Nature.com സന്ദർശിച്ചതിന് നന്ദി. നിങ്ങൾ ഉപയോഗിക്കുന്ന ബ്രൗസർ പതിപ്പിന് CSS-ന് പരിമിതമായ പിന്തുണയേ ഉള്ളൂ. മികച്ച അനുഭവത്തിനായി, നിങ്ങൾ ഒരു അപ്ഡേറ്റ് ചെയ്ത ബ്രൗസർ ഉപയോഗിക്കാൻ ഞങ്ങൾ ശുപാർശ ചെയ്യുന്നു (അല്ലെങ്കിൽ ഇന്റർനെറ്റ് എക്സ്പ്ലോററിൽ കോംപാറ്റിബിലിറ്റി മോഡ് ഓഫ് ചെയ്യുക). അതേസമയം, തുടർച്ചയായ പിന്തുണ ഉറപ്പാക്കാൻ, സ്റ്റൈലുകളും ജാവാസ്ക്രിപ്റ്റും ഇല്ലാതെ ഞങ്ങൾ സൈറ്റ് പ്രദർശിപ്പിക്കും.
മനുഷ്യ ഗട്ട് മോർഫോജെനിസിസ് 3D എപ്പിത്തീലിയൽ മൈക്രോആർക്കിടെക്ചറിന്റെയും സ്പേഷ്യൽ ഓർഗനൈസേഷന്റെയും ക്രിപ്റ്റ്-വില്ലസ് സവിശേഷതകൾ സ്ഥാപിക്കുന്നു. ബേസൽ ക്രിപ്റ്റിലെ സ്റ്റെം സെൽ മാടം ബാഹ്യ സൂക്ഷ്മജീവ ആന്റിജനുകളിൽ നിന്നും അവയുടെ മെറ്റബോളിറ്റുകളിൽ നിന്നും സംരക്ഷിച്ചുകൊണ്ട് ഗട്ട് ഹോമിയോസ്റ്റാസിസ് നിലനിർത്താൻ ഈ സവിശേഷ ഘടന ആവശ്യമാണ്. കൂടാതെ, കുടൽ വില്ലിയും സ്രവിക്കുന്ന മ്യൂക്കസും കുടൽ മ്യൂക്കോസൽ ഉപരിതലത്തിൽ ഒരു സംരക്ഷണ തടസ്സമുള്ള പ്രവർത്തനപരമായി വ്യത്യസ്തമായ എപ്പിത്തീലിയൽ കോശങ്ങളെ അവതരിപ്പിക്കുന്നു. അതിനാൽ, ഇൻ വിട്രോ ഗട്ട് മോഡലുകളുടെ നിർമ്മാണത്തിന് 3D എപ്പിത്തീലിയൽ ഘടനകൾ പുനർനിർമ്മിക്കുന്നത് നിർണായകമാണ്. ശ്രദ്ധേയമായി, ഓർഗാനിക് മിമെറ്റിക് ഗട്ട്-ഓൺ-എ-ചിപ്പിന് മെച്ചപ്പെട്ട ഫിസിയോളജിക്കൽ പ്രവർത്തനങ്ങളും ബയോമെക്കാനിക്സും ഉപയോഗിച്ച് കുടൽ എപ്പിത്തീലിയത്തിന്റെ സ്വതസിദ്ധമായ 3D മോർഫോജെനിസിസിന് പ്രേരിപ്പിക്കാൻ കഴിയും. ഇവിടെ, ഒരു മൈക്രോഫ്ലൂയിഡിക് ചിപ്പിലും ട്രാൻസ്‌വെൽ എംബഡഡ് ഹൈബ്രിഡ് ചിപ്പിലും കുടലിൽ കുടൽ മോർഫോജെനിസിസിന് ശക്തമായ പ്രേരണ നൽകുന്നതിനുള്ള ഒരു പുനരുൽപ്പാദിപ്പിക്കാവുന്ന പ്രോട്ടോക്കോൾ ഞങ്ങൾ നൽകുന്നു. പരമ്പരാഗത ക്രമീകരണങ്ങളിലും ഒരു മൈക്രോഫ്ലൂയിഡിക് പ്ലാറ്റ്‌ഫോമിലും ഉപകരണ നിർമ്മാണം, കക്കോ-2 അല്ലെങ്കിൽ കുടൽ ഓർഗനോയിഡ് എപ്പിത്തീലിയൽ കോശങ്ങളുടെ സംസ്‌കാരം, 3D മോർഫോജെനിസിസിന്റെ ഇൻഡക്ഷൻ, സ്ഥാപിതമായവയുടെ സ്വഭാവം എന്നിവയ്ക്കുള്ള വിശദമായ രീതികൾ ഞങ്ങൾ വിവരിക്കുന്നു. ഒന്നിലധികം ഇമേജിംഗ് രീതികൾ ഉപയോഗിച്ച് 3D എപ്പിത്തീലിയ. 5 ദിവസത്തേക്ക് ബാസോലാറ്ററൽ ദ്രാവക പ്രവാഹം നിയന്ത്രിച്ചുകൊണ്ട് ഈ പ്രോട്ടോക്കോൾ ഫങ്ഷണൽ ഗട്ട് മൈക്രോആർക്കിടെക്ചറിന്റെ പുനരുജ്ജീവനം കൈവരിക്കുന്നു. ഞങ്ങളുടെ ഇൻ വിട്രോ മോർഫോജെനിസിസ് രീതി ഫിസിയോളജിക്കലി പ്രസക്തമായ ഷിയർ സമ്മർദ്ദവും മെക്കാനിക്കൽ ചലനവും ഉപയോഗിക്കുന്നു, കൂടാതെ സങ്കീർണ്ണമായ സെൽ എഞ്ചിനീയറിംഗോ കൃത്രിമത്വമോ ആവശ്യമില്ല, ഇത് നിലവിലുള്ള മറ്റ് സാങ്കേതിക വിദ്യകളെ മറികടക്കും. ബയോമെഡിക്കൽ, ക്ലിനിക്കൽ, ഫാർമസ്യൂട്ടിക്കൽ ആപ്ലിക്കേഷനുകൾക്കായി വിട്രോയിലെ 3D കുടൽ എപ്പിത്തീലിയൽ പാളികൾ പുനരുജ്ജീവിപ്പിക്കുന്നതിനുള്ള ഒരു രീതി നൽകിക്കൊണ്ട്, ബയോമെഡിക്കൽ ഗവേഷണ സമൂഹത്തിന് ഞങ്ങളുടെ നിർദ്ദിഷ്ട പ്രോട്ടോക്കോളിന് വിശാലമായ പ്രത്യാഘാതങ്ങൾ ഉണ്ടാകുമെന്ന് ഞങ്ങൾ സങ്കൽപ്പിക്കുന്നു.
ഗട്ട്-ഓൺ-എ-ചിപ്പ്1,2,3,4,5 അല്ലെങ്കിൽ ബൈലെയർ മൈക്രോഫ്ലൂയിഡിക് ഉപകരണങ്ങൾ6,7 എന്നിവയിൽ കൾച്ചർ ചെയ്ത കുടൽ എപ്പിത്തീലിയൽ കാക്കോ-2 കോശങ്ങൾക്ക് അടിസ്ഥാന സംവിധാനത്തെക്കുറിച്ച് വ്യക്തമായ ധാരണയില്ലാതെ തന്നെ ഇൻ വിട്രോയിൽ സ്വയമേവയുള്ള 3D മോർഫോജെനിസിസിന് വിധേയമാകാൻ കഴിയുമെന്ന് പരീക്ഷണങ്ങൾ തെളിയിക്കുന്നു. ഞങ്ങളുടെ സമീപകാല പഠനത്തിൽ, കൾച്ചർ ഉപകരണങ്ങളിൽ നിന്ന് ബാസോലാറ്ററലി സ്രവിക്കുന്ന മോർഫോജൻ എതിരാളികളെ നീക്കം ചെയ്യുന്നത് ഇൻ വിട്രോയിൽ 3D എപ്പിത്തീലിയൽ മോർഫോജെനിസിസ് പ്രേരിപ്പിക്കുന്നതിന് ആവശ്യമാണെന്നും പര്യാപ്തമാണെന്നും ഞങ്ങൾ കണ്ടെത്തി, ഇത് കാക്കോ-2 ഉം രോഗിയിൽ നിന്ന് ഉരുത്തിരിഞ്ഞ കുടൽ ഓർഗനോയിഡുകളും തെളിയിച്ചിട്ടുണ്ട്. എപ്പിത്തീലിയൽ കോശങ്ങളെ സാധൂകരിച്ചു. ഈ പഠനത്തിൽ, ഗട്ട്-ഓൺ-എ-ചിപ്പിലും "ഹൈബ്രിഡ് ചിപ്പ്" എന്ന് വിളിക്കപ്പെടുന്ന ട്രാൻസ്‌വെൽ ഇൻസെർട്ടുകൾ അടങ്ങിയ പരിഷ്കരിച്ച മൈക്രോഫ്ലൂയിഡിക് ഉപകരണങ്ങളിലും, ശക്തമായ Wnt എതിരാളിയായ Dickopf-1 (DKK-1) ന്റെ കോശ ഉൽപാദനത്തിലും സാന്ദ്രത വിതരണത്തിലും ഞങ്ങൾ പ്രത്യേകം ശ്രദ്ധ കേന്ദ്രീകരിച്ചു. ഓൺ-ചിപ്പ് ഗട്ടിലേക്ക് എക്സോജനസ് Wnt എതിരാളികളെ (DKK-1, Wnt repressor 1, സ്രവിക്കുന്ന ഫ്രിസിൽഡ്-റിലേറ്റഡ് പ്രോട്ടീൻ 1, അല്ലെങ്കിൽ Soggy-1 പോലുള്ളവ) ചേർക്കുന്നത് മോർഫോജെനിസിസിനെ തടയുകയോ മുൻകൂട്ടി ഘടനാപരമായ 3D എപ്പിത്തീലിയൽ പാളിയെ തടസ്സപ്പെടുത്തുകയോ ചെയ്യുന്നുവെന്ന് ഞങ്ങൾ തെളിയിക്കുന്നു, ഇത് കൾച്ചർ സമയത്ത് വിരുദ്ധ സമ്മർദ്ദം ഇൻ വിട്രോ കുടൽ മോർഫോജെനിസിസിന് കാരണമാകുമെന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്നു. അതിനാൽ, എപ്പിത്തീലിയൽ ഇന്റർഫേസിൽ ശക്തമായ മോർഫോജെനിസിസ് നേടുന്നതിനുള്ള ഒരു പ്രായോഗിക സമീപനം, സജീവമായ ഫ്ലഷിംഗ് (ഉദാഹരണത്തിന്, ഗട്ട്-ഓൺ-എ-ചിപ്പ് അല്ലെങ്കിൽ ഹൈബ്രിഡ്-ഓൺ-എ-ചിപ്പ് പ്ലാറ്റ്‌ഫോമുകളിൽ) അല്ലെങ്കിൽ ഡിഫ്യൂഷൻ വഴി ബാസോലാറ്ററൽ കമ്പാർട്ടുമെന്റിലെ Wnt എതിരാളികളുടെ അളവ് നീക്കം ചെയ്യുകയോ കുറഞ്ഞത് നിലനിർത്തുകയോ ചെയ്യുക എന്നതാണ്. ബാസോലാറ്ററൽ മീഡിയ (ഉദാഹരണത്തിന്, ട്രാൻസ്‌വെൽ ഇൻസെർട്ടുകളിൽ നിന്ന് വലിയ ബാസോലാറ്ററൽ റിസർവോയറുകളിലേക്ക്. കിണറുകളിൽ).
ഈ പ്രോട്ടോക്കോളിൽ, പോളിഡിമെഥൈൽസിലോക്സെയ്ൻ (PDMS) അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള പോറസ് മെംബ്രണുകളിൽ (ഘട്ടങ്ങൾ 6A, 7A, 8, 9) അല്ലെങ്കിൽ ട്രാൻസ്‌വെൽ ഇൻസേർട്ടുകളുടെ പോളിസ്റ്റർ മെംബ്രണുകളിൽ (ഘട്ടങ്ങൾ 6B, 7B, 8, 9) ഇൻഡ്യൂസ്ഡ് 3D മോർഫോജെനിസിസ് ഇൻ വിട്രോയിൽ (ഘട്ടം 10) കൾച്ചർ ചെയ്യുന്ന കുടൽ എപ്പിത്തീലിയൽ കോശങ്ങളിലേക്ക് ഗട്ട്-ഓൺ-എ-ചിപ്പ് മൈക്രോഡിവൈസുകളും ട്രാൻസ്‌വെൽ-ഇൻസേർട്ടബിൾ ഹൈബ്രിഡ് ചിപ്പുകളും (ഘട്ടങ്ങൾ 1-5) നിർമ്മിക്കുന്നതിനുള്ള വിശദമായ രീതി ഞങ്ങൾ നൽകുന്നു. ഒന്നിലധികം ഇമേജിംഗ് രീതികൾ പ്രയോഗിച്ചുകൊണ്ട് ടിഷ്യു-നിർദ്ദിഷ്ട ഹിസ്റ്റോജെനിസിസിനെയും ലൈനേജ്-ആശ്രിത സെല്ലുലാർ ഡിഫറൻഷ്യേഷനെയും സൂചിപ്പിക്കുന്ന സെല്ലുലാർ, മോളിക്യുലാർ സവിശേഷതകളും ഞങ്ങൾ തിരിച്ചറിഞ്ഞു (ഘട്ടങ്ങൾ 11-24). പോറസ് മെംബ്രണുകളുടെ ഉപരിതല പരിഷ്ക്കരണം, 2D മോണോലെയറുകളുടെ സൃഷ്ടി, കുടൽ ബയോകെമിക്കൽ, ബയോമെക്കാനിക്കൽ മൈക്രോ എൻവയോൺമെന്റിന്റെ പുനരുൽപാദനം എന്നിവയുൾപ്പെടെയുള്ള സാങ്കേതിക വിശദാംശങ്ങളുള്ള രണ്ട് കൾച്ചർ ഫോർമാറ്റുകളിൽ കക്കോ-2 അല്ലെങ്കിൽ കുടൽ ഓർഗനോയിഡുകൾ പോലുള്ള മനുഷ്യ കുടൽ എപ്പിത്തീലിയൽ സെല്ലുകൾ ഉപയോഗിച്ച് ഞങ്ങൾ മോർഫോജെനിസിസ് പ്രേരിപ്പിക്കുന്നു. ഇൻ വിട്രോ. 2D എപ്പിത്തീലിയൽ മോണോലെയറുകളിൽ നിന്ന് 3D മോർഫോജെനിസിസ് പ്രേരിപ്പിക്കുന്നതിന്, ഞങ്ങൾ മോർഫോജെൻ എതിരാളികളെ നീക്കം ചെയ്തു. സംസ്കാരത്തിന്റെ ബാസോലാറ്ററൽ കമ്പാർട്ടുമെന്റിലേക്ക് മാധ്യമം ഒഴുക്കിക്കൊണ്ടാണ് രണ്ട് സംസ്ക്കരിച്ച രൂപങ്ങളിലും. അവസാനമായി, മോർഫോജൻ-ആശ്രിത എപ്പിത്തീലിയൽ വളർച്ച, രേഖാംശ ഹോസ്റ്റ്-മൈക്രോബയോം സഹ-കൾച്ചറുകൾ, രോഗകാരി അണുബാധ, കോശജ്വലന പരിക്ക്, എപ്പിത്തീലിയൽ ബാരിയർ ഡിസ്ഫൻഷൻ, പ്രോബയോട്ടിക് അധിഷ്ഠിത ചികിത്സകൾ എന്നിവ മാതൃകയാക്കാൻ ഉപയോഗിക്കാവുന്ന ഒരു പുനരുൽപ്പാദിപ്പിക്കാവുന്ന 3D എപ്പിത്തീലിയൽ പാളിയുടെ ഉപയോഗത്തിന്റെ ഒരു പ്രാതിനിധ്യം ഞങ്ങൾ നൽകുന്നു. ഉദാഹരണം. സ്വാധീനങ്ങൾ.
അടിസ്ഥാന (ഉദാ: കുടൽ മ്യൂക്കോസൽ ബയോളജി, സ്റ്റെം സെൽ ബയോളജി, ഡെവലപ്‌മെന്റൽ ബയോളജി) പ്രായോഗിക ഗവേഷണം (ഉദാ: പ്രീക്ലിനിക്കൽ ഡ്രഗ് ടെസ്റ്റിംഗ്, ഡിസീസ് മോഡലിംഗ്, ടിഷ്യു എഞ്ചിനീയറിംഗ്, ഗ്യാസ്ട്രോഎൻട്രോളജി) എന്നിവയിലെ വിശാലമായ ശാസ്ത്രജ്ഞർക്ക് ഞങ്ങളുടെ പ്രോട്ടോക്കോൾ ഉപയോഗപ്രദമായേക്കാം. ഇൻ വിട്രോയിൽ ഇൻ ഇൻസ്റ്റൈനൽ എപ്പിത്തീലിയത്തിന്റെ 3D മോർഫോജെനിസിസ് പ്രേരിപ്പിക്കുന്നതിനുള്ള ഞങ്ങളുടെ പ്രോട്ടോക്കോളിന്റെ പുനരുൽപാദനക്ഷമതയും കരുത്തും കാരണം, കുടൽ വികസനം, പുനരുജ്ജീവിപ്പിക്കൽ അല്ലെങ്കിൽ ഹോമിയോസ്റ്റാസിസ് സമയത്ത് സെൽ സിഗ്നലിംഗിന്റെ ചലനാത്മകത പഠിക്കുന്ന പ്രേക്ഷകർക്ക് ഞങ്ങളുടെ സാങ്കേതിക തന്ത്രം പ്രചരിപ്പിക്കാൻ കഴിയുമെന്ന് ഞങ്ങൾ വിഭാവനം ചെയ്യുന്നു. കൂടാതെ, നോറോവൈറസ് 8, സിവിയർ അക്യൂട്ട് റെസ്പിറേറ്ററി സിൻഡ്രോം കൊറോണ വൈറസ് 2 (SARS-CoV-2), ക്ലോസ്ട്രിഡിയം ഡിഫിസൈൽ, സാൽമൊണെല്ല ടൈഫിമുറിയം 9 അല്ലെങ്കിൽ വിബ്രിയോ കോളറെ തുടങ്ങിയ വിവിധ പകർച്ചവ്യാധി ഏജന്റുമാരുടെ കീഴിൽ അണുബാധയെ ചോദ്യം ചെയ്യുന്നതിന് ഞങ്ങളുടെ പ്രോട്ടോക്കോൾ ഉപയോഗപ്രദമാണ്. രോഗ പാത്തോളജി, രോഗകാരി എന്നിവയെക്കുറിച്ചുള്ള പ്രേക്ഷകരും ഉപയോഗപ്രദമാണ്. ഒരു ഓൺ-ചിപ്പ് ഗട്ട് മൈക്രോഫിസിയോളജി സിസ്റ്റത്തിന്റെ ഉപയോഗം രേഖാംശ കോ-കൾച്ചർ 10 അനുവദിച്ചേക്കാം, തുടർന്ന് ആതിഥേയ പ്രതിരോധം, രോഗപ്രതിരോധ പ്രതികരണങ്ങൾ, ഗ്യാസ്ട്രോഇന്റസ്റ്റൈനൽ (ജിഐ) ട്രാക്റ്റിലെ രോഗകാരിയുമായി ബന്ധപ്പെട്ട പരിക്ക് നന്നാക്കൽ എന്നിവ വിലയിരുത്താൻ അനുവദിച്ചേക്കാം. ലീക്കി ഗട്ട് സിൻഡ്രോം, സീലിയാക് രോഗം, ക്രോൺസ് രോഗം, അൾസറേറ്റീവ് കൊളൈറ്റിസ്, പൗച്ചൈറ്റിസ് അല്ലെങ്കിൽ ഇറിറ്റബിൾ ബവൽ സിൻഡ്രോം എന്നിവയുമായി ബന്ധപ്പെട്ട മറ്റ് ജിഐ തകരാറുകൾ രോഗിയുടെ 3D കുടൽ എപ്പിത്തീലിയൽ പാളികൾ ഉപയോഗിച്ച് 3D കുടൽ എപ്പിത്തീലിയൽ പാളികൾ തയ്യാറാക്കുമ്പോൾ അനുകരിക്കാൻ കഴിയും, ഈ രോഗങ്ങളിൽ വില്ലസ് അട്രോഫി, ക്രിപ്റ്റ് ഷോർട്ടനിംഗ്, മ്യൂക്കോസൽ കേടുപാടുകൾ അല്ലെങ്കിൽ ദുർബലമായ എപ്പിത്തീലിയൽ തടസ്സം എന്നിവ ഉൾപ്പെടുന്നു. ബയോപ്സി അല്ലെങ്കിൽ സ്റ്റെം സെൽ-ഡെറിവേഡ് ഇൻസ്റ്റൈനൽ ഓർഗനോയിഡുകൾ 12,13. രോഗ പരിസ്ഥിതിയുടെ ഉയർന്ന സങ്കീർണ്ണതയെ മികച്ച രീതിയിൽ മാതൃകയാക്കാൻ, 3D കുടൽ വില്ലസ്-ക്രിപ്റ്റ് മൈക്രോആർക്കിടെക്ചറുകൾ അടങ്ങിയ മോഡലുകളിലേക്ക് രോഗിയുടെ പെരിഫറൽ ബ്ലഡ് മോണോ ന്യൂക്ലിയർ സെല്ലുകൾ (പിബിഎംസി) പോലുള്ള രോഗ-പ്രസക്തമായ കോശ തരങ്ങൾ ചേർക്കുന്നത് വായനക്കാർക്ക് പരിഗണിക്കാം. ടിഷ്യു-നിർദ്ദിഷ്ട രോഗപ്രതിരോധ കോശങ്ങൾ, 5.
സെക്ഷനിംഗ് പ്രക്രിയ കൂടാതെ തന്നെ 3D എപ്പിത്തീലിയൽ മൈക്രോസ്ട്രക്ചർ ശരിയാക്കാനും ദൃശ്യവൽക്കരിക്കാനും കഴിയുന്നതിനാൽ, സ്പേഷ്യൽ ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റോമിക്സിലും ഉയർന്ന റെസല്യൂഷനിലോ സൂപ്പർ-റെസല്യൂഷനിലോ ഇമേജിംഗിലോ പ്രവർത്തിക്കുന്ന കാഴ്ചക്കാർക്ക് എപ്പിത്തീലിയൽ നിച്ചുകളിലെ ജീനുകളുടെയും പ്രോട്ടീനുകളുടെയും സ്പേഷ്യോടെമ്പറൽ ഡൈനാമിക്സിന്റെ ഞങ്ങളുടെ മാപ്പിംഗിൽ താൽപ്പര്യമുണ്ടാകാം. സാങ്കേതികവിദ്യയിൽ താൽപ്പര്യമുണ്ട്. സൂക്ഷ്മജീവ അല്ലെങ്കിൽ രോഗപ്രതിരോധ ഉത്തേജനങ്ങളോടുള്ള പ്രതികരണം. കൂടാതെ, ഗട്ട് ഹോമിയോസ്റ്റാസിസിനെ ഏകോപിപ്പിക്കുന്ന രേഖാംശ ഹോസ്റ്റ്-മൈക്രോബയോം ക്രോസ്‌സ്റ്റാക്ക് 10, 14, പ്രത്യേകിച്ച് ഗട്ട്-ഓൺ-എ-ചിപ്പിൽ, വിവിധ സൂക്ഷ്മജീവ സ്പീഷീസുകൾ, സൂക്ഷ്മജീവ സമൂഹങ്ങൾ അല്ലെങ്കിൽ ഫെക്കൽ മൈക്രോബയോട്ട എന്നിവ സഹ-സംസ്കരിക്കുന്നതിലൂടെ 3D കുടൽ മ്യൂക്കോസൽ പാളിയിൽ സ്ഥാപിക്കാൻ കഴിയും. പ്ലാറ്റ്‌ഫോമിൽ. മ്യൂക്കോസൽ ഇമ്മ്യൂണോളജി, ഗ്യാസ്ട്രോഎൻട്രോളജി, ഹ്യൂമൻ മൈക്രോബയോം, കൾച്ചറോമിക്സ്, ക്ലിനിക്കൽ മൈക്രോബയോളജി എന്നിവ പഠിക്കുന്ന, ലബോറട്ടറിയിൽ മുമ്പ് സംസ്ക്കരിക്കാത്ത ഗട്ട് മൈക്രോബയോട്ട വളർത്താൻ ശ്രമിക്കുന്ന പ്രേക്ഷകർക്ക് ഈ സമീപനം പ്രത്യേകിച്ചും ആകർഷകമാണ്. 24, 96 അല്ലെങ്കിൽ 384 കിണർ പ്ലേറ്റുകളിലെ മൾട്ടിവെൽ ഇൻസേർട്ടുകൾ പോലുള്ള സ്കേലബിൾ കൾച്ചർ ഫോർമാറ്റുകളിലേക്ക് ഞങ്ങളുടെ ഇൻ വിട്രോ മോർഫോജെനിസിസ് പ്രോട്ടോക്കോൾ പൊരുത്തപ്പെടുത്താൻ കഴിയുമെങ്കിൽ, ബാസോലാറ്ററൽ കമ്പാർട്ടുമെന്റുകൾ തുടർച്ചയായി നിറയ്ക്കുന്ന ഫാർമസ്യൂട്ടിക്കൽ, ബയോമെഡിക്കൽ അല്ലെങ്കിൽ ഹൈ-ത്രൂപുട്ട് സ്ക്രീനിംഗ് അല്ലെങ്കിൽ വാലിഡേഷൻ പ്ലാറ്റ്‌ഫോമുകൾ ഭക്ഷ്യ വ്യവസായത്തിനായി വികസിപ്പിക്കുന്നവർക്കും പ്രോട്ടോക്കോൾ പ്രചരിപ്പിക്കാൻ കഴിയും. തത്വത്തിന്റെ തെളിവായി, 24-കിണർ പ്ലേറ്റ് ഫോർമാറ്റിലേക്ക് സ്കേലബിൾ ചെയ്യാവുന്ന ഒരു മൾട്ടിപ്ലക്സ് ഹൈ-ത്രൂപുട്ട് മോർഫോജെനിസിസ് സിസ്റ്റത്തിന്റെ സാധ്യത ഞങ്ങൾ അടുത്തിടെ തെളിയിച്ചു. കൂടാതെ, ഒന്നിലധികം അവയവ-ഓൺ-എ-ചിപ്പ് ഉൽപ്പന്നങ്ങൾ വാണിജ്യവൽക്കരിച്ചിട്ടുണ്ട്16,17,18. അതിനാൽ, മരുന്നുകൾ പരീക്ഷിക്കുന്നതിനായി ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റോമിക് തലത്തിൽ ഇൻ വിട്രോ ഗട്ട് മോർഫോജെനിസിസിന്റെ സെല്ലുലാർ റീപ്രോഗ്രാമിംഗ് മനസ്സിലാക്കാൻ നിരവധി ഗവേഷണ ലബോറട്ടറികൾ, വ്യവസായം അല്ലെങ്കിൽ ഗവൺമെന്റ്, റെഗുലേറ്ററി ഏജൻസികൾ എന്നിവയ്ക്ക് ഞങ്ങളുടെ ഇൻ വിട്രോ മോർഫോജെനിസിസ് രീതിയുടെ സാധൂകരണം ത്വരിതപ്പെടുത്താനും സാധ്യതയുള്ള രീതിയിൽ സ്വീകരിക്കാനും കഴിയും. അല്ലെങ്കിൽ ബയോതെറാപ്പിറ്റിക്സ് 3D ഗട്ട് സറോഗേറ്റുകൾ ഉപയോഗിച്ചോ അല്ലെങ്കിൽ ഗട്ട് മോർഫോജെനിസിസ് പ്രക്രിയയുടെ പുനരുൽപാദനക്ഷമത വിലയിരുത്തുന്നതിന് കസ്റ്റം അല്ലെങ്കിൽ കൊമേഴ്‌സ്യൽ ഓർഗൻ-ഓൺ-എ-ചിപ്പ് മോഡലുകൾ ഉപയോഗിച്ചോ മയക്കുമരുന്ന് കാൻഡിഡേറ്റുകളുടെ ആഗിരണവും ഗതാഗതവും വിലയിരുത്തി.
ഇൻ വിട്രോയിൽ 3D മോർഫോജെനിസിസ് പ്രേരിപ്പിക്കുന്നതിന് നടപ്പിലാക്കാവുന്ന പ്രോട്ടോക്കോളുകളുടെ അഭാവം മൂലമാണ് കുടൽ എപ്പിത്തീലിയൽ മോർഫോജെനിസിസ് പഠിക്കാൻ പരിമിതമായ എണ്ണം മനുഷ്യ-പ്രസക്തമായ പരീക്ഷണ മാതൃകകൾ ഉപയോഗിച്ചിരിക്കുന്നത്. വാസ്തവത്തിൽ, ഗട്ട് മോർഫോജെനിസിസിനെക്കുറിച്ചുള്ള നിലവിലുള്ള അറിവിന്റെ ഭൂരിഭാഗവും മൃഗ പഠനങ്ങളെ അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ളതാണ് (ഉദാ: സീബ്രാഫിഷ്20, എലികൾ21 അല്ലെങ്കിൽ കോഴികൾ22). എന്നിരുന്നാലും, അവ അധ്വാനവും ചെലവേറിയതുമാണ്, ധാർമ്മികമായി സംശയാസ്പദമാകാം, ഏറ്റവും പ്രധാനമായി, മനുഷ്യ വികസന പ്രക്രിയകളെ കൃത്യമായി നിർണ്ണയിക്കുന്നില്ല. മൾട്ടി-വേ സ്കെയിലബിൾ രീതിയിൽ പരീക്ഷിക്കാനുള്ള കഴിവിലും ഈ മോഡലുകൾ വളരെ പരിമിതമാണ്. അതിനാൽ, ഇൻ വിട്രോയിൽ 3D ടിഷ്യു ഘടനകളെ പുനരുജ്ജീവിപ്പിക്കുന്നതിനുള്ള ഞങ്ങളുടെ പ്രോട്ടോക്കോൾ വിവോ അനിമൽ മോഡലുകളിലും മറ്റ് പരമ്പരാഗത സ്റ്റാറ്റിക് 2D സെൽ കൾച്ചർ മോഡലുകളിലും മികച്ച പ്രകടനം കാഴ്ചവയ്ക്കുന്നു. മുമ്പ് വിവരിച്ചതുപോലെ, 3D എപ്പിത്തീലിയൽ ഘടനകൾ ഉപയോഗിക്കുന്നത് വിവിധ മ്യൂക്കോസൽ അല്ലെങ്കിൽ രോഗപ്രതിരോധ ഉത്തേജനങ്ങൾക്ക് മറുപടിയായി ക്രിപ്റ്റ്-വില്ലസ് അച്ചുതണ്ടിലെ വ്യത്യസ്ത കോശങ്ങളുടെ സ്പേഷ്യൽ ലോക്കലൈസേഷൻ പരിശോധിക്കാൻ ഞങ്ങളെ അനുവദിച്ചു. 3D എപ്പിത്തീലിയൽ പാളികൾക്ക് സൂക്ഷ്മജീവി കോശങ്ങൾ സ്പേഷ്യൽ നിച്ചുകൾ രൂപപ്പെടുത്തുന്നതിനും ഹോസ്റ്റ് ഘടകങ്ങൾക്ക് (ഉദാ: ആന്തരികവും ബാഹ്യവുമായ മ്യൂക്കസ് പാളികൾ,) പ്രതികരണമായി പാരിസ്ഥിതിക പരിണാമത്തിനും എങ്ങനെ മത്സരിക്കുന്നുവെന്ന് പഠിക്കാൻ ഒരു ഇടം നൽകാൻ കഴിയും. IgA യുടെയും ആന്റിമൈക്രോബയൽ പെപ്റ്റൈഡുകളുടെയും സ്രവണം).കൂടാതെ, ഗട്ട് മൈക്രോബയോട്ട അതിന്റെ കമ്മ്യൂണിറ്റികളെ എങ്ങനെ രൂപപ്പെടുത്തുന്നുവെന്നും ബേസൽ ക്രിപ്റ്റുകളിലെ സെല്ലുലാർ ഓർഗനൈസേഷനെയും സ്റ്റെം സെൽ മാടങ്ങളെയും രൂപപ്പെടുത്തുന്ന സൂക്ഷ്മജീവ മെറ്റബോളൈറ്റുകളെ (ഉദാ: ഷോർട്ട്-ചെയിൻ ഫാറ്റി ആസിഡുകൾ) സിനർജിസ്റ്റിക് ആയി ഉത്പാദിപ്പിക്കുന്നുവെന്നും മനസ്സിലാക്കാൻ 3D എപ്പിത്തീലിയൽ രൂപഘടന നമ്മെ സഹായിക്കും. 3D എപ്പിത്തീലിയൽ പാളികൾ ഇൻ വിട്രോയിൽ സ്ഥാപിക്കപ്പെടുമ്പോൾ മാത്രമേ ഈ സവിശേഷതകൾ തെളിയിക്കാൻ കഴിയൂ.
3D കുടൽ എപ്പിത്തീലിയൽ ഘടനകൾ സൃഷ്ടിക്കുന്നതിനുള്ള ഞങ്ങളുടെ രീതിക്ക് പുറമേ, നിരവധി ഇൻ വിട്രോ രീതികളുണ്ട്. നിർദ്ദിഷ്ട മോർഫോജൻ സാഹചര്യങ്ങളിൽ കുടൽ സ്റ്റെം സെല്ലുകളുടെ കൃഷിയെ അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള ഒരു അത്യാധുനിക ടിഷ്യു എഞ്ചിനീയറിംഗ് സാങ്കേതികതയാണ് കുടൽ ഓർഗനോയിഡ് കൾച്ചർ. 23,24,25. എന്നിരുന്നാലും, ഗതാഗത വിശകലനത്തിനോ ഹോസ്റ്റ്-മൈക്രോബയോം കോ-കൾച്ചറുകൾക്കോ ​​വേണ്ടി 3D ഓർഗനോയിഡ് മോഡലുകളുടെ ഉപയോഗം പലപ്പോഴും വെല്ലുവിളി നിറഞ്ഞതാണ്, കാരണം കുടൽ ല്യൂമെൻ ഓർഗനോയിഡിനുള്ളിൽ ഉൾക്കൊള്ളുന്നു, അതിനാൽ, മൈക്രോബയൽ സെല്ലുകൾ അല്ലെങ്കിൽ എക്സോജനസ് ആന്റിജനുകൾ പോലുള്ള ലുമിനൽ ഘടകങ്ങളുടെ ആമുഖം പരിമിതമാണ്. ഒരു മൈക്രോഇൻജെക്ടർ ഉപയോഗിച്ച് ഓർഗനോയിഡ് ല്യൂമനുകളിലേക്കുള്ള പ്രവേശനം മെച്ചപ്പെടുത്താൻ കഴിയും, 26,27 എന്നാൽ ഈ രീതി ആക്രമണാത്മകവും അധ്വാനം ആവശ്യമുള്ളതുമാണ്, കൂടാതെ നിർവഹിക്കുന്നതിന് പ്രത്യേക അറിവ് ആവശ്യമാണ്. കൂടാതെ, സ്റ്റാറ്റിക് സാഹചര്യങ്ങളിൽ ഹൈഡ്രോജൽ സ്കാഫോൾഡുകളിൽ പരിപാലിക്കുന്ന പരമ്പരാഗത ഓർഗനോയിഡ് കൾച്ചറുകൾ വിവോ ബയോമെക്കാനിക്സിൽ സജീവമായി പ്രതിഫലിപ്പിക്കുന്നില്ല.
നിരവധി ഗവേഷണ ഗ്രൂപ്പുകൾ ഉപയോഗിക്കുന്ന മറ്റ് സമീപനങ്ങൾ, ജെൽ പ്രതലത്തിൽ ഒറ്റപ്പെട്ട മനുഷ്യ കുടൽ കോശങ്ങൾ സംസ്കരിച്ചുകൊണ്ട് ഗട്ട് എപ്പിത്തീലിയൽ ഘടനയെ അനുകരിക്കുന്നതിന് പ്രീസ്ട്രക്ചർ ചെയ്ത 3D ഹൈഡ്രോജൽ സ്കാഫോൾഡുകൾ ഉപയോഗിക്കുന്നു. 3D-പ്രിന്റഡ്, മൈക്രോ-മില്ലഡ്, അല്ലെങ്കിൽ ലിത്തോഗ്രാഫിക്കലി ഫാബ്രിക്കേറ്റഡ് മോൾഡുകൾ ഉപയോഗിച്ച് ഹൈഡ്രോജൽ സ്കാഫോൾഡുകൾ നിർമ്മിക്കുക. ഫിസിയോളജിക്കലി പ്രസക്തമായ മോർഫോജൻ ഗ്രേഡിയന്റുകളുള്ള ഇൻ വിട്രോയിലെ ഒറ്റപ്പെട്ട എപ്പിത്തീലിയൽ കോശങ്ങളുടെ സ്വയം-സംഘടിത ക്രമീകരണം ഈ രീതി കാണിക്കുന്നു, സ്കാഫോൾഡിൽ സ്ട്രോമൽ കോശങ്ങൾ ഉൾപ്പെടുത്തി ഉയർന്ന വീക്ഷണാനുപാത എപ്പിത്തീലിയൽ ഘടനയും സ്ട്രോമ-എപ്പിത്തീലിയൽ ക്രോസ്‌സ്റ്റാക്കും സ്ഥാപിക്കുന്നു. എന്നിരുന്നാലും, പ്രീസ്ട്രക്ചർ ചെയ്ത സ്കാഫോൾഡുകളുടെ സ്വഭാവം സ്വയമേവയുള്ള മോർഫോജെനെറ്റിക് പ്രക്രിയയുടെ പ്രദർശനം തടഞ്ഞേക്കാം. കുടൽ കോശങ്ങൾക്ക് മോർഫോജെനിസിസിന് വിധേയമാകാനും ഫിസിയോളജിക്കൽ പ്രവർത്തനം നേടാനും ആവശ്യമായ ദ്രാവക ഷിയർ സമ്മർദ്ദം ഇല്ലാത്തതിനാൽ, ഈ മോഡലുകൾ ഡൈനാമിക് ലുമിനൽ അല്ലെങ്കിൽ ഇന്റർസ്റ്റീഷ്യൽ ഫ്ലോ നൽകുന്നില്ല. മറ്റൊരു സമീപകാല പഠനം ഒരു മൈക്രോഫ്ലൂയിഡിക് പ്ലാറ്റ്‌ഫോമിൽ ഹൈഡ്രോജൽ സ്കാഫോൾഡുകളും ലേസർ-എച്ചിംഗ് ടെക്നിക്കുകൾ ഉപയോഗിച്ച് പാറ്റേൺ ചെയ്ത കുടൽ എപ്പിത്തീലിയൽ ഘടനകളും ഉപയോഗിച്ചു. കുടൽ ട്യൂബുലാർ ഘടനകൾ രൂപപ്പെടുത്തുന്നതിന് മൗസ് ഇൻസ്റ്റൈനൽ ഓർഗനോയിഡുകൾ എച്ചഡ് പാറ്റേണുകൾ പിന്തുടരുന്നു, കൂടാതെ മൈക്രോഫ്ലൂയിഡിക്സ് ഉപയോഗിച്ച് ഇൻട്രാലുമിനൽ ദ്രാവക പ്രവാഹം പുനഃക്രമീകരിക്കാൻ കഴിയും. മൊഡ്യൂൾ. എന്നിരുന്നാലും, ഈ മോഡൽ സ്വയമേവയുള്ള മോർഫോജെനെറ്റിക് പ്രക്രിയകൾ പ്രദർശിപ്പിക്കുകയോ ഗട്ട് മെക്കാനിയോബയോളജിക്കൽ ചലനങ്ങൾ ഉൾപ്പെടുത്തുകയോ ചെയ്യുന്നില്ല. ഒരേ ഗ്രൂപ്പിൽ നിന്നുള്ള 3D പ്രിന്റിംഗ് ടെക്നിക്കുകൾക്ക് സ്വയമേവയുള്ള മോർഫോജെനെറ്റിക് പ്രക്രിയകളുള്ള മിനിയേച്ചർ ഗട്ട് ട്യൂബുകൾ സൃഷ്ടിക്കാൻ കഴിഞ്ഞു. ട്യൂബിനുള്ളിലെ വ്യത്യസ്ത ഗട്ട് സെഗ്‌മെന്റുകളുടെ സങ്കീർണ്ണമായ നിർമ്മാണം ഉണ്ടായിരുന്നിട്ടും, ഈ മോഡലിന് ലുമിനൽ ദ്രാവക പ്രവാഹവും മെക്കാനിക്കൽ രൂപഭേദവും ഇല്ല. കൂടാതെ, മോഡൽ പ്രവർത്തനക്ഷമത പരിമിതമായിരിക്കാം, പ്രത്യേകിച്ച് ബയോപ്രിന്റിംഗ് പ്രക്രിയ പൂർത്തിയായ ശേഷം, പരീക്ഷണാത്മക സാഹചര്യങ്ങളോ സെൽ-ടു-സെൽ ഇടപെടലുകളോ അസ്വസ്ഥമാക്കുന്നു. പകരം, ഞങ്ങളുടെ നിർദ്ദിഷ്ട പ്രോട്ടോക്കോൾ സ്വയമേവയുള്ള ഗട്ട് മോർഫോജെനെസിസ്, ഫിസിയോളജിക്കലി പ്രസക്തമായ ഷിയർ സ്ട്രെസ്, ഗട്ട് മോട്ടിലിറ്റിയെ അനുകരിക്കുന്ന ബയോമെക്കാനിക്സ്, സ്വതന്ത്ര അഗ്രഭാഗ, ബാസോലാറ്ററൽ കമ്പാർട്ടുമെന്റുകളുടെ പ്രവേശനക്ഷമത, മോഡുലാരിറ്റിയുടെ സങ്കീർണ്ണമായ ജൈവ സൂക്ഷ്മ പരിസ്ഥിതികളുടെ പുനഃസൃഷ്ടി എന്നിവ നൽകുന്നു. അതിനാൽ, നിലവിലുള്ള രീതികളുടെ വെല്ലുവിളികളെ മറികടക്കാൻ ഞങ്ങളുടെ ഇൻ വിട്രോ 3D മോർഫോജെനെസിസ് പ്രോട്ടോക്കോൾ ഒരു പൂരക സമീപനം നൽകിയേക്കാം.
ഞങ്ങളുടെ പ്രോട്ടോക്കോൾ പൂർണ്ണമായും 3D എപ്പിത്തീലിയൽ മോർഫോജെനിസിസിൽ ശ്രദ്ധ കേന്ദ്രീകരിച്ചിരിക്കുന്നു, സംസ്കാരത്തിൽ എപ്പിത്തീലിയൽ കോശങ്ങൾ മാത്രമേ ഉള്ളൂ, മെസെൻചൈമൽ കോശങ്ങൾ, എൻഡോതെലിയൽ കോശങ്ങൾ, രോഗപ്രതിരോധ കോശങ്ങൾ തുടങ്ങിയ ചുറ്റുമുള്ള മറ്റ് തരത്തിലുള്ള കോശങ്ങൾ ഇല്ല. മുമ്പ് വിവരിച്ചതുപോലെ, അവതരിപ്പിച്ച മാധ്യമത്തിന്റെ ബാസോലാറ്ററൽ വശത്ത് സ്രവിക്കുന്ന മോർഫോജൻ ഇൻഹിബിറ്ററുകൾ നീക്കം ചെയ്തുകൊണ്ട് എപ്പിത്തീലിയൽ മോർഫോജെനിസിസിന്റെ ഇൻഡക്ഷൻ ആണ് ഞങ്ങളുടെ പ്രോട്ടോക്കോളിന്റെ കാതൽ. നമ്മുടെ ഗട്ട്-ഓൺ-എ-ചിപ്പിന്റെയും ഹൈബ്രിഡ്-ഓൺ-എ-ചിപ്പിന്റെയും ശക്തമായ മോഡുലാരിറ്റി, തരംഗദൈർഘ്യമുള്ള 3D എപ്പിത്തീലിയൽ പാളി പുനർനിർമ്മിക്കാൻ നമ്മെ അനുവദിക്കുമ്പോൾ, എപ്പിത്തീലിയൽ-മെസെൻചൈമൽ ഇടപെടലുകൾ പോലുള്ള അധിക ജൈവ സങ്കീർണ്ണതകൾ33,34, എക്സ്ട്രാ സെല്ലുലാർ മാട്രിക്സ് (ECM) നിക്ഷേപം35, ഞങ്ങളുടെ മാതൃകയിൽ, ബേസൽ ക്രിപ്റ്റുകളിൽ സ്റ്റെം സെൽ മാടം കൈമാറുന്ന ക്രിപ്റ്റ്-വില്ലസ് സവിശേഷതകൾ എന്നിവ കൂടുതൽ പരിഗണിക്കേണ്ടതുണ്ട്. മെസെൻചൈമിലെ സ്ട്രോമൽ കോശങ്ങൾ (ഉദാ. ഫൈബ്രോബ്ലാസ്റ്റുകൾ) ECM പ്രോട്ടീനുകളുടെ ഉത്പാദനത്തിലും ഇൻസ്റ്റസ്റ്റൽ മോർഫോജെനിസിസിന്റെ നിയന്ത്രണത്തിലും ഒരു പ്രധാന പങ്ക് വഹിക്കുന്നു35,37,38. ഞങ്ങളുടെ മോഡലിലേക്ക് മെസെൻചൈമൽ കോശങ്ങൾ ചേർക്കുന്നത് മോർഫോജെനെറ്റിക് പ്രക്രിയയെ വർദ്ധിപ്പിച്ചു. കോശ അറ്റാച്ച്മെന്റ് കാര്യക്ഷമതയും. കുടൽ സൂക്ഷ്മ പരിസ്ഥിതിയിൽ തന്മാത്രാ ഗതാഗതം39, രോഗപ്രതിരോധ കോശ നിയമനം40 എന്നിവ നിയന്ത്രിക്കുന്നതിൽ എൻഡോതെലിയൽ പാളി (അതായത്, കാപ്പിലറികൾ അല്ലെങ്കിൽ ലിംഫറ്റിക്സ്) ഒരു പ്രധാന പങ്ക് വഹിക്കുന്നു. കൂടാതെ, ടിഷ്യു മോഡലുകൾ ഒന്നിലധികം അവയവ ഇടപെടലുകൾ പ്രദർശിപ്പിക്കുന്നതിന് രൂപകൽപ്പന ചെയ്യുമ്പോൾ ടിഷ്യു മോഡലുകൾക്കിടയിൽ ബന്ധിപ്പിക്കാൻ കഴിയുന്ന വാസ്കുലേച്ചർ ഘടകങ്ങൾ ഒരു മുൻവ്യവസ്ഥയാണ്. അതിനാൽ, അവയവ-തല റെസല്യൂഷനോടുകൂടിയ കൂടുതൽ കൃത്യമായ ഫിസിയോളജിക്കൽ സവിശേഷതകൾ മാതൃകയാക്കാൻ എൻഡോതെലിയൽ സെല്ലുകൾ ഉൾപ്പെടുത്തേണ്ടി വന്നേക്കാം. കുടൽ രോഗത്തെ അനുകരിക്കുന്ന സാഹചര്യത്തിൽ സഹജമായ രോഗപ്രതിരോധ പ്രതികരണങ്ങൾ, ആന്റിജൻ അവതരണം, സഹജമായ അഡാപ്റ്റീവ് രോഗപ്രതിരോധ ക്രോസ്‌സ്റ്റോക്ക്, ടിഷ്യു-നിർദ്ദിഷ്ട പ്രതിരോധശേഷി എന്നിവ പ്രദർശിപ്പിക്കുന്നതിന് രോഗിയിൽ നിന്ന് ഉരുത്തിരിഞ്ഞ രോഗപ്രതിരോധ കോശങ്ങൾ അത്യാവശ്യമാണ്.
ഗട്ട്-ഓൺ-എ-ചിപ്പിനെ അപേക്ഷിച്ച് ഹൈബ്രിഡ് ചിപ്പുകളുടെ ഉപയോഗം കൂടുതൽ ലളിതമാണ്, കാരണം ഉപകരണ സജ്ജീകരണം ലളിതമാണ്, ട്രാൻസ്‌വെൽ ഇൻസെർട്ടുകളുടെ ഉപയോഗം ഗട്ട് എപ്പിത്തീലിയത്തിന്റെ സ്കെയിലബിൾ കൾച്ചർ അനുവദിക്കുന്നു. എന്നിരുന്നാലും, പോളിസ്റ്റർ മെംബ്രണുകളുള്ള വാണിജ്യപരമായി ലഭ്യമായ ട്രാൻസ്‌വെൽ ഇൻസെർട്ടുകൾ ഇലാസ്റ്റിക് അല്ല, പെരിസ്റ്റാൽറ്റിക് പോലുള്ള ചലനങ്ങളെ അനുകരിക്കാൻ കഴിയില്ല. കൂടാതെ, ഹൈബ്രിഡ് ചിപ്പിൽ സ്ഥാപിച്ചിരിക്കുന്ന ട്രാൻസ്‌വെൽ ഇൻസെർട്ടിന്റെ അഗ്രഭാഗം അഗ്രഭാഗത്ത് ഷിയർ സമ്മർദ്ദമില്ലാതെ നിശ്ചലമായി തുടർന്നു. വ്യക്തമായും, അഗ്രഭാഗ കമ്പാർട്ടുമെന്റിലെ സ്റ്റാറ്റിക് ഗുണങ്ങൾ ഹൈബ്രിഡ് ചിപ്പുകളിൽ ദീർഘകാല ബാക്ടീരിയൽ കോ-കൾച്ചർ അപൂർവ്വമായി മാത്രമേ പ്രാപ്തമാക്കുന്നുള്ളൂ. ഹൈബ്രിഡ് ചിപ്പുകൾ ഉപയോഗിക്കുമ്പോൾ ട്രാൻസ്‌വെൽ ഇൻസെർട്ടുകളിൽ നമുക്ക് 3D മോർഫോജെനിസിസ് ശക്തമായി പ്രേരിപ്പിക്കാൻ കഴിയുമെങ്കിലും, ഫിസിയോളജിക്കലി പ്രസക്തമായ ബയോമെക്കാനിക്സിന്റെയും അഗ്രഭാഗ ദ്രാവക പ്രവാഹത്തിന്റെയും കുറവ് സാധ്യതയുള്ള ആപ്ലിക്കേഷനുകൾക്കായി ഹൈബ്രിഡ് ചിപ്പ് പ്ലാറ്റ്‌ഫോമുകളുടെ സാധ്യതയെ പരിമിതപ്പെടുത്തിയേക്കാം.
ഗട്ട്-ഓൺ-എ-ചിപ്പ്, ഹൈബ്രിഡ്-ഓൺ-എ-ചിപ്പ് സംസ്കാരങ്ങളിൽ മനുഷ്യ ക്രിപ്റ്റ്-വില്ലസ് അച്ചുതണ്ടിന്റെ പൂർണ്ണ തോതിലുള്ള പുനർനിർമ്മാണങ്ങൾ പൂർണ്ണമായി സ്ഥാപിക്കപ്പെട്ടിട്ടില്ല. ഒരു എപ്പിത്തീലിയൽ മോണോലെയറിൽ നിന്നാണ് മോർഫോജെനിസിസ് ആരംഭിക്കുന്നത് എന്നതിനാൽ, 3D മൈക്രോആർക്കിടെക്ചറുകൾ ഇൻ വിവോയിലെ ക്രിപ്റ്റുകളുമായി രൂപാന്തരപരമായ സമാനത നൽകണമെന്നില്ല. മൈക്രോ എഞ്ചിനീയറിംഗ് ചെയ്ത 3D എപ്പിത്തീലിയത്തിലെ ബേസൽ ക്രിപ്റ്റ് ഡൊമെയ്‌നിനടുത്തുള്ള വ്യാപന കോശ ജനസംഖ്യയെ ഞങ്ങൾ ചിത്രീകരിച്ചിട്ടുണ്ടെങ്കിലും, ക്രിപ്റ്റും വില്ലസ് പ്രദേശങ്ങളും വ്യക്തമായി വേർതിരിച്ചിട്ടില്ല. ചിപ്പിലെ ഉയർന്ന മുകളിലെ ചാനലുകൾ മൈക്രോ എഞ്ചിനീയറിംഗ് ചെയ്ത എപ്പിത്തീലിയത്തിന്റെ ഉയരം വർദ്ധിപ്പിക്കുന്നതിലേക്ക് നയിച്ചെങ്കിലും, പരമാവധി ഉയരം ഇപ്പോഴും ~300–400 µm ആയി പരിമിതപ്പെടുത്തിയിരിക്കുന്നു. ചെറുതും വലുതുമായ കുടലുകളിലെ മനുഷ്യ കുടൽ ക്രിപ്റ്റുകളുടെ യഥാർത്ഥ ആഴം യഥാക്രമം ~135 µm ഉം ~400 µm ഉം ആണ്, ചെറുകുടൽ വില്ലിയുടെ ഉയരം ~600 µm41 ഉം ആണ്.
ഒരു ഇമേജിംഗ് കാഴ്ചപ്പാടിൽ, 3D മൈക്രോ ആർക്കിടെക്ചറുകളുടെ ഇൻ സിറ്റു സൂപ്പർ-റെസല്യൂഷൻ ഇമേജിംഗ് ഒരു ചിപ്പിലെ ഗട്ടിലേക്ക് പരിമിതപ്പെടുത്തിയേക്കാം, കാരണം ഒബ്ജക്ടീവ് ലെൻസിൽ നിന്ന് എപ്പിത്തീലിയൽ പാളിയിലേക്കുള്ള ആവശ്യമായ പ്രവർത്തന ദൂരം കുറച്ച് മില്ലിമീറ്ററുകളുടെ ക്രമത്തിലാണ്. ഈ പ്രശ്നം മറികടക്കാൻ, ഒരു വിദൂര ലക്ഷ്യം ആവശ്യമായി വന്നേക്കാം. കൂടാതെ, PDMS-ന്റെ ഉയർന്ന ഇലാസ്തികത കാരണം ഇമേജിംഗ് സ്പെസിമെൻ തയ്യാറാക്കലിനായി നേർത്ത ഭാഗങ്ങൾ നിർമ്മിക്കുന്നത് വെല്ലുവിളി നിറഞ്ഞതാണ്. കൂടാതെ, ഒരു ചിപ്പിലെ ഗട്ടിന്റെ ലെയർ-ബൈ-ലെയർ മൈക്രോഫാബ്രിക്കേഷനിൽ ഓരോ പാളിക്കും ഇടയിൽ സ്ഥിരമായ അഡീഷൻ ഉൾപ്പെടുന്നതിനാൽ, എപ്പിത്തീലിയൽ പാളിയുടെ ഉപരിതല ഘടന പരിശോധിക്കുന്നതിന് മുകളിലെ പാളി തുറക്കുകയോ നീക്കം ചെയ്യുകയോ ചെയ്യുന്നത് വളരെ വെല്ലുവിളി നിറഞ്ഞതാണ്. ഉദാഹരണത്തിന്, ഒരു സ്കാനിംഗ് ഇലക്ട്രോൺ മൈക്രോസ്കോപ്പ് (SEM) ഉപയോഗിച്ച്.
ഹൈഡ്രോഫോബിക് ചെറിയ തന്മാത്രകളെ കൈകാര്യം ചെയ്യുന്ന മൈക്രോഫ്ലൂയിഡിക് അധിഷ്ഠിത പഠനങ്ങളിൽ PDMS ന്റെ ഹൈഡ്രോഫോബിസിറ്റി ഒരു പരിമിത ഘടകമാണ്, കാരണം PDMS ന് അത്തരം ഹൈഡ്രോഫോബിക് തന്മാത്രകളെ പ്രത്യേകമായി ആഗിരണം ചെയ്യാൻ കഴിയും. മറ്റ് പോളിമെറിക് വസ്തുക്കളുമായി PDMS-ന് പകരമുള്ളവ പരിഗണിക്കാവുന്നതാണ്. പകരമായി, ഹൈഡ്രോഫോബിക് തന്മാത്രകളുടെ ആഗിരണം കുറയ്ക്കുന്നതിന് PDMS-ന്റെ ഉപരിതല പരിഷ്ക്കരണം (ഉദാ: ലിപ്പോഫിലിക് വസ്തുക്കൾ 42 അല്ലെങ്കിൽ പോളി (എഥിലീൻ ഗ്ലൈക്കോൾ) 43 എന്നിവ ഉപയോഗിച്ച് പൂശുന്നത്) പരിഗണിക്കാവുന്നതാണ്.
അവസാനമായി, ഉയർന്ന ത്രൂപുട്ട് സ്ക്രീനിംഗ് അല്ലെങ്കിൽ "എല്ലാവർക്കും യോജിക്കുന്ന" ഉപയോക്തൃ-സൗഹൃദ പരീക്ഷണ പ്ലാറ്റ്‌ഫോം നൽകുന്നതിൽ ഞങ്ങളുടെ രീതിയെ നന്നായി ചിത്രീകരിച്ചിട്ടില്ല. നിലവിലെ പ്രോട്ടോക്കോളിന് ഓരോ മൈക്രോ ഉപകരണത്തിനും ഒരു സിറിഞ്ച് പമ്പ് ആവശ്യമാണ്, ഇത് ഒരു CO2 ഇൻകുബേറ്ററിൽ സ്ഥലം എടുക്കുകയും വലിയ തോതിലുള്ള പരീക്ഷണങ്ങളെ തടയുകയും ചെയ്യുന്നു. നൂതനമായ കൾച്ചർ ഫോർമാറ്റുകളുടെ സ്കേലബിളിറ്റി (ഉദാഹരണത്തിന്, തുടർച്ചയായ പുനർനിർമ്മാണവും ബാസോലാറ്ററൽ മീഡിയ നീക്കം ചെയ്യലും അനുവദിക്കുന്ന 24-കിണർ, 96-കിണർ, അല്ലെങ്കിൽ 384-കിണർ പോറസ് ഇൻസെർട്ടുകൾ) വഴി ഈ പരിമിതി ഗണ്യമായി മെച്ചപ്പെടുത്താൻ കഴിയും.
മനുഷ്യ കുടൽ എപ്പിത്തീലിയത്തിന്റെ 3D മോർഫോജെനിസിസ് ഇൻ വിട്രോയിൽ പ്രേരിപ്പിക്കുന്നതിന്, ഒരു ല്യൂമെൻ-കാപ്പിലറി ഇന്റർഫേസ് സൃഷ്ടിക്കുന്നതിന്, രണ്ട് സമാന്തര മൈക്രോചാനലുകളും അതിനിടയിൽ ഒരു ഇലാസ്റ്റിക് പോറസ് മെംബ്രണും അടങ്ങിയ ഒരു മൈക്രോഫ്ലൂയിഡിക് ചിപ്പ് ഇൻസ്റ്റൈനൽ ഉപകരണം ഞങ്ങൾ ഉപയോഗിച്ചു. ട്രാൻസ്‌വെൽ ഇൻസെർട്ടുകളിൽ വളർത്തിയ ധ്രുവീകരിക്കപ്പെട്ട എപ്പിത്തീലിയൽ പാളികൾക്ക് കീഴിൽ തുടർച്ചയായ ബാസോലാറ്ററൽ ഒഴുക്ക് നൽകുന്ന ഒരു സിംഗിൾ-ചാനൽ മൈക്രോഫ്ലൂയിഡിക് ഉപകരണത്തിന്റെ (ഒരു ഹൈബ്രിഡ് ചിപ്പ്) ഉപയോഗവും ഞങ്ങൾ പ്രദർശിപ്പിച്ചു. രണ്ട് പ്ലാറ്റ്‌ഫോമുകളിലും, ബാസോലാറ്ററൽ കമ്പാർട്ടുമെന്റിൽ നിന്ന് മോർഫോജൻ എതിരാളികളെ നീക്കം ചെയ്യുന്നതിനായി ഒഴുക്കിന്റെ ദിശാസൂചന കൃത്രിമത്വം പ്രയോഗിച്ചുകൊണ്ട് വിവിധ മനുഷ്യ കുടൽ എപ്പിത്തീലിയൽ കോശങ്ങളുടെ മോർഫോജെനിസിസ് തെളിയിക്കാനാകും. മുഴുവൻ പരീക്ഷണ നടപടിക്രമത്തിലും (ചിത്രം 1) അഞ്ച് ഭാഗങ്ങൾ അടങ്ങിയിരിക്കുന്നു: (i) ഗട്ട് ചിപ്പിന്റെ മൈക്രോഫാബ്രിക്കേഷൻ അല്ലെങ്കിൽ ട്രാൻസ്‌വെൽ ഇൻസേർട്ടബിൾ ഹൈബ്രിഡ് ചിപ്പ് (ഘട്ടങ്ങൾ 1-5; ബോക്സ് 1), (ii) കുടൽ എപ്പിത്തീലിയൽ സെല്ലുകൾ (കാക്കോ-2 സെല്ലുകൾ) അല്ലെങ്കിൽ മനുഷ്യ കുടൽ ഓർഗനോയിഡുകൾ തയ്യാറാക്കൽ; ബോക്സുകൾ 2-5), (iii) കുടൽ ചിപ്പുകളിലോ ഹൈബ്രിഡ് ചിപ്പുകളിലോ കുടൽ എപ്പിത്തീലിയൽ കോശങ്ങളുടെ കൾച്ചർ (ഘട്ടങ്ങൾ 6-9), (iv) 3D എപ്പിത്തീലിയൽ മൈക്രോസ്ട്രക്ചറിനെ ചിത്രീകരിക്കുന്നതിന് ഇൻ വിട്രോയിൽ 3D മോർഫോജെനിസിസിന്റെ ഇൻഡക്ഷൻ (ഘട്ടം 10), (v) എന്നിവ (ഘട്ടങ്ങൾ 11-24). ഒടുവിൽ, എപ്പിത്തീലിയൽ മോർഫോജെനിസിസിനെ സ്പേഷ്യൽ, ടെമ്പറൽ, കണ്ടീഷണൽ അല്ലെങ്കിൽ പ്രൊസീജറൽ നിയന്ത്രണങ്ങളുമായി താരതമ്യം ചെയ്തുകൊണ്ട് ഇൻ വിട്രോ മോർഫോജെനിസിസിന്റെ ഫലപ്രാപ്തി സാധൂകരിക്കുന്നതിന് ഉചിതമായ ഒരു നിയന്ത്രണ ഗ്രൂപ്പ് (താഴെ കൂടുതൽ ചർച്ചചെയ്തു) രൂപകൽപ്പന ചെയ്‌തു.
ഞങ്ങൾ രണ്ട് വ്യത്യസ്ത കൾച്ചർ പ്ലാറ്റ്‌ഫോമുകൾ ഉപയോഗിച്ചു: നേരായ ചാനലുകളോ നോൺ-ലീനിയർ കൺവോൾട്ടഡ് ചാനലുകളോ ഉള്ള ഗട്ട്-ഓൺ-എ-ചിപ്പ്, അല്ലെങ്കിൽ ബോക്സ് 1-ൽ വിവരിച്ചിരിക്കുന്നതുപോലെ നിർമ്മിച്ച ഒരു മൈക്രോഫ്ലൂയിഡിക് ഉപകരണത്തിൽ ട്രാൻസ്‌വെൽ (TW) ഇൻസേർട്ടുകൾ അടങ്ങിയ ഹൈബ്രിഡ് ചിപ്പുകൾ, ഘട്ടം 1 -5. "ഡിവൈസ് ഫാബ്രിക്കേഷൻ" ഒരു സിംഗിൾ ചിപ്പ് അല്ലെങ്കിൽ ഒരു ഹൈബ്രിഡ് ചിപ്പ് നിർമ്മിക്കുന്നതിനുള്ള പ്രധാന ഘട്ടങ്ങൾ കാണിക്കുന്നു." മനുഷ്യ കുടൽ എപ്പിത്തീലിയൽ കോശങ്ങളുടെ സംസ്കാരം" ഈ പ്രോട്ടോക്കോളിൽ ഉപയോഗിക്കുന്ന സെൽ ഉറവിടം (കാക്കോ-2 അല്ലെങ്കിൽ മനുഷ്യ കുടൽ ഓർഗനോയിഡുകൾ) കൾച്ചർ നടപടിക്രമം വിശദീകരിക്കുന്നു." ഇൻ വിട്രോ മോർഫോജെനിസിസ്" ഒരു കുടൽ ചിപ്പിലോ ഒരു ഹൈബ്രിഡ് ചിപ്പിന്റെ ട്രാൻസ്‌വെൽ ഇൻസേർട്ടുകളിലോ കക്കോ-2 അല്ലെങ്കിൽ ഓർഗനോയിഡ്-ഉത്ഭവിച്ച എപ്പിത്തീലിയൽ കോശങ്ങൾ കൾച്ചർ ചെയ്യുന്നതിന്റെ മൊത്തത്തിലുള്ള ഘട്ടങ്ങൾ കാണിക്കുന്നു, തുടർന്ന് 3D മോർഫോജെനിസിസിന്റെ ഇൻഡക്ഷനും ഒരു സ്വഭാവ സവിശേഷതയുള്ള എപ്പിത്തീലിയൽ ഘടനയുടെ രൂപീകരണവും നടത്തുന്നു. പ്രോഗ്രാം സ്റ്റെപ്പ് നമ്പർ അല്ലെങ്കിൽ ബോക്സ് നമ്പർ ഓരോ അമ്പടയാളത്തിനും താഴെ പ്രദർശിപ്പിച്ചിരിക്കുന്നു. സ്ഥാപിതമായ കുടൽ എപ്പിത്തീലിയൽ പാളികൾ എങ്ങനെ ഉപയോഗിക്കാമെന്നതിന്റെ ഉദാഹരണങ്ങൾ ആപ്ലിക്കേഷൻ നൽകുന്നു, ഉദാഹരണത്തിന്, സെൽ ഡിഫറൻഷ്യേഷൻ സ്വഭാവരൂപീകരണം, ഗട്ട് ഫിസിയോളജി പഠനങ്ങൾ, ഹോസ്റ്റ്-മൈക്രോബയോം ആവാസവ്യവസ്ഥകളുടെ സ്ഥാപനം, രോഗം എന്നിവയിൽ. മോഡലിംഗ്. ഗട്ട് ചിപ്പിൽ ജനറേറ്റ് ചെയ്ത 3D കാക്കോ-2 എപ്പിത്തീലിയൽ പാളിയിൽ പ്രകടിപ്പിക്കുന്ന ന്യൂക്ലിയുകൾ, എഫ്-ആക്ടിൻ, എംയുസി2 എന്നിവ കാണിക്കുന്ന "സെൽ ഡിഫറൻഷ്യേഷൻ" ലെ ഇമ്മ്യൂണോഫ്ലൂറസെൻസ് ചിത്രങ്ങൾ. ഗോബ്ലറ്റ് കോശങ്ങളിലും മ്യൂക്കോസൽ പ്രതലങ്ങളിൽ നിന്ന് സ്രവിക്കുന്ന മ്യൂക്കസിലും എംയുസി2 സിഗ്നലിംഗ് ഉണ്ട്. ഗട്ട് ഫിസിയോളജിയിലെ ഫ്ലൂറസെന്റ് ചിത്രങ്ങൾ ഫ്ലൂറസെന്റ് ഗോതമ്പ് ജേം അഗ്ലൂട്ടിനിൻ ഉപയോഗിച്ച് സിയാലിക് ആസിഡിനും എൻ-അസെറ്റൈൽഗ്ലൂക്കോസാമൈൻ അവശിഷ്ടങ്ങൾക്കും വേണ്ടി സ്റ്റെയിനിംഗ് നടത്തുന്നതിലൂടെ ഉത്പാദിപ്പിക്കപ്പെടുന്ന മ്യൂക്കസ് കാണിക്കുന്നു. "ഹോസ്റ്റ്-മൈക്രോബ് കോ-കൾച്ചേഴ്‌സ്" ലെ രണ്ട് ഓവർലാപ്പിംഗ് ചിത്രങ്ങൾ ഒരു ചിപ്പിൽ കുടലിൽ പ്രതിനിധി ഹോസ്റ്റ്-മൈക്രോബയോം കോ-കൾച്ചറുകൾ കാണിക്കുന്നു. ഇടത് പാനൽ മൈക്രോ എഞ്ചിനീയറിംഗ് ചെയ്ത 3D കാക്കോ-2 എപ്പിത്തീലിയൽ സെല്ലുകൾ ഉപയോഗിച്ച് പച്ച ഫ്ലൂറസെന്റ് പ്രോട്ടീൻ (ജിഎഫ്‌പി) പ്രകടിപ്പിക്കുന്ന ഇ. കോളിയുടെ കോ-കൾച്ചർ കാണിക്കുന്നു. വലത് പാനൽ 3D കാക്കോ-2 എപ്പിത്തീലിയൽ സെല്ലുകളുമായി സഹ-കൾച്ചർ ചെയ്ത ജിഎഫ്‌പി ഇ. കോളിയുടെ പ്രാദേശികവൽക്കരണം കാണിക്കുന്നു, തുടർന്ന് എഫ്-ആക്ടിൻ (ചുവപ്പ്), ന്യൂക്ലിയുകൾ (നീല) എന്നിവ ഉപയോഗിച്ച് ഇമ്മ്യൂണോഫ്ലൂറസെൻസ് സ്റ്റെയിനിംഗ് കാണിക്കുന്നു. ബാക്ടീരിയയുമായുള്ള ഫിസിയോളജിക്കൽ വെല്ലുവിളിയിൽ കുടൽ വീക്കം ചിപ്പുകളിൽ ആരോഗ്യകരവും ചോർന്നതുമായ ഗട്ടിനെ രോഗ മോഡലിംഗ് ചിത്രീകരിക്കുന്നു. ആന്റിജനുകൾ (ഉദാ. ലിപ്പോപൊളിസാക്കറൈഡ്, എൽപിഎസ്) രോഗപ്രതിരോധ കോശങ്ങൾ (ഉദാ. പിബിഎംസി; പച്ച). ഒരു 3D എപ്പിത്തീലിയൽ പാളി സ്ഥാപിക്കുന്നതിനായി കക്കോ-2 കോശങ്ങളെ സംസ്കരിച്ചു. സ്കെയിൽ ബാർ, 50 µm. താഴെയുള്ള വരിയിലെ ചിത്രങ്ങൾ: റഫറൻസിൽ നിന്നുള്ള അനുമതിയോടെ സ്വീകരിച്ച "കോശങ്ങളുടെ വ്യത്യാസം".2. ഓക്സ്ഫോർഡ് യൂണിവേഴ്സിറ്റി പ്രസ്സ്; റഫർ.5-ൽ നിന്നുള്ള അനുമതിയോടെ പുനർനിർമ്മിച്ചു. NAS; "ഹോസ്റ്റ്-മൈക്രോബ് കോ-കൾച്ചർ" റഫർ.3-ൽ നിന്നുള്ള അനുമതിയോടെ സ്വീകരിച്ചു. NAS; റഫറൻസിൽ നിന്നുള്ള അനുമതിയോടെ സ്വീകരിച്ച "ഡിസീസ് മോഡലിംഗ്".5. NAS.
ഗട്ട്-ഓൺ-ചിപ്പും ഹൈബ്രിഡ് ചിപ്പുകളും PDMS പകർപ്പുകൾ ഉപയോഗിച്ച് നിർമ്മിച്ചവയാണ്, അവ സോഫ്റ്റ് ലിത്തോഗ്രാഫി ഉപയോഗിച്ച് സിലിക്കൺ മോൾഡുകളിൽ നിന്ന് പൊളിച്ചുമാറ്റി SU-8 ഉപയോഗിച്ച് പാറ്റേൺ ചെയ്‌തു. ഓരോ ചിപ്പിലെയും മൈക്രോചാനലുകളുടെ രൂപകൽപ്പന നിർണ്ണയിക്കുന്നത് ഷിയർ സ്ട്രെസ്, ഹൈഡ്രോഡൈനാമിക് പ്രഷർ തുടങ്ങിയ ഹൈഡ്രോഡൈനാമിക്സ് പരിഗണിച്ചാണ്. രണ്ട് ജക്സ്റ്റപ്പോസ് ചെയ്ത സമാന്തര നേരായ മൈക്രോചാനലുകൾ അടങ്ങിയ യഥാർത്ഥ ഗട്ട്-ഓൺ-എ-ചിപ്പ് ഡിസൈൻ (എക്സ്റ്റെൻഡഡ് ഡാറ്റ ചിത്രം 1a), പ്രേരിപ്പിക്കുന്നതിന് ഒരു ജോടി വളഞ്ഞ മൈക്രോചാനലുകൾ ഉൾപ്പെടുന്ന ഒരു സങ്കീർണ്ണമായ ഗട്ട്-ഓൺ-എ-ചിപ്പ് (എക്സ്റ്റെൻഡഡ് ഡാറ്റ ചിത്രം 1b) ആയി പരിണമിച്ചു. വർദ്ധിച്ച ദ്രാവക താമസ സമയം, രേഖീയമല്ലാത്ത ഫ്ലോ പാറ്റേണുകൾ, സംസ്ക്കരിച്ച കോശങ്ങളുടെ മൾട്ടിആക്സിയൽ രൂപഭേദം (ചിത്രം 2a–f) 12. കൂടുതൽ സങ്കീർണ്ണമായ ഗട്ട് ബയോമെക്കാനിക്സ് പുനഃസൃഷ്ടിക്കേണ്ടിവരുമ്പോൾ, സങ്കീർണ്ണമായ ഗട്ട്-ഓൺ-എ-ചിപ്പുകൾ തിരഞ്ഞെടുക്കാം. സമാനമായ അളവിലുള്ള എപ്പിത്തീലിയൽ ഉപയോഗിച്ച് സമാനമായ സമയപരിധിക്കുള്ളിൽ വളഞ്ഞ ഗട്ട്-ചിപ്പ് 3D മോർഫോജെനിസിസിനെ ശക്തമായി പ്രേരിപ്പിക്കുന്നുവെന്ന് ഞങ്ങൾ തെളിയിച്ചിട്ടുണ്ട്. കൾച്ചർ ചെയ്ത സെൽ തരം പരിഗണിക്കാതെ തന്നെ, യഥാർത്ഥ ഗട്ട്-ചിപ്പുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ വളർച്ച. അതിനാൽ, 3D മോർഫോജെനിസിസ് പ്രേരിപ്പിക്കുന്നതിന്, ലീനിയർ, കോംപ്ലക്സ് ഓൺ-ചിപ്പ് ഗട്ട് ഡിസൈനുകൾ പരസ്പരം മാറ്റാവുന്നതാണ്. SU-8 പാറ്റേണുകളുള്ള സിലിക്കൺ മോൾഡുകളിൽ ക്യൂർ ചെയ്ത PDMS പകർപ്പുകൾ, ഡെമോൾഡിംഗിന് ശേഷം നെഗറ്റീവ് സവിശേഷതകൾ നൽകി (ചിത്രം 2a). ഒരു ചിപ്പിൽ ഗട്ട് നിർമ്മിക്കുന്നതിന്, തയ്യാറാക്കിയ മുകളിലെ PDMS പാളി ഒരു പോറസ് PDMS ഫിലിമിലേക്ക് തുടർച്ചയായി ബന്ധിപ്പിച്ച്, തുടർന്ന് ഒരു കൊറോണ ട്രീറ്റർ ഉപയോഗിച്ച് മാറ്റാനാവാത്ത ബോണ്ടിംഗ് വഴി താഴത്തെ PDMS പാളിയുമായി വിന്യസിച്ചു (ചിത്രം 2b–f). ഹൈബ്രിഡ് ചിപ്പുകൾ നിർമ്മിക്കുന്നതിന്, ട്രാൻസ്‌വെൽ ഇൻസേർട്ടുകൾ ഉൾക്കൊള്ളാൻ കഴിയുന്ന സിംഗിൾ-ചാനൽ മൈക്രോഫ്ലൂയിഡിക് ഉപകരണങ്ങൾ സൃഷ്ടിക്കുന്നതിന്, ക്യൂർ ചെയ്ത PDMS പകർപ്പുകൾ ഗ്ലാസ് സ്ലൈഡുകളുമായി ബന്ധിപ്പിച്ചു (ചിത്രം 2h, എക്സ്റ്റെൻഡഡ് ഡാറ്റ ചിത്രം 2). PDMS പകർപ്പിന്റെയും ഗ്ലാസിന്റെയും ഉപരിതലങ്ങൾ ഓക്സിജൻ പ്ലാസ്മ അല്ലെങ്കിൽ കൊറോണ ചികിത്സ ഉപയോഗിച്ച് ചികിത്സിച്ചുകൊണ്ടാണ് ബോണ്ടിംഗ് പ്രക്രിയ നടത്തുന്നത്. സിലിക്കൺ ട്യൂബിൽ ഘടിപ്പിച്ചിരിക്കുന്ന മൈക്രോഫാബ്രിക്കേറ്റഡ് ഉപകരണത്തിന്റെ വന്ധ്യംകരണത്തിനുശേഷം, കുടൽ എപ്പിത്തീലിയത്തിന്റെ 3D മോർഫോജെനിസിസ് നടത്താൻ ഉപകരണ സജ്ജീകരണം തയ്യാറായി (ചിത്രം 2g).
a, SU-8 പാറ്റേൺ ചെയ്ത സിലിക്കൺ മോൾഡുകളിൽ നിന്ന് PDMS ഭാഗങ്ങൾ തയ്യാറാക്കുന്നതിന്റെ സ്കീമാറ്റിക് ചിത്രീകരണം. ക്യൂർ ചെയ്യാത്ത PDMS ലായനി ഒരു സിലിക്കൺ മോൾഡിലേക്ക് (ഇടത്) ഒഴിച്ചു, 60 °C (മധ്യത്തിൽ) ക്യൂർ ചെയ്തു, പൊളിച്ചു (വലത്). ഡീമോൾഡ് ചെയ്ത PDMS കഷണങ്ങളായി മുറിച്ച് കൂടുതൽ ഉപയോഗത്തിനായി വൃത്തിയാക്കി.b, PDMS മുകളിലെ പാളി തയ്യാറാക്കാൻ ഉപയോഗിക്കുന്ന സിലിക്കൺ മോൾഡിന്റെ ഫോട്ടോ.c, PDMS പോറസ് മെംബ്രൺ നിർമ്മിക്കാൻ ഉപയോഗിക്കുന്ന സിലിക്കൺ മോൾഡിന്റെ ഫോട്ടോ.d, മുകളിലെയും താഴെയുമുള്ള PDMS ഘടകങ്ങളുടെയും കൂട്ടിച്ചേർത്ത ഓൺ-ചിപ്പ് കുടൽ ഉപകരണത്തിന്റെയും ഫോട്ടോഗ്രാഫുകളുടെ ഒരു പരമ്പര.e, മുകളിലെ, മെംബ്രൺ, താഴത്തെ PDMS ഘടകങ്ങളുടെ വിന്യാസത്തിന്റെ സ്കീമാറ്റിക്. ഓരോ പാളിയും പ്ലാസ്മ അല്ലെങ്കിൽ കൊറോണ ചികിത്സ വഴി മാറ്റാനാവാത്തവിധം ബന്ധിപ്പിച്ചിരിക്കുന്നു.f, സൂപ്പർഇമ്പോസ് ചെയ്ത വളഞ്ഞ മൈക്രോചാനലുകളും വാക്വം ചേമ്പറുകളും ഉപയോഗിച്ച് ഫാബ്രിക്കേറ്റഡ് ഗട്ട്-ഓൺ-എ-ചിപ്പ് ഉപകരണത്തിന്റെ സ്കീമാറ്റിക്.g, മൈക്രോഫ്ലൂയിഡിക് സെൽ കൾച്ചറിനായി ഗട്ട്-ഓൺ-എ-ചിപ്പിന്റെ സജ്ജീകരണം. ഒരു സിലിക്കൺ ട്യൂബും സിറിഞ്ചും ഉപയോഗിച്ച് കൂട്ടിച്ചേർത്ത ഒരു ചിപ്പിലെ ഫാബ്രിക്കേറ്റഡ് ഗട്ട് a-യിൽ സ്ഥാപിച്ചു. കവർസ്ലിപ്പ്. പ്രോസസ്സിംഗിനായി ചിപ്പ് ഉപകരണം 150 എംഎം പെട്രി ഡിഷിന്റെ മൂടിയിൽ സ്ഥാപിച്ചു. സിലിക്കൺ ട്യൂബ് അടയ്ക്കാൻ ബൈൻഡർ ഉപയോഗിക്കുന്നു.h, ഹൈബ്രിഡ് ചിപ്പുകൾ ഉപയോഗിച്ച് ഹൈബ്രിഡ് ചിപ്പ് നിർമ്മാണത്തിന്റെയും 3D മോർഫോജെനിസിസിന്റെയും വിഷ്വൽ സ്നാപ്പ്ഷോട്ടുകൾ. കൾച്ചർ ചെയ്യുന്നതിന് സ്വതന്ത്രമായി തയ്യാറാക്കിയ ട്രാൻസ്‌വെൽ ഇൻസേർട്ടുകൾ കുടൽ 3D മോർഫോജെനിസിസിന് പ്രേരിപ്പിക്കുന്നതിനായി കുടൽ എപ്പിത്തീലിയൽ കോശങ്ങളുടെ 2D മോണോലെയറുകൾ ഹൈബ്രിഡ് ചിപ്പിലേക്ക് ചേർത്തു. ട്രാൻസ്‌വെൽ ഇൻസേർട്ടിൽ സ്ഥാപിച്ചിരിക്കുന്ന സെൽ പാളിക്ക് താഴെയുള്ള മൈക്രോചാനലുകൾ വഴി മീഡിയം പെർഫ്യൂസ് ചെയ്യുന്നു.സ്കെയിൽ ബാർ, 1 സെ.മീ.h റഫറൻസിൽ നിന്നുള്ള അനുമതിയോടെ വീണ്ടും അച്ചടിച്ചു.4. എൽസെവിയർ.
ഈ പ്രോട്ടോക്കോളിൽ, കക്കോ-2 സെൽ ലൈനും കുടൽ ഓർഗനോയിഡുകളും എപ്പിത്തീലിയൽ സ്രോതസ്സുകളായി ഉപയോഗിച്ചു (ചിത്രം 3a). രണ്ട് തരം കോശങ്ങളെയും സ്വതന്ത്രമായി കൾച്ചർ ചെയ്തു (ബോക്സ് 2 ഉം ബോക്സ് 5 ഉം) ഓൺ-ചിപ്പ് ഗട്ട് അല്ലെങ്കിൽ ട്രാൻസ്‌വെൽ ഇൻസേർട്ടുകളുടെ ECM- പൂശിയ മൈക്രോചാനലുകൾ വിത്ത് പാകാൻ ഉപയോഗിച്ചു. കോശങ്ങൾ സംഗമിക്കുമ്പോൾ (> ഫ്ലാസ്കുകളിൽ 95% കവറേജ്), ടി-ഫ്ലാസ്കുകളിലെ പതിവായി കൾച്ചർ ചെയ്ത കക്കോ-2 കോശങ്ങൾ (പാസേജുകൾ 10 നും 50 നും ഇടയിൽ) ട്രിപ്സിനൈസേഷൻ ദ്രാവകം (ബോക്സ് 2) ഉപയോഗിച്ച് വിഘടിച്ച സെൽ സസ്പെൻഷനുകൾ തയ്യാറാക്കാൻ വിളവെടുക്കുന്നു. ഘടനാപരമായ സൂക്ഷ്മ പരിസ്ഥിതിയെ പിന്തുണയ്ക്കുന്നതിനായി കുടൽ ബയോപ്സികളിൽ നിന്നോ ശസ്ത്രക്രിയാ വിഘടനങ്ങളിൽ നിന്നോ ഉള്ള മനുഷ്യ കുടൽ ഓർഗനോയിഡുകൾ 24-കിണർ പ്ലേറ്റുകളിലെ മാട്രിഗൽ സ്കാഫോൾഡ് ഡോമുകളിൽ കൾച്ചർ ചെയ്തു. അവശ്യ മോർഫോജനുകൾ (Wnt, R-spondin, Noggin പോലുള്ളവ) അടങ്ങിയ ഇടത്തരം, ബോക്സ് 3 ൽ വിവരിച്ചിരിക്കുന്നതുപോലെ തയ്യാറാക്കിയ വളർച്ചാ ഘടകങ്ങൾ എന്നിവ ഓർഗനോയിഡുകൾ ~500 µm വ്യാസത്തിലേക്ക് വളരുന്നതുവരെ മറ്റെല്ലാ ദിവസവും സപ്ലിമെന്റ് ചെയ്തു. പൂർണ്ണമായി വളർന്ന ഓർഗനോയിഡുകൾ വിളവെടുത്ത് വിഘടിപ്പിക്കുന്നു. ഒരു ചിപ്പിലെ കുടലിലേക്കോ ട്രാൻസ്‌വെൽ ഇൻസെർട്ടുകളിലേക്കോ വിത്ത് വിതയ്ക്കുന്നതിനായി ഒറ്റ കോശങ്ങളിലേക്ക് (ബോക്സ് 5). ഞങ്ങൾ മുമ്പ് റിപ്പോർട്ട് ചെയ്തതുപോലെ, രോഗ തരം 12, 13 (ഉദാ. അൾസറേറ്റീവ് കൊളൈറ്റിസ്, ക്രോൺസ് രോഗം, കൊളോറെക്ടൽ കാൻസർ, അല്ലെങ്കിൽ സാധാരണ ദാതാവ്), നിഖേദ് സ്ഥലം (ഉദാ. നിഖേദ് ഇല്ലാത്ത പ്രദേശം), ലഘുലേഖയിലെ ദഹനനാളത്തിന്റെ സ്ഥാനം (ഉദാ. ഡുവോഡിനം, ജെജുനം, ഇലിയം, സെക്കം, വൻകുടൽ അല്ലെങ്കിൽ മലാശയം) എന്നിവ അനുസരിച്ച് ഇത് വേർതിരിക്കാം. ചെറുകുടൽ ഓർഗനോയിഡുകളേക്കാൾ ഉയർന്ന സാന്ദ്രതയിലുള്ള മോർഫോജനുകൾ ആവശ്യമുള്ള കൊളോണിക് ഓർഗനോയിഡുകൾ (കൊളോയിഡുകൾ) സംസ്കരിക്കുന്നതിന് ബോക്സ് 5-ൽ ഞങ്ങൾ ഒപ്റ്റിമൈസ് ചെയ്ത ഒരു പ്രോട്ടോക്കോൾ നൽകുന്നു.
a, ഗട്ട് ചിപ്പിൽ ഗട്ട് മോർഫോജെനിസിസ് ഇൻഡക്ഷൻ ചെയ്യുന്നതിനുള്ള വർക്ക്ഫ്ലോ. 3D മോർഫോജെനിസിസ് പ്രദർശിപ്പിക്കുന്നതിന് ഈ പ്രോട്ടോക്കോളിൽ കാക്കോ-2 മനുഷ്യ കുടൽ എപ്പിത്തീലിയവും കുടൽ ഓർഗനോയിഡുകളും ഉപയോഗിക്കുന്നു. തയ്യാറാക്കിയ ഗട്ട്-ഓൺ-എ-ചിപ്പ് ഉപകരണത്തിൽ (ചിപ്പ് തയ്യാറാക്കൽ) ഒറ്റപ്പെട്ട എപ്പിത്തീലിയൽ കോശങ്ങളെ വിത്ത് ചെയ്തു. 0 (D0) ദിവസം കോശങ്ങൾ വിത്ത് (വിത്ത്) പിഡിഎംഎസ് പോറസ് മെംബ്രണിൽ ഘടിപ്പിച്ച ശേഷം (അറ്റാച്ചുചെയ്തു), ആദ്യത്തെ 2 ദിവസത്തേക്ക് (ഫ്ലോ, എപി, ഡി0-ഡി2) അഗ്രഭാഗ (എപി) പ്രവാഹം ആരംഭിക്കുകയും പരിപാലിക്കുകയും ചെയ്യുന്നു. ഒരു പൂർണ്ണമായ 2D മോണോലെയർ രൂപപ്പെടുമ്പോൾ ചാക്രിക നീട്ടൽ ചലനങ്ങൾക്കൊപ്പം (സ്ട്രെച്ച്, ഫ്ലോ, എപി, ബിഎൽ) ബാസോലാറ്ററൽ (ബിഎൽ) പ്രവാഹവും ആരംഭിക്കുന്നു. 5 ദിവസത്തെ മൈക്രോഫ്ലൂയിഡിക് കൾച്ചറിന് ശേഷം (മോർഫോജെനിസിസ്, ഡി5) കുടൽ 3D മോർഫോജെനിസിസ് സ്വയമേവ സംഭവിച്ചു. ഘട്ടം കോൺട്രാസ്റ്റ് ചിത്രങ്ങൾ ഓരോ പരീക്ഷണ ഘട്ടത്തിലോ സമയ പോയിന്റിലോ കക്കോ-2 കോശങ്ങളുടെ പ്രതിനിധി രൂപഘടന കാണിക്കുന്നു (ബാർ ഗ്രാഫ്, 100 µm). കുടലിന്റെ അനുബന്ധ കാസ്കേഡുകൾ ചിത്രീകരിക്കുന്ന നാല് സ്കീമാറ്റിക് ഡയഗ്രമുകൾ. മോർഫോജെനിസിസ് (മുകളിൽ വലത്). സ്കീമാറ്റിക്സിലെ ഡാഷ് ചെയ്ത അമ്പടയാളങ്ങൾ ദ്രാവക പ്രവാഹത്തിന്റെ ദിശയെ പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നു.b, സ്ഥാപിതമായ 3D Caco-2 എപ്പിത്തീലിയത്തിന്റെ (ഇടത്) ഉപരിതല ടോപ്പോളജി കാണിക്കുന്ന SEM ചിത്രം. മാഗ്നിഫൈഡ് ഏരിയ (വെളുത്ത ഡാഷ് ചെയ്ത ബോക്സ്) ഹൈലൈറ്റ് ചെയ്യുന്ന ഇൻസെറ്റ് 3D Caco-2 ലെയറിൽ (വലത്) പുനരുജ്ജീവിപ്പിച്ച മൈക്രോവില്ലി കാണിക്കുന്നു.c, സ്ഥാപിതമായ Caco-2 3D യുടെ തിരശ്ചീന മുൻവശത്തെ കാഴ്ച, ക്ലോഡിൻ (ZO-1, ചുവപ്പ്), F- ആക്റ്റിൻ (പച്ച), ന്യൂക്ലിയുകൾ (നീല) എന്ന് ലേബൽ ചെയ്തിരിക്കുന്ന തുടർച്ചയായ ബ്രഷ് ബോർഡർ മെംബ്രണുകൾ എന്നിവ കുടൽ ചിപ്പുകളിലെ എപ്പിത്തീലിയൽ കോശങ്ങളുടെ ഇമ്മ്യൂണോഫ്ലൂറസെൻസ് കോൺഫോക്കൽ വിഷ്വലൈസേഷൻ. മധ്യ സ്കീമാറ്റിക്സിലേക്ക് ചൂണ്ടുന്ന അമ്പുകൾ ഓരോ കോൺഫോക്കൽ വ്യൂവിനും ഫോക്കൽ തലത്തിന്റെ സ്ഥാനം സൂചിപ്പിക്കുന്നു.d, 3, 7, 9, 11, 13 ദിവസങ്ങളിൽ ഫേസ് കോൺട്രാസ്റ്റ് മൈക്രോസ്കോപ്പി വഴി ലഭിച്ച ഒരു ചിപ്പിൽ കൾച്ചർ ചെയ്ത ഓർഗനോയിഡുകളിലെ രൂപാന്തര മാറ്റങ്ങളുടെ സമയ ഗതി. ഇൻസെറ്റ് (മുകളിൽ വലത്) നൽകിയിരിക്കുന്ന ചിത്രത്തിന്റെ ഉയർന്ന മാഗ്നിഫിക്കേഷൻ കാണിക്കുന്നു.e, ദിവസം എടുത്ത സ്ലൈസിൽ കുടലിൽ സ്ഥാപിച്ചിരിക്കുന്ന ഓർഗനോയിഡ് 3D എപ്പിത്തീലിയത്തിന്റെ DIC ഫോട്ടോമൈക്രോഗ്രാഫ്. 7.f, എപ്പിത്തീലിയൽ പാളിയിൽ യഥാക്രമം 3 ദിവസത്തേക്ക് ഗട്ട് ചിപ്പുകളിൽ വളർത്തിയ സ്റ്റെം സെല്ലുകൾ (LGR5; മജന്ത), ഗോബ്ലറ്റ് സെല്ലുകൾ (MUC2; പച്ച), F-ആക്ടിൻ (ചാരനിറം), ന്യൂക്ലിയുകൾ (സിയാൻ) എന്നിവയുടെ മാർക്കറുകൾ കാണിക്കുന്ന ഓവർലേഡ് ഇമ്മ്യൂണോഫ്ലൂറസെൻസ് ചിത്രങ്ങൾ. എപ്പിത്തീലിയൽ പാളിയിൽ യഥാക്രമം (ഇടത്), 13 ദിവസത്തെ (മധ്യ) ഓർഗനോയിഡുകൾ എന്നിവ എടുത്തുകാണിക്കുന്ന വിപുലീകൃത ഡാറ്റ ചിത്രം 3 ഉം കാണുക. കൾച്ചറിന്റെ 13-ാം ദിവസം സെൽമാസ്ക് ഡൈ (വലത്) ഉപയോഗിച്ച് പ്ലാസ്മ മെംബ്രൺ സ്റ്റെയിൻ ചെയ്തുകൊണ്ട് ഒരു ചിപ്പിൽ ഗട്ടിൽ സ്ഥാപിച്ചിരിക്കുന്ന 3D ഓർഗനോയിഡ് എപിത്തീലിയത്തിന്റെ എപ്പിത്തീലിയൽ മൈക്രോസ്ട്രക്ചർ (വലത്) കാണിക്കുന്ന ഫ്ലൂറസെൻസ് ചിത്രങ്ങൾ. മറ്റുവിധത്തിൽ പറഞ്ഞിട്ടില്ലെങ്കിൽ സ്കെയിൽ ബാർ 50 μm ആണ്.b റഫറൻസിൽ നിന്നുള്ള അനുമതിയോടെ വീണ്ടും അച്ചടിച്ചു.2. ഓക്സ്ഫോർഡ് യൂണിവേഴ്സിറ്റി പ്രസ്സ്; c റഫറൻസിൽ നിന്നുള്ള അനുമതിയോടെ സ്വീകരിച്ചു.2. ഓക്സ്ഫോർഡ് യൂണിവേഴ്സിറ്റി പ്രസ്സ്; e, f എന്നിവ റഫറൻസിൽ അനുമതിയോടെ സ്വീകരിച്ചു.12 ക്രിയേറ്റീവ് കോമൺസ് ലൈസൻസ് CC BY 4.0 പ്രകാരം.
ഒരു ചിപ്പിലെ കുടലിൽ, വിജയകരമായ ECM കോട്ടിംഗിനായി PDMS പോറസ് മെംബ്രണിന്റെ ഹൈഡ്രോഫോബിക് ഉപരിതലം പരിഷ്കരിക്കേണ്ടത് ആവശ്യമാണ്. ഈ പ്രോട്ടോക്കോളിൽ, PDMS മെംബ്രണുകളുടെ ഹൈഡ്രോഫോബിസിറ്റി പരിഷ്കരിക്കുന്നതിന് ഞങ്ങൾ രണ്ട് വ്യത്യസ്ത രീതികൾ പ്രയോഗിക്കുന്നു. Caco-2 കോശങ്ങൾ കൾച്ചർ ചെയ്യുന്നതിന്, UV/ഓസോൺ ചികിത്സയിലൂടെയുള്ള ഉപരിതല സജീവമാക്കൽ മാത്രം PDMS ഉപരിതലത്തിന്റെ ഹൈഡ്രോഫോബിസിറ്റി കുറയ്ക്കുന്നതിനും, ECM പൂശുന്നതിനും, PDMS മെംബ്രണിലേക്ക് Caco-2 കോശങ്ങളെ ഘടിപ്പിക്കുന്നതിനും മതിയായിരുന്നു. എന്നിരുന്നാലും, ഓർഗനോയിഡ് എപ്പിത്തീലിയത്തിന്റെ മൈക്രോഫ്ലൂയിഡിക് കൾച്ചറിന് PDMS മൈക്രോചാനലുകളിൽ പോളിയെത്തിലീനൈമിൻ (PEI), ഗ്ലൂട്ടറാൽഡിഹൈഡ് എന്നിവ തുടർച്ചയായി പ്രയോഗിച്ചുകൊണ്ട് ECM പ്രോട്ടീനുകളുടെ കാര്യക്ഷമമായ നിക്ഷേപം നേടുന്നതിന് രാസ-അധിഷ്ഠിത ഉപരിതല പ്രവർത്തനക്ഷമത ആവശ്യമാണ്. ഉപരിതല പരിഷ്കരണത്തിനുശേഷം, പ്രവർത്തനക്ഷമമാക്കിയ PDMS ഉപരിതലത്തെ മൂടുന്നതിനായി ECM പ്രോട്ടീനുകൾ നിക്ഷേപിക്കുകയും തുടർന്ന് ഒറ്റപ്പെട്ട ഓർഗനോയിഡ് എപ്പിത്തീലിയത്തിലേക്ക് അവതരിപ്പിക്കുകയും ചെയ്തു. കോശങ്ങൾ ഘടിപ്പിച്ച ശേഷം, കോശങ്ങൾ ഒരു പൂർണ്ണമായ മോണോലെയർ രൂപപ്പെടുന്നതുവരെ മീഡിയം മാത്രം മുകളിലെ മൈക്രോചാനലിലേക്ക് പെർഫ്യൂസ് ചെയ്തുകൊണ്ട് മൈക്രോഫ്ലൂയിഡിക് സെൽ കൾച്ചർ ആരംഭിക്കുന്നു, അതേസമയം താഴത്തെ മൈക്രോചാനൽ സ്റ്റാറ്റിക് അവസ്ഥകൾ നിലനിർത്തുന്നു. ഉപരിതല സജീവമാക്കലിനും ECM കോട്ടിംഗിനുമുള്ള ഈ ഒപ്റ്റിമൈസ് ചെയ്ത രീതി ഓർഗനോയിഡ് എപ്പിത്തീലിയത്തിന്റെ അറ്റാച്ച്മെന്റ് പ്രാപ്തമാക്കുന്നു. PDMS പ്രതലത്തിൽ 3D മോർഫോജെനിസിസ് പ്രേരിപ്പിക്കുന്നതിന്.
ട്രാൻസ്‌വെൽ കൾച്ചറുകൾക്ക് സെൽ സീഡിംഗിന് മുമ്പ് ഇസിഎം കോട്ടിംഗ് ആവശ്യമാണ്; എന്നിരുന്നാലും, പോറസ് ഇൻസേർട്ടുകളുടെ ഉപരിതലം സജീവമാക്കുന്നതിന് ട്രാൻസ്‌വെൽ കൾച്ചറുകൾക്ക് സങ്കീർണ്ണമായ പ്രീ-ട്രീറ്റ്മെന്റ് ഘട്ടങ്ങൾ ആവശ്യമില്ല. ട്രാൻസ്‌വെൽ ഇൻസേർട്ടുകളിൽ കാക്കോ-2 സെല്ലുകൾ വളർത്തുന്നതിന്, പോറസ് ഇൻസേർട്ടുകളിൽ ഇസിഎം കോട്ടിംഗ് വിഘടിച്ച കാക്കോ-2 സെല്ലുകളുടെ അറ്റാച്ച്‌മെന്റിനെ ത്വരിതപ്പെടുത്തുന്നു (<1 മണിക്കൂർ) ഇറുകിയ ജംഗ്ഷൻ ബാരിയർ രൂപീകരണവും (<1-2 ദിവസം). ട്രാൻസ്‌വെൽ ഇൻസേർട്ടുകളിൽ കൾച്ചർ ചെയ്യുന്നതിന്, ഒറ്റപ്പെട്ട ഓർഗനോയിഡുകൾ ഇസിഎം-കോട്ടിഡ് ഇൻസേർട്ടുകളിൽ വിത്ത് പാകി, മെംബ്രൻ പ്രതലത്തിൽ ഘടിപ്പിച്ച് (<3 മണിക്കൂർ) ഓർഗനോയിഡുകൾ ബാരിയർ ഇന്റഗ്രിറ്റി ഉള്ള ഒരു പൂർണ്ണ മോണോലെയർ രൂപപ്പെടുന്നതുവരെ പരിപാലിക്കുന്നു. ഹൈബ്രിഡ് ചിപ്പുകൾ ഉപയോഗിക്കാതെ 24-കിണർ പ്ലേറ്റുകളിൽ ട്രാൻസ്‌വെൽ കൾച്ചറുകൾ നടത്തുന്നു.
ഒരു സ്ഥാപിത എപ്പിത്തീലിയൽ പാളിയുടെ ബാസോലാറ്ററൽ വശത്തേക്ക് ദ്രാവക പ്രവാഹം പ്രയോഗിച്ചുകൊണ്ട് ഇൻ വിട്രോ 3D മോർഫോജെനിസിസ് ആരംഭിക്കാൻ കഴിയും. ഒരു ചിപ്പിലെ കുടലിൽ, മുകളിലെയും താഴെയുമുള്ള മൈക്രോചാനലുകളിലേക്ക് മീഡിയം പെർഫ്യൂസ് ചെയ്തപ്പോൾ എപ്പിത്തീലിയൽ മോർഫോജെനിസിസ് ആരംഭിച്ചു (ചിത്രം 3a). മുമ്പ് വിവരിച്ചതുപോലെ, ദിശാസൂചന സ്രവിക്കുന്ന മോർഫോജൻ ഇൻഹിബിറ്ററുകൾ തുടർച്ചയായി നീക്കം ചെയ്യുന്നതിനായി ഇൻഫീരിയർ (ബാസോലാറ്ററൽ) കമ്പാർട്ടുമെന്റിൽ ദ്രാവക പ്രവാഹം അവതരിപ്പിക്കേണ്ടത് നിർണായകമാണ്. പോറസ് മെംബ്രണുകളിൽ ബന്ധിപ്പിച്ചിരിക്കുന്ന കോശങ്ങൾക്ക് മതിയായ പോഷകങ്ങളും സെറവും നൽകുന്നതിനും ലുമിനൽ ഷിയർ സ്ട്രെസ് സൃഷ്ടിക്കുന്നതിനും, ഞങ്ങൾ സാധാരണയായി ഒരു ചിപ്പിൽ ഗട്ടിൽ ഇരട്ട പ്രവാഹം പ്രയോഗിക്കുന്നു. ഹൈബ്രിഡ് ചിപ്പുകളിൽ, എപ്പിത്തീലിയൽ മോണോലെയറുകൾ അടങ്ങിയ ട്രാൻസ്‌വെൽ ഇൻസെർട്ടുകൾ ഹൈബ്രിഡ് ചിപ്പുകളിലേക്ക് തിരുകി. തുടർന്ന്, മൈക്രോചാനലിലൂടെ പോറസ് ട്രാൻസ്‌വെൽ ഇൻസെർട്ടിന്റെ ബാസോലാറ്ററൽ വശത്തിന് കീഴിൽ മീഡിയം പ്രയോഗിച്ചു. രണ്ട് കൾച്ചർ പ്ലാറ്റ്‌ഫോമുകളിലും ബാസോലാറ്ററൽ ഫ്ലോ ആരംഭിച്ചതിന് 3-5 ദിവസങ്ങൾക്ക് ശേഷമാണ് കുടൽ മോർഫോജെനിസിസ് സംഭവിച്ചത്.
ഫേസ് കോൺട്രാസ്റ്റ് മൈക്രോസ്കോപ്പി, ഡിഫറൻഷ്യൽ ഇന്റർഫറൻസ് കോൺട്രാസ്റ്റ് (DIC) മൈക്രോസ്കോപ്പി, SEM, അല്ലെങ്കിൽ ഇമ്മ്യൂണോഫ്ലൂറസെൻസ് കോൺഫോക്കൽ മൈക്രോസ്കോപ്പി (ചിത്രങ്ങൾ 3 ഉം 4 ഉം) ഉൾപ്പെടെ വിവിധ ഇമേജിംഗ് രീതികൾ പ്രയോഗിച്ചുകൊണ്ട് മൈക്രോ എഞ്ചിനീയറിംഗ് ചെയ്ത 3D എപ്പിത്തീലിയൽ പാളികളുടെ രൂപാന്തര സവിശേഷതകൾ വിശകലനം ചെയ്യാൻ കഴിയും. 3D എപ്പിത്തീലിയൽ പാളികളുടെ ആകൃതിയും നീണ്ടുനിൽക്കുന്നതും നിരീക്ഷിക്കുന്നതിന് കൾച്ചർ സമയത്ത് ഏത് സമയത്തും ഫേസ് കോൺട്രാസ്റ്റ് അല്ലെങ്കിൽ DIC ഇമേജിംഗ് എളുപ്പത്തിൽ നടത്താൻ കഴിയും. PDMS-ന്റെയും പോളിസ്റ്റർ ഫിലിമുകളുടെയും ഒപ്റ്റിക്കൽ സുതാര്യത കാരണം, ഗട്ട്-ഓൺ-എ-ചിപ്പ്, ഹൈബ്രിഡ് ചിപ്പ് പ്ലാറ്റ്‌ഫോമുകൾ എന്നിവയ്ക്ക് ഉപകരണത്തിന്റെ സെക്ഷനിംഗ് അല്ലെങ്കിൽ ഡിസ്അസംബ്ലിംഗ് ആവശ്യമില്ലാതെ തത്സമയ ഇൻ സിറ്റു ഇമേജിംഗ് നൽകാൻ കഴിയും. ഇമ്മ്യൂണോഫ്ലൂറസെൻസ് ഇമേജിംഗ് നടത്തുമ്പോൾ (ചിത്രങ്ങൾ 1, 3c, f, 4b, c), സെല്ലുകൾ സാധാരണയായി 4% (wt/vol) പാരാഫോർമാൽഡിഹൈഡ് (PFA), തുടർന്ന് ട്രൈറ്റൺ X-100, 2% (wt/vol) ) ബോവിൻ സെറം ആൽബുമിൻ (BSA) എന്നിവ ക്രമത്തിൽ ഉറപ്പിക്കുന്നു. സെൽ തരം അനുസരിച്ച്, വ്യത്യസ്ത ഫിക്സേറ്റീവുകൾ, പെർമിബിലൈസറുകൾ, ബ്ലോക്കിംഗ് ഏജന്റുകൾ എന്നിവ ആകാം. ഉപയോഗിച്ചു. വംശത്തെ ആശ്രയിച്ചുള്ള കോശത്തെയോ മേഖലാ മാർക്കറുകളെയോ ലക്ഷ്യം വച്ചുള്ള പ്രാഥമിക ആന്റിബോഡികൾ ചിപ്പിലെ നിശ്ചലമായ കോശങ്ങളെ ഹൈലൈറ്റ് ചെയ്യാൻ ഉപയോഗിക്കുന്നു, തുടർന്ന് ദ്വിതീയ ആന്റിബോഡികൾ, ന്യൂക്ലിയസ് (ഉദാ. 4′,6-ഡയമിഡിനോ-2-ഫെനൈലീൻ) ഇൻഡോൾ, DAPI) അല്ലെങ്കിൽ F-ആക്ടിൻ (ഉദാ. ഫ്ലൂറസെന്റ് ലേബൽ ചെയ്ത ഫാലോയിഡിൻ) എന്നിവയെ ലക്ഷ്യം വച്ചുള്ള ഒരു കൌണ്ടർസ്റ്റെയിൻ ഡൈയും ഉപയോഗിക്കുന്നു. മ്യൂക്കസ് ഉത്പാദനം (ചിത്രം 1, “സെൽ ഡിഫറൻസേഷൻ”, “ഗട്ട് ഫിസിയോളജി”), സൂക്ഷ്മജീവ കോശങ്ങളുടെ ക്രമരഹിതമായ കോളനിവൽക്കരണം (ചിത്രം 1, “ഹോസ്റ്റ്-മൈക്രോബ് കോ-കൾച്ചർ”), രോഗപ്രതിരോധ കോശങ്ങളുടെ റിക്രൂട്ട്മെന്റ് (ചിത്രം 1, 'ഡിസീസ് മോഡലിംഗ്') അല്ലെങ്കിൽ 3D എപ്പിത്തീലിയൽ മോർഫോളജിയുടെ രൂപരേഖകൾ (ചിത്രം 3c,f, 4b,c) എന്നിവ കണ്ടെത്തുന്നതിന് ഫ്ലൂറസെൻസ് അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള ലൈവ് ഇമേജിംഗ് സിറ്റുവിലും നടത്താം. റഫറൻസിൽ വിവരിച്ചിരിക്കുന്നതുപോലെ, മുകളിലെ പാളിയെ താഴത്തെ മൈക്രോചാനൽ പാളിയിൽ നിന്ന് വേർതിരിക്കുന്നതിന് ചിപ്പിലെ ഗട്ട് പരിഷ്കരിക്കുമ്പോൾ. ചിത്രം 2 ൽ കാണിച്ചിരിക്കുന്നതുപോലെ, 3D എപ്പിത്തീലിയൽ മോർഫോളജിയും അഗ്ര ബ്രഷ് ബോർഡറിലെ മൈക്രോവില്ലിയും. SEM ഉപയോഗിച്ച് ദൃശ്യവൽക്കരിക്കാൻ കഴിയും (ചിത്രം 3b). ക്വാണ്ടിറ്റേറ്റീവ് PCR5 അല്ലെങ്കിൽ സിംഗിൾ-സെൽ RNA സീക്വൻസിംഗ് നടത്തി ഡിഫറൻഷ്യേഷൻ മാർക്കറുകളുടെ എക്സ്പ്രഷൻ വിലയിരുത്താൻ കഴിയും. ഈ സാഹചര്യത്തിൽ, ഗട്ട് ചിപ്പുകളിലോ ഹൈബ്രിഡ് ചിപ്പുകളിലോ വളർത്തിയ എപ്പിത്തീലിയൽ കോശങ്ങളുടെ 3D പാളികൾ ട്രിപ്സിനൈസേഷൻ വഴി വിളവെടുക്കുകയും തുടർന്ന് തന്മാത്രാ അല്ലെങ്കിൽ ജനിതക വിശകലനത്തിനായി ഉപയോഗിക്കുകയും ചെയ്യുന്നു.
a, ഒരു ഹൈബ്രിഡ് ചിപ്പിൽ കുടൽ മോർഫോജെനിസിസ് ഇൻഡക്ഷൻ ചെയ്യുന്നതിനുള്ള വർക്ക്ഫ്ലോ. ഒരു ഹൈബ്രിഡ് ചിപ്പ് പ്ലാറ്റ്‌ഫോമിൽ 3D മോർഫോജെനിസിസ് പ്രദർശിപ്പിക്കുന്നതിന് ഈ പ്രോട്ടോക്കോളിൽ കക്കോ-2 ഉം കുടൽ ഓർഗനോയിഡുകളും ഉപയോഗിക്കുന്നു. തയ്യാറാക്കിയ ട്രാൻസ്‌വെൽ ഇൻസേർട്ടുകളിൽ വിഘടിച്ച എപ്പിത്തീലിയൽ കോശങ്ങളെ വിത്ത് ചെയ്തു (TW പ്രെപ്പ്; താഴെയുള്ള ചിത്രം കാണുക). ട്രാൻസ്‌വെൽ ഇൻസേർട്ടുകളിൽ കോശങ്ങൾ വിത്ത് (വിത്ത്) ചെയ്ത് പോളിസ്റ്റർ മെംബ്രണുകളിൽ ഘടിപ്പിച്ച ശേഷം, എല്ലാ കോശങ്ങളെയും സ്റ്റാറ്റിക് സാഹചര്യങ്ങളിൽ (TW കൾച്ചർ) കൾച്ചർ ചെയ്തു. 7 ദിവസങ്ങൾക്ക് ശേഷം, എപ്പിത്തീലിയൽ കോശങ്ങളുടെ 2D മോണോലെയർ അടങ്ങിയ ഒരു ട്രാൻസ്‌വെൽ ഇൻസേർട്ട് ഒരു ഹൈബ്രിഡ് ചിപ്പിലേക്ക് സംയോജിപ്പിച്ച് ഒരു ബാസോലാറ്ററൽ ഫ്ലോ (ഫ്ലോ, BL) അവതരിപ്പിക്കുന്നു, ഇത് ഒടുവിൽ ഒരു 3D എപ്പിത്തീലിയൽ പാളി (മോർഫോജെനിസിസ്) സൃഷ്ടിക്കുന്നതിലേക്ക് നയിച്ചു. ഓരോ പരീക്ഷണ ഘട്ടത്തിലോ സമയ പോയിന്റിലോ ആരോഹണ കോളണിൽ സാധാരണ ദാതാവിൽ (C103 ലൈൻ) നിന്ന് ഉരുത്തിരിഞ്ഞ മനുഷ്യ അവയവ എപ്പിത്തീലിയൽ കോശങ്ങളുടെ രൂപാന്തര സവിശേഷതകൾ കാണിക്കുന്ന ഘട്ടം കോൺട്രാസ്റ്റ് മൈക്രോഗ്രാഫുകൾ. മുകളിലെ പാളികളിലെ സ്കീമാറ്റിക്സ് ഓരോ ഘട്ടത്തിനുമുള്ള പരീക്ഷണാത്മക കോൺഫിഗറേഷൻ വ്യക്തമാക്കുന്നു.b, ഹൈബ്രിഡ് ചിപ്പുകൾ (ഇടത് സ്കീമാറ്റിക്) മുകളിൽ നിന്ന് താഴേക്കുള്ള കൺഫോക്കൽ മൈക്രോസ്കോപ്പി കാഴ്ചകളുള്ള ഓർഗനോയിഡ് എപ്പിത്തീലിയൽ കോശങ്ങളുടെ 3D മോർഫോജെനിസിസിലേക്ക് നയിച്ചേക്കാം. വ്യത്യസ്ത Z സ്ഥാനങ്ങളിൽ എടുത്തത് (മുകൾ, മധ്യഭാഗം, താഴെ; വലത് സ്കീമാറ്റിക്, അനുബന്ധ ഡോട്ടഡ് ലൈനുകൾ കാണുക). വ്യക്തമായ രൂപാന്തര സവിശേഷതകൾ കാണിച്ചു. സ്റ്റാറ്റിക് ട്രാൻസ്‌വെല്ലിൽ സംസ്കരിച്ച ഓർഗനോയിഡ്-ഉത്ഭവിച്ച എപ്പിത്തീലിയൽ കോശങ്ങളുടെ എഫ്-ആക്ടിൻ (സിയാൻ), ന്യൂക്ലിയസ് (ഗ്രേ).സി, ഫ്ലൂറസെൻസ് കോൺഫോക്കൽ മൈക്രോഗ്രാഫുകൾ (3D ആംഗിൾഡ് വ്യൂ) (TW; വെളുത്ത ഡാഷ്ഡ് ബോക്സിനുള്ളിൽ ഇൻസെറ്റ്) യഥാക്രമം 2D വേഴ്സസ് 3D മോർഫോളജി താരതമ്യം ചെയ്യുന്ന ഹൈബ്രിഡ് ചിപ്പിനെതിരെ (ഏറ്റവും വലിയ ഫുൾ ഷോട്ട്). 2D ലംബ ക്രോസ്-കട്ട് വ്യൂകളുടെ ഒരു ജോഡി (മുകളിൽ വലത് കോണിലുള്ള ഇൻസെറ്റ്; "XZ") 2D, 3D സവിശേഷതകളും കാണിക്കുന്നു. സ്കെയിൽ ബാർ, 100 µm.c റഫറൻസിൽ നിന്നുള്ള അനുമതിയോടെ വീണ്ടും അച്ചടിച്ചു.4. എൽസെവിയർ.
പരമ്പരാഗത സ്റ്റാറ്റിക് കൾച്ചർ സാഹചര്യങ്ങളിൽ ഒരേ കോശങ്ങളെ (കാക്കോ-2 അല്ലെങ്കിൽ കുടൽ ഓർഗനോയിഡ് എപ്പിത്തീലിയൽ കോശങ്ങൾ) ദ്വിമാന മോണോലെയറുകളാക്കി കൾച്ചർ ചെയ്തുകൊണ്ട് നിയന്ത്രണങ്ങൾ തയ്യാറാക്കാം. ശ്രദ്ധേയമായി, മൈക്രോചാനലുകളുടെ പരിമിതമായ വോളിയം ശേഷി കാരണം (അതായത് യഥാർത്ഥ ഗട്ട്-ചിപ്പ് രൂപകൽപ്പനയിലെ മുകളിലെ ചാനലിൽ ~4 µL) പോഷകങ്ങളുടെ കുറവ് സംഭവിക്കാം. അതിനാൽ, ബാസോലാറ്ററൽ ഫ്ലോ പ്രയോഗിക്കുന്നതിന് മുമ്പും ശേഷവുമുള്ള എപ്പിത്തീലിയൽ രൂപഘടനയും താരതമ്യം ചെയ്യാം.
സോഫ്റ്റ് ലിത്തോഗ്രാഫി പ്രക്രിയ വൃത്തിയുള്ള ഒരു മുറിയിലാണ് നടത്തേണ്ടത്. ചിപ്പിലെ ഓരോ പാളിക്കും (മുകളിലും താഴെയുമുള്ള പാളികളും മെംബ്രണുകളും) ഹൈബ്രിഡ് ചിപ്പുകൾക്കും, വ്യത്യസ്ത ഫോട്ടോമാസ്കുകൾ ഉപയോഗിക്കുകയും പ്രത്യേക സിലിക്കൺ വേഫറുകളിൽ നിർമ്മിക്കുകയും ചെയ്തു, കാരണം മൈക്രോചാനലുകളുടെ ഉയരം വ്യത്യസ്തമായിരുന്നു. ചിപ്പിലെ ഗട്ടിന്റെ മുകളിലും താഴെയുമുള്ള മൈക്രോചാനലുകളുടെ ലക്ഷ്യ ഉയരം യഥാക്രമം 500 µm ഉം 200 µm ഉം ആണ്. ഹൈബ്രിഡ് ചിപ്പിന്റെ ചാനൽ ലക്ഷ്യ ഉയരം 200 µm ആണ്.
അസെറ്റോൺ ഉള്ള ഒരു പാത്രത്തിൽ 3 ഇഞ്ച് സിലിക്കൺ വേഫർ വയ്ക്കുക. പ്ലേറ്റ് 30 സെക്കൻഡ് സൌമ്യമായി കറക്കുക, തുടർന്ന് വേഫർ വായുവിൽ ഉണക്കുക. വേഫർ IPA ഉള്ള ഒരു പ്ലേറ്റിലേക്ക് മാറ്റുക, തുടർന്ന് വൃത്തിയാക്കാൻ 30 സെക്കൻഡ് പ്ലേറ്റ് കറക്കുക.
സിലിക്കൺ വേഫർ പ്രതലത്തിൽ നിന്ന് ജൈവ അവശിഷ്ടങ്ങൾ പരമാവധി നീക്കം ചെയ്യുന്നതിന്, ഒരു പിരാന ലായനി (ഹൈഡ്രജൻ പെറോക്സൈഡിന്റെയും സാന്ദ്രീകൃത സൾഫ്യൂറിക് ആസിഡിന്റെയും മിശ്രിതം, 1:3 (വാല്യം/വാല്യം)) ഓപ്ഷണലായി ഉപയോഗിക്കാം.
പിരാന ലായനി അങ്ങേയറ്റം നാശകാരിയും ചൂട് ഉൽ‌പാദിപ്പിക്കുന്നതുമാണ്. കൂടുതൽ സുരക്ഷാ മുൻകരുതലുകൾ ആവശ്യമാണ്. മാലിന്യ നിർമാർജനത്തിന്, ലായനി തണുപ്പിച്ച് വൃത്തിയുള്ളതും ഉണങ്ങിയതുമായ ഒരു മാലിന്യ പാത്രത്തിലേക്ക് മാറ്റാൻ അനുവദിക്കുക. ദ്വിതീയ പാത്രങ്ങൾ ഉപയോഗിക്കുക, മാലിന്യ പാത്രങ്ങൾ ശരിയായി ലേബൽ ചെയ്യുക. കൂടുതൽ വിശദമായ നടപടിക്രമങ്ങൾക്കായി ദയവായി സൗകര്യത്തിന്റെ സുരക്ഷാ മാർഗ്ഗനിർദ്ദേശങ്ങൾ പാലിക്കുക.
200 °C ചൂടുള്ള പ്ലേറ്റിൽ 10 മിനിറ്റ് വെച്ചുകൊണ്ട് വേഫറുകൾ ഡീഹൈഡ്രേറ്റ് ചെയ്യുക. ഡീഹൈഡ്രേറ്റ് ചെയ്ത ശേഷം, വേഫർ തണുപ്പിക്കാൻ അഞ്ച് തവണ വായുവിൽ കുലുക്കി.
വൃത്തിയാക്കിയ സിലിക്കൺ വേഫറിന്റെ മധ്യഭാഗത്ത് ~10 ഗ്രാം ഫോട്ടോറെസിസ്റ്റ് SU-8 2100 ഒഴിക്കുക. വേഫറിൽ ഫോട്ടോറെസിസ്റ്റ് തുല്യമായി പരത്താൻ ട്വീസറുകൾ ഉപയോഗിക്കുക. ഫോട്ടോറെസിസ്റ്റ് ഒട്ടിപ്പിടിക്കാതിരിക്കാനും പരത്താൻ എളുപ്പമാക്കാനും ഇടയ്ക്കിടെ വേഫർ 65°C ചൂടുള്ള പ്ലേറ്റിൽ വയ്ക്കുക. വേഫർ നേരിട്ട് ഹോട്ട് പ്ലേറ്റിൽ വയ്ക്കരുത്.
സ്പിൻ കോട്ടിംഗ് പ്രവർത്തിപ്പിച്ചുകൊണ്ട് SU-8 വേഫറിൽ തുല്യമായി വിതരണം ചെയ്തു. 100 rpm/s ആക്സിലറേഷനിൽ 500 rpm-ൽ പ്രചരിപ്പിക്കുന്നതിന് 5-10 സെക്കൻഡ് നേരത്തേക്ക് SU-8 ന്റെ ഒരു ഇൻകമിംഗ് റൊട്ടേഷൻ പ്രോഗ്രാം ചെയ്യുക. 1,500 rpm-ൽ 200 µm കട്ടിയുള്ള പാറ്റേണിംഗിനായി പ്രധാന സ്പിൻ സജ്ജമാക്കുക, അല്ലെങ്കിൽ 250 µm കനം കൈവരിക്കുക (ചിപ്പിലെ ഗട്ടിന്റെ മുകളിലെ പാളിക്ക് 500 µm ഉയരം ഉണ്ടാക്കുന്നു; താഴെയുള്ള "ക്രിട്ടിക്കൽ സ്റ്റെപ്പുകൾ" കാണുക) 1,200 rpm-ൽ 30 സെക്കൻഡ് 300 rpm/s ആക്സിലറേഷനിൽ സജ്ജമാക്കുക.
സിലിക്കൺ വേഫറിലെ SU-8 പാറ്റേണിന്റെ ലക്ഷ്യ കനം അനുസരിച്ച് പ്രധാന സ്പിൻ വേഗത ക്രമീകരിക്കാൻ കഴിയും.
ചിപ്പിലെ ഗട്ടിന്റെ മുകളിലെ പാളിക്ക് 500 µm ഉയരമുള്ള SU-8 പാറ്റേണുകൾ നിർമ്മിക്കുന്നതിന്, ഈ ബോക്സിന്റെ സ്പിൻ കോട്ടിംഗും സോഫ്റ്റ് ബേക്ക് ഘട്ടങ്ങളും (ഘട്ടങ്ങൾ 7 ഉം 8 ഉം) തുടർച്ചയായി ആവർത്തിച്ചു (ഘട്ടം 9 കാണുക) 250 µm ന്റെ രണ്ട് പാളികൾ ഉത്പാദിപ്പിക്കാൻ കഴിഞ്ഞു. SU-8 ന്റെ ഒരു കട്ടിയുള്ള പാളി, ഈ ബോക്സിന്റെ 12-ാം ഘട്ടത്തിൽ UV എക്സ്പോഷർ വഴി പാളികളാക്കി കൂട്ടിച്ചേർക്കാൻ കഴിയും, ഇത് 500 µm ഉയരമുള്ള ഒരു പാളി ഉണ്ടാക്കുന്നു.
SU-8 പൂശിയ വേഫറുകൾ 65 °C-ൽ ഒരു ചൂടുള്ള പ്ലേറ്റിൽ 5 മിനിറ്റ് ശ്രദ്ധാപൂർവ്വം വെച്ചുകൊണ്ട് സോഫ്റ്റ് ബേക്ക് ചെയ്യുക, തുടർന്ന് സെറ്റിംഗ് 95 °C ആക്കി 40 മിനിറ്റ് കൂടി ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്യുക.
മുകളിലെ മൈക്രോചാനലിൽ SU-8 പാറ്റേണിന്റെ 500 μm ഉയരം കൈവരിക്കുന്നതിന്, 250 μm കട്ടിയുള്ള രണ്ട് SU-8 പാളികൾ സൃഷ്ടിക്കുന്നതിന് 7 ഉം 8 ഉം ഘട്ടങ്ങൾ ആവർത്തിക്കുക.
UV മാസ്ക് അലൈനർ ഉപയോഗിച്ച്, വേഫറിന്റെ എക്സ്പോഷർ സമയം കണക്കാക്കാൻ നിർമ്മാതാവിന്റെ നിർദ്ദേശങ്ങൾക്കനുസരിച്ച് ഒരു ലാമ്പ് ടെസ്റ്റ് നടത്തുക. (എക്സ്പോഷർ സമയം, ms) = (എക്സ്പോഷർ ഡോസ്, mJ/cm2)/(ലാമ്പ് പവർ, mW/cm2).
എക്സ്പോഷർ സമയം നിർണ്ണയിച്ചതിനുശേഷം, UV മാസ്ക് അലൈനറിന്റെ മാസ്ക് ഹോൾഡറിൽ ഫോട്ടോമാസ്ക് വയ്ക്കുക, കൂടാതെ SU-8 കോട്ട് ചെയ്ത വേഫറിൽ ഫോട്ടോമാസ്ക് വയ്ക്കുക.
UV ഡിസ്പർഷൻ കുറയ്ക്കുന്നതിന് ഫോട്ടോമാസ്കിന്റെ പ്രിന്റ് ചെയ്ത പ്രതലം സിലിക്കൺ വേഫറിന്റെ SU-8 പൂശിയ വശത്ത് നേരിട്ട് വയ്ക്കുക.
മുൻകൂട്ടി നിശ്ചയിച്ച എക്സ്പോഷർ സമയത്തേക്ക് SU-8 പൂശിയ വേഫറും ഫോട്ടോമാസ്കും ലംബമായി 260 mJ/cm2 UV പ്രകാശത്തിലേക്ക് എക്സ്പോസ് ചെയ്യുക (ഈ ബോക്സിലെ ഘട്ടം 10 കാണുക).
UV എക്സ്പോഷറിന് ശേഷം, 200 μm ഉയരമുള്ള പാറ്റേണുകൾ നിർമ്മിക്കുന്നതിനായി, SU-8-ആവരണം ചെയ്ത സിലിക്കൺ വേഫറുകൾ ഓരോ ഹോട്ട് പ്ലേറ്റിലും 65°C യിൽ 5 മിനിറ്റും 95°C യിൽ 15 മിനിറ്റും ബേക്ക് ചെയ്തു. 500 μm ഉയരമുള്ള പാറ്റേണുകൾ നിർമ്മിക്കുന്നതിന്, ബേക്ക് ചെയ്തതിന് ശേഷമുള്ള സമയം 95°C മുതൽ 30 മിനിറ്റ് വരെ നീട്ടുക.
ഡെവലപ്പർ ഒരു ഗ്ലാസ് ഡിഷിലേക്ക് ഒഴിക്കുന്നു, ബേക്ക് ചെയ്ത വേഫർ ഡിഷിൽ വയ്ക്കുന്നു. ഗ്ലാസ് പ്ലേറ്റിന്റെ വലുപ്പത്തെ ആശ്രയിച്ച് SU-8 ഡെവലപ്പറുടെ അളവ് വ്യത്യാസപ്പെടാം. എക്സ്പോസ് ചെയ്യപ്പെടാത്ത SU-8 പൂർണ്ണമായും നീക്കം ചെയ്യുന്നതിന് ആവശ്യമായ SU-8 ഡെവലപ്പർ ഉപയോഗിക്കുന്നത് ഉറപ്പാക്കുക. ഉദാഹരണത്തിന്, 1 ലിറ്റർ ശേഷിയുള്ള 150 mm വ്യാസമുള്ള ഗ്ലാസ് ഡിഷ് ഉപയോഗിക്കുമ്പോൾ, ~300 mL SU-8 ഡെവലപ്പർ ഉപയോഗിക്കുക. ഇടയ്ക്കിടെ സൌമ്യമായി കറങ്ങിക്കൊണ്ട് 25 മിനിറ്റ് നേരത്തേക്ക് മോൾഡ് വികസിപ്പിക്കുക.
വികസിപ്പിച്ച പൂപ്പൽ ~10 mL പുതിയ ഡെവലപ്പർ ഉപയോഗിച്ച് കഴുകുക, തുടർന്ന് ഒരു പൈപ്പറ്റ് ഉപയോഗിച്ച് ലായനി തളിച്ചുകൊണ്ട് IPA ഉപയോഗിക്കുക.
വേഫർ ഒരു പ്ലാസ്മ ക്ലീനറിൽ വയ്ക്കുക, തുടർന്ന് 1.5 മിനിറ്റ് ഓക്സിജൻ പ്ലാസ്മയിലേക്ക് (അന്തരീക്ഷ വാതകം, ലക്ഷ്യ മർദ്ദം 1 × 10−5 ടോർ, പവർ 125 W) തുറന്നുകാട്ടുക.
ഒരു ഗ്ലാസ് സ്ലൈഡ് ഉള്ള ഒരു വാക്വം ഡെസിക്കേറ്ററിൽ വേഫർ വയ്ക്കുക. വേഫറുകളും സ്ലൈഡുകളും അടുത്തടുത്തായി സ്ഥാപിക്കാം. വാക്വം ഡെസിക്കേറ്റർ ഒരു പ്ലേറ്റ് ഉപയോഗിച്ച് പല പാളികളായി വിഭജിച്ചിട്ടുണ്ടെങ്കിൽ, സ്ലൈഡുകൾ താഴത്തെ ചേമ്പറിലും വേഫറുകൾ മുകളിലെ ചേമ്പറിലും വയ്ക്കുക. ഒരു ഗ്ലാസ് സ്ലൈഡിൽ 100 ​​μL ട്രൈക്ലോറോ(1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl)സിലാൻ ലായനി ഇട്ട് സിലാനൈസേഷനായി വാക്വം പ്രയോഗിക്കുക.
37°C വാട്ടർ ബാത്തിൽ ശീതീകരിച്ച Caco-2 സെല്ലുകളുടെ ഒരു കുപ്പി ഉരുകുക, തുടർന്ന് ഉരുകിയ സെല്ലുകൾ 37°C യിൽ 15 mL മുൻകൂട്ടി ചൂടാക്കിയ Caco-2 മീഡിയം അടങ്ങിയ T75 ഫ്ലാസ്കിലേക്ക് മാറ്റുക.
~90% സംഗമസ്ഥാനത്ത് Caco-2 സെല്ലുകൾ കടത്തിവിടാൻ, ആദ്യം 37°C വാട്ടർ ബാത്തിൽ Caco-2 മീഡിയം, PBS, 0.25% trypsin/1 mM EDTA എന്നിവ ചൂടാക്കുക.
വാക്വം ആസ്പിറേഷൻ വഴി മീഡിയം ആസ്പിറേറ്റ് ചെയ്യുക. വാക്വം ആസ്പിറേഷൻ ആവർത്തിച്ച് പുതിയ പിബിഎസ് ചേർത്ത് 5 മില്ലി ചൂടുള്ള പിബിഎസ് ഉപയോഗിച്ച് സെല്ലുകൾ രണ്ടുതവണ കഴുകുക.