Ви благодариме што ја посетивте Nature.com. Верзијата на прелистувачот што ја користите има ограничена поддршка за CSS. За најдобро искуство, препорачуваме да користите ажуриран прелистувач (или да го оневозможите режимот на компатибилност во Internet Explorer). Во меѓувреме, за да обезбедиме континуирана поддршка, ќе ја прикажеме страницата без стилови и JavaScript.
Течната биопсија (LB) е концепт кој брзо добива на популарност во биомедицинската област. Концептот главно се базира на откривање на фрагменти од циркулирачка екстрацелуларна ДНК (ccfDNA), кои главно се ослободуваат како мали фрагменти по клеточната смрт во различни ткива. Мал дел од овие фрагменти потекнуваат од туѓи (странски) ткива или организми. Во тековната работа, го применивме овој концепт на школки, вид чувар познат по нивниот висок капацитет за филтрирање на морска вода. Ја користиме способноста на школките да дејствуваат како природни филтри за да ги фатат фрагментите од ДНК од животната средина од различни извори за да обезбедиме информации за биодиверзитетот на морските крајбрежни екосистеми. Нашите резултати покажуваат дека хемолимфата на школките содржи фрагменти од ДНК кои варираат во голема мера, од 1 до 5 kb. Секвенционирањето со пушка покажа дека голем број фрагменти од ДНК се од туѓо микробно потекло. Меѓу нив, пронајдовме фрагменти од ДНК од бактерии, археи и вируси, вклучувајќи вируси за кои е познато дека инфицираат различни домаќини кои најчесто се наоѓаат во крајбрежните морски екосистеми. Како заклучок, нашата студија покажува дека концептот на LB применет на школки претставува богат, но сè уште неистражен извор на знаење за микробната разновидност во морските крајбрежни екосистеми.
Влијанието на климатските промени (КП) врз биодиверзитетот на морските екосистеми е брзорастечка област на истражување. Глобалното затоплување не само што предизвикува важни физиолошки стресови, туку и ги поместува еволутивните граници на термичката стабилност на морските организми, влијаејќи на живеалиштето на голем број видови, поттикнувајќи ги да бараат поповолни услови [1, 2]. Покрај тоа што влијае на биодиверзитетот на метазоите, КП го нарушува деликатниот баланс на интеракциите домаќин-микроб. Оваа микробна дисбактериоза претставува сериозна закана за морските екосистеми бидејќи ги прави морските организми поподложни на заразни патогени [3, 4]. Се верува дека СП играат важна улога во масовните смртни случаи, што е сериозен проблем за управувањето со глобалните морски екосистеми [5, 6]. Ова е важно прашање со оглед на економските, еколошките и нутритивните влијанија на многу морски видови. Ова е особено точно за школките што живеат во поларните региони, каде што ефектите на КП се понепосредни и посериозни [6, 7]. Всушност, школките како што е Mytilus spp. се широко користени за следење на ефектите на КП врз морските екосистеми. Не е изненадувачки што е развиен релативно голем број биомаркери за следење на нивното здравје, честопати користејќи двостепен пристап кој вклучува функционални биомаркери базирани на ензимска активност или клеточни функции како што се одржливоста на клетките и фагоцитната активност [8]. Овие методи вклучуваат и мерење на концентрацијата на специфични индикатори за притисок кои се акумулираат во меките ткива по апсорпцијата на големи количини морска вода. Сепак, високиот капацитет на филтрација и полуотворениот циркулаторен систем на школките даваат можност за развој на нови хемолимфни биомаркери користејќи го концептот на течна биопсија (LB), едноставен и минимално инвазивен пристап кон управувањето со пациенти. Иако неколку видови циркулирачки молекули може да се најдат во човечкиот LB, овој концепт првенствено се базира на анализа на секвенционирање на ДНК на фрагменти од циркулирачка екстрацелуларна ДНК (ccfDNA) во плазмата. Всушност, присуството на циркулирачка ДНК во човечката плазма е познато од средината на 20 век [11], но дури во последниве години појавата на методи за секвенционирање со висок проток доведе до клиничка дијагноза базирана на ccfDNA. Присуството на овие циркулирачки ДНК фрагменти делумно се должи на пасивното ослободување на геномска ДНК (нуклеарна и митохондријална) по клеточната смрт. Кај здрави лица, концентрацијата на ccfDNA е нормално ниска (<10 ng/mL), но може да се зголеми за 5-10 пати кај пациенти кои страдаат од разни патологии или се подложени на стрес, што резултира со оштетување на ткивото. Кај здрави лица, концентрацијата на ccfDNA е нормално ниска (<10 ng/mL), но може да се зголеми за 5-10 пати кај пациенти кои страдаат од разни патологии или се подложени на стрес, што резултира со оштетување на ткивото. Во здоровых людей концентрация вккДНК во норме низкая (<10 нг/мл), но може да се повышаться во 5–10 разно во больных со различной патологией или подвергающихся стрессу, приводаврщенеюнему. Кај здрави луѓе, концентрацијата на cccDNA е нормално ниска (<10 ng/mL), но може да се зголеми за 5-10 пати кај пациенти со различни патологии или под стрес што доведува до оштетување на ткивото.在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/mL），但在患有各种病理或承受压力的患者中可增加5-10 倍，从而导致的在 健康 个体 中 ， ccfdna 的 浓度 较 低 （（<10 ng/ml） 但 在 各 种 病理 或中 可 增加 5-10 倍 ， 从而 组织。。。 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤损伤Концентрациите на ccfDNA обично се ниски (<10 нг/мл) во здоровых лудей, но може да бидат увеличени во 5-10 разно во пациентов со различными патологиями или стрессом, што може да се приводи на повреждению тканей. Концентрациите на ccfDNA се обично ниски (<10 ng/ml) кај здрави лица, но можат да се зголемат 5-10 пати кај пациенти со различни патологии или стрес, што резултира со оштетување на ткивото.Големината на фрагментите од ccfDNA варира во голема мера, но обично се движи од 150 до 200 bp. [12]. Анализата на самодобиената ccfDNA, т.е. ccfDNA од нормални или трансформирани клетки домаќини, може да се користи за откривање на генетски и епигенетски промени присутни во нуклеарниот и/или митохондријалниот геном, со што им помага на клиницистите да изберат специфични молекуларно-таргетирани терапии [13]. Сепак, ccfDNA може да се добие од странски извори како што е ccfDNA од фетални клетки за време на бременост или од трансплантирани органи [14,15,16,17]. ccfDNA е исто така важен извор на информации за откривање на присуство на нуклеински киселини на инфективен агенс (странски), што овозможува неинвазивно откривање на широко распространети инфекции кои не се идентификувани со хемокултури, избегнувајќи инвазивна биопсија на заразено ткиво [18]. Неодамнешните студии навистина покажаа дека човечката крв содржи богат извор на информации што може да се користат за идентификување на вирусни и бактериски патогени, и дека околу 1% од ccfDNA што се наоѓа во човечката плазма е од странско потекло [19]. Овие студии покажуваат дека биодиверзитетот на циркулирачкиот микробиом на организмот може да се процени со помош на анализа на ccfDNA. Сепак, до неодамна, овој концепт се користеше исклучиво кај луѓето и, во помала мера, кај другите 'рбетници [20, 21].
Во овој труд, го користиме LB потенцијалот за да ја анализираме ccfDNA на Aulacomya atra, јужен вид кој најчесто се наоѓа на субантарктичките острови Кергелен, група острови на врвот на голема висорамнина која се формирала пред 35 милиони години. вулканска ерупција. Користејќи in vitro експериментален систем, откривме дека фрагментите на ДНК во морската вода брзо се апсорбираат од школките и влегуваат во хемолимфниот оддел. Секвенционирањето со пушка покажа дека хемолимфата ccfDNA на школките содржи фрагменти на ДНК од сопствено и туѓо потекло, вклучувајќи симбиотски бактерии и фрагменти на ДНК од биоми типични за ладни вулкански морски крајбрежни екосистеми. Хемолимфата ccfDNA, исто така, содржи вирусни секвенци добиени од вируси со различни опсези на домаќини. Исто така, пронајдовме фрагменти на ДНК од повеќеклеточни животни како што се коскени риби, морски анемони, алги и инсекти. Како заклучок, нашата студија покажува дека концептот LB може успешно да се примени кај морските безрбетници за да се генерира богат геномски репертоар во морските екосистеми.
Возрасни единки (долги 55-70 mm) Mytilus platensis (M. platensis) и Aulacomya atra (A. atra) беа собрани од меѓуплимните карпести брегови на Порт-о-Франс (049°21.235 S, 070°13.490 E.). Островите Кергелен во декември 2018 година. Други возрасни сини школки (Mytilus spp.) беа добиени од комерцијален добавувач (PEI Mussel King Inc., Остров Принц Едвард, Канада) и ставени во аериран резервоар со контролирана температура (4°C) што содржи 10-20 L вештачка саламура од 32‰ (вештачка морска сол Reef Crystal, Instant Ocean, Вирџинија, САД). За секој експеримент, беа измерени должината и тежината на поединечните школки.
Бесплатен протокол со отворен пристап за оваа програма е достапен онлајн (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1). Накратко, LB хемолимфата беше собрана од абдукторните мускули како што е опишано [22]. Хемолимфата беше прочистена со центрифугирање на 1200 × g во тек на 3 минути, супернатантот беше замрзнат (-20°C) до употреба. За изолација и прочистување на cfDNA, примероците (1,5-2,0 ml) беа одмрзнати и обработени со помош на комплетот NucleoSnap cfDNA (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) според упатствата на производителот. ccfDNA беше складирана на -80°C до понатамошна анализа. Во некои експерименти, ccfDNA беше изолирана и прочистена со помош на комплетот QIAamp DNA Investigator (QIAGEN, Торонто, Онтарио, Канада). Прочистената ДНК беше квантифицирана со помош на стандарден PicoGreen тест. Распределбата на фрагментите од изолираната ccfDNA беше анализирана со капиларна електрофореза со помош на биоанализатор Agilent 2100 (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) со помош на комплет за ДНК со висока чувствителност. Анализата беше извршена со користење на 1 µl од примерокот од ccfDNA според упатствата на производителот.
За секвенционирање на фрагменти од хемолимфна ccfDNA, Génome Québec (Монтреал, Квебек, Канада) подготви библиотеки со пушка користејќи го комплетот Illumina DNA Mix од комплетот Illumina MiSeq PE75. Користен е стандарден адаптер (BioO). Датотеките со сурови податоци се достапни од архивата за читање секвенци на NCBI (SRR8924808 и SRR8924809). Основниот квалитет на читање е оценет со користење на FastQC [23]. Trimmomatic [24] е користен за сечење на адаптери и читања со слаб квалитет. Читањата со пушка со спарени краеви беа FLASH споени во подолги единечни читања со минимално преклопување од 20 bp за да се избегнат несовпаѓања [25]. Споените читања беа анотирани со BLASTN користејќи база на податоци за таксономија на двовалвните NCBI (e вредност < 1e−3 и 90% хомологија), а маскирањето на секвенците со ниска комплексност беше извршено со користење на DUST [26]. Споените читања беа анотирани со BLASTN користејќи база на податоци за таксономија на двовалвните NCBI (e вредност < 1e−3 и 90% хомологија), а маскирањето на секвенците со ниска комплексност беше извршено со користење на DUST [26]. Объединенные чтения были антированы со помош на BLASTN со использованием базы данных таксономии двустворчатых моллюсков NCBI (значење е < 1e-3 и 90% гоностивание последователно), а машки было выполнено со использованием ПРАШИНА [26]. Здружените читања беа анотирани со BLASTN користејќи ја базата на податоци за таксономија на двовалвните чаши NCBI (e вредност < 1e-3 и 90% хомологија), а маскирање на секвенци со ниска комплексност беше извршено со користење на DUST [26].使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90% 同源性）用BLASTN 注释合并的读数ST进行低复杂度序列的掩蔽.使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 90% 同源） 用 用 用 注释 合并 读数]进行 复杂度 序列 的。。。。 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽Объединенные чтения были антированы со помош на BLASTN со использованием таксономической базы данных дустворчатых моллюсков NCBI (значајност е <1e-3 и 90% ниска годокологност), а было выполнено со использованием ПРАШИНА [26]. Здружените читања беа анотирани со BLASTN користејќи ја NCBI базата на податоци за таксономијата на двовалвните (e вредност <1e-3 и 90% хомологија), а маскирање на секвенци со ниска комплексност беше извршено со користење на DUST [26].Читањата беа поделени во две групи: поврзани со секвенци на двовалвули (тука наречени самочитања) и неповрзани (несамочитања). Две групи беа одделно составени со помош на MEGAHIT за генерирање контизи [27]. Во меѓувреме, таксономската дистрибуција на отчитувањата на вонземскиот микробиом беше класифицирана со помош на Kraken2 [28] и графички претставена со Кронова кружна дијаграм на Galaxy [29, 30]. Оптималните kmers беа утврдени како kmers-59 од нашите прелиминарни експерименти. Потоа, самоконтизите беа идентификувани со усогласување со BLASTN (база на податоци за двовалвни NCBI, e вредност < 1e−10 и 60% хомологија) за конечна анотација. Потоа, самоконтизите беа идентификувани со усогласување со BLASTN (база на податоци за двовалвни NCBI, e вредност < 1e−10 и 60% хомологија) за конечна анотација. Затем собственные контиги были идентифицированы путем сопоставления со BLASTN (база данных двустворчатых моллюсков NCBI, значење е <1e-10 и гомологија 60%) за оценка. Потоа, самоконтигите беа идентификувани со споредување со BLASTN (база на податоци за двовалвуларни NCBI, вредност e <1e-10 и 60% хомологија) за конечна анотација.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60%同源性）对齐来识别自身重叠群以进行最终注释。然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% Затемите со идентифицирани собственные контиги за окончателни анониции путем сопоставления со BLASTN (база данных NCBI за двустворени моллюсков, значење е <1e-10 готово 6%). Потоа, самоконтигите беа идентификувани за конечна анотација со споредување со BLASTN (база на податоци за двовалвули NCBI, e вредност <1e-10 и 60% хомологија). Паралелно, контизите на несебните групи беа анотирани со BLASTN (nt NCBI база на податоци, e вредност < 1e−10 и 60% хомологија). Паралелно, контизите на несебните групи беа анотирани со BLASTN (nt NCBI база на податоци, e вредност < 1e−10 и 60% хомологија). Паралелно чужеродные групповые контиги были анотирани со помош на BLASTN (база данных nt NCBI, значење е <1e-10 и гомологија 60%). Паралелно, контизите на туѓи групи беа анотирани со BLASTN (NT NCBI база на податоци, e вредност <1e-10 и 60% хомологија).平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠 Паралелно контиги, не относящиеся к собствена група, со помош на BLASTN (база данных nt NCBI, значење е <1e-10 и гомологија 60%). Паралелно, контизите кои не се од самостојна група беа анотирани со BLASTN (nt NCBI база на податоци, e вредност <1e-10 и 60% хомологија). BLASTX беше спроведен и на несебесни контизи користејќи ги базите на податоци nr и RefSeq протеин NCBI (e вредност < 1e−10 и 60% хомологија). BLASTX беше спроведен и на несебесни контизи користејќи ги базите на податоци nr и RefSeq протеин NCBI (e вредност < 1e−10 и 60% хомологија). BLASTX также был проведен на несамостоятельных контигах со использованием баз данных белка бр и RefSeq NCBI (значение е <1e-10 и гомология 60%). BLASTX беше извршен и на не-сами контизи користејќи ги базите на податоци за протеини nr и RefSeq NCBI (e вредност < 1e-10 и 60% хомологија).还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60%还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60% BLASTX также выполняли на несамостоятельных контигах со использованием баз данных белка nr и RefSeq NCBI (значение е <1e-10 и гомологија 60%). BLASTX беше извршен и на не-сами контизи користејќи ги базите на податоци за протеини nr и RefSeq NCBI (e вредност <1e-10 и 60% хомологија).Базените BLASTN и BLASTX од не-самоконтизи ги претставуваат конечните контизи (видете ја Дополнителната датотека).
Прајмерите што се користат за PCR се наведени во Табела S1. За амплификација на гените-цели на ccfDNA беше употребена Taq ДНК полимераза (Bio Basic Canada, Markham, ON). Беа користени следните услови на реакција: денатурација на 95°C за 3 минути, 95°C за 1 минута, поставена температура на жарење за 1 минута, издолжување на 72°C за 1 минута, 35 циклуси и конечно 72°C во рок од 10 минути. . PCR производите беа одделени со електрофореза во агарозни гелови (1,5%) што содржат SYBRTM Safe DNA Gel Stain (Invitrogen, Burlington, ON, Канада) на 95 V.
Школките (Mytilus spp.) беа аклиматизирани во 500 ml оксигенирана морска вода (32 PSU) 24 часа на 4°C. Плазмидната ДНК што содржи вметнат дел што ја кодира секвенцата на хумана галектин-7 cDNA (NCBI пристапен број L07769) беше додадена во шишенцето со конечна концентрација од 190 μg/μl. Школките инкубирани под истите услови без додавање ДНК беа контролната единица. Третиот контролен резервоар содржеше ДНК без школки. За да се следи квалитетот на ДНК во морската вода, од секој резервоар беа земени примероци од морска вода (20 μl; три повторувања). За следливост на плазмидната ДНК, LB школките беа собрани во наведените времиња и анализирани со qPCR и ddPCR. Поради високата содржина на сол во морската вода, аликвотите беа разредени во вода со PCR квалитет (1:10) пред сите PCR анализи.
Дигиталната PCR со капки (ddPCR) беше извршена со користење на протоколот BioRad QX200 (Мисисага, Онтарио, Канада). Користете го температурниот профил за да ја одредите оптималната температура (Табела S1). Капките беа генерирани со користење на генератор на капки QX200 (BioRad). ddPCR беше спроведена на следниов начин: 95°C за 5 минути, 50 циклуси од 95°C за 30 секунди и дадена температура на жарење за 1 минута и 72°C за 30 секунди, 4°C за 5 минути и 90°C во рок од 5 минути. Бројот на капки и позитивни реакции (број на копии/µl) беше измерен со користење на читач на капки QX200 (BioRad). Примероците со помалку од 10.000 капки беа отфрлени. Контролата на шемата не беше извршена секој пат кога се извршуваше ddPCR.
qPCR беше извршен со користење на Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Сиднеј, Австралија) и LGALS7 специфични прајмери. Сите квантитативни PCR беа извршени во 20 µl со користење на QuantiFast SYBR Green PCR Kit (QIAGEN). qPCR започна со 15-минутна инкубација на 95°C, проследено со 40 циклуси на 95°C за 10 секунди и на 60°C за 60 секунди со едно собирање на податоци. Кривите на топење беа генерирани со користење на последователни мерења на 95°C за 5 секунди, 65°C за 60 секунди и 97°C на крајот од qPCR. Секој qPCR беше извршен во три примероци, освен за контролните примероци.
Бидејќи дагњите се познати по нивната висока стапка на филтрација, прво истраживме дали можат да филтрираат и задржат фрагменти од ДНК присутни во морската вода. Исто така, бевме заинтересирани дали овие фрагменти се акумулираат во нивниот полуотворен лимфатичен систем. Ова прашање го решивме експериментално со следење на судбината на растворливите фрагменти од ДНК додадени во резервоарите со сини дагњи. За да го олесниме следењето на фрагментите од ДНК, користевме туѓа (не сопствена) плазмидна ДНК што го содржи човечкиот ген галектин-7. ddPCR ги следи фрагментите од плазмидна ДНК во морската вода и дагњите. Нашите резултати покажуваат дека ако количината на фрагменти од ДНК во морската вода остане релативно константна со текот на времето (до 7 дена) во отсуство на дагњи, тогаш во присуство на дагњи ​​ова ниво речиси целосно исчезна во рок од 8 часа (Сл. 1а, б). Фрагменти од егзогена ДНК беа лесно откриени во рок од 15 минути во интравалвуларна течност и хемолимфа (Сл. 1в). Овие фрагменти сè уште можеа да се детектираат до 4 часа по изложеноста. Оваа активност на филтрирање во однос на фрагментите од ДНК е споредлива со активноста на филтрирање на бактериите и алгите [31]. Овие резултати укажуваат дека дагњите можат да филтрираат и акумулираат туѓа ДНК во нивните течни оддели.
Релативни концентрации на плазмидна ДНК во морска вода во присуство (А) или отсуство (Б) на школки, мерени со ddPCR. Во А, резултатите се изразени како проценти, при што границите на полињата ги претставуваат 75-тиот и 25-тиот перцентил. Прилагодената логаритамска крива е прикажана со црвена боја, а областа засенчена со сива боја го претставува интервалот на доверба од 95%. Во Б, црвената линија ја претставува средната вредност, а сината линија го претставува интервалот на доверба од 95% за концентрацијата. В Акумулација на плазмидна ДНК во хемолимфата и валвуларната течност на школките во различни времиња по додавањето на плазмидна ДНК. Резултатите се претставени како откриени апсолутни копии/mL (±SE).
Потоа, го истражувавме потеклото на ccfDNA кај школки собрани од школки на островите Кергелен, оддалечена група острови со ограничено антропогено влијание. За таа цел, cccDNA од хемолимфите на школките беше изолирана и прочистена со методи што најчесто се користат за прочистување на човечката cccDNA [32, 33]. Откривме дека просечните концентрации на хемолимфна ccfDNA кај школките се во низок опсег на микрограми на мл хемолимфа (видете Табела S2, Дополнителни информации). Овој опсег на концентрации е многу поголем отколку кај здрави луѓе (ниски нанограми на милилитар), но во ретки случаи, кај пациенти со рак, нивото на ccfDNA може да достигне неколку микрограми на милилитар [34, 35]. Анализата на распределбата на големината на хемолимфната ccfDNA покажа дека овие фрагменти варираат во голема мера по големина, почнувајќи од 1000 bp до 1000 bp, па сè до 5000 bp (Сл. 2). Слични резултати се добиени со користење на комплетот за истражување QIAamp базиран на силициум диоксид, метод што најчесто се користи во форензичката наука за брзо изолирање и прочистување на геномската ДНК од примероци на ДНК со ниска концентрација, вклучувајќи ја и ccfДНК [36].
Репрезентативен ccfDNA електрофореграм на хемолимфа од школки. Екстрахирано со NucleoSnap Plasma Kit (горе) и QIAamp DNA Investigator Kit. Б. Графикон на виолина што ја прикажува распределбата на концентрациите на ccfDNA од хемолимфа (±SE) кај школки. Црните и црвените линии ја претставуваат средната вредност и првиот и третиот квартил, соодветно.
Приближно 1% од ccfDNA кај луѓето и приматите има странски извор [21, 37]. Со оглед на полуотворениот циркулаторен систем на школките, морската вода богата со микроби и распределбата на големината на ccfDNA од школки, претпоставивме дека хемолимфата ccfDNA од школки може да содржи богат и разновиден пул на микробна ДНК. За да ја тестираме оваа хипотеза, ја секвенциониравме хемолимфата ccfDNA од примероци од Aulacomya atra собрани од островите Кергелен, давајќи над 10 милиони читања, од кои 97,6% ја поминале контролата на квалитетот. Читањата потоа беа класифицирани според сопствени и несопствени извори користејќи ги базите на податоци за школки BLASTN и NCBI (Сл. S1, Дополнителни информации).
Кај луѓето, и нуклеарната и митохондријалната ДНК можат да се ослободат во крвотокот [38]. Сепак, во оваа студија, не беше можно детално да се опише нуклеарната геномска ДНК на школките, со оглед на тоа што геномот на A. atra не е секвенциониран или опишан. Сепак, бевме во можност да идентификуваме голем број фрагменти од ccfDNA од наше потекло користејќи ја библиотеката на школки (Сл. S2, Дополнителни информации). Исто така, го потврдивме присуството на фрагменти од ДНК од наше потекло со насочена PCR амплификација на оние гени на A. atra кои беа секвенционирани (Сл. 3). Слично на тоа, со оглед на тоа што митохондријалниот геном на A. atra е достапен во јавни бази на податоци, може да се најдат докази за присуство на митохондријални фрагменти од ccfDNA во хемолимфата на A. atra. Присуството на фрагменти од митохондријална ДНК беше потврдено со PCR амплификација (Сл. 3).
Различни митохондријални гени беа присутни во хемолимфата на A. atra (црвени точки – матичен број: SRX5705969) и M. platensis (сини точки – матичен број: SRX5705968) амплифицирани со PCR. Слика адаптирана од Breton et al., 2011 B Амплификација на супернатантот на хемолимфата од A. atra Складирано на FTA хартија. Користете перфоратор од 3 mm за да додадете директно во PCR епруветата што ја содржи PCR смесата.
Со оглед на изобилството на микробни содржини во морската вода, првично се фокусиравме на карактеризацијата на микробните ДНК секвенци во хемолимфата. За да го направиме ова, користиме две различни стратегии. Првата стратегија го користеше Kraken2, програма за класификација на секвенци базирана на алгоритам која може да идентификува микробни секвенци со точност споредлива со BLAST и други алатки [28]. Беше утврдено дека повеќе од 6719 читања се од бактериско потекло, додека 124 и 64 беа од археи и вируси, соодветно (Сл. 4). Најзастапените фрагменти од бактериска ДНК беа Firmicutes (46%), Proteobacteria (27%) и Bacteroidetes (17%) (Сл. 4a). Оваа дистрибуција е во согласност со претходните студии за микробиомот на морската сина школка [39, 40]. Гамапротеобактериите беа главната класа на Proteobacteria (44%), вклучувајќи многу Vibrionales (Сл. 4b). Методот ddPCR го потврди присуството на фрагменти од ДНК од Vibrio во ccfDNA на хемолимфата A. atra (Сл. 4c) [41]. За да се добијат повеќе информации за бактериското потекло на ccfDNA, беше преземен дополнителен пристап (Сл. S2, Дополнителни информации). Во овој случај, отчитувањата што се преклопуваа беа собрани како отчитувања на парни краеви и беа класифицирани како од сопствено (школски залистоци) или туѓо потекло користејќи BLASTN и e вредност од 1e−3 и гранична вредност со хомологија од >90%. Во овој случај, отчитувањата што се преклопуваа беа собрани како отчитувања на парни краеви и беа класифицирани како од сопствено (школски залистоци) или туѓо потекло користејќи BLASTN и e вредност од 1e−3 и гранична вредност со хомологија од >90%. Во етом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения со парными концами и были классифицированы како собственные (двустворчатые моллюски) или чужие по происхольждени 1e-3 и отсечения со гомологией> 90%. Во овој случај, преклопувачките отчитувања беа собрани како парни отчитувања и беа класифицирани како нативни (двојни залистоци) или неоригинални користејќи BLASTN и e вредност од 1e-3 и гранична вредност со >90% хомологија.在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN 和1e-3 皒e >90%同源性的截止值分类为自身（双壳类）或非自身来源。在 这 种 情况 下 ， 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 ， 使用 使用 使 用 猿1-e3 bla值 和> 90% 同源性 的 分类 自身 （双 壳类） 非 自身。。。。。。 Во етом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения со парными концами и класифицированы как собственные (двустворие моллюски) или несобственные по происхолждени 1e-3 и порога гомологии> 90%. Во овој случај, преклопувачките отчитувања беа собрани како парни отчитувања и класифицирани како сопствени (двојни залистоци) или неоригинални користејќи вредности на e BLASTN и 1e-3 и праг на хомологија >90%.Бидејќи геномот на A. atra сè уште не е секвенциониран, ја користевме стратегијата за de novo асемблерија на асемблерот за секвенционирање од следната генерација (NGS) на MEGAHIT. Вкупно 147.188 контиги се идентификувани како зависни (школски) фрагменти од потекло. Овие контиги потоа беа експлодирани со e-вредности од 1e-10 користејќи BLASTN и BLASTX. Оваа стратегија ни овозможи да идентификуваме 482 фрагменти кои не се школски фрагменти присутни во ccfDNA на A. atra. Повеќе од половина (57%) од овие ДНК фрагменти се добиени од бактерии, главно од жабрени симбионти, вклучувајќи сулфотрофни симбионти, и од жабрени симбионти Solemya velum (Сл. 5).
Релативна изобилство на ниво на тип. B Микробна разновидност на два главни фила (Firmicutes и Proteobacteria). Репрезентативна амплификација на ddPCR C Vibrio spp. A. Фрагменти од генот 16S rRNA (сина) во три атра хемолимфи.
Анализирани се вкупно 482 собрани контизи. Општ профил на таксономската дистрибуција на метагеномските анотации на контизи (прокариоти и еукариоти). Б Детална дистрибуција на фрагменти од бактериска ДНК идентификувани со BLASTN и BLASTX.
Анализата на Kraken2, исто така, покажа дека ccfDNA на школките содржи архески ДНК фрагменти, вклучувајќи ДНК фрагменти од Euryarchaeota (65%), Crenarchaeota (24%) и Thaurmarcheota (11%) (Сл. 6а). Присуството на ДНК фрагменти добиени од Euryarchaeota и Crenarchaeota, претходно пронајдени во микробната заедница на калифорниските школки, не треба да биде изненадување [42]. Иако Euryarchaeota често се поврзува со екстремни услови, сега е познато дека и Euryarchaeota и Crenarcheota се меѓу најчестите прокариоти во морската криогена средина [43, 44]. Присуството на метаногени микроорганизми во школките не е изненадувачки, со оглед на неодамнешните извештаи за обемни протекувања на метан од протекувања на дното на висорамнината Кергелен [45] и можното производство на микробен метан забележано покрај брегот на островите Кергелен [46].
Потоа нашето внимание се префрли на отчитувања од ДНК вируси. Според нашите сознанија, ова е првата студија надвор од целта за содржината на вирусот кај школките. Како што се очекуваше, пронајдовме ДНК фрагменти од бактериофаги (Caudovirales) (Сл. 6б). Сепак, најчестата вирусна ДНК доаѓа од филум на нуклеоцитовируси, познат и како нуклеарен цитоплазматски голем ДНК вирус (NCLDV), кој има најголем геном од кој било вирус. Во рамките на овој филум, повеќето ДНК секвенци припаѓаат на семејствата Mimimidoviridae (58%) и Poxviridae (21%), чии природни домаќини вклучуваат 'рбетници и членконоги, додека мал дел од овие ДНК секвенци припаѓаат на познати вирусолошки алги. Инфицира морски еукариотски алги. Секвенците се добиени и од вирусот Пандора, џиновскиот вирус со најголема големина на геном од кој било познат вирусен род. Интересно е што опсегот на домаќини за кои се знае дека се инфицирани со вирусот, како што е утврдено со секвенционирање на хемолимфната ccfДНК, беше релативно голем (Слика S3, Дополнителни информации). Вклучува вируси кои инфицираат инсекти како што се Baculoviridae и Iridoviridae, како и вируси кои инфицираат амеба, алги и 'рбетници. Исто така, пронајдовме секвенци што се совпаѓаат со геномот на Pithovirus sibericum. Питовирусите (исто така познати како „зомби вируси“) за прв пат беа изолирани од 30.000 години стар пермафрост во Сибир [47]. Така, нашите резултати се во согласност со претходните извештаи кои покажуваат дека не сите современи видови на овие вируси се изумрени [48] и дека овие вируси може да бидат присутни во оддалечените субарктички морски екосистеми.
Конечно, тестиравме дали можеме да пронајдеме ДНК фрагменти од други повеќеклеточни животни. Вкупно 482 туѓи контизи беа идентификувани од BLASTN и BLASTX со nt, nr и RefSeq библиотеки (геномски и протеински). Нашите резултати покажуваат дека меѓу туѓите фрагменти од ccfDNA на повеќеклеточни животни преовладува ДНК од коскени коски (Сл. 5). Пронајдени се и ДНК фрагменти од инсекти и други видови. Релативно голем дел од ДНК фрагментите не се идентификувани, веројатно поради недоволната застапеност на голем број морски видови во геномските бази на податоци во споредба со копнените видови [49].
Во овој труд, го применуваме концептот LB на школки, тврдејќи дека секвенционирањето на хемолимфата ccfDNA може да даде увид во составот на морските крајбрежни екосистеми. Особено, откривме дека 1) хемолимфата на школки содржи релативно високи концентрации (нивоа на микрограми) на релативно големи (~1-5 kb) циркулирачки ДНК фрагменти; 2) овие ДНК фрагменти се и независни и независни 3) Меѓу странските извори на овие ДНК фрагменти, пронајдовме бактериска, археична и вирусна ДНК, како и ДНК од други повеќеклеточни животни; 4) Акумулацијата на овие странски фрагменти од ccfDNA во хемолимфата се случува брзо и придонесува за внатрешната активност на филтрирање на школките. Како заклучок, нашата студија покажува дека концептот на LB, кој досега се применуваше главно во областа на биомедицината, кодира богат, но неистражен извор на знаење што може да се користи за подобро разбирање на интеракцијата помеѓу видовите-сентинели и нивната околина.
Покрај приматите, изолација на ccfDNA е пријавена кај цицачи, вклучувајќи глувци, кучиња, мачки и коњи [50, 51, 52]. Сепак, според нашите сознанија, нашата студија е првата што известува за откривање и секвенционирање на ccfDNA кај морски видови со отворен систем на циркулација. Оваа анатомска карактеристика и способност за филтрирање на школките може, барем делумно, да ги објасни различните карактеристики на големината на циркулирачките ДНК фрагменти во споредба со другите видови. Кај луѓето, повеќето ДНК фрагменти што циркулираат во крвта се мали фрагменти со големина од 150 до 200 bp, со максимален врв од 167 bp [34, 53]. Мал, но значаен дел од ДНК фрагментите се со големина помеѓу 300 и 500 bp, а околу 5% се подолги од 900 bp. [54]. Причината за оваа распределба на големината е тоа што главниот извор на ccfDNA во плазмата се јавува како резултат на клеточна смрт, или поради клеточна смрт или поради некроза на циркулирачките хематопоетски клетки кај здрави лица или поради апоптоза на туморските клетки кај пациенти со рак (позната како циркулирачка туморска ДНК). Распределбата на големината на хемолимфата ccfDNA што ја пронајдовме кај школките се движеше од 1000 до 5000 bp, што сугерира дека ccfDNA на школките има различно потекло. Ова е логична хипотеза, бидејќи школките имаат полуотворен васкуларен систем и живеат во морски водни средини што содржат високи концентрации на микробна геномска ДНК. Всушност, нашите лабораториски експерименти со употреба на егзогена ДНК покажаа дека школките акумулираат фрагменти од ДНК во морската вода, барем по неколку часа тие се разградуваат по клеточното апсорбирање и/или се ослободуваат и/или се складираат во различни организации. Со оглед на реткоста на клетките (и прокариотски и еукариотски), употребата на интравалвуларни оддели ќе ја намали количината на ccfDNA од сопствени извори, како и од туѓи извори. Со оглед на важноста на вродениот имунитет на двовалвулата и големиот број циркулирачки фагоцити, дополнително претпоставивме дека дури и туѓата ccfDNA е збогатена со циркулирачки фагоцити кои акумулираат туѓа ДНК по ингестија на микроорганизми и/или клеточни остатоци. Земени заедно, нашите резултати покажуваат дека ccfDNA на двовалвулата хемолимфа е единствено складиште на молекуларни информации и го зајакнува нивниот статус како вид-чувар.
Нашите податоци покажуваат дека секвенционирањето и анализата на фрагментите од хемолимфата ccfDNA добиени од бактерии можат да обезбедат клучни информации за бактериската флора на домаќинот и бактериите присутни во околниот морски екосистем. Техниките за секвенционирање со истрел открија секвенци на жабрите на коменсалната бактерија A. atra кои би биле пропуштени доколку се користеле конвенционални методи за идентификација на 16S rRNA, делумно поради пристрасност на референтната библиотека. Всушност, нашата употреба на LB податоци собрани од M. platensis во истиот слој на школки во Кергелен покажа дека составот на бактериските симбионти поврзани со жабрите бил ист за двата вида школки (Сл. S4, Дополнителни информации). Оваа сличност на две генетски различни школки може да го одразува составот на бактериските заедници во ладните, сулфурни и вулкански наслаги на Кергелен [55, 56, 57, 58]. Повисоките нивоа на микроорганизми што го намалуваат сулфурот се добро опишани при берба на школки од биотурбирани крајбрежни области [59], како што е брегот на Порт-о-Франс. Друга можност е дека флората на коменсалните школки може да биде засегната од хоризонтално пренесување [60, 61]. Потребни се повеќе истражувања за да се утврди корелацијата помеѓу морската средина, површината на морското дно и составот на симбиотските бактерии кај школките. Овие студии се во тек.
Должината и концентрацијата на хемолимфата ccfDNA, нејзината леснотија на прочистување и високиот квалитет што овозможува брзо секвенционирање се некои од многуте предности на користењето на хемолимфата ccfDNA за проценка на биодиверзитетот во морските крајбрежни екосистеми. Овој пристап е особено ефикасен за карактеризирање на вирусни заедници (вироми) во даден екосистем [62, 63]. За разлика од бактериите, археите и еукариотите, вирусните геноми не содржат филогенетски конзервирани гени како што се 16S секвенците. Нашите резултати покажуваат дека течните биопсии од индикаторски видови како што се школките може да се користат за идентификување на релативно голем број фрагменти од вирусот ccfDNA за кои е познато дека инфицираат домаќини кои обично ги населуваат крајбрежните морски екосистеми. Ова вклучува вируси за кои е познато дека инфицираат протозои, членконоги, инсекти, растенија и бактериски вируси (на пр., бактериофаги). Слична дистрибуција беше пронајдена кога го испитавме виромот на хемолимфата ccfDNA на сините школки (M. platensis) собрани во истиот слој на школки во Кергелен (Табела S2, Дополнителни информации). Секвенционирањето на ccfDNA со „shotgun“ метод е навистина нов пристап кој добива на интензитет во проучувањето на виромот кај луѓето или другите видови [21, 37, 64]. Овој пристап е особено корисен за проучување на двоверижни ДНК вируси, бидејќи ниеден ген не е зачуван меѓу сите двоверижни ДНК вируси, што претставува најразновидна и најширока класа на вируси во Балтимор [65]. Иако повеќето од овие вируси остануваат некласифицирани и може да вклучуваат вируси од сосема непознат дел од вирусниот свет [66], откривме дека виромите и опсезите на домаќини на школките A. atra и M. platensis спаѓаат помеѓу двата вида. Слично (видете ја слика S3, дополнителни информации). Оваа сличност не е изненадувачка, бидејќи може да рефлектира недостаток на селективност во апсорпцијата на ДНК присутна во животната средина. Идните студии со употреба на прочистена РНК се моментално потребни за карактеризирање на РНК виромот.
Во нашата студија, користевме многу ригорозен процес на поврзување адаптиран од работата на Коварски и неговите колеги [37], кои користеа двостепено бришење на здружени читања и контизи пред и по склопувањето на нативната ccfDNA, што резултираше со висок процент на немапирани читања. Затоа, не можеме да исклучиме дека некои од овие немапирани читања сè уште може да имаат свое потекло, првенствено затоа што немаме референтен геном за овој вид школка. Исто така, го користевме овој процес на поврзување затоа што бевме загрижени за химерите помеѓу сопствените и не-самовите читања и должините на читање генерирани од Illumina MiSeq PE75. Друга причина за поголемиот дел од немапираните читања е тоа што голем дел од морските микроби, особено во оддалечените области како што е Кергуелен, не се анотирани. Користевме Illumina MiSeq PE75, претпоставувајќи должини на фрагментите од ccfDNA слични на човечката ccfDNA. За идните студии, со оглед на нашите резултати кои покажуваат дека хемолимфата ccfDNA има подолги читања од луѓето и/или цицачите, препорачуваме користење на платформа за секвенционирање посоодветна за подолги фрагменти од ccfDNA. Оваа практика ќе го олесни идентификувањето на повеќе индикации за подлабока анализа. Добивањето на моментално недостапната комплетна секвенца на нуклеарниот геном на A. atra, исто така, во голема мера би го олеснило разликувањето на ccfDNA од сопствени и туѓи извори. Со оглед на тоа што нашето истражување се фокусираше на можноста за примена на концептот на течна биопсија кај школки, се надеваме дека како што овој концепт ќе се користи во идните истражувања, ќе се развијат нови алатки и цевководи за да се зголеми потенцијалот на овој метод за проучување на микробната разновидност на школките. морскиот екосистем.
Како неинвазивен клинички биомаркер, покачените нивоа на ccfDNA во човечката плазма се поврзани со разни болести, оштетување на ткивата и стресни состојби [67,68,69]. Ова зголемување е поврзано со ослободување на фрагменти од ДНК од сопствено потекло по оштетување на ткивото. Го разгледавме ова прашање користејќи акутен топлински стрес, во кој школките беа накратко изложени на температура од 30 °C. Ја извршивме оваа анализа на три различни видови школки во три независни експерименти. Сепак, не откривме никаква промена во нивоата на ccfDNA по акутен топлински стрес (видете ја Слика S5, дополнителни информации). Ова откритие може да го објасни, барем делумно, фактот дека школките имаат полуотворен циркулаторен систем и акумулираат големи количини на туѓа ДНК поради нивната висока активност на филтрирање. Од друга страна, школките, како и многу безрбетници, може да бидат поотпорни на оштетување на ткивото предизвикано од стрес, со што се ограничува ослободувањето на ccfDNA во нивната хемолимфа [70, 71].
До денес, ДНК анализата на биодиверзитетот во водните екосистеми главно се фокусираше на метабаркодирање на ДНК од животната средина (eDNA). Сепак, овој метод обично е ограничен во анализата на биодиверзитетот кога се користат прајмери. Употребата на секвенционирање со „shotgun“ ги заобиколува ограничувањата на PCR и пристрасниот избор на сетови прајмери. Така, во извесна смисла, нашиот метод е поблизок до неодамна користениот метод на секвенционирање со „shotgun“ со висок проток на еДНК, кој е способен директно да секвенционира фрагментирана ДНК и да анализира речиси сите организми [72, 73]. Сепак, постојат голем број фундаментални прашања што го разликуваат LB од стандардните методи на eDNA. Секако, главната разлика помеѓу eDNA и LB е употребата на природни филтер-домаќини. Пријавена е употреба на морски видови како што се сунѓери и школки (Dresseina spp.) како природен филтер за проучување на eDNA [74, 75]. Сепак, студијата на Драјсена користела ткивни биопсии од кои е извлечена ДНК. Анализата на ccfDNA од LB не бара биопсија на ткиво, специјализирана, а понекогаш и скапа опрема и логистика поврзана со eDNA или биопсија на ткиво. Всушност, неодамна објавивме дека ccfDNA од LB може да се чува и анализира со FTA поддршка без одржување на ладен ланец, што е голем предизвик за истражувања во оддалечени области [76]. Екстракцијата на ccfDNA од течни биопсии е исто така едноставна и обезбедува висококвалитетна ДНК за секвенционирање со пушка и PCR анализа. Ова е голема предност со оглед на некои од техничките ограничувања поврзани со eDNA анализата [77]. Едноставноста и ниската цена на методот на земање примероци е исто така особено погодна за долгорочни програми за следење. Покрај нивната висока способност за филтрирање, друга добро позната карактеристика на школките е хемискиот мукополисахариден состав на нивната слуз, што ја промовира апсорпцијата на вируси [78, 79]. Ова ги прави школките идеален природен филтер за карактеризирање на биодиверзитетот и влијанието на климатските промени во даден воден екосистем. Иако присуството на фрагменти од ДНК добиени од домаќинот може да се смета за ограничување на методот во споредба со eDNA, трошоците поврзани со поседување на таква нативна ccfDNA во споредба со eDNA се истовремено разбирливи за огромната количина на информации достапни за здравствени студии. офсет домаќин. Ова вклучува присуство на вирусни секвенци интегрирани во геномот на домаќинот домаќин. Ова е особено важно за школките, со оглед на присуството на хоризонтално пренесувани леукемични ретровируси кај школките [80, 81]. Друга предност на LB во однос на eDNA е тоа што ја искористува фагоцитната активност на циркулирачките крвни клетки во хемолимфата, која ги проголтува микроорганизмите (и нивните геноми). Фагоцитозата е главната функција на крвните клетки кај школките [82]. Конечно, методот ја користи предноста на високиот капацитет за филтрирање на школките (просечно 1,5 л/ч морска вода) и дводневната циркулација, што го зголемува мешањето на различни слоеви на морска вода, овозможувајќи зафаќање на хетерологна eDNA. [83, 84]. Според тоа, анализата на ccfDNA од школки е интересен пат со оглед на нутритивните, економските и еколошките влијанија на школките. Слично на анализата на LB собрани од луѓе, овој метод исто така отвора можност за мерење на генетските и епигенетските промени во ДНК-та на домаќинот како одговор на егзогени супстанции. На пример, технологиите за секвенционирање од трета генерација може да се предвидат за извршување на анализа на метилација на целиот геном во нативната ccfDNA со користење на секвенционирање на нанопори. Овој процес треба да биде олеснет од фактот дека должината на фрагментите од ccfDNA од школки е идеално компатибилна со платформите за секвенционирање со долго читање кои овозможуваат анализа на метилација на ДНК на целиот геном од едно секвенционирање без потреба од хемиски трансформации.85,86] Ова е интересна можност, бидејќи е покажано дека моделите на метилација на ДНК одразуваат одговор на стрес од животната средина и опстојуваат во текот на многу генерации. Затоа, може да обезбеди вреден увид во основните механизми што го регулираат одговорот по изложеноста на климатските промени или загадувачите [87]. Сепак, употребата на LB не е без ограничувања. Непотребно е да се каже дека ова бара присуство на индикаторски видови во екосистемот. Како што споменавме погоре, користењето на LB за проценка на биодиверзитетот на даден екосистем, исто така, бара ригорозен биоинформатички процес кој го зема предвид присуството на фрагменти од ДНК од изворот. Друг голем проблем е достапноста на референтни геноми за морски видови. Се надеваме дека иницијативите како што се Проектот за геноми на морските цицачи и неодамна воспоставениот проект Fish10k [88] ќе го олеснат таквото анализирање во иднина. Примената на концептот LB кај морските организми кои се хранат со филтри е исто така компатибилна со најновите достигнувања во технологијата за секвенционирање, што го прави добро прилагоден за развој на мулти-омски биомаркери за да се обезбедат важни информации за здравјето на морските живеалишта како одговор на стресот во животната средина.
Податоците за секвенционирање на геномот се депонирани во архивата за читање секвенци на NCBI https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 под Bioprojects SRR8924808.
Бриерли АС, Кингсфорд МЈ Влијание на климатските промени врз морскиот свет и екосистемите. Cole Biology. 2009; 19: P602–P614.
Гиси Е, Манеа Е, Мазарис АД, Фрашети С, Алмпаниду В, Бевилакуа С, и др. Разгледајте ги комбинираните влијанија од климатските промени и другите локални стресори врз морската средина. општа научна средина. 2021;755:142564.
Карела Ф, Антуофермо Е, Фарина С, Салати Ф, Мандас Д, Прадо П, и др. ). Наука од први март. 2020; 7:48.
Серонт Л, Никастро ЦР, Зарди ГИ, Гобервил Е. Намалената толеранција на топлина под услови на повторувачки топлотен стрес го објаснува високиот летен морталитет кај сините школки. Научен извештај 2019; 9:17498.
Феј СБ, Сиепиелски АМ, Нусле С, Сервантес-Јошида К, Хван ЈЛ, Хубер ЕР, и др. Неодамнешни промени во фреквенцијата, причините и обемот на смртни случаи кај животни. Proc Natl Acad Sci USA. 2015;112:1083-8.
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mughetti D, Cerruti F, Hosseini S, et al. Повеќе неспецифични патогени за видовите може да предизвикале масовна смртност на Pinna nobilis. Животот. 2020; 10:238.
Бредли М, Каутс СЈ, Џенкинс Е, О'Хара ТМ. Потенцијално влијание на климатските промени врз арктичките зоонотски болести. Int J Circumpolar health. 2005; 64:468–77.
Бејер Ј., Грин НВ, Брукс С., Алан ИЈ, Руус А., Гомез Т. и др. Сини школки (Mytilus edulis spp.) како сигнални организми во мониторингот на крајбрежното загадување: преглед. Mar Environ Res 2017; 130:338-65.
Сиравења Г, Марсони С, Сиена С, Бардели А. Интеграција на течна биопсија во третманот на рак. Nat Rev Clean Oncol. 2017; 14:531–48.
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C, et al. Созревање во течна биопсија: Овозможува циркулација на туморската ДНК. Nat Rev Cancer. 2017;17:223–38.
Мандел П., Метаис П. Нуклеински киселини во човечка плазма. Записник од состаноци на подружниците на Soc Biol. 1948; 142:241-3.
Бронкхорст АЈ, Унгерер В, Холденридер С. Нова улога за слободната ДНК како молекуларен маркер за третман на рак. Квантификација на биомоларна анализа. 2019;17:100087.
Игнатиадис М., Слеџ ГВ, Џефри СС Течната биопсија влегува во клиниката – проблеми со имплементацијата и идните предизвици. Nat Rev Clin Oncol. 2021; 18:297–312.
Ло ЈМ, Корбета Н., Чемберлен ПФ, Раи В., Сарџент ИЛ, Редман ЦВ и други. Феталната ДНК е присутна во мајчината плазма и серум. Лансет. 1997; 350:485-7.
Муфареј МН, Вонг РЈ, Шо ГМ, Стивенсон ДК, Квејк СР. Студија за текот на бременоста и нејзините компликации со употреба на циркулирачка екстрацелуларна РНК во крвта на жените за време на бременоста. Допедијатрика. 2020;8:605219.
Олерих М, Шервуд К, Кеоун П, Шутц Е, Бек Ј, Стегбауер Ј, и др. Течна биопсија: ДНК без донорски клетки се користи за откривање на алогени лезии во бубрежен графт. Nat Rev Nephrol. 2021; 17:591–603.
Хуан ФК, Ло ЈМ Иновации во пренаталната дијагностика: секвенционирање на мајчиниот плазматски геном. Ана МД. 2016;67:419-32.
Гу В, Денг Х, Ли М, Суку ЈД, Аревало С, Страјк Д, и др. Брзо откривање на патогени со метагеномско секвенционирање од следната генерација на заразени телесни течности. Nat Medicine. 2021;27:115-24.