Ви благодариме што ја посетивте Nature.com. Верзијата на прелистувачот што ја користите има ограничена поддршка за CSS. За најдобро искуство, препорачуваме да користите ажуриран прелистувач (или да го исклучите режимот на компатибилност во Internet Explorer). Во меѓувреме, за да обезбедиме континуирана поддршка, ќе ја прикажеме страницата без стилови и JavaScript.
Генските вектори за третман на белодробна болест со цистична фиброза треба да ги таргетираат спроводните дишни патишта бидејќи периферната трансдукција на белите дробови не обезбедува терапевтска корист. Ефикасноста на вирусната трансдукција е директно поврзана со времето на престој на векторот. Сепак, течностите за испорака, како што се генските носачи, природно дифундираат во алвеолите за време на инспирацијата, а терапевтските честички од која било форма брзо се чистат со мукоцилијарен транспорт. Продолжувањето на времето на престој на генските носачи во дишните патишта е важно, но тешко е да се постигне. Магнетните честички конјугирани со генски носачи кои можат да бидат насочени кон површината на дишните патишта можат да го подобрат регионалното таргетирање. Поради предизвиците на in vivo визуелизацијата, однесувањето на толку мали магнетни честички на површината на дишните патишта во присуство на применето магнетно поле е слабо разбрано. Целта на оваа студија беше да се користи синхротронско снимање за да се визуелизира in vivo движењето на серија магнетни честички во трахеата на анестезирани стаорци за да се испита динамиката и моделите на однесување на индивидуалните и масовните честички in vivo. Потоа, исто така, проценивме дали испораката на лентивирусни магнетни честички во присуство на магнетно поле ќе ја зголеми ефикасноста на трансдукцијата во трахеата на стаорец. Синхротронското рендгенско снимање го открива однесувањето на магнетните честички во стационарни и подвижни магнетни полиња ин витро и ин виво. Честичките не можат лесно да се влечат по површината на живите дишни патишта со магнети, но за време на транспортот, наслагите се концентрираат во видното поле каде што магнетното поле е најсилно. Ефикасноста на трансдукцијата исто така беше зголемена шесткратно кога лентивирусните магнетни честички беа испорачани во присуство на магнетно поле. Заедно, овие резултати сугерираат дека лентивирусните магнетни честички и магнетните полиња можат да бидат вредни пристапи за подобрување на таргетирањето на генските вектори и зголемување на нивоата на трансдукција во спроводните дишни патишта ин виво.
Цистичната фиброза (CF) е предизвикана од варијација во еден ген наречен регулатор на трансмембранската спроводливост на CF (CFTR). Протеинот CFTR е јонски канал кој е присутен во многу епителни клетки низ целото тело, вклучувајќи ги и спроводните дишни патишта, главно место на патогенезата на CF. Дефектите на CFTR доведуваат до абнормален транспорт на вода, дехидрирање на површината на дишните патишта и намалување на длабочината на слојот на површинска течност на дишните патишта (ASL). Ова, исто така, ја нарушува способноста на системот за мукоцилијарен транспорт (MCT) да ги исчисти вдишаните честички и патогени од дишните патишта. Нашата цел е да развиеме лентивирусна (LV) генска терапија за да ја доставиме точната копија од генот CFTR и да го подобриме здравјето на ASL, MCT и белите дробови, како и да продолжиме да развиваме нови технологии способни за мерење на овие параметри in vivo1.
LV векторите се едни од водечките кандидати за генска терапија на дишните патишта за CF, главно затоа што можат трајно да го интегрираат терапевтскиот ген во базалните клетки на дишните патишта (матични клетки на дишните патишта). Ова е важно затоа што тие можат да ја вратат нормалната хидратација и чистењето на слузта со диференцирање во функционални ген-корегирани површински клетки на дишните патишта поврзани со CF, што резултира со доживотни придобивки. LV векторите треба да бидат насочени против спроводливите дишни патишта, бидејќи тука започнува белодробната болест со CF. Доставата на векторот подлабоко во белите дробови може да резултира со алвеоларна трансдукција, но ова нема терапевтска корист кај CF. Сепак, течностите како што се носителите на гени природно мигрираат во алвеолите по инспирацијата по породувањето3,4 и терапевтските честички брзо се чистат во усната шуплина преку MCT. Ефикасноста на LV трансдукцијата е директно поврзана со должината на времето што векторот останува до целните клетки за да овозможи клеточно апсорбирање - „времето на престој“5 - кое лесно се намалува со типичен регионален проток на воздух, како и со координирано зафаќање на честички од слуз и MCT. За CF, можноста за продолжување на времето на престој на LV во дишните патишта е важна за да се постигнат високи нивоа на трансдукција во овој регион, но досега е предизвикувачки.
За да се надмине оваа пречка, предлагаме магнетните честички (MPs) на левата комора (LV) да помогнат на два комплементарни начина. Прво, тие можат магнетно да се водат кон површината на дишните патишта за да се подобри таргетирањето и да им се помогне на честичките-носачи на гени да се задржат во посакуваниот регион на дишните патишта; и ASL) да се преместат кон клеточниот слој 6. MPs се широко користени како таргетирани средства за испорака на лекови кога се врзуваат за антитела, хемотерапевтски лекови или други мали молекули кои се прикачуваат на клеточните мембрани или се врзуваат за релевантни рецептори на површината на клетките и се акумулираат на местата на туморот во присуство на статички електрицитет. Магнетни полиња за третман на рак 7. Други „хипертермални“ техники имаат за цел да ги загреат MP кога се изложени на осцилирачки магнетни полиња, со што ги уништуваат туморските клетки. Принципот на магнетна трансфекција, во кој магнетно поле се користи како трансфекциски агенс за подобрување на трансферот на ДНК до клетките, најчесто се користи in vitro со користење на низа невирусни и вирусни генски вектори за тешко трансдуцирани клеточни линии. Ефективноста на магнетотрансфекцијата на левата комора е утврдена, со in vitro испорака на LV-MP до човечка бронхијална епителна клеточна линија во присуство на статично магнетно поле, зголемувајќи ја ефикасноста на трансдукцијата за 186 пати во споредба со само LV вектор. LV-MP е применет и на in vitro CF модел, каде што магнетната трансфекција ја зголеми LV трансдукцијата во културите на интерфејсот воздух-течност за 20 пати во присуство на CF спутум10. Сепак, in vivo магнетотрансфекцијата на органи доби релативно малку внимание и е оценета само во неколку студии на животни11,12,13,14,15, особено во бели дробови16,17. Сепак, можностите за магнетна трансфекција во терапијата на белите дробови со цистична фиброза се јасни. Тан и сор. (2020) наведоа дека „студија за доказ за концепт за ефикасна пулмонална испорака со магнетни наночестички ќе го отвори патот за идните стратегии за инхалација на CFTR за подобрување на клиничките исходи кај пациенти со цистична фиброза“6.
Однесувањето на малите магнетни честички на површините на дишните патишта во присуство на применето магнетно поле е тешко за визуелизација и проучување, и затоа е слабо разбрано. Во други студии, развивме метод на снимање со Х-зраци со фазен контраст базиран на синхротронска пропагација (PB-PCXI) за неинвазивно визуелизирање и квантификација на ситни in vivo промени во длабочината на ASL18 и однесувањето на MCT19,20 за директно мерење на хидратацијата на површината на гасниот канал и го користевме како ран индикатор за ефикасноста на третманот. Покрај тоа, нашиот метод за евалуација на MCT користи честички со дијаметар од 10–35 µm составени од алуминиум оксид или стакло со висок индекс на прекршување како MCT маркери видливи со употреба на PB-PCXI21. Двете техники се погодни за визуелизација на низа типови честички, вклучувајќи MP.
Поради високата просторна и временска резолуција, нашите техники за анализа ASL и MCT базирани на PB-PCXI се добро прилагодени за испитување на динамиката и шемите на однесувањето на единечни и големи честички in vivo за да ни помогнат да ги разбереме и оптимизираме техниките за испорака на MP гени. Пристапот што го користиме овде произлегува од нашите студии со користење на зрачната линија SPring-8 BL20B2, во која го визуелизиравме движењето на течностите по испорака на лажна векторска доза во носните и пулмоналните дишни патишта на глувци за да помогнеме во објаснувањето на нашите нерамномерни шеми на генска експресија забележани во нашите студии за дози на животни како носители на гени 3,4.
Целта на оваа студија беше да се користи синхротронот PB-PCXI за визуелизација на in vivo движењата на серија од MP во трахеата на живи стаорци. Овие студии за снимање со PB-PCXI беа дизајнирани да тестираат низа MP, јачина на магнетното поле и локации за да се утврди нивниот ефект врз движењето на MP. Претпоставивме дека надворешно применетото магнетно поле би помогнало испорачаниот MP да остане или да се движи кон целната област. Овие студии ни овозможија да идентификуваме конфигурации на магнети кои го максимизираат бројот на честички задржани во трахеата по таложењето. Во втора серија студии, се обидовме да ја искористиме оваа оптимална конфигурација за да го демонстрираме моделот на трансдукција што произлегува од in vivo испорака на LV-MP до дишните патишта на стаорци, врз основа на претпоставката дека испораката на LV-MP во контекст на насочување на дишните патишта би резултирала со подобрена ефикасност на трансдукцијата на LV.
Сите студии на животни беа спроведени според протоколи одобрени од Универзитетот во Аделаида (M-2019-060 и M-2020-022) и Комитетот за етика на животни на SPring-8 Synchrotron. Експериментите беа спроведени според упатствата на ARRIVE.
Сите рендгенски снимки беа извршени на зрачната линија BL20XU на SPring-8 синхротронот во Јапонија, користејќи поставување слично на претходно опишаното21,22. Накратко, експерименталната кутија беше сместена на 245 m од прстенот за складирање на синхротронот. Растојанието од примерокот до детекторот од 0,6 m се користи за студии за снимање на честички и 0,3 m за студии за снимање in vivo за генерирање ефекти на фазен контраст. Користена е монохроматска енергија на зракот од 25 keV. Сликите беа направени со помош на конвертор на рендгенски зраци со висока резолуција (SPring-8 BM3) поврзан со sCMOS детектор. Конверторот ги претвора рендгенските зраци во видлива светлина со помош на сцинтилатор со дебелина од 10 µm (Gd3Al2Ga3O12), кој потоа се насочува кон sCMOS сензор со помош на објектив на микроскоп со димензии × 10 (NA 0,3). sCMOS детекторот беше Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Јапонија) со големина на низа од 2048 × 2048 пиксели и сурова големина на пиксел од 6,5 × 6,5 µm. Оваа поставеност дава ефективна изотропна големина на пиксел од 0,51 µm и видно поле од приближно 1,1 mm × 1,1 mm. Избрана е должина на експозиција од 100 ms за да се максимизира односот сигнал-шум на магнетните честички во и надвор од дишните патишта, а воедно да се минимизираат артефактите од движење предизвикани од дишењето. За in vivo студии, во патеката на Х-зраците беше поставен брз рендгенски затворач за да се ограничи дозата на зрачење со блокирање на рендгенскиот зрак помеѓу експозициите.
Носачот на ЛК не беше користен во ниедна студија за снимање SPring-8 PB-PCXI бидејќи комората за снимање BL20XU не е сертифицирана за биолошка безбедност од ниво 2. Наместо тоа, избравме низа добро карактеризирани микрополиметри од два комерцијални добавувачи - кои опфаќаат низа големини, материјали, концентрации на железо и апликации - прво за да разбереме како магнетните полиња влијаат на движењето на микрополиметрите во стаклените капилари, а потоа и во живите дишни патишта. на површината. Големините на MP се движат од 0,25 до 18 μm и се направени од различни материјали (видете Табела 1), но составот на секој примерок, вклучувајќи ја и големината на магнетните честички во MP, е непознат. Врз основа на нашите обемни MCT студии 19, 20, 21, 23, 24, очекуваме дека MP со големина од 5 μm може да се видат на површината на трахеалниот дишен пат, на пример со одземање на последователни слики за да се види подобрена видливост на движењето на MP. Еден MP со големина од 0,25 μm е помал од резолуцијата на уредот за снимање, но се очекува PB-PCXI да го детектира нивниот волуменски контраст и движењето на површинската течност на која се таложат по таложењето.
Примероците за секој MP во Табела 1 беа подготвени во стаклени капилари од 20 μl (Drummond Microcaps, PA, САД) со внатрешен дијаметар од 0,63 mm. Корпускуларните честички се достапни во вода, додека честичките CombiMag се достапни во течноста во сопственост на производителот. Секоја цевка е полуполнета со течност (приближно 11 μl) и е поставена на држачот за примероци (видете ја Слика 1). Стаклените капилари беа поставени хоризонтално на површината за примероци во кутијата за снимање, соодветно, и ги позиционираа рабовите на течноста. Магнет (N35, кат. бр. LM1652, Jaycar Electronics, Австралија) со никел обвивка од ретки земјени неодимиумски железо-бор (NdFeB) со дијаметар од 19 mm (долг 28 mm) со преостаната магнетизација од 1,17 Tesla беше прикачен на посебна фаза за транслација за да се постигне промена на нејзината позиција од далечина за време на снимањето. Снимањето на рендгенски слики започнува кога магнетот е позициониран приближно 30 mm над примерокот, а сликите се добиваат со брзина од 4 слики во секунда. За време на снимањето, магнетот беше доближен до стаклена капиларна цевка (оддалечена околу 1 мм) и потоа се преместува по должината на цевката за да се проценат ефектите од јачината и положбата на полето.
Ин витро систем за снимање што содржи MP примероци во стаклени капилари на фазата на транслација xy на примерокот. Патеката на рендгенскиот сноп е обележана со црвена испрекината линија.
Откако беше утврдена видливоста на микропластични прачки (MP) in vitro, подгрупа од нив беше тестирана in vivo кај женски албино стаорци Wistar од див тип (~12 недели стари, ~200 g). 0,24 mg/kg медетомидин (Domitor®, Zenoaq, Јапонија), 3,2 mg/kg мидазолам (Dormicum®, Astellas Pharma, Јапонија) и 4 mg/kg буторфанол (Vetorphale®, Meiji Seika). Стаорците беа анестезирани со мешавина од Pharma (Јапонија) со интраперитонеална инјекција. По анестезијата, тие беа подготвени за снимање со отстранување на крзното околу трахеата, вметнување на ендотрахеална цевка (ET; 16 Ga iv канула, Terumo BCT) и нивно имобилизирање во супинкција на специјално изработена плоча за снимање што содржи термичка кеса за одржување на телесната температура 22. Потоа, плочата за снимање беше прикачена на фазата за транслација на примерокот во кутијата за снимање под мал агол за да се усогласи трахеата хоризонтално на рендгенската слика, како што е прикажано на Слика 2а.
(a) Поставување на in vivo снимање во кутијата за снимање SPring-8, патеката на рендгенскиот сноп е обележана со црвена испрекината линија. (b, c) Локализацијата на магнетот на трахеата е извршена од далечина со помош на две ортогонално монтирани IP камери. На левата страна од сликата од екранот, може да се види жичната јамка што ја држи главата, а канилата за испорака е поставена во рамките на ET цевката.
Систем за пумпа за шприц со далечинско управување (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL) со употреба на стаклен шприц од 100 μl беше поврзан со PE10 цевка (OD 0,61 mm, ID 0,28 mm) преку игла од 30 Ga. Означете ја цевката за да се осигурате дека врвот е во правилна положба во трахеата при вметнување на ET цевката. Користејќи ја микропумпата, клипот на шприцот беше повлечен додека врвот на цевката беше потопен во MP примерокот што требаше да се испорача. Наполнетата цевка за испорака потоа беше вметната во ендотрахеалната цевка, ставајќи го врвот во најсилниот дел од нашето очекувано применето магнетно поле. Снимањето на слики беше контролирано со помош на детектор за дишење поврзан со нашата Arduino-базирана кутија за мерење време, а сите сигнали (на пр. температура, дишење, отворање/затворање на блендата и снимање на слики) беа снимени со помош на Powerlab и LabChart (AD Instruments, Сиднеј, Австралија) 22. При снимање кога куќиштето беше недостапно, две IP камери (Panasonic BB-SC382) беа позиционирани на приближно 90° една во однос на друга и беа користени. за следење на положбата на магнетот во однос на трахеата за време на снимањето (сл. 2б, в). За да се минимизираат артефактите од движење, направена е една слика по здив за време на платото на крајниот прилив на воздух.
Магнет е прикачен на втора фаза што може да се постави оддалечено од надворешноста на куќиштето за снимање. Тестирани се различни позиции и конфигурации на магнети, вклучувајќи: Монтирани под агол од приближно 30° над трахеата (конфигурациите се прикажани на сликите 2а и 3а); еден магнет над животното, а другиот подолу, со полови поставени да привлекуваат (Слика 3б); еден магнет над животното, а другиот подолу, со полови поставени да одбиваат (Слика 3в); и еден магнет над и нормален на трахеата (Слика 3д). Откако животното и магнетот ќе бидат конфигурирани и пратеникот што треба да се тестира ќе се внесе во пумпата со шприц, се внесува доза од 50 μl со брзина од 4 μl/сек додека се снимаат слики. Потоа магнетот се движи напред-назад по должината или странично низ трахеата додека продолжува да се снимаат слики.
Конфигурација на магнет за in vivo снимање (а) еден магнет над трахеата под агол од приближно 30°, (б) два магнети поставени да привлекуваат, (в) два магнети поставени да одбиваат, (г) еден магнет над и нормално во трахеата. Набљудувачот погледнал надолу од устата кон белите дробови низ трахеата, а рендгенскиот сноп поминал низ левата страна на стаорецот и излегол од десната страна. Магнетот се движи или по должината на дишните патишта или лево и десно над трахеата во насока на рендгенскиот сноп.
Исто така, се обидовме да ја утврдиме видливоста и однесувањето на честичките во дишните патишта во отсуство на збунувачки дишење и срцево движење. Затоа, на крајот од периодот на снимање, животните беа хумано убиени поради предозирање со пентобарбитал (Somnopentil, Pitman-Moore, Washington Crossing, САД; ~65 mg/kg ip). Некои животни беа оставени на платформата за снимање, и откако дишењето и отчукувањата на срцето престанаа, процесот на снимање беше повторен, додавајќи дополнителна доза на MP ако немаше видлива MP на површината на дишните патишта.
Добиените слики беа корегирани со рамно поле и темно поле, а потоа собрани во филм (20 слики во секунда; 15-25 × нормална брзина во зависност од респираторната фреквенција) со користење на прилагодена скрипта напишана во MATLAB (R2020a, The Mathworks).
Сите студии за испорака на LV генски вектори беа спроведени во Центарот за лабораториски истражувања на животни на Универзитетот во Аделаида и имаа за цел да ги искористат резултатите од експериментот SPring-8 за да проценат дали испораката на LV-MP во присуство на магнетно поле може да го подобри трансферот на гени in vivo. За да се проценат ефектите на MP и магнетното поле, беа третирани две групи животни: на едната група ѝ беше даден LV-MP со поставен магнет, а другата група доби контролна група со LV-MP без магнет.
Векторите на LV генот беа генерирани со користење на претходно опишани методи 25, 26. Векторот LacZ го експресира нуклеарно-локализираниот ген на бета-галактозидаза управуван од конститутивниот MPSV промотор (LV-LacZ), кој произведува син реакциски производ во трансдуцираните клетки, видлив во предните делови на белодробното ткиво и ткивните пресеци. Титрацијата беше извршена во клеточни култури со рачно броење на бројот на LacZ позитивни клетки со хемоцитометар за да се пресмета титарот во TU/ml. Носачите се криоконзервираат на -80 °C, се одмрзнуваат пред употреба и се врзуваат за CombiMag со мешање во сооднос 1:1 и инкубирање на мраз најмалку 30 минути пред породувањето.
Нормални стаорци Sprague Dawley (n = 3/група, ~2-3 беа анестезирани интраперитонеално со мешавина од 0,4 mg/kg медетомидин (Domitor, Ilium, Австралија) и 60 mg/kg кетамин (Ilium, Австралија) стар еден месец) ip) инјекција и нехируршка орална канулација со 16 Ga iv канила. За да се осигури дека трахеалното ткиво на дишните патишта прима LV трансдукција, тоа беше условено со користење на нашиот претходно опишан протокол за механичка пертурбација, во кој површината на трахеалниот дишен пат беше триена аксијално со жичена кошница (N-Circle, Nitinol Tipless Stone Extractor NTSE-022115) -UDH, Cook Medical, САД) 30 s28. Потоа беше извршена трахеална администрација на LV-MP во биолошки безбедносен кабинет приближно 10 минути по пертурбацијата.
Магнетното поле што се користеше во овој експеримент беше конфигурирано на сличен начин како и студијата за снимање со рендген in vivo, со истите магнети држени над трахеата со помош на стент-клипови за дестилација (Слика 4). Волумен од 50 μl (2 × 25 μl аликвоти) од LV-MP беше внесен во трахеата (n = 3 животни) со помош на пипета што содржеше врв од гел како што беше претходно опишано. Контролна група (n = 3 животни) ги прими истите LV-MP без употреба на магнет. По завршувањето на инфузијата, канилата се отстранува од ET цевката и животното се екстубира. Магнетот останува на место 10 минути, а потоа се отстранува. Стаорците добија поткожна доза на мелоксикам (1 ml/kg) (Ilium, Австралија), проследено со пресврт на анестезијата со интравенска инјекција од 1 mg/kg атипамазол хидрохлорид (Antisedan, Zoetis, Австралија). Стаорците беа топли и следени до целосно закрепнување од анестезијата.
Уред за испорака на LV-MP во биолошки безбедносен кабинет. Светлосивиот Луер центар на ET цевката може да се види како штрчи од устата, а гел-врвот на пипетата прикажан на сликата е вметнат низ ET цевката до саканата длабочина во трахеата.
Една недела по постапката на дозирање на LV-MP, животните беа хумано убиени со инхалација на 100% CO2, а експресијата на LacZ беше оценета со користење на нашиот стандарден третман со X-gal. Трите каудални нај'рскавични прстени беа отстранети за да се осигури дека какво било механичко оштетување или задржување на течности од поставувањето на ендотрахеалната цевка не е вклучено во анализата. Секоја трахеа беше исечена лонгитудинално за да се создадат две половини за анализа, и тие беа монтирани во сад што содржи силиконска гума (Sylgard, Dow Inc) со помош на игла Minutien (Fine Science Tools) за визуелизација на луминалната површина. Распределбата и моделот на трансдуцираните клетки беа потврдени со фронтална фотографија со помош на микроскоп Nikon (SMZ1500) со камера DigiLite и софтвер TCapture (Tucsen Photonics, Кина). Сликите беа направени со зголемување од 20x (вклучувајќи ја највисоката поставка за целосна ширина на трахеата), при што целата должина на трахеата беше сликана чекор по чекор, обезбедувајќи доволно преклопување помеѓу секоја слика за да се овозможи „спојување“ на сликата. Сликите од секоја трахеа потоа беа собрани во една композитна слика со помош на Image Composite Editor v2.0.3 (Microsoft Research) користејќи алгоритам за рамно движење. Областите на експресија на LacZ во композитните слики од трахеата од секое животно беа квантифицирани со помош на автоматизирана MATLAB скрипта (R2020a, MathWorks) како што беше претходно опишано, користејќи поставки од 0,35 < Hue < 0,58, Saturation > 0,15 и Value < 0,7. Со следење на контурите на ткивото, рачно беше генерирана маска во GIMP v2.10.24 за секоја композитна слика со цел да се идентификува површината на ткивото и да се спречат лажни детекции надвор од трахеалното ткиво. Обоените области од сите композитни слики од секое животно беа сумирани за да се генерира вкупната обоена површина за тоа животно. Потоа обоената површина беше поделена со вкупната површина на маската за да се генерира нормализираната површина.
Секоја трахеа беше вградена во парафин и беа исечени пресеци од 5 μm. Пресеците беа контрабоени со неутрална брза црвена боја 5 минути, а сликите беа направени со помош на микроскоп Nikon Eclipse E400, камера DS-Fi3 и софтвер за снимање елементи NIS (верзија 5.20.00).
Сите статистички анализи беа извршени во GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.). Статистичката значајност беше поставена на p ≤ 0,05. Нормалноста беше потврдена со помош на Shapiro-Wilk тестот, а разликите во LacZ боењето беа оценети со помош на неспарениот t-тест.
Шесте MP опишани во Табела 1 беа испитани со употреба на PCXI, а видливоста е опишана во Табела 2. Два MP од полистирен (MP1 и MP2; 18 μm и 0,25 μm, соодветно) не беа видливи под PCXI, но останатите примероци беа препознатливи (примери се прикажани на Слика 5). MP3 и MP4 (10-15% Fe3O4; 0,25 μm и 0,9 μm, соодветно) се слабо видливи. Иако содржат некои од најмалите тестирани честички, MP5 (98% Fe3O4; 0,25 μm) беше најизразен. Производот на CombiMag MP6 е тешко да се забележи. Во сите случаи, нашата способност за детектирање на MP беше значително подобрена со поместување на магнетот напред-назад паралелно со капиларот. Кога магнетите се оддалечија од капиларот, честичките се протегаа во долги низи, но како што магнетите се приближуваа и јачината на магнетното поле се зголемуваше, низите на честичките се скратуваа како што честичките мигрираа кон горната површина на капиларот (видете го Дополнителното видео S1: MP4), зголемувајќи го густина на честичките на површината. Спротивно на тоа, кога магнетот се отстранува од капиларот, јачината на полето се намалува и микроелектронските честички се преуредуваат во долги низи што се протегаат од горната површина на капиларот (видете го Дополнителното видео S2:MP4). Откако магнетот ќе престане да се движи, честичките продолжуваат да се движат кратко време откако ќе ја достигнат рамнотежната положба. Како што микроелектронскиот честички се движи кон и од горната површина на капиларот, магнетните честички обично ги влечат остатоците низ течноста.
Видливоста на MP под PCXI значително варира помеѓу примероците. (a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 и (d) MP6. Сите слики прикажани овде се направени со магнет поставен приближно 10 mm директно над капиларот. Видливите големи кругови се воздушни меурчиња заробени во капиларите, јасно покажувајќи ги црно-белите карактеристики на рабовите на сликањето со фазен контраст. Црвената кутија го содржи зголемувањето за подобрување на контрастот. Забележете дека дијаметрите на шемите на магнетите на сите слики не се во размер и се приближно 100 пати поголеми од прикажаните.
Како што магнетот се поместува лево и десно по должината на врвот на капиларот, аголот на MP низата се менува за да се усогласи со магнетот (видете ја Слика 6), со што се обележуваат линиите на магнетното поле. За MP3-5, откако тетивата ќе достигне праг на агол, честичките се влечат по горната површина на капиларот. Ова често резултира со групирање на MP во поголеми групи блиску до местото каде што магнетното поле е најсилно (видете го Дополнителното видео S3:MP5). Ова е особено очигледно и при снимање блиску до капиларниот крај, што предизвикува MP да се агрегираат и концентрираат на интерфејсот течност-воздух. Честичките во MP6, кои беа потешки за разликување од MP3-5, не беа влечени додека магнетот се движеше по капиларот, но MP низите се дисоцираа, оставајќи ги честичките во видното поле (видете го Дополнителното видео S4:MP6). Во некои случаи, кога применетото магнетно поле беше намалено со поместување на магнетот на големо растојание од локацијата за снимање, сите преостанати MP полека се спуштија на долната површина на цевката под гравитацијата додека остануваа во низата (видете го Дополнителното видео S5: MP3).
Аголот на MP низата се менува како што магнетот се поместува надесно над капиларот. (a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 и (d) MP6. Црвената кутија го содржи зголемувањето за подобрување на контрастот. Забележете дека дополнителните видеа се информативни бидејќи откриваат важна структура на честичките и динамички информации што не можат да се визуелизираат на овие статични слики.
Нашите тестови покажаа дека бавното движење на магнетот напред-назад по трахеата го олеснува визуелизирањето на MP во контекст на комплексно движење in vivo. Тестирањето in vivo не беше извршено бидејќи полистиренските зрна (MP1 и MP2) не беа видливи во капиларот. Секој од преостанатите четири MP беше тестиран in vivo со долгата оска на магнетот конфигурирана над трахеата под агол од околу 30° во однос на вертикалата (видете ги сликите 2б и 3а), бидејќи ова резултираше со подолги MP синџири и беше поефикасно од конфигурацијата на магнетот што беше прекината. MP3, MP4 и MP6 не беа откриени во трахеата на ниедно живо животно. Кога дишните патишта на стаорци беа сликани откако животните беа хумано убиени, честичките останаа невидливи дури и кога беше додаден дополнителен волумен со помош на шприц пумпа. MP5 имаше највисока содржина на железен оксид и беше единствената видлива честичка и затоа беше користена за проценка и карактеризирање на in vivo однесувањето на MP.
Поставувањето на магнетот врз трахеата за време на породувањето со микроплазма резултираше со концентрирање на многу, но не на сите, микроплазмати во видното поле. Честичките што влегуваат во трахеата најдобро се забележуваат кај хумано жртвувани животни. Слика 7 и Дополнителното видео S6: MP5 покажуваат брзо магнетно зафаќање и усогласување на честичките на површината на вентралната трахеа, што укажува дека микроплазматиците можат да бидат насочени кон посакуваните региони на трахеата. При пребарување подистално по трахеата по породувањето со микроплазматици, некои микроплазматици беа пронајдени поблиску до карината, што укажува дека јачината на магнетното поле не е доволна за да ги собере и задржи сите микроплазматици, бидејќи тие беа испорачани низ регионот со максимална јачина на магнетното поле за време на процесот на флуидност. Сепак, постпарталните концентрации на микроплазматици беа повисоки околу снимената област, што укажува дека многу микроплазматици останале во регионите на дишните патишта каде што јачината на применетото магнетно поле беше највисока.
Слики од (а) пред и (б) по внесувањето на MP5 во трахеата на неодамна еутанизиран стаорец со магнет позициониран директно над областа за снимање. Сликаната област се наоѓа помеѓу двата 'рскавични прстени. Пред внесувањето на MP, има малку течност во дишните патишта. Црвената кутија го содржи зголемувањето за подобрување на контрастот. Овие слики се од видеото прикажано во Дополнителното видео S6:MP5.
Поместувањето на магнетот по должината на трахеата in vivo предизвикало менување на аголот на MP ланецот во површината на дишните патишта на начин сличен на оној што се гледа кај капиларите (видете ја Слика 8 и Дополнителното видео S7:MP5). Сепак, во нашата студија, MP не можеа да се влечат по површината на живите дишни патишта како што можеа со капиларите. Во некои случаи, MP ланецот ќе стане подолг како што магнетот се движи лево и десно. Интересно е што откривме и дека низата честички се чини дека ја менува длабочината на површинскиот слој на течност кога магнетот се движи лонгитудинално по должината на трахеата и се шири кога магнетот се движи директно над нив и низата честички се ротира во вертикална положба (видете го Дополнителното видео S7). : MP5 на 0:09, долу десно). Карактеристичниот модел на движење се промени кога магнетот се премести преку горниот дел од трахеата латерално (т.е. лево или десно од животното, а не по должината на трахеата). Честичките сè уште беа јасно видливи додека се движеа, но кога магнетот беше отстранет од трахеата, врвовите на низите на честичките станаа видливи (видете го Дополнителното видео S8:MP5, почнувајќи од 0:08). Ова е во согласност со однесувањето на MP што го забележавме под применето магнетно поле во стаклен капилар.
Пример слики што го прикажуваат MP5 во трахеата на жив анестезиран стаорец. (а) Магнетот се користи за добивање слики над и лево од трахеата, а потоа (б) откако магнетот ќе се помести надесно. Црвената кутија го содржи зголемувањето за подобрување на контрастот. Овие слики се од видеото прикажано во Дополнителното видео S7:MP5.
Кога двата пола беа конфигурирани во северно-јужна ориентација над и под трахеата (т.е. привлекување; Сл. 3б), MP тетивите изгледаа подолги и беа лоцирани на страничниот ѕид на трахеата, а не на дорзалната трахеална површина (видете го Дополнителното видео S9:MP5). Сепак, високи концентрации на честички на една локација (т.е. дорзалната површина на трахеата) не беа откриени по испораката на течност кога се користеше уред со двоен магнет, што обично се случува кога се користи уред со еден магнет. Потоа, кога еден магнет беше конфигуриран да ги одбива половите обратно (Сл. 3в), бројот на честички видливи во видното поле не се зголеми по испораката. Поставувањето на обете конфигурации со двоен магнет е предизвикувачко поради високата јачина на магнетното поле што ги влече или турка магнетите, соодветно. Поставувањето потоа беше променето на еден магнет паралелен со дишните патишта, но кој минува низ дишните патишта под агол од 90 степени, така што линиите на полето го преминуваат трахеалниот ѕид ортогонално (Сл. 3д), ориентација дизајнирана да утврди дали може да се забележи агрегација на честички на страничниот ѕид. Сепак, во оваа конфигурација, имаше Нема препознатливо движење на акумулацијата на MP или движење на магнет. Врз основа на сите овие резултати, за in vivo студии на генски носители беше избрана конфигурација со еден магнет, ориентација од 30 степени (Слика 3а).
Кога животното било постојано снимано веднаш по хуманото убивање, отсуството на збунувачко движење на ткивото значело дека пофини и пократки линии на честички можеле да се препознаат во јасното интерхондрално поле, „нестабилни“ во согласност со транслациското движење на магнетот. Сепак, сè уште не може јасно да се види присуството и движењето на MP6 честичките.
Титарот на LV-LacZ беше 1,8 × 108 TU/ml, а по мешање 1:1 со CombiMag MP (MP6), животните примија трахеална доза од 50 μl од 9 × 107 TU/ml LV вехикулум (т.е. 4,5 × 106 TU/стаорец). Во овие студии, наместо да го преместуваме магнетот за време на породувањето, го фиксиравме магнетот во една положба за да утврдиме дали трансдукцијата на LV (а) може да се подобри во споредба со испораката со вектори во отсуство на магнетно поле и (б) може да се фокусира. Клетките на дишните патишта се трансдуцираат во магнетни целни региони на горните дишни патишта.
Присуството на магнети и употребата на CombiMag во комбинација со LV вектори не се чини дека имаат негативни ефекти врз здравјето на животните, како што имаше и нашиот стандарден протокол за испорака на LV вектори. Фронталните слики од трахеалниот регион подложен на механичка пертурбација (Дополнителна слика 1) покажаа дека имало значително повисоки нивоа на трансдукција во групата животни третирани со LV-MP кога магнетот бил присутен (сл. 9a). Само мала количина на сино LacZ боење била присутна во контролната група (сл. 9b). Квантификацијата на нормализираните области обоени со X-Gal покажа дека администрацијата на LV-MP во присуство на магнетно поле предизвикала приближно 6-кратно подобрување (сл. 9c).
Примери за композитни слики што ја прикажуваат трахеалната трансдукција со LV-MP (а) во присуство на магнетно поле и (б) во отсуство на магнет. (в) Статистички значајно подобрување во нормализираната област на трансдукција LacZ во трахеата при употреба на магнет (*p = 0,029, t-тест, n = 3 по група, средна вредност ± SEM).
Неутралните брзо обоени со црвена боја делови (пример прикажан на Дополнителната слика 2) покажаа клетки обоени со LacZ присутни во сличен модел и локација како што беше претходно објавено.
Клучен предизвик за генската терапија на дишните патишта останува точната локализација на честичките-носачи во регионите од интерес и постигнување високи нивоа на ефикасност на трансдукција во подвижните бели дробови во присуство на проток на воздух и активно чистење на мукус. За носителите на ЛВ дизајнирани за лекување на болест на дишните патишта со цистична фиброза, зголемувањето на времето на престој на честичките-носачи во спроводните дишни патишта досега беше неостварлива цел. Како што истакнаа Кастелани и сор., употребата на магнетни полиња за подобрување на трансдукцијата има предности во споредба со другите методи на испорака на гени, како што е електропорацијата, бидејќи може да комбинира едноставност, економичност, локализација на испорака, зголемена ефикасност и пократко време на инкубација, а можеби и помала доза на носител10. Сепак, in vivo таложењето и однесувањето на магнетните честички во дишните патишта под влијание на надворешни магнетни сили никогаш не е опишано, ниту пак е докажана изводливоста на овој метод in vivo за подобрување на нивоата на генска експресија во интактни живи дишни патишта.
Нашите in vitro синхротронски PCXI експерименти покажаа дека сите честички што ги тестиравме, со исклучок на полистирен MP, беа видливи во поставувањето за снимање што го користевме. Во присуство на магнетно поле, MP формираат низи чии должини се поврзани со типот на честичка и јачината на магнетното поле (т.е. близината и движењето на магнетот). Како што е прикажано на Слика 10, низите што ги набљудуваме се формираат поради тоа што секоја поединечна честичка е магнетизирана и индуцира свое локално магнетно поле. Овие одделни полиња предизвикуваат други слични честички да се агрегираат и поврзуваат, со групни движења слични на низи поради локалните сили од локалните привлечни и одбивни сили на други честички.
Шема што ги прикажува (a, b) низите на честички генерирани во капиларите исполнети со течност и (c, d) трахеата исполнета со воздух. Забележете дека капиларите и трахеата не се нацртани во размер. Панелот (a) исто така содржи опис на MP, кој содржи честички Fe3O4 распоредени во низи.
Кога магнетот беше поместен над капиларот, аголот на низата честички достигна критичен праг за MP3-5 што содржи Fe3O4, по што низата честички повеќе не остануваше во првобитната положба, туку се движеше по површината на нова положба. Овој ефект веројатно ќе се случи затоа што површината на стаклените капилари е доволно мазна за да дозволи ова движење. Интересно е што MP6 (CombiMag) не се однесуваше на овој начин, веројатно затоа што честичките беа помали, имаа различни премази или површински полнежи, или патентирана течност-носач влијаеше на нивната способност да се движат. Контрастот на сликата на честичките CombiMag е исто така послаб, што сугерира дека течноста и честичките може да имаат слични густини и затоа не се движат лесно една кон друга. Честичките исто така можат да се заглават ако магнетот се движи пребрзо, што укажува дека јачината на магнетното поле не може секогаш да го надмине триењето помеѓу честичките во течноста, што сугерира дека можеби не е изненадувачки што јачината на магнетното поле и растојанието помеѓу магнетот и целната област се многу важни. Земени заедно, овие резултати исто така сугерираат дека, иако магнетите можат да заробат многу MP што течат низ целната област, малку е веројатно дека на магнетите може да се потпреме за... ги движат честичките CombiMag по површината на трахеата. Затоа, заклучуваме дека in vivo студиите за LV-MP треба да користат статички магнетни полиња за физичко таргетирање на специфични региони од дрвото на дишните патишта.
Кога честичките се доставуваат во телото, тие се тешки за идентификување во контекст на комплексно подвижно телесно ткиво, но можноста за нивно откривање е подобрена со хоризонтално поместување на магнетот над трахеата за да се „помрднат“ низите на микропластика. Иако е можно снимање во живо, полесно е да се препознае движењето на честичките откако животното е хумано убиено. Концентрациите на микропластика генерално биле највисоки на оваа локација кога магнетот бил поставен над областа за снимање, иако некои честички обично се наоѓале подалеку по трахеата. За разлика од студиите in vitro, честичките не можат да се влечат по трахеата со поместување на магнетот. Ова откритие е во согласност со тоа како слузта што ја обложува површината на трахеата обично ги обработува вдишаните честички, заробувајќи ги во слузта и последователно исчистени преку механизмот за мукоцилијарен клиренс.
Претпоставивме дека употребата на магнети за привлекување над и под трахеата (сл. 3б) може да резултира со порамномерно магнетно поле, наместо магнетно поле кое е високо концентрирано во еден момент, што потенцијално води до порамномерна распределба на честичките. Сепак, нашата прелиминарна студија не пронајде јасни докази за да ја поддржи оваа хипотеза. Слично на тоа, конфигурирањето на пар магнети за одбивање (сл. 3в) не резултираше со поголемо таложење на честички во снимената област. Овие два наоди покажуваат дека поставувањето со двоен магнет не ја подобрува значително локалната контрола на таргетирањето на MP и дека добиените силни магнетни сили се тешки за конфигурирање, што го прави овој пристап помалку практичен. Слично на тоа, ориентирањето на магнетот над и низ трахеата (сл. 3д) исто така не го зголеми бројот на честички задржани во снимената област. Некои од овие алтернативни конфигурации може да не бидат успешни бидејќи резултираат со помали јачини на магнетното поле во областа на таложење. Затоа, конфигурацијата на еден магнет со агол од 30 степени (сл. 3а) се смета за најлесен и најефикасен метод за in vivo тестирање.
Студијата LV-MP покажа дека кога LV векторите биле комбинирани со CombiMag и испорачани по физичка пертурбација во присуство на магнетно поле, нивоата на трансдукција биле значително зголемени во трахеата во споредба со контролните групи. Врз основа на студиите за синхротронско снимање и резултатите од LacZ, магнетното поле очигледно можело да ја зачува LV во трахеата и да го намали бројот на векторски честички кои веднаш продираат длабоко во белите дробови. Ваквите подобрувања во таргетирањето може да доведат до поголема ефикасност, а воедно да ги намалат испорачаните титри, трансдукцијата надвор од целта, воспалителните и имунолошките несакани ефекти и трошоците за генски носачи. Важно е да се напомене дека, според производителот, CombiMag може да се користи во комбинација со други методи за трансфер на гени, вклучително и со други вирусни вектори (како што е AAV) и нуклеински киселини.