Mauruuru koe mo te toro ki Nature.com. Kei te whakamahi koe i tetahi putanga tirotiro me te tautoko CSS iti. Mo te wheako pai rawa atu, e taunaki ana matou me whakamahi koe i tetahi kaitirotiro kua whakahoutia (me monohia ranei te Aratau Hototahi ki Internet Explorer). I tua atu, hei whakarite i te tautoko tonu, ka whakaatuhia e matou te waahi kaore he momo me te JavaScript.
Ka whakaatu i te carousel o nga kiriata e toru i te wa kotahi. Whakamahia nga paatene o mua me te Panuku ki te neke i roto i nga kiriata e toru i te wa kotahi, ka whakamahi ranei i nga patene rereti i te mutunga ki te neke i roto i nga kiriata e toru i te wa kotahi.
Ko nga okana neural whakahiato-whaiaro e tohu ana i te papaarangi in vitro mo te whakatauira i te whanaketanga tangata me te mate. Heoi, karekau he hononga ki roto i te vivo, e whakatiki ana i te pakeketanga me te aukati i te whakauru ki etahi atu ara iahiko e whakahaere ana i te whanonga. I konei ka whakaatu matou ko nga organoids cortical cortical i ahu mai i te tangata i ahu mai i te tangata i whakawhitia ki roto i te uho somatosensory o nga kiore tahanga whanau hou ka whakawhanake i nga momo pūtau pakeke ka uru ki roto i nga iahiko tairongo me te hihiko. I whakaatuhia e te MRI te tipu o te organoid i muri i te whakawhitinga i roto i te maha o nga raina pūtau kakau me nga kararehe, i te wa e whakaatuhia ana e te tātaritanga kotahi-matua te ahunga whakamua o te corticogenesis me te putanga mai o te kaupapa tuhi e whakawhirinaki ana ki nga mahi. Inaa, ko nga neuron cortical transplanted e whakaatu ana i nga ahuatanga morphological, synaptic, me te membrane o roto atu i o raatau i roto i te vitro, e taea ai te kite i nga ngoikoretanga neuronal i nga turoro me te mate o Timoti. Kua kitea e te whaihanga tinana me te whai mahi ka whiwhi urunga thalamocortical me te corticocortical i nga okana kua whakatokia, a ko nga rekoata o nga mahi neural e whakaatu ana ka taea e enei whakaurunga te whakaputa urupare tairongo i roto i nga pūtau tangata. Ka mutu, ka toro atu nga axons cortical organoids puta noa i te roro kiore, a ko ta ratou whakahoahoatanga optogenetic ka arahi ki te whanonga rapu utu. No reira, ka pakeke nga neuron cortex tangata i whakawhitia, ka uru ki nga iahiko o te kaihautu e whakahaere ana i te whanonga. Ko te tumanako ka taea e tenei huarahi te kite i nga tohu tohu taumata whenu i roto i nga pūtau i ahu mai i te manawanui e kore e kitea e etahi atu tikanga.
Ko te roro o te tangata e whanake ana he mahinga whakahiato-whaiaro e tipu ai nga pūtau, te rereke, te heke, me te hono ki te hanga iahiko neuronal mahi ka whakapai ake ma te wheako tairongo. Ko tetahi raruraru nui mo te mohio ki te whakawhanaketanga o te roro o te tangata, ina koa i roto i te horopaki o te mate, ko te kore uru ki te kiko roro. Ka taea e nga roopu whakahaere-whaiaro, tae atu ki nga organoids cortex tangata (hCO; e mohiotia ana ko te awheawhe cortex tangata), ka taea te whakaputa 2,3,4,5,6. Heoi, he maha nga here e whakatiki ana i to raatau whakamahinga whanui kia mohio ai ki te whakawhanaketanga me te mahi o nga iahiko neural. Ina koa, kaore i te maarama mena he iti te maoatanga o te hCO na te kore o etahi whakaurunga microenvironmental me te tairongo i roto i te vivo. I tua atu, na te mea kaore nga hCO i whakauruhia ki roto i nga iahiko ka taea te whakaputa i nga putanga whanonga, ko to raatau whaihua ki te whakatauira i nga mate pukupuku ira me nga mate neuropsychiatric whanonga he iti i tenei wa.
Ka taea e te whakawhitinga o te hCO ki roto i te roro ora tonu te wikitoria i enei here. Ko nga rangahau o mua kua whakaatu ko nga neurons tangata kua whakawhitia ki roto i te cortex kiore ka taea te ora, te kaupapa, me te korero ki nga pūtau kiore7,8,9,10,11,12. Heoi, ka mahia enei whakamatautau ki runga i nga kararehe pakeke, ka taea te whakaiti i te whakaurunga synaptic me te axonal. I konei, ka whakaahuahia e matou he tauira whakawhiti i whakatohia e matou te 3D hCO i ahu mai i nga pūtau hiPS ki roto i te uho somatosensory tuatahi (S1) o nga kiore immunodeficient i te timatanga o te whanaketanga kirihou. Ko nga neurons hCO (t-hCO) kua whakawhitia he nui te pakeketanga, ka whiwhi i nga whakauru thalamocortical me te cortical-cortical e puta ai nga urupare mohio, me te toro atu i nga tohu axonal ki roto i te roro kiore hei akiaki i te whanonga rapu utu. Ko te roanga o te matuatanga o te t-hCO kua kitea he ngoikoretanga neuronal i roto i nga turoro me Timoti's Syndrome (TS), he mate ira tino nui i puta mai i nga huringa i roto i te ngaohiko-momo L-momo CaV1.2 hongere konupora (whakawaeherehia e CACNA1C).
Ki te ako i nga neuron cortical tangata i roto i nga ara iahiko i roto i te vivo, i whakawhitia e matou te 3D hCO mau tonu ki roto i te S1 o nga kiore athymic i muri i te whanautanga o mua (ra 3-7 postnatally) (Fig. 1a me nga raraunga whakawhānui o te Fig. 1a-c). I tenei wa, kaore ano kia oti nga tohu axonal thalamocortical me te corticocortical axonal i to raatau S1 innervation (ref. 13). No reira, i hangaia tenei huarahi ki te whakanui i te whakauru t-hCO me te whakaiti i te paanga ki nga iahiko endogenous. Hei tiro i te waahi o te t-hCO i roto i nga kararehe ora, i mahia e matou nga mahi whakatikatika roro MRI T2-taimaha o nga kiore 2-3 marama i muri i te whakawhitinga (Fig. 1b me nga raraunga roa, Fig. 1d). I ata tirohia te t-hCO me nga inenga rōrahi o te t-hCO he rite ki era i tatauhia mai i nga poro kua whakaritea (Raraunga Whakaroa Fig. 1d,e; P > 0.05). I ata tirohia te t-hCO me nga inenga rōrahi o te t-hCO he rite ki era i tatauhia mai i nga poro kua whakaritea (Raraunga Whakaroa Fig. 1d,e; P > 0.05). t-hCO легко наблюдались, а объемные измерения t-hCO были аналогичны рассчитанным для фиксированных срезов (расид,р. 1d, e; P> 0,05). He ngawari te kite i te t-hCO, he rite tonu nga inenga t-hCO ki nga inenga mo nga waahanga kua whakaritea (raraunga kua whakawhānuihia, Fig. 1d, e; P > 0.05).很容易观察到t-hCO，并且t-hCO的体积测量值与从固定切片计算的测量值相似（扩展数据图1d、e；P > 0.05）。很容易观察到t-hCO，并且t-hCO t-hCO легко наблюдался, а объемные измерения t-hCO были аналогичны рассчитанным для фиксированных срезов (расныд срезов) 1d, e; P> 0,05). He ngawari te kite i te t-hCO, a he rite nga inenga t-hCO ki nga waahanga kua whakaritea mo nga waahanga kua whakaritea (raraunga kua whakawhānuihia, Fig. 1d, e; P > 0.05).I whakatauhia e matou te t-hCO i roto i te 81% o nga kararehe kua whakatokia tata ki te 2 marama i muri i te whakawhitinga (n = 72 kararehe; hCO mai i te 10 hiPS raina pūtau; hiPS raina pūtau i te Ripanga Tāpiri 1). O enei, ko te 87% kei roto i te cerebral cortex (Fig. 1c). Na roto i te mahi i nga matawai MRI rangatū i nga wa maha i roto i te kiore i whakatokia ano, i kitea e matou te pikinga e iwa nga wa o te rōrahi t-hCO i roto i nga marama 3 (Fig. 1d me te raraunga whakawhānui, Fig. 1f). Ko nga kararehe kua whakawhitia he nui te tere o te oranga (74%) i nga marama 12 i muri i te whakawhitinga (raraunga kua whakawhānuihia, Fig. 1g me te Ripanga Tāpiri 2), a kaore i kitea he motini, he ngoikoretanga mahara, gliosis, electroencephalogram (EEG) ranei. Raraunga Fig. 1g me te ripanga taapiri 2). 1h–m me te 3e).
a, Ahangahanga o te hoahoa whakamatautau. Ko te hCO i ahu mai i nga pūtau hiPS i whakawhitia ki te S1 o nga kiore tahanga whanau hou i nga ra 30-60 o te rereketanga. b, T2-taimaha coronal me nga whakaahua MRI whakapae e whakaatu ana i te t-hCO i roto i te S1 2 marama i muri i te whakawhitinga. Pae tauine, 2 mm. c, Ko te inenga o nga reiti angitu o te whakairo e whakaatuhia ana mo ia raina waea hiPS (n = 108, ko nga nama kei roto i nga kaho e tohu ana i te nui o te t-hCO mo ia raina pūtau hIPS) me te waahi cortical, subcortical ranei (n = 88). d, te ahua MRI o te arai korokoro (maui; pae tauine, 3 mm) me te hanganga 3D volumetric e rite ana (papa tauine, 3 mm) e whakaatu ana i te pikinga o te t-hCO i runga i te 3 marama. e, Te arotake i nga tauira t-hCO i roto i te kiore cerebral cortex. Pae tauine, 1 mm. f, Ko nga whakaahua immunocytochemical o te t-hCO e whakaatuhia ana mai i te taha maui ki te taha matau (i te wa o te rereketanga): PPP1R17 (4 marama), NeuN (8 marama), SOX9 me GFAP (8 marama), PDGFRα; (8 marama), MAP2 (8 marama) me IBA1 (8 marama). Pae tauine, 20 µm. Ko te whakaputanga tahi o te HNA e tohu ana i nga pūtau no te takenga mai o te tangata. g, snRNA-seq: Whakakotahitia te tini me te matapae (UMAP) whakaahua whakaheke i te rahi o nga karihi t-hCO kounga teitei i muri i te whakaurunga o Seurat (n=3 t-hCO tauira, n=2 hiPS raina pūtau). Astrocytes, nga pūtau o te raina astrocyte; cyc prog, tupuna hurihanga; GluN DL, nga neuron glutamatergic hohonu; GluN DL/SP, nga neuron glutamatergic hohonu me te sublamellar; GluN UL, paparanga teitei neurons glutamatergic; oligodendrocytes, oligodendrocytes; OPC, oligodendrocyte pūtau tupuna; RELN, reelin neurons. h, Gene Ontology (GO) tātaritanga whakarangatira o nga ira i tino whakatikatikahia (kua whakatikahia te P <0.05, te whakarereketanga o te kopa> 2, e whakaatuhia ana i te iti rawa o te 10% o te karihi) i roto i nga neurons glutamatergic t-hCO ki te hCO glutamatergic neurons. h, Gene Ontology (GO) tātaritanga whakarangatira o nga ira i tino whakatikatikahia (kua whakatikahia te P <0.05, te whakarereketanga o te kopa> 2, e whakaatuhia ana i te iti rawa o te 10% o te karihi) i roto i nga neurons glutamatergic t-hCO ki te hCO glutamatergic neurons. h, Анализ обогащения терминов Gene Ontology (GO) для генов со значительной активацией (скорректированный P <0,05, кратмоснеть ия экспрессия по крайней мере в 10% ядер) в глутаматергических нейронах t-hCO по сравнению с глутаматергических нейронах t-hCO по сравнению с глутаматергическироми. h, Gene Ontology (GO) tātaritanga whakarangatira mo nga ira me te whakahoahoa nui (kua whakatikahia te P<0.05, te huringa o te kopa>2, te whakapuaki i te iti rawa o te 10% karihi) i roto i nga neurons glutamatergic t-hCO i whakaritea ki nga neurons glutamatergic hCO. h，与hCO 谷氨酸能神经元相比，t-hCO 谷氨酸能神经元中基因显着上调（调整后P ， 嘉后P 5. 2，在至少10% 的细胞核中表达）的基因本体论(GO) 术语富集分析。 h ， 与 hco 谷氨酸 能 元 相比 ， t-hco 谷氨酸 能 神经 元 基因 显着 上调 （后 后 后 .变化> 2 ， 至少 10% 的 核中 表达） 基因 基因 基因 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 )术语富集分析。 h, гены значительно активизировались (скорректированный P <0,05, кратность изменения> 2, экспрессируется по крайне в 1%) глутаматергических нейронах t-hCO по сравнению с глутаматергическими нейронами hCO Онтологический (GO) анализ тебяониа. h, i tino whakatikatikahia nga ira (whakaritea P <0.05, huringa kopa> 2, kua whakaatuhia i roto i te iti rawa 10% o te karihi) i roto i te t-hCO glutamatergic neurons whakaritea ki te hCO glutamatergic neurons Ontological (GO) tātaritanga o te wa whakarangatira.Ko te raina iraira e tohu ana i te uara aq o te 0.05. i, UMAP atahanga o nga momo pūtau GluN i roto i te t-hCO ma te whakamahi i te whakawhiti tapanga mai i te tohutoro 22 snRNA-seq huinga huinga huinga motuka motuka pakeke. CT — pūtau corticothalamic, ET — pūtau extracerebral, IT — pūtau telencephalic ā-roto, NP — tata matapae.
Na ka aromatawaihia e matou te cytoarchitecture me te hanganga pūtau katoa o t-hCO. Ko te whakakikorua o te antibody o nga pūtau endothelial kiore i whakaatu i te vascularization me te t-hCO, i te wa e whakaatuhia ana e te IBA1 te waahi o te microglia kiore puta noa i te waahi (Fig. 1f me nga raraunga whakawhānui, Fig. 3c, d). I whakaatuhia e te Immunostaining te antigen karihi tangata (HNA) nga pūtau pai e whakaatu ana i te PPP1R17 (cortical progenitors), NeuN (neurons), SOX9 me te GFAP (glial-derived cells) or PDGFRα (oligodendrocyte progenitors) (Whakaahua 1f). Hei ako i te hanganga pūtau o t-hCO i te taumira pūtau kotahi, i mahia e matou te raupapa RNA-matua kotahi (snRNA-seq) i muri tata ki te 8 marama o te rereketanga. Ko te whiriwhiringa nui me te tangohanga o te karihi kiore i puta mai i te 21,500 nga mapi mononuclear tangata-kounga teitei (Fig. 1g me nga raraunga whakawhānui, Fig. 4a,b). Ko nga tauira whakaputanga o nga momo tohu-a-ahua angamaheni i tautuhia he tautau o nga karaehe nui o te puopu cortical, tae atu ki nga neuron glutamatergic hohonu me te papapapa, nga tupuna hurihanga, oligodendrocytes, me te whakapapa astrocyte (Fig. 1g, te raraunga whakawhānui, Fig. 4c, me te Ripanga Tāpiri 3). Ko te Immunostaining mo te SATB2 me te CTIP2 i whakaatu ahakoa te ahua o nga momo waahanga cortical, kaore te t-hCO i whakaatu i te stratification anatomical marama (raraunga kua whakawhānuihia, Fig. 3a). Ko te snRNA-seq hCO kua rite ki te atamira i whakaputa i nga momo karaehe rite tonu, he iti noa nga tuunga, tae atu ki te kore o oligodendrocytes me te aroaro o nga neurons GABAergic, tera pea e whakaatu ana i nga ahuatanga pai i roto i te vitro i mua ake nei mo nga cell progenitor lateral15 (raraunga kua whakawhānuihia, Fig. 4f - i me te Ripanga Tāpiri 4). I whakaatuhia e te tātaritanga ira ira rereke nga rereketanga nui i roto i nga neuron glutamatergic i waenga i te t-hCO me te hCO (Ripanga taapiri 5), tae atu ki te whakahoahoatanga o nga huinga o nga ira e pa ana ki te matuatanga o te neuronal penei i te tohu synaptic, te waahi dendritic, me nga mahi hongere hiko (Whakaahua 1h me te Ripanga Tāpiri 5). ripanga 6). Na reira, ko nga neurons cortical glutamatergic t-hCO i whakaatu i te tere o te whakamaoritanga whakawhiti.
Hei whakamarama mena ko enei huringa whakawhiti i roto i te t-hCO e pa ana ki nga rereketanga o te morphological i waenga i te hCO in vitro me te t-hCO i roto i te vivo, i hangaia ano e matou te hCO me te hCO kua whakakiia ki te biocytin i nga waahanga whakapeka i muri i nga marama 7-8 o te rereketanga. hCO neurons (Fig. 2a). Ko nga neuron t-hCO he tino nui ake, he 1.5 nga wa o te diameter o te soma, e rua te nui o nga dendrites, me te pikinga o te roa o te dendritic katoa e ono-whakaritea ki te in vitro hCO (Fig. 2b). I tua atu, i kitea e matou he tino teitei ake o nga tira dendritic i roto i nga neuron t-hCO i nga neurons hCO (Fig. 2c). Ko tenei e tohu ana ko nga neurons t-hCO he nui te roa o te dendritic elongation me te manga, i te mea, me te haere tonu o te tipu o te pūtau, ka uru pea ki te tipu kaha o te t-hCO i muri i te whakawhitinga (Fig. 1d me te Raraunga Whakanuia Fig. 1f). Na tenei i akiaki i a maatau ki te tirotiro i nga ahuatanga electrophysiological. Ko te kaha o te membrane e waru nga wa teitei ake (raraunga kua whakawhānuihia, Fig. 8d), he nui ake te hyperpolarized te pumanawa membrane okiokinga (tata ki te 20 mV), me te werohanga o naianei i kaha ake te tere tere i roto i nga t-hCO neurons i te hCO neurons. in vitro (Fig. 2d), e), e rite ana ki nga ahuatanga ahua nui me te uaua o te t-hCO. I tua atu, ko te auau o nga mahi o naianei postsynaptic excitatory mahorahora (EPSC) i tino teitei ake i roto i nga neurons t-hCO (Fig. 2f), e kii ana ko te piki haere o nga tira dendritic e kitea ana i roto i nga neuron t-hCO i hono ki te whakaihiihi mahi. synapse moepuku. I whakapumau matou i te ahua pakeke o nga neuron hCO i roto i te vitro ma te tuhi i nga neuron glutamatergic tapanga (raraunga kua whakawhānuihia, Fig. 6a-c).
a, 3D te hanga hou o te biocytin-filled hCO me t-hCO neurons i muri i nga marama 8 o te rereketanga. b, Te inenga o nga ahuatanga morphological (n = 8 hCO neurons, n = 6 t-hCO neurons; ** P = 0.0084, * P = 0.0179 me *** P <0.0001). b, Te inenga o nga ahuatanga morphological (n = 8 hCO neurons, n = 6 t-hCO neurons; ** P = 0.0084, * P = 0.0179 me *** P <0.0001). б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронов t-hCO; ** P = 0,0084, * P = 0,001). b, te inenga o nga ahuatanga morphological (n = 8 hCO neurons, n = 6 t-hCO neurons; ** P = 0.0084, * P = 0.0179, me *** P<0.0001). b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元，n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0.0084，*P = 0.0109 。 b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元，n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0.0084，*P = 0.0109 。 б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронов t-hCO; ** P = 0,0084, * P = 0,001). b, te inenga o nga ahuatanga morphological (n = 8 hCO neurons, n = 6 t-hCO neurons; ** P = 0.0084, * P = 0.0179, me *** P<0.0001).c, te hanganga 3D o nga manga dendritic hCO me t-hCO i muri i nga marama 8 o te rereketanga. Ko nga whetūriki whero e tohu ana i nga hiwi dendritic putative. Ko te inenga kiato o te tuara dendritic (n = 8 hCO neurons, n = 6 t-hCO neurons; **P = 0.0092). d, Te inenga o te pumanawa membrane okiokinga (n = 25 hCO neurons, n = 16 t-hCO neurons; ***P <0.0001). d, Te inenga o te pumanawa membrane okiokinga (n = 25 hCO neurons, n = 16 t-hCO neurons; ***P <0.0001). d, количественная оценка мембранного потенциала покоя (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). d, te inenga pea o te membrane (n = 25 hCO neurons, n = 16 t-hCO neurons; ***P <0.0001). d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；***P <0.0001）。 d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；***P <0.0001）。 d, количественная оценка мембранного потенциала покоя (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). d, te inenga pea o te membrane (n = 25 hCO neurons, n = 16 t-hCO neurons; ***P <0.0001). e, Ko te mahi tukurua te pupuhi i roto i te hCO me te t-hCO na te whakanui ake i nga werohanga o naianei, me te inenga o te reeti pupuhi teitei (n = 25 hCO neurons, n = 16 t-hCO neurons; ***P <0.0001). e, Ko te mahi tukurua te pupuhi i roto i te hCO me te t-hCO na te whakanui ake i nga werohanga o naianei, me te inenga o te reeti pupuhi teitei (n = 25 hCO neurons, n = 16 t-hCO neurons; ***P <0.0001). e, повторное возбуждение потенциала действия в hCO и t-hCO, вызванное увеличением тока, и количественная оценка малксистом возбуждения (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). e, te kaha o te mahi puhipuhi ano i roto i te hCO me te t-hCO na te pikinga o naianei me te ine o te tere puhipuhi morahi (n = 25 hCO neurons, n = 16 t-hCO neurons; *** P <0.0001). e，通过增加电流注入诱导的hCO 和t-hCO 重复动作电位放电，以及最大放电率的量化 的量化神经元，n = 16 个t-hCO 神经元；***P < 0.0001）。 E ， 通过 增加 电流 注入 的 的 hco 和 t-hco 重复 电位 放电 ， 以及 最 大 的 量化 （n （n2（n ， n = 16 个 t-hco 神经 ； *** p <0.0001） 。 e, повторяющееся возбуждение потенциала действия hCO и t-hCO, вызванное увеличением подачи тока, и количественкамламо скорости возбуждения (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). e, ko te pupuhi tukurua o te hCO me te t-hCO nga pumanawa mahi na te pikinga o te tuku o naianei me te inenga o te reeti pupuhi morahi (n = 25 hCO neurons, n = 16 t-hCO neurons; *** P <0.0001). f, Ko nga EPSC mohoao (sEPSCs) i roto i te hCO me te t-hCO neurons i nga marama 8 o te rereketanga, me te ine i te auau o nga huihuinga synaptic (n = 25 hCO neurons, n = 17 t-hCO neurons; *** P <0.0001). f, Ko nga EPSC mohoao (sEPSCs) i roto i te hCO me te t-hCO neurons i nga marama 8 o te rereketanga, me te ine i te auau o nga huihuinga synaptic (n = 25 hCO neurons, n = 17 t-hCO neurons; *** P <0.0001). f, спонтанные EPSC (sEPSC) i roto i te нейронах hCO me t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и количественная оценка частотыч синаптич 5 нейронов hCO, n = 17 нейронов t-hCO; *** P <0,0001) . f, Ko nga EPSC mohoao (sEPSCs) i roto i te hCO me te t-hCO neurons i nga marama 8 o te rereketanga me te inenga o nga reiti huihuinga synaptic (n = 25 hCO neurons, n = 17 t-hCO neurons; *** P<0.0001). f，分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs)，以及突触事件频率的量化（n CO =2（n 的量化（n 17 t-hCO 神经元；***P < 0.0001） . f，分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs)，以及突触事件频率的量匼5（n CO =2（n神率的量匼（n = 25 hCO 神率的量匼（n = 25hCO P < 0.0001） . f, спонтанные EPSC (sEPSC) i roto i te нейронах hCO me t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и количественная оценка частотыч синаптич 5 нейронов hCO, n = 17 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). f, Ko nga EPSC mohoao (sEPSCs) i roto i te hCO me te t-hCO neurons i nga marama 8 o te rereketanga me te ine o nga reiti huihuinga synaptic (n = 25 hCO neurons, n = 17 t-hCO neurons; *** P<0.0001).Mo te bf, ko te hCO me te t-hCO i te rarangi 1208-2 i tangohia mai i te roopu wehewehenga e mau tonu ana ki te whakarara. g, Ko te tātaritanga whakarangatira huinga Gene (te whakamatautau tika a Fisher kotahi-taha) o nga ira kua tino whakatikatikahia (kua whakatikahia te P <0.05, huringa kopa> 2, e whakaatuhia ana i roto i te 10% o te karihi) i roto i nga neurons t-hCO glutamatergic i whakaritea ki nga hCO glutamatergic neurons me nga huinga ira o nga neurons-whakautu wawe (ERG) kua tautuhia mai i nga neurons-whakautu wawe (ERG) me nga neurons-whakautu-a-muri (ERG) kua tautuhia i roto i nga neurons-whakautu wawe (ERG) ako kiore16 me nga LRG motuhake-tangata mai i nga neurons in vitro17. g, Ko te tātaritanga whakarangatira huinga Gene (te whakamatautau tika a Fisher kotahi-taha) o nga ira kua tino whakatikatikahia (kua whakatikahia te P <0.05, huringa kopa> 2, e whakaatuhia ana i roto i te 10% o te karihi) i roto i nga neurons t-hCO glutamatergic i whakaritea ki nga hCO glutamatergic neurons me nga huinga ira o nga neurons-whakautu wawe (ERG) kua tautuhia mai i nga neurons-whakautu wawe (ERG) me nga neurons-whakautu-a-muri (ERG) kua tautuhia i roto i nga neurons-whakautu wawe (ERG) ako kiore16 me nga LRG motuhake-tangata mai i nga neurons in vitro17. g. изменения > 2, экспрессия по меньшей мере в 10% ядер) в глутаматергических нейронах t-hCO по сравнению по сравнению стеримичамчина hCO наборы генов как раннего (ERG), так и позднего (LRG) генов, зависящих от активности, идентифицированных в иванных в иванных в иснисла 6 и специфических для человека LRG из нейронов in vitro17. g, te tātaritanga o te whakarangatira huinga ira (te whakamatautau tika a Fisher kotahi-hiku) o nga ira he nui te whakahohenga (kua whakatikahia te P<0.05, panoni kopa>2, te whakapuaki i te iti rawa o te 10% o te karihi) i roto i te t-hCO glutamatergic neurons whakaritea ki te hCO glutamatergic neurons huinga o nga mahi moata (ERG) me te mutunga (LRG) kua tautuhia te mahi genesce6 i roto i te mahi (LRG) te mutunga o te tangata (LRG) Ko nga LRG mai i nga neurons in vitro17. g，t-hCO谷氨酸能神经元与hCO谷氨酸能神经元相比，t -hCO谷氨酸能神经元显着上调（调整后P<0.05，倍数变化>2，在至少10%的细胞核中表达）的基因集富集分析（单侧F isher精确检验）从体内小鼠研究中鉴定的早期反应(ERG)和晚期反应(LRG) 活性依赖性基因的基因组16 和体外神经元17 中的人类特异性LRG。 g ， t-hco 谷氨酸 神经 元 与 hco 谷氨酸 神经 元 相比 ， t-hco 谷氨酸 神经 元 上调 元 上调 . ， 倍数> 2 ， 至少 至少 10%的 细胞 核中 表达） 的 集富集 分析 （单侧 fisher 精确）研究 中 的 早期 反应 反应 反应 和 晚期 反应 反应 (lrg) 活性 基因 的 基应 和 晚期 反应 反应 (lrg) 活性 基因 的 基因 的 基因 璌 6神经元 17 中 中 17 中 17的人类特异性LRG。 g, глутаматергические нейроны t-hCO были значительно активизированы по сравнению с глутаматергическими нейсронами hCO (тиронами hCO) P<0,05, кратность изменения> 2, не менее 10% Анализ обогащения набора генов (односторонний точный тест Фишетра) позднего гены, зависящие от активности ответа (LRG), идентифицированные в исследованиях на мышах in vivo16 и in vivo16 и нейиефсч для человека. g, t-hCO glutamatergic neurons i tino whakatikatikahia ki te hCO glutamatergic neurons (whakaritea P<0.05, fold change>2, i te iti rawa 10% Early response (ERG) and late response ira enrichment analysis (one-tailed Fisher's exact test) response activity dependent genes (LRGs) i tautuhia i roto i vivo vitro7 neurons motuhake LRG.Ko te raina iraira e tohu ana i te uara P kua whakatikahia e Bonferroni o 0.05. h, Ko te whakaputanga ira a GluN (pseudo-package me te tauine o ia ira) i tino whakatikatikahia i roto i nga tauira snRNA-seq o nga ira LRG i roto i nga neurons glutamatergic t-hCO. i, immunostaining whakaatu whakaaturanga SCG2 i roto i t-hCO (runga) me hCO (raro) neurons. Ka tohu nga pere ma ki nga pūtau SCG2+. Pae tauine, 25 µm. Ko nga raraunga e whakaatuhia ana ko te toharite ± inenga paerewa.
I runga i te pikinga o te mahi o te t-hCO i kitea i roto i nga poro o te ex vivo, snRNA-seq i whakaatu he mahi-whakaaro i nga tuhinga ira i roto i te t-hCO i whakaritea ki te hCO in vitro. Ko nga neurons Glutamatergic t-hCO i whakaatu i nga taumata teitei ake o nga ira e whakahaere ana i nga mahi urupare mutunga (Fig. 2g, h), i kitea i roto i nga rangahau o mua i roto i nga kiore me nga neurons tangata16,17. Hei tauira, ko te BDNF18, SCG2, me te OSTN, he ira-whakahaere mahi-whakahaere i te tuatahi, i whakaatu i te whakanui ake i nga korero i roto i nga neurons t-hCO i whakaritea ki nga neuron hCO (Fig. 2g-i). No reira, ko nga neuron t-hCO i whakaatu i nga ahuatanga o te matuatanga ake i whakaritea ki nga neuron hCO na roto i te whakamaoritanga, te morphological, me nga mahi tātaritanga.
Hei arotake ano i te hononga o te t-hCO matuatanga ki te whakawhanaketanga roro tangata, i mahia e matou he whakatairite transcriptomic o nga momo o te fetal me te pakeke cortical cell19,20 me te pakeke21,22 tae atu ki nga raraunga whanui mo te whakaaturanga ira cortical23 i te wa o te whanaketanga (raraunga kua whakawhānuihia, Fig. 5). ). me nga mahi o mua 24, ko te hCO o te ao me te t-hCO transcriptome maturation mana i te 7-8 marama o te rereketanga he tino rite ki te wa whanaketanga i roto i te vivo me te tino rite ki te mutunga o te ora o te fetal (Raraunga Raraunga 5a). Ko te mea nui, i kite matou i te piki ake o te pakeke o te transcriptome i roto i te t-hCO i whakaritea ki te hCO taurite-tau, me te whakahoahoatanga o te transcriptome e pa ana ki te synaptogenesis, astrogenesis, me te myelination (raraunga kua whakawhānuihia, Fig. 5b-d). I te taumata pūtau, i kitea e matou he taunakitanga o te momo iti o te cortex i roto i te t-hCO, me nga tautau o nga neurons glutamatergic e īnaki ana ki te pakeke L2 / 3, L5, me te L6 neuron subtypes (Whakaahua 1i). He rerekee, he iti ake te kapoipoi i waenga i nga neurons t-hCO glutamatergic me nga neuron cortical fetal i waenganui o te haputanga (raraunga kua whakawhānuihia, Whakaahua 5e-j). Hei whakatau mehemea he rite te mahi o nga neurons t-hCO ki nga neocortical neocortical postnatal tangata, i mahia e matou nga rekoata electrophysiological me nga hanganga anatomical o nga neuron pyramidal L2 / 3 tangata i roto i nga waahanga koi o te cortex postnatal tangata (raraunga kua whakawhānuihia, Fig. 7a). Ko nga ahuatanga electrophysiological o L2 / 3 neurons pyramidal he rite ki nga t-hCO pyramidal neurons (raraunga kua whakawhānuihia, Fig. 7e). Ko te ahua o te ahua, ko nga neuron L2 / 3 mai i nga tauira tangata i muri i te whanautanga he rite tonu ki te t-hCO i te hCO, ahakoa he roa ake nga pūtau L2 / 3, he maha ake nga manga i roto i te katoa, he nui ake te teitei o te hiku (Fig. 3g me te raraunga whakawhānui, Fig. 7b-). G).
a, te whakawhitinga o te hCO i puta mai i te mana whakahaere me nga raina pūtau TS hiPS ki nga kiore neonatal. b, te hanganga 3D o nga neurons t-hCO kua whakakiia ki te biocytin i muri i nga marama 8 o te rereketanga. c, te inenga o te roa dendritic toharite (n = 19 neurons whakahaere, n = 21 TS neurons; ** P = 0.0041). d, 3D-whakahouhia nga manga dendritic mai i te mana me te TS t-hCO i nga marama 8 o te rereketanga, me te ine i te kiato o te tuara dendritic (n = 16 neurons whakahaere, n = 21 TS neurons, *** P <0.0001). d, 3D-whakahouhia nga manga dendritic mai i te mana me te TS t-hCO i nga marama 8 o te rereketanga, me te ine i te kiato o te tuara dendritic (n = 16 neurons whakahaere, n = 21 TS neurons, *** P <0.0001). d, 3D-kaiwhakahaere whare karakia me te TS t-hCO i te 8 ngahuru me te hikohikohikohiko дендритных шипов (n = 16 контрольных нейронов, n = 21 TS нейронов, *** P <0,0001). d, te hanganga 3D o nga manga dendritic mai i te mana me te t-hCO TS i nga marama 8 o te rereketanga me te inenga kiato o te tuara dendritic (n = 16 neurons mana, n = 21 TS neurons, *** P<0.0001). d，分化8 个月时对照和TS t-hCO 的3D 重建树突分支，以及树突棘密度的量化（n = 16 个切21 个TS 神经元，***P < 0.0001）。 d ， 分化 8 个 时 对照 和 ts t-hco 的 3d 重建 分支 分支 以及 树突棘 密度 量化 （n元 ， n = 21 个 ts 神经 ， *** p <0.0001 ）。 d, 3D-kaiwhakahaere whare-whakahaere me te TS t-hCO e 8 nga tikanga whakahaere me te hikohikohikohikohikohikohikohikohikohikohiko. шипов (n = 16 контрольных нейронов, n = 21 TS нейронов, *** P <0,0001). d, Ko te hanganga 3D o nga manga dendritic mana me te TS t-hCO i nga marama 8 o te rereketanga me te inenga kiato o te tuara dendritic (n = 16 neurons mana, n = 21 TS neurons, *** P<0.0001).Ko nga whetūriki whero e tohu ana i nga hiwi dendritic putative. e, ko nga EPSC mahorahora kei te whakahaere me nga neuron TS t-hCO i muri i nga marama 8 o te rereketanga. f, te maataki auau taapiri me te ine i te auau me te kaha kaha o nga huihuinga synaptic (n = 32 neurons whakahaere, n = 26 TS neurons; ** P = 0.0076 me P = 0.8102). g, Te tātaritanga a Scholl o TS me te whakahaere i nga neurons i roto i te hCO me te t-hCO. Ko nga raina kua tohua e whakaatu ana i nga neurons pyramidal L2 / 3 i muri i te whanautanga mo te whakataurite (n = 24 te whakahaere t-hCO neurons, n = 21 TS t-hCO neurons, n = 8 whakahaere hCO neurons, me n = 7 TS hCO neurons). Ko nga raraunga ka whakaatuhia ko te toharite ± inenga paerewa
Ko te kaha o te t-hCO ki te whakahoki ano i nga ahuatanga ahua me nga ahuatanga mahi o nga neuron cortex tangata i te taumata teitei i akiaki i a maatau ki te tirotiro mena ka taea te whakamahi t-hCO ki te kite i nga tohu tohu mate. I aro atu matou ki te TS, he mate neurodevelopmental kino na nga huringa-a-mahi i roto i te ira e whakawaehere ana i te CaV1.2, e timata ana i te whakawhitinga ira ira-mahi i roto i nga neurons. I whiwhi matou i te hCO mai i nga turoro TS e toru e mau ana i te whakakapinga noa (p.G406R) me nga mana whakahaere e toru (Fig. 3a). I muri i te whakawhitinga, i kitea e matou kua whakarereketia te ahua o te dendritic i roto i nga neurons TS i whakaritea ki nga mana whakahaere (Fig. 3b me te whakawhānui ake i nga raraunga, Fig. 8a, b), me te pikinga-rua i te maha o nga dendrites tuatahi me te piki ake o te toharite me te heke o te roa o te dendritic (Fig. 3c me te raraunga roa, Fig. 8c). I whai hononga tenei ki te piki haere o nga koikoi me te piki haere o nga EPSC mahorahora i roto i te TS i whakaritea ki te whakahaere i nga neurons (Fig. 3d-f me te raraunga whakawhānui, Fig. 8g). I kitea ano e te tātaritanga nga tauira o te pekanga dendritic rerekee i roto i te t-hCO TS ka whakaritea ki nga mana whakahaere, engari kaore i roto i te in vitro TS hCO i te wa rite o te rereketanga (Fig. 3g). He rite tonu tenei ki o maatau purongo o mua mo te whakahekenga dendritic e whakawhirinaki ana ki te mahi i roto i te TS me te whakaatu i te kaha o tenei papaa whakawhiti ki te kite i nga tohu tohu mate i roto i te vivo.
Ka patai matou he aha te whanuitanga o nga pūtau t-hCO ka uru ki roto ki te kiore S1. Ko te S1 i roto i nga kiore ka whiwhi i nga whakaurunga synaptic kaha mai i te ipsilateral ventral basal and posterior thalamic nuclei, me te ipsilateral motor me te tuarua somatosensory cortices, me te contralateral S1 (Fig. 4a). Hei whakaora i te tauira whakaroto, ka pangia e matou te hCO ki te huaketo rabies-dG-GFP/AAV-G, ka whakawhitia te hCO ki te kiore S1 e 3 ra i muri mai. I kite matou i te ahua o te GFP i roto i nga neurons o te ipsilateral S1 me te ventral basal ganglia 7-14 ra i muri i te whakawhitinga (Fig. 4b, c). I tua atu, ko te taera antibody o te tohu thalamic netrin G1 i whakaatu i te aroaro o nga pito thalamic i roto i te t-hCO (Fig. 4d, e). Hei arotake mena ka taea e enei matapae afferent te whakaputa urupare synaptic i roto i nga pūtau t-hCO, i mahia e matou nga rekoata katoa mai i nga pūtau tangata ki nga waahanga koi o te paparanga thalamocortical. Te whakaihiihi hiko o te kiore S1, te kapi o roto, te mea ma, nga muka e tata ana ki te t-hCO, te whakahoahoatanga optogenetic ranei o nga mutunga thalamic e whakaatu ana i te opsin i roto i nga EPSCs poto-roa i roto i te t-hCO i roto i nga neurons t-hCO e kitea ana ki te AMPA antagonist NBQX. (Whakaahua 4f, g me nga raraunga taapiri, Pikitia 9a–g). Ko enei raraunga e whakaatu ana ko te t-hCO kua whakauruhia ki roto i te roro kiore, a ka taea e ia te whakahohe i te kiko o te ope kiore.
a, Hoahoa hoahoa o te whakamatautau rabies. b, GFP me te whakaaturanga STEM121 motuhake-tangata i waenga i te t-hCO me te kiore cerebral cortex (papa o runga). Kei te whakaatuhia ano te whakaaturanga GFP i roto i te kiore ipsilateral ventral basal nucleus (VB) (raro maui) me te ipsilateral S1 (raro matau). Pae tauine, 50 µm. Ko nga tapawha whero e tohu ana i nga waahi o te roro i tangohia ai nga whakaahua. c, te inenga o nga pūtau e whakaatu ana i te GFP (n = 4 kiore). d, e — Netrin G1+ nga pito thalamic i t-hCO. d e whakaatu ana i te wahanga korokoro kei roto te karihi t-hCO me VB. Pae tauine, 2 mm. e whakaatu ana i te korero Netrin G1 me STEM121 i roto i nga neurons t-hCO (maui) me VB (matau). Pae tauine, 50 µm. Ko te raina iraira karaka e tohu ana i te taitapa t-hCO. f, g, Nga tohu o naianei o nga neuron t-hCO i muri i te whakaihiihi hiko i roto i te kiore S1 (f) ranei te potae o roto (g), me te (papura) me te kore (pango) NBQX (maui). EPSC amplitudes ki me te kore NBQX (n = 6 S1 neurons, *P = 0.0119; me n = 6 neurons capsule roto, **P = 0.0022) (pokapū). Te ōrau o ngā neurons t-hCO e whakaatu ana i te EPSC hei whakautu ki te whakaihiihi hiko o te kiore S1 (f) ranei te potae o roto (g) (matau). aCSF, wai cerebrospinal artificial. h, hoahoa hoahoa o te whakamatautau atahanga 2P (maui). Te whakaputanga o nga GCaMP6 i t-hCO (waenganui). Pae tauine, 100 µm. Ko te wa rere o te GCaMP6s (matau). i, Z-score o te korikori ngohe mahorahora. j, he whakaahuatanga mo te whakaongaonga ngutu. k, 2P nga tohu awhiowhiowhiotanga i te whakamatautauranga kotahi, e hono ana ki te paheketanga pahau i te wa kore (raina kua tohua) i roto i nga tauira tauira. l, te taupori-toharite-nga whakautu z-tohu o nga pūtau katoa e whakahāngai ana ki te pahekeheke haruru i te wa kore (raina kua tohua) (whero) me nga tohu wa i hangaia matapōkeretia (hina). m. Hoahoa hoahoa o te whakamatautau mo te tohu mata. n, Ngaohiko ngaohiko ngaohiko mai i te tauira t-hCO pūtau i te wa o te whakaihiihi taiaho kikorangi, te paheketanga o te pahau. Ko nga pere Whero e tohu ana i nga koikoi tuatahi i puta mai i te marama (runga), i puta mai ranei i te paheketanga o te pahau (raro). Ko te marumaru hina e tohu ana i nga wa o te paheketanga o te paku. o, Ko nga ahuatanga ngaru marama me nga whakautu paopao. p, he koikoi o te nganatanga kotahi, e hono ana ki te paheketanga o nga pahau i roto i nga ruma o te tauira. Ko te 0 e tohu ana i te paheketanga o te pahau (raina kua pakaru). q, te reeti pupuhi-z-tauwaenga o te taupori mo nga pūtau tairongo whakaahua katoa, kua whakahāngaitia ki te paheketanga pahau i te wa kore (raina kua tohua) (whero) me nga tohu wa i hangaia matapōkeretia (hina). r, Ko te wahanga o nga waeine whakaahua i tino whakarereketia e te paheketanga o te pahau (n = 3 kiore) (maui). Ko te teitei o te piro-z te torohūtanga (n = 3 kiore; n = 5 (marama matomato), n = 4 (pouri kakariki), me n = 4 (cyan) waeine whakanekehanga paoro pahau mo ia kiore) (matau). Ko nga raraunga e whakaatuhia ana ko te toharite ± inenga paerewa
Ka patai matou mena ka taea te whakahohe i te t-hCO ma te whakaohooho i roto i te vivo. I whakawhitia e matou te hCO e whakaatu ana i nga tohu konupūmā ira GCaMP6 ki te kiore S1. I muri i nga ra 150, ka mahia e matou te whakaahua whakaahua muka, te whakaahua konupūmā rua-photon ranei (Fig. 4h me te raraunga whakawhānui, Fig. 10a). I kitea e matou ko nga pūtau t-hCO e whakaatu ana i nga mahi riipene tukutahi (Whakaahua 4i, Raraunga Whakanuia, Whakaahua 10b me te Ataata Tāpiri 1). Hei tohu i nga mahi teitei t-hCO, i mahia e matou nga rekoata electrophysiological extracellular i roto i nga kiore whakawhitinga whakahiato (raraunga kua whakawhānuihia, Fig. 10c-f). Kua hangaia e matou nga taunga stereotaxic mai i nga whakaahua MRI; na, ko enei waahanga kua tuhia e tohu ana i nga neuron tangata putative, ahakoa ko te electrophysiology anake e kore e tuku i tetahi momo takenga ki te whakatau. I kite matou i nga pakaru o te mahi (raraunga kua whakawhānuihia, Fig. 10d). Tata ki te 460 ms te roa o nga pakaru, ka wehea e nga wa wahangu mo te 2 hēkona (raraunga kua whakawhanuihia, Fig. 10d, e). Ko nga waeine takitahi i pupuhi i te toharite tata ki te toru rauna mo ia pakaru, he 73% o nga waahanga kua rehitatia mo ia pakaru. Ko nga mahi o nga waahanga takitahi i tino hono, a ko enei hononga he nui ake i nga waahanga kua tautuhia i roto i nga kararehe kaore i werohia i tuhia i raro i nga tikanga ano (raraunga kua whakawhānuihia, Fig. 10f). Hei whakaatu ake i nga urupare koikoi o nga neuron i ahu mai i te tangata, i mahia e matou he whakamatautau tohu-maama ki nga kiore kua whakatohia ki te hCO e whakaatu ana i te hongere cation cation rhodopsin 2 (hChR2), na roto i nga t-hCO neurons te whakamohiotanga poto (iti iho i te 10 ms) hei whakautu ki te whakaihiihi marama puru (Fig.4im–Fig). Ko nga neurons t-hCO i whakaatu i nga pupuhi o te mahi mahorahora i nga auau e rite ana ki nga mea i kitea i roto i te whakaahua konupūmā, me nga rekoata electrophysiological i mahia i roto i te t-hCO i te kore o te tohu marama (raraunga kua whakawhānuihia, Fig. 10c-g). Karekau he mahi ohorere i kitea i roto i nga waahanga o te hCO i tuhia i roto i te vitro. Hei aromatawai mehemea ka taea e t-hCO te whakahoahohia e nga whakaihiihi tairongo, he wa poto nei ka paopaohia e matou nga pahau kiore mai i te t-hCO (Whakaahua 4j,m me nga raraunga roa, Fig. 10h,k). E ai ki nga rangahau o mua8,10, ko te waahanga o nga pūtau t-hCO i whakaatu i te kaha ake o te mahi hei whakautu i te paheketanga o te whisker, kaore i kitea i te wa i whakatauritehia nga raraunga ki nga tohu waahi matapōkere (Fig. 4k-q me te raraunga whakawhānui, Fig. 10h-q). Inaa, tata ki te 54% o nga waeine kotahi kua tapaina ki te opto i tino piki ake te tere o te whakaoho i muri i te whakaihiihi i te haruru, ka eke ki te 650 ms (Fig. 4r). Ka huihuia, ko enei korero e kii ana ka whiwhi t-hCO i nga whakaurunga mahi e tika ana, ka taea hoki te whakahoahohia e nga whakaihiihi taiao.
Na ka tirotirohia mena ka taea e t-hCO te whakahohe iahiko i roto i nga kiore hei whakahaere i te whanonga. I tirotirohia e matou i te tuatahi mena ka uru nga axons o nga neuron t-hCO ki roto i nga kopa a tawhio noa o te kiore. I pangia e matou te hCO me te lentivirus whakawaehere hChR2 kua honoa ki te EYFP (hChR2-EYFP). I muri i nga ra 110, ka kite matou i te whakaaturanga EYFP i roto i nga rohe cortical ipsilateral, tae atu ki te whakarongo, te moto, me te somatosensory cortices, me nga rohe subcortical, tae atu ki te striatum, hippocampus, me te thalamus (Fig. 5a). Hei aromatawai mena ka taea e enei matapae rereke te whakaputa i nga urupare synaptic i roto i nga pūtau kiore, i whakahoahohia e matou nga pūtau t-hCO e whakaatu ana i te hChR2-EYFP ma te tuhi i nga pūtau cortex cerebral kiore ki nga waahanga roro koi. Ko te whakahohenga o nga toki t-hCO me te rama kikorangi i whakaawe i nga EPSCs poto i roto i nga neuron cortex pyramidal kiore, i aukatihia e NBQX (Fig. 5b-g). I tua atu, ko enei whakautu ka taea te aukati e te tetrodotoxin (TTX) me te whakahoki mai i te 4-aminopyridine (4-AP), e kii ana na nga hononga monosynaptic (Fig. 5e).
a, Hoahoa hoahoa mo te whai axon (maui). t-hCO EYFP whakapuaki (matau). Pae tauine, 100 µm. A1, uho whakarongo, ACC, uho cingulate o mua, d. striatum, dorsal striatum, HPC, hippocampus; Diaphragm, lateral septum, mPFC, medial prefrontal cortex, piri, piriform cortex, v. striatum, ventral striatum, VPM, ventropostomedial nucleus o te thalamus, VTA, ventral tegmental rohe. Ko nga tapawha whero e tohu ana i nga waahi o te roro i tangohia ai nga whakaahua. b, Hoahoa hoahoa o te whakamatautau whakaongaonga. c, d, Ko nga tauira o te urupare o te awaawa-whakaahua puru (runga) me te ngaohiko (raro) i roto i te tangata (c) EYFP + t-hCO ranei kiore (d) EYFP- pūtau. e, f, Nga tohu o naianei o nga neuron kiore i muri i te whakaihiihi marama puru o t-hCO axons me te TTX me te 4-AR (matomato), TTX (hina) ranei aCSF (pango) (e), me te (puru) me te kore (pango) ) ) NBQX (e). g, te roanga o nga urupare i whakaawehia e te rama kikorangi i roto i nga ruma kiore (n = 16 nga pūtau); ko nga pae whakapae e tohu ana i te roanga o te roa (7.13 ms) (maui). Te kaha kaha o nga EPSC kua whakamarama-marama kua tuhia me te NBQX kore ranei (n = 7 nga pūtau; ***P <0.0001) (waenganui). Te kaha kaha o nga EPSC kua whakamarama-marama kua tuhia me te NBQX kore ranei (n = 7 nga pūtau; ***P <0.0001) (waenganui). Амплитуда вызванных светом EPSC, зарегистрированных с или без NBQX (n = 7 клеток; ***P <0,0001) (i te центре). Te kaha kaha o nga EPSC i whakahiahia te marama i tuhia me te NBQX (n = 7 nga pūtau; ***P <0.0001) (pokapū).使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P < 0.0001）（中）。使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P < 0.0001）（中）。 Амплитуда вызванных светом EPSC, зарегистрированных с или без NBQX (n = 7 клеток; ***P <0,0001) (i te центре). Te kaha kaha o nga EPSC i whakahiahia te marama i tuhia me te NBQX (n = 7 nga pūtau; ***P <0.0001) (pokapū).Te ōrau o ngā pūtau kiore e whakaatu ana i ngā EPSC e aro ana ki te rama kikorangi (matau). h, Te hoahoa hoahoa o te mahi whanonga. d0, ra 0. i. Te mahi a nga kararehe pai i te ra 1 (maui) te ra 15 ranei (matau) o te whakangungu. Ko te tau toharite o nga mitimiti i mahia i te ra 1 (maui) ranei te ra 15 (pokapū matau) (n = 150 nga whakamatautau rama kikorangi, n = 150 nga whakamatautau rama whero; ***P <0.0001). Ko te tau toharite o nga mitimiti i mahia i te ra 1 (maui) ranei te ra 15 (pokapū matau) (n = 150 nga whakamatautau rama kikorangi, n = 150 nga whakamatautau rama whero; ***P <0.0001). Среднее количество облизываний, выполненных в день 1 (слева) ranei день 15 (ki центре справа) (n = 150 испытаний с = ситоний с =ситоний испытаний с красным светом; ***P <0,0001). Te tau toharite o nga mitimiti i mahia i te ra 1 (maui) ranei te ra 15 (pokapū matau) (n = 150 nga whakamatautau rama kikorangi, n = 150 nga whakamatautau rama whero; ***P <0.0001).第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验，n = 150次红光试验；***P < 0.0001）。第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验，n = 150次红光试验；***P < 0.001 Среднее количество облизываний, выполненных в день 1 (слева) ranei день 15 (ki центре справа) (n = 150 испытаний с = ситоний с =ситоний испытаний с красным светом; ***P <0,0001). Te tau toharite o nga mitimiti i mahia i te ra 1 (maui) ranei te ra 15 (pokapū matau) (n = 150 nga whakamatautau rama kikorangi, n = 150 nga whakamatautau rama whero; ***P <0.0001).Nga mitimiti whakahiato mo nga whakamatautau marama whero me te kikorangi i te ra 1 (pokapū maui) te ra 15 ranei (matau). NS, ehara i te mea nui. j, k, Ko nga ahuatanga whanonga o nga kararehe katoa i whakatokia ki te t-hCO e whakaatu ana i te hChR2-EYFP (j) ranei te whakahaere fluorophore (k) i te ra 1, 15 ranei (hChR2-EYFP: n = 9 kiore, ** P = 0.0049; mana: n = 9, P = 0.1497). l, Te whanaketanga o te kaute manakohanga (n = 9 hChR2, n = 9 mana; **P <0.001, ***P <0.0001). l, Te whanaketanga o te kaute manakohanga (n = 9 hChR2, n = 9 mana; **P <0.001, ***P <0.0001). l, Эволюция показателя предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 контрольных; **P <0,001, ***P <0,0001). l, Te whanaketanga o te kaute manakohanga (n = 9 hChR2, n = 9 mana whakahaere; **P <0.001, ***P <0.0001). l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2，n = 9 对照；**P <0.001，***P < 0.0001）。 l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2，n = 9 对照；**P <0.001，***P < 0.0001）。 l, Эволюция показателей предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 контролей; **P <0,001, ***P <0,0001). l, Te whanaketanga o nga tohu manakohanga (n = 9 hChR2, n = 9 mana whakahaere; **P <0.001, ***P <0.0001).m, te whakapuaki FOS hei whakautu ki te whakahohe optogenetic o t-hCO i S1. Ko nga whakaahua o te whakapuaki FOS (maui), me te ine (n = 3 mo ia roopu; *P <0.05, **P <0.01 me ***P <0.001) (matau) e whakaatuhia ana. Ko nga whakaahua o te whakapuaki FOS (maui), me te ine (n = 3 mo ia roopu; *P <0.05, **P <0.01 me ***P <0.001) (matau) e whakaatuhia ana. Показаны изображения экспрессии FOS (слева) me te количественного определения (n = 3 на группу; * P <0,05, ** P <0,01, 001 P <0,01 и *** P). Ko nga whakaahua o te whakapuaki FOS (taha maui) me te ine (n = 3 mo ia roopu; *P<0.05, **P<0.01, me ***P<0.001) e whakaatuhia ana (matau).显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P < 0.05、**P < 0.01 和***P < 0.001）（叾）（叾）显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P < 0.05、**P < 0.01 和***P < 0.001）（叾）（叾） Показаны изображения экспрессии FOS (слева) me te количественного определения (n = 3 на группу; * P <0,05, ** P <0,01, 001 P <0,01 и *** P). Ko nga whakaahua o te whakapuaki FOS (taha maui) me te ine (n = 3 mo ia roopu; *P<0.05, **P<0.01, me ***P<0.001) e whakaatuhia ana (matau).Pae tauine, 100 µm. Ko nga raraunga e whakaatuhia ana ko te tikanga ± hapa paerewa o BLA, basolateral tonsil, MDT, dorsomedial thalamic nucleus, PAG, periaqueductal hina.
Ka mutu, ka patai atu mena ka taea e t-hCO te whakarereke i te whanonga kiore. Hei whakamatautau i tenei, i whakatohia e matou te hChR2-EYFP-e whakaatu ana i te hCO ki roto i te S1, a 90 nga ra i muri mai, ka whakatohia e matou nga muka whatu ki te t-hCO mo te tuku marama. Katahi ka whakangungua e matou nga kiore me te tauira whakaahuru opeera kua whakarereketia (Fig. 5h). I whakanohohia e matou nga kararehe ki roto i te ruma whakamatautau whanonga me te tono matapōkeretia 5 tuarua puru (473 nm) me te whero (635 nm) whakaongaonga laser. Ka whiwhi nga kararehe i te utu wai mena ka mitimiti ratou i te wa whakaihiihi marama kahurangi engari kaore i mitimiti i te wa whakaihiihi rama whero. I te ra tuatahi o te whakangungu, karekau he rereketanga o nga kararehe mo te mitimiti i te wa e whakaihiihihia ana e te rama kikorangi, whero ranei. Heoi, i te ra 15, ko nga kararehe i whakatokia ki te hCO e whakaatu ana i te hChR2-EYFP i whakaatu i te kaha ake o te mitimiti i te wa e whakaihiihihia ana e te rama kikorangi ka whakaritea ki te whakaihiihi rama whero. Ko enei huringa i roto i te whanonga mitimiti kaore i kitea i roto i nga kararehe whakahaere i whakatokia ki te hCO e whakaatu ana i te mana fluorophore (te reanga angitu ako: hChR2 89%, EYFP 0%, Whakaahua 5i-1 me te Ataata Tāpiri 2). Ko enei raraunga e kii ana ka taea e nga pūtau t-hCO te whakahohe i nga neuron kiore hei whakaongaonga i te whanonga rapu utu. Kia mohio ai he aha nga huringa neural t-hCO kiore e whai waahi ana ki enei huringa whanonga, ka whakahohehia e matou te t-hCO i roto i nga kararehe kua whakangungua me nga kopa kua hauhake i te 90 meneti i muri mai. I whakaatuhia e te Immunohistochemistry te whakaaturanga o te pūmua FOS e whakawhirinaki ana ki te mahi i roto i nga rohe roro e uru ana ki te whanonga hihiri, tae atu ki te medial prefrontal cortex, medial thalamus, me te periaqueductal mea hina, i whakaatuhia i roto i nga kararehe whakahaere kore whakaongaonga, i nga kararehe ranei. raihi. 5m). Ko enei korero e kii ana ka taea e t-hCO te whakarereke i nga mahi neuronal kiore hei akiaki i te whanonga.
Ko nga organoids neural e tohu ana i tetahi punaha pai mo te ako i te whanaketanga o te tangata me te mate in vitro, engari he iti noa na te kore hononga i waenga i nga iahiko e noho ana i roto i te vivo. Kua whakawhanakehia e matou he papa hou i whakawhitia ai e matou te hCO ki roto i te S1 o nga kiore i muri mai i te whanautanga ki te ako i te whanaketanga o te tangata me te mahi i roto i te vivo. Kua whakaatuhia e matou ko te t-hCO e whakawhanake ana i nga momo pūtau pakeke kaore i kitea i roto i te vitro28 a ko te t-hCO kua whakauruhia ki roto i te roro kiore. Ko te whakaurunga o te t-hCO ki roto i nga iahiko neural rodent i taea ai e matou te whakatuu hononga i waenga i nga mahi pūkoro tangata me te ako i nga whanonga kararehe, e whakaatu ana ka taea e nga neuron t-hCO te whakarereke i nga mahi neuronal kiore ki te akiaki i nga urupare whanonga.
He maha nga painga o te papanga e whakaahuatia ana e matou i runga i nga rangahau o mua mo te whakawhiti i nga pūtau tangata ki roto i nga roro kiore. I te tuatahi, i whakawhitia e matou te hCO ki roto i te uho whakawhanake o nga kiore i muri i te whanautanga o mua, e pai ai te whakaurunga tinana me te mahi. Tuarua, ko te tirotiro t-hCO MRI i taea e maatau te ako i te tuunga me te tipu o nga kararehe ora, ka taea e maatau te whakahaere rangahau-kararehe mo te wa roa, me te whakapumau i te pono o nga rarangi waea hiPS. I te mutunga, i whakawhitia e matou nga organoids totika, kaua ki te whakatārewatanga o te pūtau kotahi, he iti ake te kino ki nga pūtau tangata, ka taea te whakatairanga i te whakauru me te whakatipuranga o nga neuron cortex tangata i roto i nga roro kiore.
E whakaae ana matou ahakoa te ahu whakamua i roto i tenei turanga, ko nga herenga-a-tinana, mokowhiti, me nga momo-whakawhitinga e aukati ana i te hanganga o nga iahiko neural tangata me te tino pono, ahakoa i muri i te whakawhitinga i te timatanga o te whanaketanga. Hei tauira, kaore i te maarama mena ko te ngohe mahorahora e kitea ana i roto i te t-hCO e tohu ana i te ahua o te whanaketanga e rite ana ki te ngohe manawataki i kitea i te wa o te whanaketanga cortical, na te korenga o nga momo pūtau aukati kei roto i te t-hCO. Waihoki, kaore i te maarama he aha te nui o te korenga o te lamination i roto i te t-hCO e pa ana ki te hononga mekameka30. Ko nga mahi a meake nei ka aro ki te whakauru i etahi atu momo pūtau penei i te microglia tangata, nga pūtau endothelial tangata, me nga momo rereke o nga GABAergic interneurons e whakaatuhia ana ma te whakamahi i te huihuinga 6 in vitro, me te maarama me pehea te whakauru me te tukatuka neural ka puta i roto i te t-hCO kua whakarereketia. nga taumata whakawhiti, synaptic me te whanonga i roto i nga pūtau i whiwhi mai i nga turoro.
I roto i te katoa, ko tenei papaaho in vivo he rauemi kaha hei whakakii i te whanaketanga roro tangata me te rangahau mate. Ko te tumanako ka taea e tenei papaaho te kite i nga tohu tohu-taumata hou i roto i nga pūtau i ahu mai i te manawanui me te whakamatautau i nga rautaki rongoa hou.
I hangaia e matou te hCO2.5 mai i nga pūtau HiPS i whakaahuahia i mua. Hei timata i te hanga hCO mai i nga pūtau hiPS i whakatipuria ki runga i nga paparanga kai, ka tangohia nga koroni totika o nga pūtau hiPS mai i nga riu ahurea ma te whakamahi i te dispase (0.35 mg/mL) ka whakawhitia ki nga ahurea kirihou piri-iti-iti kei roto nga rihi me te reo tikanga hiPS pūtau. (Corning) i tapirihia e rua nga kaitautoko SMAD dorsomorphine (5 μM; P5499, Sigma-Aldrich) me SB-431542 (10 μM; 1614, Tocris) me te ROCK inhibitor Y-27632 (10 μM; S1049, Selleckchem). I roto i nga ra tuatahi e 5, ka hurihia te reo hiPS i ia ra, ka taapirihia te dorsomorphine me te SB-431542. I te ono o nga ra i te whakatārewatanga, ka whakawhitia te neural spheroids ki te neural medium kei roto te neurobasal-A (10888, Life Technologies), B-27 taapiri kaore he huaora A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), penicillin me te streptomycin (1:100, Life Technologies) me te taapiri ki te huaora e (100000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000o R & D Systems) me te fibroblast growth factor 2 (FGF2; 20 ng ml−1; R & D Systems) tae noa ki te ra 24. Mai i te ra 25 ki te ra 42, ka taapirihia te reo ki te tauwehe neurotrophic i puta mai i te roro (BDNF; 20 ng ml−1, Peprotech) me te neurotrophin 3 (NT3; 20) nga huringa o etahi atu ra. I te ono o nga ra i te whakatārewatanga, ka whakawhitia te neural spheroids ki te neural medium kei roto te neurobasal-A (10888, Life Technologies), B-27 taapiri kaore he huaora A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), penicillin me te streptomycin (1:100, Life Technologies) me te taapiri ki te huaora e (100000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000o R & D Systems) me te fibroblast growth factor 2 (FGF2; 20 ng ml−1; R & D Systems) tae noa ki te ra 24. Mai i te ra 25 ki te ra 42, ka taapirihia te reo ki te tauwehe neurotrophic i puta mai i te roro (BDNF; 20 ng ml−1, Peprotech) me te neurotrophin 3 (NT3; 20) nga huringa o etahi atu ra.I te ono o nga ra i te whakatārewatanga, ka whakawhitia nga spheroids neural ki te reo neural kei roto Neurobasal-A (10888, Life Technologies), B-27 taapiri kaore he huaora A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1: 100, Life Technologies), penicillin.и стрептомицин (1:100, Life Technologies) и дополнены эпидермальным фактором роста (EGF; 20 нг/мл; R&D Systems) me te фактором роста фиброб; R&D Pūnaha) ki te 24-го дня. me te streptomycin (1:100, Life Technologies) me te taapiri atu ki te tauwehe tupu epidermal (EGF; 20 ng/ml; R&D Systems) me te fibroblast growth factor 2 (FGF2; 20 ng/ml; R&D Systems) tae noa ki te ra 24.Mai i nga ra 25 ki te 42, ko te tauwehe neurotrophic i puta mai i te roro (BDNF; 20 ng ml-1, Peprotech) me te neurotrophin 3 (NT3; 20 ng ml-1, Peprotech) i whakauruhia ki te reo, ka huri i te reo i ia ra.在悬浮的第6 天，将神经球体转移到含有neurobosal-A（10888，Life Technologies）、不含维生素A 的B-27补充剂（12587，Life Technologies）、GlutaMax（1:100，Life Technologies）、青霉素的神经培养基中和链霉素（1:10 Hangarau）并辅以表皮生长因子（EGF；20 ng ml-1；R&D Systems）和成纤维细胞生长因子2（FGF ngR2；；20 Systems）直至第24 天。在 悬浮 的 第 第 6 天 将 神经 球体 转移 含有 含有 neurobasal-a （10888 ， Life Technologies） 不 含 的索2补充剂 （12587 ， Life Technologies） Glutamax （1: 100 ， Life TechNOGIS青霉素 的 神经 培养 基 中 链霉素 （1（素 （0（1: Hangarau生长 因子 （（（20 ng ml-1 ； r & d Pūnaha） 成 纤维 细胞 生长 2 （fgf2 ； 20 ng ml- 1；笛因华＇ 6-й день суспензии нейросферы были переведены на добавку, содержащую нейробазал-А (10888, Life Technologies), бемтав7 А (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), пенициллин- нейтрализованный стрептомицин (1:100, Life Technologies) с добавлением эпидермальафратор; нг мл-1; R&D Systems) и фактора роста фибробластов 2 (FGF2; 20 нг мл-1) 1; I te ra 6, ka hurihia nga aukati neurosphere ki tetahi taapiri kei roto i te neurobasal-A (10888, Life Technologies), te taapiri B-27 kaore he huaora A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), penicillin-neutralized streptomycin (1:100, Life Technologies) kua taapirihia me te epidermal 1. tauwehe tipu fibroblast 2 (FGF2; 20 ng ml-1) 1; R&D Pūnaha) ki te 24-го дня. R&D Systems) tae noa ki te ra 24.Mai i nga ra 25 ki te 42, ko te tauwehe neurotrophic i puta mai i te roro (BDNF; 20 ng ml-1, Peprotech) me te neurotrophic factor 3 (NT3; 20 ng ml-1, Peprotech) i whakauruhia ki te reo ahurea i ia ra. Huringa Waenga kotahi.I timata mai i te ra 43, ka mau tonu te hCO i roto i te reo neurobasal-A kaore i taapirihia (NM; 1088022, Thermo Fisher) me te huringa reo i nga ra 4-6. Ki te whiwhi hCO mai i nga pūtau hiPS i whakatipuhia i raro i nga tikanga kore kai, ka whakakorohia nga pūtau hiPS ki te Accutase (AT-104, Innovate Cell Technologies) i te 37°C mo te 7 meneti, ka wehea ki roto i nga ruma kotahi, ka whakakikoruatia ki runga i nga papaa AggreWell 800 (34815, STEMCELL Technologies) i te kiato o te 3 × 106 i roto i nga pūtau whakahiatotanga o te puna wai RORO kotahi. Y-27632 (10 μM; S1049, Selleckchem). I muri i nga haora 24, ka paipahia nga paanui i roto i nga puna ki runga me te heke ki roto i nga papaaho Essential 6 (A1516401, Life Technologies) kua taapirihia ki te dorsomorphine (2.5 μM; P5499, Sigma-Aldrich) me te SB-431542 (10 μM; 1614). , Tocrida). Mai i nga ra 2 ki te 6, ka whakakapihia te reo Essential 6 ia ra ki te dorsomorphine me te taapiri SB-431542. Mai i te ono o nga ra, ka whakawhitia nga aukati neurosphere ki te reo neurobasal me te pupuri i nga korero i runga ake nei.
Ko nga mahinga kararehe katoa i mahia i runga i nga aratohu tiaki kararehe i whakaaetia e te Whare Wananga o Stanford University Laboratory Animal Care Administrative Committee (APLAC). I hokona nga kiore euthymic RNU (rnu/+) e hapu ana (Charles River Laboratories) ka noho ranei. Ka noho nga kararehe i runga i te 12-haora marama-pouri me te kai me te wai ad libitum. Ko nga pui kiore tahanga (FOXN1–/–) e toru ki te whitu nga ra i kitea e te tipu o nga pahau pakeke i mua i te tapahi. Ko nga papi (tane me te uha) i whakamomori ki te 2-3% isoflurane ka tuu ki runga i te anga stereotaxic. I mahia he trepanation o te angaanga me te diameter o te 2-3 mm i runga ake i te S1 i te wa e mau tonu ana te tapatahi o te dura mater. Na ka whakamahi i te ngira 30-G (tata ki te 0.3 mm) kei waho noa o te craniotomy hei wero i te dura. Kātahi ka pania te HCO ki tētahi parakiriata angiangi 3×3 cm ka tango i te taikaha reo. Ma te whakamahi i te syringe Kirikiriroa e piri ana ki te ngira 23 G, 45°, ata toia te hCO ki te pito rawa o te ngira. Na ka whakauruhia te syringe ki runga i te papu syringe e hono ana ki te taputapu stereotaxic. Katahi ka tuuhia te pito o te ngira ki runga i te kohao werohanga 0.3 mm te whanui o mua ki roto i te dura (z = 0 mm) ka whakawhäitihia te syringe 1–2 mm (z = tata ki te –1.5 mm) kia noho te ngira ki waenganui i te dura mater A. ka hanga he hiri hiri. Kātahi ka hikina te pūwero ki te pokapū o te mata cortical i z = -0.5 mm ka werohia te hCO i te tere o te 1-2 µl ia meneti. I muri i te otinga o te werohanga hCO, ka toia te ngira i te tere o te 0.2-0.5 mm ia meneti, ka werohia te kiri, ka tukuna tonu te kuri ki runga i te papa whakamahana mahana kia ora ra ano. Ko etahi o nga kararehe i whakawhitia takirua.
Ko nga mahinga kararehe katoa i mahia i runga i nga aratohu tiaki kararehe kua whakaaetia e te Whare Wananga o Stanford APLAC. Ko nga kiore (he nui ake i te 60 ra i muri i te whakawhitinga) i whakaawehia ki te 5% isoflurane anesthesia me te 1-3% isoflurane i te wa e whakaahua ana. Mo te whakakitenga, ko te 7 Tesla e kaha tiaki ana i te matawai poka wai whakapae Bruker (Bruker Corp.) me te puku rōnaki International Electric Company (IECO), he whakauru rōnaki whakamarumaru me te diameter o roto o te 120 mm (600 mT/m, 1000 T/m/s) i whakamahia ma te whakamahi i te AVANCE. III, waru-hongere maha-coil RF me te maha-matua kaha, me te taha Paravision 6.0.1 tūāpapa. I mahia te tuhi ma te whakamahi i tetahi coil RF volumetric kua tino wetekina me te diameter o roto o te 86 mm me te wha-hoere cryo-cooled RF coil mo te whiwhi anake. Axial 2D Turbo-RARE (wa tukurua = 2500 ms, wa paoro = 33 ms, 2 tauwaenga) me te 16 poro hopu, 0.6–0.8 mm te matotoru poro, kei roto 256 × 256 tauira. I whakawhiwhia nga tohu ma te whakamahi i te whaanui transceiver volumetric RF coil me te diameter o roto o te 2 cm (Rapid MR International, LLC). Ka mutu, whakamahia nga mahi whakatau tata o te mata o Imaris (BitPlane) mo te whakaputa 3D me te tātari rōrahi. Ko te whakawhitinga angitu i tautuhia ko tetahi i hangaia ai nga waahi o te tohu MRI e mau tonu ana te T2-taimaha i roto i te waahi whakawhiti. I tautuhia te whakakorenga graft hei taarua karekau i whakaputa i nga waahi o te tohu MRI tonu T2-taimaha i roto i te tuakoi kua whakatokia. Ko te subcortical t-hCO i whakakorehia mai i nga waahanga o muri mai.
Kia kaha te whakaatu i nga GCaMP6s i roto i te hCO mo te whakaahua konupūmā rua-photon, i pangia nga pūtau hiPS ki te pLV[Exp]-EF1a::GcaMP6s-WPRE-Puro whai muri i te kowhiringa o nga paturopi. I te wa poto, ka wehea nga pūtau ki te EDTA ka whakatarewahia i roto i te 1 ml o te reo Essential 8 i te kiato o te 300,000 nga pūtau i te aroaro o te polybrene (5 μg / ml) me te 15 μl o te huaketo. Kātahi ka whakakororia ngā pūtau i roto i te whakatārewatanga mō te 60 meneti ka ruia ki te 50,000 pūtau mō ia puna kiato. I muri i te whakawhitinga, ka tukuna nga ruma ki te 5-10 μg ml-1 puromycin mo nga ra 5-10 ranei tae noa ki te puta mai o nga koroni pumau. Ko te mate hCO kino i mahia pera me te korero i mua5 me etahi whakarereketanga. He poto, whakawhitihia te ra 30-45 hCO ki roto i te 1.5 ml Eppendorf microcentrifuge ngongo kei roto 100 µl o te reo nerve. Ka nekehia te 90 µl o te reo, 3-6 µl o te titer lentivirus teitei (mai i te 0.5 x 108 ki te 1.2 x 109) ka whakauruhia ki te ngongo, ka tukuna te hCO ki te incubator mo te 30 meneti. Kātahi ka tāpirihia te 90–100 µl o te reo ki ia ngongo, ka whakahokia nga ngongo ki te incubator mo te po. I te ra i muri mai, whakawhitia te hCO ki te arai nerve hou i roto i nga papa taapiri iti. I muri i nga ra e 7, ka whakawhitia te hCO ki nga papa o raro karaihe 24-poka mo te tirohanga me te arotake i te kounga o te mate. pLV[Exp]-SYN1::EYFP-WPRE me pLV[Exp]-SYN1::hChR2-EYFP-WPRE i hangaia e VectorBuilder. Ka whakamahia te Lentivirus i roto i te nuinga o nga whakamatautau na te mea kua whakauruhia ki roto i te ira o te kaihautu, ka taea te whakaatu ira kairīpoata i roto i nga raina pūtau kua pangia. Mo te rabies whai-whaiaro, ra 30-45 hCO i pangia tahi me te rabies-ΔG-eGFP me AAV-DJ-EF1a-CVS-G-WPRE-pGHpA (plasmid #67528, Addgene), ka horoia rawatia mo nga ra 3, ka whakatokia ki te kiore i roto i te S1 mo nga ra 7-14 ka tiakina i roto i te vivo.
Mo te immunocytochemistry, he mea whakamihi nga kararehe me te whakapuru ki te PBS whai muri i te 4% paraformaldehyde (PFA i te PBS; Electron Microscopy Sciences). I whakatauhia nga roro i roto i te 4% PFA mo nga haora 2, mo te po ranei i te 4 ° C, ka tiakina i roto i te 30% sucrose i roto i te PBS mo nga haora 48-72, ka whakauruhia ki roto i te 1: 1, 30% sucrose: OCT (Tissue-Tek OCT Compound 4583 , Sakura Finetek) me te coronal section 30ostat. Mo te immunohistochemistry o nga waahanga matotoru, ka whakawirihia nga kararehe ki te PBS, ka wehea te roro ka wehea i te koroni i te 300-400 µm ma te whakamahi i te vibratome (Leica) me nga waahanga i whakaritea ki te 4% PFA mo te 30 meneti. Na ka horoia nga tangihanga, nga waahanga matotoru ranei ki te PBS, ka aukatihia mo te 1 haora i te pāmahana rūma (10% te serum kaihe noa (NDS) me te 0.3% Triton X-100 kua waimeha ki te PBS) ka aukatihia ki te otinga aukati i te 4°C. – Incubation Cryosections I incubated i te po me nga wahanga matotoru i whakakororia mo te 5 ra. Ko nga paturopi tuatahi i whakamahia ko: anti-NeuN (kiore, 1:500; ab104224, abcam) anti-CTIP2 (kiore, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (rabbit, 1:1,000; Z0334, Dako), anti-GFP:1,09001, GTX 1000 (heihei) anti-HNA (kiore, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (rabbit, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (rabbit, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (rabbit, HPA0, Atlasbo1; HPA0, Atlasbo1) anti-RECA-1 (kiore, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (rabbit, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (koati, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1AFa: 106; 106, R&D Systems, Netrin G1A: 106; anti-STEM121 (kiore, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (kiore, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (rabbit, 1:400; ABN904, Millipore) me te anti-IBA1 (koati, ab500; ab57). Ko nga paturopi tuatahi i whakamahia ko: anti-NeuN (kiore, 1:500; ab104224, abcam) anti-CTIP2 (kiore, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (rabbit, 1:1,000; Z0334, Dako), anti -GFP: 1,1000 Gene, GTX 1000; anti-HNA (kiore, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (rabbit, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (rabbit, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (rabbit, HPA0, Atlasbo1; HPA0, Atlasbo1) anti-RECA-1 (kiore, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (rabbit , 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (koati, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin AF: 10,60, R&D Systems, Netrin G1a (koati, 6) anti-STEM121 (kiore , 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (kiore, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (rabbit, 1:400; ABN904, Millipore) me te anti-IBA1 :107; a107 (koati, a107). Использовались следующие первичные антитела: анти-NeuN (мышиные, 1:500; ab104224, abcam), анти-CTIP2 (крысиные, 51b:304;6; анти-GFAP (кроличьи, 1:1000; Z0334, Dako), анти- -GFP (курица, 1:1000; GTX13970, GeneTex), анти-HNA (мышь, 1:200; ab191181, ab19181, нтиклиcam), 1:500; ABN78, Millipore), анти-PDGFRA (кролик, 1:200; sc-338, Санта-Круз), анти-PPP1R17 (кролик, 1:200; HPA047819, нтимыRECA-1, 1; ab9774, abcam), анти-SCG2 (кролик , 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9 (козий, 1:500; AF3075, R&D Systems), нетрин G1a, нетрин G1a (козий, 1:500; AF3075, R&D Systems), нетрин G1a (коз10), R&D10 (коз10) анти-STEM121 (мышиный , 1:200; Y40410, Takara Bio), анти-SATB2 (мышь, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (кролик, 1:4040; анти-GAD65/67 (кролик, 1:4040; Miliore) (koza, 1 :100; he 5076, he aha). Ko nga paturopi tuatahi i whakamahia ko: anti-NeuN (kiore, 1:500; ab104224, abcam), anti-CTIP2 (kiore, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (rabbit, 1:1000; Z0334, Dako), anti-GFP1000, GTX1000; anti-HNA (kiore, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (rabbit, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA ( rabbit, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (rabbit, 1:2078; HPA, Atlasbo17), Antidies anti-RECA-1 (kiore, 1:50; ab9774, abcam), anti- SCG2 (rabbit, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (koati, 1:500; AF3075, R&D Systems), netrin G1AFa: 106; R&D Systems, netrin G1AFa: 106; STEM121 (kiore, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (kiore, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (rabbit, 1:400; ABN904, Millipore) me anti-IBA1 (koati, ab:507).使用的一抗是：抗NeuN（小鼠，1:500；ab104224，abcam）抗CTIP2（大鼠，1:3 00；ab18465，abcam），抗GFAP（兔，1:1,000；Z0334，Dako），抗-GF P（鸡，1:1,000；GTX13970，GeneTex），抗HNA（小鼠，1:200；ab1911 81，abcam），抗NeuN（兔，1:500；ABN78，Millipore），抗PDGFRA（兔， 1:200；sc-338，Santa Cruz），抗PPP1R17（兔，1:200；HPA047819，Atlas抗体），抗RECA-1（小鼠，1:50；ab9774，abcam），抗SCG2（兔） , 1:100；20357-1-AP，Proteintech），抗SOX9（山羊，1:500；AF3075，R&D Pūnaha），Netrin G1a（山羊，1:100；AF1166，R&D Pūnaha），抗STEM121（小鼠, 1:200;使用的一抗是：抗NeuN（小鼠，1:500；ab104224，abcam）抗CTIP2（大鼠，1 :300；ab18465，abcam），抗GFAP（兔，1:1,000；Z0334，Dako），抗-GFP（鸡，1:1,000；GTX13970，GeneTex），抗HNA（小鼠，1:200；ab191181，abcam），抗NeuN（兔，1:508；ABN7re 200；sc-338，Santa Cruz），抗PPP1R17（兔，1:200；HPA047819，Atlas 抗体），抗RECA-1（小鼠，1:50；ab9774，ab9774，ab9774， 100；20357-1-AP，Proteintech），抗SOX9（山羊，1:500；AF3075，R&D Pūnaha），Netrin G1a（山羊，1:100；AF1166，R&D1）;Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (kiore, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (rabbit, 1:400; ABN904, Millipore) me te anti-IBA1 (koati, 1:100; ab5076, abcam).Ko nga antibodies tuatahi i whakamahia ko: anti-NeuN (kiore, 1:500; ab104224, abcam), anti-CTIP2 (kiore, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (rabbit, 1:1000; Z0334, Dako) . , anti-GFP (heihei, 1:1000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (kiore, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (rabbit, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (rabbit, 1:2308, Santa Cruz),1308. (rabbit, 1:200; HPA047819, Atlas antibody), anti-RECA-1 (kiore, 1:50; ab9774, abcam), anti- SCG2 (rabbit), 1:100;20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9 (коза, 1:500; AF3075, R&D Systems), Нетрин G1a (коза, 1:100; AF1166, R&D Systems), анти -STEM121, анти -STEM121; анти-SATB2 (мышь, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (кролик, 1:400; ABN904, Millipore) me анти-IBA1 (коза, 1:100; аб5076, аб5076). 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (koati, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (koati, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (kiore, 1:200; Takara Bio, 500; Takara Bio, 1000; Takara Bio, 10,000; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (rabbit, 1:400; ABN904, Millipore), me te anti-IBA1 (koati, 1:100; ab5076, abkam).Ka horoia nga waahanga ki te PBS ka whakakororia ki te antibody tuarua mo te 1 haora i te pāmahana rūma (nga waahanga tio) mo te po ranei i te 4°C (nga waahanga matotoru). Alexa Fluor antibody tuarua (Life Technologies) diluted 1:1000 i roto i te otinga ārai i whakamahia. I muri i te horoinga me te PBS, ka kitea te karihi me te Hoechst 33258 (Life Technologies). Ka mutu, ka utaina nga kiriata ki runga i te karu karu me nga uhi hipoki (Fisher Scientific) ma te whakamahi i te Aquamount (Polysciences) ka tātarihia i runga i te karu hiko a Keyence (BZ-X anatatari) he karu hiko Leica TCS SP8 (Las-X) i runga i te ahua. I tukatukahia nga whakaahua ma te whakamahi i te kaupapa ImageJ (Fiji). Hei ine i te rahinga o nga neurons tangata i roto i te t-hCO me te uho kiore, 387.5 μm te whanui o nga whakaahua tapawha i tangohia i waenganui o te t-hCO, i te taha tata ranei o te taha o te uho kiore. I whakatauhia nga tawhwhwhanga ma te aromatawai i nga huringa o te maaramatanga o te kiko, te karihi HNA+, me te / ranei te aroaro o te autofluorescence kiko. I ia whakaahua, ka wehewehea te tapeke o nga pūtau NeuN+ me te HNA+ ki te tapeke o nga pūtau NeuN+ i te waahi kotahi. Hei whakarite ko nga pūtau whai karihi anake i te rererangi atahanga ka tatauhia, ko nga pūtau he Hoechst+ anake kei roto i te tatauranga. E rua nga whakaahua i wehea ma te iti rawa 1 mm i tauwaenga hei whakaiti i te hapa tauanga.
Kotahi wiki i mua i te kohinga tauira, waiho nga kararehe whakawhiti hCO (tata ki te 8 marama te rerekee) ki roto i te ruma pouri me nga pahau kua kuti hei whakaiti i te whakaihiihi tairongo. Ko te wehenga o nga karihi i mahia pera i korero i mua, me etahi whakarereketanga. I te wa poto, ko te t-hCO me te hCO i whakangaromia ma te whakamahi i te lysis pūtau hopi-miihini me te miihini miihini karaihe 2 ml (D8938, Sigma-Aldrich / KIMBLE). Ka tātarihia te karihi mawhero ma te whakamahi i te tātari 40 µm ka centrifuge i te 320 g mo te 10 meneti i te 4 °C i mua i te mahi i te rōnaki kiato sucrose. I muri i te taahiraa centrifugation (320 g mo te 20 min i te 4 ° C), i tukuna ano nga tauira i roto i te 0.04% BSA / PBS me te taapiri o nga waeine 0.2 o te µl-1 RNase inhibitor (40 u µl-1, AM2682, Ambion) ka haere i roto i te 40 µm tātari rere. Ko nga karihi wehe ka tukuna ano i roto i te PBS kei roto te 0.02% BSA ka utaina ki runga i te maramara Chromium Single Cell 3′ (e 8,000 nga pūtau mo ia ara). I whakaritea nga whare pukapuka snRNA-seq me te Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). I whakaritea nga whare pukapuka snRNA-seq me te Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). Библиотеки snRNA-seq были приготовлены с помощью Chromium Pūtau kotahi 3′ GEM, Whare Pukapuka & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). I whakaritea nga whare pukapuka snRNA-seq ma te whakamahi i te Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). snRNA-seq 文库是使用Chromium Pūtau kotahi 3′ GEM, Whare Pukapuka me te Kete Peera Kiriata v3 (10x Genomics) 制备的。 snRNA-seq 文库是使用Chromium Pūtau kotahi 3′ GEM, Whare Pukapuka me te Kete Peera Kiriata v3 (10x Genomics) 制备的。 Библиотеку snRNA-seq готовили с использованием Chromium Pūtau Takitahi 3′ GEM, Whare Pukapuka me te Kete Peera Peera v3 (10x Genomics). I whakaritea te whare pukapuka snRNA-seq ma te whakamahi i te Chromium Single Cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics).Ko nga whare pukapuka mai i nga tauira rereke i whakahiatohia, i raupapahia e Admera Health i runga i NovaSeq S4 (Illumina).
Ko nga taumata whakaputanga ira mo ia tohupae karihi putative i ine ma te whakamahi i te 10x Genomics CellRanger kete rorohiko tātari (putanga 6.1.2). Inaa, ko nga panui i rite ki te huinga o te tangata (GRCh38, Ensemble, putanga 98) me te kiore (Rnor_6.0, Ensemble, putanga 100) tohutoro tohutoro i hangaia me te whakahau mkref me te whakamahi tatau me te whakahau –include-introns=TRUE ki te ine me nga panui kua mapi ki nga rohe intron. Mo nga tauira t-hCO, i tautuhia nga karihi tangata i runga i te whakaritenga tiaki kia 95% o nga panui mahere katoa e rite ana ki te ira tangata. Ko nga tātaritanga katoa o muri mai i mahia i runga i te whakaputanga raupapa paewaehere kua tātarihia mai i te CellRanger ma te whakamahi i te kete R (putanga 4.1.2) Seurat (putanga 4.1.1)32.
Hei whakarite ko nga karihi o te kounga teitei anake ka uru ki roto i te tātaritanga o muri mai, i whakatinanahia he tukanga tātari haere mo ia tauira. Tuatahi, ko nga karihi iti-kounga me te iti iho i te 1000 nga ira ahurei ka kitea me te neke atu i te 20% o te katoa o te mitochondria ka tautuhia ka tangohia. I muri mai, ka whakatauhia te matrix tau ira mata e te regression binomial kino kua whakaritea ma te whakamahi i te mahi sctransform(vst.flavor=”v2″), i tautuhia hoki te 3000 te nuinga o nga ira taurangi ma te whakamahi i nga tawhā taunoa. Ko te tirotiro i nga waahi o nga turi ka whakamahia mo nga tauira katoa me nga tātaritanga roopu (ko te tikanga o te kaute DoubletFinder kei runga ake i te 95 o nga tauira t-hCO (n=3) me nga tauira hCO (n=3) i whakakotahi motuhake ma te whakamahi i te mahi IntegrateData me nga tawhā o runga ake nei.
Whai muri i te tangohanga o nga kakano kounga iti, ka whakarōpūhia te huingararaunga raraunga (taumira = 0.5) ka whakauruhia mo nga kaupapa tirohanga UMAP34. I whakatauhia nga ira tohu mo ia tautau ma te whakamahi i te mahi FindMarkers me nga tawhā taunoa i tatauhia mai i nga raraunga whakaputanga ira. Ka tautuhia, ka whakarōpūhia nga karaehe pūtau nui ma te whakakotahi i nga huingararaunga tohutoro cortical fetal me te pakeke me te tohu ira tohu 19,20,21,35 me te tuhipoka. Ina koa, i kitea nga kaitaunahi hurihanga e te korero a MKI67 me TOP2A. I tautuhia nga tautau tupuna na te kore o nga tuhinga mitotic, he nui te inaki ki nga tautau glial progenitor multipotent i whakaahuahia i te mutunga o te metaphase fetal cortex, me te whakaaturanga EGFR me OLIG1. Ka whakamahia e matou te kupu astrocyte ki te awhi i te maha o nga ahuatanga o te rereketanga astrocyte, mai i te mutunga o te radial glia ki te matuatanga o nga astrocytes. Ko nga tautau Astrocyte e whakaatu ana i nga taumata teitei o te SLC1A3 me te AQP4 kua whakaatuhia ki te mapi me nga momo iti o te glia radial fetal me/ranei nga astrocytes pakeke. Ko nga OPC e whakaatu ana i te PDGFRA me te SOX10 i te wa e whakaatu ana nga oligodendrocytes i nga tohu tohu myelination (MOG me MYRF). Ko nga neurons Glutamatergic i kitea e te aroaro o nga tuhinga neuronal (SYT1 me SNAP25), te kore o nga tohu GABAergic (GAD2), me te korero o NEUROD6, SLC17A7, BCL11B, SATB2 ranei. Ko nga neuron GluN i wehewehea ki runga (whakapuakanga SAB2 me te ngaro o te BCL11B) me te hohonu (whakaahua BCL11B) nga waahanga iti. Ko nga neurons putative subplate (SP) e whakaatu ana i nga tohu SP18 e mohiotia ana penei i te ST18 me te SORCS1 hei taapiri atu ki nga tohu GluN hohonu. Ko te ahua o te choroid plexus-like i kitea e te korero TTR, a ko nga pūtau meningeal-like i whakaatu i nga ira e hono ana ki te fibroblast me te mahere pial/vascular cell o te huinga raraunga tohutoro.
Ko te tātaritanga rereke o te whakaputanga ira i waenga i nga karaehe iti o te t-hCO me te hCO i mahia ma te whakamahi i te tikanga pseudo-putanga hou i hangaia i roto i nga tauira i whakatinanahia ma te whakamahi i te kohinga Libra R (putanga 1.0.0). Inaa, i mahia nga whakamatautauranga-raupapa edgeR (putanga 3.36.0, kete R) mo nga roopu ma te whakarapopoto i te maha o nga ira i roto i nga pūtau mo tetahi karaehe pūtau mo ia tauira tukurua. Mo te tirohanga mapi wera, ka tatauhia nga uara mo ia miriona (CPM) ma te whakamahi i te mahi edgeR (cpm()) me te tauine (ki te whakatutuki i te tikanga = 0, te inenga paerewa = 1). I mahia te tātaritanga whakarangatira Gene Ontology (GO) o nga ira t-hCO GluN kua tino whakatikatikahia (kua whakatikahia e Benjamin-Hochberg te uara P iti iho i te 0.05 kua whakaatuhia i roto i te 10% neke atu i te 10% o nga pūtau t-hCO GluN me te piki ake o te huringa o te neke atu i te 2 wa). i mahia ma te whakamahi i te ToppGene Suite (https://toppgene.cchmc.org/)37. Ka whakamahia e matou te taupānga ToppFun me nga tawhā taunoa me te whakaatu i nga uara P-whakatika a Benjamini-Hochberg i tatauhia mai i nga whakamatautau hypergeometric kua tohuhia e GO.
Ki te whakarite i o maatau tautau snRNA-seq me nga tautau pūtau kua tohuhia mai i nga rangahau tohutoro mo te RNA-seq-a-tautahi tuatahi, snRNA-seq19,20,21,22 ranei, i tono matou i te huarahi whakauru huingararaunga takirua. I whakamahia e matou te rerengamahi whakatikatika SCTransform (v2) i Seurat ki te whakauru me te whakatairite i nga kohinga kahui i waenga i nga huingararaunga (ma te whakamahi i nga tawhā rite ki runga ake nei). Ko nga huingararaunga o ia tangata i whakareri matapōkeretia ki te 500 nga pūtau, nga uho ranei mo ia huinga taketake mo te pai o te rorohiko. Ma te whakamahi i te huarahi rite ki te korero i mua ake nei, ko te īnaki kāhui i tautuhia ko te ōwehenga o ngā pūtau, karihi rānei o ia kāhui whakahiato i inaki ki te tapanga o te kāhui tohutoro. Hei whakarōpū ake i nga GluN, i whakamahia e matou te rerengamahi a Seurat's TransferData mo nga raraunga huinga-iti GluN hei tautapa i nga tapanga huingararaunga tohutoro ki o maatau pūtau GluN.
Ki te aromatawai i te mana o te matuatanga o te tuhinga o te ao o nga tauira t-hCO me te hCO, ka whakatauritea e matou o matou tauira pseudo-nui ki BrainSpan / psychENCODE23, kei roto he raupapa RNA nui e hora ana i te whanaketanga roro tangata. I mahia e matou te PCA i runga i te matrix whakahiato ira ira mai i nga tauira cortical 10 wiki i muri i te haputanga me muri mai, i roto i nga ira 5567 (me a matou raraunga) i tohuhia i mua he kaha i roto i nga tauira cortical BrainSpan (kua tautuhia he nui ake i te 50% i roto i te rereketanga o te whakawhanaketanga i whakamaramahia e te tau ma te whakamahi i te tauira putorino)38. I tua atu, i puta mai i a maatau nga ira e hono ana ki nga hainatanga transcriptome nui o te neurodevelopment ma te whakamahi i te tauwehenga matrix kore-kino pera i te korero o mua. Ko nga taumahatanga tauira i tatauhia ma te whakamahi i te tikanga whakangao matrix kore-kino ka tohua ki te Fig. 5b me nga raraunga kua whakawhānuihia mo ia o nga waitohu e rima i whakaahuahia e Zhu et al.38. Ano ano, i ahu mai nga tohu whakamaoritanga e whakawhirinaki ana ki nga mahi mai i nga rangahau kua whakaputaina i mua. Ina koa, ko te ERG me te LRG i tino whakatikatikahia i roto i nga neurons glutamatergic i tautuhia e te kohinga ataata cortex snRNA-seq kiore i muri i te whakaongaonga ataata mai i te Ripanga Taapiri 3 Hrvatin et al.16. Ko nga LRG i whakarangatirahia e te tangata i riro mai i nga ahurea roro fetal tangata kua whakahoahohia e KCl me te hauhake i nga haora 6 i muri i te whakaihiihi, a, ko nga ira kua tohua i tino whakatikatikahia i roto i te tangata engari kaore i roto i nga kiore (Taupiri 4). Ko te tātaritanga o te whakarangatira huinga ira ma te whakamahi i enei huinga ira i mahia ma te whakamahi i te whakamatautau kotahi a Fisher.
Whakawhanauhia nga kiore ki te isoflurane, tangohia nga roro ka tuu ki roto i te makariri (tata ki te 4°C) te wairewa sucrose (95% O2 me 5% CO2) mo nga waahanga kei roto: 234 mM sucrose, 11 mM glucose, 26 mM NaHCO3, 2.5 mM KCl, 1.25 mM. NaH2PO4, 10 mM MgSO4 me 0.5 mM CaCl2 (mo te 310 mOsm). Ko nga wahanga korokoro roro kiore (300–400 µm) kei roto t-hCO i hangaia ma te whakamahi i te Leica VT1200 vibratome pera i te korero o mua39. Katahi ka whakawhitia nga wahanga ki te rūma wahanga me te oxygenation pāmahana rūma tonu kei roto he aCSF kua whakaritea mai i: 10 mM glucose, 26 mM NaHCO3, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaHPO4, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2 me 126 mM NaCl (298 mM). i te iti rawa 45 meneti i mua i te tuhi. I tuhia nga waahanga ki roto i te ruma rumaki i whakapuruhia tonutia ki te aCSF (95% O2 me te 5% CO2 vial). Ko nga raraunga katoa i tuhia ki te pāmahana rūma. I whakamutua nga neurons t-hCO ki te pipette karaihe borosilicate kua whakakiia ki te otinga kei roto 127 mM pāhare pāporo gluconate, 8 mM NaCl, 4 mM konupora ATP, 0.3 mM konutai GTP, 10 mM HEPES, me te 0.6 mM EGTA, pH 7.2, te otinga o roto kua whakaritea ki te KOH (m290). Hei whakaora ake, ka taapirihia te biocytin (0.2%) ki te otinga rekoata.
I riro mai nga raraunga ma te whakamahi i te MultiClamp 700B amplifier (Molecular Devices) me te Digidata 1550B digitizer (Molecular Devices), iti-pass tātarihia ki te 2 kHz, whakamamatitia ki te 20 kHz, ka tātarihia ma te Clampfit (Molecular Devices), Origin (OriginPro). 2021b, OriginLab). me nga mahinga MATLAB ritenga (Mathworks). I tatauhia te kaha o te honohono ma te whakamahi i te JPCalc me nga whakaurunga i whakatikahia ki te uara tatau o -14 mV. Ko te Mahi IV he raupapa o nga hikoinga o naianei i roto i nga waahanga 10-25 pA, mai i te -250 ki te 750 pA.
Ko te thalamus, te mea ma, me te S1 afferents i whakaihiihihia i te hiko i roto i nga poro thalamocortical i te wa e tuhia ana te papaki-piri o nga neuron hCO, pera i te korero i mua. I te wa poto, ka tukuna te roro ki runga i te teepu taarua 3D kua titaha ki te koki 10°, ka tapahia te mua o te roro ki te koki 35°. Ka whakapirihia te roro ki te mata kua tapahia, ka wehea, ka tiakina nga toki e puta ana te thalamocortical. Bipolar tungsten electrodes (0.5 MΩ) i utaina ki runga i te micromanipulator tuarua me te whakatakoto rautaki ki te whakaihiihi i nga rohe e wha mo ia pūtau (kapipu roto, mea ma, S1 me hCO). Tuhia nga urupare synaptic i muri i te 300 µA whakaihiihi phasic i te 0.03-0.1 Hz.
Ko nga neuron hCO e whakaatu ana i te hChR2 i whakahohehia i te 480 nm me nga pupuhi marama i hangaia e te LED (Prizmatix) i whakamahia i roto i te kaupapa × 40 (0.9 NA; Olympus) ki te tuhi i te korero hChR2 tata ki nga ruma. Ko te diameter o te mara whakamarama he 0.5 mm me te mana katoa he 10-20 mW. I tautuhia te whanui o te pupuhi ki te 10 ms, e rite ana ki te pupuhi i hoatu i te wa o te whakamatautau ako whanonga. He maha nga rerenga whakaihiihi i whakamahia, mai i te 1 ki te 20 Hz, engari ko te pupuhi tuatahi o te raupapa i whakamahia mo te ine. Ko nga waahi i waenga i nga tereina he roa ake i te 30 s ki te whakaiti i te paanga ki nga arai aukati synaptic, ara whakaahuru ranei. Hei whakamatautau mehemea he monosynaptic te whakautu hChR2, ka whakamahia e matou te TTX (1 μM) ki te pati tae noa ki te ngaro o te tauhohenga EPSC, ka tonohia te 4-aminopyridine (4-AP; 100 μM). Ko te tikanga, ka whakahokia mai he whakautu i roto i nga meneti torutoru, me te whakaroa paku i waenga i te pupuhi LED me te whakatipuranga EPSC. I whakamahia te NBQX (10 μM) ki te whakamatautau mehemea kei te akiakihia te urupare e nga kaiwhiwhi AMPA.
I hangaia nga waahanga hCO koi pera i te korero o mua. I te wa poto, i whakauruhia nga waahanga hCO ki roto i te 4% agarose ka whakawhitia ki nga ruma kei roto 126 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 26 mM NaHCO3 me te 10 mM d-(+) -0gluco i tapahia ki te Wāhanga 2-(+) -0gluco. µm i te pāmahana rūma mā te whakamahi i te wiriwiri Leica VT1200 ka penapena ki ASF i te pāmahana rūma. I muri iho, i mahia te tuhi papaki-puni o nga pūtau katoa i runga i nga waahanga hCO i raro i te miihini SliceScope tika (Scientifica). I whakawirihia nga waahanga ki te aCSF (95% O2 me te 5% CO2) ka tuhia nga tohu o te pūtau i te pāmahana rūma. I whakamahia nga neuron hCO ma te whakamahi i te pipette karaihe borosilicate kua whakakiia ki te otinga kei roto 127 mM pāhare pāporo gluconate, 8 mM NaCl, 4 mM konupora ATP, 0.3 mM konutai GTP, 10 mM HEPES, me te 0.6 mM EGTA, roto pH 7, 2, whakaritea ki te KOH290 (osmolarity). Mo nga kaupapa whakaora, taapirihia te 0.2% Biocytin ki te otinga o roto.
I riro mai nga raraunga e Clampex (Clampex 11.1, Molecular Devices) ma te whakamahi i te MultiClamp 700B amplifier (Molecular Devices) me te Digidata 1550B digitizer (Molecular Devices), iti-pass i tātarihia i te 2 kHz, i whakamamatitia i te 20 kHz, ka tātarihia ma te whakamahi i nga taputapu Clampfit (putanga 10) mo te tātaritanga MAT6. (MATLAB 2019b, Mathworks). I tatauhia te kaha o te honohono ma te whakamahi i te JPCalc me nga whakaurunga i whakatikahia ki te kaha o te honohono o te -14 mV. Ko te Mahi IV he raupapa o nga hikoinga o naianei i roto i nga hikoinga 5-10 pA mai i te -50 ki te 250 pA.
Mo te hanga hou o nga neurons kua kowhakina mai, ko te 0.2% biocytin (Sigma-Aldrich) i taapiri atu ki te otinga o roto. Ko nga pūtau kei te whakamaarama mo te iti rawa 15 meneti i muri i te hacking. Ka kumea ata te pipette mo te 1-2 meneti kia hiritia ra ano te kiripi kua rehitatia. I muri i te tukanga o te tinana o te waahanga, ka whakatikahia nga waahanga mo te po i te 4 ° C. i roto i te 4% PFA, ka horoia ki te PBS X3, ka whakahekehia te 1: 1000 me te streptavidin-conjugated DyLight 549 ranei DyLight 405 (Vector Labs). Ko nga pūtau kua whakakiia ki te biocytin (2%; Sigma-Aldrich) i tapaina i te wa e hopukina ana te rawhi papaki i te pāmahana rūma mo te 2 haora. Ka whakairihia nga waahanga ki runga i nga kiriata moroiti ma te whakamahi i te Aquamount (Thermo Scientific) ka whakaatahia i te ra i muri mai i runga i te karu hiko Leica TCS SP8 ma te whakamahi i te kaupapa rumaki hinu me te kohao tau × 40 1.3, te whakanui × 0.9–1.0, xy. Ko te reeti tauira he 7 pika mo ia micron. Ko nga Z-stacks i te 1 µm i whiwhi raupapa, a ka mahia nga mosaics z-stack me te tuitui-aunoa-a-Leica ki te kapi i te rakau dendritic katoa o ia neuron. Ko nga neurons ka whaia-a-ringa ma te whakamahi i te atanga neuTube 40 ka hangaia nga konae SWC. Ka tukuna nga konae ki te mono SimpleNeuriteTracer41 Fiti (ImageJ, putanga 2.1.0; NIH).
I whiwhihia te kiko uwha tangata i runga i te whakaaetanga i runga i te kawa i whakaaetia e te Poari Arotake Whakahaere o te Whare Wananga o Stanford. E rua nga tauira o te kikokiko i muri i te whanautanga o te tangata (3 me te 18 tau) i riro mai i te tangohanga o te uho o mua (te gyrus mua o waenganui) hei waahanga o te pokanga mo te mate mate rewharewha. I muri i te tangohanga, kohia te kiko i roto i te NMDG-aCSF huka-makariri kei roto: 92 mM NMDG, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 30 mM NaHCO3, 20 mM HEPES, 25 mM glucose, 2 mM thiourea as, 5 mM thiourea, konutai mM. 0.5 mM CaCl2 4H2O me 10 mM MgSO4 7H2O. Whakawetohia ki te pH 7.3-7.4 ki te waikawa pūmāota pūmāota. I tukuna nga kopa ki te taiwhanga i roto i te 30 meneti, ka tangohia nga wahanga coronal i runga i nga tikanga i whakaahuahia i runga ake nei.
Ko nga mahinga kararehe katoa i mahia i runga i nga aratohu tiaki kararehe kua whakaaetia e te Whare Wananga o Stanford APLAC. Ko nga kiore (he nui ake i te 140 ra i muri i te whakawhitinga) i whakaawehia ki te 5% isoflurane anesthesia me te whakanekeneke ki te 1-3% isoflurane i roto i te mahi. I whakanohohia nga kararehe ki roto i te anga stereotaxic (Kopf) ka tukuna te buprenorphine (SR) tohe tonu ki raro i te kiri. Ka kitea te angaanga, ka horoia, ka kuhuhia te 3-5 ngongo wheua. Ki te aro ki te t-hCO, i hangaia e matou nga taatai ​​stereotaxic mai i nga whakaahua MRI. I keria he kohao burr ki te waahi o te paanga me nga muka (400 µm te diameter, NA 0.48, Doric) ka whakahekehia 100 µm i raro i te mata hCO, ka mau ki te angaanga ki te raima niho ka taea te rongoa UV (Relyx).
I mahia nga rekoata whakaahua whakaahua i mua42. Hei tuhi i nga mahi ohorere, ka tuuhia nga kiore ki roto i te whare herehere ma, me te 400 µm te diameter o te taura papaki muka (Doric) i honoa ki te punaha tango raraunga whakaahua whakaahua muka i honoa ki te taura muka i whakatohia. I roto i te 10-meneti te rekoata mo nga mahi motika, i waatea nga kararehe ki te tirotiro i te whare herehere. Hei tuhi i te mahi i whakaohohia, ka tukuna nga kiore (neke atu i te 140 ra i muri i te whakawhitinga) ki te 5% isoflurane mo te whakauru me te 1-3% isoflurane mo te tiaki. Whakanohoia te kararehe ki roto i te anga stereotactic (Kopf) ka kuti nga pahau i tera taha o te t-hCO ki te 2 cm pea ka haere ma te mata e hono ana ki te piezoelectric actuator (PI). He 400 µm te taura papaki muka (Doric) i honoa ki te muka i whakatohia, ka hono ki te punaha tango raraunga. Ko nga pahau i tera taha o te t-hCO ka 50 nga wa ka paopao (2 mm i te 20 Hz, 2 s mo ia whakaaturanga) i nga wa ohorere e te puku piezoelectric i roto i te 20 meneti te wa tuhi. Whakamahia te Arduino MATLAB Tautoko Mōkī ki te whakahaere i te wa whakahuri me te waehere MATLAB ritenga. Ka tukutahia nga kaupapa ki te rorohiko hopu raraunga ma te whakamahi i nga putere arorau transistor-transistor (TTL).
Ko nga kiore (he nui ake i te 140 ra i muri i te whakawhitinga) i whakaawehia ki te 5% isoflurane anesthesia me te whakanekeneke ki te 1-3% isoflurane i roto i te mahi. I whakanohoia nga kararehe ki roto i te anga stereotaxic (Kopf) ka werohia te buprenorphine SR me te dexamethasone i raro i te kiri. Ka kitea te angaanga, ka horoia, ka kuhuhia te 3-5 ngongo wheua. Ki te aro ki te t-hCO, i hangaia e matou nga taatai ​​stereotaxic mai i nga whakaahua MRI. I mahia he craniotomy porohita (tata ki te 1 cm te whanui) me te wiri tere tere tika ki runga ake i te hCO kua whakatokia. Kia angiangi rawa te koiwi, engari i mua i te keri i te katoa o te kōiwi, whakamahia te mapi hei tango i te toenga o te kopae pelvic kia kitea te t-hCO o raro. I whakakīia te craniotomy ki te tote parakore, ka mauhia he uhi uhi me tetahi pine mahunga motuhake ki te angaanga ki te raima niho kua rongoatia e te UV (Relyx).
I mahia te whakaahua whakaahua-rua ma te whakamahi i te miihini Bruker multiphoton microscope me te kaupapa Nikon LWD (×16, 0.8 NA). I mahia te whakaahua GCaMP6 i te 920 nm me te 1.4x kotahi te whakanui z-rererangi me te 8x toharite o 7.5 fps. I whakawaia nga kiore ki te 5% isoflurane anesthesia me te pupuri ki te 1-3% isoflurane. Ka whakanohohia nga kiore ki roto i te mahunga i hangaia, ka tuu ki raro i te mata. He rekoata papamuri 3-meneti mo te mahi motuka i whiwhi. I roto i te 20 meneti o te rekoata, 50 puffs (100 ms te roa o ia whakaaturanga) i tukuna matapōkeretia ki te papa whiore i te taha o t-hCO ma te whakamahi i te picospricer. Whakamahia te Arduino MATLAB Support Package ki te whakahaere i te wa pakaru me te waehere MATLAB ritenga. Tukutahihia nga huihuinga me te rorohiko hopu raraunga (PrairieView 5.5) ma te whakamahi i nga putere TTL. Mo te tātari, i whakatikahia nga whakaahua mo te nekehanga xy ma te whakamahi i te whakatikatika affine i roto i te kaupapa MoCo i whakarewahia ki Whīti. Ko te tangohanga o nga tohu rewharewha mai i nga pūtau takitahi ma te whakamahi i te CNMF-E43. I tangohia te korikori mo ia rohe e pa ana, ka huri ki nga pihi dF/F, ka huri ki nga tohu-z.
Ko nga kiore (he nui ake i te 140 ra i muri i te whakawhitinga) i whakaawehia ki te 5% isoflurane anesthesia me te whakanekeneke ki te 1-3% isoflurane i roto i te mahi. I whakanohoia nga kararehe ki roto i te anga stereotaxic (Kopf) ka werohia te buprenorphine SR me te dexamethasone i raro i te kiri. I tapahia nga pahahau i tera taha o te t-hCO ki te 2 henimita pea, ka mirohia ki te mata e hono ana ki te piezoelectric actuator. Ka kitea te angaanga ka horoia. He kowiri tira ka mau ki te angaanga. Ki te aro ki te t-hCO, i hangaia e matou nga taatai ​​stereotaxic mai i nga whakaahua MRI. Mahi i te craniotomy porohita (tata ki te 1 cm te whanui) me te wiri tere teitei i runga ake i te t-hCO. Kia angiangi rawa te koiwi, engari i mua i te keri i te katoa o te kōiwi, whakamahia te mapi hei tango i te toenga o te kopae pelvic kia kitea te t-hCO o raro. Ko nga pūtau takitahi i tuhia ma te whakamahi i te 32-channel, 64-channel high-density silicon probes (Cambridge Neurotech) kua oti te whakamau ki te whenua me te whakakaha i mua ki te RHD amplifiers (Intan). Whakamahia te manipulator ki te whakaheke i nga hiko ki te waahi kua tohua ma roto i te craniotomy, ka whakakiia ki te tote parakore. I mahia te kohinga raraunga i te auau o te 30 kHz ma te whakamahi i te punaha tango raraunga Open Ephys. I haere tonu te rekoata i te wa i kitea e matou nga mahi mahorahora e tino tika ana i roto i nga hongere 10, e kii ana kei te waahi nga hiko i roto i te graf (i runga i nga raraunga whakaahua konupūmā rua-photon). He 10-meneti te rekoata papamuri o nga mahi motuka i whiwhi. Ko nga pahau i tera taha o te t-hCO ka 50 nga wa ka paopao (2 mm i te 20 Hz, 2 s mo ia whakaaturanga) i nga wa ohorere e te puku piezoelectric i roto i te 20 meneti te wa tuhi. Ma te whakamahi i te kete Tautoko MATLAB mo Arduino (MATLAB 2019b), te whakahaere i te waa whakaheke me te waehere MATLAB ritenga. Whakamahia nga pupuhi TTL ki te tukutahi i nga huihuinga me te rorohiko hopu raraunga.
Mo nga whakamatautau tohu mata, he taura papaki whatu 200 µm (Doric) i honoa ki te taiaho 473 nm (Omicron) i honoa ki te muka whatu 200 µm i tuu ki runga i te craniotomy. I mua tonu i tenei, whakatikahia te mana peke ki te 20 mW. Whakamahia te manipulator ki te whakaheke i nga hiko ki te waahi kua tohua ma roto i te craniotomy, ka whakakiia ki te tote parakore. I te timatanga o te rekoata, tekau nga pupuhi o te marama 473 nm (auau 2 Hz, te roa o te pupuhi 10 ms) i tukuna. Ko nga pūtau Photosensitive i tautuhia hei pūtau e whakaatu ana i te urupare koikoi i roto i te 10 ms o te marama i roto i te 70% neke atu ranei o nga whakamatautau.