Ви благодариме што ја посетивте Nature.com. Верзијата на прелистувачот што ја користите има ограничена поддршка за CSS. За најдобро искуство, препорачуваме да користите ажуриран прелистувач (или да го оневозможите режимот на компатибилност во Internet Explorer). Во меѓувреме, за да обезбедиме континуирана поддршка, ќе ја прикажеме страницата без стилови и JavaScript.
Плодноста на птиците зависи од нивната способност да складираат доволно одржливи сперматозоиди подолг временски период во тубулите за складирање на сперма (SST). Точниот механизам преку кој сперматозоидите влегуваат, се задржуваат и го напуштаат SST останува контроверзен. Сперматозоидите на кокошките шаркаси покажаа висока тенденција кон аглутинација, формирајќи мобилни филаментозни снопови што содржат многу клетки. Поради тешкотијата во набљудувањето на подвижноста и однесувањето на сперматозоидите во непроѕирна јајцевода, користевме микрофлуиден уред со пресек на микроканали сличен на оној на сперматозоидите за да ја проучиме аглутинацијата и подвижноста на сперматозоидите. Оваа студија дискутира за тоа како се формираат сноповите сперматозоиди, како се движат и нивната можна улога во продолжувањето на престојот на сперматозоидите во SST. Истражувавме брзина на сперматозоидите и реолошкото однесување кога протокот на течности беше генериран во рамките на микрофлуиден канал со хидростатски притисок (брзина на проток = 33 µm/s). Сперматозоидите имаат тенденција да пливаат против струјата (позитивна реологија) и брзината на снопот сперматозоиди е значително намалена во споредба со единечните сперматозоиди. Забележано е дека сноповите сперматозоиди се движат спирално и се зголемуваат во должина и дебелина како што се регрутираат повеќе единечни сперматозоиди. Беа забележани снопови сперматозоиди како се приближуваат и се лепат за страничните ѕидови на микрофлуидните канали за да се избегне нивно движење со брзина на проток на течност > 33 µm/s. Беа забележани снопови сперматозоиди како се приближуваат и се лепат за страничните ѕидови на микрофлуидните канали за да се избегне нивно движење со брзина на проток на течност > 33 µm/s. Было замечено, что пучки сперматозоидов приближаются и прилипают к боковым стенкам микрофлюидных каналов, чтобы избежать сметания со скоростью потока жидкости> 33 мкм / с. Забележано е дека сноповите сперматозоиди се приближуваат и се лепат за страничните ѕидови на микрофлуидните канали за да избегнат да бидат однесени при брзина на проток на течности >33 µm/s.观察到精子束接近并粘附在微流体通道的侧壁上，以避免被流体流速> 33 μm/s33 µm/s 扫过. Было замечено, что пучки сперматозоидов приближаются и прилипают к боковым стенкам микрожидкостного канала, чтобы избежать сметания потоком жидкости со скоростью > 33 мкм/с. Забележано е дека снопчињата сперматозоиди се приближуваат и се лепат за страничните ѕидови на микрофлуидниот канал за да избегнат да бидат однесени од протокот на течност со брзина >33 µm/s.Скенирањето и трансмисионата електронска микроскопија покажаа дека сноповите сперматозоиди се поткрепени со изобилен густ материјал. Добиените податоци ја демонстрираат единствената мобилност на сперматозоидите од кокошките Шаркази, како и способноста на сперматозоидите да се аглутинираат и да формираат мобилни снопови, што придонесува за подобро разбирање на долгорочното складирање на сперматозоидите во SMT.
За да се постигне оплодување кај луѓето и повеќето животни, сперматозоидите и јајце-клетките мора да пристигнат на местото на оплодување во вистинско време. Затоа, парењето мора да се случи пред или во времето на овулацијата. Од друга страна, некои цицачи, како што се кучињата, како и нецицачките видови, како што се инсектите, рибите, влекачите и птиците, ја складираат спермата во своите репродуктивни органи подолг временски период додека нивните јајца не бидат подготвени за оплодување (асинхроно оплодување 1 ). Птиците се способни да ја одржат одржливоста на сперматозоидите способни да оплодат јајца 2-10 недели 2 .
Ова е единствена карактеристика што ги разликува птиците од другите животни, бидејќи обезбедува голема веројатност за оплодување по еднократно оплодување во тек на неколку недели без истовремено парење и овулација. Главниот орган за складирање на сперма, наречен тубула за складирање на сперма (SST), се наоѓа во внатрешните мукозни набори на утеровагиналниот спој. До денес, механизмите преку кои сперматозоидите влегуваат, се наоѓаат и излегуваат од банката на сперма не се целосно разбрани. Врз основа на претходни студии, изнесени се многу хипотези, но ниту една од нив не е потврдена.
Форман4 претпостави дека сперматозоидите го задржуваат својот престој во шуплината на SST преку континуирано осцилаторно движење спротивно од насоката на протокот на течност низ протеинските канали лоцирани на епителните клетки на SST (реологија). АТП се намалува поради постојаната активност на флагелите потребна за да се задржат сперматозоидите во луменот на SST, а подвижноста на крајот се намалува сè додека сперматозоидите не се изнесат од банката на сперматозоиди со проток на течност и не започнат ново патување по растечката јајцевода за да ја оплодат спермата. Јајце клетка (Форман4). Овој модел на складирање на сперматозоиди е поткрепен со откривање со имуноцитохемија на аквапорини 2, 3 и 9 присутни во епителните клетки на SST. До денес, недостасуваат студии за реологијата на спермата на кокошките и нејзината улога во складирањето на SST, селекцијата на вагиналните сперматозоиди и конкуренцијата на сперматозоидите. Кај кокошките, сперматозоидите влегуваат во вагината по природното парење, но повеќе од 80% од сперматозоидите се исфрлаат од вагината кратко време по парењето. Ова сугерира дека вагината е примарното место за селекција на сперматозоиди кај птиците. Покрај тоа, објавено е дека помалку од 1% од сперматозоидите оплодени во вагината завршуваат во SST2. При вештачко осеменување на пилиња во вагината, бројот на сперматозоиди што достигнуваат SST има тенденција да се зголемува 24 часа по инсеминацијата. Досега, механизмот на селекција на сперматозоиди за време на овој процес е нејасен, а подвижноста на сперматозоидите може да игра важна улога во апсорпцијата на сперматозоидите од SST. Поради дебелите и непроѕирни ѕидови на јајцеводите, тешко е директно да се следи подвижноста на сперматозоидите во јајцеводите кај птиците. Затоа, ни недостасува основно знаење за тоа како сперматозоидите преминуваат во SST по оплодувањето.
Реологијата неодамна е препознаена како важен фактор што го контролира транспортот на сперматозоидите во гениталиите кај цицачите. Врз основа на способноста на подвижните сперматозоиди да мигрираат спротивна струја, Заферани и сор.8 користеле кора микрофлуиден систем за пасивно изолирање на подвижни сперматозоиди од примероци од сперма. Овој тип на сортирање на сперма е од суштинско значење за медицински третман на неплодност и клинички истражувања и е претпочитан во однос на традиционалните методи кои бараат многу време и труд и можат да ја загрозат морфологијата и структурниот интегритет на спермата. Сепак, до денес, не се спроведени студии за ефектот на секретите од гениталните органи на кокошките врз подвижноста на спермата.
Без оглед на механизмот што ги одржува сперматозоидите складирани во SST, многу истражувачи забележале дека резидентните сперматозоиди се аглутинираат глава до глава во SST кај кокошките 9, 10, потполошките 2 и мисирките 11 за да формираат аглутинирани снопови сперматозоиди. Авторите сугерираат дека постои врска помеѓу оваа аглутинација и долгорочното складирање на сперматозоидите во SST.
Тингари и Лејк12 објавија силна поврзаност помеѓу сперматозоидите во жлездата што ги прима сперматозоидите кај кокошката и се запрашаа дали птичјите сперматозоиди се аглутинираат на ист начин како и сперматозоидите кај цицачите. Тие веруваат дека длабоките врски помеѓу сперматозоидите во сеферентниот канал може да се должат на стресот предизвикан од присуството на голем број сперматозоиди во мал простор.
При оценување на однесувањето на сперматозоидите на свежи висечки стаклени плочки, може да се видат минливи знаци на аглутинација, особено на рабовите на капките од спермата. Сепак, аглутинацијата често била нарушена од ротационото дејство поврзано со континуираното движење, што ја објаснува минливата природа на овој феномен. Истражувачите исто така забележале дека кога разредувачот се додавал во спермата, се појавувале издолжени „кончести“ клеточни агрегати.
Раните обиди за имитирање на сперматозоид беа направени со отстранување на тенка жица од висечка капка, што резултираше со издолжена везикула слична на сперма што штрчеше од капката сперма. Сперматозоидите веднаш се наредија паралелно во рамките на везикулата, но целата единица брзо исчезна поради 3D ограничувањето. Затоа, за да се проучи аглутинацијата на сперматозоидите, потребно е директно да се набљудува подвижноста и однесувањето на сперматозоидите во изолирани тубули за складирање на сперма, што е тешко да се постигне. Затоа, потребно е да се развие инструмент што ги имитира сперматозоидите за да се поддржат студиите за подвижноста на спермата и однесувањето на аглутинацијата. Брилар и сор.13 објавија дека просечната должина на тубулите за складирање на сперма кај возрасни пилиња е 400-600 µm, но некои SST можат да бидат долги и до 2000 µm. Меро и Огасавара14 ги поделиле семиниформните жлезди на зголемени и незголемени тубули за складирање на сперма, кои биле исти по должина (~500 µm) и ширина на вратот (~38 µm), но просечниот дијаметар на луменот на тубулите бил 56,6 и 56,6 µm. . , соодветно 11,2 µm, соодветно. Во оваа студија, користевме микрофлуиден уред со големина на канал од 200 µm × 20 µm (Ш × В), чиј пресек е донекаде близок до оној на амплифицираниот SST. Покрај тоа, ја испитавме подвижноста на сперматозоидите и однесувањето на аглутинација во течност што тече, што е во согласност со хипотезата на Форман дека течноста произведена од епителните клетки на SST ги држи сперматозоидите во луменот во спротивна (реолошка) насока.
Целта на ова истражување беше да се надминат проблемите при набљудување на подвижноста на сперматозоидите во јајцеводите и да се избегнат тешкотиите при проучување на реологијата и однесувањето на сперматозоидите во динамична средина. Користен е микрофлуиден уред кој создава хидростатски притисок за симулирање на подвижноста на сперматозоидите во гениталиите на кокошка.
Кога капка од разреден примерок од сперма (1:40) беше внесена во микроканалниот уред, можеа да се идентификуваат два вида подвижност на сперматозоидите (изолирани сперматозоиди и врзани сперматозоиди). Покрај тоа, сперматозоидите имаа тенденција да пливаат против струјата (позитивна реологија; видео 1, 2). Иако сноповите сперматозоиди имаа помала брзина од онаа на осамените сперматозоиди (p < 0,001), тие го зголемија процентот на сперматозоиди кои покажуваат позитивна реотаксиса (p < 0,001; Табела 2). Иако сноповите сперматозоиди имаа помала брзина од онаа на осамените сперматозоиди (p < 0,001), тие го зголемија процентот на сперматозоиди кои покажуваат позитивна реотаксиса (p < 0,001; Табела 2). Хотя пучки сперматозоидов имели повеќе низкую скорость, чем у одиночных сперматозоидов (p < 0,001), они увеличивали процент сперматозоидов, демонстрирующих положительный реотаксис (p < 0,001); Иако сноповите сперматозоиди имаа помала брзина од онаа на поединечните сперматозоиди (p < 0,001), тие го зголемија процентот на сперматозоиди кои покажуваат позитивна реотаксис (p < 0,001; Табела 2).尽管精子束的速度低于孤独精子的速度（p < 0,001），但它们增加了显示阳性流变性的精子百分比（p <0,001；表2）。尽管 精子束 的 速度 低于 孤独 的 速度 （p <0,001） ， 但 增加 了 显示 阾百分比 (p <0,001 ； 2…………………………………..) Хотя скорость пучков сперматозоидов была ниже, чем у одиночных сперматозоидов (p < 0,001), они увеличивали процент сперматозоидов со положительной реологией (p < 0,001; таб 2). Иако брзината на сноповите сперматозоиди беше помала од онаа на единечните сперматозоиди (p < 0,001), тие го зголемија процентот на сперматозоиди со позитивна реологија (p < 0,001; Табела 2).Позитивната реологија за единечни сперматозоиди и китки се проценува на приближно 53% и 85%, соодветно.
Забележано е дека сперматозоидите кај кокошките шаркаси веднаш по ејакулацијата формираат линеарни снопови, кои се состојат од десетици единки. Овие снопови се зголемуваат во должина и дебелина со текот на времето и може да останат in vitro неколку часа пред да се распрснат (видео 3). Овие филаментозни снопови се обликувани како сперматозоиди од ехидна кои се формираат на крајот од епидидимисот. Утврдено е дека спермата на кокошките шаркаши има голема тенденција да се аглутинира и да формира мрежест сноп за помалку од една минута по собирањето. Овие снопови се динамични и способни да се залепат за сите блиски ѕидови или статични предмети. Иако сноповите сперматозоиди ја намалуваат брзината на сперматозоидите, јасно е дека макроскопски тие ја зголемуваат нивната линеарност. Должината на сноповите варира во зависност од бројот на сперматозоиди собрани во сноповите. Два дела од снопот беа изолирани: почетниот дел, вклучувајќи ја слободната глава на аглутинираните сперматозоиди, и терминалниот дел, вклучувајќи ја опашката и целиот дистален крај на сперматозоидите. Користејќи камера со голема брзина (950 fps), во почетниот дел од снопот беа забележани слободни глави на аглутинирани сперматозоиди, одговорни за движењето на снопот поради нивното осцилаторно движење, влечејќи ги преостанатите во снопот со спирално движење (Видео 4). Меѓутоа, кај долгите снопчиња, забележано е дека некои слободни глави на сперматозоиди се залепени за телото, а терминалниот дел од снопчето дејствува како крилца за да помогне во движењето на снопчето.
Додека се во бавен проток на течност, снопчињата сперматозоиди се движат паралелно еден со друг, меѓутоа, тие почнуваат да се преклопуваат и да се лепат за сè што е неподвижно, за да не бидат однесени од течечкиот проток како што се зголемува брзината на проток. Снопчињата се формираат кога неколку сперматозоиди се приближуваат еден кон друг, тие почнуваат да се движат синхроно и се обвиткуваат еден околу друг, а потоа се лепат за леплива супстанца. Сликите 1 и 2 покажуваат како сперматозоидите се приближуваат еден кон друг, формирајќи спој додека опашките се обвиткуваат еден околу друг.
Истражувачите примениле хидростатски притисок за да создадат проток на течност во микроканал за да ја проучат реологијата на спермата. Користен е микроканал со големина од 200 µm × 20 µm (Ш × В) и должина од 3,6 µm. Користете микроканали помеѓу садовите со шприцеви поставени на краевите. За да се направат каналите повидливи, користена е прехранбена боја.
Врзете ги меѓусебните кабли и додатоците на ѕидот. Видеото е снимено со микроскоп со фазен контраст. Со секоја слика се прикажани слики од фазен контраст и мапирање. (A) Врската помеѓу два потоци се спротивставува на протокот поради спирално движење (црвена стрелка). (B) Врската помеѓу снопот на цевките и ѕидот на каналот (црвени стрелки), во исто време тие се поврзани со два други снопови (жолти стрелки). (C) Сноповите на сперматозоиди во микрофлуидниот канал почнуваат да се поврзуваат едни со други (црвени стрелки), формирајќи мрежа од снопови на сперматозоиди. (D) Формирање на мрежа од снопови на сперматозоиди.
Кога капка разредена сперма беше внесена во микрофлуидниот уред и беше создаден проток, беше забележано дека снопот сперматозоиди се движи спротивно од насоката на протокот. Сноповите се прилепуваат цврсто на ѕидовите на микроканали, а слободните глави во почетниот дел од сноповите се прилепуваат цврсто на нив (видео 5). Тие исто така се лепат за сите стационарни честички на нивниот пат, како што се остатоци, за да се спротивстават на тоа да бидат однесени од струјата. Со текот на времето, овие снопчиња стануваат долги филаменти што ги заробуваат другите единечни сперматозоиди и пократки снопчиња (Видео 6). Како што протокот почнува да се забавува, долгите линии на сперматозоиди почнуваат да формираат мрежа од линии на сперматозоиди (Видео 7; Слика 2).
При висока брзина на проток (V > 33 µm/s), спиралните движења на конците се зголемуваат како обид да се фатат многу поединечни снопови сперматозоиди што формираат, кои подобро се спротивставуваат на силата на влечење на протокот. При висока брзина на проток (V > 33 µm/s), спиралните движења на конците се зголемуваат како обид да се фатат многу поединечни снопови сперматозоиди што формираат, кои подобро се спротивставуваат на силата на влечење на протокот. При высокой скорости потока (V > 33 мкм/с) спиралевидные движения нитей усиливаются, поскольку они пытаются поймать множество отдельных сперматозоидов, образующише противечки, ко силе потока. При високи брзини на проток (V > 33 µm/s), спиралните движења на нишките се зголемуваат додека тие се обидуваат да фатат многу поединечни сперматозоиди кои формираат снопови кои се подобро способни да се спротивстават на силата на влечење на протокот.在高流速(V > 33 µm/s)时，螺纹的螺旋运动增加，以试图捕捉许多形成束的单个精子，从而更好地抵抗流动的漂移力。在 高 流速 (v> 33 μm/s) 时 ， 的 螺旋 运动 增加 ， 以 试图 许多 形成 束从而 更 地 抵抗 的 漂移力。... При высоких скоростях потока (V > 33 мкм/с) спиральное движение нитей увеличивается в попытке захватить множество отдельных сперматозоидов, образующих пучкички, чтобпрофативя постилька. При високи брзини на проток (V > 33 µm/s), спиралното движење на филаментите се зголемува во обид да се заробат многу поединечни сперматозоиди кои формираат снопови за подобро да се спротивстават на силите на движење на протокот.Тие исто така се обидоа да прикачат микроканали на страничните ѕидови.
Сноповите сперматозоиди беа идентификувани како кластери од глави на сперматозоиди и свиткани опашки со помош на светлосна микроскопија (LM). Сноповите сперматозоиди со различни агрегати се идентификувани и како извиткани глави и флагеларни агрегати, повеќекратни споени опашки на сперматозоиди, глави на сперматозоиди прикачени на опашка и глави на сперматозоиди со свиткани јадра како повеќекратни споени јадра. трансмисиона електронска микроскопија (TEM). Скенираната електронска микроскопија (SEM) покажа дека сноповите сперматозоиди беа обвиткани агрегати од глави на сперматозоиди, а агрегатите на сперматозоиди покажаа прикачена мрежа од завиткани опашки.
Морфологијата и ултраструктурата на сперматозоидите, формирањето на снопови сперматозоиди беа проучени со светлосна микроскопија (половина пресек), скенирачка електронска микроскопија (SEM) и трансмисиона електронска микроскопија (TEM), а размаските од сперма беа обоени со акридин портокалова боја и испитани со епифлуоресцентна микроскопија.
Боењето на сперматозоидите со акридин портокал (сл. 3Б) покажа дека главите на сперматозоидите се залепени заедно и покриени со секреторен материјал, што доведе до формирање на големи грутки (сл. 3Д). Сноповите на сперматозоиди се состоеја од агрегати на сперматозоиди со мрежа од прикачени опашки (сл. 4А-В). Сноповите на сперматозоиди се составени од опашките на многу сперматозоиди залепени заедно (сл. 4Д). Главите на сноповите на сперматозоидите се покриени со тајни (сл. 4Е,Ф).
Формирање на сноп сперматозоиди. Со користење на фазен контрастен микроскоп и размаски од сперматозоиди обоени со акридин портокалова боја, покажано е дека главите на сперматозоидите се лепат заедно. (A) Раното формирање на сноп од сперматозоиди започнува со еден сперматозоид (бел круг) и три сперматозоиди (жолт круг), при што спиралата започнува од опашката и завршува на главата. (B) Фотомикрографија на размаска од сперма обоена со акридин портокалова боја што ги покажува адхерентните глави на сперматозоидите (стрелки). Исцедокот ги покрива главите. Зголемување × 1000. (C) Развој на голем зрак транспортиран со проток во микрофлуиден канал (користејќи камера со голема брзина при 950 fps). (D) Микрографија на размаска од сперма обоена со акридин портокалова боја што ги покажува големите снопчиња (стрелки). Зголемување: ×200.
Скенирачки електронски микрографски преглед на зрак од сперма и размаз од сперма обоен со акридин портокалова боја. (A, B, D, E) се дигитални скенирачки електронски микрографски прегледи во боја на сперматозоиди, а C и F се микрографии на размаз од сперма обоени со акридин портокалова боја кои покажуваат прицврстување на повеќе сперматозоиди кои ја обвиткуваат каудалната мрежа. (AC) Агрегатите на сперматозоидите се прикажани како мрежа од прицврстени опашки (стрелки). (D) Адхезија на неколку сперматозоиди (со леплива супстанца, розова контура, стрелка) кои се обвиткуваат околу опашката. (E и F) Агрегати на главата на сперматозоидите (покажувачи) покриени со леплив материјал (покажувачи). Сперматозоидите формирале снопови со неколку вртложни структури (F). (C) ×400 и (F) ×200 зголемувања.
Користејќи трансмисиона електронска микроскопија, откривме дека сноповите сперматозоиди имале прикачени опашки (Сл. 6А, В), глави прикачени за опашки (Сл. 6Б) или глави прикачени за опашки (Сл. 6Д). Главите на сперматозоидите во снопот се закривени, презентирајќи се во пресекот два нуклеарни региони (Сл. 6Д). Во инцизиониот сноп, сперматозоидите имале извиткана глава со два нуклеарни региони и повеќе флагеларни региони (Сл. 5А).
Дигитална електронска микрографија во боја што ги прикажува поврзувачките опашки во снопот сперматозоиди и аглутинирачкиот материјал што ги поврзува главите на сперматозоидите. (A) Прикачена опашка од голем број сперматозоиди. Забележете како изгледа опашката и во портретна (стрелка) и во пејзажна (стрелка) проекција. (B) Главата (стрелка) на сперматозоидите е поврзана со опашката (стрелка). (C) Прикачени се неколку опашки на сперматозоидите (стрелки). (D) Материјалот за аглутинација (AS, сина) поврзува четири глави на сперматозоиди (виолетова).
Скенирачки електронски микроскоп беше користен за откривање на глави на сперматозоиди во снопови сперматозоиди покриени со секрети или мембрани (Слика 6Б), што укажува дека сноповите сперматозоиди се закотвени со екстрацелуларен материјал. Аглутинираниот материјал беше концентриран во главата на сперматозоидите (склоп сличен на глава на медуза; Сл. 5Б) и се прошири дистално, давајќи брилијантен жолт изглед под флуоресцентна микроскопија кога се обои со акридин портокалова боја (Слика 6В). Оваа супстанца е јасно видлива под скенирачки микроскоп и се смета за врзивно средство. Полутенките делови (Слика 5В) и размаските од сперматозоиди обоени со акридин портокалова боја покажаа снопови сперматозоиди што содржат густо спакувани глави и свиткани опашки (Слика 5Д).
Различни фотомикрографски снимки што прикажуваат агрегација на глави на сперматозоиди и свиткани опашки со користење на различни методи. (A) Напречен пресек на дигитална електронска микрографија во боја со трансмисија на сноп сперматозоиди што прикажува намотана глава на сперматозоиди со дводелно јадро (сина) и неколку флагеларни делови (зелена). (B) Дигитална електронска микрографија во боја со скенирање што прикажува кластер од глави на сперматозоиди слични на медуза (стрелки) што изгледаат како да се покриени. (C) Полутенок пресек што прикажува агрегирани глави на сперматозоиди (стрелки) и свиткани опашки (стрелки). (D) Микрографија на брис од сперма обоен со акридин портокалова боја што прикажува агрегати на глави на сперматозоиди (стрелки) и свиткани адхезивни опашки (стрелки). Забележете дека леплива супстанца (S) ја покрива главата на сперматозоидите. (D) зголемување × 1000.
Користејќи трансмисиона електронска микроскопија (сл. 7А), беше забележано и дека главите на сперматозоидите беа извиткани, а јадрата имаа спирална форма, што беше потврдено со размаски од сперма обоени со акридин портокал и испитани со флуоресцентна микроскопија (сл. 7Б).
(A) Дигитална електронска микрографска слика со пренос на боја и (B) Размаска од сперма обоена со акридин портокалова боја што покажува намотани глави и прицврстување на главите и опашките на сперматозоидите (стрелки). (B) зголемување × 1000.
Интересно откритие е дека сперматозоидите на Шаркази се агрегираат за да формираат мобилни филаментозни снопчиња. Својствата на овие снопчиња ни овозможуваат да ја разбереме нивната можна улога во апсорпцијата и складирањето на сперматозоидите во SST.
По парењето, сперматозоидите влегуваат во вагината и се подложени на интензивен процес на селекција, што резултира со само ограничен број сперматозоиди кои влегуваат во SST15,16. До денес, механизмите преку кои сперматозоидите влегуваат и излегуваат од SST се нејасни. Кај живината, сперматозоидите се чуваат во SST подолг период од 2 до 10 недели, во зависност од видот6. Останува контроверзноста околу состојбата на спермата за време на складирањето во SST. Дали се во движење или во мирување? Со други зборови, како сперматозоидите ја одржуваат својата позиција во SST толку долго?
Форман4 сугерираше дека престојот и исфрлањето на SST може да се објаснат во однос на подвижноста на сперматозоидите. Авторите претпоставуваат дека сперматозоидите ја одржуваат својата позиција со пливање спротивно на протокот на течност создаден од епителот на SST и дека сперматозоидите се исфрлаат од SST кога нивната брзина паѓа под точката во која почнуваат да се движат назад поради недостаток на енергија. Занибони5 го потврди присуството на аквапорини 2, 3 и 9 во апикалниот дел од епителните клетки на SST, што може индиректно да го поткрепи моделот на складирање на сперма на Форман. Во тековната студија, откривме дека речиси половина од сперматозоидите на Шаркаши покажуваат позитивна реологија во течната течност и дека аглутинираните снопови сперматозоиди го зголемуваат бројот на сперматозоиди што покажуваат позитивна реологија, иако аглутинацијата ги забавува. Начинот на кој сперматозоидите патуваат по фалопиевата цевка на птицата до местото на оплодување не е целосно разбран. Кај цицачите, фоликуларната течност ги хемоатрактанти. Сепак, се верува дека хемоатрактанти ги насочуваат сперматозоидите да се приближат на долги растојанија7. Затоа, други механизми се одговорни за транспортот на сперматозоидите. Способноста на сперматозоидите да се ориентираат и да течат спротивно од течноста на јајцеводите што се ослободува по парењето е објавена како главен фактор во насочувањето на сперматозоидите кај глувците. Паркер 17 сугерираше дека сперматозоидите ги преминуваат јајцеводите пливајќи спротивно од цилијарната струја кај птиците и влекачите. Иако тоа не е експериментално демонстрирано кај птиците, Адолфи18 беше првиот што откри дека птичјата сперма дава позитивни резултати кога се создава тенок слој течност помеѓу покривното стакленце и стакленцето со лента од филтер-хартија. Реологија. Хино и Јанагимачи [19] поставија комплекс од глувчешки јајници-туба-матка во перфузионен прстен и инјектираа 1 µl мастило во истмусот за да го визуелизираат протокот на течност во јајцеводите. Тие забележаа многу активно движење на контракција и релаксација во јајцеводите, во кое сите топчиња со мастило постојано се движеа кон ампулата на јајцеводите. Авторите ја нагласуваат важноста на протокот на течност во јајцеводите од долните кон горните јајцеводи за подигнување и оплодување на сперматозоидите. Brillard20 објави дека кај кокошките и мисирките, сперматозоидите мигрираат со активно движење од вагиналниот влез, каде што се складираат, до утеровагиналниот спој, каде што се складираат. Сепак, ова движење не е потребно помеѓу утеровагиналниот спој и инфундибулумот бидејќи сперматозоидите се транспортираат со пасивно поместување. Знаејќи ги овие претходни препораки и резултатите добиени во тековната студија, може да се претпостави дека способноста на сперматозоидите да се движат нагоре по течението (реологија) е едно од својствата на кои се базира процесот на селекција. Ова го одредува преминувањето на сперматозоидите низ вагината и нивното влегување во CCT за складирање. Како што предложи Форман4, ова може да го олесни и процесот на влегување на сперматозоидите во SST и неговото живеалиште за одреден временски период, а потоа излегување кога нивната брзина ќе почне да се забавува.
Од друга страна, Мацузаки и Сасанами 21 сугерираа дека птичјите сперматозоиди претрпуваат промени во подвижноста од мирување до подвижност во машкиот и женскиот репродуктивен тракт. Инхибицијата на подвижноста на резидентните сперматозоиди во SST е предложена за да се објасни долгото време на складирање на сперматозоидите, а потоа и подмладувањето по напуштањето на SST. Под хипоксични услови, Мацузаки и сор. 1 објавија високо производство и ослободување на лактат во SST, што може да доведе до инхибиција на подвижноста на резидентните сперматозоиди. Во овој случај, важноста на реологијата на спермата се рефлектира во селекцијата и апсорпцијата на сперматозоидите, а не во нивното складирање.
Моделот на аглутинација на сперматозоидите се смета за веродостојно објаснување за долгиот период на складирање на сперматозоидите во SST, бидејќи ова е вообичаен модел на задржување на сперматозоидите кај живината2,22,23. Бакст и сор.2 забележале дека повеќето сперматозоиди се адхерираат еден до друг, формирајќи фасцикуларни агрегати, а единечни сперматозоиди ретко се наоѓаат во CCM кај препелиците. Од друга страна, Вен и сор.24 забележале повеќе расфрлани сперматозоиди и помалку грутки сперматозоиди во луменот на SST кај кокошките. Врз основа на овие набљудувања, може да се претпостави дека склоноста кон аглутинација на сперматозоиди се разликува кај птиците и меѓу сперматозоидите во истиот ејакулат. Покрај тоа, Ван Креј и сор.9 сугерирале дека случајната дисоцијација на аглутинираните сперматозоиди е одговорна за постепеното продирање на сперматозоидите во луменот на јајцеводите. Според оваа хипотеза, сперматозоидите со помал капацитет на аглутинација треба прво да се исфрлат од SST. Во овој контекст, способноста на сперматозоидите да се аглутинираат може да биде фактор што влијае врз исходот од конкуренцијата меѓу сперматозоидите кај валканите птици. Покрај тоа, колку подолго аглутинираните сперматозоиди дисоцираат, толку подолго се одржува плодноста.
Иако агрегацијата на сперматозоидите и агрегацијата во снопови се забележани во неколку студии2,22,24, тие не се опишани детално поради сложеноста на нивното кинематичко набљудување во рамките на SST. Направени се неколку обиди за проучување на аглутинацијата на сперматозоидите in vitro. Обемна, но минлива агрегација е забележана кога тенката жица е отстранета од висечката капка семе. Ова води до фактот дека од капката излегува издолжен меур, имитирајќи ја семената жлезда. Поради 3D ограничувањата и краткото време на сушење со капење, целиот блок брзо се распадна9. Во оваа студија, користејќи кокошки Шаркаши и микрофлуидни чипови, можевме да опишеме како се формираат овие снопчиња и како се движат. Сноповите сперматозоиди се формираа веднаш по собирањето на спермата и беше откриено дека се движат спирално, покажувајќи позитивна реологија кога се присутни во протокот. Понатаму, кога се гледаат макроскопски, забележано е дека сноповите сперматозоиди ја зголемуваат линеарноста на подвижноста во споредба со изолираните сперматозоиди. Ова укажува дека аглутинацијата на сперматозоидите може да се случи пред пенетрацијата на SST и дека производството на сперматозоиди не е ограничено на мала површина поради стрес како што претходно беше сугерирано (Тингари и Лејк12). За време на формирањето на снопчињата, сперматозоидите пливаат синхронизирано сè додека не формираат спој, потоа нивните опашки се обвиткуваат една околу друга и главата на сперматозоидите останува слободна, но опашката и дисталниот дел на сперматозоидите се лепат заедно со леплива супстанца. Затоа, слободната глава на лигаментот е одговорна за движењето, влечејќи го остатокот од лигаментот. Скенираната електронска микроскопија на снопчињата сперматозоиди покажа прицврстени глави на сперматозоиди покриени со многу леплив материјал, што укажува дека главите на сперматозоидите биле прицврстени во снопчиња за одмор, што можеби се случило по достигнувањето на местото на складирање (SST).
Кога брис од сперма се бои со акридин портокал, под флуоресцентен микроскоп може да се види екстрацелуларен адхезивен материјал околу сперматозоидите. Оваа супстанца им овозможува на сноповите сперматозоиди да се лепат и да се залепат за околните површини или честички, така што тие не лебдат со околниот тек. Така, нашите набљудувања ја покажуваат улогата на адхезијата на сперматозоидите во форма на мобилни снопови. Нивната способност да пливаат против струјата и да се лепат за блиските површини им овозможува на сперматозоидите да останат подолго во SST.
Ротшилд25 користел хемоцитометриска камера за да го проучи лебдечкиот распоред на говедската сперма во капка суспензија, правејќи фотомикрографии преку камера со вертикална и хоризонтална оптичка оска на микроскопот. Резултатите покажаа дека сперматозоидите биле привлечени кон површината на комората. Авторите сугерираат дека може да има хидродинамички интеракции помеѓу спермата и површината. Земајќи го ова предвид, заедно со способноста на спермата од пилињата Шаркаши да формира лепливи прамени, може да се зголеми веројатноста спермата да се залепи за ѕидот на SST и да се чува подолг временски период.
Бчети и Афзелиу26 објавија дека гликокаликсот на спермата е потребен за препознавање и аглутинација на гамети. Форман10 забележал дека хидролизата на α-гликозидните врски во гликопротеин-гликолипидните обвивки со третирање на птичја сперма со неураминидаза резултирала со намалена плодност без да влијае на подвижноста на сперматозоидите. Авторите сугерираат дека ефектот на неураминидазата врз гликокаликсот ја нарушува секвестрацијата на сперматозоидите на утеро-вагиналниот спој, со што се намалува плодноста. Нивните набљудувања не можат да ја игнорираат можноста дека третманот со неураминидаза може да го намали препознавањето на сперматозоидите и јајце-клетките. Форман и Енгел10 откриле дека плодноста била намалена кога кокошките биле оплодени интравагинално со сперма третирана со неураминидаза. Сепак, ин витро оплодувањето со сперма третирана со неураминидаза не влијаело на плодноста во споредба со контролните кокошки. Авторите заклучиле дека промените во гликопротеин-гликолипидната обвивка околу мембраната на спермата ја намалуваат способноста на сперматозоидите да оплодуваат со нарушена секвестрација на сперматозоидите на утеровагиналниот спој, што пак го зголемува губењето на сперматозоидите поради брзината на утеровагиналниот спој, но не влијае на препознавањето на сперматозоидите и јајце-клетките.
Кај мисирките, Бакст и Баучен 11 пронајдоа мали везикули и мембрански фрагменти во луменот на SST и забележаа дека некои од овие гранули се споиле со мембраната на сперматозоидите. Авторите сугерираат дека овие односи може да придонесат за долгорочно складирање на сперматозоидите во SST. Сепак, истражувачите не го прецизираа изворот на овие честички, без разлика дали се лачат од епителните клетки на CCT, се произведуваат и лачат од машкиот репродуктивен систем или се произведуваат од самата сперма. Исто така, овие честички се одговорни за аглутинацијата. Грицнер и сор.27 објавија дека епителните клетки на епидидимисот произведуваат и лачат специфичен протеин кој е потребен за формирање на семенски тракти со една пор. Авторите, исто така, известуваат дека дисперзијата на овие снопови зависи од интеракцијата на епидидималните протеини. Никсон и сор.28 откриле дека аднексите лачат протеин, киселиот остеонектин богат со цистеин; SPARC е вклучен во формирањето на сперматозоиди кај ехидни и платипуси со краток клун. Расејувањето на овие зраци е поврзано со губењето на овој протеин.
Во тековната студија, ултраструктурната анализа со употреба на електронска микроскопија покажа дека сперматозоидите се адхерирале на голема количина густ материјал. Се смета дека овие супстанции се одговорни за аглутинацијата што се кондензира помеѓу и околу адхерираните глави, но со пониски концентрации во регионот на опашката. Претпоставуваме дека оваа аглутинирачка супстанција се излачува од машкиот репродуктивен систем (епидидимис или семеен канал) заедно со спермата, бидејќи често забележуваме одвојување на спермата од лимфата и семената плазма за време на ејакулацијата. Објавено е дека додека птичјите сперматозоиди минуваат низ епидидимисот и семениот канал, тие претрпуваат промени поврзани со созревањето што ја поддржуваат нивната способност да врзуваат протеини и да стекнуваат гликопротеини поврзани со плазма лемата. Перзистентноста на овие протеини на резидентните мембрани на сперматозоидите во SST сугерира дека овие протеини можат да влијаат на стекнувањето на стабилноста на мембраната на спермата 30 и да ја одредат нивната плодност 31. Ахамад и сор.32 објавија дека сперматозоидите добиени од различни делови на машкиот репродуктивен систем (од тестисите до дисталниот канал за течење) покажале прогресивно зголемување на одржливоста при услови на складирање во течност, без оглед на температурата на складирање, а одржливоста кај кокошките се зголемува и во јајцеводите по вештачко оплодување.
Сперматозоидите од кокошките Шаркаши имаат различни карактеристики и функции од другите видови како што се ехидните, платипусите, шумските глувци, еленските стаорци и заморчињата. Кај кокошките Шаркаши, формирањето на снопови сперматозоиди ја намали нивната брзина на пливање во споредба со единечните сперматозоиди. Сепак, овие снопови го зголемија процентот на реолошки позитивни сперматозоиди и ја зголемија способноста на сперматозоидите да се стабилизираат во динамична средина. Така, нашите резултати ја потврдуваат претходната сугестија дека аглутинацијата на сперматозоидите во SST е поврзана со долгорочно складирање на сперматозоиди. Исто така, претпоставуваме дека склоноста на сперматозоидите да формираат снопови може да ја контролира стапката на губење на сперматозоиди во SST, што може да го промени исходот од конкуренцијата на сперматозоидите. Според оваа претпоставка, сперматозоидите со низок капацитет на аглутинација прво го ослободуваат SST, додека сперматозоидите со висок капацитет на аглутинација го создаваат поголемиот дел од потомството. Формирањето на снопови сперматозоиди со единечни пори е корисно и влијае на односот родител-дете, но користи различен механизам. Кај ехидните и платипусите, сперматозоидите се распоредени паралелно еден со друг за да се зголеми брзината на движење на зракот напред. Сноповите ехидни се движат околу три пати побрзо од единечните сперматозоиди. Се верува дека формирањето на вакви снопови сперматозоиди кај ехидните е еволутивна адаптација за одржување на доминацијата, бидејќи женките се промискуитетни и обично се парат со неколку мажјаци. Затоа, сперматозоидите од различни ејакулати жестоко се натпреваруваат за оплодување на јајце-клетката.
Аглутинираните сперматозоиди кај кокошките шаркаси лесно се визуелизираат со помош на микроскопија со фазен контраст, што се смета за предност бидејќи овозможува лесно проучување на однесувањето на сперматозоидите in vitro. Механизмот со кој формирањето на снопчиња сперматозоиди ја поттикнува репродукцијата кај кокошките шаркаси е исто така различен од оној што се гледа кај некои плацентални цицачи кои претставуваат кооперативно однесување на спермата, како што се шумските глувци, каде што некои сперматозоиди стигнуваат до јајцата, помагајќи им на други сродни единки да ги достигнат и оштетат своите јајца. да се докажете. алтруистичко однесување. Самооплодување 34. Друг пример за кооперативно однесување кај сперматозоидите е пронајден кај еленските глувци, каде што сперматозоидите биле во можност да идентификуваат и комбинираат со генетски најсродните сперматозоиди и да формираат кооперативни групи за да ја зголемат својата брзина во споредба со неповрзаните сперматозоиди35.
Резултатите добиени во оваа студија не се во спротивност со теоријата на Фоман за долгорочно складирање на сперматозоиди во SWS. Истражувачите известуваат дека сперматозоидите продолжуваат да се движат во протокот на епителни клетки што ја обложуваат SST подолг временски период, а по одреден временски период, енергетските резерви на сперматозоидите се исцрпуваат, што резултира со намалување на брзината, што овозможува исфрлање на супстанции со мала молекуларна тежина. енергија на сперматозоидите со протокот на течност од луменот на SST Шуплината на јајцеводите. Во оваа студија, забележавме дека половина од поединечните сперматозоиди покажаа способност да пливаат против течечките течности, а нивната адхезија во снопот ја зголеми нивната способност да покажат позитивна реологија. Понатаму, нашите податоци се во согласност со оние на Мацузаки и сор. 1 кои објавија дека зголеменото лачење на лактат во SST може да ја инхибира подвижноста на резидентните сперматозоиди. Сепак, нашите резултати го опишуваат формирањето на подвижни лигаменти на сперматозоидите и нивното реолошко однесување во присуство на динамична средина во рамките на микроканал во обид да го разјаснат нивното однесување во SST. Идните истражувања може да се фокусираат на утврдување на хемискиот состав и потеклото на аглутинирачкиот агенс, што несомнено ќе им помогне на истражувачите да развијат нови начини за складирање на течна сперма и зголемување на времетраењето на плодноста.
Петнаесет 30-неделни машки шаркаси со головрат (хомозиготен доминантен; Na Na) беа избрани како донатори на сперма во студијата. Птиците беа одгледувани на Истражувачката фарма за живина на Факултетот за земјоделство, Универзитетот Ашит, губернијата Ашит, Египет. Птиците беа сместени во индивидуални кафези (30 x 40 x 40 см), подложени на светлосна програма (16 часа светлина и 8 часа темнина) и хранети со храна што содржи 160 g сурови протеини, 2800 kcal метаболизирачка енергија, 35 g калциум за секое. 5 грама достапен фосфор на килограм храна.
Според податоците 36, ​​37, спермата е собрана од мажи со абдоминална масажа. Вкупно 45 примероци од сперма се собрани од 15 мажи во текот на 3 дена. Спермата (n = 15/ден) веднаш е разредена 1:1 (v:v) со разредувач на сперма Belsville Poultry, кој содржи калиум дифосфат (1,27 g), мононатриум глутамат монохидрат (0,867 g), фруктоза (0,5 d), безводен натриум ацетат (0,43 g), трис(хидроксиметил)аминометан (0,195 g), калиум цитрат монохидрат (0,064 g), калиум монофосфат (0,065 g), магнезиум хлорид (0,034 g) и H2O (100 ml), pH = 7, 5, осмоларност 333 mOsm/kg38. Разредените примероци од сперма прво беа испитани под светлосен микроскоп за да се обезбеди добар квалитет на спермата (влажност), а потоа се чуваа во водена бања на 37°C до употреба во рок од половина час по собирањето.
Кинематиката и реологијата на сперматозоидите се опишани со помош на систем од микрофлуидни уреди. Примероците од сперма беа дополнително разредени до 1:40 во разредувач на птичја сперма Beltsville, натоварени во микрофлуиден уред (видете подолу), а кинетичките параметри беа одредени со помош на систем за компјутеризирана анализа на сперма (CASA) претходно развиен за карактеризација на микрофлуиди. за мобилноста на сперматозоидите во течни медиуми (Оддел за машински инженеринг, Факултет за инженерство, Универзитет Асиут, Египет). Додатокот може да се преземе на: http://www.assiutmicrofluidics.com/research/casa39. Беа измерени брзината на кривата (VCL, μm/s), линеарната брзина (VSL, μm/s) и просечната траекторска брзина (VAP, μm/s). Видеата од сперматозоидите беа направени со помош на инвертен микроскоп со фазен контраст Optika XDS-3 (со 40x објектив) поврзан со камера Tucson ISH1000 со 30 fps за 3 секунди. Користете го софтверот CASA за да проучите најмалку три области и 500 траектории на сперматозоиди по примерок. Снименото видео е обработено со помош на домашен CASA. Дефиницијата за подвижност во приклучокот CASA се базира на брзината на пливање на сперматозоидите во споредба со брзината на проток и не вклучува други параметри како што е движењето од страна на страна, бидејќи се покажа дека е посигурно при проток на течност. Реолошкото движење е опишано како движење на сперматозоидите спротивно од насоката на проток на течност. Сперматозоидите со реолошки својства беа поделени со бројот на подвижни сперматозоиди; сперматозоидите што беа во мирување и конвективно движечките сперматозоиди беа исклучени од броењето.
Сите употребени хемикалии беа добиени од Elgomhoria Pharmaceuticals (Каиро, Египет), освен ако не е поинаку наведено. Уредот беше произведен како што е опишано од El-sherry et al. 40 со некои модификации. Материјалите што се користеа за изработка на микроканали вклучуваа стаклени плочи (Howard Glass, Worcester, MA), негативен отпорник SU-8-25 (MicroChem, Newton, CA), диацетонски алкохол (Sigma Aldrich, Steinheim, Германија) и полиацетон. -184, Dow Corning, Midland, Michigan). Микроканали се изработуваат со употреба на мека литографија. Прво, проѕирна заштитна маска за лице со посакуваниот дизајн на микроканали беше испечатена на печатач со висока резолуција (Prismatic, Каиро, Египет и Pacific Arts and Design, Markham, ON). Мастер-плочите беа направени со употреба на стаклени плочи како подлоги. Плочите беа исчистени во ацетон, изопропанол и дејонизирана вода, а потоа обложени со слој од 20 µm SU8-25 со центрифугално премачкување (3000 вртежи во минута, 1 минута). Слоевите на SU-8 потоа беа нежно сушени (65°C, 2 мин и 95°C, 10 мин) и изложени на УВ зрачење 50 секунди. Постекспозиционото печење на 65°C и 95°C во времетраење од 1 минута и 4 минути за вкрстено поврзување на изложените слоеви на SU-8, по што следеше развој во диацетонски алкохол во времетраење од 6,5 минути. Вафлите беа печени на силно печење (200°C во времетраење од 15 минути) за дополнително зацврстување на слојот SU-8.
PDMS беше подготвен со мешање на мономерот и стврднувачот во тежински сооднос од 10:1, потоа дегасифициран во вакуумски ексикатор и истурен врз главната рамка на SU-8. PDMS беше стврднат во рерна (120°C, 30 мин), потоа каналите беа исечени, одвоени од главниот и перфорирани за да се овозможи прицврстување на цевките на влезот и излезот на микроканалот. Конечно, PDMS микроканали беа трајно прицврстени на микроскопски плочки со помош на преносен корона процесор (Electro-Technic Products, Чикаго, Илиноис) како што е опишано на друго место. Микроканалот што се користеше во оваа студија има димензии од 200 µm × 20 µm (Ш × В) и е долг 3,6 cm.
Протокот на флуид предизвикан од хидростатичкиот притисок во микроканалот се постигнува со одржување на нивото на флуидот во влезниот резервоар над висинската разлика Δh39 во излезниот резервоар (Сл. 1).
каде што f е коефициент на триење, дефиниран како f = C/Re за ламинарен проток во правоаголен канал, каде што C е константа што зависи од соодносот на ширина и висина на каналот, L е должината на микроканалот, Vav е просечната брзина во микроканалот, Dh е хидрауличниот дијаметар на каналот, g – забрзување на гравитацијата. Користејќи ја оваа равенка, просечната брзина на каналот може да се пресмета со помош на следната равенка: