Ви благодариме што ја посетивте Nature.com.Верзијата на прелистувачот што ја користите има ограничена поддршка за CSS.За најдобро искуство, препорачуваме да користите ажуриран прелистувач (или да го оневозможите режимот на компатибилност во Internet Explorer).Во меѓувреме, за да обезбедиме континуирана поддршка, ќе ја направиме страницата без стилови и JavaScript.
Еволуцијата на микробиолошките паразити вклучува контраакција помеѓу природната селекција, која предизвикува подобрување на паразитите и генетскиот нанос, што предизвикува паразитите да губат гени и да акумулираат штетни мутации.Овде, со цел да разбереме како се случува оваа контраакција на скалата на една макромолекула, ја опишуваме крио-ЕМ структурата на рибозомот на Encephalitozoon cuniculi, еукариотски организам со еден од најмалите геноми во природата.Екстремната редукција на rRNA во рибозомите на E. cuniculi е придружена со невидени структурни промени, како што е еволуцијата на претходно непознати споени rRNA поврзувачи и rRNA без испакнатини.Дополнително, рибозомот E. cuniculi ја преживеа загубата на фрагменти и протеини на rRNA со развивање на способноста да користи мали молекули како структурни мимики на деградираните rRNA фрагменти и протеини.Севкупно, покажуваме дека молекуларните структури за кои долго време се мислеше дека се намалени, дегенерирани и подложни на ослабувачки мутации имаат голем број на компензаторни механизми кои ги одржуваат активни и покрај екстремните молекуларни контракции.
Бидејќи повеќето групи на микробиолошки паразити имаат уникатни молекуларни алатки за да ги искористат своите домаќини, честопати мораме да развиеме различни терапевтски средства за различни групи паразити1,2.Сепак, новите докази сугерираат дека некои аспекти на еволуцијата на паразитите се конвергентни и во голема мера предвидливи, што укажува на потенцијална основа за широки терапевтски интервенции кај микробните паразити3,4,5,6,7,8,9.
Претходната работа идентификуваше заеднички еволутивен тренд кај микробните паразити наречен намалување на геномот или распаѓање на геномот10,11,12,13.Тековните истражувања покажуваат дека кога микроорганизмите се откажуваат од својот слободен начин на живот и стануваат интрацелуларни паразити (или ендосимбионти), нивните геноми подлежат на бавни, но неверојатни метаморфози во текот на милиони години9,11.Во процесот познат како распаѓање на геномот, микробните паразити акумулираат штетни мутации кои претвораат многу претходно важни гени во псевдогени, што доведува до постепено губење на гените и мутациски колапс14,15.Овој колапс може да уништи до 95% од гените во најстарите интрацелуларни организми во споредба со тесно поврзаните слободни видови.Така, еволуцијата на интрацелуларните паразити е влечење на војна помеѓу две спротивставени сили: дарвиновата природна селекција, што доведува до подобрување на паразитите и колапс на геномот, фрлајќи ги паразитите во заборав.Како паразитот успеал да се појави од ова влечење на војна и да ја задржи активноста на својата молекуларна структура останува нејасно.
Иако механизмот на распаѓање на геномот не е целосно разбран, се чини дека се јавува главно поради честите генетски наноси.Бидејќи паразитите живеат во мали, асексуални и генетски ограничени популации, тие не можат ефикасно да ги елиминираат штетните мутации кои понекогаш се случуваат за време на репликацијата на ДНК.Ова доведува до неповратна акумулација на штетни мутации и намалување на геномот на паразитот.Како резултат на тоа, паразитот не само што ги губи гените кои повеќе не се неопходни за неговиот опстанок во интрацелуларната средина.Неможноста на популациите на паразити ефикасно да ги елиминираат спорадичните штетни мутации предизвикува овие мутации да се акумулираат низ геномот, вклучувајќи ги и нивните најважни гени.
Голем дел од нашето сегашно разбирање за редукцијата на геномот се заснова исклучиво на споредби на геномските секвенци, со помалку внимание на промените во вистинските молекули кои извршуваат функции за одржување на домот и служат како потенцијални цели за лекови.Компаративните студии покажаа дека товарот на штетните интрацелуларни микробни мутации се чини дека ги предиспонира протеините и нуклеинските киселини да погрешно се преклопуваат и агрегираат, што ги прави позависни од друженикот и преосетливи на топлина19,20,21,22,23.Дополнително, различни паразити - независна еволуција понекогаш разделена со дури 2,5 милијарди години - доживеале слична загуба на центри за контрола на квалитетот во нивната синтеза на протеини5,6 и механизми за поправка на ДНК24.Сепак, малку е познато за влијанието на интрацелуларниот начин на живот врз сите други својства на клеточните макромолекули, вклучувајќи ја и молекуларната адаптација на зголемениот товар на штетни мутации.
Во оваа работа, со цел подобро да ја разбереме еволуцијата на протеините и нуклеинските киселини на интрацелуларните микроорганизми, ја утврдивме структурата на рибозомите на интрацелуларниот паразит Encephalitozoon cuniculi.E. cuniculi е организам сличен на габа кој припаѓа на група паразитски микроспориди кои имаат невообичаено мали еукариотски геноми и затоа се користат како организми модел за проучување на распаѓањето на геномот25,26,27,28,29,30.Неодамна, структурата на крио-ЕМ рибозомот беше одредена за умерено намалени геноми на Microsporidia, Paranosema locustae и Vairimorpha necatrix31,32 (~3,2 Mb геном).Овие структури сугерираат дека одредена загуба на засилување на rRNA се компензира со развој на нови контакти помеѓу соседните рибозомални протеини или со стекнување на нови msL131,32 рибозомални протеини.Видовите Encephalitozoon (геном ~ 2,5 милиони bp), заедно со нивниот најблизок роднина Ordospora, го демонстрираат крајниот степен на намалување на геномот кај еукариотите - тие имаат помалку од 2000 гени за кодирање на протеини, и се очекува дека нивните рибозоми не само што се лишени од РРНК експанзија фрагменти (рРНК) и четири рибоукарјонски протеински фрагменти (rRNA) s поради нивниот недостаток на хомолози во геномот на E. cuniculi26,27,28.Затоа, заклучивме дека рибозомот E. cuniculi може да открие претходно непознати стратегии за молекуларна адаптација на распаѓањето на геномот.
Нашата крио-ЕМ структура го претставува најмалиот еукариотски цитоплазматски рибозом што треба да се карактеризира и дава увид во тоа како крајниот степен на намалување на геномот влијае на структурата, склопувањето и еволуцијата на молекуларната машинерија што е составен дел на клетката.Откривме дека рибозомот E. cuniculi прекршува многу од широко зачуваните принципи на склопување на РНК и склопување на рибозомите и откривме нов, претходно непознат рибозомски протеин.Сосема неочекувано, покажуваме дека рибозомите на микроспоридија еволуирале способност да ги врзуваат малите молекули и претпоставуваме дека скратувањата во rRNA и протеините предизвикуваат еволутивни иновации кои на крајот може да донесат корисни квалитети на рибозомот.
За да го подобриме нашето разбирање за еволуцијата на протеините и нуклеинските киселини во интрацелуларните организми, решивме да ги изолираме спорите на E. cuniculi од култури на заразени клетки на цицачи со цел да ги прочистиме нивните рибозоми и да ја одредиме структурата на овие рибозоми.Тешко е да се добие голем број паразитски микроспоридии бидејќи микроспоридиите не можат да се култивираат во хранлива средина.Наместо тоа, тие растат и се репродуцираат само внатре во клетката домаќин.Затоа, за да се добие биомаса на E. cuniculi за прочистување на рибозомот, ја инфициравме клеточната линија на бубрези на цицачи RK13 со спори на E. cuniculi и ги култивиравме овие инфицирани клетки неколку недели за да дозволиме E. cuniculi да расте и да се размножува.Користејќи заразен клеточен монослој од околу половина квадратен метар, успеавме да прочистиме околу 300 mg спори на Microsporidia и да ги искористиме за изолирање на рибозомите.Потоа ги прекинавме прочистените спори со стаклени зрна и ги изолиравме суровите рибозоми користејќи постепено фракционирање на полиетилен гликол на лизатите.Ова ни овозможи да добиеме приближно 300 µg сурови E. cuniculi рибозоми за структурна анализа.
Потоа собравме крио-ЕМ слики користејќи ги добиените примероци на рибозом и ги обработивме овие слики користејќи маски што одговараат на големата рибозомална подединица, главата на малата подединица и малата подединица.За време на овој процес, собравме слики од околу 108.000 рибозомални честички и пресметавме крио-ЕМ слики со резолуција од 2,7 Å (Дополнителни слики 1-3).Потоа користевме cryoEM слики за моделирање на rRNA, рибозомски протеин и фактор на хибернација Mdf1 поврзани со рибозомите на E. cuniculi (сл. 1а, б).
Структура на рибозомот E. cuniculi во комплекс со факторот на хибернација Mdf1 (pdb id 7QEP).б Карта на факторот на хибернација Mdf1 поврзан со рибозомот E. cuniculi.в Мапа на секундарна структура споредувајќи ја обновената rRNA кај микроспоридиските видови со познати рибозомални структури.Панелите ја покажуваат локацијата на засилените rRNA фрагменти (ES) и активните места на рибозомот, вклучувајќи го местото за декодирање (DC), јамката на сарциницин (SRL) и центарот на пептидил трансфераза (PTC).г Густината на електроните што одговара на центарот на пептидил трансферазата на рибозомот на E. cuniculi сугерира дека оваа каталитичка локација ја има истата структура во паразитот E. cuniculi и неговите домаќини, вклучувајќи го и H. sapiens.e, f Соодветната електронска густина на центарот за декодирање (д) и шематската структура на центарот за декодирање (f) укажуваат на тоа дека E. cuniculi има остатоци U1491 наместо A1491 (нумерирање на E. coli) кај многу други еукариоти.Оваа промена сугерира дека E. cuniculi може да биде чувствителна на антибиотици кои го таргетираат ова активно место.
За разлика од претходно воспоставените структури на рибозомите на V. necatrix и P. locustae (двете структури го претставуваат истото семејство на микроспориди Nosematidae и се многу слични едни на други), 31,32 рибозомите на E. cuniculi се подложени на бројни процеси на фрагментација на rRNA и протеини.Понатамошна денатурација (Дополнителни слики 4-6).Во rRNA, највпечатливите промени вклучуваа целосно губење на засилениот 25S rRNA фрагмент ES12L и делумна дегенерација на спиралите h39, h41 и H18 (сл. 1c, дополнителна слика 4).Меѓу рибозомалните протеини, највпечатливите промени вклучуваат целосно губење на протеинот eS30 и скратување на протеините eL8, eL13, eL18, eL22, eL29, eL40, uS3, uS9, uS14, uS17 и eS7 (Дополнителни слики 4, 5).
Така, екстремното намалување на геномите на видовите Encephalotozoon/Ordospora се рефлектира во нивната рибозомска структура: рибозомите на E. cuniculi доживуваат најдраматична загуба на содржина на протеини во еукариотските цитоплазматски рибозоми кои подлежат на структурна карактеризација, а тие ги немаат ни оние rRNA и протеински фрагменти кои се исто така широко распространети во доменот на животната средина.Структурата на рибозомот на E. cuniculi го обезбедува првиот молекуларен модел за овие промени и ги открива еволутивните настани кои биле занемарени и од компаративната геномика и од студиите за интрацелуларната биомолекуларна структура (Дополнителна слика 7).Подолу, го опишуваме секој од овие настани заедно со нивното веројатно еволутивно потекло и нивното потенцијално влијание врз функцијата на рибозомите.
Потоа откривме дека, покрај големите скратувања на rRNA, рибозомите на E. cuniculi имаат варијации на rRNA на едно од нивните активни места.Иако центарот на пептидил трансфераза на рибозомот E. cuniculi ја има истата структура како и другите еукариотски рибозоми (сл. 1г), центарот за декодирање се разликува поради варијацијата на секвенцата на нуклеотидот 1491 (нумерирање на E. coli, Сл. 1e, f).Оваа опсервација е важна бидејќи местото за декодирање на еукариотските рибозоми обично содржи остатоци G1408 и A1491 во споредба со остатоците од бактериски тип A1408 и G1491.Оваа варијација лежи во основата на различната чувствителност на бактериските и еукариотските рибозоми кон семејството на аминогликозиди на рибозомални антибиотици и други мали молекули кои го таргетираат местото на декодирање.На местото за декодирање на рибозомот E. cuniculi, остатокот A1491 беше заменет со U1491, потенцијално создавајќи уникатен поврзувачки интерфејс за малите молекули насочени кон ова активно место.Истата варијанта A14901 е присутна и во други микроспоридии како што се P. locustae и V. necatrix, што сугерира дека е широко распространета меѓу видовите микроспоридии (сл. 1f).
Бидејќи нашите примероци на рибозом на E. cuniculi беа изолирани од метаболички неактивни спори, ја тестиравме крио-ЕМ картата на E. cuniculi за претходно опишано врзување на рибозомот во услови на стрес или глад.Фактори на хибернација 31,32,36,37, 38. Ја поклопивме претходно воспоставената структура на рибозомот во хибернација со крио-ЕМ картата на рибозомот E. cuniculi.За приклучување, рибозомите на S. cerevisiae беа користени во комплекс со фактор на хибернација Stm138, рибозоми на скакулци во комплекс со фактор Lso232 и рибозоми V. necatrix во комплекс со фактори Mdf1 и Mdf231.Во исто време, ја најдовме густината на крио-ЕМ што одговара на факторот на одмор Mdf1.Слично на Mdf1 што се врзува за рибозомот V. necatrix, Mdf1 се врзува и за рибозомот E. cuniculi, каде што го блокира местото Е на рибозомот, веројатно помагајќи да се направат достапни рибозомите кога спорите на паразитот стануваат метаболички неактивни при деактивирање на телото (Слика 2).).
Mdf1 го блокира местото Е на рибозомот, што се чини дека помага да се инактивира рибозомот кога спорите на паразитот стануваат метаболички неактивни.Во структурата на рибозомот E. cuniculi, откривме дека Mdf1 формира претходно непознат контакт со стеблото на рибозомот L1, дел од рибозомот што го олеснува ослободувањето на декацилирана tRNA од рибозомот за време на синтезата на протеините.Овие контакти сугерираат дека Mdf1 се дисоцира од рибозомот користејќи го истиот механизам како деацетилирана tRNA, обезбедувајќи можно објаснување за тоа како рибозомот го отстранува Mdf1 за да ја реактивира синтезата на протеините.
Сепак, нашата структура откри непознат контакт помеѓу Mdf1 и ногата на рибозомот L1 (делот од рибозомот што помага да се ослободи декацилирана tRNA од рибозомот за време на синтезата на протеините).Особено, Mdf1 ги користи истите контакти како и сегментот на лактот на деацилираната tRNA молекула (сл. 2).Ова претходно непознато молекуларно моделирање покажа дека Mdf1 се дисоцира од рибозомот користејќи го истиот механизам како деацетилирана tRNA, што објаснува како рибозомот го отстранува овој фактор на хибернација за да ја реактивира синтезата на протеините.
Кога го конструиравме моделот на rRNA, откривме дека рибозомот на E. cuniculi има ненормално превиткани фрагменти на rRNA, кои ги нарековме сплотена rRNA (сл. 3).Во рибозомите кои ги опфаќаат трите домени на животот, rRNA се преклопува во структури во кои повеќето бази на rRNA или се парат и се преклопуваат една со друга или комуницираат со рибозомалните протеини38,39,40.Меѓутоа, во рибозомите на E. cuniculi, се чини дека рРНК го прекршуваат овој принцип на превиткување со конвертирање на некои од нивните спирали во расклопени rRNA региони.
Структура на спиралата H18 25S rRNA во S. cerevisiae, V. necatrix и E. cuniculi.Вообичаено, во рибозомите што ги опфаќаат трите животни домени, овој поврзувач се намотува во РНК спирала која содржи 24 до 34 остатоци.Во Microsporidia, за разлика од тоа, овој rRNA поврзувач постепено се намалува на два едноверижни поврзувачи богати со уридин кои содржат само 12 остатоци.Повеќето од овие остатоци се изложени на растворувачи.Сликата покажува дека паразитските микроспориди се чини дека ги нарушуваат општите принципи на склопување на rRNA, каде што базите на rRNA обично се споени со други бази или се вклучени во интеракции на rRNA-протеин.Во микроспоридија, некои фрагменти на rRNA заземаат неповолно превиткување, во кое поранешната спирала на rRNA станува едножичен фрагмент издолжен речиси во права линија.Присуството на овие необични региони им овозможува на микроспоридијата rRNA да ги врзува далечните РРНК фрагменти користејќи минимален број РНК бази.
Највпечатлив пример за оваа еволутивна транзиција може да се забележи во спиралата H18 25S rRNA (сл. 3).Кај видовите од E. coli до луѓето, базите на оваа спирала rRNA содржат 24-32 нуклеотиди, формирајќи малку неправилна спирала.Во претходно идентификуваните рибозомални структури од V. necatrix и P. locustae,31,32 базите на спиралата H18 се делумно незавиткани, но спарувањето на нуклеотидните бази е зачувано.Меѓутоа, во E. cuniculi овој rRNA фрагмент станува најкратки поврзувачи 228UUUGU232 и 301UUUUUUUUUU307.За разлика од типичните РРНК фрагменти, овие поврзувачи богати со уридин не се намотуваат или остваруваат екстензивен контакт со рибозомалните протеини.Наместо тоа, тие прифаќаат структури отворени за растворувачи и целосно расклопени структури во кои нишките на rRNA се испружени речиси директно.Оваа развлечена конформација објаснува како E. cuniculi користи само 12 РНК бази за да ја пополни празнината од 33 Å помеѓу H16 и H18 rRNA спиралите, додека на другите видови им треба најмалку двојно повеќе бази на rRNA за да ја пополнат празнината.
Така, можеме да покажеме дека, преку енергетски неповолно превиткување, паразитските микроспориди развија стратегија за контракција дури и на оние сегменти на rRNA кои остануваат широко зачувани кај видовите во трите домени на животот.Очигледно, со акумулирање на мутации кои ги трансформираат спиралите на rRNA во кратки поли-U поврзувачи, E. cuniculi може да формира необични фрагменти на rRNA кои содржат што е можно помалку нуклеотиди за лигатура на дисталните rRNA фрагменти.Ова помага да се објасни како микроспоридиите постигнале драматично намалување на нивната основна молекуларна структура без губење на нивниот структурен и функционален интегритет.
Друга необична карактеристика на E. cuniculi rRNA е појавата на rRNA без згуснување (сл. 4).Испакнатините се нуклеотиди без базни парови кои се извиткуваат надвор од спиралата на РНК наместо да се кријат во неа.Повеќето испакнатини на rRNA делуваат како молекуларни лепила, помагајќи да се врзат соседните рибозомални протеини или други фрагменти на rRNA.Некои од испакнатините делуваат како шарки, дозволувајќи ѝ на rRNA спиралата да се флексира и преклопува оптимално за продуктивна синтеза на протеини 41 .
a Протрузија на rRNA (нумерација на S. cerevisiae) е отсутна во структурата на рибозомот на E. cuniculi, но присутна кај повеќето други еукариоти b E. coli, S. cerevisiae, H. sapiens и E. cuniculi внатрешните рибозоми.на паразитите им недостасуваат многу од античките, високо конзервирани испакнатини на rRNA.Овие згуснувања ја стабилизираат структурата на рибозомот;затоа, нивното отсуство во микроспоридиите укажува на намалена стабилност на склопување на rRNA кај паразитите на микроспоридиите.Споредбата со стеблата P (L7/L12 стебла кај бактериите) покажува дека губењето на испакнатините на rRNA понекогаш се совпаѓа со појавата на нови испакнатини покрај изгубените испакнатини.Спиралата H42 во 23S/28S rRNA има древна испакнатост (U1206 во Saccharomyces cerevisiae) која се проценува дека е стара најмалку 3,5 милијарди години поради нејзината заштита во три домени на животот.Во микроспоридија, оваа испакнатост е елиминирана.Меѓутоа, до изгубената испакнатина се појави нова испакнатост (A1306 во E. cuniculi).
Зачудувачки, откривме дека на рибозомите на E. cuniculi им недостасуваат поголемиот дел од рРНК испакнатините пронајдени кај другите видови, вклучително и повеќе од 30 испакнатини конзервирани кај другите еукариоти (сл. 4а).Оваа загуба елиминира многу контакти помеѓу рибозомалните подединици и соседните спирали на rRNA, понекогаш создавајќи големи шупливи празнини во рибозомот, правејќи го рибозомот E. cuniculi попорозен во споредба со повеќе традиционални рибозоми (сл. 4б).Имено, откривме дека повеќето од овие испакнатини се исто така изгубени во претходно идентификуваните рибозомски структури на V. necatrix и P. locustae, кои беа занемарени од претходните структурни анализи31,32.
Понекогаш губењето на испакнатините на rRNA е придружено со развој на нови испакнатини веднаш до изгубената испакнатост.На пример, рибозомалното Р-стебло содржи испакнатост U1208 (во Saccharomyces cerevisiae) која преживеала од E. coli до луѓето и затоа се проценува дека е стара 3,5 милијарди години.За време на синтезата на протеините, ова испакнување му помага на стеблото P да се движи помеѓу отворените и затворените конформации, така што рибозомот може да регрутира фактори на превод и да ги достави до активното место.Кај E. cuniculi рибозомите, ова задебелување е отсутно;сепак, новото задебелување (G883) лоцирано само во три базни парови може да придонесе за враќање на оптималната флексибилност на стеблото P (сл. 4в).
Нашите податоци за rRNA без испакнатини сугерираат дека минимизирањето на rRNA не е ограничено на губење на елементите на rRNA на површината на рибозомот, туку може да го вклучи и јадрото на рибозомот, создавајќи паразит специфичен молекуларен дефект кој не е опишан во слободните клетки.се забележуваат живи видови.
По моделирањето на канонските рибозомални протеини и rRNA, откривме дека конвенционалните рибозомални компоненти не можат да ги објаснат трите дела на крио-ЕМ сликата.Два од овие фрагменти се со мали молекули по големина (Сл. 5, Дополнителна слика 8).Првиот сегмент е сместен во сендвич помеѓу рибозомалните протеини uL15 и eL18 во позиција обично окупирана од C-крајот на eL18, кој е скратен во E. cuniculi.Иако не можеме да го одредиме идентитетот на оваа молекула, големината и обликот на овој остров со густина се добро објаснети со присуството на молекули на спермидин.Нејзиното врзување за рибозомот е стабилизирано со мутации специфични за микроспоридиите во протеините uL15 (Asp51 и Arg56), кои се чини дека го зголемуваат афинитетот на рибозомот за оваа мала молекула, бидејќи овозможуваат uL15 да ја обвитка малата молекула во рибозомска структура.Дополнителна слика 2).8, дополнителни податоци 1, 2).
Cryo-EM снимката покажува присуство на нуклеотиди надвор од рибозата врзани за рибозомот E. cuniculi.Во рибозомот E. cuniculi, овој нуклеотид го зазема истото место како нуклеотидот 25S rRNA A3186 (нумерирање на Saccharomyces cerevisiae) во повеќето други еукариотски рибозоми.b Во рибозомалната структура на E. cuniculi, овој нуклеотид се наоѓа помеѓу рибозомалните протеини uL9 и eL20, со што се стабилизира контактот помеѓу двата протеини.cd eL20 анализа на зачувување на секвенцата меѓу видовите микроспоридии.Филогенетското стебло на видовите Microsporidia (c) и порамнувањето на повеќекратните секвенци на протеинот eL20 (d) покажуваат дека остатоците кои се врзуваат за нуклеотиди F170 и K172 се зачувани во повеќето типични Microsporidia, со исклучок на S. lophii, со исклучок на раната разгранета Microsporidia, која ES3 ја задржала екстензијата на rRNA.д Оваа слика покажува дека остатоците кои врзуваат нуклеотид F170 и K172 се присутни само во eL20 од високо редуцираниот геном на микроспоридија, но не и кај другите еукариоти.Севкупно, овие податоци сугерираат дека рибозомите на Микроспоридија развиле место за врзување на нуклеотид што изгледа дека ги врзува молекулите на AMP и ги користи за стабилизирање на протеинско-протеинските интеракции во рибозомалната структура.Високата конзервација на оваа сврзувачка локација во Microsporidia и нејзиното отсуство кај другите еукариоти сугерира дека оваа локација може да обезбеди селективна предност за преживување за Microsporidia.Така, џебот за врзување на нуклеотидот во рибозомот на микроспоридиите не се чини дека е дегенерирана карактеристика или крајна форма на деградација на rRNA како што беше претходно опишано, туку корисна еволутивна иновација која му овозможува на рибозомот на микроспоридија директно да ги врзува малите молекули, користејќи ги како молекуларни градежни блокови.градежни блокови за рибозоми.Ова откритие го прави рибозомот на микроспоридија единствениот рибозом за кој е познато дека користи еден нуклеотид како свој структурен градежен блок.ѓ Хипотетички еволутивен пат изведен од нуклеотидно врзување.
Втората густина со мала молекуларна тежина се наоѓа на интерфејсот помеѓу рибозомалните протеини uL9 и eL30 (сл. 5а).Овој интерфејс беше претходно опишан во структурата на рибозомот на Saccharomyces cerevisiae како место за врзување за 25S нуклеотидот на rRNA A3186 (дел од екстензијата ES39L rRNA)38.Се покажа дека во дегенерираните рибозоми на P. locustae ES39L, овој интерфејс врзува непознат единечен нуклеотид 31, и се претпоставува дека овој нуклеотид е редуцирана финална форма на rRNA, во која должината на rRNA е ~130-230 бази.ES39L се редуцира на еден нуклеотид 32.43.Нашите крио-ЕМ слики ја поддржуваат идејата дека густината може да се објасни со нуклеотиди.Сепак, повисоката резолуција на нашата структура покажа дека овој нуклеотид е екстрарибозомална молекула, можеби AMP (сл. 5а, б).
Потоа прашавме дали местото за врзување на нуклеотидите се појавило во рибозомот на E. cuniculi или постоело претходно.Бидејќи врзувањето на нуклеотидите главно е посредувано од остатоците Phe170 и Lys172 во рибозомниот протеин eL30, ја проценивме зачувувањето на овие остатоци во 4396 репрезентативни еукариоти.Како и во случајот со uL15 погоре, откривме дека остатоците Phe170 и Lys172 се високо конзервирани само кај типичните микроспоридии, но отсутни кај другите еукариоти, вклучувајќи ги атипичните Microsporidia Mitosporidium и Amphiamblys, во кои ES39L rRNA фрагмент не е намален (45,44, Сл. 44,6).-д).
Земени заедно, овие податоци ја поддржуваат идејата дека E. cuniculi и веројатно другите канонски микроспориди ја развиле способноста за ефикасно зафаќање на голем број мали метаболити во структурата на рибозомот за да се компензира падот на нивоата на rRNA и протеини.Притоа, тие развиле уникатна способност да ги врзуваат нуклеотидите надвор од рибозомот, што покажува дека паразитските молекуларни структури компензираат со заробување на изобилство мали метаболити и користење како структурни мимики на деградирани РНК и протеински фрагменти..
Третиот несимулиран дел од нашата крио-ЕМ карта, пронајден во големата рибозомална подединица.Релативно високата резолуција (2,6 Å) на нашата карта сугерира дека оваа густина припаѓа на протеини со уникатни комбинации на остатоци од големи странични ланци, што ни овозможи да ја идентификуваме оваа густина како претходно непознат рибозомален протеин што го идентификувавме како msL2 (Микроспоридија специфичен протеин L2) (методи, слика 6).Нашето пребарување за хомологија покажа дека msL2 е зачуван во кладата на Microsporidia од родот Encephaliter и Orosporidium, но отсутен кај другите видови, вклучително и другите Microsporidia.Во рибозомалната структура, msL2 зафаќа празнина формирана со губење на проширената ES31L rRNA.Во оваа празнина, msL2 помага да се стабилизира склопувањето на rRNA и може да ја компензира загубата на ES31L (Слика 6).
Електронска густина и модел на Microsporidia-специфичниот рибозомски протеин msL2 пронајден во рибозомите на E. cuniculi.b Повеќето еукариотски рибозоми, вклучувајќи го и рибозомот 80S на Saccharomyces cerevisiae, имаат изгубено засилување на ES19L rRNA кај повеќето микроспоридиски видови.Претходно воспоставената структура на рибозомот на V. necatrix microsporidia сугерира дека загубата на ES19L кај овие паразити се компензира со еволуцијата на новиот msL1 рибозомски протеин.Во оваа студија, откривме дека рибозомот E. cuniculi, исто така, разви дополнителен рибозомски РНК мимички протеин како очигледна компензација за загубата на ES19L.Сепак, msL2 (моментално означен како хипотетички протеин ECU06_1135) и msL1 имаат различно структурно и еволутивно потекло.c Ова откритие за генерирање на еволуциски неповрзани msL1 и msL2 рибозомални протеини сугерира дека ако рибозомите акумулираат штетни мутации во нивната rRNA, тие можат да постигнат невидени нивоа на разновидност на составот дури и во мала подгрупа на тесно поврзани видови.Ова откритие би можело да помогне да се разјасни потеклото и еволуцијата на митохондријалниот рибозом, кој е познат по својата високо намалена РРНК и абнормална варијабилност во составот на протеините кај видовите.
Потоа го споредивме протеинот msL2 со претходно опишаниот msL1 протеин, единствениот познат рибозомски протеин специфичен за микроспоридија пронајден во рибозомот V. necatrix.Сакавме да тестираме дали msL1 и msL2 се еволутивно поврзани.Нашата анализа покажа дека msL1 и msL2 зафаќаат иста празнина во рибозомалната структура, но имаат различни примарни и терциерни структури, што укажува на нивното независно еволутивно потекло (сл. 6).Така, нашето откритие на msL2 обезбедува доказ дека групите на компактни еукариотски видови можат независно да еволуираат структурно различни рибозомални протеини за да ја компензираат загубата на фрагменти на rRNA.Овој наод е забележлив по тоа што повеќето цитоплазматски еукариотски рибозоми содржат непроменлив протеин, вклучувајќи ја истата фамилија од 81 рибозомски протеин.Појавата на msL1 и msL2 во различни клади на микроспоридии како одговор на губењето на продолжените сегменти на rRNA сугерира дека деградацијата на молекуларната архитектура на паразитот предизвикува паразитите да бараат компензаторни мутации, што на крајот може да доведе до нивно стекнување во различни популации на паразити.структури.
Конечно, кога нашиот модел беше завршен, го споредивме составот на рибозомот E. cuniculi со оној предвиден од геномската секвенца.Неколку рибозомални протеини, вклучувајќи eL14, eL38, eL41 и eS30, претходно се сметаше дека недостасуваат во геномот на E. cuniculi поради очигледното отсуство на нивните хомолози од геномот на E. cuniculi.Губење на многу рибозомални протеини е предвидено и кај повеќето други високо редуцирани интрацелуларни паразити и ендосимбионти.На пример, иако повеќето слободни бактерии ја содржат истата фамилија од 54 рибозомални протеини, само 11 од овие фамилии на протеини имаат забележливи хомолози во секој анализиран геном на бактерии ограничени од домаќинот.Како поддршка на овој поим, загуба на рибозомални протеини е експериментално забележана кај V. necatrix и P. locustae microsporidia, на кои им недостасуваат протеините eL38 и eL4131,32.
Сепак, нашите структури покажуваат дека само eL38, eL41 и eS30 се всушност изгубени во рибозомот E. cuniculi.Протеинот eL14 беше зачуван и нашата структура покажа зошто овој протеин не може да се најде во пребарувањето за хомологија (сл. 7).Во рибозомите на E. cuniculi, најголемиот дел од местото за врзување eL14 е изгубено поради деградација на ES39L засилена со rRNA.Во отсуство на ES39L, eL14 изгуби поголем дел од својата секундарна структура, а само 18% од eL14 секвенцата беше идентична кај E. cuniculi и S. cerevisiae.Ова слабо зачувување на низата е извонредно затоа што дури и Saccharomyces cerevisiae и Homo sapiens - организми кои еволуирале на растојание од 1,5 милијарди години - споделуваат повеќе од 51% од истите остатоци во eL14.Оваа аномална загуба на конзервација објаснува зошто E. cuniculi eL14 во моментов е означена како наводен M970_061160 протеин, а не како eL1427 рибозомски протеин.
и рибозомот на Microsporidia го загуби екстензијата ES39L rRNA, која делумно го елиминираше местото за врзување на рибозомниот протеин eL14.Во отсуство на ES39L, протеинот на микроспорот eL14 претрпува губење на секундарната структура, во која поранешната α-спирала што се врзува за rRNA се дегенерира во јамка со минимална должина.б.од S. cerevisiae или H. sapiens).Оваа лоша зачувување на секвенцата и варијабилноста на секундарната структура објаснува зошто хомологот eL14 никогаш не бил пронајден во E. cuniculi и зошто се смета дека овој протеин е изгубен во E. cuniculi.Спротивно на тоа, E. cuniculi eL14 претходно беше означен како наводен M970_061160 протеин.Оваа опсервација сугерира дека разновидноста на геномот на микроспоридиите моментално е преценета: некои гени за кои моментално се смета дека се изгубени во микроспоридиите се всушност зачувани, иако во високо диференцирани форми;наместо тоа, се смета дека некои кодираат за гени на микроспоридија за протеини специфични за црви (на пример, хипотетичкиот протеин M970_061160) всушност кодираат за многу различните протеини кои се наоѓаат во другите еукариоти.
Ова откритие сугерира дека денатурацијата на rRNA може да доведе до драматично губење на зачувувањето на секвенцата во соседните рибозомални протеини, што ги прави овие протеини незабележливи за пребарување на хомологија.Така, можеме да го прецениме вистинскиот степен на молекуларна деградација кај малите геномски организми, бидејќи некои протеини за кои се смета дека се изгубени, всушност опстојуваат, иако во многу изменети форми.
Како паразитите можат да ја задржат функцијата на нивните молекуларни машини во услови на екстремно намалување на геномот?Нашата студија одговара на ова прашање со опишување на сложената молекуларна структура (рибозом) на E. cuniculi, организам со еден од најмалите еукариотски геноми.
Скоро две децении е познато дека молекулите на протеинот и РНК во микробиолошките паразити често се разликуваат од нивните хомологни молекули кај слободните видови затоа што немаат центри за контрола на квалитетот, се намалени до 50% од нивната големина кај микробите кои живеат слободно, итн.многу исцрпувачки мутации кои го нарушуваат превиткувањето и функционирањето.На пример, на рибозомите на малите геномски организми, вклучително и многу интрацелуларни паразити и ендосимбионти, се очекува да им недостасуваат неколку рибозомални протеини и до една третина од нуклеотидите на rRNA во споредба со слободните видови 27, 29, 30, 49. Сепак, начинот на кој овие молекули функционираат во моите геномски паразити останува во голема мера.
Нашата студија покажува дека структурата на макромолекулите може да открие многу аспекти на еволуцијата кои е тешко да се извлечат од традиционалните компаративни геномски студии на интрацелуларните паразити и други организми ограничени од домаќинот (Дополнителна слика 7).На пример, примерот на протеинот eL14 покажува дека можеме да го прецениме вистинскиот степен на деградација на молекуларниот апарат кај паразитските видови.Сега се верува дека енцефалитичните паразити имаат стотици гени специфични за микроспоридија.Сепак, нашите резултати покажуваат дека некои од овие навидум специфични гени се всушност многу различни варијанти на гени кои се вообичаени кај другите еукариоти.Покрај тоа, примерот на протеинот msL2 покажува како ги занемаруваме новите рибозомални протеини и ја потценуваме содржината на паразитските молекуларни машини.Примерот на малите молекули покажува како можеме да ги занемариме најгенијалните иновации во паразитските молекуларни структури кои можат да им дадат нова биолошка активност.
Земени заедно, овие резултати го подобруваат нашето разбирање за разликите помеѓу молекуларните структури на организмите ограничени од домаќинот и нивните колеги во слободните организми.Покажуваме дека молекуларните машини, за кои долго време се мислеше дека се редуцирани, дегенерирани и подложни на разни ослабувачки мутации, наместо тоа имаат збир на систематски занемарени необични структурни карактеристики.
Од друга страна, необемните rRNA фрагменти и споените фрагменти што ги најдовме во рибозомите на E. cuniculi сугерираат дека редукцијата на геномот може да ги промени дури и оние делови од основната молекуларна машинерија што се зачувани во трите домени на животот - по речиси 3,5 милијарди години.независна еволуција на видовите.
Фрагментите без испакнатини и сплотени rRNA во рибозомите на E. cuniculi се од особен интерес во светлината на претходните студии за молекулите на РНК во ендосимбиотските бактерии.На пример, кај ендосимбионтот на вошката вошка Buchnera aphidicola, молекулите на rRNA и tRNA се покажаа дека имаат температурно чувствителни структури поради пристрасноста на составот на А+Т и високата пропорција на не-канонски базни парови20,50.Овие промени во РНК, како и промените во протеинските молекули, сега се смета дека се одговорни за прекумерната зависност на ендосимбионите од партнерите и неможноста на ендосимбионите да пренесуваат топлина 21, 23 .Иако паразитската микроспоридија rRNA има структурно различни промени, природата на овие промени сугерира дека намалената термичка стабилност и поголемата зависност од протеините на шаперон може да бидат заеднички карактеристики на молекулите на РНК кај организмите со намалени геноми.
Од друга страна, нашите структури покажуваат дека паразитските микроспоридии развиле уникатна способност да се спротивстават на широко конзервираните РРНК и протеински фрагменти, развивајќи ја способноста да користат изобилни и лесно достапни мали метаболити како структурни мимики на дегенерирани РРНК и протеински фрагменти.Деградација на молекуларната структура..Ова мислење е поддржано од фактот дека малите молекули кои ја компензираат загубата на протеински фрагменти во rRNA и рибозомите на E. cuniculi се врзуваат за специфичните остатоци за микроспоридија во протеините uL15 и eL30.Ова сугерира дека врзувањето на малите молекули со рибозомите може да биде производ на позитивна селекција, во која се избрани мутации специфични за Микроспоридија во рибозомалните протеини поради нивната способност да го зголемат афинитетот на рибозомите за мали молекули, што може да доведе до поефикасни рибозомални организми.Откритието открива паметна иновација во молекуларната структура на микробните паразити и ни дава подобро разбирање за тоа како паразитските молекуларни структури ја одржуваат својата функција и покрај редуктивната еволуција.
Во моментов, идентификацијата на овие мали молекули останува нејасна.Не е јасно зошто појавата на овие мали молекули во рибозомалната структура се разликува помеѓу видовите микроспоридии.Особено, не е јасно зошто врзувањето на нуклеотидите е забележано во рибозомите на E. cuniculi и P. locustae, а не во рибозомите на V. necatrix, и покрај присуството на остатокот од F170 во протеините eL20 и K172 на V. necatrix.Ова бришење може да биде предизвикано од остаток 43 uL6 (лоциран во непосредна близина на џебот за врзување на нуклеотидите), кој е тирозин во V. necatrix, а не треонин во E. cuniculi и P. locustae.Крупниот ароматичен страничен синџир на Tyr43 може да се меша со врзувањето на нуклеотидите поради стерично преклопување.Алтернативно, очигледното бришење на нуклеотид може да се должи на ниската резолуција на крио-ЕМ снимката, што го попречува моделирањето на рибозомалните фрагменти на V. necatrix.
Од друга страна, нашата работа сугерира дека процесот на распаѓање на геномот може да биде инвентивна сила.Конкретно, структурата на рибозомот E. cuniculi сугерира дека губењето на rRNA и протеинските фрагменти во рибозомот на микроспоридија создава еволутивен притисок кој промовира промени во структурата на рибозомот.Овие варијанти се појавуваат далеку од активното место на рибозомот и се чини дека помагаат во одржување (или обновување) на оптималниот состав на рибозомот кој инаку би бил нарушен со намалена rRNA.Ова сугерира дека голема иновација на рибозомот на микроспоридиите се чини дека еволуирала во потреба да се тампонира генетскиот дрифт.
Можеби ова најдобро се илустрира со врзувањето на нуклеотидите, кое досега никогаш не било забележано кај други организми.Фактот дека нуклеотидните врзувачки остатоци се присутни во типичните микроспоридии, но не и кај другите еукариоти, сугерира дека местата за врзување на нуклеотидите не се само реликвии кои чекаат да исчезнат, или конечното место за рРНК да се врати во форма на поединечни нуклеотиди.Наместо тоа, оваа страница изгледа како корисна карактеристика што можела да еволуира во текот на неколку круга на позитивна селекција.Местата за врзување на нуклеотидите може да бидат нуспроизвод на природната селекција: штом ES39L ќе се разгради, микроспоридиите се принудени да бараат компензација за да ја вратат оптималната биогенеза на рибозомот во отсуство на ES39L.Бидејќи овој нуклеотид може да ги имитира молекуларните контакти на нуклеотидот A3186 во ES39L, нуклеотидната молекула станува градежен блок на рибозомот, чие поврзување дополнително се подобрува со мутација на секвенцата eL30.
Во однос на молекуларната еволуција на интрацелуларните паразити, нашата студија покажува дека силите на дарвиновата природна селекција и генетскиот нанос на распаѓањето на геномот не функционираат паралелно, туку осцилираат.Прво, генетскиот нанос ги елиминира важните карактеристики на биомолекулите, со што компензацијата е многу потребна.Само кога паразитите ќе ја задоволат оваа потреба преку дарвиновата природна селекција, нивните макромолекули ќе имаат шанса да ги развијат своите најимпресивни и иновативни особини.Поважно е тоа што еволуцијата на местата за врзување на нуклеотидите во рибозомот на E. cuniculi сугерира дека овој модел на молекуларна еволуција од загуба до добивка не само што ги амортизира штетните мутации, туку понекогаш им дава сосема нови функции на паразитските макромолекули.
Оваа идеја е во согласност со теоријата за подвижна рамнотежа на Севел Рајт, која вели дека строгиот систем на природна селекција ја ограничува способноста на организмите да иновираат51,52,53.Меѓутоа, ако генетскиот наноси ја нарушува природната селекција, овие наноси може да произведат промени кои сами по себе не се адаптивни (или дури и штетни), туку водат до понатамошни промени кои обезбедуваат поголема кондиција или нова биолошка активност.Нашата рамка ја поддржува оваа идеја илустрирајќи дека истиот тип на мутација што го намалува наборот и функцијата на биомолекулата се чини дека е главниот поттикнувач за нејзино подобрување.Во согласност со победничкиот еволутивен модел, нашата студија покажува дека распаѓањето на геномот, традиционално гледано како дегенеративен процес, е исто така главен двигател на иновациите, понекогаш, а можеби дури и често дозволувајќи им на макромолекулите да стекнат нови паразитски активности.можат да ги користат.