Nature.com സന്ദർശിച്ചതിന് നന്ദി.നിങ്ങൾ ഉപയോഗിക്കുന്ന ബ്രൗസർ പതിപ്പിന് CSS-ന് പരിമിതമായ പിന്തുണയേ ഉള്ളൂ. മികച്ച അനുഭവത്തിനായി, നിങ്ങൾ ഒരു അപ്‌ഡേറ്റ് ചെയ്‌ത ബ്രൗസർ (അല്ലെങ്കിൽ Internet Explorer-ൽ കോംപാറ്റിബിലിറ്റി മോഡ് ഓഫാക്കുക) ഉപയോഗിക്കാൻ ഞങ്ങൾ ശുപാർശ ചെയ്യുന്നു. അതിനിടയിൽ, തുടർ പിന്തുണ ഉറപ്പാക്കാൻ, ഞങ്ങൾ ശൈലികളും JavaScript ഇല്ലാതെ സൈറ്റ് പ്രദർശിപ്പിക്കും.
ഹ്യൂമൻ ഗട്ട് മോർഫോജെനിസിസ് 3D എപ്പിത്തീലിയൽ മൈക്രോ ആർക്കിടെക്ചറിന്റെയും സ്പേഷ്യൽ ഓർഗനൈസേഷന്റെയും ക്രിപ്റ്റ്-വില്ലസ് സവിശേഷതകൾ സ്ഥാപിക്കുന്നു. ബേസൽ ക്രിപ്റ്റിലെ സ്റ്റെം സെല്ലിനെ എക്സോജനസ് മൈക്രോബയൽ ആന്റിജനുകളിൽ നിന്നും അവയുടെ മെറ്റബോളിറ്റുകളിൽ നിന്നും സംരക്ഷിച്ച് കുടൽ ഹോമിയോസ്റ്റാസിസ് നിലനിർത്താൻ ഈ സവിശേഷമായ ഘടന ആവശ്യമാണ്. മ്യൂക്കോസൽ ഉപരിതലം. അതിനാൽ, ഇൻ വിട്രോ ഗട്ട് മോഡലുകളുടെ നിർമ്മാണത്തിന് 3D എപ്പിത്തീലിയൽ ഘടനകൾ പുനർനിർമ്മിക്കുന്നത് നിർണായകമാണ്. ശ്രദ്ധേയമായി, ഓർഗാനിക് മൈമെറ്റിക് ഗട്ട്-ഓൺ-എ-ചിപ്പിന് കുടൽ എപ്പിത്തീലിയത്തിന്റെ സ്വതസിദ്ധമായ 3D മോർഫോജെനിസിസ് പ്രേരിപ്പിക്കാൻ കഴിയും. ഒരു മൈക്രോഫ്ലൂയിഡിക് ചിപ്പിലും ട്രാൻസ്‌വെൽ ഉൾച്ചേർത്ത ഹൈബ്രിഡ് ചിപ്പിലും കുടലിലെ tinal morphogenesis. ഞങ്ങൾ ഉപകരണ ഫാബ്രിക്കേഷൻ, Caco-2 അല്ലെങ്കിൽ കുടൽ ഓർഗനോയിഡ് എപിത്തീലിയൽ സെല്ലുകളുടെ സംസ്‌കരണം എന്നിവയ്ക്കുള്ള വിശദമായ രീതികൾ വിവരിക്കുന്നു. പ്രോട്ടോക്കോൾ 5 d-ലേക്കുള്ള ബാസോലാറ്ററൽ ഫ്ലൂയിഡ് ഫ്ലോ നിയന്ത്രിക്കുന്നതിലൂടെ ഫംഗ്ഷണൽ ഗട്ട് മൈക്രോ ആർക്കിടെക്ചറിന്റെ പുനരുജ്ജീവനം കൈവരിക്കുന്നു. ഞങ്ങളുടെ ഇൻ വിട്രോ മോർഫോജെനിസിസ് രീതി ഫിസിയോളജിക്കൽ പ്രസക്തമായ ഷിയർ സ്ട്രെസും മെക്കാനിക്കൽ ചലനവും ഉപയോഗിക്കുന്നു, സങ്കീർണ്ണമായ സെൽ എഞ്ചിനീയറിംഗോ കൃത്രിമത്വമോ ആവശ്യമില്ല. ബയോമെഡിക്കൽ, ക്ലിനിക്കൽ, ഫാർമസ്യൂട്ടിക്കൽ ആപ്ലിക്കേഷനുകൾക്കുള്ള വിട്രോയിലെ എപ്പിത്തീലിയൽ പാളികൾ.
ഗട്ട്-ഓൺ-എ-ചിപ്പ്1,2,3,4,5 അല്ലെങ്കിൽ ബൈലെയർ മൈക്രോഫ്ലൂയിഡിക് ഉപകരണങ്ങളിൽ 6,7 സംസ്ക്കരിച്ച കുടൽ എപ്പിത്തീലിയൽ Caco-2 കോശങ്ങൾക്ക്, അടിസ്ഥാന സംവിധാനത്തെക്കുറിച്ച് വ്യക്തമായ ധാരണയില്ലാതെ, സ്വയമേവ 3D മോർഫോജെനിസിസ് വിട്രോയ്ക്ക് വിധേയമാക്കാൻ കഴിയുമെന്ന് പരീക്ഷണങ്ങൾ തെളിയിക്കുന്നു. ഡ്യൂസ് 3D എപ്പിത്തീലിയൽ മോർഫോജെനിസിസ് ഇൻ വിട്രോ, ഇത് Caco-2 ഉം രോഗിയിൽ നിന്ന് ഉരുത്തിരിഞ്ഞ കുടൽ ഓർഗനോയിഡുകളും തെളിയിച്ചിട്ടുണ്ട്.എപ്പിത്തീലിയൽ സെല്ലുകൾ സാധൂകരിക്കപ്പെട്ടു. ഈ പഠനത്തിൽ, “ഹൈബ്രിഡ് ചിപ്പ്” എന്ന് വിളിക്കപ്പെടുന്ന ട്രാൻസ്‌വെൽ ഇൻസേർട്ടുകൾ അടങ്ങിയ ഗട്ട്-ഓൺ-എ-ചിപ്പിലും പരിഷ്‌ക്കരിച്ച മൈക്രോഫ്ലൂയിഡിക് ഉപകരണങ്ങളിലുമുള്ള ശക്തമായ Wnt എതിരാളിയായ ഡിക്കോഫ്-1 (DKK-1) ന്റെ സെൽ ഉൽപ്പാദനത്തിലും ഏകാഗ്രത വിതരണത്തിലും ഞങ്ങൾ പ്രത്യേകം ശ്രദ്ധ കേന്ദ്രീകരിച്ചു. 1, സ്രവിക്കുന്ന ഫ്രിസ്‌ലെഡ്-റിലേറ്റഡ് പ്രോട്ടീൻ 1, അല്ലെങ്കിൽ സോഗി-1) ഓൺ-ചിപ്പ് ഗട്ട് മോർഫോജെനിസിസിനെ തടയുന്നു അല്ലെങ്കിൽ മുൻകൂട്ടി നിശ്ചയിച്ച 3D എപ്പിത്തീലിയൽ പാളിയെ തടസ്സപ്പെടുത്തുന്നു, ഇത് സംസ്ക്കാരത്തിനിടയിലെ വൈരുദ്ധ്യ സമ്മർദ്ദം കുടൽ മോർഫോജെനിസിസിന് കാരണമാകുമെന്ന് നിർദ്ദേശിക്കുന്നു. സജീവമായ ഫ്ലഷിംഗ് (ഉദാഹരണത്തിന്, ഗട്ട്-ഓൺ-എ-ചിപ്പ് അല്ലെങ്കിൽ ഹൈബ്രിഡ്-ഓൺ-എ-ചിപ്പ് പ്ലാറ്റ്‌ഫോമുകളിൽ) അല്ലെങ്കിൽ ഡിഫ്യൂഷൻ .ബാസോലേറ്ററൽ മീഡിയ (ഉദാഹരണത്തിന്, ട്രാൻസ്‌വെൽ വലിയ ബാസോലാറ്ററൽ റിസർവോയറുകളിലേക്ക് ഇൻസേർട്ട് ചെയ്യുന്നതിൽ നിന്ന്) ബാസോലാറ്ററൽ കമ്പാർട്ടുമെന്റിലെ Wnt എതിരാളികളുടെ അളവ് നിലനിർത്തുക.
ഈ പ്രോട്ടോക്കോളിൽ, ഞങ്ങൾ ഗട്ട്-ഓൺ-എ-ചിപ്പ് മൈക്രോ ഡിവൈസുകളും ട്രാൻസ്‌വെൽ-ഇൻസേർട്ടബിൾ ഹൈബ്രിഡ് ചിപ്പുകളും (ഘട്ടങ്ങൾ 1-5) പോളിഡിമെഥിൽസിലോക്സെയ്ൻ (PDMS)-അടിസ്ഥാനത്തിലുള്ള പോറസ് മെംബ്രണുകളിൽ (6A, 7A, 9A, 9A, 9A, 9-എസ്റ്റ് മെംബ്രൺ) അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള കുടൽ എപ്പിത്തീലിയൽ സെല്ലുകളെ സംസ്കരിക്കുന്നതിനുള്ള വിശദമായ രീതി നൽകുന്നു. s 6B, 7B, 8, 9) കൂടാതെ ഇൻഡ്യൂസ്‌ഡ് 3D മോർഫോജെനിസിസ് ഇൻ വിട്രോ (ഘട്ടം 10). ഒന്നിലധികം ഇമേജിംഗ് രീതികൾ പ്രയോഗിച്ച് ടിഷ്യു-നിർദ്ദിഷ്ട ഹിസ്റ്റോജെനിസിസ്, ലൈനേജ്-ആശ്രിത സെല്ലുലാർ ഡിഫറൻഷ്യേഷൻ എന്നിവയെ സൂചിപ്പിക്കുന്ന സെല്ലുലാർ, മോളിക്യുലാർ സവിശേഷതകളും ഞങ്ങൾ തിരിച്ചറിഞ്ഞു. അൽ ഓർഗനോയിഡുകൾ, പോറസ് മെംബ്രണുകളുടെ ഉപരിതല പരിഷ്‌ക്കരണം, 2 ഡി മോണോലെയറുകളുടെ സൃഷ്ടി, കുടൽ ബയോകെമിക്കൽ, ബയോമെക്കാനിക്കൽ മൈക്രോ എൻവയോൺമെന്റിന്റെ പുനരുൽപാദനം എന്നിവ ഉൾപ്പെടെയുള്ള സാങ്കേതിക വിശദാംശങ്ങളുള്ള രണ്ട് കൾച്ചർ ഫോർമാറ്റുകളിൽ. സംസ്കാരത്തിന്റെ കമ്പാർട്ട്മെന്റ്.അവസാനമായി, മോർഫോജൻ-ആശ്രിത എപ്പിത്തീലിയൽ വളർച്ച, രേഖാംശ ഹോസ്റ്റ്-മൈക്രോബയോം കോ-കൾച്ചറുകൾ, രോഗകാരി അണുബാധ, കോശജ്വലന പരിക്ക്, എപ്പിത്തീലിയൽ ബാരിയർ പ്രവർത്തന വൈകല്യങ്ങൾ, പ്രോബയോട്ടിക് അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള ചികിത്സകൾ എന്നിവയെ മാതൃകയാക്കാൻ ഉപയോഗിക്കാവുന്ന പുനരുൽപ്പാദിപ്പിക്കാവുന്ന 3D എപ്പിത്തീലിയൽ പാളിയുടെ ഉപയോഗത്തിന്റെ ഒരു പ്രാതിനിധ്യം ഞങ്ങൾ നൽകുന്നു.
അടിസ്ഥാനപരമായ (ഉദാ. കുടൽ മ്യൂക്കോസൽ ബയോളജി, സ്റ്റെം സെൽ ബയോളജി, ഡെവലപ്‌മെന്റൽ ബയോളജി), പ്രായോഗിക ഗവേഷണം (ഉദാ. പ്രീക്ലിനിക്കൽ ഡ്രഗ് ടെസ്റ്റിംഗ്, ഡിസീസ് മോഡലിംഗ്, ടിഷ്യൂ എഞ്ചിനീയറിംഗ്, ഗ്യാസ്ട്രോഎൻട്രോളജി) എന്നിവയിലെ വിശാലമായ ശ്രേണിയിലുള്ള ശാസ്ത്രജ്ഞർക്ക് ഞങ്ങളുടെ പ്രോട്ടോക്കോൾ ഉപയോഗപ്രദമായേക്കാം. കുടൽ വികസനം, പുനരുജ്ജീവനം അല്ലെങ്കിൽ ഹോമിയോസ്റ്റാസിസ് സമയത്ത് സെൽ സിഗ്നലിങ്ങിന്റെ ചലനാത്മകത പഠിക്കുന്ന പ്രേക്ഷകരിലേക്ക് ഞങ്ങളുടെ സാങ്കേതിക തന്ത്രം പ്രചരിപ്പിക്കാൻ കഴിയും. കൂടാതെ, നോറോവൈറസ് 8, സിവിയർ അക്യൂട്ട് റെസ്പിറേറ്ററി സിൻഡ്രോം കൊറോണ വൈറസ്, ക്ലോമോൺവി-2 (SARS-9), ക്ലോറോവി-2 (SARS-9), ബ്രിയോ കോളറ.രോഗത്തിന്റെ രോഗപഠനത്തിന്റെയും രോഗകാരികളുടെയും പ്രേക്ഷകർക്കും ഉപയോഗപ്രദമാണ്. ഓൺ-ചിപ്പ് ഗട്ട് മൈക്രോഫിസിയോളജി സിസ്റ്റത്തിന്റെ ഉപയോഗം രേഖാംശ കോ-കൾച്ചർ 10-നെയും തുടർന്നുള്ള ആതിഥേയ പ്രതിരോധം, രോഗപ്രതിരോധ പ്രതികരണങ്ങൾ, ദഹനനാളത്തിലെ (ജിഐ) ട്രാക്‌ടിലെ രോഗകാരിയുമായി ബന്ധപ്പെട്ട പരിക്ക് 11 വിലയിരുത്തുന്നതിനും അനുവദിച്ചേക്കാം. രോഗിയുടെ 3D കുടൽ എപ്പിത്തീലിയൽ പാളികൾ ഉപയോഗിച്ച് 3D കുടൽ എപ്പിത്തീലിയൽ പാളികൾ തയ്യാറാക്കുമ്പോൾ വൻകുടൽ പുണ്ണ്, പൗച്ചൈറ്റിസ് അല്ലെങ്കിൽ ഇറിറ്റബിൾ ബവൽ സിൻഡ്രോം അനുകരിക്കാം, ഈ രോഗങ്ങളിൽ വില്ലസ് അട്രോഫി, ക്രിപ്റ്റ് ഷോർട്ടനിംഗ്, മ്യൂക്കോസൽ ക്ഷതം, അല്ലെങ്കിൽ വൈകല്യമുള്ള എപ്പിത്തീലിയൽ ബാരിയർ എന്നിവ ഉൾപ്പെടുന്നു. രോഗ പരിതസ്ഥിതിയുടെ ഉയർന്ന സങ്കീർണ്ണത, 3D കുടൽ വില്ലസ്-ക്രിപ്റ്റ് മൈക്രോ ആർക്കിടെക്ചറുകൾ അടങ്ങിയ മോഡലുകളിലേക്ക് രോഗിയുടെ പെരിഫറൽ ബ്ലഡ് മോണോ ന്യൂക്ലിയർ സെല്ലുകൾ (PBMCs) പോലെയുള്ള രോഗവുമായി ബന്ധപ്പെട്ട കോശ തരങ്ങൾ ചേർക്കുന്നത് വായനക്കാർ പരിഗണിച്ചേക്കാം.ടിഷ്യു-നിർദ്ദിഷ്ട രോഗപ്രതിരോധ കോശങ്ങൾ, 5.
3D എപ്പിത്തീലിയൽ മൈക്രോസ്ട്രക്ചർ ശരിയാക്കാനും ദൃശ്യവൽക്കരിക്കാനും കഴിയും എന്നതിനാൽ, സ്പേഷ്യൽ ട്രാൻസ്‌ക്രിപ്‌റ്റോമിക്‌സ്, ഹൈ-റെസല്യൂഷൻ അല്ലെങ്കിൽ സൂപ്പർ-റെസല്യൂഷൻ ഇമേജിംഗ് എന്നിവയിൽ പ്രവർത്തിക്കുന്ന കാഴ്‌ചക്കാർക്ക് എപ്പിത്തീലിയൽ നിച്ചുകളിലെ ജീനുകളുടെയും പ്രോട്ടീനുകളുടെയും സ്പേഷ്യോ ടെമ്പറൽ ഡൈനാമിക്‌സിന്റെ മാപ്പിംഗിൽ താൽപ്പര്യമുണ്ടാകാം.സാങ്കേതികവിദ്യയിൽ താൽപ്പര്യമുണ്ട്. മൈക്രോബയൽ അല്ലെങ്കിൽ രോഗപ്രതിരോധ ഉത്തേജകങ്ങളോടുള്ള പ്രതികരണം. കൂടാതെ, രേഖാംശ ഹോസ്റ്റ്-മൈക്രോബയോം ക്രോസ്‌സ്റ്റോക്ക് 10, 14, 3D കുടൽ ഹോമിയോസ്റ്റാസിസ് ഏകോപിപ്പിക്കുന്ന വിവിധ സൂക്ഷ്മജീവികളെ, മൈക്രോബയൽ കമ്മ്യൂണിറ്റികളെ, പ്രത്യേകിച്ച് ഫെക്കൽ-മൈക്രോബയോട്ടയിൽ 3D കുടൽ മ്യൂക്കോസൽ പാളിയിൽ സ്ഥാപിക്കാൻ കഴിയും.പ്ലാറ്റ്‌ഫോമിൽ. മ്യൂക്കോസൽ ഇമ്മ്യൂണോളജി, ഗ്യാസ്‌ട്രോഎൻട്രോളജി, ഹ്യൂമൻ മൈക്രോബയോം, കൾച്ചറോമിക്‌സ്, ക്ലിനിക്കൽ മൈക്രോബയോളജി എന്നിവ പഠിക്കുന്ന പ്രേക്ഷകർക്ക് ഈ സമീപനം പ്രത്യേകിച്ചും ആകർഷകമാണ്, മുമ്പ് സംസ്‌കരിക്കാത്ത ഗട്ട് മൈക്രോബയോട്ട ലബോറട്ടറിയിൽ വളർത്താൻ ശ്രമിക്കുന്നു. ബാസോലാറ്ററൽ കമ്പാർട്ടുമെന്റുകൾ നിറയ്ക്കുക, ഭക്ഷ്യ വ്യവസായത്തിനായി ഫാർമസ്യൂട്ടിക്കൽ, ബയോമെഡിക്കൽ അല്ലെങ്കിൽ ഹൈ-ത്രൂപുട്ട് സ്ക്രീനിംഗ് അല്ലെങ്കിൽ വാലിഡേഷൻ പ്ലാറ്റ്‌ഫോമുകൾ വികസിപ്പിക്കുന്നവർക്കും പ്രോട്ടോക്കോൾ പ്രചരിപ്പിക്കാൻ കഴിയും. ഒരു തത്ത്വത്തിന്റെ തെളിവായി, ഞങ്ങൾ അടുത്തിടെ മൾട്ടിപ്ലക്‌സ് ഹൈ-ത്രൂപുട്ട് മോർഫോജെനിസിസ് ഉൽപ്പന്നങ്ങൾക്കായി മൾട്ടിപ്ലക്‌സ് ഹൈ-ത്രൂപുട്ട് മോർഫോജെനിസിസ് ഉൽപ്പന്നങ്ങളുടെ സാദ്ധ്യത തെളിയിച്ചു. 16,17,18 വാണിജ്യവൽക്കരിക്കപ്പെട്ടിരിക്കുന്നു. അതിനാൽ, ഇൻ വിട്രോ ഗട്ട് മോർഫോജെനിസിസിന്റെ സെല്ലുലാർ റീപ്രോഗ്രാമിംഗ് മനസിലാക്കാൻ നിരവധി ഗവേഷണ ലബോറട്ടറികൾ, വ്യവസായ അല്ലെങ്കിൽ ഗവൺമെന്റ്, റെഗുലേറ്ററി ഏജൻസികൾ എന്നിവയ്ക്ക് ഞങ്ങളുടെ ഇൻ വിട്രോ മോർഫോജെനിസിസ് രീതിയുടെ സാധൂകരണം ത്വരിതപ്പെടുത്താനും അവലംബിക്കാനും കഴിയും. ഗട്ട് മോർഫോജെനിസിസ് പ്രക്രിയയുടെ പുനരുൽപ്പാദനക്ഷമത വിലയിരുത്തുന്നതിന് റോഗേറ്റുകൾ അല്ലെങ്കിൽ ഇഷ്‌ടാനുസൃത അല്ലെങ്കിൽ വാണിജ്യ ഓർഗൻ-ഓൺ-എ-ചിപ്പ് മോഡലുകൾ ഉപയോഗിക്കുന്നു.
കുടൽ എപ്പിത്തീലിയൽ മോർഫോജെനിസിസ് പഠിക്കാൻ പരിമിതമായ എണ്ണം മനുഷ്യ-പ്രസക്തമായ പരീക്ഷണ മോഡലുകൾ ഉപയോഗിച്ചിട്ടുണ്ട്, പ്രധാനമായും വിട്രോയിൽ 3D മോർഫോജെനിസിസ് പ്രേരിപ്പിക്കുന്നതിനുള്ള പ്രാവർത്തികമാക്കാവുന്ന പ്രോട്ടോക്കോളുകളുടെ അഭാവമാണ്. വാസ്തവത്തിൽ, ഗട്ട് മോർഫോജെനിസിസിനെക്കുറിച്ചുള്ള നിലവിലെ അറിവുകളിൽ ഭൂരിഭാഗവും മൃഗ പഠനങ്ങളെ അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ളതാണ് (ഉദാ. ധാർമ്മികമായി സംശയാസ്പദമായിരിക്കുക, ഏറ്റവും പ്രധാനമായി, മാനുഷിക വികസന പ്രക്രിയകളെ കൃത്യമായി നിർണയിക്കരുത്. ഈ മോഡലുകൾ മൾട്ടി-വേ സ്കേലബിൾ രീതിയിൽ പരീക്ഷിക്കുന്നതിനുള്ള കഴിവിലും വളരെ പരിമിതമാണ്. അതിനാൽ, വിട്രോയിലെ 3D ടിഷ്യു ഘടനകളെ പുനരുജ്ജീവിപ്പിക്കാനുള്ള ഞങ്ങളുടെ പ്രോട്ടോക്കോൾ vivo അനിമൽ മോഡലുകളെ മറികടക്കുന്നു. വിവിധ മ്യൂക്കോസൽ അല്ലെങ്കിൽ രോഗപ്രതിരോധ ഉത്തേജകങ്ങളോടുള്ള പ്രതികരണമായി ക്രിപ്റ്റ്-വില്ലസ് അച്ചുതണ്ടിലെ വ്യത്യസ്തമായ കോശങ്ങളുടെ സ്പേഷ്യൽ പ്രാദേശികവൽക്കരണം. 3D എപ്പിത്തീലിയൽ പാളികൾക്ക് സൂക്ഷ്മജീവ കോശങ്ങൾ ആതിഥേയ ഘടകങ്ങളോട് പ്രതികരണമായി സ്പേഷ്യൽ മാടങ്ങളും പാരിസ്ഥിതിക പരിണാമവും രൂപപ്പെടുത്തുന്നതിന് മത്സരിക്കുന്നത് എങ്ങനെയെന്ന് പഠിക്കാൻ ഒരു ഇടം നൽകും (ഉദാ. ഗട്ട് മൈക്രോബയോട്ട അതിന്റെ കമ്മ്യൂണിറ്റികളെ എങ്ങനെ രൂപപ്പെടുത്തുന്നുവെന്നും സിനർജിസ്റ്റിക് ആയി മൈക്രോബയൽ മെറ്റബോളിറ്റുകളെ (ഉദാ, ഷോർട്ട്-ചെയിൻ ഫാറ്റി ആസിഡുകൾ) ഉത്പാദിപ്പിക്കുന്നത് എങ്ങനെയെന്ന് മനസ്സിലാക്കാൻ ഫോളജി നമ്മെ അനുവദിക്കുന്നു, അത് സെല്ലുലാർ ഓർഗനൈസേഷനും ബേസൽ ക്രിപ്റ്റുകളിലെ സ്റ്റെം സെൽ നിച്ചുകളും രൂപപ്പെടുത്തുന്നു.
3D കുടൽ എപ്പിത്തീലിയൽ ഘടനകൾ സൃഷ്ടിക്കുന്നതിനുള്ള ഞങ്ങളുടെ രീതിക്ക് പുറമേ, നിരവധി ഇൻ വിട്രോ രീതികളും ഉണ്ട്. പ്രത്യേക മോർഫോജൻ സാഹചര്യങ്ങളിൽ കുടൽ സ്റ്റെം സെല്ലുകളുടെ കൃഷിയെ അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള ഒരു അത്യാധുനിക ടിഷ്യു എഞ്ചിനീയറിംഗ് സാങ്കേതികതയാണ് ഇൻറ്റസ്റ്റൈനൽ ഓർഗനോയിഡ് കൾച്ചർ ഓർഗനോയിഡിനുള്ളിൽ അടച്ചിരിക്കുന്നു, അതിനാൽ, മൈക്രോബയൽ സെല്ലുകൾ അല്ലെങ്കിൽ എക്സോജനസ് ആന്റിജനുകൾ പോലുള്ള ലുമിനൽ ഘടകങ്ങളുടെ ആമുഖം പരിമിതമാണ്.ഓർഗനോയിഡ് ല്യൂമനുകളിലേക്കുള്ള പ്രവേശനം ഒരു മൈക്രോഇൻജെക്റ്റർ ഉപയോഗിച്ച് മെച്ചപ്പെടുത്താം, 26,27, എന്നാൽ ഈ രീതി അധിനിവേശവും അധ്വാനവും കൂടുതലുള്ളതും നിർവ്വഹിക്കുന്നതിന് പ്രത്യേക അറിവ് ആവശ്യമാണ്. കൂടാതെ, സ്റ്റാറ്റിക് അവസ്ഥയിൽ ഹൈഡ്രോജൽ സ്കാർഫോൾഡുകളിൽ പരിപാലിക്കുന്ന പരമ്പരാഗത ഓർഗനോയിഡ് സംസ്കാരങ്ങൾ വിവോ ബയോമെക്കാനിക്സിൽ സജീവമായി പ്രതിഫലിക്കുന്നില്ല.
ജെൽ ഉപരിതലത്തിൽ ഒറ്റപ്പെട്ട മനുഷ്യ കുടൽ കോശങ്ങളെ സംസ്കരിച്ച് ഗട്ട് എപ്പിത്തീലിയൽ ഘടനയെ അനുകരിക്കാൻ പല ഗവേഷണ ഗ്രൂപ്പുകളും ഉപയോഗിക്കുന്ന മറ്റ് സമീപനങ്ങൾ പ്രീസ്ട്രക്ചർ ചെയ്ത 3D ഹൈഡ്രോജൽ സ്കാർഫോൾഡുകൾ ഉപയോഗിക്കുന്നു. പ്രസക്തമായ മോർഫോജൻ ഗ്രേഡിയന്റുകൾ, ഉയർന്ന വീക്ഷണാനുപാതമായ എപ്പിത്തീലിയൽ ഘടനയും സ്‌ട്രോമ-എപ്പിത്തീലിയൽ ക്രോസ്‌സ്റ്റോക്കും സ്‌കഫോൾഡിൽ സ്‌ട്രോമൽ സെല്ലുകൾ ഉൾപ്പെടുത്തി സ്‌ട്രോമ-എപിത്തീലിയൽ ക്രോസ്‌സ്റ്റോക്ക് സ്ഥാപിക്കുന്നു. എന്നിരുന്നാലും, സ്‌കഫോൾഡിൽ സ്‌ട്രോമൽ സെല്ലുകളുടെ സ്വഭാവം സ്വയമേവയുള്ള മോർഫോജെനെറ്റിക് പ്രദർശനം തടയാം. മോർഫോജെനിസിസും ഫിസിയോളജിക്കൽ ഫംഗ്‌ഷനും നേടുന്നു. മറ്റൊരു സമീപകാല പഠനം ഒരു മൈക്രോഫ്ലൂയിഡിക് പ്ലാറ്റ്‌ഫോമിൽ ഹൈഡ്രോജൽ സ്‌കാഫോൾഡുകളും ലേസർ-എച്ചിംഗ് ടെക്‌നിക്കുകൾ ഉപയോഗിച്ച് പാറ്റേൺ ചെയ്ത കുടൽ എപ്പിത്തീലിയൽ ഘടനകളും ഉപയോഗിച്ചു. മൗസിന്റെ കുടൽ ഓർഗനോയിഡുകൾ കുടൽ ട്യൂബുലാർ ഘടനകൾ രൂപപ്പെടുത്തുന്നതിന് കൊത്തുപണി പാറ്റേണുകൾ പിന്തുടരുന്നു. സ്വയമേവയുള്ള മോർഫോജെനറ്റിക് പ്രക്രിയകളോ ഗട്ട് മെക്കാനിക്കൽ ചലനങ്ങളോ ഉൾപ്പെടുന്നില്ല. ഒരേ ഗ്രൂപ്പിൽ നിന്നുള്ള 3D പ്രിന്റിംഗ് ടെക്നിക്കുകൾക്ക് സ്വതസിദ്ധമായ മോർഫോജെനെറ്റിക് പ്രക്രിയകളുള്ള മിനിയേച്ചർ ഗട്ട് ട്യൂബുകൾ സൃഷ്ടിക്കാൻ കഴിഞ്ഞു. ട്യൂബിനുള്ളിലെ വിവിധ ഗട്ട് സെഗ്‌മെന്റുകളുടെ സങ്കീർണ്ണമായ ഫാബ്രിക്കേഷൻ ഉണ്ടായിരുന്നിട്ടും, ഈ മോഡലിന് ലുമിനൽ ഫ്ളൂയിഡ് ഫ്ലോയും മെക്കാനിക്കൽ വൈകല്യവും ഇല്ലായിരിക്കാം, പ്രത്യേകിച്ചും പ്രവർത്തനത്തിന്റെ പൂർണ്ണമായ രൂപഭേദം. ബിംഗ് പരീക്ഷണാത്മക സാഹചര്യങ്ങൾ അല്ലെങ്കിൽ സെൽ-ടു-സെൽ ഇടപെടലുകൾ.പകരം, ഞങ്ങളുടെ നിർദ്ദിഷ്ട പ്രോട്ടോക്കോൾ സ്വയമേവയുള്ള ഗട്ട് മോർഫോജെനിസിസ്, ഫിസിയോളജിക്കൽ പ്രസക്തമായ ഷിയർ സ്ട്രെസ്, ഗട്ട് ചലനത്തെ അനുകരിക്കുന്ന ബയോമെക്കാനിക്സ്, സ്വതന്ത്ര അഗ്ര-ബാസോലാറ്ററൽ കമ്പാർട്ടുമെന്റുകളുടെ പ്രവേശനക്ഷമത, സങ്കീർണ്ണമായ ജൈവ സൂക്ഷ്മ പരിസ്ഥിതിയുടെ പുനർനിർമ്മാണം എന്നിവ നൽകുന്നു. നിലവിലുള്ള രീതികളുടെ വെല്ലുവിളികളെ മറികടക്കാൻ ഒരു പൂരക സമീപനം നൽകുക.
ഞങ്ങളുടെ പ്രോട്ടോക്കോൾ പൂർണ്ണമായും 3D എപ്പിത്തീലിയൽ മോർഫോജെനിസിസിൽ ശ്രദ്ധ കേന്ദ്രീകരിച്ചിരിക്കുന്നു, സംസ്‌കാരത്തിൽ എപ്പിത്തീലിയൽ സെല്ലുകൾ മാത്രമേയുള്ളൂ, ചുറ്റുമുള്ള കോശങ്ങളായ മെസെൻകൈമൽ സെല്ലുകൾ, എൻഡോതെലിയൽ സെല്ലുകൾ, ഇമ്മ്യൂൺ സെല്ലുകൾ എന്നിവയൊന്നുമില്ല. മുമ്പ് വിവരിച്ചതുപോലെ, ഞങ്ങളുടെ പ്രോട്ടോക്കോളിന്റെ കാതൽ എപ്പിത്തീലിയൽ മോർഫോജെനിസിസിന്റെ ഇൻഡക്ഷൻ ആണ്. ഞങ്ങളുടെ ഗട്ട്-ഓൺ-എ-ചിപ്പിന്റെയും ഹൈബ്രിഡ്-ഓൺ-എ-ചിപ്പിന്റെയും മോഡുലാരിറ്റി, 3D എപ്പിത്തീലിയൽ പാളി പുനർനിർമ്മിക്കാൻ ഞങ്ങളെ അനുവദിക്കുന്നു, അധിക ജൈവ സങ്കീർണതകളായ എപ്പിത്തീലിയൽ-മെസെൻചൈമൽ ഇന്ററാക്ഷൻസ്33,34, എക്സ്ട്രാ സെല്ലുലാർ മാട്രിക്സ് (ECM) ഡിപ്പോസിഷൻ 35, കൂടാതെ, നമ്മുടെ മാതൃകയിൽ, ക്രിപ്റ്റ്-വില്ലുകളുടെ ഘടനാപരമായ സവിശേഷതകളായി കണക്കാക്കപ്പെടുന്നു. മെസെൻകൈമിലെ ട്രോമൽ സെല്ലുകൾ (ഉദാ, ഫൈബ്രോബ്ലാസ്റ്റുകൾ) ഇസിഎം പ്രോട്ടീനുകളുടെ ഉൽപാദനത്തിലും കുടൽ മോർഫോജെനിസിസ് നിയന്ത്രിക്കുന്നതിലും പ്രധാന പങ്ക് വഹിക്കുന്നു. ഞങ്ങളുടെ മോഡലിൽ മെസെൻചൈമൽ സെല്ലുകൾ ചേർക്കുന്നത് മോർഫോജെനറ്റിക് പ്രക്രിയയും സെൽ അറ്റാച്ച്മെന്റ് കാര്യക്ഷമതയും വർദ്ധിപ്പിക്കുന്നു. 9, ഗട്ട് മൈക്രോ എൻവയോൺമെന്റിൽ ഇമ്മ്യൂൺ സെൽ റിക്രൂട്ട്‌മെന്റ്40. കൂടാതെ, ടിഷ്യൂ മോഡലുകൾ മൾട്ടി-ഓർഗൻ ഇടപെടലുകൾ പ്രകടിപ്പിക്കാൻ രൂപകൽപ്പന ചെയ്യുമ്പോൾ ടിഷ്യൂ മോഡലുകൾക്കിടയിൽ ബന്ധിപ്പിക്കാൻ കഴിയുന്ന വാസ്കുലേച്ചർ ഘടകങ്ങൾ ഒരു മുൻവ്യവസ്ഥയാണ്. അതിനാൽ, എൻഡോതെലിയൽ സെല്ലുകൾ ഉൾപ്പെടുത്തേണ്ടതായി വന്നേക്കാം. അഡാപ്റ്റീവ് ഇമ്യൂൺ ക്രോസ്‌സ്റ്റോക്ക് കഴിച്ചു, കുടൽ രോഗത്തെ അനുകരിക്കുന്ന പശ്ചാത്തലത്തിൽ ടിഷ്യു-നിർദ്ദിഷ്ട പ്രതിരോധശേഷി.
ഹൈബ്രിഡ് ചിപ്പുകളുടെ ഉപയോഗം ഗട്ട്-ഓൺ-എ-ചിപ്പിനെക്കാൾ ലളിതമാണ്, കാരണം ഉപകരണ സജ്ജീകരണം ലളിതവും ട്രാൻസ്‌വെൽ ഇൻസേർട്ടുകളുടെ ഉപയോഗം ഗട്ട് എപിത്തീലിയത്തിന്റെ സ്കേലബിൾ സംസ്‌കാരത്തെ അനുവദിക്കുന്നു. എന്നിരുന്നാലും, വാണിജ്യപരമായി ലഭ്യമായ പോളിസ്റ്റർ മെംബ്രണുകളുള്ള ട്രാൻസ്‌വെൽ ഇൻസെർട്ടുകൾ ഇലാസ്റ്റിക് അല്ല, മാത്രമല്ല ട്രാൻസ്‌വെൽ തരംഗങ്ങളെ താരതമ്യപ്പെടുത്താൻ കഴിയില്ല. ഹൈബ്രിഡ് ചിപ്പ് അഗ്രഭാഗത്ത് കത്രിക സമ്മർദ്ദമില്ലാതെ നിശ്ചലമായി തുടർന്നു. വ്യക്തമായും, അഗ്രഭാഗത്തെ കമ്പാർട്ടുമെന്റിലെ സ്റ്റാറ്റിക് പ്രോപ്പർട്ടികൾ ഹൈബ്രിഡ് ചിപ്പുകളിൽ ദീർഘകാല ബാക്റ്റീരിയൽ കോ-കൾച്ചറിനെ അപൂർവ്വമായി പ്രാപ്തമാക്കുന്നു. ട്രാൻസ്‌വെല്ലിൽ നമുക്ക് ശക്തമായി 3D മോർഫോജെനിസിസ് പ്രേരിപ്പിക്കാനാകും, അതേസമയം ഹൈബ്രിഡ് ഫ്‌ളൂയിഡ് ഫ്‌ളൂയിഡ് പരിമിതപ്പെടുത്തിയേക്കാം. സാധ്യതയുള്ള ആപ്ലിക്കേഷനുകൾക്കായി ഹൈബ്രിഡ് ചിപ്പ് പ്ലാറ്റ്‌ഫോമുകളുടെ സാദ്ധ്യത.
ഗട്ട്-ഓൺ-എ-ചിപ്പ്, ഹൈബ്രിഡ്-ഓൺ-എ-ചിപ്പ് സംസ്കാരങ്ങളിലെ ഹ്യൂമൻ ക്രിപ്റ്റ്-വില്ലസ് അച്ചുതണ്ടിന്റെ പൂർണ്ണ തോതിലുള്ള പുനർനിർമ്മാണം പൂർണ്ണമായി സ്ഥാപിക്കപ്പെട്ടിട്ടില്ല. മോർഫോജെനിസിസ് ആരംഭിക്കുന്നത് ഒരു എപ്പിത്തീലിയൽ മോണോലെയറിൽ നിന്നായതിനാൽ, 3D മൈക്രോ ആർക്കിടെക്ചറുകൾ ക്രിപ്റ്റിന്റെ ക്രിപ്റ്റിംഗ് പോപ്പുലേഷനുമായി സാമ്യമുള്ള ജീവജാലങ്ങളുടെ സ്വഭാവത്തിന് സമാനത നൽകണമെന്നില്ല. മൈക്രോ എഞ്ചിനീയറിംഗ് 3D എപിത്തീലിയത്തിലെ ഡൊമെയ്‌ൻ, ക്രിപ്റ്റ്, വില്ലസ് മേഖലകൾ വ്യക്തമായി വേർതിരിക്കപ്പെട്ടിട്ടില്ല. ചിപ്പിലെ ഉയർന്ന മുകളിലെ ചാനലുകൾ മൈക്രോ എഞ്ചിനീയറിംഗ് എപിത്തീലിയത്തിന്റെ ഉയരം വർദ്ധിപ്പിക്കുന്നതിലേക്ക് നയിക്കുന്നുണ്ടെങ്കിലും, പരമാവധി ഉയരം ഇപ്പോഴും ~300–400 µm ആയി പരിമിതപ്പെടുത്തിയിരിക്കുന്നു. യഥാക്രമം µm, ചെറുകുടൽ വില്ലിയുടെ ഉയരം ~600 µm41 ആണ്.
ഒരു ഇമേജിംഗ് കാഴ്ചപ്പാടിൽ, 3D മൈക്രോ ആർക്കിടെക്ചറുകളുടെ സിറ്റു സൂപ്പർ റെസല്യൂഷൻ ഇമേജിംഗ് ഒരു ചിപ്പിലെ കുടലിലേക്ക് പരിമിതപ്പെടുത്തിയേക്കാം, കാരണം ഒബ്ജക്റ്റീവ് ലെൻസിൽ നിന്ന് എപ്പിത്തീലിയൽ ലെയറിലേക്കുള്ള ആവശ്യമായ പ്രവർത്തന ദൂരം കുറച്ച് മില്ലിമീറ്ററാണ്. ഈ പ്രശ്നം മറികടക്കാൻ, ഒരു വിദൂര ലക്ഷ്യം ആവശ്യമായി വന്നേക്കാം. DMS.കൂടാതെ, ഒരു ചിപ്പിലെ ഗട്ടിന്റെ ലെയർ-ബൈ-ലെയർ മൈക്രോഫാബ്രിക്കേഷനിൽ ഓരോ ലെയറിനുമിടയിൽ സ്ഥിരമായ അഡീഷൻ ഉൾപ്പെടുന്നതിനാൽ, എപ്പിത്തീലിയൽ ലെയറിന്റെ ഉപരിതല ഘടന പരിശോധിക്കുന്നതിന് മുകളിലെ പാളി തുറക്കുകയോ നീക്കം ചെയ്യുകയോ ചെയ്യുന്നത് അങ്ങേയറ്റം വെല്ലുവിളിയാണ്. ഉദാഹരണത്തിന്, ഒരു സ്കാനിംഗ് ഇലക്ട്രോൺ മൈക്രോസ്കോപ്പ് (SEM) ഉപയോഗിച്ച്.
ഹൈഡ്രോഫോബിക് ചെറിയ തന്മാത്രകൾ കൈകാര്യം ചെയ്യുന്ന മൈക്രോഫ്ലൂയിഡിക് അധിഷ്ഠിത പഠനങ്ങളിൽ PDMS-ന്റെ ഹൈഡ്രോഫോബിസിറ്റി പരിമിതപ്പെടുത്തുന്ന ഘടകമാണ്, കാരണം PDMS-ന് അത്തരം ഹൈഡ്രോഫോബിക് തന്മാത്രകളെ പ്രത്യേകമായി ആഗിരണം ചെയ്യാൻ കഴിയും. 43) ഹൈഡ്രോഫോബിക് തന്മാത്രകളുടെ ആഗിരണം കുറയ്ക്കുന്നതിന് പരിഗണിക്കാം.
അവസാനമായി, ഉയർന്ന ത്രൂപുട്ട് സ്ക്രീനിംഗ് അല്ലെങ്കിൽ "എല്ലാത്തിനും യോജിക്കുന്ന" ഉപയോക്തൃ-സൗഹൃദ പരീക്ഷണ പ്ലാറ്റ്ഫോം നൽകുന്ന കാര്യത്തിൽ ഞങ്ങളുടെ രീതി നന്നായി ചിത്രീകരിച്ചിട്ടില്ല. നിലവിലെ പ്രോട്ടോക്കോളിന് ഓരോ മൈക്രോ ഉപകരണത്തിനും ഒരു സിറിഞ്ച് പമ്പ് ആവശ്യമാണ്, അത് CO2 ഇൻകുബേറ്ററിൽ ഇടം പിടിക്കുകയും വലിയ തോതിലുള്ള പരീക്ഷണങ്ങളെ തടയുകയും ചെയ്യുന്നു. ഈ പരിമിതി ഗണ്യമായി മെച്ചപ്പെടുത്താം. 384-നല്ല പോറസ് ഇൻസെർട്ടുകൾ തുടർച്ചയായി നികത്താനും ബാസോലാറ്ററൽ മീഡിയ നീക്കംചെയ്യാനും അനുവദിക്കുന്നു).
വിട്രോയിലെ ഹ്യൂമൻ ഇന്റസ്റ്റൈനൽ എപിത്തീലിയത്തിന്റെ 3D മോർഫോജെനിസിസ് പ്രേരിപ്പിക്കുന്നതിന്, ഒരു ല്യൂമൻ-കാപ്പിലറി ഇന്റർഫേസ് സൃഷ്‌ടിക്കാൻ രണ്ട് സമാന്തര മൈക്രോചാനലുകളും അതിനിടയിൽ ഒരു ഇലാസ്റ്റിക് പോറസ് മെംബ്രണും അടങ്ങുന്ന മൈക്രോഫ്ലൂയിഡിക് ചിപ്പ് ഇൻറ്റസ്റ്റൈനൽ ഉപകരണം ഞങ്ങൾ ഉപയോഗിച്ചു. ട്രാൻസ്‌വെൽ ഇൻസെർട്ടുകളിൽ വളരുന്ന എപ്പിത്തീലിയൽ പാളികൾ. രണ്ട് പ്ലാറ്റ്‌ഫോമുകളിലും, ബാസോലാറ്ററൽ കമ്പാർട്ട്‌മെന്റിൽ നിന്ന് മോർഫോജൻ എതിരാളികളെ നീക്കം ചെയ്യുന്നതിനായി ഒഴുക്കിന്റെ ദിശാസൂചന കൃത്രിമം പ്രയോഗിച്ച് വിവിധ മനുഷ്യ കുടലിലെ എപ്പിത്തീലിയൽ സെല്ലുകളുടെ മോർഫോജെനിസിസ് തെളിയിക്കാനാകും. മുഴുവൻ പരീക്ഷണ പ്രക്രിയയും (ചിത്രം 1) അഞ്ച് ഭാഗങ്ങൾ ഉൾക്കൊള്ളുന്നു. eps 1-5; ബോക്സ് 1), (ii) കുടൽ എപ്പിത്തീലിയൽ സെല്ലുകൾ (കാക്കോ-2 സെല്ലുകൾ) അല്ലെങ്കിൽ മനുഷ്യ കുടൽ ഓർഗനോയിഡുകൾ തയ്യാറാക്കൽ;ബോക്സുകൾ 2-5), (iii) കുടൽ ചിപ്പുകളിലോ ഹൈബ്രിഡ് ചിപ്പുകളിലോ ഉള്ള കുടൽ എപ്പിത്തീലിയൽ സെല്ലുകളുടെ സംസ്ക്കാരം (ഘട്ടങ്ങൾ 6-9), (iv) വിട്രോയിൽ 3D മോർഫോജെനിസിസ് ഇൻഡക്ഷൻ (ഘട്ടം 10) കൂടാതെ (v) ) 3D എപ്പിത്തീലിയൽ സൂക്ഷ്മഘടനയുടെ സ്വഭാവം വ്യക്തമാക്കുന്നതിന് താഴെയുള്ള 3D എപിത്തീലിയൽ മൈക്രോസ്ട്രക്ചർ (അനുയോജ്യമായ ഒരു ഗ്രൂപ്പ് 1-2. ) എപ്പിത്തീലിയൽ മോർഫോജെനിസിസിനെ സ്പേഷ്യൽ, ടെമ്പറൽ, സോപാധിക അല്ലെങ്കിൽ പ്രൊസീജറൽ നിയന്ത്രണങ്ങളുമായി താരതമ്യം ചെയ്തുകൊണ്ട് ഇൻ വിട്രോ മോർഫോജെനിസിസിന്റെ ഫലപ്രാപ്തിയെ സാധൂകരിക്കാൻ രൂപകൽപ്പന ചെയ്‌തിരിക്കുന്നു.
ഞങ്ങൾ രണ്ട് വ്യത്യസ്‌ത സംസ്‌കാര പ്ലാറ്റ്‌ഫോമുകൾ ഉപയോഗിച്ചു: നേരായ ചാനലുകളുള്ള ഗട്ട്-ഓൺ-എ-ചിപ്പ്, അല്ലെങ്കിൽ ബോക്‌സ് 1-ൽ വിവരിച്ചിരിക്കുന്നതുപോലെ മൈക്രോഫ്ലൂയിഡിക് ഉപകരണത്തിൽ ട്രാൻസ്‌വെൽ (ടിഡബ്ല്യു) ഇൻസേർട്ടുകൾ അടങ്ങിയ ഹൈബ്രിഡ് ചിപ്പുകൾ, കൂടാതെ സ്റ്റെപ്പ് 1 -5.”ഡിവൈസ് ഫാബ്രിക്കേഷൻ” ഒരു ഹൈബ്രിഡ് ചിപ്പ് നിർമ്മിക്കുന്നതിനുള്ള പ്രധാന ഘട്ടങ്ങൾ കാണിക്കുന്നു. ഈ പ്രോട്ടോക്കോളിൽ ഉപയോഗിച്ചിരിക്കുന്ന കോശ സ്രോതസ്സും (കാക്കോ-2 അല്ലെങ്കിൽ മനുഷ്യ കുടൽ ഓർഗനോയിഡുകൾ) സംസ്ക്കരണ പ്രക്രിയയും കാണിക്കുന്നു. ഓരോ അമ്പടയാളത്തിന് താഴെയും സ്റ്റെപ്പ് നമ്പറോ ബോക്സ് നമ്പറോ പ്രദർശിപ്പിച്ചിരിക്കുന്നു. സെൽ ഡിഫറൻഷ്യേഷൻ സ്വഭാവം, ഗട്ട് ഫിസിയോളജി സ്റ്റഡീസ്, ഹോസ്റ്റ്-മൈക്രോബയോം ഇക്കോസിസ്റ്റംസ്, ഡിസീസ് മോഡലിംഗ് എന്നിവയിൽ കുടൽ എപ്പിത്തീലിയൽ പാളികൾ എങ്ങനെ ഉപയോഗിക്കാമെന്നതിന്റെ ഉദാഹരണങ്ങൾ ആപ്ലിക്കേഷൻ നൽകുന്നു. ഗട്ട് ചിപ്പിൽ ജനറേറ്റ് ചെയ്യുന്ന ഒരു പാളി. ഗോബ്ലറ്റ് സെല്ലുകളിലും മ്യൂക്കോസൽ പ്രതലങ്ങളിൽ നിന്ന് സ്രവിക്കുന്ന മ്യൂക്കസിലും എംയുസി 2 സിഗ്നലിംഗ് ഉണ്ട്. ഗട്ട് ഫിസിയോളജിയിലെ ഫ്ലൂറസെന്റ് ചിത്രങ്ങൾ സിയാലിക് ആസിഡിനും എൻ-അസെറ്റൈൽഗ്ലൂക്കോസാമൈൻ അവശിഷ്ടങ്ങൾക്കും വേണ്ടി സ്റ്റെയിൻ ചെയ്ത് ഉത്പാദിപ്പിക്കുന്ന മ്യൂക്കസ് കാണിക്കുന്നു. ഒരു ചിപ്പിൽ കുടലിലെ ആതിഥേയ-മൈക്രോബയോം കോ-കൾച്ചറുകൾ. ഇടത് പാനൽ മൈക്രോ എഞ്ചിനീയറിംഗ് 3D Caco-2 എപ്പിത്തീലിയൽ സെല്ലുകൾക്കൊപ്പം ഗ്രീൻ ഫ്ലൂറസെന്റ് പ്രോട്ടീൻ (GFP) പ്രകടിപ്പിക്കുന്ന E. coli യുടെ കോ-കൾച്ചർ കാണിക്കുന്നു. ) കൂടാതെ ന്യൂക്ലിയസ് (നീല). ബാക്ടീരിയൽ ആന്റിജനുകൾ (ഉദാ, ലിപ്പോപോളിസാക്കറൈഡ്, എൽപിഎസ്), രോഗപ്രതിരോധ കോശങ്ങൾ (ഉദാ, പിബിഎംസി);പച്ച).ഒരു 3D എപ്പിത്തീലിയൽ ലെയർ സ്ഥാപിക്കുന്നതിനായി Caco-2 സെല്ലുകൾ സംസ്ക്കരിച്ചു.സ്കെയിൽ ബാർ, 50 µm. താഴെ വരിയിലുള്ള ചിത്രങ്ങൾ: "സെല്ലുകളുടെ വ്യത്യാസം" റഫറൻസിൽ നിന്നുള്ള അനുമതിയോടെ സ്വീകരിച്ചുഓക്സ്ഫോർഡ് യൂണിവേഴ്സിറ്റി പ്രസ്സ്;Ref.5-ൽ നിന്നുള്ള അനുമതിയോടെ പുനർനിർമ്മിച്ചു.NAS;"ഹോസ്റ്റ്-മൈക്രോബ് കോ-കൾച്ചർ" ref.3-ൽ നിന്നുള്ള അനുമതിയോടെ സ്വീകരിച്ചു.NAS;"ഡിസീസ് മോഡലിംഗ്" റഫറൻസിൽ നിന്നുള്ള അനുമതിയോടെ സ്വീകരിച്ചു.5.NAS.
ഗട്ട്-ഓൺ-ചിപ്പും ഹൈബ്രിഡ് ചിപ്പുകളും നിർമ്മിച്ചിരിക്കുന്നത് PDMS പകർപ്പുകൾ ഉപയോഗിച്ചാണ്, അത് സോഫ്റ്റ് ലിത്തോഗ്രഫി 1,44 ഉപയോഗിച്ച് സിലിക്കൺ മോൾഡുകളിൽ നിന്ന് പൊളിച്ച് SU-8 ഉപയോഗിച്ച് പാറ്റേൺ ചെയ്തു. ഓരോ ചിപ്പിലെയും മൈക്രോചാനലുകളുടെ രൂപകൽപ്പന നിർണ്ണയിക്കുന്നത് ഹൈഡ്രോഡൈനാമിക്‌കളായ ഷിയർ സ്ട്രെസ്, ഹൈഡ്രോഡൈനാമിക് മർദ്ദം എന്നിവ പരിഗണിച്ചാണ്. രണ്ട് സംയോജിത സമാന്തര നേരായ മൈക്രോചാനലുകൾ അടങ്ങുന്ന, സങ്കീർണ്ണമായ ഗട്ട്-ഓൺ-എ-ചിപ്പായി പരിണമിച്ചു (വിപുലീകരിച്ച ഡാറ്റ ചിത്രം. 1b) അതിൽ ഒരു ജോടി വളഞ്ഞ മൈക്രോചാനലുകൾ ഉൾപ്പെടുന്നു, വർദ്ധിച്ച ദ്രാവക താമസ സമയം, രേഖീയമല്ലാത്ത ഒഴുക്ക് പാറ്റേണുകൾ, കൂടാതെ കൾച്ചർഡ് സെല്ലുകളുടെ മൾട്ടിആക്സിയൽ ഡീഫോർമേഷൻ 1. , സങ്കീർണ്ണമായ ഗട്ട്-ഓൺ-എ-ചിപ്പുകൾ തിരഞ്ഞെടുക്കാം. കൾച്ചർഡ് സെൽ തരം പരിഗണിക്കാതെ, യഥാർത്ഥ ഗട്ട്-ചിപ്പുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ, സമാനമായ അളവിലുള്ള എപ്പിത്തീലിയൽ വളർച്ചയോടെ, വളഞ്ഞ ഗട്ട്-ചിപ്പ് സമാനമായ സമയ ഫ്രെയിമിൽ 3D മോർഫോജെനിസിസിനെ ശക്തമായി പ്രേരിപ്പിക്കുന്നുവെന്ന് ഞങ്ങൾ തെളിയിച്ചിട്ടുണ്ട്. SU-8 പാറ്റേണുകളുള്ള സിലിക്കൺ മോൾഡുകളിൽ സൌഖ്യമാക്കപ്പെട്ട ലിക്കാകൾ പൊളിച്ചുമാറ്റിയതിന് ശേഷം നെഗറ്റീവ് സവിശേഷതകൾ നൽകി (ചിത്രം.2a).ഒരു ചിപ്പിൽ ഗട്ട് നിർമ്മിക്കുന്നതിന്, തയ്യാറാക്കിയ മുകളിലെ PDMS പാളി തുടർച്ചയായി ഒരു പോറസ് PDMS ഫിലിമുമായി ബന്ധിപ്പിച്ചിരിക്കുന്നു, തുടർന്ന് കൊറോണ ട്രീറ്റർ (ചിത്രം 2b-f) ഉപയോഗിച്ച് തിരിച്ചെടുക്കാനാവാത്ത ബോണ്ടിംഗ് വഴി താഴത്തെ PDMS പാളിയുമായി വിന്യസിച്ചു. commodate Transwell inserts (Fig. 2h, Extended Data Fig. 2). PDMS പകർപ്പിന്റെയും ഗ്ലാസിന്റെയും ഉപരിതലങ്ങൾ ഓക്സിജൻ പ്ലാസ്മ അല്ലെങ്കിൽ കൊറോണ ട്രീറ്റ്മെന്റ് ഉപയോഗിച്ചാണ് ബോണ്ടിംഗ് പ്രക്രിയ നടത്തുന്നത്. സിലിക്കൺ ട്യൂബിൽ ഘടിപ്പിച്ചിരിക്കുന്ന മൈക്രോ ഫാബ്രിക്കേറ്റഡ് ഉപകരണത്തിന്റെ വന്ധ്യംകരണത്തിന് ശേഷം, ഫിഗ്ച്യൂർ 2000-ൽ ഫിഗ്ച്യൂർ 2-ന്റെ ഉപകരണ സജ്ജീകരണം പൂർത്തിയായി.
a, SU-8 പാറ്റേണുള്ള സിലിക്കൺ മോൾഡുകളിൽ നിന്ന് PDMS ഭാഗങ്ങൾ തയ്യാറാക്കുന്നതിന്റെ സ്കീമാറ്റിക് ചിത്രീകരണം. ശുദ്ധീകരിക്കാത്ത PDMS ലായനി ഒരു സിലിക്കൺ മോൾഡിലേക്ക് ഒഴിച്ചു (ഇടത്), 60 °C (മധ്യത്തിൽ) ഡീമോൾഡ് (വലത്). പൊളിച്ചുമാറ്റിയ PDMS കഷണങ്ങളായി മുറിച്ച് വൃത്തിയാക്കി. PDMS പോറസ് membrane.d നിർമ്മിക്കാൻ ഉപയോഗിക്കുന്ന സിലിക്കൺ മോൾഡ് സൂപ്പർഇമ്പോസ്ഡ് വളഞ്ഞ മൈക്രോചാനലുകളും വാക്വം ചേമ്പറുകളും.g, മൈക്രോഫ്ലൂയിഡിക് സെൽ കൾച്ചറിനായി ഗട്ട്-ഓൺ-എ-ചിപ്പ് സജ്ജീകരണം. സിലിക്കൺ ട്യൂബും സിറിഞ്ചും ഉപയോഗിച്ച് കൂട്ടിച്ചേർത്ത ചിപ്പിലെ ഫാബ്രിക്കേറ്റഡ് ഗട്ട് ഒരു കവർസ്ലിപ്പിൽ സ്ഥാപിച്ചു. 150 മില്ലിമീറ്റർ വലിപ്പമുള്ള പെട്രി ഡിഷ് ട്യൂബിന്റെ ലിഡിലാണ് ചിപ്പ് ഉപകരണം സ്ഥാപിച്ചിരിക്കുന്നത്. ഹൈബ്രിഡ് ചിപ്പുകൾ ഉപയോഗിച്ചുള്ള ഹൈബ്രിഡ് ചിപ്പ് ഫാബ്രിക്കേഷന്റെയും 3D മോർഫോജെനിസിസിന്റെയും സ്നാപ്പ്ഷോട്ടുകൾ. സംസ്ക്കരണത്തിനായി സ്വതന്ത്രമായി തയ്യാറാക്കിയ ട്രാൻസ്വെൽ ഇൻസെർട്ടുകൾ 2D കുടൽ എപ്പിത്തീലിയൽ സെല്ലുകളുടെ ഹൈബ്രിഡ് ചിപ്പിലേക്ക് തിരുകുകയും കുടലിലെ 3D മോർഫോജെനിസിസിനെ പ്രേരിപ്പിക്കുകയും ചെയ്യുന്നു. ബാർ, 1 cm.h റഫറൻസിൽ നിന്നുള്ള അനുമതിയോടെ വീണ്ടും അച്ചടിച്ചു.4.എൽസെവിയർ.
ഈ പ്രോട്ടോക്കോളിൽ, Caco-2 സെൽ ലൈനും കുടൽ ഓർഗനോയിഡുകളും എപ്പിത്തീലിയൽ സ്രോതസ്സുകളായി ഉപയോഗിച്ചു (ചിത്രം 3a). രണ്ട് തരം സെല്ലുകളും സ്വതന്ത്രമായി സംസ്ക്കരിക്കുകയും (ബോക്സ് 2, ബോക്സ് 5) ഓൺ-ചിപ്പ് ഗട്ട് അല്ലെങ്കിൽ ട്രാൻസ്‌വെൽ ഇൻസെർട്ടുകളുടെ ECM- പൂശിയ മൈക്രോചാനലുകൾ വിത്ത് വിതയ്ക്കുന്നതിനും ഉപയോഗിച്ചു. 10-നും 50-നും ഇടയിലുള്ള ഭാഗങ്ങൾ ടി-ഫ്ലാസ്‌ക്കുകളിൽ ട്രിപ്‌സിനൈസേഷൻ ദ്രാവകം (ബോക്‌സ് 2) ഉപയോഗിച്ച് വിഘടിപ്പിച്ച സെൽ സസ്പെൻഷനുകൾ തയ്യാറാക്കുന്നതിനായി വിളവെടുക്കുന്നു. nt, R-spondin, Noggin) എന്നിവയും ബോക്‌സ് 3-ൽ വിവരിച്ചിരിക്കുന്നതുപോലെയുള്ള വളർച്ചാ ഘടകങ്ങളും ഓർഗനോയിഡുകൾ ~500 µm വ്യാസത്തിൽ വളരുന്നതുവരെ മറ്റെല്ലാ ദിവസവും അനുബന്ധമായി നൽകിയിരുന്നു. പൂർണ്ണമായി വളർന്ന ഓർഗനോയിഡുകൾ വിളവെടുത്ത് ഒറ്റ കോശങ്ങളായി വിഘടിപ്പിച്ച് കുടലിലേക്ക് വിതയ്ക്കുന്നു അല്ലെങ്കിൽ ട്രാൻസ്‌വെൽ ഇൻസേർട്ട് ചെയ്തവയാണ്. ഉദാ വൻകുടൽ പുണ്ണ്, ക്രോൺസ് രോഗം, വൻകുടൽ കാൻസർ, അല്ലെങ്കിൽ സാധാരണ ദാതാവ്), നിഖേദ് സൈറ്റ് (ഉദാ, നിഖേദ് വേഴ്സസ് നോൺ-ലെസിയോണഡ് ഏരിയ), ദഹനനാളത്തിന്റെ സ്ഥാനം (ഉദാ, ഡുവോഡിനം, ജെജൂനം, ഇലിയം, സെകം, കോളൻ, അല്ലെങ്കിൽ മലാശയം). ചെറുകുടലിലെ ഓർഗനോയിഡുകളേക്കാൾ ഉയർന്ന സാന്ദ്രത മോർഫോജനുകൾ ആവശ്യമാണ്.
a, ഗട്ട് ചിപ്പിലെ ഗട്ട് മോർഫോജെനിസിസിന്റെ പ്രേരണയ്ക്കുള്ള വർക്ക്ഫ്ലോ. 3D മോർഫോജെനിസിസ് കാണിക്കാൻ ഈ പ്രോട്ടോക്കോളിൽ Caco-2 ഹ്യൂമൻ ഇന്റസ്റ്റൈനൽ എപിത്തീലിയവും കുടൽ ഓർഗനോയിഡുകളും ഉപയോഗിക്കുന്നു. വേർതിരിച്ചെടുത്ത എപ്പിത്തീലിയൽ സെല്ലുകൾ തയ്യാറാക്കിയ ഗട്ട്-ഓൺ-എ-ചിപ്പ് സെല്ലുകളിൽ വിത്ത് വിതച്ചു. DMS പോറസ് മെംബ്രൺ ദിവസം 0 (D0), apical (AP) ഒഴുക്ക് ആരംഭിക്കുകയും ആദ്യ 2 ദിവസം പരിപാലിക്കുകയും ചെയ്യുന്നു (ഫ്ലോ, AP, D0-D2). ഒരു പൂർണ്ണമായ 2D മോണോലെയ്‌സ് രൂപം കൊള്ളുമ്പോൾ 3D മോണോലെയ്‌സ് രൂപപ്പെട്ടതിന് ശേഷം ചാക്രിക സ്‌ട്രെച്ചിംഗ് ചലനങ്ങളോടൊപ്പം ബാസോലേറ്ററൽ (BL) പ്രവാഹവും ആരംഭിക്കുന്നു. 5 ദിവസത്തെ മൈക്രോഫ്ലൂയിഡിക് കൾച്ചർ (മോർഫോജെനിസിസ്, D5).ഘട്ട കോൺട്രാസ്റ്റ് ഇമേജുകൾ ഓരോ പരീക്ഷണ ഘട്ടത്തിലും അല്ലെങ്കിൽ സമയ പോയിന്റിലും Caco-2 സെല്ലുകളുടെ പ്രതിനിധി രൂപഘടന കാണിക്കുന്നു (ബാർ ഗ്രാഫ്, 100 µm). കുടൽ മോർഫോജെനിസിസിന്റെ അനുബന്ധ കാസ്കേഡുകൾ ചിത്രീകരിക്കുന്ന നാല് സ്കീമാറ്റിക് ഡയഗ്രമുകൾ കാണിക്കുന്നു. സ്ഥാപിതമായ 3D Caco-2 എപിത്തീലിയത്തിന്റെ (ഇടത്). മാഗ്നിഫൈഡ് ഏരിയ ഹൈലൈറ്റ് ചെയ്യുന്ന ഇൻസെറ്റ്, 3D Caco-2 ലെയറിൽ (വലത്) പുനരുജ്ജീവിപ്പിച്ച മൈക്രോവില്ലി കാണിക്കുന്നു (വലത്). കുടൽ ചിപ്പുകളിലെ എപ്പിത്തീലിയൽ സെല്ലുകളുടെ ഫ്ലൂറസെൻസ് കൺഫോക്കൽ വിഷ്വലൈസേഷൻ. മധ്യ സ്‌കീമാറ്റിക്കിലേക്ക് ചൂണ്ടിക്കാണിക്കുന്ന അമ്പുകൾ ഓരോ കൺഫോക്കൽ വ്യൂവിനും ഫോക്കൽ പ്ലെയ്‌നിന്റെ സ്ഥാനം സൂചിപ്പിക്കുന്നു.d, ഫേസ് കോൺട്രാസ്റ്റ് മൈക്രോസ്‌കോപ്പി വഴി ലഭിച്ച ചിപ്പിൽ കൾച്ചർ ചെയ്‌ത ഓർഗനോയിഡുകളിലെ രൂപാന്തര മാറ്റങ്ങളുടെ സമയ ഗതി 3, 7, ദിവസങ്ങളിൽ, 9, 11-ന്റെ വലത് മാഗ്‌നിഫിക്കേഷൻ, നൽകിയിരിക്കുന്ന വലത് മാഗ്‌നിഫിക്കേഷൻ. ഓർഗനോയിഡ് 3D എപിത്തീലിയത്തിന്റെ ഐസി ഫോട്ടോമൈക്രോഗ്രാഫ്, ദിവസം 7.f-ൽ എടുത്ത സ്ലൈസിൽ കുടലിൽ സ്ഥാപിച്ചു, സ്റ്റെം സെല്ലുകളുടെ മാർക്കറുകൾ കാണിക്കുന്ന ഓവർലേയ്ഡ് ഇമ്മ്യൂണോഫ്ലൂറസെൻസ് ചിത്രങ്ങൾ (LGR5;മജന്ത), ഗോബ്ലറ്റ് സെല്ലുകൾ (MUC2; പച്ച), എഫ്-ആക്റ്റിൻ (ചാരനിറം), ന്യൂക്ലിയസ് (സിയാൻ) എന്നിവ യഥാക്രമം 3 ദിവസത്തേക്ക് (ഇടത്), 13 ദിവസത്തെ (മധ്യഭാഗം) ഓർഗനോയിഡുകൾ എപ്പിത്തീലിയൽ ലെയറിൽ വളരുന്നു. എപ്പിത്തീലിയൽ ലെയറിൽ യഥാക്രമം 3 ദിവസത്തേക്ക് വളരുന്ന ഡാറ്റ. ചിത്രം 3-ഉം കാണുക. സംസ്‌കാരത്തിന്റെ 13-ാം ദിവസം സെൽമാസ്‌ക് ഡൈ (വലത്) ഉപയോഗിച്ച് പ്ലാസ്മ മെംബറേൻ സ്റ്റെയിൻ ചെയ്‌ത് ഒരു ചിപ്പിൽ 3D ഓർഗനോയിഡ് എപിത്തീലിയത്തിന്റെ മൈക്രോസ്ട്രക്ചർ (വലത്) സ്ഥാപിച്ചിരിക്കുന്നു. സ്‌കെയിൽ ബാർ 50 μm ആണ്.ഓക്സ്ഫോർഡ് യൂണിവേഴ്സിറ്റി പ്രസ്സ്;സി റഫറൻസിൽ നിന്നുള്ള അനുമതിയോടെ സ്വീകരിച്ചത്.2.ഓക്സ്ഫോർഡ് യൂണിവേഴ്സിറ്റി പ്രസ്സ്;e, f എന്നിവ റഫറൻസ് മുഖേനയുള്ള അനുമതിയോടെ സ്വീകരിച്ചു.12 ക്രിയേറ്റീവ് കോമൺസ് ലൈസൻസിന് കീഴിൽ CC BY 4.0.
ഒരു ചിപ്പിലെ കുടലിൽ, വിജയകരമായ ECM കോട്ടിംഗിനായി PDMS പോറസ് മെംബ്രണിന്റെ ഹൈഡ്രോഫോബിക് ഉപരിതലത്തിൽ മാറ്റം വരുത്തേണ്ടത് ആവശ്യമാണ്. ഈ പ്രോട്ടോക്കോളിൽ, PDMS മെംബ്രണുകളുടെ ഹൈഡ്രോഫോബിസിറ്റി പരിഷ്കരിക്കുന്നതിന് ഞങ്ങൾ രണ്ട് വ്യത്യസ്ത രീതികൾ പ്രയോഗിക്കുന്നു. Caco-2 കോശങ്ങൾ സംസ്ക്കരിക്കുന്നതിന്, UV/ഓസോൺ ഉപരിതലം മാത്രം ഘടിപ്പിച്ച്, UV/ഓസോൺ ഉപരിതലം മാത്രം ഘടിപ്പിച്ചാൽ മതിയാകും. PDMS മെംബ്രണിലേക്ക് Caco-2 സെല്ലുകൾ. എന്നിരുന്നാലും, പോളിയെത്തിലീൻമൈൻ (PEI), ഗ്ലൂട്ടറാൽഡിഹൈഡ് എന്നിവ PDMS മൈക്രോചാനലുകളിലേക്ക് തുടർച്ചയായി പ്രയോഗിച്ച് ECM പ്രോട്ടീനുകളുടെ കാര്യക്ഷമമായ നിക്ഷേപം നേടുന്നതിന് ഓർഗനോയിഡ് എപിത്തീലിയത്തിന്റെ മൈക്രോഫ്ലൂയിഡിക് കൾച്ചറിന് രാസ-അടിസ്ഥാന ഉപരിതല പ്രവർത്തനം ആവശ്യമാണ്. oid epithelium.കോശങ്ങൾ ഘടിപ്പിച്ച ശേഷം, മൈക്രോഫ്ലൂയിഡിക് സെൽ കൾച്ചർ ആരംഭിക്കുന്നത് മുകളിലെ മൈക്രോചാനലിലേക്ക് മീഡിയം മാത്രം പെർഫ്യൂസ് ചെയ്തുകൊണ്ട് കോശങ്ങൾ ഒരു പൂർണ്ണമായ മോണോലെയർ രൂപപ്പെടുന്നതുവരെ, താഴത്തെ മൈക്രോചാനൽ സ്റ്റാറ്റിക് അവസ്ഥകൾ നിലനിർത്തുന്നു. ഉപരിതല സജീവമാക്കുന്നതിനും ECM പൂശുന്നതിനുമുള്ള ഈ ഒപ്റ്റിമൈസ് ചെയ്ത രീതി ഓർഗനോയിഡ് എപ്പിത്തീലിയം ഉപരിതലത്തിലേക്ക് പി.ഡി.എം.എസ്.
ട്രാൻസ്‌വെൽ കൾച്ചറുകൾക്ക് സെൽ സീഡിംഗിന് മുമ്പ് ഇസിഎം കോട്ടിംഗ് ആവശ്യമാണ്;എന്നിരുന്നാലും, പോറസ് ഇൻസെർട്ടുകളുടെ ഉപരിതലം സജീവമാക്കുന്നതിന് ട്രാൻസ്‌വെൽ സംസ്‌കാരങ്ങൾക്ക് സങ്കീർണ്ണമായ മുൻകരുതൽ നടപടികൾ ആവശ്യമില്ല. ട്രാൻസ്‌വെൽ ഇൻസേർട്ടുകളിൽ കാക്കോ-2 സെല്ലുകൾ വളർത്തുന്നതിന്, പോറസ് ഇൻസേർട്ടുകളിലെ ഇസിഎം കോട്ടിംഗ് വിഘടിച്ച Caco-2 കോശങ്ങളുടെ (<1 മണിക്കൂർ) അറ്റാച്ച്‌മെന്റിനെ ത്വരിതപ്പെടുത്തുന്നു (<1 മണിക്കൂർ) ഇറുകിയ ജംഗ്ഷൻ ബാരിയർ രൂപീകരണം (<1-2 ദിവസങ്ങൾക്കുള്ളിൽ, ഓർഗനോയിഡ് കൾച്ചറോയിഡ് കാണാം). ECM-കോട്ടഡ് ഇൻസെർട്ടുകളിൽ, മെംബ്രൻ പ്രതലത്തിൽ ഘടിപ്പിച്ച് (<3 h) ഓർഗനോയിഡുകൾ ബാരിയർ ഇന്റഗ്രിറ്റി ഉള്ള ഒരു പൂർണ്ണമായ മോണോലെയർ രൂപപ്പെടുന്നതുവരെ പരിപാലിക്കുന്നു.
ഒരു സ്ഥാപിത എപ്പിത്തീലിയൽ പാളിയുടെ അടിസ്ഥാന വശത്തേക്ക് ദ്രാവക പ്രവാഹം പ്രയോഗിച്ച് ഇൻ വിട്രോ 3D മോർഫോജെനിസിസ് ആരംഭിക്കാൻ കഴിയും. ഒരു ചിപ്പിലെ കുടലിൽ, എപ്പിത്തീലിയൽ മോർഫോജെനിസിസ് ആരംഭിച്ചത് മീഡിയം മുകളിലേക്കും താഴെയുമുള്ള മൈക്രോചാനലുകളിലേക്ക് (ചിത്രം 3 എ) പെർഫ്യൂസ് ചെയ്യുമ്പോൾ (ചിത്രം 3 എ).മുമ്പ് വിവരിച്ചതുപോലെ, ദ്രാവകത്തിന്റെ തുടർച്ചയായ നീക്കം ചെയ്യൽ നിർണ്ണായകമാണ്. സ്രവിക്കുന്ന മോർഫോജൻ ഇൻഹിബിറ്ററുകൾ. പോറസ് മെംബ്രണുകളിൽ ബന്ധിച്ചിരിക്കുന്ന കോശങ്ങൾക്ക് മതിയായ പോഷകങ്ങളും സെറവും നൽകാനും ലുമിനൽ ഷിയർ സ്ട്രെസ് സൃഷ്ടിക്കാനും, ഞങ്ങൾ സാധാരണയായി ഒരു ചിപ്പിൽ കുടലിൽ ഇരട്ട പ്രവാഹം പ്രയോഗിക്കുന്നു. ഹൈബ്രിഡ് ചിപ്പുകളിൽ, എപ്പിത്തീലിയൽ മോണോലെയറുകൾ അടങ്ങിയ ട്രാൻസ്‌വെൽ ഇൻസെർട്ടുകൾ ട്രാൻസ്‌പോറൽ വശത്ത് പ്രയോഗിച്ചു. മൈക്രോചാനലിലൂടെ rt. രണ്ട് കൾച്ചർ പ്ലാറ്റ്‌ഫോമുകളിലും ബാസോലാറ്ററൽ ഫ്ലോ ആരംഭിച്ച് 3-5 ദിവസങ്ങൾക്ക് ശേഷം കുടൽ മോർഫോജെനിസിസ് സംഭവിച്ചു.
ഫേസ് കോൺട്രാസ്റ്റ് മൈക്രോസ്കോപ്പി, ഡിഫറൻഷ്യൽ ഇന്റർഫെറൻസ് കോൺട്രാസ്റ്റ് (ഡിഐസി) മൈക്രോസ്കോപ്പി, എസ്ഇഎം, അല്ലെങ്കിൽ ഇമ്മ്യൂണോഫ്ലൂറസെൻസ് കൺഫോക്കൽ മൈക്രോസ്കോപ്പി (ചിത്രങ്ങൾ 3, 4) എന്നിവയുൾപ്പെടെ വിവിധ ഇമേജിംഗ് രീതികൾ പ്രയോഗിച്ചുകൊണ്ട് മൈക്രോ എഞ്ചിനീയറിംഗ് 3D എപ്പിത്തീലിയൽ പാളികളുടെ രൂപഘടന സവിശേഷതകൾ വിശകലനം ചെയ്യാൻ കഴിയും. എപ്പിത്തീലിയൽ പാളികൾ.പിഡിഎംഎസ്, പോളിസ്റ്റർ ഫിലിമുകൾ എന്നിവയുടെ ഒപ്റ്റിക്കൽ സുതാര്യത കാരണം, ഗട്ട്-ഓൺ-എ-ചിപ്പ്, ഹൈബ്രിഡ് ചിപ്പ് പ്ലാറ്റ്‌ഫോമുകൾ എന്നിവയ്ക്ക് ഉപകരണത്തിന്റെ സെക്ഷനിംഗ് അല്ലെങ്കിൽ ഡിസ്അസംബ്ലിംഗ് ആവശ്യമില്ലാതെ തത്സമയം സിറ്റു ഇമേജിംഗ് നൽകാൻ കഴിയും. ഡിഹൈഡ് (PFA), തുടർന്ന് ട്രൈറ്റൺ X-100, 2% (wt/vol) ) ബോവിൻ സെറം ആൽബുമിൻ (BSA) ക്രമത്തിൽ. സെൽ തരം അനുസരിച്ച്, വ്യത്യസ്ത ഫിക്സേറ്റീവ്സ്, പെർമെബിലൈസറുകൾ, ബ്ലോക്കിംഗ് ഏജന്റുകൾ എന്നിവ ഉപയോഗിക്കാം. ലൈനേജ് ആശ്രിത സെല്ലിനെ ലക്ഷ്യം വച്ചുള്ള പ്രാഥമിക ആന്റിബോഡികൾ അല്ലെങ്കിൽ റീജിയണൽ മാർക്കറുകൾ ഹൈലൈറ്റ് ചെയ്യാൻ ഉപയോഗിക്കുന്നു. ന്യൂക്ലിയസ് (ഉദാ, 4′,6-ഡയാമിഡിനോ-2-ഫിനൈലീൻ) ഇൻഡോൾ, ഡിഎപിഐ) അല്ലെങ്കിൽ എഫ്-ആക്റ്റിൻ (ഉദാ, ഫ്ലൂറസന്റ് ലേബൽ ചെയ്ത ഫാലോയ്ഡിൻ) എന്നിവയെ ലക്ഷ്യം വയ്ക്കുന്ന ഡൈ.1, “സെൽ ഡിഫറൻഷ്യേഷൻ”, “ഗട്ട് ഫിസിയോളജി”), മൈക്രോബയൽ സെല്ലുകളുടെ ക്രമരഹിതമായ കോളനിവൽക്കരണം (ചിത്രം. 1, “ഹോസ്റ്റ്-മൈക്രോബ് കോ-കൾച്ചർ”), രോഗപ്രതിരോധ കോശങ്ങളുടെ റിക്രൂട്ട്‌മെന്റ് (ചിത്രം. 1, 'ഡിസീസ് മോഡലിംഗ്') അല്ലെങ്കിൽ 3D എപ്പിത്തീലിയൽ മോർഫോളജിയിലെ 3D രൂപരേഖകൾ (ചിത്രം. താഴത്തെ മൈക്രോചാനൽ ലെയറിൽ നിന്ന് മുകളിലെ പാളി വേർതിരിക്കുക. ചിത്രം 2-ൽ കാണിച്ചിരിക്കുന്നതുപോലെ, 3D എപ്പിത്തീലിയൽ രൂപഘടനയും അഗ്രം ബ്രഷ് ബോർഡറിലെ മൈക്രോവില്ലിയും SEM-ന് ദൃശ്യവൽക്കരിക്കാൻ കഴിയും (ചിത്രം. 3b). ഡിഫറൻഷ്യേഷൻ മാർക്കറുകളുടെ പ്രകടനം വിലയിരുത്താൻ കഴിയും. ഈ പി.സി.ആർ. ut ചിപ്സ് അല്ലെങ്കിൽ ഹൈബ്രിഡ് ചിപ്സ് ട്രിപ്സിനൈസേഷൻ വഴി വിളവെടുക്കുന്നു, തുടർന്ന് തന്മാത്രാ അല്ലെങ്കിൽ ജനിതക വിശകലനത്തിനായി ഉപയോഗിക്കുന്നു.
a, ഒരു ഹൈബ്രിഡ് ചിപ്പ് പ്ലാറ്റ്‌ഫോമിൽ 3D മോർഫോജെനിസിസ് കാണിക്കാൻ ഈ പ്രോട്ടോക്കോളിൽ Caco-2 ഉം കുടൽ ഓർഗനോയിഡുകളും ഉപയോഗിച്ചിരിക്കുന്നു. ട്രാൻസ്‌വെൽ ഇൻസെർട്ടുകളിലെ മെംബ്രണുകൾ, എല്ലാ സെല്ലുകളും സ്റ്റാറ്റിക് അവസ്ഥയിൽ (TW കൾച്ചർ) സംസ്‌കരിക്കപ്പെട്ടു. 7 ദിവസത്തിന് ശേഷം, എപ്പിത്തീലിയൽ സെല്ലുകളുടെ 2D മോണോലെയർ അടങ്ങുന്ന ഒരൊറ്റ ട്രാൻസ്‌വെൽ ഇൻസേർട്ട് ഒരു ഹൈബ്രിഡ് ചിപ്പിലേക്ക് സംയോജിപ്പിച്ച് ഒരു ബാസോലാറ്ററൽ ഫ്ലോ (ഫ്ലോ, BL) അവതരിപ്പിക്കുന്നു. ഓരോ പരീക്ഷണ ഘട്ടത്തിലും അല്ലെങ്കിൽ സമയ പോയിന്റിലും സാധാരണ ദാതാവിൽ നിന്ന് (C103 ലൈൻ) ആരോഹണ കോളണിൽ നിന്ന് ഉരുത്തിരിഞ്ഞ മനുഷ്യ അവയവങ്ങളുടെ എപ്പിത്തീലിയൽ കോശങ്ങളുടെ രൂപഘടന സവിശേഷതകൾ കാണിക്കുന്ന ഗ്രാഫുകൾ. മുകളിലെ പാളികളിലെ സ്കീമാറ്റിക്സ് ഓരോ ഘട്ടത്തിന്റെയും പരീക്ഷണ കോൺഫിഗറേഷൻ വ്യക്തമാക്കുന്നു. സ്ഥാനങ്ങൾ (മുകൾ, മധ്യ, താഴെ;വലത് സ്കീമാറ്റിക്, അനുബന്ധ ഡോട്ട് ലൈനുകൾ കാണുക).വ്യക്തമായ രൂപഘടന സ്വഭാവസവിശേഷതകൾ കാണിച്ചു. എഫ്-ആക്റ്റിൻ (സിയാൻ), ന്യൂക്ലിയസ് (ഗ്രേ).സി, ഫ്ലൂറസെൻസ് കൺഫോക്കൽ മൈക്രോഗ്രാഫുകൾ (3D ആംഗിൾ വ്യൂ) ഓർഗനോയിഡ്-ഡെറൈവ്ഡ് എപ്പിത്തീലിയൽ സെല്ലുകളുടെ സ്റ്റാറ്റിക് ട്രാൻസ്‌വെല്ലിൽ സംസ്‌കരിച്ച് (TW; വൈറ്റ് ഡാഷ്ഡ് ബോക്‌സിനുള്ളിൽ ഇൻസെറ്റ്) ഹൈബ്രിഡ് ചിപ്പുമായി താരതമ്യം ചെയ്യുമ്പോൾ (യഥാക്രമം 3D ഫുൾ ഷോട്ട് ical ക്രോസ്-കട്ട് കാഴ്ചകൾ (മുകളിൽ വലത് കോണിലുള്ള ഇൻസെറ്റ്; "XZ") 2D, 3D സവിശേഷതകളും കാണിക്കുന്നു. സ്കെയിൽ ബാർ, 100 µm.c റഫറൻസിൽ നിന്നുള്ള അനുമതിയോടെ വീണ്ടും അച്ചടിച്ചു.4.എൽസെവിയർ.
പരമ്പരാഗത സ്റ്റാറ്റിക് കൾച്ചർ സാഹചര്യങ്ങളിൽ ഒരേ കോശങ്ങൾ (കാക്കോ-2 അല്ലെങ്കിൽ കുടൽ ഓർഗനോയിഡ് എപ്പിത്തീലിയൽ സെല്ലുകൾ) ദ്വിമാന മോണോലെയറുകളായി സംസ്ക്കരിച്ചുകൊണ്ട് നിയന്ത്രണങ്ങൾ തയ്യാറാക്കാം. മൈക്രോചാനലുകളുടെ പരിമിതമായ വോളിയം കപ്പാസിറ്റി (അതായത് ~4 µL) കാരണം പോഷകശോഷണത്തിന് കാരണമായേക്കാം. basolateral ഒഴുക്കും താരതമ്യം ചെയ്യാം.
മൃദുവായ ലിത്തോഗ്രാഫി പ്രക്രിയ ഒരു വൃത്തിയുള്ള മുറിയിൽ നടത്തണം. ചിപ്പിലെ ഓരോ ലെയറിനും (മുകളിലെയും താഴെയുമുള്ള പാളികളും മെംബ്രണുകളും) ഹൈബ്രിഡ് ചിപ്പുകളും വ്യത്യസ്ത ഫോട്ടോമാസ്കുകൾ ഉപയോഗിക്കുകയും പ്രത്യേക സിലിക്കൺ വേഫറുകളിൽ നിർമ്മിക്കുകയും ചെയ്തു, കാരണം മൈക്രോചാനലുകളുടെ ഉയരം വ്യത്യസ്തമാണ്. ഹൈബ്രിഡ് ചിപ്പിന്റെ 200 µm ആണ്.
അസെറ്റോണുള്ള ഒരു പാത്രത്തിൽ 3 ഇഞ്ച് സിലിക്കൺ വേഫർ വയ്ക്കുക. പ്ലേറ്റ് 30 സെക്കൻഡ് നേരത്തേക്ക് മൃദുവായി ചുഴറ്റുക, തുടർന്ന് വേഫർ എയർ ഡ്രൈ ചെയ്യുക. IPA ഉള്ള ഒരു പ്ലേറ്റിലേക്ക് വേഫർ മാറ്റുക, തുടർന്ന് വൃത്തിയാക്കാൻ 30 സെക്കൻഡ് പ്ലേറ്റ് സ്പിൻ ചെയ്യുക.
സിലിക്കൺ വേഫർ ഉപരിതലത്തിൽ നിന്ന് ജൈവ അവശിഷ്ടങ്ങൾ പരമാവധി നീക്കം ചെയ്യാൻ പിരാന ലായനി (ഹൈഡ്രജൻ പെറോക്സൈഡിന്റെയും സാന്ദ്രീകൃത സൾഫ്യൂറിക് ആസിഡിന്റെയും മിശ്രിതം, 1:3 (വോളിയം/വോള്യം)) ഓപ്ഷണലായി ഉപയോഗിക്കാം.
പിരാന ലായനി അങ്ങേയറ്റം നാശമുണ്ടാക്കുകയും ചൂട് സൃഷ്ടിക്കുകയും ചെയ്യുന്നു. അധിക സുരക്ഷാ മുൻകരുതലുകൾ ആവശ്യമാണ്. മാലിന്യ നിർമാർജനത്തിന്, ലായനി തണുപ്പിച്ച് വൃത്തിയുള്ളതും ഉണങ്ങിയതുമായ മാലിന്യ പാത്രത്തിലേക്ക് മാറ്റാൻ അനുവദിക്കുക. ദ്വിതീയ പാത്രങ്ങൾ ഉപയോഗിക്കുക, മാലിന്യ പാത്രങ്ങൾ ശരിയായി ലേബൽ ചെയ്യുക. കൂടുതൽ വിശദമായ നടപടിക്രമങ്ങൾക്കായി സൗകര്യത്തിന്റെ സുരക്ഷാ മാർഗ്ഗനിർദ്ദേശങ്ങൾ പാലിക്കുക.
200 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസ് ചൂടുള്ള ഒരു ചൂടുള്ള പ്ലേറ്റിൽ 10 മിനിറ്റ് നേരം വെയ്‌ഫറുകൾ നിർജ്ജലീകരണം ചെയ്യുക. നിർജ്ജലീകരണത്തിന് ശേഷം, തണുക്കാൻ വേഫർ അഞ്ച് തവണ വായുവിൽ കുലുക്കി.
വൃത്തിയാക്കിയ സിലിക്കൺ വേഫറിന്റെ മധ്യഭാഗത്തേക്ക് ~10 ഗ്രാം ഫോട്ടോറെസിസ്റ്റ് എസ്‌യു-8 2100 ഒഴിക്കുക. ഫോട്ടോറെസിസ്റ്റ് വേഫറിൽ തുല്യമായി പരത്താൻ ട്വീസറുകൾ ഉപയോഗിക്കുക. ഇടയ്‌ക്കിടെ 65 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസ് ചൂടുള്ള ഒരു ചൂടുള്ള പ്ലേറ്റിൽ വെയ്‌ഫർ വയ്ക്കുക.
സ്പിൻ കോട്ടിംഗ് പ്രവർത്തിപ്പിച്ച് SU-8 വേഫറിൽ തുല്യമായി വിതരണം ചെയ്യപ്പെടുന്നു. SU-8 ന്റെ ഇൻകമിംഗ് റൊട്ടേഷൻ 5-10 സെക്കന്റിനുള്ളിൽ പ്രോഗ്രാം ചെയ്യുക ചിപ്പിലെ കുടലിന്റെ മുകളിലെ പാളിക്ക് 500 µm ഉയരം; താഴെയുള്ള "നിർണ്ണായക ഘട്ടങ്ങൾ" കാണുക) 300 rpm/s 30 സെക്കൻഡ് വേഗതയിൽ 1,200 rpm-ൽ സജ്ജമാക്കുക.
സിലിക്കൺ വേഫറിലെ SU-8 പാറ്റേണിന്റെ ടാർഗെറ്റ് കനം അനുസരിച്ച് പ്രധാന സ്പിൻ വേഗത ക്രമീകരിക്കാൻ കഴിയും.
ചിപ്പിലെ കുടലിന്റെ മുകളിലെ പാളിക്കായി 500 µm ഉയരമുള്ള SU-8 പാറ്റേണുകൾ നിർമ്മിക്കാൻ, ഈ ബോക്‌സിന്റെ സ്പിൻ കോട്ടിംഗും സോഫ്റ്റ് ബേക്ക് സ്റ്റെപ്പുകളും (7, 8 ഘട്ടങ്ങൾ) തുടർച്ചയായി ആവർത്തിച്ചു (ഘട്ടം 9 കാണുക) 250 µm ന്റെ രണ്ട് പാളികൾ ഉത്പാദിപ്പിക്കുന്നു (ഘട്ടം 9 കാണുക). µm ഉയരം.
SU-8 പൂശിയ വേഫറുകൾ 5 മിനിറ്റ് നേരം 65 °C ചൂടുള്ള പ്ലേറ്റിൽ ശ്രദ്ധാപൂർവ്വം വയ്ക്കുക, തുടർന്ന് ക്രമീകരണം 95 °C ലേക്ക് മാറ്റി 40 മിനിറ്റ് കൂടി ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്യുക.
മുകളിലെ മൈക്രോചാനലിൽ SU-8 പാറ്റേണിന്റെ 500 μm ഉയരം നേടുന്നതിന്, 250 μm കട്ടിയുള്ള രണ്ട് SU-8 ലെയറുകൾ സൃഷ്ടിക്കുന്നതിന് 7, 8 ഘട്ടങ്ങൾ ആവർത്തിക്കുക.
UV മാസ്ക് അലൈനർ ഉപയോഗിച്ച്, വേഫറിന്റെ എക്സ്പോഷർ സമയം കണക്കാക്കാൻ നിർമ്മാതാവിന്റെ നിർദ്ദേശങ്ങൾക്കനുസരിച്ച് ഒരു ലാമ്പ് ടെസ്റ്റ് നടത്തുക.(എക്‌സ്‌പോഷർ സമയം, ms) = (എക്‌സ്‌പോഷർ ഡോസ്, mJ/cm2)/(ലാമ്പ് പവർ, mW/cm2).
എക്സ്പോഷർ സമയം നിർണ്ണയിച്ചതിന് ശേഷം, UV മാസ്ക് അലൈനറിന്റെ മാസ്ക് ഹോൾഡറിൽ ഫോട്ടോമാസ്ക് സ്ഥാപിക്കുകയും SU-8 പൂശിയ വേഫറിൽ ഫോട്ടോമാസ്ക് സ്ഥാപിക്കുകയും ചെയ്യുക.
അൾട്രാവയലറ്റ് വ്യാപനം കുറയ്ക്കുന്നതിന് ഫോട്ടോമാസ്കിന്റെ അച്ചടിച്ച ഉപരിതലം സിലിക്കൺ വേഫറിന്റെ SU-8 പൂശിയ ഭാഗത്ത് നേരിട്ട് സ്ഥാപിക്കുക.
SU-8 പൂശിയ വേഫറും ഫോട്ടോമാസ്കും ലംബമായി 260 mJ/cm2 UV ലൈറ്റിലേക്ക് മുൻകൂട്ടി നിശ്ചയിച്ച എക്സ്പോഷർ സമയത്തിനായി തുറന്നുകാട്ടുക (ഈ ബോക്സിന്റെ ഘട്ടം 10 കാണുക).
UV എക്സ്പോഷറിന് ശേഷം, 200 μm ഉയരമുള്ള പാറ്റേണുകൾ നിർമ്മിക്കുന്നതിനായി ഓരോ ഹോട്ട് പ്ലേറ്റിലും SU-8-കോട്ടഡ് സിലിക്കൺ വേഫറുകൾ 65 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിലും 5 മിനിറ്റ് 95 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിലും ബേക്ക് ചെയ്തു.
ഡെവലപ്പർ ഒരു ഗ്ലാസ് പാത്രത്തിൽ ഒഴിച്ചു, ചുട്ടുപഴുത്ത വേഫർ വിഭവത്തിൽ വയ്ക്കുന്നു. ഗ്ലാസ് പ്ലേറ്റിന്റെ വലുപ്പത്തെ ആശ്രയിച്ച് SU-8 ഡവലപ്പറിന്റെ അളവ് വ്യത്യാസപ്പെടാം. SU-8 പൂർണ്ണമായി നീക്കം ചെയ്യാൻ വേണ്ടത്ര SU-8 ഡവലപ്പർ ഉപയോഗിക്കുന്നത് ഉറപ്പാക്കുക. ഉദാഹരണത്തിന്, 150 mm, 150 mm വ്യാസമുള്ള, 150 mm വ്യാസമുള്ള M20- 800-ൽ ~ 30 എൽ. ഇടയ്ക്കിടെ സൌമ്യമായി ഭ്രമണം ചെയ്യുന്ന മിനിറ്റ്.
വികസിപ്പിച്ച പൂപ്പൽ ~10 മില്ലി ഫ്രഷ് ഡെവലപ്പർ ഉപയോഗിച്ച് കഴുകുക, തുടർന്ന് ഐപിഎ പൈപ്പറ്റ് ഉപയോഗിച്ച് ലായനി തളിക്കുക.
ഒരു പ്ലാസ്മ ക്ലീനറിൽ വേഫർ വയ്ക്കുക, ഓക്സിജൻ പ്ലാസ്മയിലേക്ക് (അന്തരീക്ഷ വാതകം, ടാർഗെറ്റ് മർദ്ദം 1 × 10−5 ടോർ, പവർ 125 W) 1.5 മിനിറ്റ് നേരത്തേക്ക് വയ്ക്കുക.
അകത്ത് ഒരു ഗ്ലാസ് സ്ലൈഡുള്ള ഒരു വാക്വം ഡെസിക്കേറ്ററിൽ വേഫർ സ്ഥാപിക്കുക. വേഫറുകളും സ്ലൈഡുകളും വശങ്ങളിലായി സ്ഥാപിക്കാവുന്നതാണ്. വാക്വം ഡെസിക്കേറ്റർ പല പാളികളായി ഒരു പ്ലേറ്റ് ഉപയോഗിച്ച് വിഭജിച്ചിട്ടുണ്ടെങ്കിൽ, സ്ലൈഡുകൾ താഴത്തെ അറയിലും വേഫറുകൾ മുകളിലെ അറയിലും വയ്ക്കുക. ഒരു ഗ്ലാസ് സ്ലൈഡ്, സിലാനൈസേഷനായി വാക്വം പ്രയോഗിക്കുക.
ശീതീകരിച്ച Caco-2 സെല്ലുകളുടെ ഒരു കുപ്പി 37 ° C വാട്ടർ ബാത്തിൽ ഉരുകുക, തുടർന്ന് ഉരുകിയ കോശങ്ങൾ 15 മില്ലി 37 ° C താപനിലയിൽ ചൂടാക്കിയ Caco-2 മീഡിയം അടങ്ങിയ T75 ഫ്ലാസ്കിലേക്ക് മാറ്റുക.
~90% സംഗമസ്ഥാനത്ത് Caco-2 സെല്ലുകൾ കടന്നുപോകാൻ, ആദ്യം ചൂടാക്കിയ Caco-2 മീഡിയം, PBS, 0.25% ട്രിപ്സിൻ/1 mM EDTA എന്നിവ 37°C വാട്ടർ ബാത്തിൽ.
വാക്വം ആസ്പിറേഷൻ വഴി മീഡിയം ആസ്പിറേറ്റ് ചെയ്യുക. വാക്വം ആസ്പിറേഷൻ ആവർത്തിച്ച് പുതിയ പിബിഎസ് ചേർത്ത് 5 മില്ലി വാം പിബിഎസ് ഉപയോഗിച്ച് സെല്ലുകൾ രണ്ടുതവണ കഴുകുക.