Ви благодариме што ја посетивте Nature.com.Верзијата на прелистувачот што ја користите има ограничена поддршка за CSS.За најдобро искуство, препорачуваме да користите ажуриран прелистувач (или да го оневозможите режимот на компатибилност во Internet Explorer).Во меѓувреме, за да обезбедиме континуирана поддршка, ќе ја направиме страницата без стилови и JavaScript.
Angustifolius лупин (NLL, Lupinus angustifolius L.) е мешункаст растение кое се користи за производство на храна и подобрување на почвата.Глобалната експанзија на НЛЛ како култура привлече многу патогени габи, вклучувајќи ја и лупинската антракоза, која предизвикува разорна болест на антракоза.Два алели, Lanr1 и AnMan, кои даваат зголемена отпорност, се користени во размножувањето на NLL, но основните молекуларни механизми остануваат непознати.Во оваа студија, маркерите Lanr1 и AnMan беа користени за проверка на европските NLL примероци.Тестирањето на вакцината во контролирана средина ја потврди ефикасноста на двата резистентни донори.Профилирањето на диференцијалната генска експресија беше изведено на репрезентативни резистентни и осетливи линии.Отпорноста на антракоза беше поврзана со прекумерна експресија на термините на генетската онтологија „GO:0006952 Одбранбен одговор“, „GO:0055114 Редокс процес“ и „GO:0015979 фотосинтеза“.Дополнително, линијата Lanr1(83A:476) покажа значајно репрограмирање на транскриптом брзо по инокулацијата, додека другите линии покажаа задоцнување во овој одговор за околу 42 часа.Одбранбените одговори се поврзани со гените TIR-NBS, CC-NBS-LRR и NBS-LRR, 10 протеини вклучени во патогенезата, протеини за трансфер на липиди, ендоглукан-1,3-β-глукозидаза, протеини богати со глицин на клеточниот ѕид и гени од реактивната патека на кислородот.Раните одговори на 83A:476, вклучително и внимателно сузбивање на гените поврзани со фотосинтезата, се совпаднаа со успешната заштита за време на фазата на вегетативен раст на габичната биологија, што сугерира дека ефекторот го активира имунитетот.Реакцијата на Mandeloop е забавена, како и целокупното хоризонтално влечење.
Теснолистниот лупин (NLL, Lupinus angustifolius L.) е високопротеинска житарка со потекло од западниот медитерански регион1,2.Во моментов се одгледува како прехранбена култура за животни и луѓе.Исто така, се смета за зелено ѓубриво во системите за плодоред поради фиксација на азот со симбиотски бактерии кои фиксираат азот и севкупно подобрување на структурата на почвата.НЛЛ претрпе брз процес на припитомување во минатиот век и сè уште е под висок притисок за размножување3,4,5,6,7,8,9,10,11,12.Со широко распространето одгледување на НЛЛ, сукцесијата на патогени габи развиле нови земјоделски ниши и предизвикале нови болести кои ги уништуваат посевите. Највпечатливо за фармерите и одгледувачите на лупин беше појавата на антракоза, предизвикана од патогената габа Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Највпечатливо за фармерите и одгледувачите на лупин беше појавата на антракоза, предизвикана од патогената габа Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Наиболее примечательным для фермеров и селекционеров люпина было появление антракноза, вызванного патогенным грибком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Најзабележително за фармерите и одгледувачите на лупин беше појавата на антракоза предизвикана од патогената габа Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是猎умиторих , Feiler & Hagedorn13 引起的.对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是猎umletorich) Коса. 1 Наиболее поразительным для фермеров и селекционеров люпина является появление антракноза, вызываемого патогенным грибком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Најраните извештаи за болеста дојдоа од Бразил и САД, со типични симптоми кои се појавија во 1912 и 1929 година соодветно.Меѓутоа, по околу 30 години, патогенот бил означен како Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc., телеоморф Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., телеоморф Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., телеоморф Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., телеоморф на Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld в Целенаправленной морфологии. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld во насочена морфологија. & Х. Шренк,. & Х. Шренк,.и H. Schrenk. & H.施伦克，. & H.施伦克，.и Х. Шленк,.Прелиминарниот фенотип на болеста направен во средината на 20 век покажа одредена отпорност кај НЛЛ и жолтиот лупин (L. luteus L.), но сите тестирани акцесии со бел лупин (L. albus L.) беа високо чувствителни15,16.Истражувањата покажаа дека развојот на антракоза е поврзан со зголемени врнежи (влажност на воздухот) и температура (во опсег од 12-28°C), што доведува до нарушување на отпорот при повисоки температури17, 18. Всушност, времето потребно за ртење на конидиите и за започнување на болеста беше четири пати пократко на 24°C (10°C (1 часа) високи услови за влажност (1 час.)Така, тековното глобално затоплување доведе до ширење на антракоза.Сепак, болеста беше забележана во Франција (1982) и Украина (1983) како предвесник на претстојната закана, но очигледно беше игнорирана од индустријата за лупин во тоа време20,21.Неколку години подоцна, оваа разорна болест се прошири низ целиот свет, а исто така ги зафати и големите земји кои произведуваат лупин како што се Австралија, Полска и Германија22,23,24.По појавата на антракоза во средината на 1990-тите, обемниот скрининг резултираше со идентификација на неколку резистентни донатори во примероците NLL19.Отпорноста на NLL на антракноза е контролирана од два посебни доминантни алели кои се наоѓаат во различни извори на герминација: Lanr1 во сортата Tanjil и Wonga и AnMan во сортата.Mandalay 25, 26. Овие алели ги надополнуваат молекуларните маркери кои го поддржуваат изборот на резистентна герминативна плазма во програмите за размножување25,26,27,28,29,30.Отпорната линија за размножување 83A:476 што го носи алелот Lanr1 беше вкрстена со осетливата дива линија P27255 за да се добие RIL популација која се сегрегира за отпорност на антракоза, што овозможи да се додели локусот Lanr1 на хромозомот NLL-1131, 32, означувајќи алтернативна ознака за означување на3, геномска рамка, NLL ја откри локацијата на сите три алели на истиот хромозом (NLL-11), но на различни позиции29,34,35.Сепак, поради малиот број на RIL и големото генетско растојание помеѓу маркерите и соодветните алели, не може да се извлечат сигурни заклучоци за нивните основни гени.Од друга страна, употребата на обратна генетика кај лупините е отежната поради нивниот многу низок потенцијал за регенерација, што ја прави генетската манипулација незгодна37.
Развојот на припитомени гермиплазма која го носи посакуваниот алел во хомозиготна состојба, како што се 83A:476 (Lanr1) и Mandelup (AnMan), ја отвори вратата за проучување на отпорноста на антракоза со оглед на присуството на спротивставени комбинации на алели кај дивите популации.Можности на молекуларни механизми.Споредете ги одбранбените одговори генерирани од специфични генотипови.Оваа студија го евалуираше раниот одговор на транскриптом на NLL на вакцинацијата со C. lupini.Прво, европски NLL гермплазма панел кој содржи 215 линии беше скриниран со помош на молекуларни маркери кои ги означуваат алелите Lanr1 и AnMan.Потоа беше изведена фенотипизација на антракоза на 50 NLL линии, претходно избрани за молекуларни маркери, под контролирани услови.Врз основа на овие експерименти, четири линии кои се разликуваат во отпорноста на антракоза и алелниот состав на Lanr1/AnMan беа избрани за профилирање на диференцијална одбранбена генска експресија со користење на два комплементарни пристапи: секвенционирање на РНК со висок пропуст и квантификација на PCR во реално време.
Скринингот на множество NLL гермплазма (N = 215) со маркери Lanr1 (Anseq3 и Anseq4) и AnMan (Anseq4) и AnMan (AnManM1) покажа дека само една линија (95726, во близина на Саламанка-b) ја засилува „отпорот“ на сите пронајдени ознаки, додека „отпорот“ на сите ознаки за сите во 158 (~73,5%) линии.Тринаесет линии произведоа два „отпорни“ алели на маркерот Lanr1, а 8 линии произведоа „отпорни“ алели на Lanr1.маркер.Алелот „отпорност“ на маркерот AnMan (Дополнителна табела S1).Две линии беа хетерозиготни за маркерот Anseq3 и една хетерозиготна за маркерот AnManM1.42 линии (19,5%) носеа спротивни фази од алелите Anseq3 и Anseq4, што укажува на висока фреквенција на рекомбинација помеѓу овие два локуси.Разликите во просечните резултати се движеа од 1,8 (умерено отпорни) до 6,9 (чувствителни) и разликите во тежината на растенијата се движеа од 0,62 (чувствителни) до 4,45 g (отпорни). Имаше значајна корелација помеѓу вредностите забележани во две повторувања на експериментот (0,51 за оценките за сериозноста на болеста, P = 0,00017 и 0,61 за тежината на растението, P <0,0001) како и помеѓу овие два параметри (- 0,59 и - 0,77, P <0,000). Имаше значајна корелација помеѓу вредностите забележани во две повторувања на експериментот (0,51 за оценките за сериозноста на болеста, P = 0,00017 и 0,61 за тежината на растението, P <0,0001) како и помеѓу овие два параметри (- 0,59 и - 0,77, P <10,0). Выявлена ​​достоверная корреляция между значениями, наблюдаемыми во двух повторностях эксперимента (0,51 для баллов тяжести болезни, P = 0,00017 и 0,61 для для масси, 0,51 для баллов тяжести болезни, P = 0,00017 и 0,61 для мл. умя параметри (-0,59 и -0,77, Р < 0,0001) 0,0001). Беше пронајдена значајна корелација помеѓу вредностите забележани во две повторувања на експериментот (0,51 за оценките за сериозноста на болеста, P = 0,00017 и 0,61 за тежината на растението, P <0,0001), како и помеѓу овие два параметри (- 0,59 и -0,77, P <110,0).在两次重复实验中观察到的值之间存在显着相关性（疾病严重程度评P.10，0P.10，0分0.物重量为0,61，P <0,0001）以及这两个参数之间（- 0,59 和- 0,77，P <0,0001)。在 两 次 重复 实验 中 观察 的 值 之间 存在 相关性 （疾病 严重 程庈 0. 1 ， p = 0,00017 ， 植物 为 为 0,61 ， p <0,0001） 以及 两 个 参数 之间 （（（（0（0（及和 - 0,59 和 - 0,77, P < 0,0001). Наблюдалась значительная корреляция между значениями, наблюдаемыми во двух повторностях (оценка тяжести заболевания 0,51, P = 0,00017 и масса растения 0,61, P <0,0000 - 0,00000000000000001), 001) 0,77, P <0,0001. Имаше значајна корелација помеѓу вредностите забележани во дупликат (оценка за сериозноста на болеста 0,51, P = 0,00017 и тежина на растението 0,61, P < 0,0001) и помеѓу овие два параметри (-0,59 и -0,0001) 0,77, P1,0,00, ).Типични симптоми забележани кај осетливи растенија вклучуваат свиткување и извртување на стеблото што личи на структура на „пастирски лак“, проследено со овални лезии со портокалови/розови спорозоити (Дополнителна слика 1).Австралиските пристапи кои ги носат гените LANR1 (83A: 476 и Tanjil) и Anman (Mandelup) се умерено отпорни, 0.0331 и 0.0036).Некои линии кои исто така носат „отпорни“ lanr1 и/или аман алели покажуваат симптоми на болеста.
Интересно е тоа што неколку NLL линии на кои им недостигаше каков било „отпорен“ маркерски алел открија високо ниво на отпорност на антракоза (споредливо или повисоко отколку за генотиповите Lanr1 или AnMan), како што се Boregine (P вредност < 0,0001 за двата параметри), Bojar (P вредност < 0,0001 тежина < 0,0001 и вредност B01 за популација <0-5 вредност) .0001 за бод и незначителен за тежина). Интересно е тоа што неколку NLL линии на кои им недостигаше каков било „отпорен“ маркерски алел открија високо ниво на отпорност на антракоза (споредливо или повисоко отколку за генотиповите Lanr1 или AnMan), како што се Boregine (P вредност < 0,0001 за двата параметри), Bojar (P вредност < 0,0001 тежина < 0,0001 и вредност B01 за популација <0-5 вредност) .0001 за бод и незначителен за тежина). Интересно, что несколько линий NLL, лишенных какого-либо «резистентного» маркерного алеля, показали высокий уровень устойчивости к антракнозу (сопоставимый или более высокий, чем дльлем для, чем для 100000000), P <0,0001 за обоих параметров), Бојар (значение P < 0,0001 за оценки и 0,001 за массы растения) и популација B-549/79b (значение P <0,0001 для оценки незначително). Интересно е тоа што неколку NLL линии на кои им недостигаше каков било „отпорен“ маркерски алел покажаа високо ниво на отпорност на антракноза (споредливо или повисоко отколку за генотиповите Lanr1 или AnMan), како што се Борегин (P вредност < 0,0001 за двата параметри ), Бојар (П вредност < 0,0001 тежина < 0,0001) и Вредност на Р 0.0001 <09 за популација и . 0,0001 за евалуација и незначително за тежина). Интересно е што некои NLL системи кои немаат никакви „антигенски“ маркери покажуваат висока хоризонтална отпорност (еквивалент на гените Lanr1 или AnMan или повисоко), како што се Boregine (двата параметри P < 0,0001), Bojar (P вредност < 0,0001, тежина на растението 0,001) и сој <7, не значајна вредност (тежина на растенијата) B-54). Интересно, что некоторые линии NLL, лишенные каких-либо маркерных аллелей «резистентности», показали высокие уровни устойчивости к антракнозу (сравнимые или выше, чем у генотипов Lanr1) ров <0,0001), Бојар (значение P <0,0001, масса растения 0,001) и популяция B-549/79b (оценка P-значение <0,0001, масса незначительна). Интересно е што некои NLL линии на кои им недостигаат алели за маркери за „отпорност“ покажаа високи нивоа на отпорност на антракоза (споредлива или повисока од генотиповите Lanr1 или AnMan), како што се Борегин (P вредност за двата параметри <0,0001), Бојар (P-вредност < 0,0001-вредност популација < 0,0001-001, тежина <0,0001, популација, 9-0, популација, 9, 0, 0, 0,1, популација, 0,00-0, популација, 9-01, популација) .0001, тежината не е значајна).Овој феномен укажува на можноста за нов генетски извор на отпор, објаснувајќи го забележаниот недостаток на корелација помеѓу генотиповите на маркерите и фенотиповите на болеста (P вредности од ~ 0,42 до ~ 0,98).Така, тестот Колмогоров-Смирнов покажа дека податоците за отпорноста на антракоза се приближно нормално распределени за резултати (P-вредности 0,25 и 0,11) и растителна маса (P-вредности 0,47 и 0,55), што сугерира дека претпоставувам дека се вклучени повеќе алели од Lanr1 и AnMan.
Врз основа на резултатите од скринингот на отпорност на антракоза, беа избрани 4 линии за анализа на транскриптом: 83A:476, Boregine, Mandelup и Популација 22660. Овие линии беа повторно тестирани за отпорност на антракс во експериментите со инокулација со секвенционирање на РНК, под услов да се исти како во претходниот тест.Вредностите на резултатот беа како што следува: Борегин (1,71 ± 1,39), 83А: 476 (2,09 ± 1,38), Манделуп (3,82 ± 1,42) и население 22660 (6,11 ± 1,29).
Протоколот Illumina NovASEQ 6000 постигна просек од 40,5 парови на мочари по примерок (29,7 до 54,4 мрежи) (Дополнителна табела S3).Резултатите за усогласување во референтната секвенца се движеа од 75,5% до 88,6%.Просечната корелација на податоците за броењето на читањето помеѓу експерименталните варијанти помеѓу биолошките репликати се движеше од 0,812 до 0,997 (просечно 0,959). Од анализираните 35.170 гени, 2917 не откриле никаков израз, а другите 4785 гени беа изразени на занемарливо ниво (основно ниво <5). Од анализираните 35.170 гени, 2917 не откриле никаков израз, а другите 4785 гени беа изразени на занемарливо ниво (основно ниво <5). Из 35 170 проанализирани генови 2917 не се пројавляли експрессии, а остальные 4785 генови експресировались на незначителен уровне (базовое среднее <5). Од 35.170 анализирани гени, 2917 не покажале изразување, а останатите 4785 гени биле изразени на занемарливо ниво (основна средна вредност <5).在 分析 的 35,170 个 基因 中 ， 2917 个 没有 表达 ， 其他 4785 个 基因 的 可以 忽略不计 （（平均值 平均值 <5）。35.170 Из 35 170 проанализированных генови 2917 не експресировались, а ональные 4785 генови имели незначительную экспрессию (базовое среднее значење <5). Од анализираните 35.170 гени, 2917 не беа изразени, а останатите 4785 гени имаа занемарлив израз (основно средно <5).Така, бројот на гените што се сметаат за изразени (основно средно ≥ 5) за време на експериментот беше 27.468 (78,1%) (Дополнителна табела S4).
Од првата временска точка, сите NLL линии реагираа на инокулацијата на C. lupini (сој Col-08) со репрограмирање на транскриптомот (Табела 1), меѓутоа, беа забележани значајни разлики помеѓу линиите.Така, линијата на отпор 83A:476 (го носи генот Lanr1) покажа значајно репрограмирање на транскриптом во првата временска точка (6 hpi) со 31-69 пати зголемување на бројот на изолирани гени нагоре и надолу во споредба со другите временски точки во овој временски момент.Покрај тоа, овој врв беше краткотраен, бидејќи изразот на само неколку гени остана значително изменет во втората временска точка (12 hpi).Интересно е тоа што Бореџин, кој исто така покажал високо ниво на отпор при тестот за графт, не бил подложен на такво масивно препрограмирање на транскрипција за време на експериментот.Сепак, бројот на различно изразени гени (ДЕГ) беше ист за Борегин и 83А: 476 на 12 кг.И Манделуп и населението 22660 покажаа врвови на ДЕГ во последен пат (48 L/s), што укажува на релативно одложување на одговорите на одбраната.
Сепак, имаше одредено преклопување во раните одговори помеѓу линиите на студијата, бидејќи 68,5%, 50,9% и 52,6% DEG во Бореџин, Манделуп и популацијата 22660, соодветно, се преклопија со оние пронајдени во 83A:476 во одредени временски периоди.Сепак, овие DEG сочинуваа само мал дел (0,97-1,70%) од сите DEGs моментално откриени со користење на 83A:476.Дополнително, 11 DEG од сите линии беа кохерентни во тоа време (Дополнителни табели S4-S6), вклучително и вообичаени компоненти на одбранбените одговори на растенијата: протеин за трансфер на липиди (TanjilG_32225), ензим на ендоглукан-1,3-β-глукозид (TanjilG_23384), два протеин како стрес-15_AM28 31531), основен латекс протеин (TanjilG_32352) и два структурни клеточни ѕидови богати со глицин протеини (TanjilG_19701 и TanjilG_19702).Исто така, имаше релативно високо преклопување во одговорите на транскриптомите помеѓу 83A:476 и Борегин на 24 HPI (вкупно 16-38% DEG) и помеѓу Mandelup и населението 22660 на 48 HPI (вкупно 14-20% DEG).
Венов дијаграм кој го покажува бројот на диференцијално изразени гени (DEG) во теснолистните линии на лупин (NLL) инокулирани со Colletotrichum lupini (сој Col-08 добиен од полињата со лупин во Вирженице, Полска, 1999 година).Кратенката hpi стои со часови по вакцинацијата.Нулта вредности се отстранети за да се поедностави графикот.
Збирот на преекспресирани гени на 6 hpi беше анализиран за присуство на канонски R генски домени (Дополнителна табела S7).Оваа студија откри транскриптомска индукција на класични гени отпорни на болести со домени NBS-LRR само на 83A:476.Сите овие гени имаат канонски домени распоредени во зачувани секвенци.
Гените со значително изменета експресија како одговор на инокулацијата со C. lupini (сој Col-08) беа подложени на анализа на збогатување на генската онтологија (GO) (Дополнителна табела S8). Најчесто презастапуваниот термин за биолошки процес беше „GO: 0006952 одбранбен одговор“ кој се појави во 6 од 16 (време × линија) комбинации со големо значење (P вредност < 0,001) (сл. 2). Најчесто презастапуваниот термин за биолошки процес беше „GO: 0006952 одбранбен одговор“ кој се појави во 6 од 16 (време × линија) комбинации со големо значење (P вредност < 0,001) (сл. 2). 最 常 被 过度 代表 生物 过程 过程 术语 是 是 ‘go: 0006952 防御 反应” ， 它 出现 16 个 （时间 × 线） 组合 中 的 6 个 中 具有 高 显着性 （（p 值 <0.001） （图 2）。 Овој термин беше премногу застапен во две временски точки во 83А: 476 и Бореџин (6 и 24 КС) и во еден временски период во Манделуп и Популација 22660 (12 и 6 КС, соодветно).Ова е очекуван резултат, нагласувајќи го антифунгалниот одговор на отпорните линии.Дополнително, 83A:476 одговори на C. lupini со брзо индуцирање на гени поврзани со оксидативниот излив претставен со терминот „GO:0055114 редокс процес“, што укажува на специфичен одбранбен одговор, додека Бореџин откри специфични одбранбени одговори, поврзани со терминот „GO“.:0006950 Одговор на стрес“.Популацијата 22660 го активираше одговорот на хоризонтална отпорност кој вклучува секундарни метаболити, истакнувајќи го прекумерниот број на термини „GO:0016104 Процес на биосинтеза на тритерпен“ и „GO:0006722 Процес на метаболизам на тритерпен“ (двата поими припаѓаат на истиот сет на гени, земајќи ги предвид резултатите од анализата на регулацијата на популацијата и РЕГОМОТ РЕГУПРЕНУВАЊЕ на резултатите од Man. 22660. Покрај тоа, раната реакција 83A:476 (6 hpi) и одложената реакција Mandelup and Population 22660 го вклучуваат терминот GO:0015979 „фотосинтеза“ и други поврзани биолошки процеси.
Анализираните NLL линии беа: 83A:476 (отпорни, носители на хомозиготниот алел Lanr1), Борегин (отпорен, непозната генетска позадина), Mandelup (умерено отпорен, носител на хомозиготниот алел AnMan) и популација 22660 (чувствителна).
× точка во времето комбинирајќи статистички значајни вредности на log2 (промена на пати).Бројот на гени што ги исполнуваат овие критериуми беше 65 за GO:0006952 и 524 за GO:0055114.
83A:476 откри два DEG врвови означени со терминот GO:0006952, првиот со 6 гени на инч (64 гени, регулација нагоре и надолу) и вториот со 24 гени на инч (15 гени, само до регулација).Бореџин, исто така, покажа дека GO:0006952 достигна врв во истата временска точка, но со помалку степени (11 и 8) и преференцијално активирање.Mandeloop покажа два врва на GO:0006952 на 12 и 48 HPI, и двата носеа 12 гени (првиот со активирачки гени, а вториот со само супресивни гени), додека популацијата од 22660 со 6 HPI (13 гени) имаше поголема доминација на врвот на зголемувањето.регулатива.Треба да се забележи дека 96,4% од GO:0006952 DEG во овие врвови имале ист тип на одговор (нагоре или надолу), што укажува на значително преклопување во одбранбените одговори и покрај разликите во бројот на вклучени гени.Најголемата група секвенци поврзани со терминот GO:0006952 го шифрира протеинот 22 на пораката поврзана со гладниот стрес (како SAM22), кој припаѓа на протеинскиот клад од класата 10 поврзан со патогенезата (PR-10) и основниот протеин латекс.сличен (како MLP) протеин) протеин (сл. 3).Двете групи се разликуваа по природата на изразувањето и насоката на одговорот.Гените што ги кодираат протеините слични на SAM22 покажаа конзистентна и значајна индукција во раните временски точки (6 или 12 hpi) и генерално не реагираа на крајот на експериментот (48 hpi), додека протеините слични на MLP покажаа координација на 6 hpi.hpi.83A:476 и Mandelup со 48 КС/ин, речиси сите други точки на податоци не реагираа.Дополнително, разликите во профилите на изразување на протеинските гени слични на SAM22 ја следеа забележаната варијабилност во отпорноста на антракоза, бидејќи поотпорните линии имаа повеќе временски точки кои значително ги поттикнуваат овие гени отколку повеќе подложни гени.Друг PR-10 ген сличен на LlR18A/B покажа многу сличен модел на изразување со протеинскиот ген сличен на SAM22.

Дополнително, беа евалуирани профилите на изразување на кандидатските гени на RNA-seq Lanr1 (TanjilG_05042) и AnMan (TanjilG_12861) (сл. 3).Генот TanjilG_05042 покажа значителен одговор (активирање) на 83A:476 само во првата временска точка (6 hpi), додека TanjilG_12861 беше значаен во Mandeloop само во две временски точки: 6 hpi (намалена регулација) и 24 hpi (6 hpi).Со.).прилагодлив)).
Најпреизразените гени во терминот GO:0055114 „процес на редокс“ беа гени кои ги кодираат протеините и пероксидазата на цитохром P450 (сл. 4).За примероците изолирани од 83A:476 на 6 HPI, максималните или минималните вредности на log2 (промена на пати) (за 86,6% од гените) генерално беа забележани помеѓу инокулираните и контролните растенија, што ја истакнува високата реакција на овој генотип на инокулирачкиот пол.83A:476 го покажа најзначајниот GO: 0055114 DEG на 6 hpi (503 гени), додека остатокот од линиите на 48 hpi (Boregine, 31 ген; Mandelup, 85 гени; и Популација 22660, 78 гени)).Во повеќето гени од семејството GO:0055114, забележани се два типа на одговори на вакцинација (активирање и инхибиција).Интересно е тоа што до 97,6% од DEGs идентификувани за терминот GO: 0055114 во Mandelupe со 48 КС Овие набљудувања сугерираат дека, и покрај значително помалиот размер (т.е., бројот на мутирани редокс гени, 85 наспроти 503), моделот на задоцнет одговор на транскриптом на 48 е сличен. 76.Во Борегине и населението 22660, оваа конвергенција е помала од 51,6% и 75,6%, соодветно.
Откриени се шемите на изразување на главните компоненти на терминот на биолошкиот процес „GO:0055114 Редокс процес“.Скалата Log2 ги претставува вредностите на log2 (промена на пати) помеѓу инокулирани (Colletotrichum lupini, сој Col-08, добиени од полиња со лупин, Виженица, Полска, 1999 година) и контролни (инокулирани со лажно) растенија во исто време.Следниве теснолисни лупински линии беа анализирани: 83A:476 (отпорен, носител на хомозиготниот алел Lanr1), Бореџин (отпорен, непозната генетска позадина), Mandelup (умерено отпорен, носител на хомозиготниот алел AnMan) и Популација 22660 (чувствителна).
83A:476 Транскриптомските одговори на инокулацијата со C. lupini (сој Col-08), исто така, вклучуваа координирано замолчување на гените припишани на терминот GO:0015979 „фотосинтеза“ и други сродни биолошки процеси (СЛИКА 5).Овој комплет GO:0015979 DEG содржеше 105 гени кои беа значително потиснати на 6 КС на 83А:476.Во оваа подгрупа, 37 гени беа исто така намалени во Mandelup на 48 HPI и 35 во исто време во 22660 популација, вклучувајќи 19 DEG заеднички за двата генотипа.Ниту една DEG поврзана со терминот GO: 0015979 не беа значително активирани во која било комбинација (линија x време).
Откриени се моделите на изразување на главните компоненти на терминот на биолошкиот процес „GO:0015979 Photosynthesis“.Скалата Log2 ги претставува вредностите на log2 (промена на пати) помеѓу инокулирани (Colletotrichum lupini, сој Col-08, добиени од полиња со лупин, Виженица, Полска, 1999 година) и контролни (инокулирани со лажно) растенија во исто време.Следниве теснолисни лупински линии беа анализирани: 83A:476 (отпорен, носител на хомозиготниот алел Lanr1), Бореџин (отпорен, непозната генетска позадина), Mandelup (умерено отпорен, носител на хомозиготниот алел AnMan) и Популација 22660 (чувствителна).
Врз основа на резултатите од анализата на диференцијалната експресија и веројатно вклучена во одбранбените одговори против патогени габи, овој сет од седум гени беше избран за квантификација на профилите на изразување со PCR во реално време (Дополнителна табела S9).
Наводниот протеински ген TanjilG_10657 беше значително индуциран во сите проучувани линии и временски точки во споредба со контролните (мимични) растенија (Дополнителни табели S10, S11).Дополнително, изразниот профил на TanjilG_10657 покажа растечки тренд во текот на експериментот за сите линии.Популацијата 22660 покажа најголема чувствителност на TanjilG_10657 на инокулација со 114-кратно активирање и највисоко ниво на релативно изразување (4,4 ± 0,4) на 24 HPI (сл. 6а).Протеинскиот ген PR10 LlR18A TanjilG_27015, исто така, покажа активирање низ сите линии и временски точки, со статистичка значајност во повеќето точки на податоци (сл. 6б).Слично на TanjilG_10657, највисокото ниво на релативна експресија на TanjilG_27015 беше забележано кај 22660 инокулирана популација на 24 HPI (19,5 ± 2,4).Генот на киселинската ендохитиназа TanjilG_04706 беше значително регулиран во сите линии и во сите временски точки, освен за Boregine 6 hpi (сл. 6c).Тој беше силно индуциран во првата временска точка (6 HPI) на 83A:476 (за 10,5 пати) и умерено зголемен во другите линии (за 6,6-7,5 пати).За време на експериментот, изразот на TanjilG_04706 остана на слични нивоа во 83A:476 и Boregine, додека кај Mandelup и Population 22660 значително се зголеми, достигнувајќи релативно високи вредности (5,9 ± 1,5 и 6,2 ± 1,5, соодветно).Генот сличен на ендоглукан-1,3-β-глукозидаза TanjilG_23384 покажа висока активација во првите две временски точки (6 и 12 hpi) во сите линии освен популацијата 22660 (сл. 6г).Највисоките релативни нивоа на изразување на TanjilG_23384 беа забележани во втората временска точка (12 hpi) во Mandelup (2,7 ± 0,3) и 83A:476 (1,5 ± 0,1).На 24 HPI, изразот на TanjilG_23384 беше релативно низок во сите проучувани линии (од 0,04 ± 0,009 до 0,44 ± 0,12).
Профили на изразување на избраните гени (ag) откриени со квантитативна PCR.Броевите 6, 12 и 24 претставуваат часови по вакцинацијата.Гените LanDExH7 и LanTUB6 беа користени за нормализација, а LanTUB6 за калибрација меѓу сериите.Лентите за грешки го претставуваат стандардното отстапување врз основа на три биолошки реплики, од кои секоја е просек од три технички реплики. Статистичката значајност на разликите во нивоата на изразување помеѓу инокулираните (Colletotrichum lupini, сој Col-08, добиена во 1999 година од полето со лупин во Вирзеница, Полска) и контролните (проблематични) растенија се означени над точките на податоци (*P вредност < 0,05, **P вредност *** 0 . Статистичката значајност на разликите во нивоата на изразување помеѓу инокулираните (Colletotrichum lupini, сој Col-08, добиена во 1999 година од полето со лупин во Вирзеница, Полска) и контролните (проблематични) растенија се означени над точките на податоци (*P вредност < 0,05, **P вредност *** 0 . Статистическая значитемость различий во уровнях експрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, штамм Col-08, получен во 1999 г. х (*значение P < 0,05, **значение P ≤ 0,01, ***значение P ≤ 0,001). Статистички значајни разлики во нивоата на изразување помеѓу инокулираните (Colletotrichum lupini, сој Col-08, добиен во 1999 година од полето со лупин во Вирженице, Полска) и контролните (искокулирани со лажно) растенија се забележани над точките на податоци (*P вредност < 0,05, **P-вредност ≤1-0,00).接种（Colletotrichum lupini，Col-08株，1999年从波兰Wierzenica的羽扇豆田获得）和对照（模觾漢羽扇豆田获得）和对照（模觋水平差异的统计学显着性标记在数据点上方（*P值< 0,05, **P 值≤ 0,01, ***P 倂 1.00≥)接种 （colletotrichum lupini ， color-08 株 ， 1999 年 波兰 波兰 wierzenica 的 羽扇 获徍） 和 对煰平 差异 的 统计学 显着性 标记 数据点 上方*p 值 <0,05, **P ≤ 0,01, ***P ≤ 0,001) Статистичко растечки значителни различија во уровнях експрессии меѓу инокулированными (Colletotrichum lupini, штамм Col-08, полученный со полей лупина во Верженице, Польша, во 1999 г.) нных (* значење P < 0,05, ** P-значение ≤ 0,01, ***P-значение ≤ 0,001). Статистички значајни разлики во нивоата на изразување помеѓу инокулираните (Colletotrichum lupini, сој Col-08, добиени од полињата со лупин во Верженице, Полска, во 1999 година) и контролните (искокулирани со лажна) растенија се забележани над точките на податоци (*P вредност < 0,05 , **P-вредност .≥ 0-0,0,0).Анализираните NLL линии беа: 83A:476 (отпорни, носители на хомозиготниот алел Lanr1), Mandelup (умерено отпорен, носител на хомозиготниот AnMan алел), Бореџин (отпорен, непозната генетска позадина) и популација 22660 (чувствителна).
Кандидатскиот ген TanjilG_05042 во локусот Lanr1 покажа значително различен модел на изразување од профилите добиени од RNA-seq студиите (сл. 6e).Значајно активирање на овој ген беше забележано кај Mandelup и 22660 популација (до 39,7 и 11,7 пати, соодветно), што резултираше со релативно високи нивоа на изразување (до 1,4 ± 0,14 и 7,2 ± 1,3, соодветно).83A:476, исто така, откри одредена нагорна регулација на генот TanjilG_05042 (до 3,8 пати), меѓутоа, постигнатите релативни нивоа на изразување (0,044 ± 0,002) беа повеќе од 30 пати пониски од оние забележани во Mandelup и 22660 популација.анализирани со qPCR покажаа значајни разлики во нивоата на изразување помеѓу генотиповите во лажни вакцинирани (контролни) варијанти, достигнувајќи 58-кратна разлика помеѓу популациите 22660 и 83A:476, како и помеѓу популациите 22660 и 22660. Постигната е двократна разлика помеѓу Boregine и Mandalup.
Кандидатскиот ген во локусот AnMan, TanjilG_12861, беше активиран како одговор на вакцинацијата во 83A:476 и Mandelup, беше неутрален кај 22660 популација и беше намален во Борегине (сл. 6f).Релативната експресија на генот TanjilG_12861 беше највисока кај инокулираните 83А: 476 (0,14±0,01).Генот за протеин од топлински шок од 17,4 kDa, TanjilG_05080 HSP17.4, покажа пониски нивоа на релативна експресија во сите проучувани соеви и временски точки (сл. 6g).Највисоката вредност е забележана на 24 HPI кај 22660 популација (0,14 ± 0,02, осумкратно зголемување како одговор на вакцинацијата).
Споредбата на профилите на генска експресија (сл. 7) откри висока корелација помеѓу TanjilG_10657 и четири други гени: TanjilG_27015 (r = 0,89), TanjilG_05080 (r = 0,85), TanjilG_05042 (r = 0,806 (r = 0,809) и 4.80.Ваквите резултати може да укажуваат на корегулација на овие гени за време на одбранбените одговори.Гените TanjilG_12861 и TanjilG_23384 покажаа различни профили на изразување со пониски вредности на коефициентот на корелација на Пирсон (од 0,08 до 0,43 и -0,19 до 0,28, соодветно) во споредба со другите гени.
Корелациите помеѓу профилите на изразување на гени беа откриени со употреба на квантитативна PCR.Следниве теснолисни лупински линии беа анализирани: 83A:476 (отпорен, носител на хомозиготниот алел Lanr1), Манделуп (умерено отпорен, носител на хомозиготниот алел AnMan), Борегин (отпорен, непозната генетска позадина) и Популација 22660 (чувствителна).Беа пресметани три временски точки (6, 12 и 24 часа по инокулацијата), вклучително и инокулирани (Colletotrichum lupini, сој Col-08, добиени од полињата со лупин во Вирженице, Полска, во 1999 година) и контролни растенија (инокулирани со лажно).Скалата ја покажува вредноста на Пирсоновиот коефициент на корелација.
Врз основа на податоците добиени со 6 коњски сили на инч, WGCNA беше изведена на 9981 DEG идентификувани со споредување на инокулираните и контролните постројки за да се фокусираат на раните одбранбени одговори (Дополнителна табела S12).Пронајдени се 22 генски модули (кластери) со корелирани (позитивни или негативни) профили на изразување помеѓу генотиповите и експерименталните варијанти. Во просек, нивоата на генска експресија се намалуваа по редослед 83A:476 > Mandelup > Boregine > Популација 22660 (во двете варијанти, сепак, овој тренд беше посилен кај контролните растенија). Во просек, нивоата на генска експресија се намалуваа по редослед 83A:476 > Mandelup > Boregine > Популација 22660 (во двете варијанти, сепак, овој тренд беше посилен кај контролните растенија). В среднем уровни експрессии генов снижались во порядке 83A:476 > Mandelup > Boregine > Население 22660 (во обоих варијантах, однако, ета тенденция была сильнее у контрольных растений). Во просек, нивоата на генска експресија се намалија по редоследот 83A:476 > Mandelup > Boregine > Популација 22660 (во двете варијанти, сепак, овој тренд беше посилен кај контролните растенија).平均而言，基因表达水平按83A:476 > Mandelup > Boregine > Популација 22660 的顺序下降（然而，在两在对照植物中更强）.平均 而 言 ， 基因 水平 按 按 83a: 476> mandelup> boregine> население 22660 的 顺序 下降 （， 下降 （， 圸在 植物 中 更）…………………………….. В среднем уровни експресии генови снижались во ряду 83A:476 > Mandelup > Boregine > Население 22660 (однако во обоих варијантах ета тенденция была сильнее у контрольных растений). Во просек, нивоата на генска експресија се намалија во серијата 83A:476 > Mandelup > Boregine > Популација 22660 (сепак, во двете варијанти, овој тренд беше посилен кај контролните растенија).Вакцинацијата резултираше со регулација на генската експресија, особено во модулите 18, 19, 14, 6 и 1 (по опаѓачки редослед на ефектот), негативна регулација (на пр. модули 9 и 20) или со неутрални ефекти (на пр. модули 11, 22, 8 и 13).Анализата за збогатување на терминот GO (Дополнителна табела S13) откри „GO: 0006952 Заштитни одговори“ за инокулираниот модул (18) со максимална активација, вклучувајќи гени анализирани со qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_23384, TanjilG_23culate as well-1065), притиснати модули за фотосинтеза (9).Концентраторот на модулот 18 (сл. 8) беше идентификуван како генот TanjilG_26536 кој го кодира протеинот LlR18B сличен на PR-10, а концентраторот на модулот 9 беше идентификуван како генот TanjilG_28955 кој го кодира протеинот на фотосистем II PsbQ.Кандидатот за ген за отпорност на антракоза Lanr1, TanjilG_05042, беше пронајден во модулот 22 (сл. 9) и е поврзан со термините „GO:0044260 Клеточни макромолекуларни метаболички процеси“ и „GO:0006355 Транскрипциска регулација, образец на ДНК“ кои го носат hub01212G.генот го кодира факторот на транскрипција на топлинскиот стрес А-4а (HSFA4a).
Пондерирана мрежна анализа на генска ко-изразување на модули со презастапени термини на биолошки процеси „GO: 0006952 Одбрани одговори“.Лигацијата беше поедноставена за да се истакнат четирите гени анализирани со qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 и TanjilG_27015).
Пондерирана мрежна анализа на генска ко-изразување на модул со презастапен термин за биолошки процес „GO: 0006355: Транскрипциона регулација, образец на ДНК“ и носител на кандидатски ген за отпорност на антракоза Lanr1 TanjilG_05042.Лигацијата беше поедноставена за да се изолираат генот TanjilG_05042 и централниот ген TanjilG_01212.
Скринингот за отпорност на антракоза, собран во Австралија, покажа дека повеќето од рано ослободените сорти биле подложни;Kalya, Coromup и Mandelup се опишани како умерено отпорни, додека Wonga, Tanjil и 83A:476 се опишани како високо отпорни26,27,31.го имаа истиот алел за отпор, означен Lanr1, а Coromup и Mandelup имаа различен алел, означен AnMan10, 26, 39, додека Каља помина на различен алел., Lanr2.Скринингот за отпорност на антракоза во Германија резултираше со идентификација на отпорна линија Bo7212 со кандидат алел различен од Lanr1, означен LanrBo36.
Нашата студија откри многу ниска фреквенција (околу 6%) на алелот Lanr1 во тестираната герматолошка плазма.Оваа опсервација е во согласност со резултатите од скринингот на источноевропската гермплазма користејќи ги маркерите Anseq3 и Anseq4, кои покажаа дека алелот Lanr1 е присутен само во две белоруски линии.Ова сугерира дека алелот Lanr1 сè уште не е широко користен од локалните програми за размножување, за разлика од Австралија, каде што е еден од клучните алели за размножување со помош на маркери.Ова може да се должи на пониското ниво на отпор обезбедено од алелот Lanr1 во европски теренски услови во споредба со австралискиот извештај.Дополнително, студиите за антракоза во области со високи врнежи во Австралија покажаа дека реакциите на отпор со посредство на алелот Lanr1 може да не бидат ефективни во временските услови кои го фаворизираат растот и брзиот развој на патогенот19,42.Всушност, во оваа студија, некои симптоми на антракноза беа забележани и кај генотипови кои го носат алелот Lanr1, што сугерира дека отпорноста може да исчезне при оптимални услови за развој на C. lupini.Дополнително, можни се лажно позитивни толкувања на присуството на маркерите Anseq3 и Anseq4, кои се приближно 1 cM од локусот Lanr1, 28,30,43.
Нашата студија покажа дека 83A:476, носител на алелот Lanr1, одговори на инокулацијата на C. lupini со репрограмирање на транскриптом во големи размери во првата анализирана временска точка (6 hpi), додека кај Mandelup, кој го носи алелот AnMan, транскриптомските одговори беа забележани многу подоцна.(од 24 до 48 КС).Овие временски варијации во одбранбените одговори се поврзани со разлики во симптомите на болеста, нагласувајќи ја важноста од раното препознавање на патогенот за успешен одговор на отпорот.За да се зарази растителното ткиво, спорите на антракс мора да поминат низ неколку развојни фази на површината на домаќинот, вклучувајќи ртење, клеточна делба и формирање на апресориум.Додаток е инфективна структура која се прицврстува на површината на домаќинот и го олеснува пенетрацијата во ткивата на домаќинот.Така, спорите на C. gloeosporioides во екстрактот од грашок покажаа прва поделба на јадрото по 75-90 минути инкубација, формирање на микробна цевка по 90-120 минути и сузбивање по 4 часа 45 .Mango C. gloeosporioides покажа повеќе од 40% конидијално ртење по 3 часа инкубација и околу 20% формирање на апресори по 4 часа.CAP20 генот поврзан со вирулентност на C. gloeosporioides покажа транскрипциона активност во конидиите кои формираат епифити по 3,5 часа инкубација во површински восок од авокадо со високи концентрации на протеин CAP20 по 4 часа и 46 минути.Слично на тоа, активноста на гените за биосинтеза на меланин во C. trifolii беше индуцирана за време на 2-часовна инкубација проследена со формирање на апресориум по 1 час.Студиите на лисните ткива покажаа дека јагодите инокулирани со C. acutatum имаат прво супресија на 8 hpi, додека доматите инокулирани со C. coccodes имаат прво сузбивање на 4 hpi48,49.во голема мера во согласност со временската скала на Colletotrichum spp.инфективен процес.Брзите одбранбени одговори на 83A:476 сугерираат вклучување на гените за отпорност на растенијата и ефектор-активиран имунитет (ETI) во оваа линија, додека одложените одговори на Mandelup ја поддржуваат хипотезата за микро-асоцираниот имунитет предизвикан од молекуларен модел (MTI) 50. Рани одговори на 83A: 476 иДелумното преклопување помеѓу нагоре или надолу регулираните гени во одложениот одговор, исто така, го поддржува овој концепт, бидејќи ETI често се смета за забрзан и зајакнат MTI одговор кој кулминира со програмирана клеточна смрт на местото на инфекцијата, познат како анафилактичен шок 51,52.
Повеќето од гените кои се припишуваат на презастапениот термин Gene Ontology GO:0006952 „Одбранбен одговор“ се 11-те хомолози на протеинот 22 на пораката за постот предизвикан од стрес (сличен на SAM22) и седумте главни слични на латекс протеини (MLPs).Протеините слични на 31, 34, 43 и 423 покажаа сличност во низата.Гените слични на SAM22 покажаа значајна активација која траеше подолго, покажувајќи зголемено ниво на отпорност на антракоза (83A:476 и Бореџин).Сепак, гените слични на MLP беа намалени само во линиите што го носеа алелот на кандидат за отпор (83A:476/Lanr1 на 6 hpi и Mandelup/AnMan на 24 hpi).Треба да се забележи дека сите идентификувани хомолози слични на SAM22 потекнуваат од генска група која опфаќа приближно 105 kb, додека гените слични на MLP потекнуваат од одделни региони на геномот.Координирано активирање на таквите гени слични на SAM22 беше пронајдено и во нашата претходна студија за отпорноста на NLL на инокулација со Diaporthetoxica, што укажува на тоа дека тие се вклучени во хоризонталните компоненти на одбранбениот одговор.Овој заклучок е поддржан и од извештаите за позитивен одговор на гени слични на SAM22 на повреда или третман со салицилна киселина, габични индуктори или водород пероксид.
Се покажа дека гените слични на MLP реагираат на различни абиотски и биотски стресови, вклучувајќи бактериски, вирусни и патогени габични инфекции кај многу растителни видови55.Насоките на одговор на одредени интеракции помеѓу растенијата и патогените се движеа од силно зголемување (т.е. за време на наезда на памук со Verticillium dahliae) до значително намалување (т.е. по инфекција на јаболкницата со Alternaria spp.)56,57.Значително намалување на регулацијата на генот 423 сличен на MLP е забележано за време на одбраната од авокадо на инфекција со F. niger и за време на инфекцијата на јаболкницата Botryosphaeria berengeriana f.цн.piricola и Alternaria alternata се патотипови на јаболка58,59.Дополнително, калусите од јаболкото кои прекумерно го изразуваат генот 423 сличен на MLP имале помала експресија на гените поврзани со отпорноста и биле поподложни на габична инфекција59.После Fusarium oxysporum F, генот сличен на MLP 423 исто така беше потиснат во отпорен гермплазма на обичен грав.цн.Инфекција со грав 60.
Други членови на семејството PR-10 идентификувани во нашата RNA-seq студија беа гените LlR18A и LlR18B како одговор на надрегулацијата, како и нагоре регулираниот (1 ген) или надолурегулиран (3 гени) ген за протеинот за трансфер на липиди DIR1..Покрај тоа, WGCNA го истакнува генот LlR18B како центар во овој модул, кој е многу подложен на вакцинација и носи неколку гени за заштитна реакција.Гените LLR18A и LLR18B беа индуцирани во жолти лупински лисја како одговор на патогени бактерии, како и во стеблата NLL по D. toxica инокулација, додека оризот хомолог на овие гени, rsospr10, беше брзо предизвикана од габична инфекција што веројатно се вклучи во Jasmonic сигнализирање gene53,61 Протеини за липиден транспорт што се потребни за почеток на системски стекнат отпор (САР).Со развојот на заштитни реакции, протеинот DIR1 се транспортира од фокусот на инфекцијата низ флоемот за да предизвика SAR во далечните органи.Интересно, генот TanjilG_02313 DIR1 беше значително индуциран во првата временска точка во линиите 84A:476 и Популацијата 22660, но отпорноста на антракоза успешно се разви само во линијата 84A:476.Ова може да укаже на одредена субфункционализација на генот DIR1 во NLL, бидејќи преостанатите три хомолози реагираа на инокулација само во линијата 83A:476 на 6 hpi, и овој одговор беше насочен надолу.
Во нашата студија, најчестите компоненти што одговараат на биолошкиот процес наречен „GO: 0055114 Редокс процес“ беа протеинот цитохром P450, пероксидазата, линолеинската киселина 9S-/13S-липоксигеназа и 1-аминоциклопропан-1-карбоксилна киселина оксидаза.Дополнително, нашата WGCNA го дефинира хомологот HSFA4a како центар што носи модули како што е кандидатот за отпорен ген Lanr1 TanjilG_05042.HSFA4a е компонента на редокс-зависната регулација на нуклеарната транскрипција во растенијата.
Протеините на цитохром P450 се оксидоредуктази кои ги катализираат NADPH и/или O2-зависни реакции на хидроксилација во примарниот и секундарниот метаболизам, вклучувајќи го метаболизмот на ксенобиотиците, како и хормоните, масни киселини, стероли, компонентите на клеточниот ѕид, биополимерите и биосинтезата на заштитните соединенија на растенијата. функцијата беше намалена од -10,6 log2 (промена на пати) на 5,7 поради големиот број на изменети хомолози (37) и разликите во моделите на одговор помеѓу специфичните гени, што одразува нагорна ревизија..Користењето само на податоци од RNA-seq за да се разјасни наводната биолошка функција на гените на NLL во толку голема протеинска суперфамилија би било многу шпекулативно.Сепак, вреди да се напомене дека некои гени на цитохром P450 се поврзани со зголемена отпорност на патогени габи или бактерии, вклучително и придонес за алергиски реакции69,70,71.
Пероксидазите од класа III се мултифункционални растителни ензими вклучени во широк опсег на метаболички процеси за време на растот и развојот на растенијата, како и како одговор на еколошки стресови како што се соленоста, сушата, висок интензитет на светлина и напад на патогенот72.Пероксидазите се вклучени во интеракцијата на неколку растителни видови со Anthracis, вклучувајќи ги Stylosanthes humilis и C. gloeosporioides, Lens culinaris и C. truncatum, Phaseolus vulgaris и C. lindemuthianum, Cucumis sativus и C. lagenarium73,776,75.Одговорот е многу брз, понекогаш дури и на 4 HPI, пред габата да навлезе во растителното ткиво73.Генот на пероксидаза, исто така, реагираше на инокулација на D. toxica NLL.Покрај нивните типични функции за регулирање на оксидативниот излив или елиминирање на оксидативниот стрес, пероксидазите може да го попречат растот на патогенот со создавање физички бариери базирани на зајакнување на клеточниот ѕид за време на лигнификација, подединица или вкрстено поврзување на специфични соединенија.Оваа функција може да се припише во силико на генот TanjilG_03329 кој шифрира наводна анјонска пероксидаза што формира лигнин, која беше значително регулиран во нашата студија во линијата отпорна на 83A:476 на 6 HPI, но не и во други соеви и временски точки кои не реагираа.
9S-/13S-липоксигеназа на линолова киселина е првиот чекор во оксидативниот пат на липидната биосинтеза78.Производите од оваа патека имаат повеќекратни функции во одбраната на растенијата, вклучувајќи зајакнување на клеточниот ѕид преку формирање на наслаги на калоза и пектин и регулирање на оксидативниот стрес преку производство на реактивни видови кислород79,80,81,82,83.Во оваа студија, експресијата на линолеинската киселина 9S-/13S-липоксигеназа беше променета кај сите соеви, но кај осетливата популација 22660, надрегулацијата преовладуваше во различни временски периоди, додека кај соевите кои носат резистентен Lanr1 и алелот AnMan, ја нагласува диверзификацијата на овие генерички типови на заштитни слоеви.
Хомологот на 1-аминоциклопропан-1-карбоксилат оксидаза (ACO) беше значително регулиран (9 гени) или намален (2 гени) кога беше инокулиран со лупин.Со два исклучоци, сите овие одговори се случија на 6 КС.во 83A:476.Ензимската реакција посредувана од ACO протеините е чекор со ограничување на брзината во производството на етилен и затоа е високо регулирана84.Етилен е растителен хормон кој игра различни улоги во регулирањето на развојот на растенијата и одговорот на абиотски и биотски стресни услови.Индукцијата на ACO транскрипција и активирањето на етиленската сигнална патека се вклучени во зголемувањето на отпорноста на оризот на хемибиотрофната габа oryzae oryzae преку регулирање на производството на реактивни видови кислород и фитоалексини.Многу сличен процес на инфекција на листот пронајден помеѓу M. oryzae и C. lupini88,89, наспроти позадината на значајната регулација на хомолозите на ACO во линијата 83A:476 пријавени во оваа студија, ја менува можноста за доделување отпор на NLL антракоза Етилен како сигнален централен чекор во молекуларните патишта.
Во оваа студија, големо потиснување на многу гени поврзани со фотосинтезата беше забележано на 6 hpi во 83A:476 и на 48 hpi во Mandeloop и популацијата од 22660.Обемот и прогресијата на овие промени е пропорционален на нивото.Во овој експеримент беше забележана отпорност на антракоза.Неодамна, силна и рана репресија на транскриптите поврзани со фотосинтезата е пријавена во неколку модели на интеракции на растенија-патогени, вклучувајќи патогени бактерии и габи.Брзањето (од 2 HPI во некои интеракции) и глобалното сузбивање на гените поврзани со фотосинтезата како одговор на инфекцијата може да го поттикнат растителниот имунитет врз основа на распоредувањето на реактивни видови кислород и нивната интеракција со патеката на салицилна киселина за да посредуваат во алергиски реакции 90,94.
Како заклучок, механизмите за одбранбен одговор предложени за најотпорната лоза (83A:476) вклучуваат брзо препознавање на патогенот од генот R (најверојатно TIR-NBS-LRR TanjilG_05042) и сигнализација со салицилна киселина и етилен со посредство на алергиски одговор, проследено со воспоставување на SAR со долг дострел.дејството е поддржано од протеинот DIR-1.Треба да се забележи дека биотрофниот период за инфекција со C. lupini е многу краток (приближно 2 дена), проследен со некротичен раст95.Преминот помеѓу овие фази може да биде поврзан со некроза и експресија на етилен-индуцирани протеини кои делуваат како предизвикувачи за реакции на преосетливост кај растенијата домаќини.Затоа, временскиот прозорец за успешно снимање на C. lupini во биотрофичната фаза е многу тесен.Репрограмирањето на гените поврзани со редокс и фотосинтезата забележано во 83A:476 на 6 hpi е во согласност со прогресијата на габичните хифи и го најавува развојот на успешен заштитен одговор во биотрофичната фаза.Транскриптомските одговори на Mandelup и популацијата 22660 може да бидат премногу одложени за да се фатат габата пред да се префрлат на некротичен раст, сепак, Mandelup може да биде поефективен од популацијата 22660 бидејќи релативно брзата регулација на протеинот PR-10 промовира хоризонтална отпорност.
ETI, управуван од канонскиот ген R, се чини дека е вообичаен механизам за отпорност на грав на антракоза.Така, во моделот на мешунките Medicago truncatula, отпорноста кон антракоза се доделува од генот RCT1, член на класата на генот на растението TIR-NBS-LRR97.Овој ген, исто така, дава отпорност на антракоза со широк спектар на луцерка кога се пренесува на чувствителни растенија.Во обичниот грав (П. вулгарис), до денес се идентификувани повеќе од дваесетина гени на отпорност на антракноза.Некои од овие гени се наоѓаат во региони на кои им недостигаат канонски R гени, но многу други се наоѓаат на рабовите на хромозомите што го носат генскиот кластер NBS-LRR, вклучувајќи го и TIR-NBS-LRRs99.Студијата за SSR ширум геномот, исто така, ја потврди поврзаноста на генот NBS-LRR со отпорноста на антракоза кај обичниот грав.Канонскиот R ген беше пронајден и во геномскиот регион кој го носи главниот локус на отпорност на антракоза во белиот лупин 101.
Нашата работа покажува дека реакцијата на непосредна отпорност, активирана во рана фаза на инфекција на растенијата (по можност не подоцна од 12 КС), ефикасно го штити теснолистниот лупин од антракоза предизвикана од патогената габа Collelotrichum lupini.Користејќи секвенционирање со висока пропусна моќ, демонстриравме профили на диференцијална експресија на гените за отпорност на антракоза во растенијата NLL со посредство на гените за отпорност Lanr1 и AnMan.Успешната одбрана вклучува внимателно дизајнирање на гените за протеините вклучени во редокс, фотосинтезата и патогенезата во рок од неколку часа по првиот контакт на растението со патогенот.Слични заштитни реакции, но задоцнети со време, се многу помалку ефикасни во заштитата на растенијата од болести.Отпорноста на антракс посредувана од генот Lanr1 наликува на типичната брза реакција на генот R (имунитет активиран од ефекторот), додека генот AnMan најверојатно обезбедува хоризонтален одговор (имунитет поттикнат од молекуларна шема поврзана со микробите), обезбедувајќи умерено ниво на одржливост.
215 NLL линии користени за скрининг за маркери за антракноза се состоеја од 74 сорти, 60 линии добиени со вкрстување или размножување, 5 мутанти и 76 диви или оригинални гермиплазми.Линиите дојдоа од 17 земји, главно од Полска (58), Шпанија (47), Германија (27), Австралија (26), Русија (19), Белорусија (7), Италија (5) и други линии.од 10 земји.Комплетот вклучува и референтни отпорни линии: 83A:476, Tanjil, Wonga што го носи алелот Lanr1 и Mandelup кој го носи алелот AnMan.Линиите се добиени од Европската база на податоци за генетски ресурси на лупин, одржувана од Poznań Plant Breeding Ltd., Wiatrowo, Полска (Дополнителна табела S1).
Растенијата се одгледуваа под контролирани услови (фотопериод 16 часа, температура 25°C во текот на денот и 18°C ​​во текот на ноќта).Беа анализирани две биолошки реплики.ДНК беше изолирана од тринеделни листови со помош на DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Германија) според протоколот.Квалитетот и концентрацијата на изолираната ДНК беа оценети со спектрофотометриски методи (NanoDrop 2000; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA).Маркерот AnManM1 што го означува генот за отпорност на антракоза AnMan (изведен од cv. Mandelup) и маркерите Anseq3 и Anseq4 кои го граничат генот Lanr1 (добиен од cv. Tanjil) беа анализирани 11,26,28.Хомозиготите за отпорни алели беа постигнати како „1 ″, подложни - како„ 0 ″ и хетерозиготи - како 0,5.
Врз основа на резултатите од скринингот за маркерите AnManM1, AnSeq3 и AnSeq4 и достапноста на семиња за конечни последователни експерименти, беа избрани 50 NLL линии за фенотипизација на отпорност на антракоза.Анализата беше извршена во дупликат во компјутерски контролирана стаклена градина со 14 часовен фотопериод со температурен опсег од 22°C во текот на денот и 19°C во текот на ноќта.Семето се гребе (се отсекува семето од спротивната страна на ембрионот со остар нож) пред сеидбата за да се спречи мирување на семето поради прецврстувањето на семето и да се обезбеди рамномерно ртење.Растенијата се одгледувале во саксии (11 × 11 × 21 cm) со стерилна почва (TS-1 REC 085 Medium Basic, Klasmann-Deilmann Polska, Варшава, Полска).Инокулацијата беше извршена со сојот Colletotrichum lupini Col-08, израснат во 1999 година од стебла на теснолисни растенија лупин одгледувани на поле во Верженица, Голема Полска (52° 27′ 42″ N 17° 04′ 05″ E ).Добијте област.Изолатите беа култивирани во СНА -медиум на 20 ° C под црна светлина за 21 ден за да предизвикаат спорулација.Четири недели по сеидбата, кога растенијата го достигнале стадиумот од 4-6 листа, се врши инокулација со прскање со суспензија на конидии во концентрација од 0,5 x 106 конидии на ml.По инокулацијата, растенијата се чуваат во темница 24 часа на влажност од околу 98% и температура од 25°C за да се олесни ртењето на конидиите и процесот на инфекција.Растенијата потоа се одгледуваа под 14-часовен фотопериод на 22°C ден/19°C ноќе и 70% влажност.Резултатот на болеста беше направен 22 дена по инокулацијата и се движеше од 0 (имунолошки) до 9 (многу чувствителен) во зависност од присуството или отсуството на некротични лезии на стеблата и лисјата.Дополнително, по бодирањето беше измерена тежината на растенијата.Односите помеѓу генотиповите на маркерите и фенотиповите на болеста беа пресметани како точкести двосеквентни корелации (отсуство на хетерозиготни маркери во множеството линии за анализа на фенотипот на отпорност на антракоза).