Ви благодариме што ја посетивте Nature.com.Верзијата на прелистувачот што ја користите има ограничена поддршка за CSS.За најдобро искуство, препорачуваме да користите ажуриран прелистувач (или да го оневозможите режимот на компатибилност во Internet Explorer).Во меѓувреме, за да обезбедиме континуирана поддршка, ќе ја направиме страницата без стилови и JavaScript.
Течната биопсија (ЛБ) е концепт кој брзо се здобива со популарност во биомедицинското поле.Концептот главно се заснова на откривање на фрагменти од циркулирачката екстрацелуларна ДНК (ccfDNA), кои главно се ослободуваат како мали фрагменти по клеточната смрт во различни ткива.Мал дел од овие фрагменти потекнуваат од туѓи (туѓи) ткива или организми.Во тековната работа, го применивме овој концепт на школки, вид чувар познат по нивниот висок капацитет за филтрирање на морска вода.Ја користиме способноста на школките да дејствуваат како природни филтри за да ги фати фрагментите на ДНК на животната средина од различни извори за да обезбеди информации за биолошката разновидност на морските крајбрежни екосистеми.Нашите резултати покажуваат дека хемолимфата од школки содржи фрагменти на ДНК кои се многу различни по големина, од 1 до 5 kb.Секвенционирањето на пушка покажа дека голем број фрагменти на ДНК се од туѓо микробно потекло.Меѓу нив, најдовме фрагменти од ДНК од бактерии, археи и вируси, вклучително и вируси за кои е познато дека инфицираат различни домаќини кои вообичаено се наоѓаат во крајбрежните морски екосистеми.Како заклучок, нашата студија покажува дека концептот на LB применет на школки претставува богат, но сè уште неистражен извор на знаење за микробната разновидност во морските крајбрежни екосистеми.
Влијанието на климатските промени (КК) врз биодиверзитетот на морските екосистеми е рапидно растечка област на истражување.Глобалното затоплување не само што предизвикува важни физиолошки стресови, туку и ги турка еволутивните граници на топлинската стабилност на морските организми, влијаејќи на живеалиштето на голем број видови, поттикнувајќи ги да бараат поповолни услови [1, 2].Покрај тоа што влијае на биодиверзитетот на метазоаните, CC ја нарушува деликатната рамнотежа на интеракциите домаќин-микробни.Оваа микробна дисбактериоза претставува сериозна закана за морските екосистеми бидејќи ги прави морските организми поподложни на заразни патогени [3, 4].Се верува дека СС играат важна улога во масовните смртни случаи, што е сериозен проблем за управувањето со глобалните морски екосистеми [5, 6].Ова е важно прашање со оглед на економските, еколошките и нутритивните влијанија на многу морски видови.Ова е особено точно за бивалвите кои живеат во поларните региони, каде што ефектите на ЦК се понепосредни и потешки [6, 7].Всушност, бивалвите како што е Mytilus spp.широко се користат за следење на ефектите на CC врз морските екосистеми.Не е изненадувачки, релативно голем број биомаркери се развиени за следење на нивното здравје, често користејќи двостепен пристап кој вклучува функционални биомаркери базирани на ензимска активност или клеточни функции како што се одржливост на клетките и фагоцитна активност [8].Овие методи вклучуваат и мерење на концентрацијата на специфични индикатори за притисок кои се акумулираат во меките ткива по апсорпцијата на големи количини на морска вода.Сепак, високиот капацитет на филтрација и полуотворениот циркулаторен систем на бивалвите даваат можност да се развијат нови биомаркери на хемолимфа користејќи го концептот на течна биопсија (LB), едноставен и минимално инвазивен пристап за управување со пациентите.примероци од крв [9, 10].Иако може да се најдат неколку типови на циркулирачки молекули во човечкото LB, овој концепт првенствено се заснова на анализа на секвенционирање на ДНК на циркулирачките екстрацелуларна ДНК (ccfDNA) фрагменти во плазмата.Всушност, присуството на циркулирачка ДНК во човечката плазма е познато уште од средината на 20 век [11], но само во последниве години доаѓањето на методите за секвенционирање со висок пропуст доведе до клиничка дијагноза базирана на ccfDNA.Присуството на овие циркулирачки фрагменти на ДНК делумно се должи на пасивното ослободување на геномната ДНК (нуклеарна и митохондријална) по клеточната смрт. Кај здрави индивидуи, концентрацијата на ccfDNA е нормално ниска (<10 ng/mL), но може да се зголеми за 5-10 пати кај пациенти кои страдаат од различни патологии или се подложени на стрес, што резултира со оштетување на ткивото. Кај здрави индивидуи, концентрацијата на ccfDNA е нормално ниска (<10 ng/mL), но може да се зголеми за 5-10 пати кај пациенти кои страдаат од различни патологии или се подложени на стрес, што резултира со оштетување на ткивото. Во здоровых людей концентрация вккДНК во норме низкая (<10 нг/мл), но може да се повышаться во 5–10 разно во больных со различной патологией или подвергающихся стрессу, приводаврщенеюнему. Кај здрави луѓе, концентрацијата на cccDNA е нормално ниска (<10 ng/mL), но може да се зголеми за 5-10 пати кај пациенти со различни патологии или под стрес што доведува до оштетување на ткивото.在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/mL），但在患有各种病理或承各种病理或承可加5-10 倍，从而导致组织损伤.在 健康 个体 中 ， ccfdna 的 浓度 较 低 （（<10 ng/ml） 但 在 各 种 病理 或可 增加 5-10 倍 ， 从而 组织。。。Концентрациите на ccfDNA обично се ниски (<10 нг/мл) во здоровых лудей, но може да бидат увеличени во 5-10 разно во пациентов со различными патологиями или стрессом, што може да се приводи на повреждению тканей. Концентрациите на ccfDNA обично се ниски (<10 ng/ml) кај здрави индивидуи, но може да се зголемат 5-10 пати кај пациенти со различни патологии или стрес, што резултира со оштетување на ткивото.Големината на фрагментите на ccfDNA варира во голема мера, но обично се движи од 150 до 200 bp.[12].Анализата на самодобиената ccfDNA, т.е. ccfDNA од нормални или трансформирани клетки домаќини, може да се користи за откривање на генетски и епигенетски промени присутни во нуклеарниот и/или митохондријалниот геном, со што ќе им се помогне на лекарите да изберат специфични молекуларно насочени терапии [13].Сепак, ccfDNA може да се добие од странски извори како што е ccfDNA од фетални клетки за време на бременоста или од трансплантирани органи [14,15,16,17].ccfDNA е исто така важен извор на информации за откривање на присуството на нуклеински киселини на инфективен агенс (странец), што овозможува неинвазивно откривање на широко распространети инфекции кои не се идентификувани со хемокултури, избегнувајќи инвазивна биопсија на заразено ткиво [18].Неодамнешните студии навистина покажаа дека човечката крв содржи богат извор на информации што може да се користи за да се идентификуваат вирусни и бактериски патогени и дека околу 1% од ccfDNA пронајдена во човечката плазма е од странско потекло [19].Овие студии покажуваат дека биодиверзитетот на циркулирачкиот микробиом на организмот може да се процени со помош на ccfDNA анализа.Сепак, до неодамна, овој концепт се користеше исклучиво кај луѓето и, во помала мера, кај другите 'рбетници [20, 21].
Во овој труд, го користиме потенцијалот LB за да ја анализираме ccfDNA на Aulacomya atra, јужен вид кој најчесто се среќава на субантарктичките острови Кергуелен, група острови на врвот на големото плато што се формирало пред 35 милиони години.вулканска ерупција.Користејќи ин витро експериментален систем, откривме дека фрагментите на ДНК во морската вода брзо се земаат од школки и влегуваат во одделот за хемолимфна.Секвенционирањето на пушка покажа дека ccfDNA од хемолимфа од школки содржи ДНК фрагменти од сопствено и не само потекло, вклучувајќи симбиотски бактерии и ДНК фрагменти од биоми типични за ладни вулкански морски крајбрежни екосистеми.Хемолимфната ccfDNA исто така содржи вирусни секвенци добиени од вируси со различен опсег на домаќинот.Најдовме и ДНК фрагменти од повеќеклеточни животни како коскени риби, морски анемони, алги и инсекти.Како заклучок, нашата студија покажува дека концептот LB може успешно да се примени на морските безрбетници за да генерира богат геномски репертоар во морските екосистеми.
Возрасните (долги 55-70 mm) Mytilus platensis (M. platensis) и Aulacomya atra (A. atra) беа собрани од меѓуплимните карпести брегови на Порт-о-Франс (049°21.235 S, 070°13.490 E .).Островите Кергулен во декември 2018 година. Други возрасни сини школки (Mytilus spp.) беа добиени од комерцијален добавувач (PEI Mussel King Inc., островот Принц Едвард, Канада) и ставени во газиран резервоар со контролирана температура (4°C) кој содржи 10-20 L од 32‰ вештачка саламура.(вештачка морска сол од гребен Кристал, Инстант Океан, Вирџинија, САД).За секој експеримент беа мерени должината и тежината на поединечните школки.
Бесплатен протокол за отворен пристап за оваа програма е достапен онлајн (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1).Накратко, ЛБ хемолимфата беше собрана од киднаперните мускули како што е опишано [22].Хемолимфата беше прочистена со центрифугирање на 1200 × g за 3 минути, супернатантот беше замрзнат (-20 ° C) до употреба.За изолација и прочистување на cfDNA, примероците (1,5-2,0 ml) беа одмрзнати и обработени со помош на NucleoSnap cfDNA комплетот (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) според упатствата на производителот.ccfDNA се чуваше на -80°C до понатамошна анализа.Во некои експерименти, ccfDNA беше изолирана и прочистена со користење на QIAamp DNA Investigator Kit (QIAGEN, Торонто, Онтарио, Канада).Прочистената ДНК беше квантифицирана со користење на стандардна анализа на PicoGreen.Распределбата на фрагментот на изолираната ccfDNA беше анализирана со капиларна електрофореза со користење на биоанализатор Agilent 2100 (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) со помош на комплет за ДНК со висока чувствителност.Анализата беше изведена со користење на 1 µl од примерокот ccfDNA според упатствата на производителот.
За секвенционирање на фрагменти од ccfDNA на хемолимфата, Génome Québec (Монтреал, Квебек, Канада) подготви библиотеки со сачмарки користејќи го комплетот Illumina DNA Mix од комплетот Illumina MiSeq PE75.Се користеше стандарден адаптер (BioO).Датотеките со необработени податоци се достапни од архивата за читање на секвенца NCBI (SRR8924808 и SRR8924809).Основниот квалитет на читање беше проценет со користење на FastQC [23].Trimmomatic [24] се користи за сечење адаптери и слаб квалитет на читање.Читањата од пушка со спарени краеви беа FLASH споени во подолги единечни читања со минимално преклопување од 20 bp за да се избегнат несовпаѓања [25]. Споените читања беа забележани со BLASTN со користење на база на податоци за таксономија на NCBI (e вредност < 1e−3 и 90% хомологија), а маскирањето на низите со ниска сложеност беше изведено со помош на DUST [26]. Споените читања беа забележани со BLASTN со користење на база на податоци за таксономија на NCBI (e вредност < 1e−3 и 90% хомологија), а маскирањето на низите со ниска сложеност беше изведено со помош на DUST [26]. Объединенные чтения были антированы со помош BLASTN со использованием базы данных таксономии двустворчатых моллюсков NCBI (значение е < 1e-3 и 90% целосно нискобьвание), а маески со использованием ПРАШИНА [26]. Збирните читања беа означени со BLASTN користејќи ја базата на податоци за бивалвната таксономија NCBI (e вредност < 1e-3 и 90% хомологија), а маскирањето на низата со ниска сложеност беше изведено со помош на DUST [26].使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90% 同源性）用BLASTN 注释合并的读数低复杂度序列的掩蔽.使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 90% 同源） 用 用 用 注释 合并 读数 使用 合并 读数复杂度 序列 的。。。。 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽蔽 掩蔽 掩蔽Объединенные чтения были антированы со помош на BLASTN со использованием таксономической базы данных двустворчатых моллюсков NCBI (значајност е <1e-3 и 90% ниска глобалност), а полнено со использование ПРАШИНА [26]. Збирните читања беа означени со BLASTN користејќи ја NCBI бивалвната таксономска база на податоци (e вредност <1e-3 и 90% хомологија), а маскирањето на низата со ниска сложеност беше изведено со помош на DUST [26].Читањата беа поделени во две групи: поврзани со бивалвни секвенци (тука наречени само-читања) и неповрзани (не-само-читања).Две групи беа одделно собрани користејќи MEGAHIT за да генерираат контиги [27].Во меѓувреме, таксономската дистрибуција на отчитувањата на вонземскиот микробиом беше класифицирана со користење на Kraken2 [28] и графички претставена со табела со Крона пита на Галакси [29, 30].Од нашите прелиминарни експерименти беше утврдено дека оптималниот кмер е кмер-59. Само-контигите потоа беа идентификувани со усогласување со BLASTN (база на податоци со двовалвни NCBI, вредност e < 1e−10 и 60% хомологија) за конечна прибелешка. Само-контигите потоа беа идентификувани со усогласување со BLASTN (база на податоци со двовалвни NCBI, вредност e < 1e−10 и 60% хомологија) за конечна прибелешка. Затем собственные контиги были идентифицированы путем сопоставления со BLASTN (база данных двустворчатых моллюсков NCBI, значење е <1e-10 и гомологија 60%) за оценка. Само-контигите потоа беа идентификувани со совпаѓање со BLASTN (NCBI двовалвната база на податоци, вредност e <1e-10 и 60% хомологија) за конечна прибелешка.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）对齐来识襾别最终注释.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% Затемите со идентифицирани собственные контиги за окончателни анониции путем сопоставления со BLASTN (база данных NCBI за двустворени моллюсков, значење е <1e-10 готово 6%). Потоа беа идентификувани само-контигите за конечна прибелешка со совпаѓање со BLASTN (база на податоци за бивалвни NCBI, вредност e <1e-10 и 60% хомологија). Паралелно, контигите на несамогрупни беа означени со BLASTN (nt NCBI база на податоци, вредност e < 1e−10 и 60% хомологија). Паралелно, контигите на несамогрупни беа означени со BLASTN (nt NCBI база на податоци, вредност e < 1e−10 и 60% хомологија). Паралелно чужеродные групповые контиги были анотирани со помош на BLASTN (база данных nt NCBI, значење е <1e-10 и гомологија 60%). Паралелно, контигите на странски групи беа означени со BLASTN (база на податоци NT NCBI, вредност e <1e-10 и 60% хомологија).平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠 Паралелно контиги, не относящиеся к собствена група, со помош на BLASTN (база данных nt NCBI, значење е <1e-10 и гомологија 60%). Паралелно, со BLASTN (nt NCBI база на податоци, вредност e <1e-10 и 60% хомологија) беа означени контиги на не-самогрупни. BLASTX беше спроведен и на nonself contigs користејќи ги базите на податоци на протеин nr и RefSeq NCBI (вредност e < 1e−10 и 60% хомологија). BLASTX беше спроведен и на nonself contigs користејќи ги базите на податоци на протеин nr и RefSeq NCBI (вредност e < 1e−10 и 60% хомологија). BLASTX также был проведен на несамостоятельных контигах со использованием баз данных белка бр и RefSeq NCBI (значение е <1e-10 и гомология 60%). BLASTX исто така беше изведен на не-само-контиги со користење на базите на податоци за протеини nr и RefSeq NCBI (e вредност < 1e-10 и 60% хомологија).还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60%还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60% BLASTX также выполняли на несамостоятельных контигах со использованием баз данных белка nr и RefSeq NCBI (значение е <1e-10 и гомологија 60%). BLASTX, исто така, беше изведен на не-само-контиги користејќи ги базите на податоци за протеини nr и RefSeq NCBI (e вредност <1e-10 и 60% хомологија).Збирките на BLASTN и BLASTX на не-само-контиги ги претставуваат конечните контиги (види Дополнителна датотека).
Прајмерите што се користат за PCR се наведени во Табела S1.Taq DNA полимеразата (Bio Basic Canada, Markham, ON) беше искористена за засилување на целните гени ccfDNA.Беа користени следните услови за реакција: денатурација на 95°C за 3 минути, 95°C за 1 минута, поставена температура на жарење за 1 минута, издолжување на 72°C за 1 минута, 35 циклуси и на крајот 72°C во рок од 10 минути..Производите на PCR беа одвоени со електрофореза во агарозни гелови (1,5%) кои содржат SYBRTM Safe DNA Gel Stain (Invitrogen, Burlington, ON, Канада) на 95 V.
Школките (Mytilus spp.) беа аклиматизирани во 500 ml оксигенирана морска вода (32 PSU) 24 часа на 4°C.Плазмидна ДНК што содржи инсерт што ја кодира секвенцата на човечка галектин-7 cDNA (NCBI пристапен број L07769) беше додадена во вијалата со конечна концентрација од 190 μg/μl.Школки инкубирани под исти услови без додавање на ДНК беа контролата.Третиот контролен резервоар содржеше ДНК без школки.За следење на квалитетот на ДНК во морската вода, примероци од морска вода (20 μl; три повторувања) беа земени од секој резервоар во наведеното време.За следливост на плазмидната ДНК, LB школките беа собрани во наведените времиња и анализирани со qPCR и ddPCR.Поради високата содржина на сол во морската вода, деловите беа разредени во вода со квалитет на PCR (1:10) пред сите PCR анализи.
Дигитална капка PCR (ddPCR) беше изведена со користење на протоколот BioRad QX200 (Мисага, Онтарио, Канада).Користете го температурниот профил за да ја одредите оптималната температура (Табела S1).Капките беа генерирани со помош на генератор на капки QX200 (BioRad).ddPCR беше спроведено на следниов начин: 95°C за 5 минути, 50 циклуси од 95°C за 30 секунди и дадена температура на жарење за 1 мин и 72°C за 30 секунди, 4°C за 5 минути и 90°C во рок од 5 минути.Бројот на капки и позитивните реакции (број на копии/µl) беа измерени со помош на читач за капки QX200 (BioRad).Примероците со помалку од 10.000 капки беа отфрлени.Контролата на моделот не се вршеше секогаш кога се извршуваше ddPCR.
qPCR беше изведена со користење на Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Сиднеј, Австралија) и LGALS7 специфични прајмери.Сите квантитативни PCR беа изведени во 20 µl со користење на комплетот QuantiFast SYBR Green PCR (QIAGEN).qPCR започна со 15 мин инкубација на 95°C проследено со 40 циклуси на 95°C за 10 секунди и на 60°C за 60 секунди со едно собирање податоци.Кривите на топење беа генерирани со помош на последователни мерења на 95°C за 5 секунди, 65°C за 60 секунди и 97°C на крајот од qPCR.Секој qPCR беше изведен во три примероци, освен за контролните примероци.
Бидејќи школките се познати по нивната висока стапка на филтрација, прво испитавме дали тие можат да ги филтрираат и задржат фрагментите на ДНК присутни во морската вода.Бевме заинтересирани и дали овие фрагменти се акумулираат во нивниот полуотворен лимфен систем.Ова прашање го решивме експериментално со следење на судбината на растворливите ДНК фрагменти додадени во резервоарите со сини школки.За да го олесниме следењето на фрагментите на ДНК, користевме странска (не самостојна) плазмидна ДНК што го содржи човечкиот ген галектин-7.ddPCR ги следи фрагментите на плазмидната ДНК во морската вода и школките.Нашите резултати покажуваат дека ако количината на фрагменти на ДНК во морската вода останала релативно константна со текот на времето (до 7 дена) во отсуство на школки, тогаш во присуство на школки ова ниво речиси целосно исчезнало во рок од 8 часа (сл. 1а, б).Фрагменти од егзогена ДНК беа лесно откриени во рок од 15 минути во интравалвуларна течност и хемолимфа (сл. 1в).Овие фрагменти сè уште може да се откријат до 4 часа по изложувањето.Оваа активност на филтрирање во однос на фрагментите на ДНК е споредлива со активноста на филтрирање на бактериите и алгите [31].Овие резултати сугерираат дека школките можат да филтрираат и акумулираат туѓа ДНК во нивните оддели за течност.
Релативните концентрации на плазмидната ДНК во морската вода во присуство (А) или отсуство (Б) на школки, измерени со ddPCR.Во А, резултатите се изразени во проценти, при што границите на полињата ги претставуваат 75-тиот и 25-тиот перцентил.Вградената логаритамска крива е прикажана со црвена боја, а областа засенчена во сиво го претставува интервалот на доверба од 95%.Во Б, црвената линија ја претставува средната вредност, а сината линија го претставува интервалот на доверба од 95% за концентрацијата.C Акумулација на плазмидна ДНК во хемолимфата и валвуларната течност на школките во различни периоди по додавањето на плазмидната ДНК.Резултатите се претставени како апсолутни откриени копии/mL (±SE).
Следно, го истражувавме потеклото на ccfDNA во школки собрани од школки на островите Кергулен, оддалечена група острови со ограничено антропогено влијание.За таа цел, cccDNA од хемолимфи на школки беше изолирана и прочистена со методи кои вообичаено се користат за прочистување на човечката cccDNA [32, 33].Откривме дека просечните концентрации на ccfDNA на хемолимфата во школките се во опсегот на ниски микрограми на ml хемолимфа (види Табела S2, Дополнителни информации).Овој опсег на концентрации е многу поголем отколку кај здравите луѓе (ниски нанограми на милилитар), но во ретки случаи, кај пациенти со рак, нивото на ccfDNA може да достигне неколку микрограми на милилитар [34, 35].Анализата на дистрибуцијата на големината на ccfDNA на хемолимфата покажа дека овие фрагменти варираат во голема мера по големина, кои се движат од 1000 bp до 1000 bp.до 5000 bp (сл. 2).Слични резултати беа добиени со користење на QIAamp Investigator Kit базиран на силика, метод кој вообичаено се користи во форензичката наука за брзо изолирање и прочистување на геномната ДНК од примероци на ДНК со ниска концентрација, вклучително и ccfDNA [36].
Репрезентативен ccfDNA електрофореграм на хемолимфа од школки.Извлечено со NucleoSnap плазма комплет (горе) и QIAamp DNA истражувачки комплет.B Виолина графика која ја прикажува дистрибуцијата на концентрациите на ccfDNA на хемолимфата (± SE) во школки.Црните и црвените линии ја претставуваат медијаната и првиот и третиот квартал, соодветно.
Приближно 1% од ccfDNA кај луѓето и приматите има странски извор [21, 37].Со оглед на полуотворениот циркулаторен систем на бивалви, морската вода богата со микроби и дистрибуцијата на големината на ccfDNA на школки, претпоставивме дека ccfDNA на хемолимфата на школки може да содржи богат и разновиден базен на микробна ДНК.За да ја тестираме оваа хипотеза, ја секвенциониравме ccfDNA на хемолимфата од примероците на Aulacomya atra собрани од островите Кергуелен, давајќи над 10 милиони читања, од кои 97,6% поминаа контрола на квалитетот.Читањата потоа беа класифицирани според сопствени и не-извори со користење на базите на податоци за двовалвни BLASTN и NCBI (Сл. S1, Дополнителни информации).
Кај луѓето, и нуклеарната и митохондријалната ДНК може да се ослободат во крвотокот [38].Меѓутоа, во оваа студија, не беше можно детално да се опише нуклеарната геномска ДНК на школки, имајќи предвид дека геномот на A. atra не е секвенциониран или опишан.Сепак, можевме да идентификуваме голем број ccfDNA фрагменти од наше потекло користејќи ја бивалвната библиотека (сл. S2, Дополнителни информации).Исто така, го потврдивме присуството на фрагменти на ДНК од наше потекло со насочено PCR засилување на оние гени на A. atra кои беа секвенционирани (сл. 3).Слично на тоа, имајќи предвид дека митохондријалниот геном на A. atra е достапен во јавните бази на податоци, може да се најдат докази за присуство на фрагменти од митохондријална ccfDNA во хемолимфата на A. atra.Присуството на фрагменти од митохондријална ДНК беше потврдено со PCR засилување (сл. 3).
Различни митохондријални гени беа присутни во хемолимфата на A. atra (црвени точки – залихи: SRX5705969) и M. platensis (сини точки – број на залиха: SRX5705968) засилена со PCR.Слика адаптирана од Breton et al., 2011 B Засилување на супернатантот на хемолимфот од A. atra Складирано на FTA хартија.Користете перфоратор од 3 mm за да го додадете директно во цевката за PCR што ја содржи мешавината на PCR.
Со оглед на изобилната микробна содржина во морската вода, првично се фокусиравме на карактеризацијата на секвенците на микробната ДНК во хемолимфата.За да го направите ова, ние користиме две различни стратегии.Првата стратегија користеше Kraken2, програма за класификација на секвенци базирана на алгоритам која може да идентификува микробиолошки секвенци со точност споредлива со BLAST и други алатки [28].Повеќе од 6719 читања беа утврдени дека се од бактериско потекло, додека 124 и 64 беа од археи и вируси, соодветно (сл. 4).Најзастапени фрагменти од бактериска ДНК беа Firmicutes (46%), Proteobacteria (27%) и Bacteroidetes (17%) (сл. 4а).Оваа дистрибуција е во согласност со претходните студии на микробиомот на морски сини школки [39, 40].Гамапротеобактериите беа главната класа на протеобактерии (44%), вклучително и многу вибриони (сл. 4б).Методот ddPCR го потврди присуството на фрагменти на Vibrio ДНК во ccfDNA на A. atra hemolymph (сл. 4в) [41].За да се добијат повеќе информации за бактериското потекло на ccfDNA, беше преземен дополнителен пристап (Сл. S2, Дополнителни информации). Во овој случај, отчитувањата што се преклопуваа беа составени како отчитувања со спарени краеви и беа класифицирани како од само (двовални) или несамо потекло користејќи BLASTN и вредност e од 1e−3 и прекин со >90% хомологија. Во овој случај, отчитувањата што се преклопуваа беа составени како отчитувања со спарени краеви и беа класифицирани како од само (двовални) или несамо потекло користејќи BLASTN и вредност e од 1e−3 и прекин со >90% хомологија. Во етом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения со парными концами и были классифицированы како собственные (двустворчатые моллюски) или чужие по происхольждени отсечения со гомологией> 90%. Во овој случај, преклопувачките отчитувања беа собрани како читања со спарени завршетоци и беа класифицирани како природни (двовалвни) или неоригинални користејќи BLASTN и e вредност од 1e-3 и отсек со >90% хомологија.在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN 和1e-3 皐e 倢%值分类为自身（双壳类）或非自身来源。在 这 种 情况 下 ， 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 ， 使用 使用 使 用 使1-e3和> 90% 同源性 的 分类 自身 （双 壳类） 非 自身。。。。。。 Во етом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения со парными концами и классифицированы како собственные (двустворие моллюски) или несобственные по происхольждени рога гомологии> 90%. Во овој случај, преклопувачките отчитувања беа собрани како отчитувања со спарени завршетоци и класифицирани како сопствени (двовални) или неоригинални користејќи вредности e BLASTN и 1e-3 и праг на хомологија >90%.Бидејќи геномот на A. atra сè уште не е секвенциониран, ја користевме стратегијата за склопување de novo на асемблерот за секвенционирање на следната генерација на MEGAHIT (NGS).Вкупно 147.188 контиги се идентификувани како зависни (бивалвици) од потекло.Овие контиги потоа беа експлодирани со е-вредности од 1e-10 користејќи BLASTN и BLASTX.Оваа стратегија ни овозможи да идентификуваме 482 небивалвни фрагменти присутни во A. atra ccfDNA.Повеќе од половина (57%) од овие фрагменти на ДНК се добиени од бактерии, главно од жабрени симбиони, вклучително и сулфотрофни симбиони, и од жабрени симбиони Solemya velum (сл. 5).
Релативно изобилство на ниво на тип.Б.Репрезентативно засилување на ddPCR C Vibrio spp.А. Фрагменти од генот 16S rRNA (сино) во три атра хемолимфи.
Беа анализирани вкупно 482 собрани контиги.Општ профил на таксономската дистрибуција на метагеномските контиг прибелешки (прокариоти и еукариоти).Б Детална дистрибуција на фрагменти од бактериска ДНК идентификувани со BLASTN и BLASTX.
Анализата Kraken2, исто така, покажа дека ccfDNA од школки содржи археални ДНК фрагменти, вклучувајќи ДНК фрагменти од Euryarchaeota (65%), Crenarchaeota (24%) и Thaurmarcheota (11%) (сл. 6а).Присуството на фрагменти на ДНК добиени од Euryarchaeota и Crenarchaeota, претходно пронајдени во микробната заедница на калифорниските школки, не треба да изненадува [42].Иако Euryarchaeota често се поврзува со екстремни услови, сега е признаено дека и Euryarchaeota и Crenarcheota се меѓу најчестите прокариоти во морската криогена средина [43, 44].Присуството на метаногени микроорганизми во школките не е изненадувачки, со оглед на неодамнешните извештаи за екстензивно истекување на метан од истекувањето на дното на висорамнината Кергулен [45] и можното производство на микроби метан забележано на брегот на островите Кергелен [46].
Нашето внимание потоа се префрли на читањата од ДНК вирусите.Според нашите сознанија, ова е прва нецелна студија за содржината на вирусот во школките.Како што се очекуваше, најдовме ДНК фрагменти од бактериофаги (Caudovirales) (сл. 6б).Сепак, најчестата вирусна ДНК доаѓа од група нуклеоцитовируси, познат и како нуклеарен цитоплазматски голем ДНК вирус (NCLDV), кој има најголем геном од кој било вирус.Во рамките на оваа група, повеќето ДНК секвенци припаѓаат на фамилиите Mimimidoviridae (58%) и Poxviridae (21%), чии природни домаќини вклучуваат 'рбетници и членконоги, додека мал дел од овие ДНК секвенци припаѓаат на познати виролошки алги.Ги инфицира морските еукариотски алги.Секвенците се добиени и од вирусот Пандора, џиновскиот вирус со најголема големина на геном од кој било познат вирусен род.Интересно, опсегот на домаќини за кои се знае дека се инфицирани со вирусот, како што е утврдено со секвенционирање на ccfDNA на хемолимфата, беше релативно голем (Слика S3, Дополнителни информации).Вклучува вируси кои инфицираат инсекти како Baculoviridae и Iridoviridae, како и вируси кои ги инфицираат амебите, алгите и 'рбетниците.Најдовме и секвенци кои се совпаѓаат со геномот на Pithovirus sibericum.Питовирусите (исто така познати како „зомби вируси“) првпат беа изолирани од вечниот мраз стар 30.000 години во Сибир [47].Така, нашите резултати се конзистентни со претходните извештаи кои покажуваат дека не сите современи видови на овие вируси се изумрени [48] и дека овие вируси може да бидат присутни во оддалечените субарктички морски екосистеми.
Конечно, тестиравме за да видиме дали можеме да најдеме фрагменти од ДНК од други повеќеклеточни животни.Вкупно 482 странски контиги беа идентификувани од BLASTN и BLASTX со библиотеки nt, nr и RefSeq (геномски и протеински).Нашите резултати покажуваат дека меѓу странските фрагменти на ccfDNA на повеќеклеточни животни преовладува ДНК на коскените коски (сл. 5).Пронајдени се и ДНК фрагменти од инсекти и други видови.Релативно голем дел од фрагментите на ДНК не е идентификуван, веројатно поради недоволната застапеност на голем број морски видови во геномските бази на податоци во споредба со копнените видови [49].
Во овој труд, го применуваме концептот LB на школки, тврдејќи дека секвенционирањето на снимки од хемолимфа ccfDNA може да обезбеди увид во составот на морските крајбрежни екосистеми.Конкретно, откривме дека 1) хемолимфата од школки содржи релативно високи концентрации (нивоа на микрограми) на релативно големи (~ 1-5 kb) циркулирачки фрагменти на ДНК;2) овие ДНК фрагменти се и независни и независни 3) Меѓу странските извори на овие фрагменти на ДНК, најдовме бактериска, археална и вирусна ДНК, како и ДНК на други повеќеклеточни животни;4) Акумулацијата на овие туѓи ccfDNA фрагменти во хемолимфата се случува брзо и придонесува за внатрешната активност на филтрирање на школките.Како заклучок, нашата студија покажува дека концептот на ЛБ, кој досега се применуваше главно во областа на биомедицината, шифрира богат, но неистражен извор на знаење што може да се искористи за подобро разбирање на интеракцијата помеѓу видовите чувари и нивната околина.
Покрај приматите, ccfDNA изолацијата е пријавена кај цицачи, вклучувајќи глувци, кучиња, мачки и коњи [50, 51, 52].Сепак, според нашите сознанија, нашата студија е прва што го пријави откривањето и секвенционирањето на ccfDNA кај морски видови со отворен циркулаторен систем.Оваа анатомска карактеристика и способност за филтрирање на школките може, барем делумно, да ги објаснат различните карактеристики на големината на циркулирачките фрагменти на ДНК во споредба со другите видови.Кај луѓето, повеќето ДНК фрагменти кои циркулираат во крвта се мали фрагменти со големина од 150 до 200 bp.со максимален врв од 167 bp [34, 53].Мал, но значителен дел од фрагментите на ДНК се со големина помеѓу 300 и 500 bp, а околу 5% се подолги од 900 bp.[54].Причината за оваа дистрибуција на големината е што главниот извор на ccfDNA во плазмата се јавува како резултат на клеточна смрт, или поради клеточна смрт или поради некроза на циркулирачките хематопоетски клетки кај здрави индивидуи или поради апоптоза на клетките на туморот кај пациенти со рак (позната како циркулирачка туморска ДНК)., ctDNA).Распределбата на големината на ccfDNA на хемолимфата што ја најдовме кај школките се движеше од 1000 до 5000 bp, што сугерира дека ccfDNA на школки има различно потекло.Ова е логична хипотеза, бидејќи школките имаат полуотворен васкуларен систем и живеат во морски водни средини кои содржат високи концентрации на микробна геномска ДНК.Всушност, нашите лабораториски експерименти со користење на егзогена ДНК покажаа дека школките акумулираат фрагменти на ДНК во морската вода, барем по неколку часа тие се разградуваат по клеточното навлегување и/или ослободени и/или складирани во различни организации.Со оглед на реткоста на клетките (и прокариотски и еукариотски), употребата на интравалвуларни компартмани ќе го намали количеството на ccfDNA од сопствени извори, како и од странски извори.Со оглед на важноста на вродениот имунитет на две валвули и големиот број на циркулирачки фагоцити, понатаму претпоставивме дека дури и туѓата ccfDNA е збогатена со циркулирачки фагоцити кои акумулираат туѓа ДНК при голтање на микроорганизми и/или клеточни остатоци.Земени заедно, нашите резултати покажуваат дека ccfDNA на бивалвната хемолимфа е уникатно складиште на молекуларни информации и го зајакнува нивниот статус како чувар вид.
Нашите податоци покажуваат дека секвенционирањето и анализата на фрагментите од ccfDNA на хемолимфа добиени од бактерии може да обезбедат клучни информации за бактериската флора домаќин и бактериите присутни во околниот морски екосистем.Техниките за секвенционирање на снимки открија секвенци на комензалната бактерија A. atra жабрена што би биле пропуштени доколку се користеле конвенционалните методи за идентификација на 16S rRNA, делумно поради пристрасноста на референтната библиотека.Всушност, нашата употреба на LB податоци собрани од M. platensis во истиот слој на школки во Кергулен покажа дека составот на бактериски симбиони поврзани со жабрени е ист за двата вида школки (сл. S4, Дополнителни информации).Оваа сличност на две генетски различни школки може да го одрази составот на бактериските заедници во студените, сулфурните и вулканските наслаги на Кергулен [55, 56, 57, 58].Повисоките нивоа на микроорганизми кои го намалуваат сулфурот се добро опишани кога се собираат школки од биотурбирани крајбрежни области [59], како што е брегот на Порт-о-Франс.Друга можност е дека комензалната флора на школки може да биде засегната од хоризонталното пренесување [60, 61].Потребни се повеќе истражувања за да се утврди корелацијата помеѓу морската средина, површината на морското дно и составот на симбиотските бактерии во школките.Овие студии моментално се во тек.
Должината и концентрацијата на ccfDNA на хемолимфата, неговата леснотија на прочистување и високиот квалитет за да се овозможи брзо секвенционирање на сачмарката се некои од многуте предности на користењето на ccfDNA на школки за проценка на биодиверзитетот во морските крајбрежни екосистеми.Овој пристап е особено ефикасен за карактеризирање на вирусни заедници (вироми) во даден екосистем [62, 63].За разлика од бактериите, археите и еукариотите, вирусните геноми не содржат филогенетски конзервирани гени како што се секвенците 16S.Нашите резултати покажуваат дека течните биопсии од видови индикатори, како што се школките, може да се користат за да се идентификуваат релативно голем број фрагменти на вирусот ccfDNA за кои е познато дека ги инфицираат домаќините кои обично ги населуваат крајбрежните морски екосистеми.Ова ги вклучува вирусите за кои е познато дека инфицираат протозои, членконоги, инсекти, растенија и бактериски вируси (на пример, бактериофаги).Слична дистрибуција беше откриена кога го испитавме виромот на хемолимфата ccfDNA на сините школки (M. platensis) собрани во истиот слој на школки во Кергулен (Табела S2, Дополнителни информации).Секвенционирањето со пушка на ccfDNA е навистина нов пристап кој добива на интензитет во проучувањето на виромот на луѓето или другите видови [21, 37, 64].Овој пристап е особено корисен за проучување на двоверижни ДНК вируси, бидејќи ниту еден ген не е зачуван меѓу сите двоверижни ДНК вируси, што претставува најразновидна и најширока класа на вируси во Балтимор [65].Иако повеќето од овие вируси остануваат некласифицирани и може да вклучуваат вируси од сосема непознат дел од вирусниот свет [66], откривме дека виромите и опсегот на домаќинот на школките A. atra и M. platensis паѓаат помеѓу двата вида.слично (види слика S3, дополнителни информации).Оваа сличност не е изненадувачка, бидејќи може да го одрази недостатокот на селективност во навлегувањето на ДНК присутна во околината.Моментално се потребни идни студии со употреба на прочистена РНК за да се карактеризира РНК виромот.
Во нашата студија, користевме многу ригорозен цевковод адаптиран од работата на Коварски и колегите [37], кои користеа бришење во два чекора на здружени читања и контиги пред и по склопувањето на домашната ccfDNA, што резултираше со висок процент на немапирани читања.Затоа, не можеме да исклучиме дека некои од овие немапирани читања се уште имаат свое потекло, првенствено затоа што немаме референтен геном за овој вид школки.Го користевме и овој цевковод затоа што бевме загрижени за химерите помеѓу само и не-само отчитувањата и должината на читање генерирана од Illumina MiSeq PE75.Друга причина за повеќето непознати читања е тоа што голем дел од морските микроби, особено во оддалечените области како што е Кергулен, не се забележани.Ние користевме Illumina MiSeq PE75, претпоставувајќи должина на фрагменти од ccfDNA слични на човечката ccfDNA.За идни студии, со оглед на нашите резултати кои покажуваат дека ccfDNA на хемолимфата има подолго читање од луѓето и/или цицачите, препорачуваме користење на платформа за секвенционирање посоодветна за подолги ccfDNA фрагменти.Оваа практика ќе го олесни идентификувањето на повеќе индикации за подлабока анализа.Добивањето на моментално недостапната комплетна секвенца на нуклеарниот геном на A. atra, исто така, во голема мера ќе ја олесни дискриминацијата на ccfDNA од сопствени и не-извори.Имајќи предвид дека нашето истражување се фокусираше на можноста за примена на концептот на течна биопсија на школки, се надеваме дека бидејќи овој концепт ќе се користи во идните истражувања, ќе се развијат нови алатки и цевководи за да се зголеми потенцијалот на овој метод за проучување на микробната разновидност на школките.морски екосистем.
Како неинвазивен клинички биомаркер, покачените нивоа на ccfDNA во човечката плазма се поврзани со разни болести, оштетување на ткивото и стресни состојби [67,68,69].Ова зголемување е поврзано со ослободување на фрагменти на ДНК од сопствено потекло по оштетување на ткивото.Го решивме ова прашање користејќи акутен топлински стрес, во кој школките беа накратко изложени на температура од 30 °C.Оваа анализа ја извршивме на три различни видови школки во три независни експерименти.Сепак, не најдовме никаква промена во нивоата на ccfDNA по акутен топлински стрес (види Слика S5, дополнителни информации).Ова откритие може да го објасни, барем делумно, фактот дека школките имаат полуотворен циркулаторен систем и акумулираат големи количини на туѓа ДНК поради нивната висока активност на филтрирање.Од друга страна, школките, како и многу безрбетници, може да бидат поотпорни на оштетување на ткивото предизвикано од стрес, а со тоа го ограничува ослободувањето на ccfDNA во нивната хемолимфа [70, 71].
До денес, ДНК анализата на биодиверзитетот во водните екосистеми главно се фокусираше на метабаркодирање на ДНК (еДНК) на животната средина.Сепак, овој метод обично е ограничен во анализата на биолошката разновидност кога се користат прајмери.Употребата на секвенционирање на сачмарки ги заобиколува ограничувањата на PCR и пристрасниот избор на сетови на прајмери.Така, во извесна смисла, нашиот метод е поблиску до неодамна користениот метод за секвенционирање на еДНК со пушка со висок пропуст, кој е во состојба директно да секвенционира фрагментирана ДНК и да ги анализира речиси сите организми [72, 73].Сепак, постојат голем број фундаментални прашања кои го разликуваат LB од стандардните методи на eDNA.Се разбира, главната разлика помеѓу eDNA и LB е употребата на природен филтер домаќин.Пријавена е употребата на морски видови како сунѓери и бивалви (Dresseina spp.) како природен филтер за проучување на еДНК [74, 75].Сепак, студијата на Драјсена користела ткивна биопсија од која била извлечена ДНК.Анализата на ccfDNA од LB не бара ткивна биопсија, специјализирана и понекогаш скапа опрема и логистика поврзани со еДНК или ткивна биопсија.Всушност, неодамна објавивме дека ccfDNA од LB може да се складира и анализира со FTA поддршка без одржување на ладен ланец, што е голем предизвик за истражување во оддалечените области [76].Екстракцијата на ccfDNA од течни биопсии е исто така едноставна и обезбедува висококвалитетна ДНК за секвенционирање на пушка и PCR анализа.Ова е голема предност со оглед на некои технички ограничувања поврзани со еДНК анализата [77].Едноставноста и ниската цена на методот на земање примероци е исто така особено погоден за долгорочни програми за следење.Покрај нивната висока способност за филтрирање, друга добро позната карактеристика на бивалвите е хемискиот мукополисахариден состав на нивната слуз, што ја промовира апсорпцијата на вирусите [78, 79].Ова ги прави двовалвите идеален природен филтер за карактеризирање на биолошката разновидност и влијанието на климатските промени во даден воден екосистем.Иако присуството на фрагменти од ДНК добиени од домаќинот може да се гледа како ограничување на методот во споредба со еДНК, цената поврзана со поседувањето на таква народна ccfDNA во споредба со еДНК е истовремено разбирлива за огромното количество информации достапни за здравствени студии.офсет домаќин.Ова го вклучува присуството на вирусни секвенци интегрирани во геномот на домаќинот домаќин.Ова е особено важно за школките, со оглед на присуството на хоризонтално пренесени леукемични ретровируси кај бивалвите [80, 81].Друга предност на ЛБ во однос на еДНК е тоа што ја искористува фагоцитната активност на циркулирачките крвни зрнца во хемолимфата, која ги проголтува микроорганизмите (и нивните геноми).Фагоцитозата е главната функција на крвните клетки во бивалвите [82].Конечно, методот го користи високиот капацитет за филтрирање на школките (просечно 1,5 l/h морска вода) и дводневната циркулација, што го зголемува мешањето на различни слоеви на морска вода, овозможувајќи зафаќање на хетерологна еДНК.[83, 84].Така, анализата на ccfDNA на школки е интересна авенија со оглед на нутритивните, економските и еколошките влијанија на школките.Слично на анализата на LB собрана од луѓе, овој метод исто така ја отвора можноста за мерење на генетските и епигенетските промени во ДНК на домаќинот како одговор на егзогените супстанции.На пример, технологиите за секвенционирање од трета генерација може да се предвидат да вршат анализа на метилација на целиот геном во народна ccfDNA користејќи секвенционирање на нанопори.Овој процес треба да биде олеснет со фактот дека должината на фрагментите од ccfDNA од школки е идеално компатибилна со долгочитаните платформи за секвенционирање кои овозможуваат анализа на метилација на ДНК на целиот геном од едно секвенционирање без потреба од хемиски трансформации.Затоа, може да обезбеди вреден увид во основните механизми кои го регулираат одговорот по изложувањето на климатските промени или загадувачите [87].Сепак, употребата на LB не е без ограничувања.Непотребно е да се каже дека ова бара присуство на видови индикатори во екосистемот.Како што споменавме погоре, користењето на LB за проценка на биодиверзитетот на даден екосистем бара и ригорозен биоинформатички цевковод кој го зема предвид присуството на фрагменти на ДНК од изворот.Друг голем проблем е достапноста на референтни геноми за морските видови.Се надеваме дека иницијативите како што се Проектот за геноми на морски цицачи и неодамна воспоставениот проект Fish10k [88] ќе ја олеснат таквата анализа во иднина.Примената на концептот LB на морските организми кои се хранат со филтри е исто така компатибилна со најновите достигнувања во технологијата за секвенционирање, што го прави добро прилагоден за развој на биомаркери со повеќе оми за да обезбеди важни информации за здравјето на морските живеалишта како одговор на стресот од околината.
Податоците за секвенционирање на геномот се депонирани во NCBI Sequence Read Archive https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 под Bioprojects SRR8924808.
Brierley AS, Kingsford MJ Влијанието на климатските промени врз морскиот свет и екосистемите.Кол биологија.2009 година;19: P602-P614.
Гиси Е, Манеа Е, Мазарис АД, Фрашети С, Алмпаниду В, Бевилакуа С, и др.Размислете за комбинираните влијанија на климатските промени и другите локални стресни фактори врз морската средина.општа научна средина.2021; 755: 142564.
Карела Ф, Антуофермо Е, Фарина С, Салати Ф, Мандас Д, Прадо П, и др.).Наука од први март.2020; 7:48.
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. Намалената толеранција на топлина при повторливи услови на топлотен стрес ја објаснува високата летна смртност на сините школки.Научен извештај 2019 година;9:17498.
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER, et al.Неодамнешни промени во зачестеноста, причините и степенот на смртта на животните.Proc Natl Acad Sci САД.2015; 112: 1083-8.
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mughetti D, Cerruti F, Hosseini S, et al.Повеќе неспецифични патогени за видовите може да предизвикале масовна смртност на Pinna nobilis.Животот.2020; 10:238.
Бредли М, Коутс СЈ, Џенкинс Е, О'Хара ТМ.Потенцијалното влијание на климатските промени врз зоонотичните болести на Арктикот.Int J Circumpolar здравје.2005 година;64:468-77.
Beyer J., Greene NW, Brooks S., Allan IJ, Ruus A., Gomez T. et al.Сините школки (Mytilus edulis spp.) како сигнални организми во мониторингот на крајбрежното загадување: преглед.Mar Environ Res 2017;130:338-65.
Siravegna G, Marsoni S, Siena S, Bardelli A. Интеграција на течна биопсија во третман на рак.Nat Rev Чиста Oncol.2017 година;14:531–48.
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C, et al.Созревање на течна биопсија: Овозможува циркулирање на ДНК на туморот.Нат Рев Рак.2017; 17:223-38.
Mandel P., Metais P. Нуклеински киселини во човечката плазма.Записник од состаноци на подружниците на Soc Biol.1948 година;142:241-3.
Bronkhorst AJ, Ungerer W, Holdenrieder S. Нова улога за ДНК без клетки како молекуларен маркер за третман на рак.Квантификација на биомоларна анализа.2019; 17:100087.
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS Течната биопсија влегува во клиниката – прашања за имплементација и идни предизвици.Нат Рев Клин Онкол.2021 година;18:297–312.
Lo YM, Corbetta N., Chamberlain PF, Rai W., Sargent IL, Redman CW и други.Феталната ДНК е присутна во плазмата и серумот на мајката.Лансет.1997 година;350:485-7.
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR Студија на текот на бременоста и нејзините компликации користејќи циркулирачка екстрацелуларна РНК во крвта на жените за време на бременоста.Допедијатрија.2020; 8: 605219.
Олерих М, Шервуд К, Кеоун П, Шутц Е, Бек Ј, Стегбауер Ј, и сор.Течна биопсија: ДНК без донаторски клетки се користи за откривање на алогени лезии во бубрежен графт.Нат Рев Нефрол.2021 година;17:591-603.
Juan FC, Lo YM Иновации во пренаталната дијагностика: секвенционирање на мајчиниот плазма геном.Д-р Ана.2016; 67: 419-32.
Гу В, Денг Х, Ли М, Суку ИД, Аревало С, Страјк Д, и др.Брзо откривање на патоген со метагеномско секвенционирање на заразените телесни течности од следната генерација.Нат Медицина.2021; 27:115-24.