Ви благодариме што ја посетивте Nature.com. Верзијата на прелистувачот што ја користите има ограничена поддршка за CSS. За најдобро искуство, препорачуваме да користите ажуриран прелистувач (или да го исклучите режимот на компатибилност во Internet Explorer). Во меѓувреме, за да обезбедиме континуирана поддршка, ќе ја прикажеме страницата без стилови и JavaScript.
Морфогенезата на човечките црева воспоставува карактеристики на крипт-ресички на 3D епителна микроархитектура и просторна организација. Оваа единствена структура е потребна за одржување на хомеостазата на цревата со заштита на нишата на матичните клетки во базалната крипта од егзогени микробни антигени и нивните метаболити. Покрај тоа, цревните ресички и секретирачкиот мукус претставуваат функционално диференцирани епителни клетки со заштитна бариера на површината на цревната мукоза. Затоа, повторното создавање на 3D епителни структури е клучно за изградба на in vitro модели на цревата. Имено, органскиот миметички црево на чип може да предизвика спонтана 3D морфогенеза на цревниот епител со подобрени физиолошки функции и биомеханика. Тука, ние обезбедуваме репродуктивен протокол за робусно индуцирање на цревна морфогенеза во цревата на микрофлуиден чип, како и во хибриден чип вграден во Transwell. Ние опишуваме детални методи за производство на уреди, култивирање на Caco-2 или цревни органоидни епителни клетки во конвенционални услови, како и на микрофлуидна платформа, индукција на 3D морфогенеза и карактеризација на воспоставени 3D епител со користење на повеќекратни модалитети на снимање. Овој протокол постигнува регенерација на функционалната цревна микроархитектура со контролирање на протокот на базолатерална течност во тек на 5 дена. Нашиот метод на морфогенеза in vitro користи физиолошки релевантен стрес на смолкнување и механичко движење и не бара комплексно клеточно инженерство или манипулација, што може да ги надмине другите постоечки техники. Замислуваме дека нашиот предложен протокол би можел да има широки импликации за биомедицинската истражувачка заедница, обезбедувајќи метод за регенерација на 3D цревни епителни слоеви in vitro за биомедицински, клинички и фармацевтски апликации.
Експериментите покажуваат дека клетките на цревниот епител Caco-2 култивирани во уреди „gut-on-a-chip“1,2,3,4,5 или двослојни микрофлуидни уреди6,7 можат да претрпат спонтана 3D морфогенеза in vitro без јасно разбирање на основниот механизам. Во нашата неодамнешна студија, откривме дека отстранувањето на базолатерално секретираните антагонисти на морфогенот од уредите за култура е неопходно и доволно за да се индуцира 3D епителна морфогенеза in vitro, што е демонстрирано со Caco-2 и цревни органоиди добиени од пациенти. Епителните клетки беа валидирани. Во оваа студија, ние конкретно се фокусиравме на производството на клетки и распределбата на концентрацијата на моќен Wnt антагонист, Dickkopf-1 (DKK-1), во чип-црева и модифицирани микрофлуидни уреди што содржат Transwell инсерти, наречени „хибриден чип“. Ние покажуваме дека додавањето на егзогени Wnt антагонисти (како што се DKK-1, Wnt репресор 1, секретиран протеин 1 поврзан со фризли или Soggy-1) во чип-цревата ја инхибира морфогенезата или го нарушува претходно структурираниот 3D епителен слој, што укажува дека антагонистичкиот стрес за време на културата е одговорен за цревната морфогенеза in vitro. Затоа, практичен пристап за постигнување робусна морфогенеза на епителниот интерфејс е да се отстранат или минимално да се одржат нивоата на Wnt антагонисти во базолатералниот оддел со активно испирање (на пр., во платформи „црева на чип“ или „хибридни на чип“) или дифузија. Базолатерални медиуми (на пр., од Transwell инсерти во големи базолатерални резервоари во бунари).
Во овој протокол, ние нудиме детален метод за производство на микроуреди „чип на црево“ и хибридни чипови што можат да се вметнат во „Трансвел“ (чекори 1-5) за култивирање на цревни епителни клетки на порозни мембрани базирани на полидиметилсилоксан (PDMS) (чекори 6А, 7А, 8, 9) или полиестерски мембрани од „Трансвел“ вметнати елементи (чекори 6Б, 7Б, 8, 9) и индуцирана 3Д морфогенеза in vitro (чекор 10). Исто така, идентификувавме клеточни и молекуларни карактеристики што укажуваат на ткивно-специфична хистогенеза и клеточна диференцијација зависна од лозата со примена на повеќекратни модалитети на снимање (чекори 11-24). Индуцираме морфогенеза користејќи човечки цревни епителни клетки, како што се Caco-2 или цревни органоиди, во два формати на култура со технички детали, вклучувајќи модификација на површината на порозните мембрани, создавање на 2Д монослоеви и цревна биохемиска и репродукција на биомеханичката микросредина in vitro. За да индуцираме 3Д морфогенеза од 2Д епителни монослоеви, отстранивме антагонисти на морфоген во обете култивирани форми со внесување на медиумот во базолатералниот дел од културата. Конечно, даваме претстава за корисноста на регенеративен 3D епителен слој што може да се користи за моделирање на раст на епителот зависен од морфоген, лонгитудинални кокултури на микробиомот домаќин, инфекција на патогени, воспалително оштетување, дисфункција на епителната бариера и терапии базирани на пробиотици. Примери за влијанија.
Нашиот протокол може да биде корисен за широк спектар на научници во основно (на пр., биологија на цревна мукоза, биологија на матични клетки и развојна биологија) и применето истражување (на пр., претклиничко тестирање на лекови, моделирање на болести, ткивно инженерство и гастроентерологија) со широко влијание. Поради репродуктивноста и робусноста на нашиот протокол за индуцирање на 3D морфогенеза на цревниот епител in vitro, предвидуваме дека нашата техничка стратегија може да се дистрибуира до публиката што ја проучува динамиката на клеточната сигнализација за време на цревниот развој, регенерација или хомеостаза. Покрај тоа, нашиот протокол е корисен за испитување на инфекција под различни заразни агенси како што се Норовирус 8, Тежок акутен респираторен синдром Коронавирус 2 (SARS-CoV-2), Clostridium difficile, Salmonella Typhimurium 9 или Vibrio cholerae. Разбирањето на патологијата и патогенезата на болестите е исто така корисно. Употребата на систем за цревна микрофизиологија на чип може да овозможи лонгитудинална кокултура 10 и последователна проценка на одбраната на домаќинот, имунолошките одговори и поправката на повредите поврзани со патогенот во гастроинтестиналниот (ГИ) тракт 11. Други гастроинтестинални нарушувања поврзани со синдром на протекување на цревата, целијачна болест, Кронова болест, улцерозен колитис, пухитис или синдром на иритабилно црево може да се симулираат кога се подготвуваат 3D цревни епителни слоеви со користење на 3D цревни епителни слоеви на пациентот, овие болести вклучуваат атрофија на вилозните реси, скратување на криптите, оштетување на мукозата или оштетена епителна бариера. Биопсија или цревни органоиди добиени од матични клетки 12,13. За подобро моделирање на поголемата сложеност на околината на болеста, читателите може да размислат за додавање на типови на клетки релевантни за болеста, како што се мононуклеарни клетки од периферната крв (PBMCs) на пациентот, на модели што содржат 3D микроархитектури на цревни вилус-крипта. ткивно-специфични имунолошки клетки, 5.
Бидејќи 3D епителната микроструктура може да се фиксира и визуелизира без процесот на сечење, гледачите кои работат на просторна транскриптомика и снимање со висока резолуција или суперрезолуција може да бидат заинтересирани за нашето мапирање на просторно-временската динамика на гените и протеините на епителните ниши. Заинтересирани за технологија. Одговор на микробни или имунолошки стимули. Понатаму, лонгитудиналната вкрстена комуникација домаќин-микробиом 10, 14 што ја координира цревната хомеостаза може да се воспостави во 3D слојот на цревната мукоза со кокултивирање на различни микробни видови, микробни заедници или фекална микробиота, особено во цревата на чип. во платформата. Овој пристап е особено привлечен за публиката што ја изучува мукозната имунологија, гастроентерологијата, човечкиот микробиом, културомијата и клиничката микробиологија што сака да култивира претходно некултивирана цревна микробиота во лабораторија. Ако нашиот протокол за морфогенеза in vitro може да се прилагоди на скалабилни формати на култури, како што се повеќебуларни инсерти во плочи од 24, 96 или 384 бунари што континуирано ги надополнуваат базолатералните оддели, протоколот може да се дистрибуира и до оние што развиваат фармацевтски, биомедицински или платформи за скрининг или валидација со висок проток за прехранбената индустрија. Како доказ за принципот, неодамна ја демонстриравме изводливоста на мултиплекс систем за морфогенеза со висок проток што може да се скалабилизира во формат на плоча од 24 бунари. Покрај тоа, комерцијализирани се повеќе производи од орган на чип16,17,18. Затоа, валидацијата на нашиот метод на морфогенеза in vitro може да се забрза и потенцијално да се усвои од многу истражувачки лаборатории, индустрија или владини и регулаторни агенции за да се разбере клеточното репрограмирање на морфогенезата на цревата in vitro на транскриптомско ниво за тестирање лекови или биотерапевтски средства Апсорпцијата и транспортот на лекови-кандидати беше оценета со користење на 3D цревни сурогати или со користење на прилагодени или комерцијални модели „орган на чип“ за да се процени репродуктивноста на процесот на цревна морфогенеза.
Ограничен број експериментални модели релевантни за луѓето се користени за проучување на морфогенезата на цревниот епител, главно поради недостаток на применливи протоколи за индуцирање на 3D морфогенеза in vitro. Всушност, голем дел од сегашното знаење за морфогенезата на цревата се базира на студии врз животни (на пр., зебра риба20, глувци21 или кокошки22). Сепак, тие се трудоинтензивни и трошочни, можат да бидат етички сомнителни и, што е најважно, не ги одредуваат прецизно процесите на човечки развој. Овие модели се исто така многу ограничени во нивната способност да се тестираат на повеќекратно скалабилен начин. Затоа, нашиот протокол за регенерирање на 3D структури на ткиво in vitro ги надминува in vivo животинските модели, како и другите традиционални статични 2D модели на клеточни култури. Како што беше претходно опишано, користењето на 3D епителни структури ни овозможи да ја испитаме просторната локализација на диференцираните клетки во оската крипт-ресички како одговор на различни мукозни или имунолошки стимули. 3D епителните слоеви можат да обезбедат простор за проучување како микробните клетки се натпреваруваат за формирање просторни ниши и еколошка еволуција како одговор на факторите на домаќинот (на пр., внатрешни наспроти надворешни Мукусни слоеви, секреција на IgA и антимикробни пептиди). Понатаму, 3D епителната морфологија може да ни овозможи да разбереме како цревната микробиота ги структурира своите заедници и синергистички произведува микробни метаболити (на пр., масни киселини со краток синџир) кои ја обликуваат клеточната организација и нишите на матичните клетки во базалните крипти. Овие карактеристики можат да се демонстрираат само кога 3D епителните слоеви се воспоставени in vitro.
Покрај нашиот метод за создавање 3D цревни епителни структури, постојат неколку in vitro методи. Цревната органоидна култура е најсовремена техника на инженерство на ткива базирана на одгледување на цревни матични клетки под специфични морфогенски услови23,24,25. Сепак, употребата на 3D органоидни модели за анализа на транспорт или кокултури домаќин-микробиом често е предизвикувачка бидејќи цревниот лумен е затворен во органоидот и, затоа, воведувањето на луминални компоненти како што се микробни клетки или егзогени антигени е ограничено. Пристапот до органоидни лумени може да се подобри со помош на микроинјектор,26,27, но овој метод е инвазивен и трудоинтензивен и бара специјализирано знаење за да се изврши. Понатаму, традиционалните органоидни култури одржувани во хидрогелови скелиња под статички услови не ја одразуваат точно активната in vivo биомеханика.
Други пристапи што ги користат неколку истражувачки групи користат претходно структурирани 3D хидрогелови скелиња за да ја имитираат структурата на цревниот епител со култивирање на изолирани човечки цревни клетки на површината на гелот. Изработете хидрогелови скелиња со користење на 3D печатени, микро-мелени или литографски изработени калапи. Овој метод го покажува самоорганизираното уредување на изолирани епителни клетки in vitro со физиолошки релевантни морфогенски градиенти, воспоставувајќи епителна структура со висок сооднос на ширина и должина и строма-епителен преслушок со вклучување на стромални клетки во скелето. Сепак, природата на претходно структурираните скелиња може да го спречи прикажувањето на самиот спонтан морфогенетски процес. Овие модели, исто така, не обезбедуваат динамичен луминален или интерстицијален проток, без стрес на смолкнување на течноста што им е потребен на цревните клетки за да се подложат на морфогенеза и да добијат физиолошка функција. Друга неодамнешна студија користела хидрогелови скелиња во микрофлуидна платформа и обликувала цревни епителни структури со користење на техники на ласерско гравирање. Глувчешки цревни органоиди следат гравирани модели за да формираат цревни тубуларни структури, а интралуминалниот проток на течност може да се рекапитулира со користење на микрофлуидички модул. Сепак, овој модел ниту покажува спонтани морфогенетски процеси, ниту вклучува цревни механобиолошки движења. Техниките за 3D печатење од истата група беа во можност да создадат минијатурни цревни цевки со спонтани морфогенетски процеси. И покрај сложеното производство на различни цревни сегменти во рамките на цевката, на овој модел му недостасува и проток на луминална течност и механичка деформација. Дополнително, оперативноста на моделот може да биде ограничена, особено откако ќе заврши процесот на биопечатење, нарушувајќи ги експерименталните услови или интеракциите клетка-до-клетка. Наместо тоа, нашиот предложен протокол обезбедува спонтана цревна морфогенеза, физиолошки релевантен стрес на смолкнување, биомеханика што ја имитира подвижноста на цревата, достапност на независни апикални и базолатерални прегради и повторно создавање на сложени биолошки микросредини на модуларност. Затоа, нашиот протокол за 3D морфогенеза in vitro може да обезбеди комплементарен пристап за надминување на предизвиците на постојните методи.
Нашиот протокол е целосно фокусиран на 3D епителна морфогенеза, само со епителни клетки во култура и без други видови околни клетки како што се мезенхимални клетки, ендотелни клетки и имуни клетки. Како што беше претходно опишано, јадрото на нашиот протокол е индукција на епителна морфогенеза со отстранување на инхибиторите на морфогенот секретирани на базолатералната страна од воведениот медиум. Додека робусната модуларност на нашиот цревен чип и хибриден чип ни овозможува да го рекреираме брановидниот 3D епителен слој, дополнителни биолошки сложености како што се епително-мезенхималните интеракции33,34, таложење на екстрацелуларна матрица (ECM)35 и, во нашиот модел, карактеристиките на крипт-ресички кои пренесуваат ниши на матични клетки во базалните крипти остануваат дополнително да се разгледаат. Стромалните клетки (на пр., фибробласти) во мезенхимот играат клучна улога во производството на ECM протеини и регулирањето на цревната морфогенеза in vivo35,37,38. Додавањето на мезенхимални клетките на нашиот модел го подобрија морфогенетскиот процес и ефикасноста на прицврстување на клетките. Ендотелниот слој (т.е. капиларите или лимфните садови) игра важна улога во регулирањето на молекуларниот транспорт39 и регрутирањето на имунолошките клетки40 во цревната микросредина. Понатаму, компонентите на васкулатурата што можат да се поврзат помеѓу ткивните модели се предуслов кога ткивните модели се дизајнирани да демонстрираат интеракции меѓу повеќе органи. Затоа, ендотелните клетки можеби ќе треба да се вклучат за да се моделираат поточни физиолошки карактеристики со резолуција на ниво на орган. Имунолошките клетки добиени од пациентот се исто така неопходни за прикажување на вродени имунолошки одговори, презентација на антигени, вродена адаптивна имунолошка преслушување и имунитет специфичен за ткивото во контекст на имитирање на цревни заболувања.
Употребата на хибридни чипови е поедноставна од методот „црева на чип“ бидејќи поставувањето на уредот е поедноставно, а употребата на Transwell влошки овозможува скалабилна култура на цревниот епител. Сепак, комерцијално достапните Transwell влошки со полиестерски мембрани не се еластични и не можат да симулираат движења слични на перисталтика. Понатаму, апикалниот дел од Transwell влошката поставена во хибридниот чип остана стационарен без стрес на смолкнување на апикалната страна. Јасно е дека статичките својства во апикалниот дел ретко овозможуваат долгорочна бактериска кокултура во хибридни чипови. Иако можеме робусно да индуцираме 3D морфогенеза во Transwell влошки кога користиме хибридни чипови, недостатокот на физиолошки релевантна биомеханика и проток на апикална течност може да ја ограничи изводливоста на платформите за хибридни чипови за потенцијални апликации.
Реконструкциите во целосен обем на оската човечки крипт-ресички во културите „црева на чип“ и „хибридни ресички“ не се целосно утврдени. Бидејќи морфогенезата започнува од епителен монослој, 3D микроархитектурите не мора нужно да обезбедат морфолошка сличност со криптите in vivo. Иако ја карактеризиравме популацијата на клетки што се размножуваат во близина на базалниот криптен домен во микроинженерскиот 3D епител, регионите на криптите и ресичките не беа јасно ограничени. Иако повисоките горни канали на чипот водат до зголемена висина на микроинженерскиот епител, максималната висина е сè уште ограничена на ~300-400 µm. Вистинската длабочина на човечките цревни крипти во тенкото и дебелото црево е ~135 µm и ~400 µm, соодветно, а висината на тенкоцревните ресички е ~600 µm41.
Од гледна точка на снимање, in situ снимањето со суперрезолуција на 3D микроархитектури може да биде ограничено на цревата на чипот, бидејќи потребното работно растојание од објективот до епителниот слој е од редот на неколку милиметри. За да се надмине овој проблем, може да биде потребен далечен објектив. Понатаму, правењето тенки делови за подготовка на примероци за снимање е предизвик поради високата еластичност на PDMS. Понатаму, бидејќи микрофабрикувањето слој по слој на цревата на чипот вклучува трајна адхезија помеѓу секој слој, исклучително е предизвик да се отвори или отстрани горниот слој за да се испита површинската структура на епителниот слој. На пример, со користење на скенирачки електронски микроскоп (SEM).
Хидрофобноста на PDMS е ограничувачки фактор во студиите базирани на микрофлуиди кои се занимаваат со хидрофобни мали молекули, бидејќи PDMS може неспецифично да адсорбира такви хидрофобни молекули. Алтернативи на PDMS може да се разгледаат со други полимерни материјали. Алтернативно, може да се разгледа површинска модификација на PDMS (на пр., премачкување со липофилни материјали 42 или поли(етилен гликол) 43) за да се минимизира адсорпцијата на хидрофобни молекули.
Конечно, нашиот метод не е добро окарактеризиран во однос на обезбедување скрининг со висок проток или експериментална платформа „една големина за сите“ лесна за користење. Тековниот протокол бара шприц-пумпа по микроуред, што зафаќа простор во CO2 инкубатор и спречува експерименти од голем обем. Ова ограничување може значително да се подобри со скалабилност на иновативни формати на култури (на пр., порозни влошки со 24 бунари, 96 бунари или 384 бунари што овозможуваат континуирано надополнување и отстранување на базолатералните медиуми).
За да предизвикаме 3D морфогенеза на човечкиот цревен епител in vitro, користевме микрофлуиден чип за црево што содржи два паралелни микроканали и еластична порозна мембрана помеѓу нив за да создадеме лумен-капиларен интерфејс. Исто така, демонстрираме употреба на едноканален микрофлуиден уред (хибриден чип) што обезбедува континуиран базолатерален проток под поларизираните епителни слоеви одгледувани на Transwell инсерти. На обете платформи, морфогенезата на различни човечки цревни епителни клетки може да се демонстрира со примена на насочена манипулација на протокот за отстранување на антагонистите на морфогенот од базолатералниот оддел. Целата експериментална постапка (Слика 1) се состои од пет дела: (i) микрофабрикација на цревниот чип или хибриден чип што може да се вметне во Transwell (чекори 1-5; Кутија 1), (ii) подготовка на цревни епителни клетки (Caco-2 клетки) или човечки цревни органоиди; кутии 2-5), (iii) култура на цревни епителни клетки на цревни чипови или хибридни чипови (чекори 6-9), (iv) индукција на 3D морфогенеза in vitro (чекор 10) и (v)) за карактеризирање на 3D епителната микроструктура (чекори 11-24). Конечно, беше дизајнирана соодветна контролна група (дискутирана подолу) за да се потврди ефикасноста на in vitro морфогенезата со споредување на епителната морфогенеза со просторни, временски, условни или процедурални контроли.
Користевме две различни платформи за култура: црево-на-чип со прави канали или нелинеарни згрчени канали, или хибридни чипови што содржат Transwell (TW) влошки во микрофлуиден уред, изработени како што е опишано во Кутија 1, а чекор 1-5. „Изработка на уред“ ги прикажува главните чекори во правењето на еден чип или хибриден чип. „Култура на човечки цревни епителни клетки“ го објаснува изворот на клетките (Caco-2 или човечки цревни органоиди) и постапката за култура што се користи во овој протокол. „Морфогенеза ин витро“ ги прикажува целокупните чекори во кои епителните клетки добиени од Caco-2 или органоиди се култивираат на цревен чип или на Transwell влошки на хибриден чип, проследено со индукција на 3D морфогенеза и формирање на карактеризирана епителна структура. Бројот на чекорот на програмата или бројот на кутијата е прикажан под секоја стрелка. Апликацијата дава примери за тоа како воспоставените слоеви на цревниот епител можат да се користат, на пример, во карактеризација на клеточната диференцијација, студии за физиологија на цревата, воспоставување на екосистеми на микробиомот домаќин и моделирање на болести. Имунофлуоресценција Слики во „Диференцијација на клетки“ кои прикажуваат јадра, F-актин и MUC2 експресирани во 3D Caco-2 епителниот слој генериран на чипот на цревата. Сигнализација на MUC2 е присутна во пехарските клетки и слузта секретирана од мукозните површини. Флуоресцентните слики во „Физиологија на цревата“ покажуваат слуз произведена со боење за остатоци од сијална киселина и N-ацетилглукозамин со употреба на флуоресцентен аглутинин од пченични никулци. Двете преклопувачки слики во „Ко-култури на микробиом-домаќин“ покажуваат репрезентативни ко-култури на микробиом-домаќин во цревата на чип. Левиот панел ја прикажува кокултурата на E. coli која експресира зелен флуоресцентен протеин (GFP) со микроинженерски 3D Caco-2 епителни клетки. Десниот панел ја прикажува локализацијата на GFP E. coli ко-култивирана со 3D Caco-2 епителни клетки, проследено со имунофлуоресцентно боење со F-актин (црвена) и јадра (сина). Моделирањето на болести илустрира здрави наспроти протекувачки црева во чипови за воспаление на цревата под физиолошки предизвик со бактериски антигени (на пр., липополисахарид, LPS) и имуни клетки (на пр., PBMC; зелена). Caco-2 клетките беа култивирани за да се воспостави 3D епителен слој. Скала, 50 µm. Слики во долниот ред: „Диференцијација на клетки“ адаптирано со дозвола од референцата.2. Oxford University Press; Репродуцирано со дозвола од референцата 5. NAS; „Ко-култура домаќин-микроб“ адаптирано со дозвола од референцата 3. NAS; „Моделирање на болести“ адаптирано со дозвола од референцата.5. NAS.
И чиповите „црево на чип“ и хибридните чипови беа изработени со употреба на PDMS реплики кои беа отстранети од силиконски калапи со мека литографија1,44 и моделирани со SU-8. Дизајнот на микроканали во секој чип е определен со земање предвид на хидродинамиката како што се напрегањето на смолкнувањето и хидродинамичкиот притисок1,4,12. Оригиналниот дизајн „црево на чип“ (Проширени податоци Сл. 1а), кој се состоеше од два јукстапозирани паралелни прави микроканали, еволуираше во комплексен дизајн „црево на чип“ (Проширени податоци Сл. 1б) кој вклучува пар закривени микроканали за да предизвика зголемено време на престој на течноста, нелинеарни шеми на проток и мултиаксијална деформација на култивираните клетки (Сл. 2а-ѓ)12. Кога треба да се рекреира посложена биомеханика на цревата, може да се изберат сложени „црево на чипови“. Покажавме дека конволтираниот „цревен чип“ исто така силно индуцира 3D морфогенеза во слична временска рамка со сличен степен на епителен раст во споредба со оригиналниот. Gut-Chip, без оглед на типот на култивирана клетка. Затоа, за да се индуцира 3D морфогенеза, линеарните и сложените дизајни на цревата на чипот се заменливи. PDMS репликите стврднати на силиконски калапи со SU-8 шеми дадоа негативни карактеристики по отстранувањето од калапот (Сл. 2а). За да се изработи цревата на чип, подготвениот горен PDMS слој беше секвенцијално врзан за порозен PDMS филм, а потоа порамнет со долниот PDMS слој со неповратно врзување со употреба на корона третирач (Сл. 2б-ѓ). За да се изработат хибридни чипови, стврднатите PDMS реплики беа залепени на стаклени плочки за да се создадат едноканални микрофлуидни уреди кои би можеле да сместат Transwell влошки (Сл. 2ж и Проширени податоци Сл. 2). Процесот на врзување се изведува со третирање на површините на PDMS репликата и стаклото со кислородна плазма или корона третман. По стерилизацијата на микрофабрикуваниот уред прикачен на силиконската цевка, поставувањето на уредот беше подготвено да изврши 3D морфогенеза на цревниот епител (Слика 2г).
a, Шематска илустрација на подготовката на PDMS делови од силиконски калапи со SU-8 модел. Нестврднатиот PDMS раствор беше истурен во силиконски калап (лево), стврднат на 60 °C (средина) и одкалапен (десно). Одкалапениот PDMS беше исечен на парчиња и исчистен за понатамошна употреба. b, Фотографија од силиконскиот калап што се користи за подготовка на горниот слој на PDMS. c, Фотографија од силиконскиот калап што се користи за изработка на порозната мембрана на PDMS. d, Серија фотографии од горните и долните компоненти на PDMS и склопениот цревен уред на чип. e, Шематска шема на усогласувањето на горните, мембранските и долните компоненти на PDMS. Секој слој е неповратно врзан со третман со плазма или корона. f, Шематска шема на изработениот уред „црево на чип“ со надредени згрчени микроканали и вакуумски комори. g, Поставување на „црево на чип“ за микрофлуидна клеточна култура. Изработеното црево на чип склопен со силиконска цевка и шприц беше поставено на покривно стакленце. Уредот со чип беше поставен на капакот на Петриева шоља од 150 mm за обработка. Врзувачот се користи за затворање на силиконската цевка. h, Визуелни снимки од изработка на хибриден чип и 3D морфогенеза со употреба на хибридни чипови. Трансвел инсерти подготвени независно за култивирање на 2D монослоеви на цревни епителни клетки беа вметнати во хибридниот чип за да се индуцира цревна 3D морфогенеза. Медиумот се перфузира преку микроканали под клеточниот слој воспоставен на Трансвел инсертот. Скала, 1 cm. h Препечатено со дозвола од референцата. 4. Елсевиер.
Во овој протокол, клеточната линија Caco-2 и цревните органоиди беа користени како епителни извори (Сл. 3а). И двата типа на клетки беа култивирани независно (Поле 2 и Поле 5) и користени за засејување на микроканали обложени со ECM на цревата на чипот или Transwell инсерти. Кога клетките се конфлуентни (>95% покриеност во колбите), рутински култивираните Caco-2 клетки (помеѓу пасажите 10 и 50) во Т-колбиња се собираат за да се подготват дисоцирани клеточни суспензии со трипсинска течност (поле 2). Човечките цревни органоиди од цревни биопсии или хируршки ресекции беа култивирани во куполи на скелето Matrigel во плочи со 24 бунари за да се поддржи структурната микросредина. Медиум што содржи есенцијални морфогени (како што се Wnt, R-спондин и Noggin) и фактори на раст подготвени како што е опишано во Поле 3 беше дополнуван секој втор ден додека органоидите не пораснат до ~500 µm во дијаметар. Целосно пораснатите органоиди се собираат и дисоцираат во единечни клетки за засејување на црево или Трансвел инсерти на чип (Поле 5). Како што претходно објавивме, може да се разликува според типот на болеста12,13 (на пр. улцерозен колитис, Кронова болест, колоректален карцином или нормален донор), местото на лезијата (на пр., лезија наспроти неоштетена област) и гастроинтестиналната локација во трактот (на пр., дуоденум, јејунум, илеум, цекум, дебело црево или ректум). Во Поле 5 нудиме оптимизиран протокол за култивирање на цревни органоиди (колоиди) кои обично бараат повисоки концентрации на морфогени отколку органоидите од тенкото црево.
a, Работен тек за индукција на цревна морфогенеза во цревниот чип. Во овој протокол се користат Caco-2 човечки цревен епител и цревни органоиди за да се демонстрира 3D морфогенеза. Изолираните епителни клетки беа засеани во подготвениот уред gut-on-a-chip (подготовка на чип). Откако клетките ќе се засеат (посеат) и ќе се прикачат (прикачат) на порозната мембрана PDMS на ден 0 (D0), апикалниот (AP) проток се иницира и одржува во текот на првите 2 дена (проток, AP, D0-D2). Базолатералниот (BL) проток се иницира заедно со циклични движења на истегнување (истегнување, проток, AP и BL) кога се формира комплетен 2D монослој. Цревната 3D морфогенеза се случи спонтано по 5 дена микрофлуидна култура (морфогенеза, D5). Сликите со фазен контраст покажуваат репрезентативна морфологија на Caco-2 клетките во секој експериментален чекор или временска точка (графикон со столпчиња, 100 µm). Четири шематски дијаграми што ги илустрираат соодветните каскади на цревна морфогенеза (горе десно). Испрекинатите стрелки на шемата ја претставуваат насоката на проток на течност. б, SEM слика што ја покажува површинската топологија на воспоставениот 3D Caco-2 епител (лево). Вметнатото парче што ја означува зголемената област (бела испрекината кутија) ги прикажува регенерираните микровили на 3D Caco-2 слојот (десно). в, Хоризонтален фронтален поглед на воспоставените Caco-2 3D, клаудин (ZO-1, црвена) и континуирани четкасти гранични мембрани означени со F-актин (зелена) и јадра (сина). Имунофлуоресцентна конфокална визуелизација на епителните клетки на цревни чипови. Стрелките што покажуваат кон средната шема ја означуваат локацијата на фокусната рамнина за секој конфокален поглед. г, Временски тек на морфолошките промени кај органоидите култивирани на чип добиен со фазно контрастна микроскопија на 3, 7, 9, 11 и 13 дена. Вметнатото парче (горе десно) го покажува големото зголемување на дадената слика. д, DIC фотомикрографија на органоиден 3D епител воспоставен во цревата на парче направено на 7-миот ден. ѓ, Преклопени имунофлуоресцентни слики што прикажуваат маркери за матични клетки (LGR5; магента), пехарски клетки (MUC2; зелена), F-актин (сива) и јадра (цијан) одгледувани на цревни чипови 3 дена, соодветно (лево) и 13-дневни (средни) органоиди на епителниот слој. Видете ја и Слика 3 со проширени податоци, која го истакнува сигнализирањето на LGR5 без сигнализирање на MUC2. Флуоресцентни слики што ја прикажуваат епителната микроструктура (десно) на 3D органоиден епител воспоставен во цревата на чип со боење на плазма мембраната со боја CellMask (десно) на 13-тиот ден од културата. Скалната лента е 50 μm освен ако не е поинаку наведено.b Препечатено со дозвола од референцата.2. Oxford University Press; c Адаптирано со дозвола од референцата.2. Oxford University Press; e и f адаптирани со дозвола од референцата.12 Под Creative Commons License CC BY 4.0.
Во цревата на чип, потребно е да се модифицира хидрофобната површина на порозната мембрана на PDMS за успешно обложување на ECM. Во овој протокол, применуваме два различни методи за модифицирање на хидрофобноста на PDMS мембраните. За култивирање на Caco-2 клетки, површинската активација само со UV/озонски третман беше доволна за да се намали хидрофобноста на површината на PDMS, да се обложи ECM и да се прикачат Caco-2 клетките на PDMS мембраната. Сепак, микрофлуидната култура на органоиден епител бара хемиски базирана површинска функционализација за да се постигне ефикасно таложење на ECM протеини со секвенцијално нанесување на полиетиленимин (PEI) и глутаралдехид на PDMS микроканали. По модификацијата на површината, ECM протеините беа депонирани за да ја покријат функционализираната површина на PDMS, а потоа воведени во изолираниот органоиден епител. Откако клетките ќе се прикачат, микрофлуидната клеточна култура започнува со перфузија само на медиумот во горниот микроканал сè додека клетките не формираат комплетен монослој, додека долниот микроканал одржува статички услови. Овој оптимизиран метод за површинска активација и ECM обложување овозможува прицврстување на органоиден епител за да се индуцира 3D морфогенеза на површината на PDMS.
Трансвел културите исто така бараат ECM премачкување пред сеење на клетките; сепак, Трансвел културите не бараат сложени чекори на претходна обработка за активирање на површината на порозните влошки. За одгледување на Caco-2 клетки на Трансвел влошки, ECM премачкувањето на порозните влошки го забрзува прицврстувањето на дисоцираните Caco-2 клетки (<1 час) и формирањето на бариера со тесна врска (<1-2 дена). За култивирање на органоиди на Трансвел влошки, изолираните органоиди се засејуваат на влошки обложени со ECM, се прицврстуваат на површината на мембраната (<3 часа) и се одржуваат сè додека органоидите не формираат комплетен монослој со интегритет на бариерата. Трансвел културите се изведуваат во плочи со 24 бунари без употреба на хибридни чипови.
Ин витро 3D морфогенезата може да се иницира со примена на проток на течност на базолатералниот аспект на воспоставениот епителен слој. Во цревата на чип, епителната морфогенеза започнала кога медиумот бил перфузиран во горните и долните микроканали (Сл. 3а). Како што беше претходно опишано, од клучно значење е да се воведе проток на течност во долниот (базолатерален) оддел за континуирано отстранување на насочените секретирани инхибитори на морфоген. За да се обезбедат доволно хранливи материи и серум за клетките врзани за порозни мембрани и да се генерира луминален стрес на смолкнување, ние обично применуваме двоен проток во цревата на чип. Кај хибридните чипови, Transwell инсертите што содржат епителни монослоеви биле вметнати во хибридните чипови. Потоа, медиумот бил нанесен под базолатералната страна на порозниот Transwell инсерт преку микроканалот. Цревната морфогенеза се случила 3-5 дена по иницирањето на базолатералниот проток на обете платформи за култура.
Морфолошките карактеристики на микроинженерските 3D епителни слоеви може да се анализираат со примена на различни модалитети на снимање, вклучувајќи микроскопија со фазен контраст, микроскопија со диференцијален интерферентен контраст (DIC), SEM или имунофлуоресцентна конфокална микроскопија (Слики 3 и 4). Фазниот контраст или DIC снимањето може лесно да се изврши во кое било време за време на културата за да се следи обликот и испакнатоста на 3D епителните слоеви. Поради оптичката транспарентност на PDMS и полиестерските филмови, и платформите „црева на чип“ и хибридниот чип можат да обезбедат снимање во реално време in situ без потреба од сечење или расклопување на уредот. При изведување на имунофлуоресцентно снимање (Слики 1, 3c, f и 4b, c), клетките обично се фиксираат со 4% (wt/vol) параформалдехид (PFA), проследено со Triton X-100 и 2% (wt/vol)) говедски серумски албумин (BSA), по редослед. Во зависност од типот на клетка, може да се користат различни фиксативи, пермеабилизатори и блокирачки агенси. се користи. Примарни антитела насочени кон маркери на клетки или региони зависни од лозата се користат за да се истакнат клетките имобилизирани in situ на чипот, проследени со секундарни антитела заедно со контрабоја насочена кон јадрото (на пр., 4′,6-диамидино-2-фенилен) индол, DAPI) или F-актин (на пр., флуоресцентно обележан фалоидин). Сликањето во живо базирано на флуоресценција може да се изврши и in situ за да се открие производство на слуз (Сл. 1, „Диференцијација на клетки“ и „Физиологија на цревата“), случајна колонизација на микробни клетки (Сл. 1, „Кокултура домаќин-микроб“), регрутирање на имуни клетки (Сл. 1, „Моделирање на болести“) или контурите на 3D епителна морфологија (Сл. 3c, f и 4b, c). При модифицирање на цревата на чипот за да се оддели горниот слој од долниот слој на микроканали, како што е опишано во реф. Како што е прикажано на Сл. 2, 3D епителната морфологија, како и микровилите на апикалниот Четкастата граница може да се визуелизира со SEM (Сл. 3б). Експресијата на маркерите за диференцијација може да се процени со изведување на квантитативно PCR5 или секвенционирање на РНК на единечни клетки. Во овој случај, 3D слоеви на епителни клетки одгледувани во цревни чипови или хибридни чипови се собираат со трипсинизација, а потоа се користат за молекуларна или генетска анализа.
a, Работен тек за индукција на цревна морфогенеза во хибриден чип. Caco-2 и цревни органоиди се користат во овој протокол за да се демонстрира 3D морфогенеза во хибридна платформа за чип. Дисоцираните епителни клетки беа засеани во подготвени Transwell инсерти (TW prep; видете ја сликата подолу). Откако клетките беа засеани (посеани) и прикачени на полиестерски мембрани во Transwell инсерти, сите клетки беа култивирани под статички услови (TW култура). По 7 дена, еден Transwell инсерт што содржи 2D монослој на епителни клетки беше интегриран во хибриден чип за да се воведе базолатерален проток (Flow, BL), што на крајот доведе до генерирање на 3D епителен слој (морфогенеза). Микрографии со фазен контраст што покажуваат морфолошки карактеристики на епителни клетки на човечки органи добиени од нормален донорски асцендентен колон (линија C103) во секој експериментален чекор или временска точка. Шемите во горните слоеви ја илустрираат експерименталната конфигурација за секој чекор. b, Хибридните чипови (лева шема) можат да доведат до 3D морфогенеза на органоидни епителни клетки со Конфокални микроскопски прикази од горе надолу направени на различни Z позиции (горна, средна и долна; видете ја десната шема и соодветните испрекината линија). покажаа очигледни морфолошки карактеристики. F-актин (цијан), јадро (сиво).c, Флуоресцентни конфокални микрографии (3D аголен приказ) на епителни клетки добиени од органоид култивирани во статичен Transwell (TW; вметнат во бела испрекината кутија) наспроти хибриден чип (најголем целосен кадар) споредувајќи 2D наспроти 3D морфологија, соодветно. Пар 2D вертикални попречни прикази (вметнат во горниот десен агол; „XZ“) исто така покажуваат 2D и 3D карактеристики. Скалирана лента, 100 µm.c Препечатено со дозвола од референцата.4. Elsevier.
Контролите може да се подготват со култивирање на истите клетки (Caco-2 или цревни органоидни епителни клетки) во дводимензионални монослоеви под конвенционални услови на статичко култивирање. Имено, намалувањето на хранливите материи може да се должи на ограничениот волуменски капацитет на микроканали (т.е. ~4 µL во горниот канал на оригиналниот дизајн на цревен чип). Затоа, може да се спореди и епителната морфологија пред и по примената на базолатералниот проток.
Процесот на мека литографија треба да се изведува во чиста просторија. За секој слој на чипот (горни и долни слоеви и мембрани) и хибридни чипови, беа користени различни фотомаски и изработени на одделни силиконски плочки бидејќи висините на микроканали беа различни. Целните висини на горните и долните микроканали на цревото на чипот се 500 µm и 200 µm, соодветно. Целната висина на каналот на хибридниот чип е 200 µm.
Ставете силиконска плочка од 3 инчи во сад со ацетон. Нежно протресете ја плочката 30 секунди, а потоа исушете ја плочката на воздух. Префрлете ја плочката на чинија со IPA, а потоа центрифугирајте ја плочката 30 секунди за да ја исчистите.
Раствор од пирана (мешавина од водород пероксид и концентрирана сулфурна киселина, 1:3 (вол/вол)) може опционално да се користи за максимизирање на отстранувањето на органските остатоци од површината на силициумската плочка.
Растворот од пирана е исклучително корозивен и генерира топлина. Потребни се дополнителни безбедносни мерки на претпазливост. За отстранување на отпадот, оставете го растворот да се олади и префрлете го во чист, сув контејнер за отпад. Користете секундарни контејнери и правилно означете ги контејнерите за отпад. Ве молиме следете ги безбедносните упатства на објектот за подетални процедури.
Дехидрирајте ги вафлите така што ќе ги ставите на рингла на 200 °C во времетраење од 10 минути. По дехидрацијата, вафлата се протресува пет пати на воздух за да се олади.
Истурете ~10 g фоторезист SU-8 2100 во центарот на исчистената силиконска плочка. Користете пинцета за рамномерно распоредување на фоторезистот врз плочката. Повремено ставајте ја плочката на шпорет на 65°C за да биде помалку леплив и полесен за распоредување. Не ја ставајте плочката директно врз шпоретот.
SU-8 беше рамномерно распределен на плочката со нанесување на центрифугално премачкување. Програмирајте ја влезната ротација на SU-8 за 5-10 секунди за да се шири со брзина од 500 вртежи во минута при забрзување од 100 вртежи во минута/сек. Поставете го главното вртење за обликување со дебелина од 200 µm на 1.500 вртежи во минута или постигнете дебелина од 250 µm (со што се добива висина од 500 µm за горниот слој на цревото на чипот; видете „Критични чекори“ подолу) поставете ја на забрзување од 300 вртежи во минута/сек 30 секунди при 1.200 вртежи во минута.
Главната брзина на центрифугирање може да се прилагоди според целната дебелина на шаблонот SU-8 на силиконската плочка.
За да се изработат SU-8 шаблони со висина од 500 µm за горниот слој на цревото на чипот, чекорите на центрифугирање и меко печење од оваа кутија (чекори 7 и 8) беа последователно повторени (видете чекор 9) за да се добијат два слоја од SU-8 со дебелина од 250 µm, кои можат да се нанесат во слоеви и да се спојат со UV изложеност во чекор 12 од оваа кутија, со што се добива слој висок 500 µm.
Печете ги вафлите обложени со SU-8 со внимателно поставување на вафлите на топла плоча на 65 °C во траење од 5 минути, потоа променете ја поставката на 95 °C и инкубирајте дополнителни 40 минути.
За да се постигне висина од 500 μm на шаблонот SU-8 во горниот микроканал, повторете ги чекорите 7 и 8 за да генерирате два слоја SU-8 со дебелина од 250 μm.
Користејќи го порамнувачот на UV маски, извршете тест со ламба според упатствата на производителот за да го пресметате времето на изложеност на плочката. (време на изложеност, ms) = (доза на изложеност, mJ/cm2)/(моќност на ламбата, mW/cm2).
Откако ќе го одредите времето на експозиција, поставете ја фотомаската на држачот за маска од порамнувачот на UV маски и поставете ја фотомаската на плочката обложена со SU-8.
Поставете ја печатената површина на фотомаската директно на страната од силиконската плочка обложена со SU-8 за да се минимизира дисперзијата на УВ зрачењето.
Изложете ја плочката и фотомаската обложена со SU-8 вертикално на 260 mJ/cm2 УВ светлина за претходно одреденото време на експозиција (видете го чекор 10 од ова поле).
По изложувањето на УВ зрачење, силиконските плочки обложени со SU-8 беа печени на 65°C во траење од 5 минути и на 95°C во траење од 15 минути на секоја топла плоча за да се изработат шари со висина од 200 μm. Продолжете го времето по печењето на 95°C на 30 минути за да се изработат шари со висина од 500 μm.
Развивачот се истура во стаклен сад, а печената вафла се става во садот. Количината на SU-8 развивач може да варира во зависност од големината на стаклената плоча. Употребете доволно SU-8 развивач за целосно отстранување на неизложениот SU-8. На пример, кога користите стаклен сад со дијаметар од 150 mm и капацитет од 1 L, користете ~300 mL SU-8 развивач. Развивајте го калапот 25 минути со повремено нежно ротирање.
Исплакнете ја развиената калапка со ~10 мл свеж развивач, проследено со IPA со прскање на растворот со пипета.
Ставете ја плочката во плазма чистач и изложете ја на кислородна плазма (атмосферски гас, целен притисок 1 × 10−5 Torr, моќност 125 W) 1,5 минути.
Ставете ја плочката во вакуумски ексикатор со стаклено стакло внатре. Плочките и плочките може да се постават една до друга. Ако вакуумскиот ексикатор е поделен на неколку слоеви со плоча, ставете ги плочките во долната комора, а плочките во горната комора. Ставете 100 μL раствор од трихлоро(1H, 1H, 2H, 2H-перфлуорооктил)силан на стаклено стакло и применете вакуум за силанизација.
Одмрзнете шишенце со замрзнати Caco-2 клетки во водена бања на 37°C, а потоа префрлете ги одмрзнатите клетки во колба T75 што содржи 15 mL претходно загреан Caco-2 медиум на 37°C.
За да се пропуштат Caco-2 клетките при ~90% конфлуенција, прво се загреваат Caco-2 средната средина, PBS и 0,25% трипсин/1 mM EDTA во водена бања на 37°C.
Аспирирајте го медиумот со вакуумска аспирација. Измијте ги клетките двапати со 5 mL топол PBS со повторување на вакуумската аспирација и додавање на свеж PBS.