Некои теми за решавање проблеми со LC никогаш не се застарени, бидејќи постојат проблеми во практиката со LC, дури и кога технологијата на инструментите се подобрува со текот на времето. Постојат многу начини на кои проблемите можат да се појават во LC систем и да завршат со лоша форма на врвовите. Кога ќе се појават проблеми поврзани со формата на врвовите, кратка листа на можни причини за овие резултати помага да се поедностави нашето искуство со решавање проблеми.
Беше забавно да се пишува оваа колумна „Решавање проблеми со течна хроматографија“ и да се размислува за теми секој месец, бидејќи некои теми никогаш не излегуваат од мода. Додека во областа на истражувањето на хроматографијата, одредени теми или идеи стануваат застарени бидејќи се заменети со понови и подобри идеи, во областа на решавање проблеми, од првата статија за решавање проблеми што се појави во ова списание (LC Journal во тоа време) бидејќи некои теми се сè уште релевантни) во 1983 година (1). Во текот на изминатите неколку години, неколку делови за решавање проблеми со течна хроматографија ги фокусирав на современите трендови што влијаат на течната хроматографија (LC) (на пример, релативната споредба на нашето разбирање за ефектот на притисокот врз задржувањето [2] Нови достигнувања) Нашето толкување на резултатите од LC и како да се решат проблемите со модерни LC инструменти. Во делот од овој месец, ја продолжувам мојата серија (3), која започна во декември 2021 година, која се фокусираше на некои од темите „на живот и смрт“ за решавање проблеми со течна хроматографија - елементи што се одлични за секој алат за решавање проблеми се неопходни, без оглед на возраста на системот што го користиме. Основната тема на оваа серија е многу релевантна за познатиот ѕид „Водич за решавање проблеми со течна хроматографија“ на LCGC. графикон (4) виси во многу лаборатории. За третиот дел од оваа серија, одбрав да се фокусирам на прашања поврзани со обликот на врвот или карактеристиките на врвот. Неверојатно, ѕидниот графикон наведува 44 различни потенцијални причини за лоша форма на врвот! Не можеме детално да ги разгледаме сите овие проблеми во една статија, па затоа во ова прво продолжение на темата, ќе се фокусирам на некои од оние што ги гледам најчесто. Се надевам дека младите и старите корисници на LC ќе најдат некои корисни совети и потсетници за оваа важна тема.
Сè повеќе одговарам на прашањата за решавање проблеми со „сè е можно“. Овој одговор може да изгледа лесен кога се разгледуваат набљудувања кои се тешки за толкување, но често го сметам за соодветен. Со оглед на многуте можни причини за лоша форма на врвот, важно е да се биде отворен кога се разгледува во што би можел да биде проблемот и да се може да се даде приоритет на потенцијалните причини за да се започнат нашите напори за решавање проблеми, фокусирајќи се на оние најчести можности, оваа поента е многу важна.
Клучен чекор во секоја вежба за решавање проблеми - но еден што мислам дека е потценет - е препознавањето дека постои проблем што треба да се реши. Препознавањето дека постои проблем честопати значи препознавање дека она што се случува со алатката е различно од нашите очекувања, кои се обликувани од теоријата, емпириското знаење и искуството (5). „Обликот на врвот“ што се споменува овде всушност се однесува не само на обликот на врвот (симетричен, асиметричен, мазен, мек, со преден раб, со опашка итн.), туку и на ширината. Нашите очекувања за вистинската форма на врвот се едноставни. Теоријата (6) добро го поддржува очекувањето од учебникот дека, во повеќето случаи, хроматографските врвови треба да бидат симетрични и да се во согласност со обликот на Гаусовата распределба, како што е прикажано на Слика 1а. Она што го очекуваме од ширините на врвовите е посложено прашање и ќе ја разгледаме оваа тема во идна статија. Другите облици на врвовите на Слика 1 покажуваат некои од другите можности што би можеле да се забележат - со други зборови, некои од начините на кои работите би можеле да тргнат наопаку. Во остатокот од овој дел, ќе поминеме време дискутирајќи за некои специфични примери на ситуации што можат да доведат до овие типови облици.
Понекогаш пиковите воопшто не се забележуваат во хроматограмот каде што се очекува да бидат елуирани. Горенаведената ѕидна табела покажува дека отсуството на пик (под претпоставка дека примерокот всушност го содржи целниот аналит во концентрација што треба да го направи одговорот на детекторот доволен за да го види над шумот) обично е поврзано со некој проблем со инструментот или неточни услови на мобилната фаза (доколку воопшто се забележани). Пиковите, обично се премногу „слаби“). Краток список на потенцијални проблеми и решенија во оваа категорија може да се најде во Табела I.
Како што споменавме погоре, прашањето колку проширување на врвовите треба да се толерира пред да се обрне внимание и да се обиде да се поправи е сложена тема што ќе ја дискутирам во идна статија. Моето искуство е дека значајното проширување на врвовите често е придружено со значителна промена во обликот на врвовите, а опашката на врвовите е почеста отколку пред-врвот или разделувањето. Сепак, номинално симетричните врвови се исто така проширени, што може да биде предизвикано од неколку различни причини:
Секое од овие прашања е детално дискутирано во претходните изданија на „Тестирање на проблеми со LC“, а читателите заинтересирани за овие теми можат да ги погледнат овие претходни статии за информации за основните причини и потенцијалните решенија за овие проблеми. Повеќе детали.
Врвните врвови на дното, врвните врвови на предната страна и разделувањето можат да бидат предизвикани од хемиски или физички феномени, а листата на потенцијални решенија за овие проблеми варира во голема мера, во зависност од тоа дали се работи за хемиски или физички проблем. Честопати, со споредување на различните врвови во хроматограмот, можете да најдете важни индиции за тоа кој е виновникот. Ако сите врвови во хроматограмот покажуваат слични форми, причината најверојатно не е физичка. Ако се засегнати само еден или неколку врвови, но останатите изгледаат добро, причината најверојатно е хемиска.
Хемиските причини за намалување на врвовите се премногу сложени за накратко да се дискутираат овде. Заинтересираниот читател е упатен кон неодамнешното издание на „LC Troubleshooting“ за подетална дискусија (10). Сепак, лесна работа што може да се обиде е да се намали масата на инјектираниот аналит и да се види дали обликот на врвот се подобрува. Ако е така, тогаш ова е добар показател дека проблемот е „преоптоварување со маса“. Во овој случај, методот мора да биде ограничен на инјектирање мали маси на аналит, или хроматографските услови мора да се променат така што добри форми на врвовите може да се добијат дури и со инјектирани поголеми маси.
Исто така, постојат многу потенцијални физички причини за намалување на врвните вредности. Читателите заинтересирани за детална дискусија за можностите се упатуваат на друго неодамнешно издание на „LC Troubleshooting“ (11). Една од почестите физички причини за намалување на врвните вредности е лошата врска во точката помеѓу инјекторот и детекторот (12). Екстремен пример е прикажан на Слика 1d, добиен во мојата лабораторија пред неколку недели. Во овој случај, изградивме систем со нов вентил за вбризгување што не го користевме претходно и инсталиравме јамка за вбризгување со мал волумен со обрач што беше обликуван на капиларна плоча од не'рѓосувачки челик. По неколку почетни експерименти за решавање проблеми, сфативме дека длабочината на отворот во статорот на вентилот за вбризгување е многу подлабока отколку што бевме навикнати, што резултира со голем мртов волумен на дното на отворот. Овој проблем лесно се решава со замена на јамката за вбризгување со друга цевка, можеме да го прилагодиме обрачот во соодветната положба за да го елиминираме мртвиот волумен на дното на отворот.
Фронтовите на врвовите како оние прикажани на Слика 1e можат да бидат предизвикани и од физички или хемиски проблеми. Честа физичка причина за водечката ивица е тоа што честичкиот слој на колоната не е добро спакуван или дека честичките се реорганизирале со текот на времето. Како и со намалувањето на врвовите предизвикано од овој физички феномен, најдобриот начин да се поправи ова е да се замени колоната и да се продолжи. Фундаментално, облиците на врвовите на водечката ивица со хемиско потекло често произлегуваат од она што го нарекуваме „нелинеарни“ услови на задржување. Под идеални (линеарни) услови, количината на аналит задржана од стационарната фаза (оттука, факторот на задржување) е линеарно поврзана со концентрацијата на аналитот во колоната. Хроматографски, ова значи дека како што масата на аналитот инјектиран во колоната се зголемува, врвот станува повисок, но не и поширок. Оваа врска е прекината кога однесувањето на задржување е нелинеарно, а врвовите не само што стануваат повисоки, туку и пошироки како што се инјектира повеќе маса. Покрај тоа, нелинеарните форми го одредуваат обликот на хроматографските врвови, што резултира со водечки или задни рабови. Како и со преоптоварувањето на масата што предизвикува намалување на врвовите (10), водењето на врвовите предизвикано од нелинеарно задржување може да се дијагностицира и со намалување на инјектираната маса на аналитот. Доколку обликот на врвовите се подобри, методот мора да се модифицира за да не го надмине квалитетот на инјектирање што го предизвикува водечката ивица, или хроматографските услови мора да се променат за да се минимизира ова однесување.
Понекогаш забележуваме нешто што изгледа како „разделен“ пик, како што е прикажано на Слика 1f. Првиот чекор во решавањето на овој проблем е да се утврди дали обликот на пикот се должи на делумно коелуирање (т.е. присуство на две различни, но блиску елуирани соединенија). Ако всушност постојат два различни аналити кои елуираат блиску еден до друг, тогаш станува збор за подобрување на нивната резолуција (на пример, со зголемување на селективноста, задржувањето или бројот на плочи), а очигледните „разделени“ пикови се поврзани со физичките карактеристики. Перформансите немаат никаква врска со самата колона. Честопати, најважниот показател за оваа одлука е дали сите пикови во хроматограмот покажуваат разделени форми, или само еден или два. Ако е само еден или два, веројатно е проблем со коелуирањето; ако сите пикови се разделени, веројатно е физички проблем, најверојатно поврзан со самата колона.
Разделните врвови поврзани со физичките својства на самата колона обично се должат на делумно блокирани влезни или излезни фритови или реорганизација на честичките во колоната, што овозможува мобилната фаза да тече побрзо од мобилната фаза во одредени области од формирањето на каналот на колоната во други региони (11). Делумно запушениот фрит понекогаш може да се исчисти со обратен тек низ колоната; сепак, според моето искуство, ова е обично краткорочно, а не долгорочно решение. Ова често е фатално кај модерните колони ако честичките се рекомбинираат во колоната. Во овој момент, најдобро е да се замени колоната и да се продолжи.
Врвот на Слика 1g, исто така од неодамнешен пример во мојата лабораторија, обично укажува дека сигналот е толку висок што го достигнал високиот крај од опсегот на одговор. За оптички детектори за апсорпција (UV-vis во овој случај), кога концентрацијата на аналитот е многу висока, аналитот апсорбира поголем дел од светлината што минува низ проточната ќелија на детекторот, оставајќи многу малку светлина за детекција. Под овие услови, електричниот сигнал од фотодетекторот е силно под влијание на различни извори на бучава, како што се залутана светлина и „темна струја“, што го прави сигналот многу „нејасен“ по изглед и независен од концентрацијата на аналитот. Кога тоа ќе се случи, проблемот често може лесно да се реши со намалување на волуменот на инјектирање на аналитот - намалување на волуменот на инјектирање, разредување на примерокот или и двете.
Во училиштето за хроматографија, го користиме сигналот на детекторот (т.е. y-оската во хроматограмот) како индикатор за концентрацијата на аналитот во примерокот. Затоа, изгледа чудно да се види хроматограм со сигнал под нулата, бидејќи едноставното толкување е дека ова укажува на негативна концентрација на аналитот - што секако не е физички можно. Според моето искуство, негативните врвови најчесто се забележуваат кога се користат оптички детектори за апсорпција (на пр., UV-vis).
Во овој случај, негативен пик едноставно значи дека молекулите што елуираат од колоната апсорбираат помалку светлина од самата мобилна фаза непосредно пред и по пикот. Ова може да се случи, на пример, кога се користат релативно ниски бранови должини на детекција (<230 nm) и адитиви за мобилна фаза кои апсорбираат поголем дел од светлината на овие бранови должини. Ваквите адитиви можат да бидат компоненти на растворувач во мобилна фаза како што е метанол или компоненти на пуфер како што се ацетат или формат. Всушност, може да се користат негативни пикови за да се подготви калибрациска крива и да се добијат точни квантитативни информации, така што нема фундаментална причина да се избегнуваат тие сами по себе (овој метод понекогаш се нарекува „индиректно UV откривање“) (13). Меѓутоа, ако навистина сакаме целосно да избегнеме негативни пикови, во случај на детекција на апсорпција, најдоброто решение е да се користи различна бранова должина на детекција, така што аналитот апсорбира повеќе од мобилната фаза, или да се промени составот на мобилната фаза, така што тие апсорбираат помалку светлина од аналитите.
Негативните врвови може да се појават и при користење на детекција на индекс на прекршување (RI) кога индексот на прекршување на компонентите различни од аналитот во примерокот, како што е матрицата на растворувачот, е различен од индексот на прекршување на мобилната фаза. Ова се случува и со детекција на UV-vis, но овој ефект има тенденција да биде ослабен во однос на детекцијата на RI. Во двата случаи, негативните врвови може да се минимизираат со поблиску усогласување на составот на матрицата на примерокот со оној на мобилната фаза.
Во третиот дел, на основната тема за решавање проблеми со LC, дискутирав за ситуации во кои набљудуваната форма на врвот се разликува од очекуваната или нормална форма на врвот. Ефективното решавање проблеми со ваквите проблеми започнува со познавање на очекуваните форми на врвот (врз основа на теорија или претходно искуство со постојните методи), така што отстапувањата од овие очекувања се очигледни. Проблемите со обликот на врвот имаат многу различни потенцијални причини (премногу широки, со опашка, со преден раб итн.). Во овој дел, детално дискутирам за некои од причините што ги гледам најчесто. Познавањето на овие детали обезбедува добро место за почеток на решавање проблеми, но не ги опфаќа сите можности. Читателите заинтересирани за подетален список на причини и решенија можат да се повикаат на ѕидната табела „Водич за решавање проблеми со LC“ на LCGC.
(4) Ѕидна шема „Водич за решавање проблеми со LCGC“. https://www.chromatographyonline.com/view/troubleshooting-wallchart (2021).
(6) А. Фелингер, Анализа на податоци и обработка на сигнали во хроматографијата (Елсевиер, Њујорк, Њујорк, 1998), стр. 43-96.
(8) Вахаб МФ, Дасгупта ПК, Каџо АФ и Армстронг ДВ, Anal.Chim.Journal.Rev. 907, 31–44 (2016).https://doi.org/10.1016/j.aca.2015.11.043.