Ви благодариме што ја посетивте Nature.com. Верзијата на прелистувачот што ја користите има ограничена поддршка за CSS. За најдобро искуство, препорачуваме да користите ажуриран прелистувач (или да го оневозможите режимот на компатибилност во Internet Explorer). Во меѓувреме, за да обезбедиме континуирана поддршка, ќе ја прикажеме страницата без стилови и JavaScript.
Еволуцијата на микробните паразити вклучува контраакција помеѓу природната селекција, која предизвикува паразити да се подобрат, и генетскиот дрифт, кој предизвикува паразити да губат гени и да акумулираат штетни мутации. Овде, за да разбереме како се случува оваа контраакција на ниво на една макромолекула, ја опишуваме крио-ЕМ структурата на рибозомот на Encephalitozoon cuniculi, еукариотски организам со еден од најмалите геноми во природата. Екстремното намалување на rRNA во рибозомите на E. cuniculi е придружено со невидени структурни промени, како што е еволуцијата на претходно непознати споени rRNA линкери и rRNA без испакнатини. Покрај тоа, рибозомот на E. cuniculi го преживеал губењето на rRNA фрагменти и протеини со развивање на способност да користи мали молекули како структурни имитации на деградирани rRNA фрагменти и протеини. Генерално, покажуваме дека молекуларните структури за кои долго се сметало дека се редуцирани, дегенерирани и подложни на ослабувачки мутации имаат голем број компензаторни механизми што ги одржуваат активни и покрај екстремните молекуларни контракции.
Бидејќи повеќето групи микробни паразити имаат уникатни молекуларни алатки за да ги искористат своите домаќини, честопати мора да развиваме различни терапии за различни групи паразити1,2. Сепак, новите докази сугерираат дека некои аспекти на еволуцијата на паразитот се конвергентни и во голема мера предвидливи, што укажува на потенцијална основа за широки терапевтски интервенции кај микробните паразити3,4,5,6,7,8,9.
Претходните истражувања идентификуваа заеднички еволутивен тренд кај микробните паразити наречен редукција на геномот или распаѓање на геномот10,11,12,13. Сегашните истражувања покажуваат дека кога микроорганизмите се откажуваат од својот слободен животен стил и стануваат интрацелуларни паразити (или ендосимбионти), нивните геноми претрпуваат бавни, но неверојатни метаморфози во текот на милиони години9,11. Во процес познат како распаѓање на геномот, микробните паразити акумулираат штетни мутации кои ги претвораат многу претходно важни гени во псевдогени, што доведува до постепено губење на гени и мутациски колапс14,15. Овој колапс може да уништи до 95% од гените кај најстарите интрацелуларни организми во споредба со тесно поврзаните видови кои живеат слободно. Така, еволуцијата на интрацелуларните паразити е влечење јаже помеѓу две спротивставени сили: дарвинистичката природна селекција, што доведува до подобрување на паразитите, и колапсот на геномот, фрлајќи ги паразитите во заборав. Како паразитот успеал да излезе од ова влечење јаже и да ја задржи активноста на својата молекуларна структура, останува нејасно.
Иако механизмот на распаѓање на геномот не е целосно разбран, се чини дека се јавува главно поради често генетско дрифтување. Бидејќи паразитите живеат во мали, бесполови и генетски ограничени популации, тие не можат ефикасно да ги елиминираат штетните мутации што понекогаш се јавуваат за време на репликацијата на ДНК. Ова води до неповратна акумулација на штетни мутации и намалување на геномот на паразитот. Како резултат на тоа, паразитот не само што губи гени кои повеќе не се потребни за неговиот опстанок во интрацелуларната средина. Неможноста на популациите на паразити ефикасно да ги елиминираат спорадичните штетни мутации е причина за акумулацијата на овие мутации низ целиот геном, вклучувајќи ги и нивните најважни гени.
Голем дел од нашето сегашно разбирање за намалувањето на геномот се базира исклучиво на споредби на секвенците на геномот, со помалку внимание на промените во вистинските молекули кои извршуваат функции на одржување и служат како потенцијални цели на лекови. Компаративните студии покажаа дека товарот на штетните интрацелуларни микробни мутации се чини дека ги предиспонира протеините и нуклеинските киселини да се погрешно преклопуваат и агрегираат, што ги прави позависни од шапероните и преосетливи на топлина19,20,21,22,23. Покрај тоа, разни паразити - независна еволуција понекогаш одделени и до 2,5 милијарди години - доживеале слична загуба на центрите за контрола на квалитетот во нивната синтеза на протеини5,6 и механизмите за поправка на ДНК24. Сепак, малку се знае за влијанието на интрацелуларниот начин на живот врз сите други својства на клеточните макромолекули, вклучително и молекуларната адаптација на зголеменото оптоварување на штетните мутации.
Во оваа работа, со цел подобро да ја разбереме еволуцијата на протеините и нуклеинските киселини на интрацелуларните микроорганизми, ја утврдивме структурата на рибозомите на интрацелуларниот паразит Encephalitozoon cuniculi. E. cuniculi е организам сличен на габа кој припаѓа на група паразитски микроспоридии кои имаат невообичаено мали еукариотски геноми и затоа се користат како модел организми за проучување на распаѓањето на геномот25,26,27,28,29,30. Неодамна, беше утврдена крио-EM рибозомската структура за умерено редуцирани геноми на Microsporidia, Paranosema locustae и Vairimorpha necatrix31,32 (~3,2 Mb геном). Овие структури сугерираат дека одреден губиток на амплификација на rRNA се компензира со развој на нови контакти помеѓу соседните рибозомални протеини или стекнување на нови msL131,32 рибозомални протеини. Видот Encephalitozoon (геном ~2,5 милиони bp), заедно со нивниот најблизок роднина Ordospora, го покажуваат највисокиот степен на редукција на геномот кај еукариотите - тие имаат помалку од 2000 гени што кодираат протеини, и се очекува дека нивните рибозоми не само што се лишени од фрагменти за експанзија на rRNA (фрагменти на rRNA што ги разликуваат еукариотските рибозоми од бактериските рибозоми), туку имаат и четири рибозомални протеини поради недостатокот на хомолози во геномот на E. cuniculi26,27,28. Затоа, заклучивме дека рибозомот на E. cuniculi може да открие претходно непознати стратегии за молекуларна адаптација на распаѓање на геномот.
Нашата крио-ЕМ структура го претставува најмалиот еукариотски цитоплазматски рибозом што треба да се карактеризира и дава увид во тоа како крајниот степен на намалување на геномот влијае на структурата, склопувањето и еволуцијата на молекуларната машинерија што е составен дел од клетката. Откривме дека рибозомот на E. cuniculi ги крши многу од широко зачуваните принципи на преклопување на РНК и склопување на рибозомите и откривме нов, претходно непознат рибозомален протеин. Сосема неочекувано, покажуваме дека рибозомите на микроспоридиите ја развиле способноста да врзуваат мали молекули и претпоставуваме дека скратувањата во rRNA и протеините предизвикуваат еволутивни иновации што на крајот можат да му дадат корисни квалитети на рибозомот.
За да го подобриме нашето разбирање за еволуцијата на протеините и нуклеинските киселини во интрацелуларните организми, решивме да ги изолираме спорите на E. cuniculi од култури на заразени клетки на цицачи со цел да ги прочистиме нивните рибозоми и да ја одредиме структурата на овие рибозоми. Тешко е да се добие голем број паразитски микроспоридии бидејќи микроспоридиите не можат да се култивираат во хранлива подлога. Наместо тоа, тие растат и се размножуваат само во клетката домаќин. Затоа, за да добиеме биомаса на E. cuniculi за прочистување на рибозомите, ја инфициравме бубрежната клеточна линија RK13 на цицачите со спори на E. cuniculi и ги култивиравме овие заразени клетки неколку недели за да му овозможиме на E. cuniculi да расте и да се размножува. Користејќи монослој од инфицирани клетки од околу половина квадратен метар, успеавме да прочистиме околу 300 мг спори на Microsporidia и да ги искористиме за изолирање на рибозоми. Потоа ги разбивме прочистените спори со стаклени зрнца и ги изолиравме суровите рибозоми користејќи постепена фракционирање на лизатите со полиетилен гликол. Ова ни овозможи да добиеме приближно 300 µg сурови рибозоми на E. cuniculi за структурна анализа.
Потоа собравме крио-ЕМ слики користејќи ги добиените примероци од рибозоми и ги обработивме овие слики користејќи маски што одговараат на големата рибозомска под-единица, главата на малата под-единица и малата под-единица. За време на овој процес, собравме слики од околу 108.000 рибозомски честички и пресметавме крио-ЕМ слики со резолуција од 2,7 Å (Дополнителни слики 1-3). Потоа користевме крио-ЕМ слики за да моделираме rRNA, рибозомски протеин и фактор на хибернација Mdf1 поврзан со рибозомите на E. cuniculi (Сл. 1а, б).
a Структура на рибозомот на E. cuniculi во комплекс со факторот на хибернација Mdf1 (pdb id 7QEP). b Мапа на факторот на хибернација Mdf1 поврзан со рибозомот на E. cuniculi. c Мапа на секундарна структура што ја споредува обновената rRNA кај микроспоридијалните видови со познатите рибозомални структури. Панелите ја покажуваат локацијата на амплифицираните фрагменти на rRNA (ES) и активните места на рибозомот, вклучувајќи го местото на декодирање (DC), сарциницинската јамка (SRL) и центарот на пептидил трансфераза (PTC). d Густината на електроните што одговара на центарот на пептидил трансфераза на рибозомот на E. cuniculi сугерира дека ова каталитичко место има иста структура кај паразитот E. cuniculi и неговите домаќини, вклучувајќи го и H. sapiens. e, f Соодветната густина на електроните на декодирачкиот центар (e) и шематската структура на декодирачкиот центар (f) укажуваат дека E. cuniculi има остатоци U1491 наместо A1491 (нумерирање на E. coli) кај многу други еукариоти. Оваа промена сугерира дека E. cuniculi може да биде чувствителна на антибиотици кои го таргетираат ова активно место.
За разлика од претходно утврдените структури на рибозомите на V. necatrix и P. locustae (двете структури претставуваат исто семејство микроспоридии Nosematidae и се многу слични една на друга), 31,32 рибозомите на E. cuniculi подлежат на бројни процеси на фрагментација на rRNA и протеини. Понатамошна денатурација (Дополнителни слики 4-6). Кај rRNA, највпечатливите промени вклучуваат целосно губење на амплифицираниот 25S rRNA фрагмент ES12L и делумна дегенерација на h39, h41 и H18 спиралите (Сл. 1c, Дополнителна слика 4). Меѓу рибозомските протеини, највпечатливите промени вклучуваат целосно губење на протеинот eS30 и скратување на протеините eL8, eL13, eL18, eL22, eL29, eL40, uS3, uS9, uS14, uS17 и eS7 (Дополнителни слики 4, 5).
Така, екстремното намалување на геномите на видовите Encephalotozoon/Ordospora се рефлектира во нивната рибозомска структура: рибозомите на E. cuniculi доживуваат најдраматична загуба на содржина на протеини во еукариотските цитоплазматски рибозоми кои се предмет на структурна карактеризација, а тие дури и немаат оние rRNA и протеински фрагменти кои се широко зачувани не само кај еукариотите, туку и во трите домени на животот. Структурата на рибозомот на E. cuniculi го обезбедува првиот молекуларен модел за овие промени и открива еволутивни настани кои биле занемарени и од компаративната геномика и од студиите за интрацелуларната биомолекуларна структура (Дополнителна слика 7). Подолу, ги опишуваме секој од овие настани заедно со нивното веројатно еволутивно потекло и нивното потенцијално влијание врз функцијата на рибозомите.
Потоа откривме дека, покрај големите скратувања на rRNA, рибозомите на E. cuniculi имаат варијации на rRNA на едно од нивните активни места. Иако центарот за пептидил трансфераза на рибозомот на E. cuniculi има иста структура како и другите еукариотски рибозоми (Сл. 1d), центарот за декодирање се разликува поради варијацијата на секвенцата на нуклеотидот 1491 (нумерирање на E. coli, Сл. 1e, f). Ова набљудување е важно бидејќи местото за декодирање на еукариотските рибозоми обично содржи остатоци G1408 и A1491 во споредба со остатоците од бактериски тип A1408 и G1491. Оваа варијација е основа на различната чувствителност на бактериските и еукариотските рибозоми кон аминогликозидното семејство на рибозомални антибиотици и други мали молекули кои го таргетираат местото за декодирање. На местото за декодирање на рибозомот на E. cuniculi, остатокот A1491 беше заменет со U1491, потенцијално создавајќи уникатен интерфејс за врзување за мали молекули кои го таргетираат ова активно место. Истата варијанта A14901 е присутна и кај други микроспоридии како што се P. locustae и V. necatrix, што укажува дека е широко распространета меѓу видовите микроспоридии (сл. 1f).
Бидејќи нашите примероци од рибозоми на E. cuniculi беа изолирани од метаболички неактивни спори, ја тестиравме крио-EM мапата на E. cuniculi за претходно опишано врзување на рибозомите под стрес или услови на гладување. Фактори на хибернација 31,32,36,37, 38. Ја споредивме претходно утврдената структура на хибернирачкиот рибозом со крио-EM мапата на рибозомот на E. cuniculi. За спојување, рибозомите на S. cerevisiae беа користени во комплекс со факторот на хибернација Stm138, рибозомите на скакулци во комплекс со факторот Lso232 и рибозомите на V. necatrix во комплекс со факторите Mdf1 и Mdf231. Во исто време, ја откривме густината на крио-EM што одговара на факторот на мирување Mdf1. Слично на врзувањето на Mdf1 за рибозомот на V. necatrix, Mdf1 се врзува и за рибозомот на E. cuniculi, каде што го блокира Е-местото на рибозомот, веројатно помагајќи да се направат рибозомите достапни кога спорите на паразитот стануваат метаболички неактивни по инактивацијата на телото (Слика 2).
Mdf1 го блокира Е-местото на рибозомот, што се чини дека помага во инактивирањето на рибозомот кога спорите на паразитот стануваат метаболички неактивни. Во структурата на рибозомот на E. cuniculi, откривме дека Mdf1 формира претходно непознат контакт со L1 рибозомското стебло, делот од рибозомот што го олеснува ослободувањето на деацилираната tRNA од рибозомот за време на синтезата на протеини. Овие контакти сугерираат дека Mdf1 се дисоцира од рибозомот користејќи го истиот механизам како деацетилираната tRNA, што дава можно објаснување за тоа како рибозомот го отстранува Mdf1 за да ја реактивира синтезата на протеини.
Сепак, нашата структура откри непознат контакт помеѓу Mdf1 и L1 рибозомската нога (делот од рибозомот што помага во ослободувањето на деацилираната tRNA од рибозомот за време на синтезата на протеини). Поточно, Mdf1 ги користи истите контакти како и сегментот на лактот на деацилираната tRNA молекула (Сл. 2). Ова претходно непознато молекуларно моделирање покажа дека Mdf1 се дисоцира од рибозомот користејќи го истиот механизам како деацетилираната tRNA, што објаснува како рибозомот го отстранува овој фактор на хибернација за да ја реактивира синтезата на протеини.
При конструирањето на моделот на rRNA, откривме дека рибозомот на E. cuniculi има абнормално превиткани фрагменти од rRNA, кои ги нарековме споена rRNA (сл. 3). Во рибозомите што ги опфаќаат трите домени на животот, rRNA се превиткува во структури во кои повеќето rRNA се базираат или во парови на бази и се превиткуваат една со друга или комуницираат со рибозомски протеини38,39,40. Сепак, во рибозомите на E. cuniculi, rRNA се чини дека го нарушуваат овој принцип на превиткување со претворање на некои од нивните спирали во непрекинати региони на rRNA.
Структура на спиралата на H18 25S rRNA кај S. cerevisiae, V. necatrix и E. cuniculi. Типично, кај рибозомите што ги опфаќаат трите животни домени, овој линкер се намотува во спирала на РНК што содржи од 24 до 34 остатоци. Кај микроспоридиите, пак, овој линкер на rRNA постепено се намалува на два едноверижни линкери богати со уридин што содржат само 12 остатоци. Повеќето од овие остатоци се изложени на растворувачи. Сликата покажува дека паразитските микроспоридии се чини дека ги кршат општите принципи на преклопување на rRNA, каде што базите на rRNA обично се поврзани со други бази или се вклучени во интеракциите на rRNA со протеини. Кај микроспоридиите, некои фрагменти на rRNA добиваат неповолно преклопување, во кое поранешната спирала на rRNA станува едноверижен фрагмент издолжен речиси во права линија. Присуството на овие необични региони ѝ овозможува на rRNA на микроспоридиите да врзува далечни фрагменти на rRNA користејќи минимален број на бази на РНК.
Највпечатлив пример за оваа еволутивна транзиција може да се забележи во спиралата на rRNA H18 25S (сл. 3). Кај видовите од E. coli до луѓето, базите на оваа rRNA спирала содржат 24-32 нуклеотиди, формирајќи малку неправилна спирала. Во претходно идентификуваните рибозомални структури од V. necatrix и P. locustae,31,32 базите на спиралата H18 се делумно одмотани, но спарувањето на нуклеотидните бази е зачувано. Сепак, кај E. cuniculi овој фрагмент од rRNA станува најкраткиот линкер 228UUUGU232 и 301UUUUUUUUU307. За разлика од типичните фрагменти од rRNA, овие линкери богати со уридин не се намотуваат ниту пак воспоставуваат екстензивен контакт со рибозомалните протеини. Наместо тоа, тие усвојуваат структури отворени за растворувач и целосно расклопени во кои нишките на rRNA се продолжени речиси право. Оваа растегната конформација објаснува како E. cuniculi користи само 12 РНК бази за да ја пополни празнината од 33 Å помеѓу H16 и H18 rRNA хеликсите, додека на другите видови им се потребни најмалку двојно повеќе rRNA бази за да ја пополнат празнината.
Така, можеме да покажеме дека, преку енергетски неповолно преклопување, паразитските микроспоридии развиле стратегија за контракција дури и на оние сегменти на rRNA кои остануваат широко зачувани низ видовите во трите домени на животот. Очигледно, со акумулирање на мутации кои ги трансформираат спиралите на rRNA во кратки поли-U линкери, E. cuniculi може да формира необични фрагменти на rRNA кои содржат што е можно помалку нуклеотиди за лигација на дисталните фрагменти на rRNA. Ова помага да се објасни како микроспоридиите постигнале драматично намалување на нивната основна молекуларна структура без да го изгубат својот структурен и функционален интегритет.
Друга необична карактеристика на E. cuniculi rRNA е појавата на rRNA без згуснувања (сл. 4). Испакнатините се нуклеотиди без базни парови кои се извиткуваат од спиралата на РНК наместо да се кријат во неа. Повеќето испакнатини на rRNA дејствуваат како молекуларни адхезии, помагајќи да се врзат соседните рибозомални протеини или други фрагменти на rRNA. Некои од испакнатините дејствуваат како шарки, овозможувајќи спиралата на rRNA да се свиткува и превиткува оптимално за продуктивна синтеза на протеини 41.
а Испакнатина на rRNA (нумерирање на S. cerevisiae) отсуствува од структурата на рибозомот на E. cuniculi, но е присутна кај повеќето други еукариоти б E. coli, S. cerevisiae, H. sapiens и внатрешни рибозоми на E. cuniculi. На паразитите им недостасуваат многу од античките, високо конзервирани испакнатини на rRNA. Овие згуснувања ја стабилизираат структурата на рибозомот; затоа, нивното отсуство во микроспоридиите укажува на намалена стабилност на преклопувањето на rRNA кај паразитите на микроспоридиите. Споредбата со P стеблата (L7/L12 стебла кај бактериите) покажува дека губењето на испакнатините на rRNA понекогаш се совпаѓа со појавата на нови испакнатини до изгубените испакнатини. Хеликсот H42 во 23S/28S rRNA има античка испакнатина (U1206 кај Saccharomyces cerevisiae) за која се проценува дека е стара најмалку 3,5 милијарди години поради нејзината заштита во три домени на животот. Кај микроспоридиите, оваа испакнатина е елиминирана. Сепак, до изгубената испакнатина се појави нова испакнатина (A1306 кај E. cuniculi).
Впечатливо е што откривме дека на рибозомите на E. cuniculi им недостасуваат повеќето испакнатини на rRNA што се наоѓаат кај други видови, вклучувајќи повеќе од 30 испакнатини конзервирани кај други еукариоти (сл. 4а). Оваа загуба елиминира многу контакти помеѓу рибозомските подединици и соседните rRNA спирали, понекогаш создавајќи големи шупливи празнини во рибозомот, правејќи го рибозомот на E. cuniculi попорозен во споредба со по традиционалните рибозоми (сл. 4б). Имено, откривме дека повеќето од овие испакнатини се изгубени и во претходно идентификуваните структури на рибозомите на V. necatrix и P. locustae, кои беа занемарени од претходните структурни анализи31,32.
Понекогаш губењето на испакнатините на rRNA е придружено со развој на нови испакнатини веднаш до изгубената испакнатина. На пример, рибозомското P-стебло содржи испакнатина U1208 (кај Saccharomyces cerevisiae) која преживеала од E. coli до луѓето и затоа се проценува дека е стара 3,5 милијарди години. За време на синтезата на протеини, оваа испакнатина му помага на P стеблото да се движи помеѓу отворени и затворени конформации, така што рибозомот може да регрутира фактори на транслација и да ги достави до активното место. Кај рибозомите на E. cuniculi, ова задебелување е отсутно; сепак, ново задебелување (G883) кое се наоѓа само во три базни пара може да придонесе за враќање на оптималната флексибилност на P стеблото (Сл. 4c).
Нашите податоци за rRNA без испакнатини укажуваат дека минимизирањето на rRNA не е ограничено на губење на rRNA елементи на површината на рибозомот, туку може да го вклучи и јадрото на рибозомот, создавајќи молекуларен дефект специфичен за паразитот кој не е опишан во клетките што живеат слободно.
По моделирањето на канонските рибозомални протеини и rRNA, откривме дека конвенционалните рибозомални компоненти не можат да ги објаснат трите дела од крио-ЕМ сликата. Два од овие фрагменти се мали молекули по големина (Сл. 5, Дополнителна слика 8). Првиот сегмент е сместен помеѓу рибозомалните протеини uL15 и eL18 во позиција што обично ја зафаќа C-терминалот на eL18, кој е скратен кај E. cuniculi. Иако не можеме да го утврдиме идентитетот на оваа молекула, големината и обликот на овој остров со густина е добро објаснета со присуството на молекули на спермидин. Неговото врзување за рибозомот е стабилизирано со мутации специфични за микроспоридиите во протеините uL15 (Asp51 и Arg56), кои се чини дека го зголемуваат афинитетот на рибозомот за оваа мала молекула, бидејќи му овозможуваат на uL15 да ја завитка малата молекула во рибозомална структура. Дополнителна слика 2). 8, дополнителни податоци 1, 2).
Крио-ЕМ снимањето покажува присуство на нуклеотиди надвор од рибозата врзана за рибозомот на E. cuniculi. Во рибозомот на E. cuniculi, овој нуклеотид го зазема истото место како и нуклеотидот 25S rRNA A3186 (нумерирање на Saccharomyces cerevisiae) во повеќето други еукариотски рибозоми. b Во рибозомската структура на E. cuniculi, овој нуклеотид се наоѓа помеѓу рибозомските протеини uL9 и eL20, со што се стабилизира контактот помеѓу двата протеини. cd анализа на зачувување на секвенцата на eL20 меѓу видовите микроспоридии. Филогенетското дрво на видовите Microsporidia (c) и повеќекратното усогласување на секвенцата на протеинот eL20 (d) покажуваат дека остатоците што се врзуваат за нуклеотиди F170 и K172 се зачувани кај повеќето типични микроспоридии, со исклучок на S. lophii, со исклучок на рано разгранувачките микроспоридии, кои го задржале продолжувањето на ES39L rRNA. e Оваа слика покажува дека остатоците за врзување на нуклеотиди F170 и K172 се присутни само во eL20 од високо редуцираниот геном на микроспоридии, но не и кај другите еукариоти. Генерално, овие податоци сугерираат дека микроспоридијалните рибозоми развиле место за врзување на нуклеотиди кое се чини дека ги врзува молекулите на AMP и ги користи за стабилизирање на интеракциите протеин-протеин во рибозомската структура. Високата конзервација на ова место за врзување кај микроспоридиите и неговото отсуство кај други еукариоти сугерира дека ова место може да обезбеди селективна предност за преживување за микроспоридиите. Така, џебот за врзување на нуклеотиди во рибозомот на микроспоридиите не се чини дека е дегенеративна карактеристика или крајна форма на деградација на rRNA како што е претходно опишано, туку корисна еволутивна иновација што му овозможува на рибозомот на микроспоридиите директно да се врзува за мали молекули, користејќи ги како молекуларни градежни блокови за рибозоми. Ова откритие го прави рибозомот на микроспоридиите единствениот рибозом познат што користи еден нуклеотид како свој структурен градежен блок. f Хипотетички еволутивен пат добиен од врзување на нуклеотиди.
Втората густина со мала молекуларна тежина се наоѓа на интерфејсот помеѓу рибозомските протеини uL9 и eL30 (сл. 5а). Овој интерфејс беше претходно опишан во структурата на рибозомот Saccharomyces cerevisiae како место за врзување за 25S нуклеотидот на rRNA A3186 (дел од екстензијата ES39L на rRNA)38. Беше покажано дека кај дегенерираните рибозоми на P. locustae ES39L, овој интерфејс врзува непознат единечен нуклеотид 31, и се претпоставува дека овој нуклеотид е редуцирана финална форма на rRNA, во која должината на rRNA е ~130-230 бази. ES39L е редуциран на единечен нуклеотид 32,43. Нашите крио-ЕМ слики ја поддржуваат идејата дека густината може да се објасни со нуклеотиди. Сепак, повисоката резолуција на нашата структура покажа дека овој нуклеотид е екстрарибозомален молекул, веројатно AMP (сл. 5а, б).
Потоа прашавме дали местото на врзување на нуклеотиди се појавува во рибозомот на E. cuniculi или постоело претходно. Бидејќи врзувањето на нуклеотиди е главно посредувано од остатоците Phe170 и Lys172 во рибозомалниот протеин eL30, ја проценивме конзервацијата на овие остатоци кај 4396 репрезентативни еукариоти. Како и во случајот со uL15 погоре, откривме дека остатоците Phe170 и Lys172 се високо конзервирани само кај типичните микроспоридии, но отсутни кај другите еукариоти, вклучувајќи ги атипичните микроспоридии Mitosporidium и Amphiamblys, кај кои фрагментот ES39L rRNA не е редуциран 44, 45, 46 (Сл. 5c). -e).
Земени заедно, овие податоци ја поддржуваат идејата дека E. cuniculi и веројатно други канонски микроспоридии развиле способност ефикасно да заробуваат голем број мали метаболити во структурата на рибозомот за да го компензираат падот на нивоата на rRNA и протеини. Притоа, тие развиле единствена способност да врзуваат нуклеотиди надвор од рибозомот, покажувајќи дека паразитските молекуларни структури компензираат со заробување на изобилство мали метаболити и нивно користење како структурни имитации на деградирани фрагменти на РНК и протеини.
Третиот несимулиран дел од нашата крио-ЕМ мапа, пронајден во големата рибозомска подединица. Релативно високата резолуција (2,6 Å) на нашата мапа сугерира дека оваа густина припаѓа на протеини со уникатни комбинации од големи остатоци од странични ланци, што ни овозможи да ја идентификуваме оваа густина како претходно непознат рибозомален протеин што го идентификувавме како. Тој беше именуван msL2 (Microsporidia-специфичен протеин L2) (методи, слика 6). Нашето пребарување на хомологија покажа дека msL2 е конзервиран во кладот ​​Microsporidia од родот Encephaliter и Orosporidium, но отсутен кај други видови, вклучително и други Microsporidia. Во рибозомската структура, msL2 зафаќа празнина формирана со губење на проширената ES31L rRNA. Во оваа празнина, msL2 помага во стабилизирање на преклопувањето на rRNA и може да го компензира губењето на ES31L (Слика 6).
a Електронска густина и модел на специфичниот за микроспоридија рибозомален протеин msL2 пронајден во рибозомите на E. cuniculi. b Повеќето еукариотски рибозоми, вклучувајќи го и 80S рибозомот на Saccharomyces cerevisiae, имаат изгубена амплификација на ES19L rRNA кај повеќето микроспоридијални видови. Претходно утврдената структура на рибозомот на V. necatrix microsporidia сугерира дека губењето на ES19L кај овие паразити се компензира со еволуцијата на новиот рибозомален протеин msL1. Во оваа студија, откривме дека рибозомот на E. cuniculi, исто така, развил дополнителен протеин што имитира рибозомална РНК како очигледна компензација за губењето на ES19L. Сепак, msL2 (моментално анотиран како хипотетички протеин ECU06_1135) и msL1 имаат различно структурно и еволутивно потекло. c Ова откритие за генерирање на еволутивно неповрзани msL1 и msL2 рибозомални протеини сугерира дека ако рибозомите акумулираат штетни мутации во нивната rRNA, тие можат да постигнат невидени нивоа на композициска разновидност дури и кај мала подгрупа на тесно поврзани видови. Ова откритие би можело да помогне во разјаснувањето на потеклото и еволуцијата на митохондријалниот рибозом, кој е познат по својата високо намалена rRNA и абнормална варијабилност во составот на протеините кај различните видови.
Потоа го споредивме протеинот msL2 со претходно опишаниот протеин msL1, единствениот познат рибозомален протеин специфичен за микроспоридии кој се наоѓа во рибозомот на V. necatrix. Сакавме да тестираме дали msL1 и msL2 се еволутивно поврзани. Нашата анализа покажа дека msL1 и msL2 ја зафаќаат истата празнина во рибозомалната структура, но имаат различни примарни и терцијарни структури, што укажува на нивното независно еволутивно потекло (Сл. 6). Така, нашето откритие на msL2 дава доказ дека групите компактни еукариотски видови можат независно да развиваат структурно различни рибозомални протеини за да компензираат за губењето на фрагментите од rRNA. Ова откритие е значајно по тоа што повеќето цитоплазматски еукариотски рибозоми содржат инваријантен протеин, вклучувајќи го и истото семејство од 81 рибозомални протеини. Појавата на msL1 и msL2 во различни клади на микроспоридии како одговор на губењето на проширените сегменти на rRNA сугерира дека деградацијата на молекуларната архитектура на паразитот предизвикува паразитите да бараат компензаторни мутации, што на крајот може да доведе до нивно стекнување во различни популации на паразити.
Конечно, кога нашиот модел беше завршен, го споредивме составот на рибозомот на E. cuniculi со оној предвиден од секвенцата на геномот. Претходно се сметаше дека неколку рибозомални протеини, вклучувајќи ги eL14, eL38, eL41 и eS30, недостасуваат од геномот на E. cuniculi поради очигледното отсуство на нивните хомолози од геномот на E. cuniculi. Губење на многу рибозомални протеини е предвидено и кај повеќето други високо редуцирани интрацелуларни паразити и ендосимбионти. На пример, иако повеќето бактерии што живеат слободно содржат исто семејство од 54 рибозомални протеини, само 11 од овие протеински семејства имаат детектабилни хомолози во секој анализиран геном на бактерии ограничени од домаќинот. Во поддршка на оваа идеја, експериментално е забележано губење на рибозомални протеини кај микроспоридиите на V. necatrix и P. locustae, на кои им недостасуваат протеините eL38 и eL4131,32.
Сепак, нашите структури покажуваат дека само eL38, eL41 и eS30 се всушност изгубени во рибозомот на E. cuniculi. Протеинот eL14 беше конзервиран и нашата структура покажа зошто овој протеин не можеше да се најде во пребарувањето за хомологија (Сл. 7). Во рибозомите на E. cuniculi, поголемиот дел од местото на врзување на eL14 е изгубено поради деградација на ES39L засилен со rRNA. Во отсуство на ES39L, eL14 го изгуби поголемиот дел од својата секундарна структура, а само 18% од секвенцата на eL14 беше идентична кај E. cuniculi и S. cerevisiae. Ова слабо зачувување на секвенцата е извонредно бидејќи дури и Saccharomyces cerevisiae и Homo sapiens - организми кои еволуирале во период од 1,5 милијарди години - делат повеќе од 51% од истите остатоци во eL14. Ова аномално губење на конзервацијата објаснува зошто E. cuniculi eL14 моментално е анотиран како претпоставен протеин M970_061160, а не како рибозомален протеин eL1427.
и Рибозомот на Microsporidia го изгубил продолжението на ES39L rRNA, што делумно го елиминирало местото за врзување на рибозомалниот протеин eL14. Во отсуство на ES39L, протеинот на микроспори eL14 претрпува губење на секундарната структура, во која поранешната α-хеликс што се врзува за rRNA дегенерира во јамка со минимална должина. б Повеќекратното усогласување на секвенците покажува дека протеинот eL14 е високо конзервиран кај еукариотските видови (57% идентичност на секвенцата помеѓу квасните и човечките хомолози), но слабо конзервиран и дивергентен кај микроспоридиите (кај кои не повеќе од 24% од остатоците се идентични со хомологот на eL14). од S. cerevisiae или H. sapiens). Оваа слаба конзервација на секвенцата и варијабилноста на секундарната структура објаснува зошто хомологот на eL14 никогаш не е пронајден кај E. cuniculi и зошто се смета дека овој протеин е изгубен кај E. cuniculi. Спротивно на тоа, E. cuniculi eL14 претходно беше анотиран како претпоставен протеин M970_061160. Ова набљудување сугерира дека разновидноста на геномот на микроспоридиите во моментов е преценета: некои гени за кои во моментов се смета дека се изгубени во микроспоридиите всушност се зачувани, иако во високо диференцирани форми; наместо тоа, се смета дека некои кодираат гени на микроспоридиите за протеини специфични за црвите (на пр., хипотетичкиот протеин M970_061160) всушност кодира за многу разновидните протеини што се наоѓаат во други еукариоти.
Ова откритие сугерира дека денатурацијата на rRNA може да доведе до драматично губење на зачувувањето на секвенцата во соседните рибозомални протеини, правејќи ги овие протеини неоткриени за пребарувања на хомологија. Така, можеме да го прецениме вистинскиот степен на молекуларна деградација кај организмите со мал геном, бидејќи некои протеини за кои се смета дека се изгубени всушност перзистираат, иако во многу изменети форми.
Како паразитите можат да ја задржат функцијата на своите молекуларни машини во услови на екстремна редукција на геномот? Нашето истражување одговара на ова прашање со опишување на сложената молекуларна структура (рибозом) на E. cuniculi, организам со еден од најмалите еукариотски геноми.
Веќе речиси две децении е познато дека молекулите на протеини и РНК кај микробните паразити често се разликуваат од нивните хомологни молекули кај слободноживеачките видови бидејќи им недостасуваат центри за контрола на квалитетот, се намалени на 50% од нивната големина кај слободноживеачките микроби итн., многу ослабувачки мутации кои го нарушуваат преклопувањето и функцијата. На пример, се очекува дека рибозомите на организмите со мал геном, вклучувајќи многу интрацелуларни паразити и ендосимбионти, немаат неколку рибозомални протеини и до една третина од rRNA нуклеотидите во споредба со слободноживеачките видови 27, 29, 30, 49. Сепак, начинот на кој овие молекули функционираат кај паразитот останува во голема мера мистерија, проучувана главно преку компаративна геномика.
Нашата студија покажува дека структурата на макромолекулите може да открие многу аспекти на еволуцијата кои е тешко да се извлечат од традиционалните компаративни геномски студии на интрацелуларни паразити и други организми ограничени од домаќинот (Дополнителна слика 7). На пример, примерот со протеинот eL14 покажува дека можеме да го прецениме вистинскиот степен на деградација на молекуларниот апарат кај паразитските видови. Сега се верува дека енцефалитичните паразити имаат стотици гени специфични за микроспоридиите. Сепак, нашите резултати покажуваат дека некои од овие навидум специфични гени се всушност само многу различни варијанти на гени кои се вообичаени кај другите еукариоти. Покрај тоа, примерот со протеинот msL2 покажува како ги занемаруваме новите рибозомални протеини и ја потценуваме содржината на паразитските молекуларни машини. Примерот со мали молекули покажува како можеме да ги занемариме најгенијалните иновации во паразитските молекуларни структури кои можат да им дадат нова биолошка активност.
Земени заедно, овие резултати го подобруваат нашето разбирање на разликите помеѓу молекуларните структури на организмите ограничени од домаќинот и нивните еквиваленти кај слободноживите организми. Покажуваме дека молекуларните машини, за кои долго време се сметаше дека се редуцирани, дегенерираат и се подложни на разни исцрпувачки мутации, наместо тоа имаат збир на систематски занемарени необични структурни карактеристики.
Од друга страна, не-гломазните фрагменти од rRNA и споените фрагменти што ги пронајдовме во рибозомите на E. cuniculi сугерираат дека редукцијата на геномот може да ги промени дури и оние делови од основната молекуларна машинерија што се зачувани во трите домени на животот - по речиси 3,5 милијарди години. независна еволуција на видовите.
Фрагментите од rRNA без испакнатини и споени во рибозомите на E. cuniculi се од особен интерес во светлината на претходните студии за молекули на РНК кај ендосимбиотски бактерии. На пример, кај ендосимбионтот Buchnera aphidicola, е покажано дека молекулите на rRNA и tRNA имаат структури чувствителни на температура поради пристрасност на составот A+T и висок процент на неканонски базни парови20,50. Сега се смета дека овие промени во РНК, како и промените во протеинските молекули, се одговорни за прекумерната зависност на ендосимбионтите од партнерите и неможноста на ендосимбионтите да пренесуваат топлина21, 23. Иако паразитската rRNA на микроспоридиите има структурно различни промени, природата на овие промени сугерира дека намалената термичка стабилност и поголемата зависност од шаперонските протеини може да бидат вообичаени карактеристики на молекулите на РНК кај организми со намалени геноми.
Од друга страна, нашите структури покажуваат дека паразитските микроспоридии развиле единствена способност да се спротивстават на широко конзервираните rRNA и протеински фрагменти, развивајќи ја способноста да користат изобилни и лесно достапни мали метаболити како структурни имитации на дегенерираните rRNA и протеински фрагменти. Деградација на молекуларната структура. . Ова мислење е поткрепено со фактот дека малите молекули кои го компензираат губењето на протеинските фрагменти во rRNA и рибозомите на E. cuniculi се врзуваат за остатоци специфични за микроспоридиите во протеините uL15 и eL30. Ова сугерира дека врзувањето на малите молекули за рибозомите може да биде производ на позитивна селекција, во која специфичните мутации за микроспоридиите во рибозомалните протеини се избрани поради нивната способност да го зголемат афинитетот на рибозомите за мали молекули, што може да доведе до поефикасни рибозомални организми. Откритието открива паметна иновација во молекуларната структура на микробните паразити и ни дава подобро разбирање за тоа како молекуларните структури на паразитите ја одржуваат својата функција и покрај редуктивната еволуција.
Во моментов, идентификацијата на овие мали молекули останува нејасна. Не е јасно зошто појавата на овие мали молекули во рибозомската структура се разликува помеѓу видовите микроспоридии. Особено, не е јасно зошто врзувањето на нуклеотиди се забележува во рибозомите на E. cuniculi и P. locustae, а не во рибозомите на V. necatrix, и покрај присуството на остатокот F170 во протеините eL20 и K172 на V. necatrix. Ова бришење може да биде предизвикано од остатокот 43 uL6 (лоциран веднаш до џебот за врзување на нуклеотиди), кој е тирозин во V. necatrix, а не треонин во E. cuniculi и P. locustae. Гломазниот ароматичен страничен ланец на Tyr43 може да се меша со врзувањето на нуклеотиди поради стерично преклопување. Алтернативно, очигледното бришење на нуклеотиди може да се должи на ниската резолуција на крио-ЕМ снимањето, што го попречува моделирањето на рибозомските фрагменти на V. necatrix.
Од друга страна, нашата работа сугерира дека процесот на распаѓање на геномот може да биде инвентивна сила. Особено, структурата на рибозомот на E. cuniculi сугерира дека губењето на rRNA и протеински фрагменти во рибозомот на микроспоридија создава еволутивен притисок што промовира промени во структурата на рибозомот. Овие варијанти се јавуваат далеку од активното место на рибозомот и се чини дека помагаат во одржувањето (или обновувањето) на оптималното склопување на рибозомот кое инаку би било нарушено од редуцираната rRNA. Ова сугерира дека голема иновација на рибозомот на микроспоридија се чини дека еволуирала во потреба за амортизирање на генскиот дрифт.
Можеби ова најдобро е илустрирано со врзувањето на нуклеотиди, кое досега никогаш не е забележано кај други организми. Фактот дека остатоците од врзувањето на нуклеотиди се присутни кај типичните микроспоридии, но не и кај другите еукариоти, сугерира дека местата за врзување на нуклеотиди не се само реликвии што чекаат да исчезнат или конечното место за рРНК да се врати во форма на поединечни нуклеотиди. Наместо тоа, ова место изгледа како корисна карактеристика што можела да еволуира во текот на неколку рунди на позитивна селекција. Местата за врзување на нуклеотиди може да бидат нуспроизвод на природната селекција: откако ES39L ќе се деградира, микроспоридиите се принудени да бараат компензација за да ја вратат оптималната биогенеза на рибозомите во отсуство на ES39L. Бидејќи овој нуклеотид може да ги имитира молекуларните контакти на нуклеотидот A3186 во ES39L, молекулата на нуклеотид станува градежен блок на рибозомот, чие врзување е дополнително подобрено со мутација на секвенцата eL30.
Во однос на молекуларната еволуција на интрацелуларните паразити, нашата студија покажува дека силите на дарвинистичката природна селекција и генетскиот дрифт на распаѓањето на геномот не дејствуваат паралелно, туку осцилираат. Прво, генетскиот дрифт елиминира важни карактеристики на биомолекулите, што ја прави компензацијата неопходна. Само кога паразитите ќе ја задоволат оваа потреба преку дарвинистичката природна селекција, нивните макромолекули ќе имаат шанса да ги развијат своите најимпресивни и иновативни особини. Важно е да се напомене дека еволуцијата на местата за врзување на нуклеотиди во рибозомот на E. cuniculi сугерира дека овој модел на молекуларна еволуција од типот „губење кон добивка“ не само што ги амортизира штетните мутации, туку понекогаш им дава и сосема нови функции на паразитските макромолекули.
Оваа идеја е во согласност со теоријата за подвижна рамнотежа на Севел Рајт, која наведува дека строг систем на природна селекција ја ограничува способноста на организмите за иновации51,52,53. Меѓутоа, ако генетскиот дрифт ја наруши природната селекција, овие дрифтови можат да предизвикаат промени кои сами по себе не се адаптивни (или дури и штетни), туку водат до понатамошни промени кои обезбедуваат поголема кондиција или нова биолошка активност. Нашата рамка ја поддржува оваа идеја со илустрирање дека истиот тип на мутација што го намалува превиткувањето и функцијата на биомолекулата се чини дека е главниот поттик за нејзино подобрување. Во согласност со еволутивниот модел „win-win“, нашата студија покажува дека распаѓањето на геномот, традиционално сметано за дегенеративен процес, е исто така главен двигател на иновациите, понекогаш, а можеби дури и често, дозволувајќи им на макромолекулите да стекнат нови паразитски активности.