Ви благодариме што ја посетивте Nature.com.Верзијата на прелистувачот што ја користите има ограничена поддршка за CSS.За најдобро искуство, препорачуваме да користите ажуриран прелистувач (или да го оневозможите режимот на компатибилност во Internet Explorer).Во меѓувреме, за да обезбедиме континуирана поддршка, ќе ја направиме страницата без стилови и JavaScript.
Плодноста на птиците зависи од нивната способност да складираат доволно остварлива сперма за подолг временски период во тубулите за складирање на спермата (SST).Точниот механизам со кој сперматозоидите влегуваат, престојуваат и излегуваат од SST останува контроверзен.Спермата на кокошките шаркаси покажала висока склоност кон аглутинација, формирајќи мобилни филаментозни снопови кои содржат многу клетки.Поради тешкотијата да се набљудува подвижноста и однесувањето на сперматозоидите во непроѕирна фалопиева туба, користевме микрофлуиден уред со микроканален пресек сличен на оној на сперматозоидите за да ја проучуваме аглутинацијата и подвижноста на сперматозоидите.Оваа студија дискутира како се формираат снопови сперматозоиди, како тие се движат и нивната можна улога во продолжувањето на престојот на спермата во SST.Ја испитувавме брзината на спермата и реолошкото однесување кога протокот на течност беше генериран во микрофлуиден канал со хидростатички притисок (стапка на проток = 33 µm/s).Сперматозоидите имаат тенденција да пливаат спротивно на струјата (позитивна реологија) и брзината на снопот на сперматозоидите е значително намалена во споредба со единечните сперматозоиди.Забележано е дека сноповите на сперматозоидите се движат во спирала и се зголемуваат во должина и дебелина како што се регрутираат повеќе единечни сперматозоиди. Забележано е дека сноповите на сперматозоидите се приближуваат и се прилепуваат на страничните ѕидови на микрофлуидните канали за да се избегне бришење со брзина на проток на течност > 33 µm/s. Забележано е дека сноповите на сперматозоидите се приближуваат и се прилепуваат на страничните ѕидови на микрофлуидните канали за да се избегне бришење со брзина на проток на течност > 33 µm/s. Было замечено, что пучки сперматозоидов приближаются и прилипают к боковым стенкам микрофлюидных каналов, чтобы избежать сметания со скоростью потока жидкости> 33 мкм / с. Забележано е дека сноповите на сперматозоидите се приближуваат и се прилепуваат до страничните ѕидови на микрофлуидните канали за да се избегне однесување со брзина на проток на течност >33 µm/s.观察到精子束接近并粘附在微流体通道的侧壁上，以避免被流体流速> 33 μm/s33 µm/s 扫过. Было замечено, что пучки сперматозоидов приближаются и прилипают к боковым стенкам микрожидкостного канала, чтобы избежать сметания потоком жидкости со скоростью > 33 мкм/с. Забележано е дека сноповите на сперматозоидите се приближуваат и се прилепуваат до страничните ѕидови на микрофлуидниот канал за да избегнат да бидат однесени од протокот на течност со >33 µm/s.Скенирањето и трансмисионата електронска микроскопија откри дека сноповите на спермата се поддржани од изобилство густ материјал.Добиените податоци ја демонстрираат уникатната мобилност на сперматозоидите од пилешко Sharkazi, како и способноста на сперматозоидите да се аглутинираат и да формираат мобилни снопови, што придонесува за подобро разбирање на долгорочното складирање на сперматозоидите во SMT.
За да се постигне оплодување кај луѓето и кај повеќето животни, спермата и јајце клетките мора да пристигнат на местото на оплодување во вистинско време.Затоа, парењето мора да се случи пред или за време на овулацијата.Од друга страна, некои цицачи, како што се кучињата, како и видовите кои не се цицачи, како што се инсектите, рибите, влекачите и птиците, складираат сперматозоиди во нивните репродуктивни органи подолг временски период додека нивните јајце клетки не бидат подготвени за оплодување (асинхроно оплодување 1 ).Птиците се способни да ја одржуваат одржливоста на сперматозоидите способни за оплодување на јајце клетките 2-10 недели2.
Ова е уникатна карактеристика што ги разликува птиците од другите животни, бидејќи обезбедува голема веројатност за оплодување по едно оплодување неколку недели без истовремено парење и овулација.Главниот орган за складирање на спермата, наречен тубула за складирање на сперма (SST), се наоѓа во внатрешните мукозни набори на утеровагиналниот спој.До денес, механизмите со кои спермата влегува, престојува и излегува од банката на сперма не се целосно разбрани.Врз основа на претходните студии, беа изнесени многу хипотези, но ниту една од нив не беше потврдена.
Форман4 претпостави дека сперматозоидите го одржуваат своето место на живеење во SST шуплината преку континуирано осцилаторно движење спротивно на насоката на протокот на течност низ протеинските канали лоцирани на SST епителните клетки (реологија).АТП е исцрпена поради постојаната флагеларна активност потребна за да се задржи спермата во луменот SST и подвижноста на крајот опаѓа додека спермата не се изнесе од банката на спермата со проток на течност и не започне ново патување по растечката фалопиева цевка за да се оплоди спермата.Јајце (Форман4).Овој модел на складирање на сперма е поддржан со детекција со имуноцитохемија на аквапорини 2, 3 и 9 присутни во SST епителните клетки.До денес, недостигаат студии за реологијата на пилешката сперма и нејзината улога во складирањето на SST, изборот на вагинална сперма и конкуренцијата на спермата.Кај кокошките, спермата влегува во вагината по природно парење, но повеќе од 80% од сперматозоидите се исфрлаат од вагината кратко време по парењето.Ова сугерира дека вагината е примарна локација за селекција на сперма кај птиците.Дополнително, објавено е дека помалку од 1% од сперматозоидите оплодени во вагината завршуваат во SST2.При вештачко оплодување на пилињата во вагината, бројот на сперматозоиди кои достигнуваат SST има тенденција да се зголемува 24 часа по оплодувањето.Досега, механизмот на селекција на сперматозоиди за време на овој процес е нејасен, а подвижноста на спермата може да игра важна улога во навлегувањето на спермата SST.Поради дебелите и непроѕирни ѕидови на јајцеводите, тешко е директно да се следи подвижноста на спермата во јајцеводите на птиците.Затоа, ни недостасува основно знаење за тоа како сперматозоидите преминуваат кон SST по оплодувањето.
Реологијата неодамна беше препознаена како важен фактор кој го контролира транспортот на спермата во гениталиите на цицачите.Врз основа на способноста на подвижните сперматозоиди да мигрираат контраструјно, Заферани и сор8 користеле кора микрофлуиден систем за пасивно да ги изолираат подвижните сперматозоиди од испишаните примероци на сперма.Овој тип на сортирање на спермата е од суштинско значење за медицински третман на неплодност и клиничко истражување, и се претпочита во однос на традиционалните методи кои се интензивни на време и труд и можат да ја загрозат морфологијата и структурниот интегритет на спермата.Сепак, до денес, не се спроведени студии за ефектот на секретите од гениталните органи на кокошките врз подвижноста на спермата.
Без оглед на механизмот што ја одржува спермата складирана во SST, многу истражувачи забележале дека резидентните сперматозоиди се аглутинираат од глава до глава во SST на кокошки 9, 10, потполошки 2 и мисирки 11 за да формираат аглутинирани сперматозоиди.Авторите сугерираат дека постои врска помеѓу оваа аглутинација и долгорочното складирање на сперматозоидите во SST.
Tingari и Lake12 пријавија силна поврзаност помеѓу сперматозоидите во жлездата што прима сперма кај кокошката и се запрашаа дали птичјите сперматозоиди се аглутинираат на ист начин како сперматозоидите на цицачите.Тие веруваат дека длабоките врски помеѓу сперматозоидите во деференсот може да се должат на стресот предизвикан од присуството на голем број сперматозоиди на мал простор.
При проценка на однесувањето на сперматозоидите на свежи висечки стаклени лизгалки, може да се забележат минливи знаци на аглутинација, особено на рабовите на капките на спермата.Сепак, аглутинацијата често била нарушена од ротационото дејство поврзано со континуирано движење, што ја објаснува минливата природа на овој феномен.Истражувачите, исто така, забележале дека кога разредувачот бил додаден во спермата, се појавиле издолжени клеточни агрегати „како нишки“.
Раните обиди да се имитира сперматозоид беа направени со отстранување на тенка жица од висечка капка, што резултираше со издолжена везикула слична на сперма која штрчи од капката сперма.Сперматозоидите веднаш се наредени на паралелен начин во везикулата, но целата единица брзо исчезна поради ограничувањето на 3D.Затоа, за проучување на аглутинацијата на сперматозоидите, неопходно е да се набљудува подвижноста и однесувањето на сперматозоидите директно во изолираните тубули за складирање на сперматозоиди, што е тешко да се постигне.Затоа, неопходно е да се развие инструмент кој имитира сперматозоиди за да ги поддржи студиите за подвижноста на спермата и однесувањето на аглутинација.Brillard et al13 објавија дека просечната должина на тубулите за складирање на спермата кај возрасни пилиња е 400-600 µm, но некои SST може да бидат долги и до 2000 µm.Меро и Огасавара14 ги поделија семиниформните жлезди на зголемени и незголемени тубули за складирање на сперматозоиди, од кои и двете беа исти по должина (~ 500 µm) и ширина на вратот (~ 38 µm), но просечниот дијаметар на луменот на тубулите беше 56,6 и 56,6 µm.., соодветно 11,2 μm, соодветно.Во тековната студија, користевме микрофлуиден уред со големина на канал од 200 µm × 20 µm (Ш × В), чиј пресек е нешто близок до оној на засилениот SST.Дополнително, ја испитавме подвижноста на спермата и однесувањето на аглутинација во течноста што тече, што е во согласност со хипотезата на Форман дека течноста произведена од епителните клетки на SST ја одржува спермата во луменот во контраструјна (реолошка) насока.
Целта на оваа студија беше да се надминат проблемите на набљудување на подвижноста на сперматозоидите во фалопиевата туба и да се избегнат тешкотиите при проучување на реологијата и однесувањето на сперматозоидите во динамична средина.Користена е микрофлуидна направа која создава хидростатички притисок за да се симулира подвижноста на спермата во гениталиите на кокошката.
Кога капка од разредениот примерок на сперма (1:40) се вчита во уредот за микроканали, може да се идентификуваат два типа на подвижност на спермата (изолирана сперма и врзана сперма).Покрај тоа, сперматозоидите имаат тенденција да пливаат спротивно на струјата (позитивна реологија; видео 1, 2). Иако сноповите на спермата имаа помала брзина од онаа на осамените сперматозоиди (p <0,001), тие го зголемија процентот на сперматозоиди кои покажуваат позитивна реотаксија (p <0,001; Табела 2). Иако сноповите на спермата имаа помала брзина од онаа на осамените сперматозоиди (p <0,001), тие го зголемија процентот на сперматозоиди кои покажуваат позитивна реотаксија (p <0,001; Табела 2). Хотя пучки сперматозоидов имели повеќе низкую скорость, чем у одиночных сперматозоидов (p < 0,001), они увеличивали процент сперматозоидов, демонстрирующих положительный реотаксис (p < 0,001); Иако сноповите на сперматозоидите имаа помала брзина од онаа на единечните сперматозоиди (p <0,001), тие го зголемија процентот на сперматозоиди кои покажуваат позитивна реотаксија (p <0,001; Табела 2).尽管精子束的速度低于孤独精子的速度（p < 0,001），但它们增加了显独精子的速度（p < 0,001），但它们增加了显独精子阳分比 (p < 0,001; 表2）.尽管 精子束 的 速度 低于 孤独 的 速度 （p <0,001） ， 但 增加 了 显独 阾 的分比 (p <0,001 ； 2..... ）)))) Хотя скорость пучков сперматозоидов была ниже, чем у одиночных сперматозоидов (p < 0,001), они увеличивали процент сперматозоидов со положительной реологией (p < 0,001; таб 2). Иако брзината на сперматозоидите беше помала од онаа на единечните сперматозоиди (p <0,001), тие го зголемија процентот на сперматозоиди со позитивна реологија (p <0,001; Табела 2).Позитивната реологија за единечни сперматозоиди и прамени се проценува на приближно 53% и 85%, соодветно.
Забележано е дека сперматозоидите на кокошките шаркаси веднаш по ејакулацијата формираат линеарни снопови, составени од десетици единки.Овие прамени се зголемуваат во должина и дебелина со текот на времето и може да останат ин витро неколку часа пред да се распаднат (видео 3).Овие филаментозни снопови имаат облик на ехидна сперматозоиди кои се формираат на крајот на епидидимисот.Утврдено е дека спермата од кокошката Sharkashi има висока тенденција да се аглутинира и да формира мрежест пакет за помалку од една минута по собирањето.Овие греди се динамични и способни да се држат до блиските ѕидови или статични предмети.Иако сноповите на спермата ја намалуваат брзината на сперматозоидите, јасно е дека макроскопски тие ја зголемуваат нивната линеарност.Должината на сноповите варира во зависност од бројот на сперматозоиди собрани во снопови.Два дела од снопот беа изолирани: почетниот дел, вклучувајќи ја слободната глава на аглутинираната сперма, и терминалниот дел, вклучувајќи ја опашката и целиот дистален крај на спермата.Со помош на камера со голема брзина (950 fps), во почетниот дел од пакетот беа забележани слободни глави на аглутинирани сперматозоиди, одговорни за движењето на снопот поради нивното осцилаторно движење, влечејќи ги преостанатите во пакетот со спирално движење (Видео 4).Меѓутоа, во долгите прамени, забележано е дека некои слободни глави на сперматозоиди залепени за телото и завршниот дел од туфтот делуваат како лопатки за да помогнат во придвижувањето на туфтот.
Додека се во бавен проток на течност, сноповите на сперматозоидите се движат паралелно еден со друг, сепак, тие почнуваат да се преклопуваат и да се држат до сè што е неподвижно, за да не бидат измиени од тековниот проток како што се зголемува брзината на протокот.Сноповите се формираат кога грст сперматозоиди ќе се приближат една до друга, тие почнуваат да се движат синхроно и да се обвиткуваат една околу друга, а потоа да се залепат за леплива супстанција.Сликата 1 и 2 покажуваат како сперматозоидите се приближуваат еден кон друг, формирајќи спој додека опашките се обвиткуваат една околу друга.
Истражувачите примениле хидростатички притисок за да создадат проток на течност во микроканал за да ја проучуваат реологијата на спермата.Користен е микроканал со големина од 200 µm × 20 µm (Ш × В) и должина од 3,6 µm.Користете микроканали помеѓу контејнерите со шприцови поставени на краевите.Се користеше боја за храна за да се направат каналите повидливи.
Врзете ги каблите и додатоците за меѓусебно поврзување на ѕидот.Видеото е направено со фазен контраст микроскоп.Со секоја слика, се прикажуваат фазен контраст микроскопија и слики од мапирање.(А) Врската помеѓу два потоци се спротивставува на протокот поради спирално движење (црвена стрелка).(Б) Врската помеѓу снопот на цевката и ѕидот на каналот (црвени стрелки), во исто време тие се поврзани со два други снопови (жолти стрелки).(В) Сперматозоидите во микрофлуидниот канал почнуваат да се поврзуваат едни со други (црвени стрелки), формирајќи мрежа од снопови сперматозоиди.(Г) Формирање на мрежа од снопови сперматозоиди.
Кога капка разредена сперма се вчита во микрофлуидниот уред и се создаде проток, беше забележано дека зракот на спермата се движи спротивно на насоката на протокот.Пакетите цврсто се вклопуваат на ѕидовите на микроканалите, а слободните глави во почетниот дел од сноповите цврсто се вклопуваат на нив (видео 5).Тие, исто така, се држат до сите неподвижни честички на нивниот пат, како што се остатоците, за да се спротивстават да бидат однесени од струјата.Со текот на времето, овие прамени стануваат долги филаменти заробувајќи други поединечни сперматозоиди и пократки прамени (Видео 6).Како што протокот почнува да се забавува, долгите линии на сперматозоиди почнуваат да формираат мрежа од линии на сперма (Видео 7; Слика 2).
При голема брзина на проток (V > 33 µm/s), спиралните движења на нишките се зголемуваат како обид да се фатат многу поединечни снопови кои формираат сперматозоиди подобро да се спротивстават на силата на движење на протокот. При голема брзина на проток (V > 33 µm/s), спиралните движења на нишките се зголемуваат како обид да се фатат многу поединечни снопови кои формираат сперматозоиди подобро да се спротивстават на силата на движење на протокот. При высокой скорости потока (V > 33 мкм/с) спиралевидные движения нитей усиливаются, поскольку они пытаются поймать множество отдельных сперматозоидов, образующито противоштетување, . При високи стапки на проток (V > 33 µm/s), спиралните движења на нишките се зголемуваат додека се обидуваат да фатат многу поединечни сперматозоиди кои формираат снопови кои се подобро способни да се спротивстават на силата на движење на протокот.在高流速(V > 33 μm/s)地抵抗流动的漂移力.在 高 流速 (v> 33 µm/s)地 抵抗 的 漂移力……….. При высоких скоростях потока (V > 33 мкм/с) спиральное движение нитей увеличивается в попытке захватить множество отдельных сперматозоидов, образующих пучкички, чтобпрофативя постилька. При високи стапки на проток (V > 33 µm/s), спиралното движење на филаментите се зголемува во обид да се фатат многу поединечни сперматозоиди кои формираат снопови за подобро да се спротивстават на силите на провлекување на протокот.Тие исто така се обидоа да закачат микроканали на страничните ѕидови.
Сперматозоидите беа идентификувани како кластери од глави на сперматозоиди и виткани опашки со помош на светлосна микроскопија (LM).Сперматозоидите со различни агрегати се исто така идентификувани како искривени глави и флагеларни агрегати, повеќе споени опашки на сперматозоиди, глави на сперматозоиди прикачени на опашка и глави на сперма со свиткани јадра како повеќе споени јадра.преносна електронска микроскопија (TEM).Електронската микроскопија за скенирање (SEM) покажа дека сноповите на спермата се обложени агрегати на глави на сперматозоиди, а агрегатите на спермата покажаа поврзана мрежа од завиткани опашки.
Морфологијата и ултраструктурата на сперматозоидите, формирањето на снопови сперматозоиди беа проучувани со помош на светлосна микроскопија (половина пресек), скенирачка електронска микроскопија (SEM) и преносна електронска микроскопија (TEM), размаските од сперматозоидите беа обоени со акридин портокалова и испитувани со помош на микроскопија на епифлуор.
Боење со размаска со сперма со акридин портокал (сл. 3Б) покажа дека главите на сперматозоидите се залепени заедно и покриени со секреторен материјал, што доведе до формирање на големи прамени (сл. 3Д).Сперматозоидите се состоеја од агрегати на сперматозоиди со мрежа на прицврстени опашки (сл. 4A-C).Сперматозоидите се составени од опашки на многу сперматозоиди заглавени заедно (сл. 4D).Тајните (сл. 4E,F) ги покриваа главите на снопови сперматозоиди.
Формирање на сноп сперматозоиди Со користење на фазна контрастна микроскопија и брисеви со сперматозоиди обоени со портокалова акридин, се покажа дека главите на сперматозоидите се лепат заедно.(А) Раното формирање на сперматозоиди започнува со сперма (бел круг) и три сперматозоиди (жолт круг), при што спиралата започнува од опашката и завршува на главата.(Б) Фотомикрографија на размаска од сперма обоена со акридин портокалова која покажува прилепени глави на сперматозоиди (стрелки).Исцедокот ја покрива главата(ите).Зголемување × 1000. (C) Развој на голем зрак транспортиран со проток во микрофлуиден канал (со користење на камера со голема брзина со 950 fps).(Г) Микрографија на размаска од сперма обоена со акридин портокалова која покажува големи прамени (стрелки).Зголемување: × 200.
Скенирање на електронска микрографија на сперматозен зрак и сперматозоид обоена со акридин портокалова боја.(A, B, D, E) се дигитални електронски микрографи за скенирање во боја на сперматозоиди, а C и F се микрографи на сперматозоиди обоени со акридин портокалова боја кои покажуваат прицврстување на повеќе сперматозоиди кои ја обвиткуваат опашката мрежа.(AC) Агрегатите на спермата се прикажани како мрежа од прикачени опашки (стрелки).(Г) Адхезија на неколку сперматозоиди (со леплива супстанција, розова контура, стрела) кои се обвиткуваат околу опашката.(E и F) Агрегати на сперматозоидни глави (покажувачи) покриени со леплив материјал (покажувачи).Сперматозоидите формирале снопови со неколку структури слични на вител (F).(C) ×400 и (F) ×200 зголемувања.
Со помош на трансмисиона електронска микроскопија, откривме дека сноповите на сперматозоидите имаат закачени опашки (сл. 6A, C), глави прикачени на опашки (сл. 6B) или глави прикачени на опашки (сл. 6D).Главите на сперматозоидите во снопот се закривени, прикажувајќи ги во делот два нуклеарни региони (сл. 6D).Во пакетот со засеци, сперматозоидите имаа извиткана глава со две нуклеарни региони и повеќе флагеларни региони (сл. 5А).
Дигитален електронски микрограф во боја што ги прикажува поврзувачките опашки во снопот на спермата и аглутинирачкиот материјал што ги поврзува главите на спермата.(А) Закачена опашка на голем број сперматозоиди.Забележете како изгледа опашката и во портрет (стрелка) и во пејзаж (стрелка).(Б) Главата (стрелката) на спермата е поврзана со опашката (стрелката).(В) Закачени се неколку опашки (стрелки) на спермата.(Г) Материјалот за аглутинација (AS, сина) поврзува четири глави на сперматозоиди (виолетова).
Електронска микроскопија за скенирање беше искористена за откривање на глави на сперматозоиди во снопови на сперматозоиди покриени со секрети или мембрани (Слика 6Б), што покажува дека сноповите на спермата биле закотвени со екстрацелуларен материјал.Аглутинираниот материјал беше концентриран во главата на спермата (склоп како глава на медуза; Сл. 5Б) и се прошири дистално, давајќи брилијантен жолт изглед под флуоресцентна микроскопија кога е обоен со акридин портокал (сл. 6C).Оваа супстанца е јасно видлива под микроскоп за скенирање и се смета за врзивно средство.Полутенки делови (слика 5C) и брисеви со сперматозоиди обоени со акридин портокал покажаа снопови сперматозоиди кои содржат густо набиени глави и свиткани опашки (сл. 5D).
Различни фотомикрографии кои покажуваат агрегација на глави на сперматозоиди и свиткани опашки користејќи различни методи.(А) Пресечен дигитален пренос на боја електронски микрограф на пакет на сперматозоид што прикажува намотана глава на сперма со дводелно јадро (сино) и неколку флагеларни делови (зелено).(Б) Дигитална електронска микрографија за скенирање во боја која прикажува кластер од глави на сперматозоиди слични на медуза (стрелки) кои се чини дека се покриени.(В) Полутенок дел кој покажува собрани глави на сперматозоиди (стрелки) и завиткани опашки (стрелки).(Г) Микрографија на размаска од сперма обоена со портокалова акридин која прикажува агрегати на глави на сперматозоиди (стрелки) и свиткани прилепени опашки (стрелки).Забележете дека леплива супстанција (S) ја покрива главата на сперматозоидот.(D) × 1000 зголемување.
Користејќи трансмисивна електронска микроскопија (сл. 7А), исто така беше забележано дека главите на сперматозоидите се искривени и јадрата имаат спирален облик, што е потврдено со брисеви од сперматозоиди обоени со акридин портокалова и испитани со помош на флуоресцентна микроскопија (сл. 7Б).
(А) Електронски микрограф за дигитален пренос на боја и (Б) Сперматозоид обоен со портокалова акридин што покажува намотани глави и прицврстување на глави и опашки на спермата (стрелки).(Б) × 1000 зголемување.
Интересно откритие е дека спермата на Шаркази се агрегира за да формира подвижни филаментозни снопови.Својствата на овие снопови ни овозможуваат да ја разбереме нивната можна улога во апсорпцијата и складирањето на сперматозоидите во SST.
По парењето, сперматозоидите влегуваат во вагината и се подложени на интензивен процес на селекција, што резултира со само ограничен број на сперматозоиди кои влегуваат во SST15,16.До денес, механизмите со кои спермата влегува и излегува од SST се нејасни.Кај живината, сперматозоидите се чуваат во SST подолг период од 2 до 10 недели, во зависност од видот6.Останува контроверзноста за состојбата на спермата за време на складирањето во SST.Дали се во движење или во мирување?Со други зборови, како клетките на спермата ја задржуваат својата позиција во SST толку долго?
Форман4 сугерираше дека престојот и исфрлањето на SST може да се објаснат во однос на подвижноста на спермата.Авторите претпоставуваат дека сперматозоидите ја задржуваат својата позиција со пливање против протокот на течност создаден од епителот SST и дека сперматозоидите се исфрлаат од SST кога нивната брзина паѓа под точката во која почнуваат да се движат наназад поради недостаток на енергија.Zaniboni5 го потврди присуството на аквапорини 2, 3 и 9 во апикалниот дел на SST епителните клетки, што може индиректно да го поддржи Формановиот модел за складирање на сперма.Во тековната студија, откривме дека речиси половина од сперматозоидите на Шаркаши покажуваат позитивна реологија во течноста што тече, и дека аглутинираните снопови на сперматозоиди го зголемуваат бројот на сперматозоиди кои покажуваат позитивна реологија, иако аглутинацијата ги забавува.Како сперматозоидите патуваат низ фалопиевата цевка на птицата до местото на оплодување не е целосно разбрано.Кај цицачите, фоликуларната течност ги привлекува сперматозоидите.Сепак, се верува дека хемоатрактантите ги насочуваат сперматозоидите да се приближат на долги растојанија7.Затоа, други механизми се одговорни за транспортот на спермата.Способноста на спермата да се ориентира и да тече против течноста од фалопиевите туби ослободена по парењето е пријавена како главен фактор за таргетирање на спермата кај глувците.Паркер 17 сугерираше дека сперматозоидите ги преминуваат јајцеводите пливајќи против цилијарната струја кај птиците и рептилите.Иако не е експериментално докажано кај птиците, Adolphi18 бил првиот што открил дека птичји сперматозоиди дава позитивни резултати кога тенок слој течност помеѓу капакот и лизгачот се создава со лента филтер-хартија.Реологија.Хино и Јанагимачи [19] ставија комплекс јајник-тубал-матка од глушец во перфузиониот прстен и инјектираа 1 µl мастило во истмус за да го визуелизираат протокот на течност во јајцеводите.Тие забележале многу активно движење на контракција и релаксација во фалопиевата цевка, во која сите топчиња со мастило стабилно се движеле кон ампулата на фалопиевата цевка.Авторите ја нагласуваат важноста на протокот на тубалната течност од долните кон горните јајцеводи за подигање и оплодување на спермата.Brillard20 објави дека кај кокошките и мисирките, сперматозоидите мигрираат со активно движење од вагиналниот влез, каде што се складираат, до утеро-вагиналниот спој, каде што се складираат.Сепак, ова движење не е потребно помеѓу утеровагиналниот спој и инфундибулумот бидејќи сперматозоидите се транспортираат со пасивно поместување.Знаејќи ги овие претходни препораки и резултатите добиени во тековната студија, може да се претпостави дека способноста на сперматозоидите да се движат нагоре (реологија) е една од својствата на кои се заснова процесот на селекција.Ова го одредува преминувањето на сперматозоидите низ вагината и нивното влегување во CCT за складирање.Како што предложи Форман4, ова исто така може да го олесни процесот на влегување на сперматозоидите во SST и неговото живеалиште за одреден временски период и потоа излегување кога нивната брзина ќе почне да се намалува.
Од друга страна, Мацузаки и Сасанами 21 сугерираа дека птичјите сперматозоиди подлежат на промени на подвижноста од мирување до подвижност во машкиот и женскиот репродуктивен тракт.Инхибицијата на подвижноста на резидентна сперма во SST е предложена за да се објасни долгото време на складирање на спермата, а потоа и подмладување по напуштањето на SST.Под хипоксични услови, Matsuzaki et al.1 објави високо производство и ослободување на лактат во SST, што може да доведе до инхибиција на подвижноста на резидентна сперма.Во овој случај, важноста на реологијата на спермата се рефлектира во изборот и апсорпцијата на сперматозоидите, а не во нивното складирање.
Моделот на аглутинација на спермата се смета за веродостојно објаснување за долгиот период на складирање на спермата во SST, бидејќи ова е вообичаен модел на задржување на спермата кај живината2,22,23.Бакст и сор.2 забележале дека повеќето сперматозоиди се прилепуваат еден до друг, формирајќи фасцикуларни агрегати, а единечните сперматозоиди ретко биле пронајдени во CCM на потполошки.Од друга страна, Вен и сор.24 забележани се повеќе расфрлани сперматозоиди и помалку сперматозоиди во луменот на SST кај кокошките.Врз основа на овие набљудувања, може да се претпостави дека склоноста кон аглутинација на спермата се разликува помеѓу птиците и помеѓу сперматозоидите во истиот ејакулат.Покрај тоа, Ван Креј и сор.9 сугерираше дека случајната дисоцијација на аглутинираните сперматозоиди е одговорна за постепеното навлегување на сперматозоидите во луменот на фалопиевата туба.Според оваа хипотеза, сперматозоидите со помал капацитет на аглутинација треба прво да се исфрлат од SST.Во овој контекст, способноста на сперматозоидите да се аглутинираат може да биде фактор кој влијае на исходот од конкуренцијата на спермата кај валканите птици.Покрај тоа, колку подолго се дисоцира аглутинираната сперма, толку подолго се одржува плодноста.
Иако агрегација и агрегација на сперматозоидите во снопови се забележани во неколку студии2,22,24, тие не се детално опишани поради сложеноста на нивното кинематско набљудување во рамките на SST.Направени се неколку обиди за проучување на аглутинација на спермата ин витро.Беше забележано опширно, но минливо агрегација кога тенката жица беше отстранета од висечката капка семе.Ова води до фактот дека издолжен меур излегува од капката, имитирајќи ја семената жлезда.Поради ограничувањата во 3D и краткото време на сушење капка по капка, целиот блок брзо падна во лоша состојба9.Во тековната студија, користејќи кокошки Sharkashi и микрофлуидни чипови, можевме да опишеме како се формираат овие прамени и како тие се движат.Сперматозоидите се формирале веднаш по собирањето на спермата и било откриено дека се движат во спирала, покажувајќи позитивна реологија кога е присутна во протокот.Понатаму, кога макроскопски се гледа, сноповите на сперматозоидите се забележани дека ја зголемуваат линеарноста на подвижноста во споредба со изолираните сперматозоиди.Ова сугерира дека аглутинацијата на спермата може да се случи пред пенетрацијата на SST и дека производството на сперма не е ограничено на мала област поради стрес како што беше предложено претходно (Тингари и Лејк12).За време на формирањето на туфтот, сперматозоидите пливаат синхроно додека не формираат спој, потоа нивните опашки се обвиткуваат една околу друга и главата на сперматозоидот останува слободна, но опашката и дисталниот дел од сперматозоидот се лепат заедно со леплива материја.Затоа, слободната глава на лигаментот е одговорна за движењето, влечејќи го остатокот од лигаментот.Електронската микроскопија на скенирачките снопови на сперматозоидите покажа прикачени глави на сперматозоиди покриени со многу леплив материјал, што сугерира дека главите на спермата биле прикачени во снопови мирни, што можеби се случило откако стигнале до местото на складирање (SST).
Кога размаска од сперма е обоена со акридин портокалова боја, екстрацелуларниот адхезивен материјал околу клетките на спермата може да се види под флуоресцентен микроскоп.Оваа супстанца им овозможува на сноповите на сперматозоидите да се залепат и да се залепат за сите околни површини или честички за да не се оддалечуваат со околниот проток.Така, нашите набљудувања ја покажуваат улогата на адхезијата на сперматозоидите во форма на мобилни снопови.Нивната способност да пливаат спротивно на струјата и да се држат до блиските површини им овозможува на спермата да остане подолго во SST.
Ротшилд25 користел камера за хемоцитометрија за да ја проучува пловечката дистрибуција на говеда сперма во капка суспензија, правејќи фотомикрографии преку камера со вертикална и хоризонтална оптичка оска на микроскопот.Резултатите покажале дека сперматозоидите биле привлечени кон површината на комората.Авторите сугерираат дека може да има хидродинамички интеракции помеѓу спермата и површината.Земајќи го ова предвид, заедно со способноста на спермата од пиле Шаркаши да формира лепливи прамени, може да ја зголеми веројатноста дека спермата ќе се залепи на ѕидот SST и ќе се чува долги временски периоди.
Bccetti и Afzeliu26 објавија дека гликокаликсот на спермата е потребен за препознавање на гамети и аглутинација.Форман10 забележал дека хидролизата на α-гликозидните врски во гликопротеинско-гликолипидните облоги со третирање на птичји сперма со неураминидаза резултирала со намалена плодност без да влијае на подвижноста на спермата.Авторите сугерираат дека ефектот на неураминидазата врз гликокаликсот ја нарушува секвестрацијата на спермата на утеро-вагиналниот спој, а со тоа ја намалува плодноста.Нивните набљудувања не можат да ја игнорираат можноста дека третманот со неураминидаза може да го намали препознавањето на спермата и ооцитите.Форман и Енгел10 открија дека плодноста е намалена кога кокошките се оплодуваат интравагинално со сперма третирана со неураминидаза.Сепак, ИВФ со сперма третирана со неураминидаза не влијаеше на плодноста во споредба со контролните кокошки.Авторите заклучија дека промените во гликопротеинско-гликолипидната обвивка околу мембраната на спермата ја намалуваат способноста на сперматозоидите да се оплодуваат со нарушување на секвестрацијата на сперматозоидите на утеро-вагиналниот спој, што пак го зголеми губењето на спермата поради брзината на утеро-вагиналниот дел на спермата.
Кај мисирките Bakst и Bauchan 11 пронајдоа мали везикули и мембрански фрагменти во луменот на SST и забележаа дека некои од овие гранули се споиле со сперматозоидната мембрана.Авторите сугерираат дека овие односи може да придонесат за долгорочно складирање на сперматозоидите во SST.Сепак, истражувачите не го прецизираа изворот на овие честички, дали тие се излачуваат од CCT епителни клетки, произведени и излачувани од машкиот репродуктивен систем или произведени од самата сперма.Исто така, овие честички се одговорни за аглутинација.Grützner et al27 објавија дека епидидималните епителни клетки произведуваат и лачат специфичен протеин кој е потребен за формирање на семенски тракти со една пора.Авторите исто така известуваат дека дисперзијата на овие снопови зависи од интеракцијата на епидидималните протеини.Никсон и сор28 откриле дека аднексите лачат протеин, киселинскиот остеонектин богат со цистеин;SPARC е вклучен во формирањето на сперматозоиди во ехидни со краток клун и птицечовки.Распрснувањето на овие зраци е поврзано со губење на овој протеин.
Во тековната студија, ултраструктурната анализа со помош на електронска микроскопија покажа дека сперматозоидите се прилепуваат на голема количина густ материјал.Се смета дека овие супстанции се одговорни за аглутинација што се кондензира помеѓу и околу прилепените глави, но при помали концентрации во регионот на опашката.Претпоставуваме дека оваа аглутинирачка супстанца се излачува од машкиот репродуктивен систем (епидидимис или деференс) заедно со спермата, бидејќи често забележуваме дека семето се одвојува од лимфата и семената плазма за време на ејакулацијата.Пријавено е дека додека птичјите сперматозоиди минуваат низ епидидимисот и деферентните, тие се подложени на промени поврзани со созревањето кои ја поддржуваат нивната способност да се врзуваат со протеините и да се здобијат со гликопротеини поврзани со лемата во плазмата.Упорноста на овие протеини на резидентни сперматозоиди во SST сугерира дека овие протеини може да влијаат на стекнувањето на стабилноста на сперматозоидната мембрана 30 и да ја одредат нивната плодност 31 .Ahammad et al32 објавија дека сперматозоидите добиени од различни делови на машкиот репродуктивен систем (од тестисите до дисталните vas deferens) покажале прогресивно зголемување на одржливоста во услови на складирање на течности, без оглед на температурата на складирање, а одржливоста кај кокошките исто така се зголемува во јајцеводите по вештачко оплодување.
Шаркаши пилешките сперматозоиди имаат различни карактеристики и функции од другите видови како што се ехидни, птицечовки, дрвени глувци, еленски стаорци и заморчиња.Кај кокошките шаркаси, формирањето на снопови сперматозоиди ја намали нивната брзина на пливање во споредба со единечните сперматозоиди.Сепак, овие снопови го зголемија процентот на реолошки позитивни сперматозоиди и ја зголемија способноста на сперматозоидите да се стабилизираат во динамична средина.Така, нашите резултати ја потврдуваат претходната сугестија дека аглутинацијата на спермата во SST е поврзана со долгорочно складирање на спермата.Ние, исто така, претпоставуваме дека склоноста на сперматозоидите да формираат прамени може да ја контролира стапката на губење на спермата во SST, што може да го промени исходот од конкуренцијата на спермата.Според оваа претпоставка, сперматозоидите со низок капацитет на аглутинација прво ослободуваат SST, додека сперматозоидите со висок капацитет за аглутинација произведуваат најголем дел од потомството.Формирањето на снопови на сперматозоиди со една пора е корисно и влијае на односот родител-дете, но користи различен механизам.Кај ехидните и птицечовките, сперматозоидите се распоредени паралелно едни на други за да се зголеми брзината на зракот напред.Пакетите ехидни се движат околу три пати побрзо од единечните сперматозоиди.Се верува дека формирањето на такви сперматозоиди во ехидни е еволутивна адаптација за одржување на доминацијата, бидејќи женките се промискуитетни и обично се парат со неколку мажјаци.Затоа, сперматозоидите од различни ејакулации жестоко се натпреваруваат за оплодување на јајце клетката.
Аглутинираните сперматозоиди на кокошките шаркаси лесно се визуелизираат со помош на фазна контрастна микроскопија, што се смета за поволно бидејќи овозможува лесно проучување на однесувањето на сперматозоидите ин витро.Механизмот со кој формирањето на сперматозоиди ја промовира репродукцијата кај кокошките шаркаси е исто така различен од оној што се гледа кај некои плацентарни цицачи кои претставуваат кооперативно однесување на спермата, како што се дрвените глувци, каде што некои сперматозоиди стигнуваат до јајце клетките, помагајќи им на другите сродни поединци да стигнат и да ги оштетат нивните јајце клетки.да се докажеш.алтруистичко однесување.Самооплодување 34. Друг пример на кооперативно однесување кај сперматозоидите е пронајден кај глувците од елени, каде што сперматозоидите можеа да се идентификуваат и комбинираат со генетски најповрзаните сперматозоиди и да формираат кооперативни групи за да ја зголемат нивната брзина во споредба со неповрзаните сперматозоиди35.
Резултатите добиени во оваа студија не се во спротивност со теоријата на Фоман за долгорочно складирање на сперматозоиди во SWS.Истражувачите известуваат дека сперматозоидите продолжуваат да се движат во протокот на епителните клетки што ја обложуваат SST подолг временски период, а по одреден временски период, енергетските резерви на клетките на спермата се исцрпуваат, што резултира со намалување на брзината, што овозможува исфрлање на супстанции со мала молекуларна тежина.енергија на сперматозоидите со проток на течност од луменот на SST Шуплината на фалопиевата цевка.Во тековната студија, забележавме дека половина од единечните сперматозоиди покажаа способност да пливаат против течности што течат, а нивната адхезија во снопот ја зголеми нивната способност да покажат позитивна реологија.Понатаму, нашите податоци се конзистентни со оние на Matsuzaki et al.1 кој објави дека зголемената секреција на лактат во SST може да ја инхибира подвижноста на резидентна сперма.Сепак, нашите резултати го опишуваат формирањето на подвижни лигаменти на сперматозоидите и нивното реолошко однесување во присуство на динамична средина во рамките на микроканалот во обид да го разјаснат нивното однесување во SST.Идните истражувања може да се фокусираат на одредување на хемискиот состав и потеклото на аглутинирачкиот агенс, што несомнено ќе им помогне на истражувачите да развијат нови начини за складирање на течната сперма и зголемување на времетраењето на плодноста.
Петнаесет 30-неделни машки шаркаси со голо врат (хомозиготна доминантна; ​​Na Na) беа избрани како донатори на сперма во студијата.Птиците биле одгледувани во Истражувачката живинарска фарма на Земјоделскиот факултет, Универзитетот Ашит, гувернерот Ашит, Египет.Птиците биле сместени во поединечни кафези (30 x 40 x 40 cm), биле подложени на светлосна програма (16 часа светлина и 8 часа темнина) и хранети со диета која содржи 160 g сурови протеини, 2800 kcal метаболизирачка енергија, по 35 g калциум.5 грама достапен фосфор по килограм исхрана.
Според податоците 36, 37, спермата се собирала од мажјаците со масажа на абдоменот.Вкупно 45 примероци од сперма беа собрани од 15 мажи во текот на 3 дена.Семето (n = 15/ден) беше веднаш разредено 1:1 (v:v) со разредувач на семенот од живина Belsville, кој содржи калиум дифосфат (1,27 g), мононатриум глутамат монохидрат (0,867 g), фруктоза (0,5 d) безводен натриум.ацетат (0,43 g), трис(хидроксиметил)аминометан (0,195 g), калиум цитрат монохидрат (0,064 g), калиум монофосфат (0,065 g), магнезиум хлорид (0,034 g) и H2O (100 ml, m03, pH, 3,3mg, pH =Примероците од разредената сперма најпрво беа испитувани под светлосен микроскоп за да се обезбеди добар квалитет на спермата (влага), а потоа се чуваа во водена бања на 37°C до употреба во рок од половина час по собирањето.
Кинематиката и реологијата на сперматозоидите се опишани со помош на систем на микрофлуидни уреди.Примероците на спермата беа дополнително разредени до 1:40 во разредувач на птичји семе во Beltsville, натоварени во микрофлуиден уред (види подолу), а кинетичките параметри беа одредени со помош на систем за компјутерска анализа на семе (CASA) претходно развиен за карактеризирање на микрофлуиди.за мобилноста на сперматозоидите во течни медиуми (Катедра за машинско инженерство, инженерски факултет, Универзитетот Асиут, Египет).Приклучокот може да се преземе на: http://www.assiutmicrofluidics.com/research/casa39.Беа измерени брзината на кривата (VCL, μm/s), линеарната брзина (VSL, μm/s) и просечната брзина на траекторијата (VAP, μm/s).Видеата од сперматозоидите се направени со помош на превртен фазен контраст на микроскоп Optika XDS-3 (со 40x објектив) поврзан со камера Tucson ISH1000 со 30 fps за 3 секунди.Користете го софтверот CASA за да проучите најмалку три области и 500 траектории на сперматозоиди по примерок.Снименото видео е обработено со помош на домашна CASA.Дефиницијата за подвижност во приклучокот CASA се заснова на брзината на пливање на спермата во споредба со брзината на проток и не вклучува други параметри како што е движењето од страна на страна, бидејќи е откриено дека тоа е посигурно во протокот на течности.Реолошкото движење се опишува како движење на сперматозоидите спротивно на насоката на протокот на течноста.Сперматозоидите со реолошки својства беа поделени со бројот на подвижни сперматозоиди;сперматозоидите кои беа во мирување и сперматозоидите што се движат конвективно беа исклучени од пребројувањето.
Сите употребени хемикалии се добиени од Elgomhoria Pharmaceuticals (Каиро, Египет), освен ако не е поинаку наведено.Уредот е произведен како што е опишано од Ел-шери и сор.40 со некои модификации.Материјалите што се користеа за изработка на микроканали вклучуваа стаклени плочи (Howard Glass, Worcester, MA), SU-8-25 негативен отпор (MicroChem, Newton, CA), диацетонски алкохол (Sigma Aldrich, Steinheim, Германија) и полиацетон.-184, Дау Корнинг, Мидленд, Мичиген).Микроканалите се изработуваат со помош на мека литографија.Прво, на печатач со висока резолуција беше испечатена чиста заштитна маска за лице со саканиот дизајн на микроканали (Prismatic, Каиро, Египет и Пацифик Arts and Design, Markham, ON).Мајсторите беа направени користејќи стаклени плочи како подлоги.Плочите беа исчистени во ацетон, изопропанол и дејонизирана вода и потоа беа обложени со 20 μm слој од SU8-25 со обложување со центрифугирање (3000 вртежи во минута, 1 мин).Слоевите SU-8 потоа беа нежно сушени (65°C, 2 мин и 95°C, 10 мин) и беа изложени на УВ зрачење 50 секунди.Печете по експозиција на 65°C и 95°C за 1 мин и 4 мин за вкрстено поврзување на изложените слоеви SU-8, проследено со развој во диацетонски алкохол 6,5 мин.Тешко испечете ги вафлите (200°C за 15 мин) за дополнително да се зацврсти слојот SU-8.
PDMS беше подготвен со мешање на мономерот и зацврстувачот во тежински сооднос од 10:1, потоа дегазиран во вакуум сукатор и истурен на главната рамка SU-8.PDMS беше стврднат во рерна (120°C, 30 мин), потоа каналите беа исечени, одвоени од главниот и продупчени за да се овозможи прицврстување на цевките на влезот и излезот од микроканалот.Конечно, микроканалите PDMS беа трајно прикачени на слајдовите со микроскоп користејќи пренослив корона процесор (Electro-Technic Products, Chicago, IL) како што е опишано на друго место.Микроканалот што се користи во оваа студија е со димензии 200 µm × 20 µm (Ш × В) и е долг 3,6 cm.
Протокот на течноста предизвикан од хидростатичкиот притисок внатре во микроканалот се постигнува со одржување на нивото на течноста во влезниот резервоар над висинската разлика Δh39 во излезниот резервоар (сл. 1).
каде што f е коефициентот на триење, дефиниран како f = C/Re за ламинарен проток во правоаголен канал, каде што C е константа во зависност од односот на изгледот на каналот, L е должината на микроканалот, Vav е просечната брзина во внатрешноста на микроканалот, Dh е хидрауличниот дијаметар на каналот, g – забрзување на гравитацијата.Користејќи ја оваа равенка, просечната брзина на каналот може да се пресмета со помош на следнава равенка: