupapa tripeptide o te whare pukapuka i werohia me te phage i ahu mai i te toto mai i nga kararehe #1.1 me te #1.2.(f) Te marara honohono e whakatairite ana i nga iarere tata o nga motika tripeptide phage kararehe #1.1 me te #1.2 kua wehea i roto i te toto me te wai cerebrospinal.(g, h) Whakaaturanga ID raupapa o te phage i whakarangatirahia ki te toto (g) ki nga whare pukapuka i werohia me te phage i whakarangatira ki te CSF (h) ki te toto i muri i te wahanga o te whiriwhiringa in vivo i roto i nga kararehe e rua.Ko te rahi o te waehere reta kotahi e tohu ana i te maha o nga wa e puta ai taua waikawa amino ki tera waahi.Kākāriki = polar, papura = kūpapa, kahurangi = taketake, whero = waikawa me te pango = waikawa amino hydrophobic.Ko te ahua 1a, b na Eduard Urich i hoahoa.
I werohia e matou he whare pukapuka peptide phage ki roto ki nga kiore taputapu CM e rua (nga papa A me B) me te phage wehe mai i te wai cerebrospinal me te toto (Whakaahua 1d).He iti ake te korero o te whakakoi tere tuatahi o te whare pukapuka ki te ahua o te momo mohoao.Ko te haurua o te ora o te whare pukapuka i werohia i roto i nga kararehe e rua he 24.8 meneti i roto i te toto, he rite ki te momo momo mohoao, me te 38.5 meneti i roto i te CSF.Ko nga tauira phage toto me te wai cerebrospinal mai i ia kararehe i tukuna ki te HTS me nga peptides katoa kua tautuhia i tātarihia mo te ahua o te kaupapa tripeptide poto.I whiriwhiria nga motika tripeptide na te mea he iti noa te kaupapa mo te hanga hanganga me nga taunekeneke peptide-protein14,15.I kitea e matou he hononga pai i roto i te tohatoha o nga kaupapa i waenga i te whare pukapuka phage kua werohia me nga tohu i tangohia mai i te toto o nga kararehe e rua (Fig. 1e).Ko nga raraunga e tohu ana ko te hanganga o te whare pukapuka he iti noa te whakarangatira i roto i te waahanga toto.Ko nga rerenga waikawa amino me nga raupapa whakaaetanga i tātarihia i ia waahi ma te whakamahi i te urutaunga o te rorohiko Weblogo16.He mea whakamiharo, i kitea e matou he whakarangatira kaha i roto i nga toenga glycine toto (Fig. 1g).I te wa i whakatauritea ai te toto ki nga karaehe kua tohua mai i te CSF, ka kitea te kowhiringa kaha me te whakakorenga o nga kaupapa (Fig. 1f), a ko etahi waikawa amino i pai ake ki nga waahi kua tohua i roto i nga mema 12 (Fig. 1h).Ko te mea nui, he rereke te rereke o nga kararehe takitahi i roto i te wai cerebrospinal, engari i kitea te whakarangatira glycine toto i roto i nga kararehe e rua (Taupiri Fig. 4a-j).I muri i te tātari kaha o nga raraunga raupapa i roto i te wai cerebrospinal o nga kararehe #1.1 me te #1.2, he 964 me te 420 ahurei 12-mer peptides i whiwhi (Taupiri Fig. 1d-e).I whakanuia nga karaka phage taratahi ka tukuna ki te rauna tuarua o te kowhiringa in vivo.Ko te Phage i tangohia mai i te wahanga tuarua o te kowhiringa ka tukuna ki te HTS i ia kararehe ka whakamahia nga peptides katoa i tautuhia hei whakaurunga ki te kaupapa whakamohiotanga motika hei tātari i te puta mai o nga kaupapa tripeptide (Fig. 2a, b, ef).Ka whakatauritea ki te huringa tuatahi o te phage i ora mai i te CSF, i kite matou i te kowhiringa me te whakakore i nga kaupapa maha i roto i te CSF i nga manga A me B (Fig. 2).I whakamahia he algorithm tautuhi whatunga ki te whakatau mena he rereke nga tauira o te raupapa riterite.I kitea he ahua tino rite i waenga i nga raupapa ahu-12 i whakahokia mai e te CSF i roto i nga waahanga rereke A (Fig. 2c, d) me te clade B (Fig. 2g, h).Ko te tātaritanga whakahiato i ia peka i whakaatu mai i nga korero whiriwhiringa rereke mo te 12-mer peptides (Taupiri Fig. 5c,d) me te pikinga o te CSF/te rawehenga titer toto i roto i te waa mo nga kaapene whakahiato i muri i te waahanga tuarua o te kowhiringa i whakaritea ki te rauna tuatahi o te kowhiringa (Taupiri Fig. 5e).).
Te whakarangatira i nga kaupapa me nga peptides i roto i te wai cerebrospinal e rua nga rauna whai muri o te kowhiringa whakaaturanga phage mahi in vivo.
Ko nga phages wai cerebrospinal katoa i ora mai i te rauna tuatahi o ia kararehe (kararehe #1.1 me #1.2) i whakahiatohia, i whakakahahia, i raupapahia te HT me te werohia ano (2 x 1010 phages/kararehe) 2 SM cannulated kiore (#1.1 → #).2.1 me 2.2, 1.2 → 2.3 me 2.4).(a,b,e,f) Ko nga marara honohono e whakatairite ana i te auautanga o nga motika tripeptide o nga phages katoa i ahu mai i te CSF i roto i nga waahanga whiriwhiri tuatahi me te tuarua.Te auau me te tohatoha o nga kaupapa e tohu ana i nga tripeptide inaki katoa ka kitea i roto i nga peptides i nga waahanga e rua.Ka whakaatuhia te maha o nga kaupapa i kitea i roto i te 1000 panui.Ko nga kaupapa i tino tohua (p <0.001) i tohua, i whakakorehia ranei i roto i tetahi o nga whare pukapuka kua whakatauritehia ka tohua ki nga tohu whero.(c, d, g, h) Raupapa tohu tohu mo te CSF-taonga 12 waikawa amino raupapa roa i runga i nga rauna 2 me te 1 o te whiriwhiringa in vivo.Ko te rahi o te waehere reta kotahi e tohu ana i te maha o nga wa e puta ai taua waikawa amino ki tera waahi.Hei tohu i te waitohu, ka whakatauritehia te auau o nga raupapa CSF i tangohia mai i nga kararehe takitahi i waenga i nga rauna whiriwhiri e rua, ka whakaatuhia nga raupapa whakarangatira i te rauna tuarua: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 me (h) #1.2–#2.4.Ko nga waikawa amino tino whakarangatira i tetahi waahi i roto (c, d) kararehe No.2.1 me te kore.2.2 ranei (g, h) i roto i nga kararehe No.2.3 me te kore.2.4 e whakaatuhia ana i te tae.Kākāriki = polar, papura = kūpapa, kahurangi = taketake, whero = waikawa me te pango = waikawa amino hydrophobic.
I muri i te wahanga tuatoru o te kowhiringa, i kitea e matou he 124 nga raupapa peptide ahurei (#3.1 me #3.2) mai i te 332 CSF-reconstituted phage clones i wehea mai i nga kararehe e rua (Taupiri Fig. 6a).Ko te raupapa LGSVS (18.7%) ko te waahanga tino nui rawa atu, ka whai ake ko nga whakauru momo mohoao PAGISRELVDKL (8.2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2.2%), me te SARGSWREIVSLS (2.2%).I te rauna tuawha whakamutunga, i whakahiatohia e matou nga peka e rua kua tohua motuhake mai i nga kararehe motuhake e toru (Fig. 1c).O te 925 karaka phage raupapa i ora mai i te CSF, i te wha o nga rauna i kitea e matou e 64 nga raupapa peptide ahurei (Taapiri 6b), i roto i enei ka heke iho te owehenga o te momo momo mohoao ki te 0.8%.Ko te nuinga o nga clones CSF i te wha o nga rauna ko LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3.6%) me RLSSVDSDLSGC (3, 2%).%)).Ko te awhe roa o nga peptides i kowhiria na te whakaurunga/whakamuku nucleotide me nga codone mutu taanata ranei i roto i nga pukapuka tuatahi o te whare pukapuka i te wa e whakamahi ana i nga codone whakaheke mo te hoahoa whare pukapuka NNK.Ko nga codons mutu moata ka whakaputa i nga peptide poto ake, ka tohua na te mea kei roto i a raatau te kaupapa aa pai.Ko te roa ake o nga peptide ka puta mai i te whakaurunga/whakamuku i nga pukapuka tuatahi o nga whare pukapuka waihanga.Ma tenei ka tuu te codon mutu i hoahoatia ki waho o te anga ka panui kia puta ra ano he codon mutu hou ki raro.I te nuinga, i tatauhia e matou nga mea whakarangatira mo nga rauna whiriwhiri e wha ma te whakatairite i nga raraunga whakauru me nga tauira raraunga putanga.Mo te rauna tuatahi o te tirotiro, i whakamahia e matou nga tohu phage momo mohoao hei tohutoro papamuri kore-motuhake.Ko te mea whakamiharo, he tino kaha te kowhiringa phage kino i te huringa CSF tuatahi, engari kaore i roto i te toto (Fig. 3a), na te iti o te tupono o te whakamaaramatanga o te nuinga o nga mema o te whare pukapuka peptide ki roto i te wahanga CSF me nga phages whanaunga ka kaha ake te pupuri, te nekehia atu ranei i te toto mai i te bacteriophages.Heoi, i roto i te rauna tuarua o te panning, he kaha te kowhiringa o nga phages i roto i te CSF i roto i nga papa e rua, e kii ana i whakarangatirahia te rauna o mua i roto i nga phages e whakaatu ana i nga peptides e whakatairanga ana i te tangohanga CSF (Fig. 3a).Ano, kaore he taonga toto nui.I te wahanga tuatoru me te wha o nga rauna, i tino whakarangatirahia nga karaka phage ki te CSF.Ko te whakatairite i te auautanga o ia raupapa peptide ahurei i waenga i nga waahanga e rua whakamutunga o te whiriwhiringa, i kitea e maatau ake te whakarangatira o nga raupapa i te wha o nga rauna whiriwhiri (Fig. 3b).He 931 nga kaupapa tripeptide i tangohia mai i nga raupapa peptide ahurei e 64 ma te whakamahi i nga waahanga peptide e rua.Ko nga kaupapa tino whakarangatira i te rauna tuawha i ata tirohia mo o raatau korero whakarangatira puta noa i nga rauna katoa ka whakatauritea ki te whare pukapuka i werohia (tapahia: 10% te whakarangatira) (Taupiri Fig. 6c).Ko nga tauira whanui o te kowhiringa i whakaatu ko te nuinga o nga kaupapa i akohia i whakarangatirahia i nga wahanga katoa o mua o nga peka whiriwhiri e rua.Heoi, ko etahi o nga kaupapa (hei tauira, SGL, VSG, LGS GSV) i ahu mai i etahi atu kara A, ko etahi atu (hei tauira, FGW, RTN, WGF, NTR) i whakarangatirahia ki etahi atu kara B.
Te whakamanatanga o te kawe CSF o nga peptides phage-whakaahua a CSF me nga peptides rangatira biotinylated kua honoa ki nga utu streptavidin.
(a) Ko nga owehenga whakarangatira kua tatauhia i roto i nga rauna e wha (R1-R4) i runga i nga tohu i werohia (whakauru = I) phage (PFU) me nga tohu tohu CSF phage (putanga = O).Ko nga mea whakarangatira mo nga rauna e toru whakamutunga (R2-R4) i tatauhia ma te whakataurite ki te rauna o mua me te rauna tuatahi (R1) me nga raraunga taumaha.Ko nga tutaki tuwhera ko te wai cerebrospinal, ko nga tutaki whakamarumaru he plasma.(***p<0.001, i runga i te whakamatautau-t a te Tauira).(b) Rarangi o nga peptide phage tino nui, kua tohua i runga i to raatau ohanga ki nga phages katoa i kohia i te CSF i muri i te rauna 4 o te kowhiringa.Ko nga karaehe phage e ono e tohuhia ana i roto i te tae, te tatau me o raatau whakarangatira i waenga i nga rauna 3 me te 4 o te kowhiringa (whakauru).(c, d) Ko nga karaehe phage e ono kua tino whakarangatira, nga whare pukapuka phage kau me nga whare pukapuka peptide phage matua mai i te rauna 4 i tātarihia takitahi i roto i te tauira tauira CSF.I kohia nga tauira CSF me nga toto i nga waahi kua tohua.(c) Kia rite te nui o te 6 karaka phage kaitono (2 x 1010 phages/kararehe), phage kau (#1779) (2 x 1010 phage/kararehe) me nga whare pukapuka phage peptide kararehe (2 x 1012 phages/kararehe) Inohia ki te 3 CM te iti rawa ka tukuna ma te kararehe hiku ka tukunaKa whakaatuhia nga rongoako CSF ​​o ia phage clone me te whare pukapuka phage peptide i roto i te waa.(d) whakaatu i te tauwehenga CSF/toto toharite mo nga phages/mL katoa i ora ake i roto i te wa whakatauira.(e) E wha nga peptides rangatira waihanga me tetahi mana scrambled i honoa ki te biotin ki te streptavidin na roto i to raatau N-terminus (whakakitenga tetramer) whai muri i te werohanga (he uaua hiku iv, 10 mg streptavidin/kg).E toru nga kiore kua werohia (N = 3).).Ko nga tauira CSF i kohia i nga waahi kua tohua me nga kohinga streptavidin i inehia e te CSF anti-streptavidin ELISA (nd = kaore i kitea).(* p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, i runga i te whakamatautau ANOVA).(f) Whakatauritenga o te raupapa waikawa amino o te phage peptide clone tino whakarangatira #2002 (papura) me etahi atu phage peptide clones kua tohua mai i te rauna 4 o te kowhiringa.Ko nga wahanga waikawa amino rite me te rite he tohu-tae.
O nga phages whakarangatira katoa i te rauna tuawha (Fig. 3b), e ono nga karamahe kaitono i tohua hei tātaritanga takitahi i roto i te tauira tauira CSF.Ko nga rahinga rite o te ono o te kaitono phage, te phage kau (kaore he whakauru) me nga whare pukapuka peptide prophage i werohia ki nga kararehe CM cannulated e toru, a ka whakatauhia te rongoa rongoa i roto i te CSF (Fig. 3c) me te toto (Taupiri Fig. 7).Ko nga karaehe phage katoa i whakamatauria i whaaia te wahanga CSF ki te taumata 10-1000 teitei ake i tera o te phage mana kau (#1779).Hei tauira, he 1000 nga wa teitei ake o nga tohu CSF o nga karamate #2020 me #2077 i te mana whakahaere.He rereke te ahua o te rongoa rongoa o ia peptide kua tohua, engari he nui te kaha ki te noho CSF.I kite matou i te heke haere tonu o te waa mo nga iramate #1903 me te #2011, engari mo nga iramate #2077, #2002 me #2009 ka piki ake i roto i nga meneti 10 tuatahi ka tohu he kawe kaha engari me manatoko.Ko nga karaka #2020, #2002, me te #2077 i whakapumau i nga taumata teitei, i te wa i heke haere te kukū o te CSF o te clone #2009 i muri i te pikinga tuatahi.Na ka whakatauritehia e matou te auau o ia kaitono CSF ​​me tona toto toto (Fig. 3d).Ko te hononga o te tohu toharite o ia kaitono CSF ​​me ona tohu toto i nga wa whakatauira katoa i whakaatu ko te toru o nga kaitono e ono i tino whakarangatira ki te CSF toto.He mea whakamiharo, ko te clone #2077 te whakaatu i te pumau o te toto (Whakaahua 7).Hei whakapumau ka kaha nga peptides ki te kawe uta i tua atu i nga matūriki phage ki roto i te wahanga CSF, i whakahiatohia e matou nga peptides rangatira e wha i ahu mai ki te biotin i te pito-N e piri ai nga peptides ki te matūriki phage.Ko nga peptides biotinylated (nos. 2002, 2009, 2020 me 2077) i honoa ki te streptavidin (SA) kia whiwhi ai i nga momo multimeric e ahua rite ana ki te ahuahanga phage.Ma tenei whakatakotoranga ka taea e matou te ine i te whakaaturanga SA i roto i te toto me te wai cerebrospinal hei peptides pūmua kawe utanga.Ko te mea nui, he maha nga wa ka taea te whakaputa i nga raraunga phage ina tukuna nga peptides waihanga i roto i tenei whakatakotoranga SA-conjugated (Fig. 3e).Ko nga peptide kua rukuhia he iti ake te whakaputanga tuatahi me te tere ake o te whakaea CSF me nga taumata kore e kitea i roto i nga haora 48.Ki te whai matauranga ki nga huarahi tuku o enei peptide phage clones ki roto i te waahi CSF, i tirotirohia e matou te waahi o nga peptide phage takitahi ma te whakamahi i te immunohistochemistry (IHC) kia kitea tika nga matūriki phage 1 haora i muri i te werohia i roto i te vivo.Ko te mea nui, ka kitea nga karaehe #2002, #2077, me te #2009 na te kaha whakapouri i roto i nga capillaries roro, i te mea kaore i kitea te phage mana (#1779) me te clone #2020 (Whakaahua 8).E tohu ana ko enei peptides ka uru ki te paanga ki te roro ma te whakawhiti i te BBB.Ko etahi atu tātaritanga taipitopito e hiahiatia ana hei whakamatautau i tenei whakapae, na te mea ka uru ano te huarahi BSCFB.I te whakataurite i te raupapa waikawa amino o te clone tino whakarangatira (#2002) me etahi atu peptides kua tohua, i tohuhia ko etahi o ratou he rite nga toronga waikawa amino, e tohu ana i te ahua o te kawe waka (Fig. 3f).
Na tona ahua motuhake o te plasma me te pikinga nui o te CSF i roto i te waa, i tirotirohia ano te clone whakaatu phage #2077 i roto i te waa roa 48-haora ka taea te whakaputa i te piki tere o te CSF i kitea i roto i te hononga ki nga taumata SA pumau (Fig. 4a).Mo etahi atu iramate phage kua tautuhia, ko #2077 i tino pokea mo nga capillaries roro me te whakaatu i te koocalization nui me te tohu tohu capillary lectin ina tirohia ki te taumira teitei ake, me etahi peara i te waahi parenchymal (Whakaahua 4b).Ki te tirotiro mehemea ka taea te whiwhi i nga paanga rongoora-whakawhitiwhiti peptide i roto i te CNS, i mahia e matou he whakamatautau i roto i nga putanga biotinylated o i) te peptide whakawhiti #2077 me te ii) te peptide aukati BACE1 i konatunatua ki te SA i nga waahanga rereke e rua.Mo tetahi huinga i whakamahia e matou ko te aukati peptide BACE1 anake me tetahi atu i whakamahia e matou he 1:3 ōwehenga o te aukati peptide BACE1 ki te #2077 peptide.I tukuna nga tauira e rua i roto i te toto, ka inehia nga taumata toto me te wai cerebrospinal o te beta-amyloid peptide 40 (Abeta40) i roto i te waa.I inehia a Abeta40 ki te CSF na te mea e whakaatu ana i te aukati BACE1 i roto i te parenchyma roro.I te mea i whakaarohia, ko nga matatini e rua i tino whakahekehia nga taumata toto o Abeta40 (Fig. 4c, d).Heoi, ko nga tauira anake kei roto he ranunga o te peptide no.Ko te 2077 me te aukati o te peptide BACE1 i honoa ki te SA he nui te heke o te Abeta40 i roto i te wai cerebrospinal (Fig. 4c).Ko nga raraunga e whakaatu ana ko te peptide no.Ka taea e 2077 te kawe i te pūmua 60 kDa SA ki roto i te CNS me te whakaawe hoki i nga hua rongoa me nga aukati SA-conjugated o te peptide BACE1.
(a) Clonal injection (2 × 10 phages/kararehe) o T7 phage e whakaatu ana i nga korero rongoa mo te wa roa o te CSF peptide #2077 (RLSSVDSDLLSGC) me te phage mana kore i werohia (#1779) i roto i te toru o nga kiore CM-intubated.(b) Ko te ahua mokotiki whakararu o nga waka moroiti i roto i nga kiore kua werohia ki te phage (2 × 10 10 phages/kararehe) e whakaatu ana i te parepare o te peptide #2077 me nga oko (lectin).I tukuna enei kiore phage ki nga kiore e 3, ka tukuna kia huri haere mo te 1 haora i mua i te whaowhia.I wehewehea nga roro ka pania ki te polyclonal FITC-labeled antibodies ki te T7 phage capsid.Tekau mēneti i mua i te whakawhanaungatanga me te whakatikanga o muri mai, ka tukuna a DyLight594-labeled lectin ki roto i te toto.Ko nga whakaahua kareoro e whakaatu ana i te whakapouri o te lectin (whero) o te taha marama o nga waka moroiti me nga phages (matomato) i roto i te lumen o nga kapi me te kiko roro perivascular.He rite te pae tauine ki te 10 µm.(c, d) Biotinylated BACE1 peptide aukati anake, i te whakakotahitanga ranei me te biotinylated transit peptide #2077 i honoa ki te streptavidin whai muri mai i te werohanga a-roto o nga kiore CM cannulated neke atu i te toru (10 mg streptavidin/kg).Ko te BACE1 peptide inhibitor-mediated reduction i roto i te Aβ40 i inehia e te Aβ1-40 ELISA i roto i te toto (whero) me te wai cerebrospinal (karaka) i nga waahi kua tohua.Kia tino marama ake, ka tuhia he raina iraira ki te kauwhata i te tauine 100%.(c) Te hekenga ōrau o te Aβ40 i roto i te toto (nga tapatoru whero) me te wai cerebrospinal (nga tapatoru karaka) i roto i nga kiore i tukinotia ki te streptavidin i honoa ki te whakawhiti peptide #2077 me te peptide aukati BACE1 i roto i te 3: 1 ōwehenga.(d) Te hekenga ōrau o te toto Aβ40 (porowhita whero) me te wai cerebrospinal (porowhita karaka) o nga kiore i rongoa ki te streptavidin i honoa ki te peptide aukati BACE1 anake.Ko te kukū Aβ i roto i te mana whakahaere ko 420 pg / ml (paerewa ine = 101 pg / ml).
Ko te whakaaturanga o Phage kua tutuki pai ki te maha o nga waahi rangahau rongoa koiora17.Kua whakamahia tenei tikanga mo nga rangahau kanorau vascular in vivo18,19 me nga rangahau e aro ana ki nga oko roro20,21,22,23,24,25,26.I roto i tenei rangahau, i whakawhānuihia e matou te whakamahinga o tenei tikanga whiriwhiri ehara i te mea anake ki te tautuhi tika o nga peptides e aro ana ki nga oko roro, engari ano hoki ki te kitenga o nga kaitono whai taonga kawe kaha ki te whakawhiti i te arai toto-roro.Ka whakaahuahia e maatau te whakawhanaketanga o te tikanga whiriwhiri in vivo i roto i nga kiore intubated CM me te whakaatu i tona kaha ki te tautuhi i nga peptides me nga taonga noho CSF.Ma te whakamahi i te T7 phage e whakaatu ana i te whare pukapuka o nga peptides matapōkere 12-mer, i taea e matou te whakaatu he iti rawa te T7 phage (tata ki te 60 nm te whanui)10 hei urutau ki te arai toto-roro, na reira ka whakawhiti tika i te arai toto-roro, plexus choroid ranei.I kitea e matou ko te hauhake CSF mai i nga kiore CM cannulated he tikanga tirotiro i roto i te vivo mahi, a ko te phage kua tangohia kaore i herea ki te kopa engari ka mahi ano hei kaikawe puta noa i te arai toto-roro.I tua atu, na te kohi toto i te wa kotahi me te whakamahi i te HTS ki te CSF ​​me nga phages i ahu mai i te toto, i whakapumautia e maatau ko ta maatau whiriwhiri mo te CSF kaore i awehia e te whakarangatira toto, te whakapakari ranei mo te roha i waenga i nga waahanga whiriwhiri.Heoi ano, ko te wahanga toto tetahi waahanga o te tikanga whiriwhiri, na te mea ko nga phages ka taea te tae atu ki te wahanga CSF me ora me te huri haere i roto i te toto kia roa ai te whakarangatira i a ratou ano i roto i te roro.Hei tango i nga korero raupapa pono mai i nga raraunga HTS mata, i whakatinanahia e matou nga whiriwhiringa i urutau ki nga hapa raupapa-a-papa i roto i te rerenga mahi tātari.Na roto i te whakauru i nga tawhā kinetic ki te tikanga tirotiro, i whakapumautia e matou te tere o te rongoa o te momo mohoao T7 phages (t½ ~ 28 min) i roto i te toto24, 27, 28 me te whakatau hoki i to ratau haurua o te ora i roto i te wai cerebrospinal (t½ ~ 26 min) ia meneti).Ahakoa he rite nga korero mo te rongoa rongoa i roto i te toto me te CSF, ko te 0.001% anake o te kuhanga toto o te phage ka kitea i roto i te CSF, e tohu ana i te iti o te nekehanga o te momo T7 momo mohoao puta noa i te arai toto-roro.Ko tenei mahi e whakaatu ana i te hiranga o te rauna tuatahi o te kowhiringa i te wa e whakamahi ana i nga rautaki panning in vivo, ina koa mo nga punaha phage ka tere te whakakore i te tohanga, na te mea he iti noa nga karaka ka tae ki te wahanga CNS.No reira, i te rauna tuatahi, he tino nui te whakahekenga o te kanorau o te whare pukapuka, na te mea he iti noa te maha o nga karaehe i kohia i tenei tauira CSF tino kaha.I roto i tenei rautaki panning in vivo he maha nga waahanga whiriwhiri penei i te whakaemi kaha i roto i te wahanga CSF, te ora o te clone i roto i te wahanga toto, me te tango tere o nga karaka T7 phage mai i te toto i roto i nga meneti 10 tuatahi (Fig. 1d me te Whakaaturanga 4M).).No reira, i muri i te rauna tuatahi, ka kitea nga momo phage i roto i te CSF, ahakoa ko te puna tuatahi i whakamahia mo nga kararehe takitahi.E tohu ana tenei he maha nga waahanga whiriwhiringa mo nga whare pukapuka puna me te maha o nga mema o te wharepukapuka ka hua te hekenga nui o te kanorau.No reira, ka noho nga huihuinga matapōkere hei waahanga nui o te tukanga whiriwhiri tuatahi, ka tino whakaawe i te hua.Te ahua nei he rite tonu te ahua o te maha o nga iramate i te whare pukapuka taketake i te ahua whakarangatira CSF.Heoi ano, ahakoa i raro i nga ahuatanga whakamatautau, ka rereke pea nga hua whiriwhiri na te iti o te maha o ia tohu i roto i te puna tuatahi.
He rereke nga kaupapa i whakarangatirahia i roto i te CSF i era i roto i te toto.Ko te mea whakamiharo, i kite matou i te huringa tuatahi ki nga peptides whai kiko ki te glycine i roto i te toto o nga kararehe takitahi.(Whakaahua 1g, Pikitia Tāpiri. 4e, 4f).Ko te phage kei roto nga peptides glycine ka kaha ake, ka iti ake te tango mai i te tohanga.Heoi, karekau enei peptide whai hua ki te glycine i kitea i roto i nga tauira wai cerebrospinal, e kii ana ko nga whare pukapuka kua oti te whakarite i haere i roto i nga waahanga whiriwhiri rereke e rua: kotahi i roto i te toto me tetahi i whakaaetia ki te whakaemi i roto i te wai cerebrospinal.Ko nga karamai whakarangatira a CSF i puta mai i te rauna tuawha o nga whiringa kua tino whakamatauria.Tata ki te katoa o nga karaehe i whakamatauria takitahi i whakapumauhia ki te whakarangatira ki te CSF ka whakaritea ki te phage mana.Kotahi te peptide hit (#2077) i tirotirohia i roto i nga korero taipitopito.I whakaatu he roa ake te haurua o te plasma ki etahi atu whiu (Whakaahua 3d me te Whakaahua 7 taapiri), me te mea whakamere, kei roto i tenei peptide he toenga cysteine ​​i te C-terminus.No tata nei kua whakaatuhia ko te taapiri o te cysteine ​​​​ki nga peptides ka taea te whakapai ake i o raatau taonga pharmacokinetic ma te here ki te albumin 29.I tenei wa kaore i te mohiotia mo te peptide #2077 me te hiahia rangahau ano.Ko etahi o nga peptide i whakaatu i te ti'aturi-vance i roto i te whakarangatira CSF (kaore nga raraunga e whakaatuhia ana), e pa ana pea ki te ahuahanga mata o te T7 capsid.Ko te punaha T7 i whakamahia e matou i whakaatu i te 5-15 kape o ia peptide mo ia matūriki phage.I mahihia te IHC ki runga i nga karamahe a te kaitono i werohia ki roto i te uho roro o te kiore (Taupiri Fig. 8).Ko nga raraunga i whakaatu mai e toru neke atu nga karaka (No. 2002, No. 2009 me No. 2077) i taunekeneke ki te BBB.Ka noho tonu ki te whakatau mena ka puta mai tenei taunekeneke BBB ki te kohi o te CSF, ki te neke tika ranei o enei kiore ki te BCSFB.Ko te mea nui, ka whakaatuhia e matou ko nga peptides kua tohua ka mau tonu to raatau kaha kawe CSF ka whakahiatohia ka herea ki te uta pūmua.Ko te herenga o nga peptides biotinylated N-terminal ki te SA ka whakahoki ano i nga hua ka puta mai me o raatau momo phage i roto i te toto me te wai cerebrospinal (Fig. 3e).I te mutunga, ka whakaatuhia e matou ko te peptide arahi #2077 ka kaha ki te whakatairanga i te mahi roro o te aukati peptide biotinylated o BACE1 i honoa ki te SA, ka puta nga hua o te rongoa rongoa i roto i te CNS ma te whakaiti nui i nga taumata Abeta40 i roto i te CSF (Fig. 4).Kaore i taea e matou te tautuhi i nga homologues i roto i te paataka raraunga ma te mahi i te raupapa peptide homology rapunga o nga pa katoa.He mea nui kia mahara ko te rahi o te whare pukapuka T7 he tata ki te 109, ko te rahi o te whare pukapuka whakaaro mo te 12-mers ko te 4 x 1015. Na reira, i tohua e matou he hautanga iti o te waahi kanorau o te whare pukapuka peptide 12-mer, tera pea ka taea te tautuhi i nga peptides tino pai ake ma te arotake i te waahi o enei waahanga tata.Ko te tikanga, ko tetahi o nga take kaore ano kia kitea he homologues maori o enei peptides ko te whakakore i te wa o te kukuwhatanga hei aukati i te urunga koretake o etahi momo peptide ki roto i te roro.
Ka huihuia, ko o maatau hua he kaupapa mo nga mahi a meake nei ki te tautuhi me te tohu i nga punaha kawe o te arai cerebrovascular in vivo i roto i nga korero taipitopito.Ko te tatūnga taketake o tenei tikanga e ahu mai ana i runga i te rautaki kowhiringa mahi e kore e tautuhi noa i nga iramahe me nga taonga herenga ngongo roro, engari kei roto ano hoki he taahiraa tino nui e whai mahi ai nga iramate angitu ki te whakawhiti i nga arai koiora i roto i te vivo ki roto i te wahanga CNS.Ko te whakamarama i te tikanga kawe o enei peptides me o raatau hiahia mo te here ki te microvasculature motuhake ki te rohe roro.Ka kitea pea he huarahi hou mo te kawe i te BBB me nga kaiwhakawhiwhi.Kei te tumanako matou ka taea e nga peptides kua tautuhia te here tika ki nga kaiwhakawhiwhi cerebrovascular, ki nga riipene whakawhiti ranei e kawea ana ma te BBB, BCSFB ranei.Ko nga peptide vectors me nga mahi kawe CSF i kitea i roto i tenei mahi ka tirotirohia ano.Kei te tirotirohia e matou te ahua o te roro o enei peptides mo to raatau kaha ki te whakawhiti i te BBB me / ranei BCSFB.Ko enei peptides hou he taputapu tino nui mo te kitea pea o nga kaiwhakawhiwhi hou, ara ranei mo te whanaketanga o nga papaaho hou tino pai mo te tuku macromolecules, penei i te koiora, ki te roro.
Whakanuia te puna nui (CM) ma te whakamahi i te whakarereketanga o te tikanga i whakaahuatia i mua.Ka mauhia nga kiore Wistar (200-350 g) ki runga i te taputapu stereotaxic, ka mahia he tapahi waenga ki runga i te mahunga kua heua, kua oti te whakarite kia kitea te angaanga.Tuhia kia rua nga kohao ki te waahi o te whitiki o runga ka whakamau i nga kohao whakatika i roto i nga rua.He kohao taapiri i keria ki te taha o te taha okipital mo te arataki stereotactic o te cannula kowiri tira ki roto i te CM.Hoatuhia he sima niho huri noa i te kano ka whakamau ki te tiu.I muri i te whakamaarama-whakaahua me te whakamaroke sima, ka kati te patunga kiri ki te 4/0 supramid tui.Ko te whakanohonga tika o te cannula ka whakapumautia e te rerenga ohorere o te wai cerebrospinal (CSF).Tangohia te kiore mai i te taputapu stereotaxic, whiwhi tiaki tika i muri i te mahi me te whakahaere mamae, ka tuku kia ora mo te iti rawa kia kotahi wiki kia kitea nga tohu o te toto i roto i te wai cerebrospinal.Ko nga kiore Wistar (Crl:WI/Han) i riro mai i te awa o Charles (France).Ka puritia nga kiore katoa i raro i nga tikanga motuhake-kore-mate.Ko nga whakamatautau kararehe katoa i whakaaetia e te Tari Veterinary o te Taone o Basel, Switzerland, a, i mahia i runga i te Raihana Kararehe Nama 2474 (Te Aromatawai o te Kawenga Roo Hohe ma te Ine i nga Taumata o nga Kaitono Whakaora i roto i te Cerebrospinal Fluid me te Brain of Rat).
Kia ata noho te kiore me te cannula CM i te ringaringa.Tangohia a Datura mai i te kano ka kohia te 10 µl o te wai cerebrospinal rere noa.I te mea i whakararu te patene o te cannula i te mutunga, ko nga tauira wai o te cerebrospinal marama noa kaore he tohu o te pokenga o te toto, te paheketanga ranei i whakauruhia ki roto i tenei rangahau.I roto i te whakarara, tata ki te 10-20 μl o te toto i tangohia mai i tetahi waahi iti i te pito o te hiku ki roto i nga ngongo me te heparin (Sigma-Aldrich).I kohia te CSF me te toto i nga waahi rereke i muri i te werohanga o te T7 phage.Tata ki te 5-10 μl o te wai i maka i mua i te kohia o ia tauira CSF, e rite ana ki te rahinga mate o te catheter.
I hangaia nga whare pukapuka ma te whakamahi i te vector T7Select 10-3b i whakaahuatia i roto i te pukapuka punaha T7Select (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996).I te wa poto, i whakahiatohia he whakauru DNA 12-mer matapōkere i te whakatakotoranga e whai ake nei:
I whakamahia te codon NNK ki te karo i nga codons mutu rua me te nui o te waikawa amino i roto i te whakauru.Ko te N he owehenga equimolar i konatunatua-a-ringa o ia nucleotide, a ko te K he owehenga equimolar i konatunatua-a-ringa o te adenine me te cytosine nucleotides.I hurihia nga rohe paea kotahi ki te DNA paearua ma te whakamohoatanga ki te dNTP (Novagen) me te enzyme Klenow (New England Biolabs) i roto i te Klenow buffer (New England Biolabs) mo te 3 haora i te 37°C.I muri i te tauhohenga, ka whakahokia mai te DNA paerua e te rerenga o EtOH.Ko te DNA i puta mai i kerihia me nga whaariki here EcoRI me HindIII (no Roche e rua).Ko te whakauru me te purea (QIAquick, Qiagen) whakauru (T4 ligase, New England Biolabs) ka honoa i roto i te anga ki roto i te vector T7 i mua i te waahi i muri i te waikawa amino 348 o te ira capsid 10B.Ko nga tauhohenga herenga i whakakororiahia i te 16° C. mo nga haora 18 i mua i te whakaurunga in vitro.I mahia te kohinga Phage in vitro i runga i nga tohutohu i tukuna mai me te kete T7Select 10-3b cloning kit (Novagen) a ka whakanuia te otinga whakangao kotahi ki te lysis ma te whakamahi i te Escherichia coli (BLT5615, Novagen).Ko nga lysates i centrifuged, titrated me te whakatoo i te -80° C. hei otinga kararehe mo te glycerol.
Ko te whakakaha PCR tika o nga rohe rerekee o te phage kua whakanuia ki te hupa, ki te pereti ranei ma te whakamahi i te 454/Roche-amplicon fusion primers.Kei roto i te tuatahi o te whakakotahitanga o mua nga raupapatanga kei te taha o te rohe taurangi (NNK) 12 (tauira-motuhake), GS FLX Titanium Adapter A, me te raupapa matua whare pukapuka wha-turanga (TCAG) (Whakaahua 1a taapiri):
Kei roto hoki i te tuatahi o te whakakotahitanga whakamuri te biotin e piri ana ki te hopu pirepire me te GS FLX Titanium Adapter B e hiahiatia ana mo te whakakaha i te wa o te PCR whakaehunga:
Ko nga amplicons ka tukuna ki te 454 / Roche pyrosequencing e ai ki te kawa 454 GS-FLX Titanium.Mo te raupapatanga a-ringa a Sanger (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA Analyzer), i whakanuia te T7 phage DNA e te PCR ka whakaraupapahia me nga takirua tuatahi e whai ake nei:
Ko nga whakaurunga mai i nga tohu takitahi i tukuna ki te PCR whakarahi ma te whakamahi i te Roche Fast Start DNA Polymerase Kit (e ai ki nga tohutohu a te kaihanga).Mahi i te timatanga wera (10 min i 95 °C) me 35 huringa whakanui (50 s i 95 °C, 1 min i 50 °C, me te 1 min i 72 °C).
Ko te phage mai i nga whare pukapuka, te momo momo mohoao, te phage i whakaorangia mai i te CSF me te toto, i whakanuia ranei nga karamai takitahi ki te Escherichia coli BL5615 i roto i te hupa TB (Sigma Aldrich) i roto ranei i nga rihi 500 cm2 (Thermo Scientific) mo te 4 haora i te 37°C.I tangohia mai te Phage mai i nga pereti ma te horoi i nga pereti ki te Tris-EDTA buffer (Fluka Analytical), ma te kohi ranei i nga papa me nga tohutohu paipa paipa.I wehea a Phage mai i te supernatant ahurea, i te paera tangohanga ranei me te kotahi rauna o te polyethylene glycol (PEG 8000) rerenga (Promega) ka whakatarewahia ano ki roto i te parepare Tris-EDTA.
Ko te phage kua whakanuia i tukuna ki te 2-3 rauna o te tango endotoxin ma te whakamahi i nga pirepire tango endotoxin (Miltenyi Biotec) i mua i te werohia (IV) (500 μl / kararehe).I te rauna tuatahi, 2×1012 phages i whakauruhia;i te tuarua, 2×1010 phages;i te toru me te wha o nga rauna whiriwhiri, 2×109 phages mo ia kararehe.Ko te ihirangi Phage i roto i te CSF me nga tauira toto i kohia i nga waahi kua tohua i whakatauhia ma te tatau tohu i runga i nga tohutohu a te kaihanga (T7Select system manual).Ko te whiriwhiringa o te Phage i mahia ma te werohia o nga whare pukapuka kua purea ki roto i te uaua hiku, ma te wero ano ranei o te phage i tangohia mai i te CSF mai i te waahanga whiriwhiri o mua, a ko nga kotinga o muri mai i mahia i te 10 min, 30 min, 60 min, 90 min, 120 min, 180 min, me te tauira CSF 240.E wha nga rauna o in vivo panning i whakahaerea i roto i nga peka e rua kua tohua i rongoa motuhake me te tātari i roto i nga rauna tuatahi e toru o te kowhiringa.Ko nga whakaurunga phage katoa i tangohia mai i te CSF mai i nga rauna tuatahi e rua o te kowhiringa i tukuna ki te 454/Roche pyrosequencing, ko nga kiore katoa i tangohia mai i te CSF mai i nga rauna whiriwhiringa e rua ka whakareri a ringa.Ko nga phages toto katoa mai i te rauna tuatahi o te kowhiringa i tukuna ano ki te 454/Roche pyrosequencing.Mo te werohanga o nga karaehe phage, ka whakanuia nga whae kua tohua ki te E. coli (BL5615) i runga i nga papa 500 cm2 i te 37°C mo te 4 haora.Ko nga karaehe kua tohua takitahi me te raupapa-a-ringa i horahia ki te reo TB.I muri i te tangohanga o te phage, te purenga me te tango i te endotoxin (penei i te korero i runga ake nei), 2×1010 phages/kararehe i roto i te 300 μl i werohia ki roto ki tetahi uaua hiku.
Te tukatuka o mua me te tātari kounga o nga raraunga raupapa.I hurihia nga raraunga Raw 454/Roche mai i te whakatakotoranga mahere awa paerewa (sff) ki te whakatakotoranga panui tangata a Pearson (fasta) ma te whakamahi i te rorohiko kaihoko.Ko etahi atu tukatuka o te raupapa nucleotide i mahia ma te whakamahi i nga kaupapa C me nga tuhinga tuhi (pumanawa rorohiko kaore i tukuna) penei i te korero i raro nei.Kei roto i te tātaritanga o nga raraunga tuatahi nga tikanga tātari tino-waahanga.Hei tarai i nga panui karekau he raupapa DNA whakauru 12mer whaimana, i whakahiatohia nga panui ki te tiimata i te tapanga (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), tapanga mutu (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) me te whakauru papamuri (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC) ma te whakamahi i te whakamatautau o te ao Needleman-Wunsch.te tirohanga kia 2 nga tauritenga mo ia tirohanga31.No reira, ko nga panui karekau he tiimata me te whakamutu i nga tohu me nga panui kei roto nga whakauru papamuri, ara, nga tirohanga ka nui ake i te maha o nga taurite kore e whakaaetia, i tangohia mai i te whare pukapuka.Mo te toenga o nga panui, ko te raupapa DNA N-mer e toro atu ana i te tohu tiimata me te mutunga i mua o te tohu aukati i tangohia mai i te raupapa panui taketake ka mahia ano (i muri nei ka kiia ko "whakauru").Whai muri i te whakamaoritanga o te whakaurunga, ka tangohia te wahanga i muri i te codon mutu tuatahi i te pito 5′ o te tuatahi ka tangohia mai i te whakauru.I tua atu, ko nga nucleotides e arahi ana ki nga codons kore i oti i te pito 3′ o te tuatahi ka tangohia ano.Hei whakakore i nga whakaurunga kei roto anake nga raupapa papamuri, i tangohia hoki nga whakaurunga whakamaori i timata mai i te tauira waikawa amino "PAG".Ko nga peptides he iti iho i te 3 nga waikawa amino i muri i te whakamaoritanga i tangohia mai i te whare pukapuka.Hei whakamutunga, tango i te taapiri i roto i te puna whakauru ka whakatau i te auau o ia whakauru ahurei.Ko nga hua o tenei tātaritanga ko te rarangi o nga raupapa nucleotide (whakauru) me o raatau (panui) iarere (Whakaahua Tāpiri 1c me te 2).
Rōpū N-mer DNA whakauru i runga i te ahua o te raupapa: Hei whakakore i nga hapa raupapa 454/Roche-motuhake (pēnei i nga raruraru me te whakawhitinga i nga toronga homopolymer) me te tango i nga waahanga iti ake, ka tohua nga whakaurunga raupapa N-mer DNA kua tohua i mua (whakauru) i runga i te ahua.whakaurunga (tae atu ki te 2 nga turanga kore-rite e whakaaetia ana) ma te whakamahi i te huringa algorithm kua tautuhia e whai ake nei: ko nga whakaurunga ka tohua i te tuatahi i runga i te auau (te teitei ki te iti rawa), a mena he rite tonu, ma te waahanga tuarua ma te roa (te roa ki te poto) ).Na, ko nga whakaurunga tino maha me te roa e tautuhi ana i te "rōpū" tuatahi.Kua whakaritea te auau roopu ki te auau matua.Na, ko ia whakaurunga e toe ana ki te rarangi kua tohua ka ngana ki te taapiri atu ki te roopu ma te tirohanga takirua a Needleman-Wunsch.Ki te kore e nui ake te maha o nga tauritenga, whakaurunga, mukua ranei i roto i te tiaroaro i te paepae o te 2, ka taapirihia he whakaurunga ki te roopu, ka piki ake te auau o te roopu ma te maha o te taapiri i te whakaurunga.Ko nga whakaurunga kua taapirihia ki tetahi roopu ka tohua kua whakamahia ka waihohia mai i etahi atu tukatuka.Ki te kore e taea te taapiri te raupapa whakauru ki tetahi roopu kua oti ke, ka whakamahia te raupapa whakauru hei hanga i tetahi roopu hou me te auau whakauru tika me te tohu kua whakamahia.Ka mutu te whitiwhitinga ina kua whakamahia ia raupapa whakauru ki te hanga i tetahi roopu hou, ka taea ranei te whakauru ki roto i te roopu o mua.I muri i nga mea katoa, ko nga whakauru kua whakarōpūhia ko nga nucleotides ka huri ki nga raupapa peptide (whare pukapuka peptide).Ko te hua o tenei tātaritanga he huinga whakaurunga me o raatau auau e rite ana ki te hanga i te maha o nga panui karapīpiti (Taupiri Pikitia 2).
Whakatupu Motif: I runga i te rarangi o nga peptides ahurei, i hangaia he whare pukapuka kei roto nga tauira waikawa amino katoa (aa) penei i raro nei.Ko ia tauira o te roa 3 i tangohia mai i te peptide ka honoa atu tona tauira koaro me te whare pukapuka motika noa kei roto nga tauira katoa (tripeptides).I whakaraupapahia nga whare pukapuka o nga motika tino tukurua, ka whakakorehia te mahi.Na, mo ia tripeptide i roto i te whare pukapuka motif, i tirohia e maatau te noho ki te whare pukapuka ma te whakamahi i nga taputapu rorohiko.I tenei keehi, ka taapirihia te auau o te peptide kei roto te tripeptide motif kua kitea, ka tohua ki te kaupapa i roto i te whare pukapuka motif (“te maha o nga kaupapa”).Ko te hua o te whakahiato motika he huinga ahu-rua kei roto nga putanga katoa o nga tripeptides (motifs) me o raatau uara, ko te maha o nga panui raupapa ka puta i te kaupapa e rite ana ka tātarihia, ka whakarōpūhia, ka whakamaoritia nga panui.Inenga pera i whakaahuahia i runga ake nei.
Whakariteritenga o te maha o nga kaupapa me nga marara e rite ana: Ko te maha o nga kaupapa mo ia tauira i whakaritea ma te whakamahi
ko ni te maha o nga panui kei roto te kaupapa i.No reira, ko te vi e tohu ana i te ōrau auau o nga panui (he peptides ranei) kei roto te motif i roto i te tauira.Ko nga uara-P mo te maha o nga kaupapa kore-whakaritea i tatauhia ma te whakamahi i te whakamatautau tika a Fisher.Mo nga correlograms o te maha o nga kaupapa, i tatauhia nga hononga a Spearman ma te whakamahi i te maha o nga kaupapa me R.
Hei whakaata i nga ihirangi o nga waikawa amino i ia waahi i te whare pukapuka peptide, i hangaia nga tohu tohu paetukutuku 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com).Tuatahi, ko te ihirangi o nga waikawa amino i ia waahi o te peptide 12-mer ka rongoa i roto i te matrix 20x12.Na, ka hangaia he huinga 1000 peptides kei roto te ahua o te waikawa amino whanaunga i ia tuunga i roto i te whakatakotoranga tere-raupapa ka tukuna hei whakauru ki te tohu-tukutuku 3, e whakaputa ana i te ahua kauwhata o te ihirangi waikawa amino whanaunga i ia waahi.mo te whare pukapuka peptide kua hoatu.Hei whakaata i nga huingararaunga maha, i hangaia he mapi wera ma te whakamahi i tetahi taputapu i whakawhanakehia i roto i te R (biosHeatmap, he kete R kare ano kia tukuna).Ko nga dendrograms e whakaatuhia ana i roto i nga mapi wera i tatauhia ma te whakamahi i te tikanga whakahiato hierarchical a Ward me te ine tawhiti Euclidean.Mo te tātari tauanga o nga raraunga tohu motif, i tatauhia nga uara P mo nga whiwhinga kore noa ma te whakamahi i te whakamatautau tika a Fisher.Ko nga uara-P mo etahi atu huinga raraunga i tatauhia ki te R ma te whakamahi i te whakamatautau-t a te tauira, ANOVA ranei.
I werohia nga karaka phage me nga phage kaore he whakaurunga i roto i te uaua ma te uaua hiku (2×1010 phages/kararehe i te 300 μl PBS).Tekau meneti i mua i te whakamahutanga me te whakatikatika i muri mai, ka werohia nga kararehe rite ki te 100 μl o te DyLight594-labeled lectin (Vector Laboratories Inc., DL-1177).60 meneti i muri i te werohanga phage, ka parai nga kiore ki roto i te ngakau me te 50 ml PBS whai muri ko te 50 ml 4% PFA/PBS.Ko nga tauira roro i whakatauhia mo te po i roto i te 4% PFA/PBS ka rukuhia ki te 30% sucrose mo te po i te 4°C.Ko nga tauira ka tio ana i roto i te ranunga OCT.I mahia te tātaritanga immunohistochemical o nga tauira tio i te pāmahana rūma i runga i te 30 µm cryosections kua aukatihia ki te 1% BSA me te whakawhao ki nga antibody polyclonal FITC-tapanga ki te T7 phage (Novus NB 600-376A) i te 4 °C.Whakanuia mo te po.I te mutunga, ka horoia nga waahanga 3 nga wa me te PBS ka tirotirohia me te miihini laser confocal (Leica TCS SP5).
Ko nga peptides katoa he iti rawa te ma o te 98% i synthesized e GenScript USA, biotinylated me te lyophilized.Ka herea te Biotin ma tetahi atu mokowhiti glycine toru i te pito-N.Tirohia nga peptides katoa ma te whakamahi i te spectrometry papatipu.
Ko Streptavidin (Sigma S0677) i konatunatua ki te 5-fold equimolar te taikaha o te peptide biotinylated, te peptide aukati BACE1 biotinylated, te huinga ranei (3: 1 ōwehenga) o te peptide aukati BACE1 biotinylated me te peptide aukati BACE1 i roto i te 5-10% DMSO / incubated i roto i te PBSSO / incubated.1 haora i te pāmahana rūma i mua i te werohanga.I werohia nga peptides kua whakauruhia ki te Streptavidin i te horopeta o te 10 mg / kg ki tetahi o nga uaua hiku o te kiore me te kohanga roro.
Ko te kukū o nga matatini streptavidin-peptide i aromatawaihia e ELISA.Nunc Maxisorp microtiter plates (Sigma) i pania i te po i te 4°C me te 1.5 μg/ml kiore anti-streptavidin antibody (Thermo, MA1-20011).I muri i te aukati (te aukati i te parepare: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0.05% NP40, 0.25% gelatin, 1% BSA) i te pāmahana rūma mo nga haora 2, horoia te pereti me te 0.05% Tween-20/PBS (wash buffer) mo te 3 Tuarua, CSF me nga tauira plasma0 kua whakauruhia ki roto i te 1. CSF 1:115).Ko te pereti ka werohia i te po i te 4 ° C me te antibody detection (1 μg / ml, anti-streptavidin-HRP, Novus NB120-7239).I muri i nga taahiraa horoi e toru, ka kitea te streptavidin e te heki i roto i te otinga TMB substrate (Roche) mo te 20 min.I muri i te whakamutu i te whanaketanga tae me te 1M H2SO4, ine i te horonga ki te 450 nm.
Ko te mahi o te streptavidin-peptide-BACE1 inhibitor complex i aromatawaihia e Aβ (1-40) ELISA i runga i te kawa o te kaihanga (Wako, 294-64701).I te wa poto, i waimehahia nga tauira CSF ki te waimeha paerewa (1:23) ka whakakororia i te po i te 4°C i roto i nga papa 96-puna kua pania ki te BNT77 hopu antibody.I muri i te horoinga e rima, ka tapirihia te antibody BA27-HRP-conjugated ka whakakororia mo te 2 haora i te 4° C., ka whai i nga hikoi horoi e rima.I kitea te Aβ(1-40) e te heki i roto i te otinga TMB mo te 30 meneti i te pāmahana rūma.I muri i te whakamutua o te whanaketanga o te tae me te otinga mutu, ine i te horonga i te 450 nm.I tukuna nga tauira plasma ki te tangohanga wahanga totoka i mua i te Aβ(1-40) ELISA.I tapirihia te Plasma ki te 0.2% DEA (Sigma) i roto i nga pereti 96-poka me te incubated i te pāmahana rūma mo te 30 meneti.I muri i te horoinga i nga papaa SPE (Oasis, 186000679) ki te wai me te 100% methanol, ka taapirihia nga tauira plasma ki nga papaa SPE ka tangohia nga wai katoa.I horoia nga tauira (tuatahi me te 5% methanol ka 30% methanol) me te 2% NH4OH/90% methanol.I muri i te whakamaroketanga o te eluate i te 55°C mo te 99 min i te naianei N2 tonu, ka whakahekehia nga tauira i roto i nga diluent paerewa me te ine Aβ(1-40) i runga ake nei.
Me pehea te tuhi i tenei tuhinga: Urich, E. et al.Te tuku utanga ki te roro ma te whakamahi i nga peptides whakawhiti kua tautuhia i roto i te vivo.te pūtaiao.5, 14104;doi:10.1038/srep14104 (2015).
Likhota J., Skjorringe T., Thomsen LB me Moos T. Te tukunga o nga raau taero macromolecular ki te roro ma te whakamahi i te rongoa kua whakaritea.Journal of Neurochemistry 113, 1-13, 10.1111 / j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C., me Martinez-Martinez, P. Te tukunga o nga raau taero peptide me te pūmua puta noa i te arai toto-roro.Prog Neurobiol 87, 212-251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
Pardridge, WM Ko te arai toto-roro: he kohungahunga i te whanaketanga tarukino roro.NeuroRx 2, 3-14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
Johanson, KE, Duncan, JA, Stopa, EG, me Byrd, A. Nga tumanakohanga mo te whakapai ake i te tuku tarukino me te aro ki te roro ma te huarahi choroid plexus-CSF.Rangahau Rongoa 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
Pardridge, WM Whakahoutanga o nga rongoa koiora me nga hoiho Torotiana ngota mo te tuku roro.Bioconjug Chem 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008).
Pardridge, te kawe peptide-whakawhitiwhiti a WM puta noa i te arai toto-roro.Endocr Rev. 7, 314–330 (1986).
Niewoehner, J. et al.Whakanuia te urunga o te roro me te whai huatanga o nga paturopi rongoa ma te whakamahi i nga waka molecular monovalent.Neuron 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
Bien-Lee, N. et al.Ko te kawe kawe whakawhiti (TfR) e whakatau ana i te urunga o te roro o nga momo hononga o nga paturopi TfR.J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).