Ви благодариме што ја посетивте Nature.com. Верзијата на прелистувачот што ја користите има ограничена поддршка за CSS. За најдобро искуство, ви препорачуваме да користите ажуриран прелистувач (или да го исклучите режимот на компатибилност во Internet Explorer). Во меѓувреме, за да обезбедиме континуирана поддршка, ќе ја прикажеме страницата без стилови и JavaScript.
Порозните силика честички беа подготвени со метод на сол-гел со некои модификации за да се добијат макропорозни честички. Овие честички беа дериватизирани со реверзибилна адитивна фрагментација синџир трансфер (RAFT) полимеризација со N-фенилмалеимид-метилвинилизоцијанат (PMI) и стирен за да се подготви N-phenylmaleimide-methylvinylisocyanate (PMI) и стирен за да се подготви N-phenylmaleimide-метилвинилизоцианат. помалку челични столбови (100 × 1,8 mm id) беа спакувани со пакување со кашеста маса. Оценето сепарација на PMP колона на мешавина од пептиди која се состои од пет пептиди (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Gly-Serucine) и човечки перформанси на трипсинчропском-Арг. албумин (HAS). Под оптимални услови на елуирање, теоретскиот број на плочи на пептидната смеса е дури 280.000 плочи/m². Споредувајќи ги перформансите на раздвојување на развиената колона со комерцијалната колона Ascentis Express RP-Amide, беше забележано дека перформансите на раздвојување на колоната PMP беа подобри од комерцијалната резолуција на колоната во однос на сепаратната колона.
Во последниве години, биофармацевтската индустрија стана глобален пазар што се шири со значително зголемување на уделот на пазарот. протеините во телесните течности, ткива и клетки е исклучително предизвикувачка задача поради големиот број потенцијално забележливи видови во еден примерок. Иако масената спектрометрија е ефикасна алатка за секвенционирање на пептиди и протеини, ако таквите примероци се инјектираат во масениот спектрометар во еден премин, одвојувањето нема да биде идеално. аналитите кои влегуваат во масениот спектрометар во дадено време4,5,6. Покрај тоа, за време на одвојувањето на течната фаза, аналитите може да се фокусираат во тесни региони, а со тоа да се концентрираат овие аналити и да се подобри чувствителноста за откривање на MS.
Течната хроматографија со обратна фаза (RP-LC) е широко користена за прочистување и одвојување на пептидни мешавини со користење на октадецил-модифицирана силициум диоксид (ODS) како стационарна фаза11,12,13. Сепак, RP стационарни фази не обезбедуваат задоволително раздвојување на пептидите, специјалната 1 рефлексна и амфичната структура на нивните пептиди, 5 и протеините. Потребни се дизајнирани стационарни фази за да се анализираат пептидите и протеините со поларни и неполарни делови за да се интеракција и да се задржат овие аналити. и протеински сепарации17,18,19,20,21. Стационарни фази со мешан режим (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, поларна интеркалација/RPLC) се погодни за сепарации на пептиди и протеини поради присуството на поларни и неполарни групи22,23,24,25,28, поларни стационарни и поларни стационарни и поларни стационарни. Ларните групи покажуваат добра сепарациска моќ и единствена селективност за поларните и неполарните аналити, бидејќи раздвојувањето зависи од интеракцијата помеѓу аналитот и стационарната фаза.Мултимодални интеракции 29, 30, 31, 32. Неодамна, Џанг и сор.30 подготви стационарна фаза на полиамин со додецил и успешно одвои јаглеводороди, антидепресиви, флавоноиди, нуклеозиди, естрогени и неколку други аналити. Поларниот интеркалатор има и поларни и неполарни групи, така што може да се користи за одвојување на пептиди и протеини кои имаат и хидрофобни и хидрофобни и хидрофобни колони. ed C18 колони) се комерцијално достапни под трговското име Ascentis Express RP-Amide колони, но овие колони се користат само за анализа на амин 33.
Во тековната студија, беше подготвена поларно вградена стационарна фаза (N-фенилмалеимид-вграден полистирен) и беше евалуирана за раздвојување на пептидите и трипсин дигестиите на HSA. Стационарната фаза беше подготвена користејќи ја следната стратегија. G), TMOS, вода оцетна киселина беше прилагодена за да се подготват силика честички со голема големина на порите. Второ, нов лиганд, фенилмалеимид-метил винил изоцијанат, беше синтетизиран и искористен за дериватизација на честички од силика за да се подготви поларна вградена стационарна фаза. Резултирачката стационарна фаза од 1 mm беше спакувана во стационарна фаза 1 mm шема на пакување. Пакувањето на колоната е потпомогнато со механички вибрации за да се обезбеди формирање на хомогено лежиште во колоната.(Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) и трипсин дигестот на хуманиот серумски албумин (HAS). Пептидната мешавина и трипсин дигестот на HSA беа забележани да се одвојат со добра резолуција и ефикасноста на колоната беше во споредба со изразената ефикасност на PMPA. Беше забележано дека и пептидите и протеините се добро решени и ефикасни на колоната PMP, која беше поефикасна од колоната Ascentis Express RP-Amide.
PEG (полиетилен гликол), уреа, оцетна киселина, триметокси ортосиликат (TMOS), триметил хлоросилан (TMCS), трипсин, хуман серумски албум (HSA), амониум хлорид, уреа, хексан метилдисилазан (HMDS), метакрилоил стихлорид-хлорид (МЦС) BPO), HPLC степен ацетонитрил (ACN), метанол, 2-пропанол и ацетон купени од Sigma-Oldrich (Сент Луис, MO, САД).
Мешавина од уреа (8 g), полиетилен гликол (8 g) и 8 ml 0,01 N оцетна киселина се мешаше 10 минути, а потоа 24 ml TMOS беа додадени на неа под ладни услови. Се сушеше на 70°C 12 часа. Исушената мека маса беше мазна мелена во рерна и калцинирана на 550°C 12 часа. Беа подготвени три серии и се карактеризираа за да се испита репродуктивноста во големината на честичките, големината на порите и површината.
Со површинска модификација на честички од силициум диоксид со претходно синтетизиран лиганд фенилмалеимид-метилвинилизоцијанат (PCMP) проследена со радијална полимеризација со стирен, беше подготвено соединение што содржи поларна група.Стационарна фаза за агрегати и полистиренски синџири. Процесот на подготовка е опишан подолу.
N-фенилмалеимид (200 mg) и метил винил изоцијанат (100 mg) беа растворени во сув толуен, а 0,1 ml 2,2'-азоизобутиронитрил (AIBN) беше додаден во реакционата колба за да се подготви фенилмалеимид-метил винил изоцијанат, смесата се филтрира на 6°C изоцијанатот 30 °C и се филтрира на 30 часа. се суши во рерна на 40°C 3 часа.
Исушените силика честички (2 g) беа дисперзирани во сув толуен (100 mL), промешани и звучни во колба со тркалезно дно од 500 mL за 10 мин. PMCP (10 mg) беше растворен во толуен и додадена капка во реакционата колба преку инка за капнување. 60°C за 3 часа. Потоа, PMCP-врзаните силика честички (100 g) се растворени во толуен (200 ml) и се додава 4-хидрокси-TEMPO (2 mL) во присуство на 100 μL дибутил-калај дилаурат како катализатор. .
Стирен (1 mL), бензоил пероксид BPO (0,5 mL) и TEMPO-PMCP-прикачени силика честички (1,5 g) беа дисперзирани во толуен и прочистени со азот. Полимеризацијата на стирен беше спроведена на 100°C за 12 часа. ме е прикажано на слика 1.
Примероците беа дегазирани на 393 К за 1 час за да се добие резидуален притисок помал од 10-3 Torr. Количината на N2 адсорбиран при релативен притисок од P/P0 = 0,99 беше искористена за да се одреди вкупниот волумен на порите. Исушените примероци (голи силициум диоксид и силика честички поврзани со лиганд) беа поставени на алуминиумска колона со помош на леплива јаглеродна лента. На примероците беше обложена злато со помош на распрскувач Q150T, а на примероците беше наталожен слој Au од 5 nm. шунка, МА, САД) Флеш EA1112 елементарен анализатор беше користен за елементарна анализа. За да се добие дистрибуцијата на големината на честичките беше користен Malvern (Worcestershire, UK) Mastersizer 2000 анализатор на големината на честичките. мин, и се става на оптичката клупа на Mastersizer. Термогравиметриската анализа беше изведена со брзина од 5 °C во минута во температурен опсег од 30 до 800 °C.
Стаклени столбови од не'рѓосувачки челик со димензии со тесен отвор (100 × 1,8 mm id) беа спакувани со методот на пакување со кашеста маса, применувајќи ја истата постапка користена во Реф.31. Колона од не'рѓосувачки челик (обложена со стакло, id 100 × 1,8 mm) со излезна фитинг што содржи фрит од 1 µm беше поврзана со пакувач за кашеста маса (Alltech Deerfield, IL, САД). се користи како растворувач за кашеста маса, како и како погонски растворувач. Пополнете ја колоната последователно со примена на притисок од 100 MP за 10 минути, 80 MP за 15 минути и 60 MP за 30 минути. пакувачот и полека ослободете го притисокот за да спречите какво било оштетување во столбот. Исклучете ја колоната од единицата за пакување кашеста маса и поврзете друг фитинг на влезот и во системот за LC за да ги проверите неговите перформанси.
Конструиран е LC пумпа (10AD Shimadzu, Јапонија), инјектор (Valco (САД) C14 W.05) со јамка за вбризгување 50nL, мембрански дегазиран (Shimadzu DGU-14A), UV-VIS капиларен прозорец. По пакувањето, капиларите (50 μm id 365 и редуциските капилари (50 μm) беа инсталирани на излезот од 1/16″ од редукциониот спој. Собирањето податоци и хроматографската обработка беа направени со помош на Multichro 2000. Следењето беше анализирано со софтверот за 254V. inPro8 (Нортемптон, МА).
Албумин од човечки серум, лиофилизиран прав, ≥ 96% (електрофореза со гел агароза) 3 mg измешан со трипсин (1,5 mg), 4,0 M уреа (1 ml) и 0,2 M амониум бикарбонат (1 ml). 0,1% TFA. Филтрирајте го растворот и чувајте го на температура под 4 °C.
Раздвојувањето на пептидните мешавини и дигестот на HSA трипсин беа евалуирани одделно на PMP колоните. Проверете го раздвојувањето на пептидната смеса и трипсин дигестот на HSA со PMP колоната и споредете ги резултатите со колоната Ascentis Express RP-Amide. Теоретскиот број на плочата се пресметува на следниов начин:
SEM слики од голи силика честички и силика честички поврзани со лиганд се прикажани на Сл.2. SEM сликите од голи силика честички (A, B) покажуваат дека, за разлика од нашите претходни студии, овие честички се сферични во кои честичките се издолжени или имаат неправилна симетрија. Површината на силициумските честички поврзани со лиганд (C, D) е помазна од онаа на голите силициуми, кои може да се должат на полисиличните честички. честички.
Сликите на електронски микроскоп за скенирање на голи силика честички (A, B) и силика честички поврзани со лиганд (C, D).
Распределбата на големината на честичките на голите силика честички и силициумските честички поврзани со лиганд се прикажани на Слика 3(А). Кривите на дистрибуција на големината на честичките засновани на волумен покажаа дека големината на честичките силика се зголемила по хемиската модификација (сл. 3А). (0,5), од PMP е 3,36 μm, во споредба со нашата претходна студија со ad(0,5) вредност од 3,05 μm (полистирен врзани силика честички) 34. Оваа серија имаше потесна дистрибуција на големината на честичките во споредба со нашата претходна студија поради различните соодноси на PEG, уреа, TMР честичка со малку поголема големина на реакцијата од TMOS. Фаза на не-врзани силика честички што претходно ја проучувавме. Ова значи дека површинската функционализација на силика честички со стирен депонирала само полистиренски слој (0,97 µm) на површината на силика, додека во фазата PMP дебелината на слојот била 1,38 µm.
Распределба на големината на честичките (А) и дистрибуција на големината на порите (Б) на голи силика честички и силика честички врзани со лиганд.
Големината на порите, волуменот на порите и површината на силициумските честички од тековната студија се дадени во Табела 1 (Б). покажува дека големината на порите се намалува за 69 по хемиската модификација, како што е прикажано во Табела 1(Б), а промената на кривата е прикажана на сл. 3(Б). студија (124 m2/g). Како што е прикажано во Табела 1(B), површината (m2/g) на честичките силика исто така се намалила од 116 m2/g на 105 m2/g по хемиската модификација.
Резултатите од елементарната анализа на стационарната фаза се прикажани во Табела 2. Јаглеродното оптоварување на тековната стационарна фаза е 6,35%, што е помало од јаглеродното оптоварување од нашата претходна студија (полистирен врзани силика честички, 7,93%35 и 10,21%, соодветно) не, користени се некои поларни лиганди како што се фенилмалеимид-метилвинилизоцианат (PCMP) и 4-хидрокси-ТЕМПО. Слично на тоа, јаглеродните оптоварувања на производите (4) и (5) беа 2,7% и 2,9%, соодветно, додека јаглеродното оптоварување на финалниот производ (6) беше 6,35%, како што е прикажано во Табела 2. Губењето на тежината беше проверено со PMP стационарна фаза, а кривата TGA е прикажана на Слика 4. На Слика 4, кривата на TGA е прикажана на Слика 4. Кривата на товарот е добра 6% на товарот. 35%) бидејќи лигандите содржат не само C туку и N, O и H.
Лигандот фенилмалеимид-метилвинилизоцијанат е избран за површинска модификација на честичките силициум диоксид бидејќи има поларни фенилмалеимидни групи и винилизоцијанат групи. Винил изоцијанатните групи можат дополнително да реагираат со стирен со полимеризација на жива радикална полимеризација. Втората причина е да се вметне група која има интеракција со аналитичката и умерена фаза на аналити. , бидејќи делот фенилмалеимид нема виртуелен полнеж при нормална pH вредност. Поларитетот на стационарната фаза може да се контролира со оптималната количина на стирен и времето на реакција на полимеризација на слободните радикали. Последниот чекор од реакцијата (полимеризација со слободни радикали) е критичен и може да го промени поларитетот на стационарната фаза. ne и времето на реакција го зголемија јаглеродното оптоварување на стационарната фаза и обратно. СП подготвени со различни концентрации на стирен имаат различни јаглеродни оптоварувања. Повторно, вчитајте ги овие стационарни фази во столбови од нерѓосувачки челик и проверете ги нивните хроматографски перформанси (селективност, резолуција, N вредност, итн.).
Пет пептидни мешавини (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, леуцин енкефалин) исто така беа евалуирани со користење на PMP колона користејќи мобилна фаза;60/40 (v/v) ацетонитрил/вода (0,1% TFA) со брзина на проток од 80 μL/min. Под оптимални услови за елуирање, теоретскиот број на плочата (N) по колона (100 × 1,8 mm id) е 20.000 ± 100 (200,00 T на колоните, а 200,000 колони може да ги даваат вредностите на N/3M²). хроматограмите се прикажани на слика 5А. Брза анализа на колона PMP со висока брзина на проток (700 μL/min), пет пептиди беа елуирани во рок од една минута, вредностите на N беа многу добри, 13.500 ± 330 по колона (100 × 1.8 mm id), што одговара на 000h повторно со големина на колона 135. (100 × 1,8 mm id) беа спакувани со три различни множества на стационарна фаза на PMP за да се провери репродуктивноста. Концентрацијата на аналитот за секоја колона беше забележана со користење на оптимални услови за елуирање и бројот на теоретски плочи N и време на задржување за да се одвои истата тест мешавина на секоја колона. Податоците за репродуктивност за PMP столбовите се прикажани во табела за многу ниска репродуктивност на колоната %R. во Табела 3.
Одвојување на пептидната смеса на PMP колона (B) и Ascentis Express RP-Amide колона (A);мобилна фаза 60/40 ACN/H2O (TFA 0,1%), димензии на колоната PMP (100 × 1,8 mm id);аналитички Редоследот на елуирање на соединенијата: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) и 5 ​​(леуцин) киселина енкефалин)).
Колона PMP (100 × 1,8 mm id) беше евалуирана за раздвојување на триптични дигестии на хуман серумски албумин во течна хроматографија со високи перформанси. Хроматограмот на Слика 6 покажува дека примерокот е добро одвоен и резолуцијата е многу добра. Дигестиите на HSA беа анализирани со користење на брзина на проток од 100 µ1 мл. .
Триптичен дигест на HSA (100 × 1,8 mm id) беше одвоен на колона PMP;брзина на проток (100 µL/min), мобилна фаза 60/40 ацетонитрил/вода со 0,1% TFA.
каде што L е должината на колоната, η е вискозноста на мобилната фаза, ΔP е задниот притисок на колоната, а u е линеарната брзина на мобилната фаза. Пропустливоста на колоната PMP беше 2,5 × 10-14 m2, брзината на проток беше 25 μL/min, а 60/40 v/v ACN × искористена е способноста на колоната 1 mm/me. беше слична на онаа од нашата претходна студија Ref.34. Пропустливоста на колоната преполна со површно порозни честички е: 1,7 × 10-15 за 1,3 μm честички, 3,1 × 10-15 за 1,7 μm честички, 5,2 μm × 10-15×15 честички, 5,2 × 10-15 × 2 m честички 43. Затоа, пропустливоста на фазата PMP е слична на онаа на честичките од јадрото-школка од 5 μm.
каде што Wx е тежината на колоната преполна со хлороформ, Wy е тежината на колоната преполна со метанол, а ρ е густината на растворувачот. Густини на метанол (ρ = 0,7866) и хлороформ (ρ = 1,484). Колоните C18-Уреа 31 што претходно ги проучувавме беа 0,63 и 0,55, соодветно. Ова значи дека присуството на лиганди на уреа ја намалува пропустливоста на стационарната фаза. Од друга страна, вкупната порозност на столбот PMP (100 × 1,8 mm id) е 0,60 мм пониска од тој пакет на колона од 1 MP. честички бидејќи во стационарни фази од типот C18 лигандите C18 се прикачени на силициумските честички како линеарни синџири, додека во стационарни фази од типот на полистирен, околу него се формира релативно дебел полимерен слој А. Во типичен експеримент, порозноста на колоната се пресметува како:
Слика 7A,B ја прикажува колоната PMP (100 × 1,8 mm id) и Ascentis Express RP-Amide колоната (100 × 1,8 mm id) со користење на истите услови на елуција (т.е. 60/40 ACN/H2O и 0,1% TFA).) на парцелата van Deemter.Избраните пептидни мешавини (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, леуцин енкефалин) беа подготвени во 20 µL/ Минималната брзина на проток за двете колони е 800 µL/min. Минималната HETP вредности на протокот на колоната е 8 мин. Колоната RP-Amide беше соодветно 2,6 µm и 3,9 µm. Вредностите на HETP покажуваат дека ефикасноста на раздвојување на колоната PMP (100 × 1,8 mm id) е многу подобра од комерцијално достапната колона Ascentis Express RP-Amide (100 × 1,8 мм се намалува со зголемување на дијаграмот на протокот во 7). не е значајна во споредба со нашата претходна студија. Повисоката ефикасност на раздвојување на колоната PMP (100 × 1,8 mm id) во споредба со колоната Ascentis Express RP-Amide се заснова на подобрувања во обликот на честичките, големината и сложените процедури за пакување на колоните што се користат во тековната работа34.
(А) ван Деемтер график (HETP наспроти линеарна брзина на мобилната фаза) добиен со користење на колона PMP (100 × 1,8 mm id) во 60/40 ACN/H2O со 0,1% TFA. ACN/H2O со 0,1% TFA.
Беше подготвена и евалуирана стационарна фаза од полистирен со поларно вградување и евалуирана за раздвојување на синтетички пептидни мешавини и трипсин дигестија на хуман серумски албумин (HAS) во течна хроматографија со високи перформанси. од силициумските честички, контролирана синтеза на стационарната фаза и сложеното пакување на колоните. Покрај високата ефикасност на раздвојување, нискиот повратен притисок на колоната при високи стапки на проток е уште една предност на оваа стационарна фаза. Колоните PMP покажуваат добра репродуктивност и може да се користат за анализа на пептидни мешавини и трипсин дигестија на различни природни соединенија за сепарати на колона. растенија и габични екстракти во течна хроматографија. Во иднина, колоните на PMP, исто така, ќе се оценуваат за одвојување на протеините и моноклоналните антитела.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Истражување на системи за сепарација на пептиди со хроматографија со обратна фаза Дел I: Развој на протокол за карактеризирање на колони.J.Хроматографија.1603, 113–129.https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038 (2019).
Gomez, B. et al.Подобрени активни пептиди дизајнирани за третман на заразни болести.Biotechnology.Advanced.36(2), 415-429.https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khreschatisky, M. Synthetic therapeutic peptides: Science and the market.drug discovery.15 (1-2) денес, 40-56.https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.2009).
Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Напредна протеомска течна хроматографија.Chromatography.A 1261, 78-90 (2012).
Liu, W. и сор.
Chesnut, SM & Salisbury, JJ Улогата на UHPLC во развојот на лекови.J.Сеп. Sci.30 (8), 1183-1190 (2007).
Wu, N. & Clausen, AM Основни и практични аспекти на течна хроматографија со ултрависок притисок за брзи сепарации.Сеп. Sci.30 (8), 1167-1182.https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA & Tchelitcheff, P. Примена на течна хроматографија со ултра високи перформанси во развојот на лекови.J.Хроматографија.1119(1-2), 140-146.https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. et al.Монолитни макропорозни хидрогели подготвени од емулзии со висока внатрешна фаза масло во вода за ефикасно прочистување на ентеровируси.Хемиски.Британија.Ј.401, 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA Улогата на течната хроматографија во протеомијата.Chromatography.A 1053 (1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Veuthey, J.-L.& Guillarme, D. Нови трендови во раздвојувања на течна хроматографија со обратна фаза на терапевтски пептиди и протеини: теорија и апликации.Pharmacy.Biomedical Science.anus.69, 9-27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC Дводимензионално раздвојување на пептиди со помош на RP-RP-HPLC систем со користење на различни pH вредности во првата и втората димензија на сепарација.Сеп. Sci.28 (14), 1694-1703 (2005).
Feletti, S. et al. Беа испитани карактеристиките на пренос на маса и кинетичките перформанси на високоефикасните хроматографски столбови преполни со C18 под-2 μm целосно и површно порозни честички.Сеп. Sci.43 (9-10), 1737-1745 (2020).
Piovesana, S. et al. Неодамнешни трендови и аналитички предизвици во изолацијата, идентификацијата и валидацијата на растителните биоактивни пептиди.anus.biological anus.Chemical.410(15), 3425-3444.https://doi.org/10.1007/s018x108.
Мулер, Џ.
DeLuca, C. et al. Downstream processing на терапевтски пептиди со препаративна течна хроматографија. Molecule (Базел, Швајцарија) 26 (15), 4688 (2021).
Yang, Y. & Geng, X. Хроматографија со мешан режим и нејзината примена на биополимери.Chromatography.A 1218 (49), 8813-8825 (2011).
Zhao, G., Dong, X.-Y.& Sun, Y. Лиганди за протеинска хроматографија со мешан режим: принцип, карактеризација и дизајн.Биотехнологија.144 (1), 3-11 (2009).