Ви благодариме што ја посетивте Nature.com.Користите верзија на прелистувач со ограничена поддршка за CSS.За најдобро искуство, препорачуваме да користите ажуриран прелистувач (или да го оневозможите режимот на компатибилност во Internet Explorer).Покрај тоа, за да обезбедиме постојана поддршка, ја прикажуваме страницата без стилови и JavaScript.
Прикажува рингишпил од три слајдови одеднаш.Користете ги копчињата Previous и Next за да се движите низ три слајдови истовремено или користете ги копчињата за лизгање на крајот за да се движите низ три слајдови истовремено.
Крво-мозочната бариера и крвно-мозочната бариера ги спречуваат биотерапевтските агенси да стигнат до нивните цели во централниот нервен систем, а со тоа го попречуваат ефективно лекување на невролошки заболувања.За да откриеме нови мозочни транспортери in vivo, воведовме библиотека на пептиди на Т7 фаг и сериски собравме крв и цереброспинална течност (CSF) користејќи канулиран свесен модел на голем базен на стаорци.Специфични клонови на фаг беа високо збогатени во CSF по четири круга на селекција.Тестирањето на индивидуалните кандидати пептиди откри повеќе од 1000 пати збогатување во CSF.Биоактивноста на испораката до мозокот со посредство на пептид беше потврдена со 40% намалување на нивото на амилоид-β во цереброспиналната течност со користење на BACE1 пептид инхибитор поврзан со идентификуваниот нов транзитен пептид.Овие резултати сугерираат дека пептидите идентификувани со in vivo методите на селекција на фагот може да бидат корисни средства за системско доставување на макромолекули до мозокот со терапевтски ефект.
Истражувањето за насочена терапија на централниот нервен систем (ЦНС) во голема мера се фокусираше на идентификување на оптимизирани лекови и агенси кои покажуваат својства на таргетирање на ЦНС, со помал напор за откривање на механизмите што ја поттикнуваат активната испорака на лекови до мозокот.Ова почнува да се менува сега бидејќи испораката на лекови, особено големите молекули, е составен дел од современиот развој на лекови за невронаука.Околината на централниот нервен систем е добро заштитена со цереброваскуларниот бариерен систем, кој се состои од крвно-мозочната бариера (BBB) ​​и крвно-мозочната бариера (BCBB)1, што го прави предизвик да се доставува лекови до мозокот1,2.Се проценува дека скоро сите лекови со големи молекули и повеќе од 98% од лековите со мали молекули се елиминираат од мозокот3.Затоа е многу важно да се идентификуваат нови системи за транспорт на мозокот кои обезбедуваат ефикасна и специфична испорака на терапевтски лекови до ЦНС 4,5.Сепак, BBB и BCSFB, исто така, претставуваат одлична можност за испорака на лекови бидејќи тие продираат и влегуваат во сите структури на мозокот преку неговата екстензивна васкулатура.Така, сегашните напори за користење на неинвазивни методи за испорака до мозокот во голема мера се засноваат на механизмот на транспорт посредуван од рецепторот (PMT) со користење на ендогениот BBB6 рецептор.И покрај неодамнешните клучни достигнувања со користење на патеката на рецепторите на трансферин7,8, потребен е понатамошен развој на нови системи за испорака со подобрени својства.За таа цел, нашата цел беше да ги идентификуваме пептидите способни да посредуваат во транспортот на цереброспиналната течност, бидејќи тие во принцип би можеле да се користат за доставување макромолекули до ЦНС или за отворање на нови рецепторни патишта.Особено, специфичните рецептори и транспортери на цереброваскуларниот систем (BBB и BSCFB) можат да послужат како потенцијални цели за активно и специфично доставување на биотерапевтски лекови.Цереброспиналната течност (CSF) е секреторен производ на хориоидниот плексус (CS) и е во директен контакт со интерстицијалната течност на мозокот преку субарахноидалниот простор и вентрикуларниот простор4.Неодамна се покажа дека субарахноидалната цереброспинална течност прекумерно дифундира во интерстициумот на мозокот9.Се надеваме дека ќе пристапиме до паренхимниот простор користејќи го овој субарахноидален прилив тракт или директно преку БББ.За да го постигнеме ова, имплементиравме робусна in vivo стратегија за селекција на фаг која идеално ги идентификува пептидите транспортирани преку кој било од овие два различни патишта.
Сега опишуваме секвенцијален in vivo метод на скрининг при прикажување на фаги со земање примероци од CSF заедно со секвенционирање со висока пропусна моќ (HTS) за следење на првичните кругови на селекција со најголема библиотечна разновидност.Скринингот беше извршен на свесни стаорци со трајно вградена голема цистерна (CM) канила за да се избегне контаминација на крвта.Поважно, овој пристап избира и таргетирање на мозокот и пептиди со транспортна активност преку цереброваскуларната бариера.Ние користевме Т7 фаги поради нивната мала големина (~ 60 nm)10 и предложивме дека тие се погодни за транспорт на везикули кои овозможуваат трансцелуларно преминување на ендотелната и/или епителијално-медулата бариера.По четири рунди на панирање, популациите на фаг беа изолирани кои покажуваат силно ин виво збогатување на цереброспиналната течност и асоцијација на церебралните микросадови.Поважно, ние можевме да ги потврдиме нашите наоди со демонстрација дека преферираните и хемиски синтетизирани најдобри кандидати пептиди се способни да транспортираат протеински товар во цереброспиналната течност.Прво, фармакодинамските ефекти на ЦНС беа воспоставени со комбинирање на водечки транзитен пептид со инхибитор на BACE1 пептидот.Покрај демонстрирањето дека ин виво функционалните скрининг стратегии можат да ги идентификуваат новите мозочни транспортни пептиди како ефективни носители на протеински товар, очекуваме слични пристапи за функционална селекција исто така да станат важни во идентификувањето на новите патишта за транспорт на мозокот.
Врз основа на единиците за формирање на наслаги (PFU), по чекорот на пакување на фагот, беше дизајнирана и создадена библиотека од случајни 12-мерни линеарни Т7 пептиди на фаг со разновидност од приближно 109 (види Материјали и методи).Важно е да се напомене дека внимателно ја анализиравме оваа библиотека пред панирањето во виво.PCR засилување на примероци од библиотека на фаги со помош на модифицирани прајмери ​​генерираше ампликони кои беа директно применливи на HTS (Дополнителна слика 1а).Поради а) грешки во секвенционирањето на HTS11, б) влијание врз квалитетот на прајмерите (NNK) 1-12 и в) присуство на фаг од див (wt) (внеси на скелет) во библиотеката на подготвеност, беше спроведена процедура за филтрирање на секвенца за да се извлечат само проверени информации за секвенцата (Дополнителна 1b сл.).Овие чекори за филтрирање се однесуваат на сите библиотеки за секвенционирање на HTS.За стандардната библиотека, добиени се вкупно 233.868 читања, од кои 39% ги поминаа критериумите за филтрирање и беа искористени за анализа на библиотеката и избор за следните кругови (Дополнителна слика 1в–д).Читањата беа претежно множители на 3 базни парови во должина со врв на 36 нуклеотиди (Дополнителна слика 1в), потврдувајќи го дизајнот на библиотеката (ННК) 1-12.Забележително, приближно 11% од членовите на библиотеката содржеа 12-димензионален инсерт PAGISRELVDKL од див тип (wt) и речиси половина од секвенците (49%) содржеа вметнувања или бришења.HTS на библиотечната библиотека ја потврди големата разновидност на пептиди во библиотеката: повеќе од 81% од пептидните секвенци беа пронајдени само еднаш и само 1,5% се појавија во ≥4 копии (Дополнителна слика 2а).Фреквенциите на амино киселините (аа) на сите 12 позиции во репертоарот добро корелираат со фреквенциите што се очекуваат за бројот на кодони генерирани од дегенерираниот репертоар NKK (Дополнителна слика 2б).Набљудуваната фреквенција на остатоците од аа кодирани од овие инсерти добро корелираше со пресметаната фреквенција (r = 0,893) (Дополнителна слика 2в).Подготовката на фаг библиотеки за инјектирање ги вклучува чекорите на засилување и отстранување на ендотоксинот.Претходно се покажа дека ова потенцијално ја намалува разновидноста на библиотеките на фаги12,13.Затоа, секвенциониравме фаг библиотека засилена со плоча која беше подложена на отстранување на ендотоксин и ја споредивме со оригиналната библиотека за да ја процениме фреквенцијата на АА.Беше забележана силна корелација (r = 0,995) помеѓу оригиналниот базен и засилениот и прочистениот базен (Дополнителна слика 2г), што покажува дека конкуренцијата помеѓу клоновите засилени на плочите со користење на T7 фагот не предизвика голема пристрасност.Оваа споредба се заснова на фреквенцијата на трипептидните мотиви во секоја библиотека, бидејќи разновидноста на библиотеките (~ 109) не може целосно да се долови дури и со HTS.Фреквентната анализа на аа на секоја позиција откри мала пристрасност зависна од позицијата во последните три позиции од внесениот репертоар (Дополнителна слика 2д).Како заклучок, заклучивме дека квалитетот и разновидноста на библиотеката се прифатливи и забележани се само мали промени во различноста поради засилување и подготовка на библиотеки на фаги помеѓу неколку кругови на селекција.
Сериското земање примероци од цереброспиналната течност може да се изврши со хируршко имплантирање на канила во CM на свесни стаорци за да се олесни идентификацијата на Т7 фагот инјектиран интравенски (iv) преку BBB и/или BCSFB (сл. 1a-b).Користивме две независни краци за селекција (рацете А и Б) во првите три круга на in vivo селекција (сл. 1в).Постепено ја зголемувавме строгоста на селекцијата со намалување на вкупната количина на фаг воведен во првите три круга на селекција.За четвртиот круг на панирање, комбиниравме примероци од гранките А и Б и извршивме три дополнителни независни селекции.За да се проучат ин виво својствата на честичките на фагот Т7 во овој модел, фаг од див тип (главен инсерт PAGISRELVDKL) беше инјектиран во стаорци преку вената на опашката.Враќањето на фагите од цереброспиналната течност и крвта во различни временски точки покажа дека релативно малите Т7 икозаедрални фаги имаат брза почетна фаза на клиренс од одделот за крв (Дополнителна слика 3).Врз основа на администрираните титри и волуменот на крвта на стаорците, пресметавме дека само приближно 1% wt.фаг од администрираната доза е откриен во крвта 10 минути по интравенска инјекција.По овој првичен брз пад, беше измерен побавен примарен клиренс со полуживот од 27,7 минути.Поважно, само многу малку фаги беа извадени од одделот на цереброспиналната течност, што укажува на ниска позадина за миграција на фагот од див тип во одделот на цереброспиналната течност (Дополнителна слика 3).Во просек, само околу 1 x 10-3% титри од T7 фагот во крвта и 4 x 10-8% од првично инфузираните фаги беа откриени во цереброспиналната течност во текот на целиот период на земање мостри (0-250 мин).Имено, полуживотот (25,7 мин) на фагот од див тип во цереброспиналната течност беше сличен на оној забележан во крвта.Овие податоци покажуваат дека бариерата што го одвојува одделот за цереброспинална течност од крвта е недопрена кај стаорци канулирани со CM, што овозможува in vivo избор на библиотеки на фаги да ги идентификува клоновите кои лесно се транспортираат од крвта во одделот за цереброспинална течност.
(а) Поставување метод за повторно земање примероци од цереброспиналната течност (CSF) од голем базен.(б) Дијаграм што ја прикажува клеточната локација на бариерата на централниот нервен систем (ЦНС) и стратегијата за селекција што се користи за да се идентификуваат пептидите што ја преминуваат крвно-мозочната бариера (БББ) и крвно-мозочната бариера.(в) Табела за скрининг на приказ на фаг ин виво.Во секој круг на селекција, фагите (идентификатори на животните во стрелките) беа инјектирани интравенски.Две независни алтернативни гранки (А, Б) се чуваат посебно до 4-тиот круг на селекција.За круговите на селекција 3 и 4, секој клон на фаг извлечен од CSF беше рачно секвенциониран.(г) Кинетика на фагот изолиран од крв (црвени кругови) и цереброспинална течност (зелени триаголници) за време на првиот круг на селекција кај два канулирани стаорци по интравенска инјекција на библиотеката со пептиди Т7 (2 x 1012 фаги/животно).Сините квадрати ја означуваат просечната почетна концентрација на фаг во крвта, пресметана од количината на инјектираниот фаг, земајќи го предвид вкупниот волумен на крв.Црните квадрати ја означуваат точката на пресек на линијата y екстраполирана од концентрациите на крвните фаги.(д, ѓ) Презентирајте ја релативната фреквенција и дистрибуција на сите можни преклопувачки трипептидни мотиви пронајдени во пептидот.Прикажан е бројот на мотиви пронајдени во 1000 читања.Значајно (p <0,001) збогатените мотиви се означени со црвени точки.(д) Скатер на корелација што ја споредува релативната фреквенција на трипептидниот мотив на инјектираната библиотека со фаг добиен од крв од животни #1.1 и #1.2.(ѓ) Скатер на корелација што ги споредува релативните фреквенции на трипептидните мотиви на животински фаг #1.1 и #1.2 изолирани во крвта и цереброспиналната течност.(g, h) Претставување на ID на секвенца на фаг збогатен со крв (g) наспроти инјектираните библиотеки и фаг збогатен со CSF (h) наспроти крв по круг на in vivo селекција кај двете животни.Големината на кодот со една буква покажува колку често таа аминокиселина се појавува на таа позиција.Зелена = поларна, виолетова = неутрална, сина = основна, црвена = кисела и црна = хидрофобни амино киселини.Слика 1а, б е дизајнирана и произведена од Едуард Урих.
Инјектиравме библиотека на фаг пептиди во два CM инструмент стаорци (клади А и Б) и изолиравме фаг од цереброспиналната течност и крв (Слика 1г).Почетното брзо чистење на библиотеката беше помалку изразено во споредба со фагот од див тип.Просечниот полуживот на инјектираната библиотека кај двете животни беше 24,8 минути во крвта, слично на фагот од див тип и 38,5 минути во CSF.Примероците на фагот на крв и цереброспинална течност од секое животно беа подложени на HTS и сите идентификувани пептиди беа анализирани за присуство на краток трипептиден мотив.Трипептидните мотиви беа избрани затоа што обезбедуваат минимална основа за формирање структура и интеракции на пептид-протеин14,15.Најдовме добра корелација во дистрибуцијата на мотивите помеѓу инјектираната фагна библиотека и клоновите извлечени од крвта на двете животни (сл. 1д).Податоците укажуваат дека составот на библиотеката е само маргинално збогатен во одделот за крв.Фреквенциите на аминокиселините и консензусните секвенци беа дополнително анализирани на секоја позиција користејќи адаптација на софтверот Weblogo16.Интересно, најдовме силно збогатување со остатоци од глицин во крвта (сл. 1g).Кога крвта беше споредена со клонови избрани од цереброспиналната течност, забележана е силна селекција и одредено отселектирање на мотивите (сл. 1f), а одредени амино киселини беа преференцијално присутни на однапред одредени позиции во 12-члената (сл. 1h).Имено, поединечните животни значително се разликуваа во цереброспиналната течност, додека збогатувањето на глицинот во крвта беше забележано кај двете животни (Дополнителна слика 4а-ј).По строго филтрирање на податоците за низата во цереброспиналната течност на животните #1.1 и #1.2, добиени се вкупно 964 и 420 уникатни 12-мерни пептиди (Дополнителна слика 1d-e).Изолираните клонови на фагот беа засилени и подложени на втор круг на in vivo селекција.Фагите извлечени од вториот круг на селекција беа подложени на HTS кај секое животно и сите идентификувани пептиди беа искористени како влез во програмата за препознавање мотив за да се анализира појавата на трипептидни мотиви (сл. 2a, b, ef).Во споредба со првиот циклус на фагот обновен од CSF, забележавме понатамошен избор и деселекција на многу мотиви во CSF во гранките А и Б (сл. 2).Беше применет алгоритам за идентификација на мрежата за да се утврди дали тие претставуваат различни модели на конзистентна низа.Беше забележана јасна сличност помеѓу 12-димензионалните секвенци обновени од CSF во алтернативната клада А (слика 2c, d) и кладата B (сл. 2g, h).Здружената анализа во секоја гранка откри различни профили на селекција за 12-мер пептиди (Дополнителна слика 5c,d) и зголемување на односот CSF/титарот на крвта со текот на времето за здружени клонови по вториот круг на селекција во споредба со првиот круг на селекција (Дополнителна слика 5e).).
Збогатување на мотиви и пептиди во цереброспиналната течност со два последователни круга на избор на функционален приказ на фаг in vivo.
Сите фаги на цереброспиналната течност обновени од првиот круг на секое животно (животни #1.1 и #1.2) беа здружени, засилени, HT-секвенционирани и повторно инјектирани заедно (2 x 1010 фаги/животно) 2 SM канулирани стаорци (#1.1 → #).2.1 и 2.2, 1.2 → 2.3 и 2.4).(а, б, е, ѓ) Корелација расејување споредувајќи ја релативната фреквенција на трипептидните мотиви на сите фаги добиени од CSF во првиот и вториот круг на селекција.Релативна фреквенција и дистрибуција на мотиви кои ги претставуваат сите можни трипептиди кои се преклопуваат пронајдени во пептидите во двете ориентации.Прикажан е бројот на мотиви пронајдени во 1000 читања.Мотивите кои беа значително (p <0,001) избрани или исклучени во една од споредените библиотеки се означени со црвени точки.(c, d, g, h) Претставување на логото на секвенцата на сите долги секвенци со 12 аминокиселини богати со CSF врз основа на кругови 2 и 1 од in vivo селекција.Големината на кодот со една буква покажува колку често таа аминокиселина се појавува на таа позиција.За да се прикаже логото, се споредува фреквенцијата на секвенците на CSF извлечени од поединечни животни помеѓу два круга на селекција и се прикажани збогатените секвенци во вториот круг: (в) #1.1–#2.1 (г) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 и (ж) #1.2–#2.4.Најзбогатените аминокиселини на дадена позиција кај (в, г) животните бр.2.1 и бр.2.2 или (g, h) кај животни бр.2.3 и бр.2.4 се прикажани во боја.Зелена = поларна, виолетова = неутрална, сина = основна, црвена = кисела и црна = хидрофобни амино киселини.
По третиот круг на селекција, идентификувавме 124 уникатни пептидни секвенци (#3.1 и #3.2) од 332 клонови на фаг реконституирани со CSF изолирани од две животни (Дополнителна слика 6а).Низата LGSVS (18,7%) имаше највисока релативна пропорција, проследена со инсертите од див тип PAGISRELVDKL (8,2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2,2%) и SARGSWREIVSLS (2,2%).Во последниот четврти круг, здруживме две независно избрани гранки од три посебни животни (сл. 1в).Од 925 секвенционирани фагни клонови обновени од цереброспиналната течност, во четвртиот круг најдовме 64 уникатни пептидни секвенци (Дополнителна слика 6б), меѓу кои релативната пропорција на фаг од див тип падна на 0,8%.Најчести клонови на цереброспиналната течност во четвртиот круг беа LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3.6%), РСССВСДЛС (3.6%) и 3.6%).%)).Опсегот на должина на избраните пептиди се должи на вметнувања/бришења на нуклеотиди или предвремени стоп-кодони во библиотечните прајмери ​​кога се користат дегенерирани кодони за дизајн на библиотеката NNK.Кодоните за предвремено стопирање генерираат пократки пептиди и се избрани затоа што го содржат поволниот мотив aa.Подолги пептиди може да произлезат од вметнувања/бришења во прајмерите на синтетичките библиотеки.Ова го позиционира дизајнираниот стоп-кодон надвор од рамката и го чита додека не се појави нов стоп-кодон низводно.Генерално, ги пресметавме факторите на збогатување за сите четири круга на селекција со споредување на влезните податоци со излезните податоци од примерокот.За првиот круг на скрининг, користевме титри на фаг од див тип како неспецифична референца во позадина.Интересно, негативниот избор на фаг беше многу силен во првиот циклус на цереброспиналната течност, но не и во крвта (сл. 3а), што може да се должи на малата веројатност за пасивна дифузија на повеќето членови на пептидната библиотека во одделот на цереброспиналната течност или релативните фаги имаат тенденција да бидат поефикасно задржани или отстранети од крвотокот отколку бактериофагите.Меѓутоа, во вториот круг на панирање, забележан е силен избор на фаги во цереброспиналната течност кај двата клада, што сугерира дека претходниот круг бил збогатен со фаги кои прикажуваат пептиди кои промовираат навлегување на цереброспиналната течност (сл. 3а).Повторно, без значително збогатување на крвта.Исто така во третиот и четвртиот круг, клоновите на фагот беа значително збогатени со цереброспинална течност.Споредувајќи ја релативната фреквенција на секоја единствена пептидна секвенца помеѓу последните два круга на селекција, откривме дека секвенците беа уште повеќе збогатени во четвртиот круг на селекција (сл. 3б).Вкупно 931 трипептидни мотиви беа извлечени од сите 64 уникатни пептидни секвенци користејќи ги двете пептидни ориентации.Најзбогатените мотиви во четвртиот круг беа повнимателно испитани за нивните профили на збогатување во сите кругови во споредба со инјектираната библиотека (пресечен: 10% збогатување) (Дополнителна слика 6в).Општите обрасци на селекција покажаа дека повеќето од проучуваните мотиви беа збогатени во сите претходни кругови на двете селекциони гранки.Сепак, некои мотиви (на пр. SGL, VSG, LGS GSV) беа претежно од алтернативниот клад А, додека други (на пр. FGW, RTN, WGF, NTR) беа збогатени со алтернативната клада Б.
Валидација на транспортот на цереброспиналната течност на цереброспиналната течност збогатена со фаг-прикажани пептиди и биотинилирани водечки пептиди конјугирани со носивост на стрептавидин.
(а) Односите на збогатување пресметани во сите четири круга (R1-R4) врз основа на инјектираните (влез = I) титри на фагот (PFU) и утврдените титри на CSF фагот (излез = O).Факторите на збогатување за последните три рунди (R2-R4) беа пресметани со споредба со претходниот круг и првиот круг (R1) со податоци за тежината.Отворените шипки се цереброспинална течност, засенчените шипки се плазма.(***p<0,001, врз основа на Студентскиот t-тест).(б) Список на најзастапените фагни пептиди, рангирани според нивната релативна пропорција со сите фаги собрани во цереброспиналната течност по 4-тиот круг на селекција.Шесте најчести клонови на фагот се означени во боја, нумерирани и нивните фактори на збогатување помеѓу круговите 3 и 4 од селекцијата (внеси).(в, г) Шесте најзбогатени фагни клонови, празни библиотеки на фаг и родителски пептиди на фаг од кругот 4 беа анализирани поединечно во модел на земање примероци на CSF.Примероците на цереброспиналната течност и крвта беа собрани во наведените временски точки.(в) Еднакви количества од 6 кандидатски клонови на фагот (2 x 1010 фаги/животни), празни фаги (#1779) (2 x 1010 фаги/животни) и библиотеки со залихи на пептиди на фаги (2 x 1012 фаги/животни) Инјектирајте најмалку 3 CM за да се минимизира животното за да се минимизира опашката.Прикажана е фармакокинетиката на цереброспиналната течност на секој инјектиран клон на фаг и библиотека на пептиди на фаг со текот на времето.(г) го покажува просечниот сооднос CSF/крв за сите обновени фаги/mL во текот на времето на земање мостри.(д) Четири синтетички водечки пептиди и една измешана контрола беа поврзани со биотин со стрептавидин преку нивниот N-терминал (тетрамер приказ) проследено со инјектирање (опашка вена iv, 10 mg стрептавидин/kg).Најмалку три интубирани стаорци (N = 3).).Примероците на цереброспиналната течност беа собрани во наведените временски точки и концентрациите на стрептавидин беа измерени со анти-стрептавидин ELISA на CSF (nd = не е откриен).(*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, врз основа на ANOVA тест).(ѓ) Споредба на амино киселинската секвенца на најзбогатениот фаг пептиден клон #2002 (виолетова) со други избрани клонови на пептид на фаг од 4-от круг на селекција.Идентични и слични фрагменти од амино киселини се кодирани во боја.
Од сите збогатени фаги во четвртиот круг (сл. 3б), беа избрани шест кандидатски клонови за понатамошна индивидуална анализа во моделот за земање примероци на CSF.Еднакви количества од шест кандидатски фази, празни фагни библиотеки (без вметнување) и профаг пептиди беа инјектирани во три канулирани CM животни, а фармакокинетиката беше одредена во анализите на цереброспиналната течност (сл. 3в) и крвта (Дополнителна слика 7).Сите тестирани клонови на фаг го таргетираа одделот на цереброспиналната течност на ниво 10-1000 пати повисоко од оној на празниот контролен фаг (#1779).На пример, клоновите #2020 и #2077 имале околу 1000 пати повисоки титри на CSF од контролниот фаг.Фармакокинетскиот профил на секој одбран пептид е различен, но сите од нив имаат висока способност за враќање на CSF.Забележавме постојано намалување со текот на времето за клоновите #1903 и #2011, додека за клоновите #2077, #2002 и #2009 зголемувањето во текот на првите 10 минути може да укажува на активен транспорт, но треба да се потврди.Клоновите #2020, #2002 и #2077 се стабилизираа на високи нивоа, додека концентрацијата на CSF на клонот #2009 полека се намалуваше по првичното зголемување.Потоа ја споредивме релативната фреквенција на секој кандидат за CSF со неговата концентрација во крвта (сл. 3г).Корелацијата на средниот титар на секој кандидат за CSF со неговиот титар на крв во сите времиња на земање примероци покажа дека три од шесте кандидати биле значително збогатени со крв CSF.Интересно, клонот #2077 покажа поголема стабилност на крвта (Дополнителна слика 7).За да потврдиме дека самите пептиди се способни активно да транспортираат товар освен честичките на фагот во одделот на цереброспиналната течност, синтетизиравме четири водечки пептиди дериватизирани со биотин на N-крајот каде што пептидите се прикачуваат на честичката на фагот.Биотинилирани пептиди (бр. 2002, 2009, 2020 и 2077) беа конјугирани со стрептавидин (SA) за да се добијат мултимерни форми кои донекаде ја имитираат геометријата на фагот.Овој формат, исто така, ни овозможи да ја измериме изложеноста на SA во крвта и цереброспиналната течност како протеински пептиди кои транспортираат товар.Поважно, податоците од фагот често може да се репродуцираат кога синтетичките пептиди се администрираат во овој формат конјугиран со SA (сл. 3д).Измешаните пептиди имаа помала почетна изложеност и побрзо клиренс на цереброспиналната течност со незабележливи нивоа во рок од 48 часа.За да се добие увид во патеките на испорака на овие клонови на пептидни фаги во просторот на цереброспиналната течност, ја анализиравме локализацијата на поединечни хитови на пептиди на фаг користејќи имунохистохемија (IHC) за директно откривање на честички на фагот 1 час по интравенска инјекција in vivo.Имено, клоновите #2002, #2077 и #2009 може да се детектираат со силно боење во мозочните капилари, додека контролниот фаг (#1779) и клонот #2020 не беа откриени (Дополнителна слика 8).Ова сугерира дека овие пептиди придонесуваат за ефектот врз мозокот токму со преминување на BBB.Потребна е понатамошна детална анализа за да се тестира оваа хипотеза, бидејќи може да биде вклучена и рутата BSCFB.При споредување на амино киселинската секвенца на најзбогатениот клон (#2002) со други избрани пептиди, беше забележано дека некои од нив имаат слични продолжетоци на аминокиселини, што може да укаже на сличен транспортен механизам (сл. 3f).
Поради неговиот уникатен плазма профил и значително зголемување на цереброспиналната течност со текот на времето, клонот на приказ на фаг #2077 беше дополнително истражен во подолг период од 48 часа и беше во можност да го репродуцира брзото зголемување на цереброспиналната течност забележано во врска со одржливите нивоа на SA (сл. 4а).Во однос на другите идентификувани клонови на фагот, #2077 беше силно обоен за мозочните капилари и покажа значајна колокализација со капиларен маркер лектин кога се гледаше со повисока резолуција и евентуално некое боење во паренхимниот простор (Слика 4б).За да истражиме дали може да се добијат фармаколошки ефекти посредувани од пептиди во ЦНС, извршивме експеримент во кој биотинилираните верзии на i) транзитниот пептид #2077 и ii) пептидот на инхибиторот BACE1 беа измешани со SA во два различни соодноси.За едната комбинација користевме само BACE1 пептид инхибитор, а за другата користевме сооднос 1:3 на BACE1 пептид инхибитор до пептид #2077.Двата примероци беа администрирани интравенски и со текот на времето беа мерени нивоата на бета-амилоид пептид 40 (Абета40) во крвта и цереброспиналната течност.Абета40 беше измерен во цереброспиналната течност бидејќи ја одразува BACE1 инхибицијата во мозочниот паренхим.Како што се очекуваше, двата комплекса значително ги намалија нивоата на Абета40 во крвта (сл. 4в, г).Сепак, само примероците што содржат мешавина од пептид бр.2077 и инхибитор на BACE1 пептидот конјугиран со SA предизвика значително намалување на Abeta40 во цереброспиналната течност (сл. 4в).Податоците покажуваат дека пептидот бр.2077 е способен да го транспортира протеинот SA од 60 kDa во ЦНС и исто така индуцира фармаколошки ефекти со SA-конјугирани инхибитори на BACE1 пептидот.
(а) Клонална инјекција (2 × 10 фаги/животно) на T7 фаг што покажува долгорочни фармакокинетски профили на CSF пептидот #2077 (RLSSVDSDLSGC) и неинјектиран контролен фаг (#1779) кај најмалку три CM-интубирани стаорци.(б) Конфокална микроскопска слика на репрезентативни кортикални микросадови кај стаорци инјектирани со фаг (2 × 10 10 фаги/животно) што покажува контрабоење на пептидот #2077 и садови (лектин).Овие клонови на фаг беа администрирани на 3 стаорци и оставени да циркулираат 1 час пред перфузијата.Мозоците беа пресечени и обоени со поликлонални FITC-означени антитела против капсидот на фагот Т7.Десет минути пред перфузијата и последователната фиксација, лектинот означен со DyLight594 беше администриран интравенски.Флуоресцентни слики кои покажуваат боење на лектин (црвено) на луминалната страна на микросадовите и фагите (зелено) во луменот на капиларите и периваскуларното мозочно ткиво.Лентата на скалата одговара на 10 µm.(в, г) Биотинилиран BACE1 инхибиторен пептид сам или во комбинација со биотинилиран транзитен пептид #2077 беше поврзан со стрептавидин проследен со интравенска инјекција на најмалку три канулирани CM стаорци (10 mg стрептавидин/kg).Намалувањето на Aβ40 посредувано од BACE1 пептидниот инхибитор беше измерено со Aβ1-40 ELISA во крвта (црвено) и цереброспиналната течност (портокалова) во наведените временски точки.За подобра јасност, исцртана линија со точки на графиконот на скала од 100%.(в) Процентуално намалување на Aβ40 во крвта (црвени триаголници) и цереброспиналната течност (портокалови триаголници) кај стаорци третирани со стрептавидин конјугиран со транзитен пептид #2077 и BACE1 инхибиторен пептид во сооднос 3:1.(г) Процентуално намалување на крвниот Aβ40 (црвени кругови) и цереброспиналната течност (портокалови кругови) кај стаорци третирани со стрептавидин поврзан само со BACE1 инхибиторен пептид.Концентрацијата на Aβ во контролата беше 420 pg/ml (стандардна девијација = 101 pg/ml).
Приказот на фаг е успешно применет во неколку области на биомедицински истражувања17.Овој метод е користен за in vivo студии за васкуларна разновидност18,19 како и за студии насочени кон церебралните садови20,21,22,23,24,25,26.Во оваа студија, ја проширивме примената на овој метод на селекција не само за директна идентификација на пептиди насочени кон церебралните садови, туку и за откривање на кандидати со активни транспортни својства да ја преминат крвно-мозочната бариера.Сега го опишуваме развојот на процедурата за селекција in vivo кај CM интубираните стаорци и го демонстрираме неговиот потенцијал да ги идентификува пептидите со својства на цереброспинална течност.Користејќи го T7 фагот кој прикажува библиотека од 12-мерни случајни пептиди, можевме да покажеме дека T7 фагот е доволно мал (приближно 60 nm во дијаметар)10 за да се прилагоди на крвно-мозочната бариера, со што директно ја преминува крвно-мозочната бариера или хориоидниот плексус.Забележавме дека бербата на CSF од канулирани CM стаорци беше добро контролирана in vivo функционална скрининг метода, и дека екстрахираниот фаг не само што се врзува за васкулатурата, туку и функционира како транспортер преку крвно-мозочната бариера.Понатаму, со истовремено собирање крв и примена на HTS на CSF и фаги добиени од крв, потврдивме дека нашиот избор на CSF не беше под влијание на збогатувањето на крвта или способноста за проширување помеѓу круговите на селекција.Сепак, одделот за крв е дел од процедурата за селекција, бидејќи фагите способни да стигнат до одделот на цереброспиналната течност мора да преживеат и да циркулираат во крвотокот доволно долго за да се збогатат во мозокот.Со цел да се извлечат сигурни информации за секвенцата од необработени податоци на HTS, имплементиравме филтри приспособени на грешки во секвенционирањето специфични за платформата во работниот тек на анализата.Со инкорпорирање на кинетичките параметри во методот на скрининг, ја потврдивме брзата фармакокинетика на дивиот тип Т7 фаги (t½ ~ 28 мин) во крвта24, 27, 28 и исто така го одредивме нивниот полуживот во цереброспиналната течност (t½ ~ 26 мин) во минута).И покрај сличните фармакокинетски профили во крвта и цереброспиналната течност, само 0,001% од концентрацијата на фагот во крвта може да се открие во цереброспиналната течност, што укажува на ниска позадинска подвижност на дивиот тип Т7 фаг преку крвно-мозочната бариера.Оваа работа ја нагласува важноста на првиот круг на селекција при користење на стратегии за панирање in vivo, особено за фагите системи кои брзо се отстрануваат од циркулацијата, бидејќи неколку клонови можат да стигнат до одделот на ЦНС.Така, во првиот круг, намалувањето на разновидноста на библиотеката беше многу големо, бидејќи само ограничен број на клонови на крајот беа собрани во овој многу строг модел на CSF.Оваа in vivo стратегија за панирање вклучуваше неколку чекори за селекција како што се активна акумулација во одделот на цереброспиналната течност, преживување на клонови во одделот за крв и брзо отстранување на клоновите на T7 фагот од крвта во првите 10 минути (сл. 1г и дополнителна слика 4М).).Така, по првиот круг, различни клонови на фаг беа идентификувани во цереброспиналната течност, иако истиот првичен базен беше користен за поединечни животни.Ова сугерира дека повеќекратните строги чекори за избор на изворни библиотеки со голем број членови на библиотеката резултираат со значително намалување на различноста.Затоа, случајните настани ќе станат составен дел од првичниот процес на селекција, што во голема мера ќе влијае на резултатот.Веројатно е дека многу од клоновите во оригиналната библиотека имале многу слична склоност кон збогатување на CSF.Сепак, дури и при исти експериментални услови, резултатите од селекцијата може да се разликуваат поради малиот број на секој конкретен клон во почетната група.
Мотивите збогатени со цереброспинална течност се разликуваат од оние во крвта.Интересно е што ја забележавме првата промена кон пептиди богати со глицин во крвта на поединечни животни.(Сл. 1g, Дополнителни Сл. 4e, 4f).Фагите што содржат глицин пептиди може да бидат постабилни и со помала веројатност да бидат извадени од циркулацијата.Сепак, овие пептиди богати со глицин не беа откриени во примероците на цереброспиналната течност, што сугерира дека курираните библиотеки поминале низ два различни чекори на селекција: еден во крвта и друг дозволен да се акумулира во цереброспиналната течност.Клоновите збогатени со CSF кои произлегуваат од четвртиот круг на селекција се опширно тестирани.Речиси сите индивидуално тестирани клонови беа потврдени дека се збогатени со CSF во споредба со бланко контролниот фаг.Еден пептид хит (#2077) беше испитан подетално.Тој покажа подолг полуживот во плазмата во споредба со другите хитови (слика 3г и дополнителна слика 7), а интересно е што овој пептид содржеше остаток на цистеин на Ц-крајот.Неодамна се покажа дека додавањето на цистеин во пептидите може да ги подобри нивните фармакокинетски својства со врзување за албумин 29.Ова во моментов е непознато за пептидот #2077 и бара дополнително проучување.Некои пептиди покажаа валентна зависност во збогатувањето на цереброспиналната течност (податоците не се прикажани), што може да биде поврзано со прикажаната површинска геометрија на капсидата Т7.Системот Т7 што го користевме покажа 5-15 копии од секој пептид по честичка на фагот.IHC беше изведен на кандидатски клонови на олово фаг инјектирани интравенски во церебралниот кортекс на стаорци (Дополнителна слика 8).Податоците покажаа дека најмалку три клонови (бр. 2002, бр. 2009 и бр. 2077) имале интеракција со БББ.Останува да се утврди дали оваа интеракција на BBB резултира со акумулација на CSF или движење на овие клонови директно до BCSFB.Поважно, покажуваме дека избраните пептиди го задржуваат транспортниот капацитет на CSF кога се синтетизираат и се врзуваат за товарот на протеини.Врзувањето на N-терминалните биотинилирани пептиди за SA суштински ги повторува резултатите добиени со нивните соодветни клонови на фагот во крвта и цереброспиналната течност (сл. 3e).Конечно, покажуваме дека оловниот пептид #2077 е способен да го промовира мозочното дејство на биотинилиран пептиден инхибитор на BACE1 конјугиран со SA, предизвикувајќи изразени фармакодинамски ефекти во ЦНС со значително намалување на нивоата на Абета40 во цереброспиналната течност (сл. 4).Не можевме да идентификуваме хомолози во базата на податоци со извршување на хомологија за пребарување на пептидна низа на сите хитови.Важно е да се напомене дека големината на библиотеката Т7 е приближно 109, додека теоретската големина на библиотеката за 12-мери е 4 x 1015. Затоа, избравме само мал дел од просторот за разновидност на библиотеката со 12-мерни пептиди, што може да значи дека повеќе оптимизирани пептиди може да се идентификуваат погодувајќи го просторот според evalusu.Хипотетички, една од причините зошто не најдовме никакви природни хомолози на овие пептиди може да биде деселекцијата за време на еволуцијата за да се спречи неконтролираното влегување на одредени пептидни мотиви во мозокот.
Земени заедно, нашите резултати даваат основа за идна работа за подетално идентификување и карактеризирање на транспортните системи на цереброваскуларната бариера in vivo.Основното поставување на овој метод се заснова на стратегија за функционална селекција која не само што идентификува клонови со церебрални васкуларни сврзувачки својства, туку вклучува и критичен чекор во кој успешните клонови имаат внатрешна активност да ги преминат биолошките бариери in vivo во одделот на ЦНС.е да се разјасни механизмот на транспорт на овие пептиди и нивната предност за врзување за микроваскулатурата специфична за регионот на мозокот.Ова може да доведе до откривање на нови патишта за транспорт на БББ и рецепторите.Очекуваме дека идентификуваните пептиди можат директно да се поврзат со цереброваскуларни рецептори или со циркулирачки лиганди транспортирани преку BBB или BCSFB.Пептидните вектори со транспортна активност на CSF откриени во оваа работа ќе бидат дополнително истражени.Во моментов ја истражуваме специфичноста на мозокот на овие пептиди за нивната способност да ги преминат BBB и/или BCSFB.Овие нови пептиди ќе бидат исклучително вредни алатки за потенцијално откривање на нови рецептори или патеки и за развој на нови високо ефикасни платформи за испорака на макромолекули, како што се биолошките средства, до мозокот.
Канилирајте ја големата цистерна (CM) користејќи модификација на претходно опишаниот метод.Анестезирани Wistar стаорци (200-350 g) беа монтирани на стереотаксичен апарат и беше направен средна засек над избричениот и асептично подготвен скалп за да се открие черепот.Дупчете две дупки во пределот на горниот појас и прицврстете ги завртките за прицврстување во дупките.Беше дупчена дополнителна дупка во страничниот окципитален гребен за стереотактички водење на канила од нерѓосувачки челик во CM.Нанесете дентален цемент околу канилата и прицврстете го со завртки.По фото-стврднувањето и стврднувањето на цементот, раната на кожата беше затворена со 4/0 супрамидна шиење.Правилното поставување на канилата се потврдува со спонтано истекување на цереброспиналната течност (CSF).Отстранете го стаорецот од стереотаксичниот апарат, добијте соодветна постоперативна нега и управување со болката и оставете го да закрепне најмалку една недела додека не се забележат знаци на крв во цереброспиналната течност.Вистар стаорци (Crl:WI/Han) се добиени од реката Чарлс (Франција).Сите стаорци беа чувани во специфични услови без патогени.Сите експерименти со животни беа одобрени од Ветеринарната канцеларија на градот Базел, Швајцарија и беа изведени во согласност со лиценцата за животни бр. 2474 (Проценка на активниот транспорт на мозокот преку мерење на нивоата на терапевтски кандидати во цереброспиналната течност и мозокот на стаорец).
Нежно држете го стаорецот свесен со CM канилата во рака.Отстранете го Datura од канилата и соберете 10 µl спонтано течечка цереброспинална течност.Бидејќи проодноста на канилата на крајот беше загрозена, во оваа студија беа вклучени само проѕирни примероци од цереброспиналната течност без докази за контаминација на крв или промена на бојата.Паралелно, приближно 10-20 μl крв беше земена од мал засек на врвот на опашката во цевки со хепарин (Сигма-Олдрич).CSF и крв беа собрани во различни временски точки по интравенска инјекција на T7 фагот.Приближно 5-10 μl течност беше исфрлена пред да се собере секој примерок од CSF, што одговара на мртвиот волумен на катетерот.
Библиотеките беа генерирани со користење на векторот T7Select 10-3b како што е опишано во прирачникот за системот T7Select (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996).Накратко, случаен 12-мерен инсерт на ДНК беше синтетизиран во следниот формат:
Кодонот NNK се користеше за да се избегнат двојни стоп-кодони и прекумерна експресија на аминокиселини во влошката.N е рачно измешан еквимоларен однос на секој нуклеотид, а K е рачно измешан еквимоларен однос на нуклеотидите на аденин и цитозин.Едноверижните региони беа конвертирани во двојно верижна ДНК со понатамошна инкубација со dNTP (Novagen) и ензимот Klenow (New England Biolabs) во пуферот Klenow (New England Biolabs) за 3 часа на 37°C.По реакцијата, двоверижна ДНК беше обновена со преципитација на EtOH.Добиената ДНК беше дигестирана со рестриктивните ензими EcoRI и HindIII (и двете од Roche).Расцепениот и прочистениот (QIAquick, Qiagen) влошка (T4 лигаза, New England Biolabs) потоа беше поврзан во рамка во претходно расцепен T7 вектор по амино киселина 348 од генот 10B капсид.Реакциите на лигатура беа инкубирани на 16°C 18 часа пред пакувањето ин витро.Пакувањето на фагот ин витро беше изведено според упатствата испорачани со комплетот за клонирање T7Select 10-3b (Новаген) и растворот за пакување беше засилен еднаш до лиза со помош на Escherichia coli (BLT5615, Novagen).Лизатите беа центрифугирани, титрирани и замрзнати на -80°C како максимален раствор на глицерол.
Директно PCR засилување на варијабилните региони на фагот засилени во супа или плоча со користење на сопственички 454/Roche-amplicon фузија прајмери.Напредниот фузионен прајмер содржи секвенци кои го граничат променливиот регион (NNK) 12 (специфичен за шаблон), GS FLX титаниумски адаптер А и четири-базна библиотечна клучна секвенца (TCAG) (Дополнителна слика 1а):
Прајмерот за обратна фузија, исто така, содржи биотин прикачен за зафаќање на монистра и GS FLX титаниумски адаптер B потребен за клонално засилување за време на емулзија PCR:
Ампликоните потоа беа подложени на 454/Roche pyrosequencing според протоколот 454 GS-FLX Titanium.За рачно секвенционирање на Sanger (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA Analyzer), ДНК на фагот Т7 беше засилена со PCR и секвенционирана со следните парови на прајмери:
Инсерти од поединечни плаки беа подложени на PCR засилување со користење на Roche Fast Start DNA Polymerase Kit (според упатствата на производителот).Изведете топол старт (10 мин на 95 °C) и 35 циклуси на засилување (50 секунди на 95 °C, 1 мин на 50 °C и 1 мин на 72 °C).
Фаг од библиотеки, фаг од див тип, фаг спасен од цереброспинална течност и крв или поединечни клонови беа засилени во Escherichia coli BL5615 во супа од ТБ (Sigma Aldrich) или во садови од 500 cm2 (Thermo Scientific) 4 часа на 37°C.Фагите беа извлечени од плочите со испирање на плочите со Tris-EDTA пуфер (Fluka Analytical) или со собирање на плочите со стерилни врвови од пипети.Фагите беа изолирани од супернатантот на културата или пуферот за екстракција со еден круг таложење со полиетилен гликол (PEG 8000) (Promega) и повторно суспендирани во Tris-EDTA пуфер.
Засилениот фаг беше подложен на 2-3 рунди на отстранување на ендотоксин со помош на монистра за отстранување на ендотоксин (Miltenyi Biotec) пред интравенска (IV) инјекција (500 μl/животно).Во првиот круг беа воведени 2×1012 фаги;во вториот, 2×1010 фаги;во третиот и четвртиот круг на селекција, 2×109 фаги по животно.Содржината на фаг во цереброспиналната течност и примероците од крв собрани во наведените временски точки беше одредена со броење на плаките според упатствата на производителот (прирачник за системот T7Select).Изборот на фаг беше изведен со интравенска инјекција на прочистени библиотеки во вена на опашката или со повторно вбризгување на фаг изваден од CSF од претходниот круг на селекција, а последователните берби беа извршени на 10 мин, 30 мин, 60 мин, 90 мин, 120 мин, 180 мин и примероци од крв соодветно 240 мин.Беа спроведени вкупно четири рунди на in vivo панирање во кои двете избрани гранки беа посебно складирани и анализирани во текот на првите три круга на селекција.Сите фагни инсерти извлечени од CSF од првите два круга на селекција беа подложени на 454/Roche pyrosequencing, додека сите клонови извадени од CSF од последните два круга на селекција беа рачно секвенционирани.Сите крвни фаги од првиот круг на селекција беа исто така подложени на 454/Roche pyrosequencing.За инјектирање на клонови на фаг, избраните фаги беа засилени во E. coli (BL5615) на плочи од 500 cm2 на 37°C за 4 часа.Поединечно избрани и рачно секвенционирани клонови беа пропагирани во медиум за ТБ.По екстракција на фагот, прочистување и отстранување на ендотоксинот (како што е опишано погоре), 2×1010 фаги/животно во 300 μl беа инјектирани интравенски во една вена на опашката.
Претходна обработка и квалитативно филтрирање на податоците за низата.Необработените податоци од 454/Roche беа конвертирани од бинарен стандарден формат на мапа на поток (sff) во формат за читање од луѓе на Pearson (fasta) со помош на софтверот на продавачот.Понатамошната обработка на нуклеотидната секвенца беше извршена со користење на сопствени C програми и скрипти (необјавен софтверски пакет) како што е опишано подолу.Анализата на примарните податоци вклучува строги процедури за филтрирање во повеќе фази.За да се филтрираат читањата што не содржеле валидна секвенца на ДНК од 12-мерна вметнување, отчитувањата беа последователно порамнети со почетната етикета (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), ознаката за застанување (TAAGCTTGCGGGCCGCACTCGAGTA) и вметнувањето во заднина (CCCTGCAGGGATATCCCGTCGGAATTCT) користејќи го глобалниот тест.порамнување што дозволува до 2 недоследности по траса31.Затоа, од библиотеката беа отстранети читањата без ознаки за почеток и стоп и читања што содржат вметнати заднини, т.е. порамнувања што го надминуваат дозволениот број на несовпаѓања.Што се однесува до преостанатите отчитувања, N-mer секвенцата на ДНК што се протега од почетната ознака и завршува пред ознаката за застанување беше отстранета од оригиналната прочитана низа и дополнително обработена (во натамошниот текст „внеси“).По преведувањето на влошката, делот по првиот стоп-кодон на 5' крајот на прајмерот се отстранува од влошката.Дополнително, беа отстранети и нуклеотидите кои водеа до нецелосни кодони на 3' крајот на прајмерот.За да се исклучат инсертите што содржат само секвенци на заднина, преведените инсерти кои започнуваат со моделот на амино киселина „PAG“ исто така беа отстранети.Од библиотеката беа отстранети пептиди со должина на пост-преведување помала од 3 аминокиселини.Конечно, отстранете го вишокот во базенот за вметнување и одредете ја фреквенцијата на секој уникатен додаток.Резултатите од оваа анализа вклучуваа листа на нуклеотидни секвенци (инсерти) и нивните (читани) фреквенции (Дополнителни слики 1в и 2).
Групни N-mer ДНК вметнувања по сличност на секвенцата: За да се елиминираат грешките во секвенционирањето специфични за 454/Roche (како што се проблемите со секвенционирање на екстензии на хомополимер) и да се отстранат помалку важните вишок, претходно филтрираните влошки од N-mer ДНК секвенци (инсерти) се подредени по сличност.вметнувања (дозволени се до 2 основи кои не се совпаѓаат) со користење на итеративен алгоритам дефиниран на следниов начин: вметнувањата прво се подредуваат според нивната фреквенција (највисока до најниска), а ако се исти, според нивното секундарно сортирање по должина (најдолго до најкратко) ).Така, најчестите и најдолгите вметнувања ја дефинираат првата „група“.Фреквенцијата на групата е поставена на клучната фреквенција.Потоа, секое вметнување што остана во сортираната листа се обиде да се додаде во групата со парно порамнување Needleman-Wunsch.Ако бројот на несовпаѓања, вметнувања или бришења во порамнувањето не го надмине прагот од 2, во групата се додава вметнување, а вкупната фреквенција на групата се зголемува за тоа колку често се додавало вметнувањето.Вметнувањата додадени во група се означени како користени и исклучени од понатамошна обработка.Ако секвенцата за вметнување не може да се додаде на веќе постоечка група, секвенцата за вметнување се користи за создавање нова група со соодветна фреквенција на вметнување и означена како користена.Итерацијата завршува кога секоја секвенца на вметнување е или искористена за формирање нова група или може да се вклучи во веќе постоечка група.На крајот на краиштата, групираните инсерти кои се состојат од нуклеотиди на крајот се преведени во пептидни секвенци (пептидни библиотеки).Резултатот од оваа анализа е збир на вметнувања и нивните соодветни фреквенции кои го сочинуваат бројот на последователни читања (Дополнителна слика 2).
Генерирање на мотиви: Врз основа на список на уникатни пептиди, создадена е библиотека која ги содржи сите можни модели на аминокиселини (аа) како што е прикажано подолу.Секоја можна шема со должина 3 беше извлечена од пептидот и неговата инверзна шема беше додадена заедно со заедничка библиотека со мотиви што ги содржи сите обрасци (трипептиди).Библиотеките со многу повторувачки мотиви беа секвенционирани и вишокот беше отстранет.Потоа, за секој трипептид во библиотеката со мотиви, го проверивме неговото присуство во библиотеката користејќи пресметковни алатки.Во овој случај, фреквенцијата на пептидот што го содржи пронајдениот мотив трипептид се додава и се доделува на мотивот во библиотеката на мотиви („број на мотиви“).Резултатот од генерирањето мотив е дводимензионална низа што ги содржи сите појави на трипептиди (мотиви) и нивните соодветни вредности, кои се бројот на читања на секвенционирање што резултираат со соодветниот мотив кога отчитувањата се филтрираат, групираат и преведуваат.Метрика како што е детално опишано погоре.
Нормализација на бројот на мотиви и соодветните распрскувачи: Бројот на мотиви за секој примерок беше нормализиран со користење
каде ni е бројот на читања кои содржат тема i.Така, vi ја претставува процентуалната фреквенција на читања (или пептиди) кои содржат мотив i во примерокот.P-вредностите за ненормализираниот број на мотиви беа пресметани со помош на точниот тест на Фишер.Во однос на корелограмите на бројот на мотиви, корелациите на Спирман беа пресметани користејќи го нормализираниот број на мотиви со Р.
За да се визуелизира содржината на амино киселините на секоја позиција во библиотеката на пептиди, беа креирани веб-логограми 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com).Прво, содржината на амино киселините на секоја позиција на 12-мерниот пептид се складира во матрица 20×12.Потоа, збир од 1000 пептиди кои ја содржат истата релативна содржина на аминокиселини на секоја позиција се генерираат во формат на брза секвенца и се обезбедуваат како влез во веб-логото 3, што генерира графичка претстава на релативната содржина на амино киселини на секоја позиција.за дадена библиотека на пептиди.За да се визуелизираат повеќедимензионални сетови на податоци, топлинските мапи беа креирани со помош на внатрешно развиена алатка во R (biosHeatmap, R пакет што допрва треба да биде објавен).Дендрограмите претставени во топлинските карти беа пресметани со помош на Вардовиот метод на хиерархиско групирање со Евклидовата метрика на растојание.За статистичка анализа на податоците за бодување на мотивите, P вредностите за ненормализирано бодување беа пресметани со помош на точниот тест на Фишер.P-вредностите за други збирки на податоци беа пресметани во R со помош на студентски т-тест или ANOVA.
Избрани клонови на фаг и фаги без инсерти беа инјектирани интравенски преку опашката вена (2×1010 фаги/животно во 300 μl PBS).Десет минути пред перфузијата и последователната фиксација, на истите животни им се инјектираат интравенски 100 μl лектин означен со DyLight594 (Vector Laboratories Inc., DL-1177).60 минути по инјектирањето на фагот, стаорците беа перфузирани низ срцето со 50 ml PBS проследено со 50 ml 4% PFA/PBS.Примероците од мозокот беа дополнително фиксирани преку ноќ во 4% PFA/PBS и натопени во 30% сахароза преку ноќ на 4°C.Примероците се блиц замрзнати во OCT смесата.Имунохистохемиската анализа на замрзнатите примероци беше изведена на собна температура на криосекции од 30 µm блокирани со 1% BSA и инкубирани со поликлонални FITC-означени антитела против T7 фагот (Novus NB 600-376A) на 4 °C.Инкубирајте преку ноќ.Конечно, деловите беа измиени 3 пати со PBS и испитани со конфокален ласерски микроскоп (Leica TCS SP5).
Сите пептиди со минимална чистота од 98% беа синтетизирани од GenScript USA, биотинилирани и лиофилизирани.Биотинот се врзува преку дополнителен троен глицин разделувач на N-крајот.Проверете ги сите пептиди користејќи масена спектрометрија.
Стрептавидин (Sigma S0677) беше измешан со 5-кратен еквимоларен вишок на биотинилиран пептид, биотинилиран BACE1 инхибиторен пептид или комбинација (однос 3:1) на биотинилиран BACE1 инхибиторен пептид и BACE1 инхибиторен пептид DM5/BSSO5/10%.1 час на собна температура пред инјектирање.Пептидите конјугирани со стрептавидин беа инјектирани интравенски во доза од 10 mg/kg во една од вените на опашката на стаорците со церебрална празнина.
Концентрацијата на стрептавидин-пептидните комплекси беше проценета со ELISA.Микротитерските плочи Nunc Maxisorp (Sigma) беа обложени преку ноќ на 4°C со 1,5 μg/ml глувчешки анти-стрептавидински антитела (Thermo, MA1-20011).По блокирање (блокирачки пуфер: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0,05% NP40, 0,25% желатин, 1% BSA) на собна температура во тек на 2 часа, измијте ја плочата со 0,05% Tween-20/PBS (миење пуфер) за 3 секунди, во бунарската плазма беа додадени 1 примероци од плазмата и CSF. 0.000, CSF 1:115).Плочата потоа беше инкубирана преку ноќ на 4°C со детекционо антитело (1 μg/ml, анти-стрептавидин-HRP, Novus NB120-7239).По три чекори на миење, стрептавидин беше откриен со инкубација во раствор на супстрат TMB (Roche) до 20 мин.По запирање на развојот на бојата со 1M H2SO4, измерете ја апсорпцијата на 450 nm.
Функцијата на комплексот инхибитор на стрептавидин-пептид-BACE1 беше проценета со Aβ(1-40) ELISA според протоколот на производителот (Wako, 294-64701).Накратко, примероците од CSF беа разредени во стандарден разредувач (1:23) и инкубирани преку ноќ на 4°C во плочи со 96 бунари обложени со антитела за заробување BNT77.По пет чекори на миење, HRP-конјугираното BA27 антитело беше додадено и инкубираше 2 часа на 4°C, проследено со пет чекори на миење.Aβ (1-40) беше откриен со инкубација во раствор на TMB 30 минути на собна температура.Откако ќе се запре развојот на бојата со стоп раствор, измерете ја апсорпцијата на 450 nm.Примероците од плазмата беа подложени на екстракција на цврста фаза пред Aβ(1-40) ELISA.Плазмата беше додадена на 0,2% DEA (Sigma) во плочи со 96 бунари и се инкубираше на собна температура 30 минути.По сукцесивно миење на SPE плочите (Oasis, 186000679) со вода и 100% метанол, примероците од плазма беа додадени на SPE плочите и целата течност беше отстранета.Примероците беа измиени (прво со 5% метанол потоа 30% метанол) и елуирани со 2% NH4OH/90% метанол.По сушењето на елуатот на 55°C за 99 мин при константна струја N2, примероците беа намалени во стандардни разредувачи и Aβ(1-40) беше измерен како што е опишано погоре.
Како да се цитира овој напис: Urich, E. et al.Испорака на товар до мозокот користејќи транзитни пептиди идентификувани in vivo.науката.5, 14104;doi:10.1038/srep14104 (2015).
Likhota J., Skjorringe T., Thomsen LB и Moos T. Испорака на макромолекуларни лекови до мозокот користејќи насочена терапија.Journal of Neurochemistry 113, 1-13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C., and Martinez-Martinez, P. Испорака на пептидни и протеински лекови преку крвно-мозочната бариера.Prog Neurobiol 87, 212-251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
Pardridge, WM Крво-мозочната бариера: тесно грло во развојот на лекови за мозокот.NeuroRx 2, 3-14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
Johanson, KE, Duncan, JA, Stopa, EG и Byrd, A. Изгледи за подобрена испорака на лекови и таргетирање до мозокот преку патеката на хориоидниот плексус-CSF.Фармацевтски истражувања 22, 1011-1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
Pardridge, WM Модернизација на биофармацевтски производи со молекуларни тројански коњи за испорака на мозокот.Bioconjug Chem 19, 1327-1338, 10.1021/bc800148t (2008).
Pardridge, транспорт на пептиди посредуван од WM рецептор преку крвно-мозочната бариера.Endocr Rev. 7, 314-330 (1986).
Niewoehner, J. et al.Зголемете ја пенетрацијата на мозокот и ефикасноста на терапевтските антитела користејќи едновалентни молекуларни шатлови.Неврон 81, 49-60, 10.1016/j.неврон.2013.10.061 (2014).
Bien-Lee, N. et al.Трансферинскиот рецептор (TfR) транспорт го одредува преземањето на мозокот на афинитетните варијанти на TfR антителата.J Exp Med 211, 233-244, 10.1084/jem.20131660 (2014).