Nature.com സന്ദർശിച്ചതിന് നന്ദി. പരിമിതമായ CSS പിന്തുണയുള്ള ഒരു ബ്രൗസർ പതിപ്പാണ് നിങ്ങൾ ഉപയോഗിക്കുന്നത്. മികച്ച അനുഭവത്തിനായി, അപ്ഡേറ്റ് ചെയ്ത ഒരു ബ്രൗസർ ഉപയോഗിക്കാൻ ഞങ്ങൾ ശുപാർശ ചെയ്യുന്നു (അല്ലെങ്കിൽ ഇന്റർനെറ്റ് എക്സ്പ്ലോററിൽ കോംപാറ്റിബിലിറ്റി മോഡ് പ്രവർത്തനരഹിതമാക്കുക). കൂടാതെ, തുടർച്ചയായ പിന്തുണ ഉറപ്പാക്കാൻ, സ്റ്റൈലുകളും ജാവാസ്ക്രിപ്റ്റും ഇല്ലാതെ ഞങ്ങൾ സൈറ്റ് കാണിക്കുന്നു.
മൂന്ന് സ്ലൈഡുകളുടെ ഒരു കറൗസൽ ഒരേസമയം പ്രദർശിപ്പിക്കുന്നു. ഒരേ സമയം മൂന്ന് സ്ലൈഡുകളിലൂടെ നീങ്ങാൻ മുമ്പത്തേതും അടുത്തതും ബട്ടണുകൾ ഉപയോഗിക്കുക, അല്ലെങ്കിൽ ഒരേ സമയം മൂന്ന് സ്ലൈഡുകളിലൂടെ നീങ്ങാൻ അവസാനത്തിലുള്ള സ്ലൈഡർ ബട്ടണുകൾ ഉപയോഗിക്കുക.
രക്ത-തലച്ചോറ് തടസ്സവും രക്ത-തലച്ചോറ് തടസ്സവും കേന്ദ്ര നാഡീവ്യവസ്ഥയിലെ ബയോതെറാപ്പിറ്റിക് ഏജന്റുകൾ അവയുടെ ലക്ഷ്യങ്ങളിൽ എത്തുന്നത് തടയുന്നു, അതുവഴി ന്യൂറോളജിക്കൽ രോഗങ്ങളുടെ ഫലപ്രദമായ ചികിത്സയെ തടസ്സപ്പെടുത്തുന്നു. ഇൻ വിവോയിൽ പുതിയ ബ്രെയിൻ ട്രാൻസ്പോർട്ടറുകളെ കണ്ടെത്തുന്നതിന്, ഞങ്ങൾ ഒരു T7 ഫേജ് പെപ്റ്റൈഡ് ലൈബ്രറിയും എലികളുടെ കാനുലേറ്റഡ് കോൺഷ്യസ് ലാർജ് പൂൾ മോഡൽ ഉപയോഗിച്ച് സീരിയലായി ശേഖരിച്ച രക്തവും സെറിബ്രോസ്പൈനൽ ഫ്ലൂയിഡും (CSF) അവതരിപ്പിച്ചു. നാല് റൗണ്ട് സെലക്ഷന് ശേഷം നിർദ്ദിഷ്ട ഫേജ് ക്ലോണുകൾ CSF-ൽ വളരെയധികം സമ്പുഷ്ടമാക്കി. വ്യക്തിഗത കാൻഡിഡേറ്റ് പെപ്റ്റൈഡുകളുടെ പരിശോധനയിൽ CSF-ൽ 1000 മടങ്ങിലധികം സമ്പുഷ്ടീകരണം കണ്ടെത്തി. തിരിച്ചറിഞ്ഞ നോവൽ ട്രാൻസിറ്റ് പെപ്റ്റൈഡുമായി ബന്ധിപ്പിച്ചിരിക്കുന്ന BACE1 പെപ്റ്റൈഡ് ഇൻഹിബിറ്റർ ഉപയോഗിച്ച് സെറിബ്രോസ്പൈനൽ ദ്രാവകത്തിലെ അമിലോയിഡ്-β യുടെ അളവിൽ 40% കുറവ് വരുത്തിയതിലൂടെ തലച്ചോറിലേക്കുള്ള പെപ്റ്റൈഡ്-മധ്യസ്ഥതയുള്ള ഡെലിവറിയുടെ ബയോ ആക്ടിവിറ്റി സ്ഥിരീകരിച്ചു. ഇൻ വിവോ ഫേജ് സെലക്ഷൻ രീതികൾ വഴി തിരിച്ചറിഞ്ഞ പെപ്റ്റൈഡുകൾ ഒരു ചികിത്സാ ഫലത്തോടെ തലച്ചോറിലേക്ക് മാക്രോമോളിക്യൂളുകളുടെ വ്യവസ്ഥാപിത ഡെലിവറിക്ക് ഉപയോഗപ്രദമായ വാഹനങ്ങളായിരിക്കാമെന്ന് ഈ ഫലങ്ങൾ സൂചിപ്പിക്കുന്നു.
കേന്ദ്ര നാഡീവ്യൂഹം (CNS) ലക്ഷ്യം വച്ചുള്ള തെറാപ്പി ഗവേഷണം പ്രധാനമായും ശ്രദ്ധ കേന്ദ്രീകരിച്ചിരിക്കുന്നത് CNS- ലക്ഷ്യ സവിശേഷതകൾ പ്രകടിപ്പിക്കുന്ന ഒപ്റ്റിമൈസ് ചെയ്ത മരുന്നുകളെയും ഏജന്റുമാരെയും തിരിച്ചറിയുന്നതിലാണ്, തലച്ചോറിലേക്ക് സജീവമായ മരുന്ന് വിതരണം നയിക്കുന്ന സംവിധാനങ്ങൾ കണ്ടെത്തുന്നതിൽ കുറഞ്ഞ പരിശ്രമത്തോടെ. മയക്കുമരുന്ന് വിതരണം, പ്രത്യേകിച്ച് വലിയ തന്മാത്രകൾ, ആധുനിക ന്യൂറോ സയൻസ് മരുന്ന് വികസനത്തിന്റെ അവിഭാജ്യ ഘടകമായതിനാൽ ഇത് ഇപ്പോൾ മാറാൻ തുടങ്ങിയിരിക്കുന്നു. രക്ത-തലച്ചോറ് തടസ്സം (BBB), രക്ത-തലച്ചോറ് തടസ്സം (BCBB)1 എന്നിവ അടങ്ങുന്ന സെറിബ്രോവാസ്കുലർ തടസ്സ സംവിധാനത്താൽ കേന്ദ്ര നാഡീവ്യൂഹത്തിന്റെ പരിസ്ഥിതി നന്നായി സംരക്ഷിക്കപ്പെടുന്നു, ഇത് തലച്ചോറിലേക്ക് മരുന്നുകൾ എത്തിക്കുന്നത് വെല്ലുവിളിയാക്കുന്നു1,2. മിക്കവാറും എല്ലാ വലിയ തന്മാത്ര മരുന്നുകളും 98%-ത്തിലധികം ചെറിയ തന്മാത്ര മരുന്നുകളും തലച്ചോറിൽ നിന്ന് നീക്കം ചെയ്യപ്പെടുന്നുണ്ടെന്ന് കണക്കാക്കപ്പെടുന്നു3. അതുകൊണ്ടാണ് CNS 4,5-ലേക്ക് ചികിത്സാ മരുന്നുകളുടെ കാര്യക്ഷമവും നിർദ്ദിഷ്ടവുമായ വിതരണം നൽകുന്ന പുതിയ മസ്തിഷ്ക ഗതാഗത സംവിധാനങ്ങളെ തിരിച്ചറിയേണ്ടത് വളരെ പ്രധാനമായത്. എന്നിരുന്നാലും, BBB, BCSFB എന്നിവ മയക്കുമരുന്ന് വിതരണത്തിന് മികച്ച അവസരവും നൽകുന്നു, കാരണം അവ അതിന്റെ വിപുലമായ വാസ്കുലേച്ചറിലൂടെ തലച്ചോറിന്റെ എല്ലാ ഘടനകളിലേക്കും തുളച്ചുകയറുകയും പ്രവേശിക്കുകയും ചെയ്യുന്നു. അതിനാൽ, തലച്ചോറിലേക്ക് ഡെലിവറി ചെയ്യുന്നതിന് ആക്രമണാത്മകമല്ലാത്ത രീതികൾ ഉപയോഗിക്കുന്നതിനുള്ള നിലവിലെ ശ്രമങ്ങൾ പ്രധാനമായും എൻഡോജെനസ് BBB6 റിസപ്റ്റർ ഉപയോഗിച്ചുള്ള റിസപ്റ്റർ-മെഡിയേറ്റഡ് ട്രാൻസ്‌പോർട്ടിന്റെ (PMT) സംവിധാനത്തെ അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ളതാണ്. ട്രാൻസ്‌ഫെറിൻ റിസപ്റ്റർ പാത്ത്‌വേ ഉപയോഗിച്ചുള്ള സമീപകാല പ്രധാന പുരോഗതികൾ ഉണ്ടായിരുന്നിട്ടും7,8, മെച്ചപ്പെട്ട ഗുണങ്ങളുള്ള പുതിയ ഡെലിവറി സിസ്റ്റങ്ങളുടെ കൂടുതൽ വികസനം ആവശ്യമാണ്. ഇതിനായി, CSF ഗതാഗതത്തിന് മധ്യസ്ഥത വഹിക്കാൻ കഴിവുള്ള പെപ്റ്റൈഡുകളെ തിരിച്ചറിയുക എന്നതായിരുന്നു ഞങ്ങളുടെ ലക്ഷ്യം, കാരണം അവ തത്വത്തിൽ CNS-ലേക്ക് മാക്രോമോളിക്യൂളുകൾ എത്തിക്കുന്നതിനോ പുതിയ റിസപ്റ്റർ പാതകൾ തുറക്കുന്നതിനോ ഉപയോഗിക്കാം. പ്രത്യേകിച്ചും, സെറിബ്രോവാസ്കുലർ സിസ്റ്റത്തിന്റെ (BBB, BSCFB) നിർദ്ദിഷ്ട റിസപ്റ്ററുകളും ട്രാൻസ്‌പോർട്ടറുകളും ബയോതെറാപ്പിറ്റിക് മരുന്നുകളുടെ സജീവവും നിർദ്ദിഷ്ടവുമായ ഡെലിവറിക്ക് സാധ്യതയുള്ള ലക്ഷ്യങ്ങളായി വർത്തിക്കും. സെറിബ്രോസ്പൈനൽ ദ്രാവകം (CSF) കോറോയിഡ് പ്ലെക്സസിന്റെ (CS) ഒരു സ്രവ ഉൽപ്പന്നമാണ്, കൂടാതെ സബ്അരക്നോയിഡ് സ്ഥലത്തിലൂടെയും വെൻട്രിക്കുലാർ സ്ഥലത്തിലൂടെയും തലച്ചോറിന്റെ ഇന്റർസ്റ്റീഷ്യൽ ദ്രാവകവുമായി നേരിട്ട് സമ്പർക്കം പുലർത്തുന്നു4. സബ്അരക്നോയിഡ് സെറിബ്രോസ്പൈനൽ ദ്രാവകം തലച്ചോറിന്റെ ഇന്റർസ്റ്റീഷ്യത്തിലേക്ക് അമിതമായി വ്യാപിക്കുന്നുവെന്ന് അടുത്തിടെ തെളിയിക്കപ്പെട്ടിട്ടുണ്ട്9. ഈ സബ്അരാക്നോയിഡ് ഇൻഫ്ലോ ട്രാക്റ്റ് ഉപയോഗിച്ചോ അല്ലെങ്കിൽ ബിബിബി വഴി നേരിട്ടോ പാരൻചൈമൽ സ്‌പെയ്‌സിലേക്ക് പ്രവേശിക്കാൻ ഞങ്ങൾ പ്രതീക്ഷിക്കുന്നു. ഇത് നേടുന്നതിന്, ഈ രണ്ട് വ്യത്യസ്ത പാതകളിലൂടെ കൈമാറ്റം ചെയ്യപ്പെടുന്ന പെപ്റ്റൈഡുകളെ അനുയോജ്യമായി തിരിച്ചറിയുന്ന ഒരു ശക്തമായ ഇൻ വിവോ ഫേജ് സെലക്ഷൻ തന്ത്രം ഞങ്ങൾ നടപ്പിലാക്കി.
ഉയർന്ന ലൈബ്രറി വൈവിധ്യത്തോടെ പ്രാരംഭ സെലക്ഷൻ റൗണ്ടുകൾ നിരീക്ഷിക്കുന്നതിനായി, ഉയർന്ന ത്രൂപുട്ട് സീക്വൻസിംഗ് (HTS) സഹിതം CSF സാമ്പിൾ ഉപയോഗിച്ച് ഒരു സീക്വൻഷ്യൽ ഇൻ വിവോ ഫേജ് ഡിസ്പ്ലേ സ്ക്രീനിംഗ് രീതി ഞങ്ങൾ ഇപ്പോൾ വിവരിക്കുന്നു. രക്ത മലിനീകരണം ഒഴിവാക്കാൻ സ്ഥിരമായി ഇംപ്ലാന്റ് ചെയ്ത വലിയ സിസ്റ്റെർണ (CM) കാനുല ഉള്ള ബോധമുള്ള എലികളിലാണ് സ്ക്രീനിംഗ് നടത്തിയത്. പ്രധാനമായും, ഈ സമീപനം ബ്രെയിൻ-ടാർഗെറ്റിംഗ്, സെറിബ്രോവാസ്കുലർ ബാരിയറിലുടനീളം ഗതാഗത പ്രവർത്തനമുള്ള പെപ്റ്റൈഡുകൾ എന്നിവ തിരഞ്ഞെടുക്കുന്നു. ചെറിയ വലിപ്പം (~60 nm)10 കാരണം ഞങ്ങൾ T7 ഫേജുകൾ ഉപയോഗിച്ചു, എൻഡോതെലിയൽ,/അല്ലെങ്കിൽ എപ്പിത്തീലിയൽ-മെഡുള്ള തടസ്സത്തിന്റെ ട്രാൻസ്സെല്ലുലാർ ക്രോസിംഗ് അനുവദിക്കുന്ന വെസിക്കിളുകളുടെ ഗതാഗതത്തിന് അവ അനുയോജ്യമാണെന്ന് നിർദ്ദേശിച്ചു. നാല് റൗണ്ട് പാനിംഗിന് ശേഷം, ഫേജ് പോപ്പുലേഷനുകളെ ഒറ്റപ്പെടുത്തി, ഇൻ വിവോ CSF സമ്പുഷ്ടീകരണവും സെറിബ്രൽ മൈക്രോവെസൽ അസോസിയേഷനും ശക്തമാണെന്ന് കാണിച്ചു. പ്രധാനമായും, ഇഷ്ടപ്പെട്ടതും രാസപരമായി സമന്വയിപ്പിച്ചതുമായ മികച്ച കാൻഡിഡേറ്റ് പെപ്റ്റൈഡുകൾക്ക് സെറിബ്രോസ്പൈനൽ ദ്രാവകത്തിലേക്ക് പ്രോട്ടീൻ കാർഗോ കൊണ്ടുപോകാൻ കഴിയുമെന്ന് തെളിയിച്ചുകൊണ്ട് ഞങ്ങളുടെ കണ്ടെത്തലുകൾ സ്ഥിരീകരിക്കാൻ ഞങ്ങൾക്ക് കഴിഞ്ഞു. ഒന്നാമതായി, ഒരു മുൻനിര ട്രാൻസിറ്റ് പെപ്റ്റൈഡിനെ BACE1 പെപ്റ്റൈഡിന്റെ ഒരു ഇൻഹിബിറ്ററുമായി സംയോജിപ്പിച്ചാണ് CNS-ന്റെ ഫാർമകോഡൈനാമിക് ഇഫക്റ്റുകൾ സ്ഥാപിച്ചത്. ഇൻ വിവോ ഫങ്ഷണൽ സ്ക്രീനിംഗ് തന്ത്രങ്ങൾക്ക് നൂതന ബ്രെയിൻ ട്രാൻസ്പോർട്ട് പെപ്റ്റൈഡുകളെ ഫലപ്രദമായ പ്രോട്ടീൻ കാർഗോ വാഹകരായി തിരിച്ചറിയാൻ കഴിയുമെന്ന് തെളിയിക്കുന്നതിനൊപ്പം, നൂതന ബ്രെയിൻ ട്രാൻസ്പോർട്ട് പാതകളെ തിരിച്ചറിയുന്നതിലും സമാനമായ പ്രവർത്തനപരമായ തിരഞ്ഞെടുപ്പ് സമീപനങ്ങൾ പ്രധാനമാകുമെന്ന് ഞങ്ങൾ പ്രതീക്ഷിക്കുന്നു.
പ്ലാക്ക്-ഫോമിംഗ് യൂണിറ്റുകളെ (PFU) അടിസ്ഥാനമാക്കി, ഫേജ് പാക്കേജിംഗ് ഘട്ടത്തിനുശേഷം, ഏകദേശം 109 വൈവിധ്യമുള്ള റാൻഡം 12-മെർ ലീനിയർ T7 ഫേജ് പെപ്റ്റൈഡുകളുടെ ഒരു ലൈബ്രറി രൂപകൽപ്പന ചെയ്ത് സൃഷ്ടിച്ചു (മെറ്റീരിയലുകളും രീതികളും കാണുക). ഇൻ വിവോ പാനിംഗിന് മുമ്പ് ഞങ്ങൾ ഈ ലൈബ്രറി ശ്രദ്ധാപൂർവ്വം വിശകലനം ചെയ്തുവെന്നത് ശ്രദ്ധിക്കേണ്ടതാണ്. പരിഷ്കരിച്ച പ്രൈമറുകൾ ഉപയോഗിച്ചുള്ള ഫേജ് ലൈബ്രറി സാമ്പിളുകളുടെ PCR ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ HTS-ന് നേരിട്ട് ബാധകമായ ആംപ്ലികോണുകൾ സൃഷ്ടിച്ചു (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം 1a). a) HTS11 സീക്വൻസിംഗ് പിശകുകൾ, b) പ്രൈമറുകളുടെ ഗുണനിലവാരത്തിലുള്ള ആഘാതം (NNK)1-12, c) സ്റ്റാൻഡ്‌ബൈ ലൈബ്രറിയിലെ വൈൽഡ്-ടൈപ്പ് (wt) ഫേജ് (അസ്ഥികൂട ഇൻസേർട്ടുകൾ) എന്നിവയുടെ സാന്നിധ്യം കാരണം, പരിശോധിച്ചുറപ്പിച്ച സീക്വൻസ് വിവരങ്ങൾ മാത്രം വേർതിരിച്ചെടുക്കുന്നതിന് ഒരു സീക്വൻസ് ഫിൽട്ടറിംഗ് നടപടിക്രമം നടപ്പിലാക്കി (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം 1b). ഈ ഫിൽട്ടർ ഘട്ടങ്ങൾ എല്ലാ HTS സീക്വൻസിംഗ് ലൈബ്രറികൾക്കും ബാധകമാണ്. സ്റ്റാൻഡേർഡ് ലൈബ്രറിക്ക്, ആകെ 233,868 റീഡുകൾ ലഭിച്ചു, അതിൽ 39% ഫിൽട്ടർ മാനദണ്ഡങ്ങൾ പാസാക്കി, തുടർന്നുള്ള റൗണ്ടുകൾക്കായി ലൈബ്രറി വിശകലനത്തിനും തിരഞ്ഞെടുപ്പിനും ഉപയോഗിച്ചു (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം 1c–e). പ്രധാനമായും 3 ബേസ് ജോഡികളുടെ ഗുണിതങ്ങളായിരുന്നു റീഡുകൾ, അതിന്റെ പീക്ക് 36 ന്യൂക്ലിയോടൈഡുകളായിരുന്നു (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം 1c), ഇത് ലൈബ്രറി ഡിസൈൻ (NNK) 1-12 സ്ഥിരീകരിക്കുന്നു. ശ്രദ്ധേയമായി, ലൈബ്രറി അംഗങ്ങളിൽ ഏകദേശം 11% പേർ 12-ഡൈമൻഷണൽ വൈൽഡ്-ടൈപ്പ് (wt) ബാക്ക്ബോൺ PAGISRELVDKL ഇൻസേർട്ട് ഉൾക്കൊള്ളുന്നു, കൂടാതെ ഏകദേശം പകുതി സീക്വൻസുകളിലും (49%) ഇൻസേർഷനുകളോ ഇല്ലാതാക്കലുകളോ അടങ്ങിയിരിക്കുന്നു. ലൈബ്രറി ലൈബ്രറിയുടെ HTS ലൈബ്രറിയിലെ ഉയർന്ന വൈവിധ്യമാർന്ന പെപ്റ്റൈഡുകൾ സ്ഥിരീകരിച്ചു: 81%-ൽ കൂടുതൽ പെപ്റ്റൈഡ് സീക്വൻസുകൾ ഒരിക്കൽ മാത്രമേ കണ്ടെത്തിയിട്ടുള്ളൂ, ≥4 പകർപ്പുകളിൽ 1.5% മാത്രമേ സംഭവിച്ചിട്ടുള്ളൂ (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം 2a). റിപ്പർട്ടറിയിലെ 12 സ്ഥാനങ്ങളിലുമുള്ള അമിനോ ആസിഡുകളുടെ (aa) ഫ്രീക്വൻസികൾ ഡീജനറേറ്റ് NKK റെപ്പർട്ടറി സൃഷ്ടിക്കുന്ന കോഡോണുകളുടെ എണ്ണത്തിന് പ്രതീക്ഷിക്കുന്ന ഫ്രീക്വൻസികളുമായി നന്നായി ബന്ധപ്പെട്ടിരിക്കുന്നു (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം 2b). ഈ ഇൻസേർട്ടുകൾ എൻകോഡ് ചെയ്ത aa അവശിഷ്ടങ്ങളുടെ നിരീക്ഷിച്ച ഫ്രീക്വൻസി കണക്കാക്കിയ ഫ്രീക്വൻസിയുമായി (r = 0.893) നന്നായി ബന്ധപ്പെട്ടിരിക്കുന്നു (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം 2c). ഇൻജക്ഷനായി ഫേജ് ലൈബ്രറികൾ തയ്യാറാക്കുന്നതിൽ എൻഡോടോക്സിൻ ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ, നീക്കം ചെയ്യൽ എന്നീ ഘട്ടങ്ങൾ ഉൾപ്പെടുന്നു. ഫേജ് ലൈബ്രറികളുടെ വൈവിധ്യം കുറയ്ക്കാൻ ഇത് സാധ്യതയുള്ളതായി മുമ്പ് കാണിച്ചിട്ടുണ്ട്. അതിനാൽ, എൻഡോടോക്സിൻ നീക്കം ചെയ്തതിന് വിധേയമായ ഒരു പ്ലേറ്റ്-ആംപ്ലിഫൈഡ് ഫേജ് ലൈബ്രറി ഞങ്ങൾ ക്രമീകരിച്ച് AA യുടെ ആവൃത്തി കണക്കാക്കാൻ യഥാർത്ഥ ലൈബ്രറിയുമായി താരതമ്യം ചെയ്തു. യഥാർത്ഥ പൂളിനും ആംപ്ലിഫൈഡ്, പ്യൂരിഫൈഡ് പൂളിനും ഇടയിൽ ശക്തമായ ഒരു പരസ്പരബന്ധം (r = 0.995) നിരീക്ഷിക്കപ്പെട്ടു (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം 2d), T7 ഫേജ് ഉപയോഗിച്ച് പ്ലേറ്റുകളിൽ ആംപ്ലിഫൈ ചെയ്ത ക്ലോണുകൾ തമ്മിലുള്ള മത്സരം വലിയ പക്ഷപാതത്തിന് കാരണമായില്ലെന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്നു. HTS ഉപയോഗിച്ച് പോലും ലൈബ്രറികളുടെ വൈവിധ്യം (~109) പൂർണ്ണമായി പിടിച്ചെടുക്കാൻ കഴിയാത്തതിനാൽ, ഓരോ ലൈബ്രറിയിലെയും ട്രൈപെപ്റ്റൈഡ് മോട്ടിഫുകളുടെ ആവൃത്തിയെ അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ളതാണ് ഈ താരതമ്യം. ഓരോ സ്ഥാനത്തും aa യുടെ ആവൃത്തി വിശകലനം നൽകിയ ശേഖരത്തിന്റെ അവസാന മൂന്ന് സ്ഥാനങ്ങളിൽ ഒരു ചെറിയ സ്ഥാന-ആശ്രിത പക്ഷപാതം വെളിപ്പെടുത്തി (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം 2e). ഉപസംഹാരമായി, ലൈബ്രറിയുടെ ഗുണനിലവാരവും വൈവിധ്യവും സ്വീകാര്യമാണെന്നും നിരവധി റൗണ്ട് തിരഞ്ഞെടുപ്പുകൾക്കിടയിൽ ഫേജ് ലൈബ്രറികളുടെ ആംപ്ലിഫിക്കേഷനും തയ്യാറെടുപ്പും കാരണം വൈവിധ്യത്തിൽ ചെറിയ മാറ്റങ്ങൾ മാത്രമേ നിരീക്ഷിക്കപ്പെട്ടിട്ടുള്ളൂവെന്നും ഞങ്ങൾ നിഗമനം ചെയ്തു.
BBB അല്ലെങ്കിൽ BCSFB വഴി ഇൻട്രാവെൻസായി (iv) കുത്തിവച്ച T7 ഫേജിനെ തിരിച്ചറിയാൻ സഹായിക്കുന്നതിന്, ബോധമുള്ള എലികളുടെ CM-ലേക്ക് ഒരു കാനുല ശസ്ത്രക്രിയയിലൂടെ ഇംപ്ലാന്റ് ചെയ്തുകൊണ്ട് സീരിയൽ സെറിബ്രോസ്പൈനൽ ഫ്ലൂയിഡ് സാമ്പിൾ നടത്താം (ചിത്രം 1a-b). ഇൻ വിവോ സെലക്ഷന്റെ ആദ്യ മൂന്ന് റൗണ്ടുകളിൽ (ചിത്രം 1c) ഞങ്ങൾ രണ്ട് സ്വതന്ത്ര സെലക്ഷൻ ആം (ആംസ് എ, ബി) ഉപയോഗിച്ചു. സെലക്ഷന്റെ ആദ്യ മൂന്ന് റൗണ്ടുകളിൽ അവതരിപ്പിച്ച ഫേജിന്റെ ആകെ അളവ് കുറച്ചുകൊണ്ട് ഞങ്ങൾ സെലക്ഷന്റെ സ്ട്രിംഗൻസി ക്രമേണ വർദ്ധിപ്പിച്ചു. നാലാമത്തെ റൗണ്ട് പാനിംഗിനായി, എ, ബി ശാഖകളിൽ നിന്നുള്ള സാമ്പിളുകൾ ഞങ്ങൾ സംയോജിപ്പിച്ച് മൂന്ന് അധിക സ്വതന്ത്ര സെലക്ഷനുകൾ നടത്തി. ഈ മോഡലിൽ T7 ഫേജ് കണങ്ങളുടെ ഇൻ വിവോ ഗുണങ്ങൾ പഠിക്കാൻ, വൈൽഡ്-ടൈപ്പ് ഫേജ് (PAGISRELVDKL മാസ്റ്റർ ഇൻസേർട്ട്) വാൽ സിര വഴി എലികളിലേക്ക് കുത്തിവച്ചു. വ്യത്യസ്ത സമയ പോയിന്റുകളിൽ സെറിബ്രോസ്പൈനൽ ഫ്ലൂയിഡിൽ നിന്നും രക്തത്തിൽ നിന്നും ഫേജുകൾ വീണ്ടെടുക്കുമ്പോൾ, താരതമ്യേന ചെറിയ T7 ഐക്കോസഹെഡ്രൽ ഫേജുകൾക്ക് രക്ത അറയിൽ നിന്ന് ദ്രുതഗതിയിലുള്ള പ്രാരംഭ ക്ലിയറൻസ് ഘട്ടം ഉണ്ടെന്ന് കാണിച്ചു (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം 3). എലികളിൽ നൽകിയ ടൈറ്ററുകളും രക്തത്തിന്റെ അളവും അടിസ്ഥാനമാക്കി, ഇൻട്രാവണസ് കുത്തിവയ്പ്പിന് 10 മിനിറ്റിനുശേഷം രക്തത്തിൽ നൽകിയ ഡോസിൽ നിന്നുള്ള ഏകദേശം 1% wt. ഫേജ് മാത്രമേ കണ്ടെത്തിയിട്ടുള്ളൂ എന്ന് ഞങ്ങൾ കണക്കാക്കി. ഈ പ്രാരംഭ ദ്രുതഗതിയിലുള്ള കുറവിനുശേഷം, 27.7 മിനിറ്റ് അർദ്ധായുസ്സോടെ മന്ദഗതിയിലുള്ള പ്രാഥമിക ക്ലിയറൻസ് അളന്നു. പ്രധാനമായി, CSF കമ്പാർട്ടുമെന്റിൽ നിന്ന് വളരെ കുറച്ച് ഫേജുകൾ മാത്രമേ വീണ്ടെടുക്കാൻ കഴിഞ്ഞുള്ളൂ, ഇത് CSF കമ്പാർട്ടുമെന്റിലേക്ക് വൈൽഡ്-ടൈപ്പ് ഫേജ് മൈഗ്രേഷനുള്ള കുറഞ്ഞ പശ്ചാത്തലത്തെ സൂചിപ്പിക്കുന്നു (അനുബന്ധ ചിത്രം 3). ശരാശരി, മുഴുവൻ സാമ്പിൾ കാലയളവിലും (0-250 മിനിറ്റ്) രക്തത്തിൽ T7 ഫേജിന്റെ ഏകദേശം 1 x 10-3% ടൈറ്ററുകളും തുടക്കത്തിൽ ഇൻഫ്യൂസ് ചെയ്ത ഫേജുകളുടെ 4 x 10-8% മാത്രമേ സെറിബ്രോസ്പൈനൽ ദ്രാവകത്തിൽ കണ്ടെത്തിയിട്ടുള്ളൂ. ശ്രദ്ധേയമായി, സെറിബ്രോസ്പൈനൽ ദ്രാവകത്തിലെ വൈൽഡ്-ടൈപ്പ് ഫേജിന്റെ അർദ്ധായുസ്സ് (25.7 മിനിറ്റ്) രക്തത്തിൽ നിരീക്ഷിച്ചതിന് സമാനമാണ്. സി‌എം-കാനുലേറ്റഡ് എലികളിൽ, സി‌എസ്‌എഫ് കമ്പാർട്ടുമെന്റിനെ രക്തത്തിൽ നിന്ന് വേർതിരിക്കുന്ന തടസ്സം കേടുകൂടാതെയിരിക്കുകയാണെന്ന് ഈ ഡാറ്റ തെളിയിക്കുന്നു, ഇത് രക്തത്തിൽ നിന്ന് സി‌എസ്‌എഫ് കമ്പാർട്ടുമെന്റിലേക്ക് എളുപ്പത്തിൽ കൊണ്ടുപോകുന്ന ക്ലോണുകളെ തിരിച്ചറിയാൻ ഫേജ് ലൈബ്രറികളുടെ ഇൻ വിവോ സെലക്ഷനെ അനുവദിക്കുന്നു.
(എ) ഒരു വലിയ പൂളിൽ നിന്ന് സെറിബ്രോസ്പൈനൽ ദ്രാവകം (CSF) വീണ്ടും സാമ്പിൾ ചെയ്യുന്നതിനുള്ള ഒരു രീതി സജ്ജീകരിക്കുന്നു. (ബി) കേന്ദ്ര നാഡീവ്യൂഹം (CNS) തടസ്സത്തിന്റെ സെല്ലുലാർ സ്ഥാനം കാണിക്കുന്ന ഡയഗ്രം, രക്ത-മസ്തിഷ്ക തടസ്സം (BBB), രക്ത-മസ്തിഷ്ക തടസ്സം എന്നിവ കടക്കുന്ന പെപ്റ്റൈഡുകൾ തിരിച്ചറിയാൻ ഉപയോഗിക്കുന്ന തിരഞ്ഞെടുപ്പ് തന്ത്രം. (സി) ഇൻ വിവോ ഫേജ് ഡിസ്പ്ലേ സ്ക്രീനിംഗ് ഫ്ലോചാർട്ട്. ഓരോ റൗണ്ട് തിരഞ്ഞെടുപ്പിലും, ഫേജുകൾ (അമ്പുകൾക്കുള്ളിലെ മൃഗ ഐഡന്റിഫയറുകൾ) ഇൻട്രാവെൻസായി കുത്തിവച്ചു. നാലാമത്തെ റൗണ്ട് തിരഞ്ഞെടുപ്പു വരെ രണ്ട് സ്വതന്ത്ര ബദൽ ശാഖകൾ (A, B) പ്രത്യേകം സൂക്ഷിച്ചിരിക്കുന്നു. 3, 4 സെലക്ഷൻ റൗണ്ടുകൾക്കായി, CSF-ൽ നിന്ന് വേർതിരിച്ചെടുത്ത ഓരോ ഫേജ് ക്ലോണും സ്വമേധയാ ക്രമീകരിച്ചു. (ഡി) T7 പെപ്റ്റൈഡ് ലൈബ്രറിയുടെ ഇൻട്രാവണസ് കുത്തിവയ്പ്പിനുശേഷം രണ്ട് കാനുലേറ്റഡ് എലികളിൽ (2 x 1012 ഫേജുകൾ/മൃഗം) ആദ്യ റൗണ്ട് തിരഞ്ഞെടുപ്പിൽ രക്തത്തിൽ നിന്ന് (ചുവന്ന വൃത്തങ്ങൾ) വേർതിരിച്ചെടുത്ത ഫേജിന്റെയും (പച്ച ത്രികോണങ്ങൾ) സെലക്ഷന്റെയും ചലനാത്മകത. രക്തത്തിലെ ഫേജിന്റെ ശരാശരി പ്രാരംഭ സാന്ദ്രതയെ നീല ചതുരങ്ങൾ സൂചിപ്പിക്കുന്നു, ഇത് കുത്തിവച്ച ഫേജിന്റെ അളവിൽ നിന്ന് കണക്കാക്കി, മൊത്തം രക്തത്തിന്റെ അളവ് കണക്കിലെടുക്കുന്നു. കറുത്ത ചതുരങ്ങൾ രക്ത ഫേജ് സാന്ദ്രതകളിൽ നിന്ന് വേർതിരിച്ചെടുത്ത y രേഖയുടെ വിഭജന പോയിന്റിനെ സൂചിപ്പിക്കുന്നു. (e,f) പെപ്റ്റൈഡിൽ കാണപ്പെടുന്ന എല്ലാ സാധ്യമായ ഓവർലാപ്പിംഗ് ട്രൈപെപ്റ്റൈഡ് മോട്ടിഫുകളുടെയും ആപേക്ഷിക ആവൃത്തിയും വിതരണവും അവതരിപ്പിക്കുക. 1000 റീഡിംഗുകളിൽ കണ്ടെത്തിയ മോട്ടിഫുകളുടെ എണ്ണം കാണിച്ചിരിക്കുന്നു. (p < 0.001) സമ്പുഷ്ടമായ മോട്ടിഫുകൾ ചുവന്ന ഡോട്ടുകൾ കൊണ്ട് അടയാളപ്പെടുത്തിയിരിക്കുന്നു. (e) ഇൻജെക്റ്റ് ചെയ്ത ലൈബ്രറിയുടെ ട്രൈപെപ്റ്റൈഡ് മോട്ടിഫിന്റെ ആപേക്ഷിക ആവൃത്തിയെ മൃഗങ്ങളിൽ നിന്ന് #1.1 ഉം #1.2 ഉം രക്തത്തിൽ നിന്ന് ഉരുത്തിരിഞ്ഞ ഫേജുമായി താരതമ്യം ചെയ്യുന്ന പരസ്പര ബന്ധ സ്കാറ്റർപ്ലോട്ട്. (f) രക്തത്തിലും സെറിബ്രോസ്പൈനൽ ദ്രാവകത്തിലും വേർതിരിച്ചെടുത്ത മൃഗ ഫേജ് ട്രൈപെപ്റ്റൈഡ് മോട്ടിഫുകൾ #1.1 ഉം #1.2 ഉം ആപേക്ഷിക ആവൃത്തികളെ താരതമ്യം ചെയ്യുന്ന പരസ്പര ബന്ധ സ്കാറ്റർപ്ലോട്ട്. (g, h) രണ്ട് മൃഗങ്ങളിലും ഇൻ വിവോ സെലക്ഷന്റെ ഒരു റൗണ്ടിന് ശേഷം രക്തത്തിൽ സമ്പുഷ്ടമാക്കിയ ഫേജിന്റെ (g) ഇൻജെക്റ്റഡ് ലൈബ്രറികളും CSF (h) ൽ സമ്പുഷ്ടമാക്കിയ ഫേജും രക്തവും തമ്മിലുള്ള സീക്വൻസ് ഐഡി പ്രാതിനിധ്യം. ഒറ്റ അക്ഷര കോഡിന്റെ വലുപ്പം ആ സ്ഥാനത്ത് ആ അമിനോ ആസിഡ് എത്ര തവണ സംഭവിക്കുന്നു എന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്നു. പച്ച = ധ്രുവം, പർപ്പിൾ = നിഷ്പക്ഷം, നീല = അടിസ്ഥാനം, ചുവപ്പ് = അസിഡിക്, കറുപ്പ് = ഹൈഡ്രോഫോബിക് അമിനോ ആസിഡുകൾ. ചിത്രം 1a, b രൂപകൽപ്പന ചെയ്ത് നിർമ്മിച്ചത് എഡ്വേർഡ് യൂറിച്ച് ആണ്.
രണ്ട് സിഎം ഇൻസ്ട്രുമെന്റ് എലികളിലേക്ക് (ക്ലേഡുകൾ എ, ബി) ഒരു ഫേജ് പെപ്റ്റൈഡ് ലൈബ്രറിയും സെറിബ്രോസ്പൈനൽ ഫ്ലൂയിഡിൽ നിന്നും രക്തത്തിൽ നിന്നുമുള്ള ഒറ്റപ്പെട്ട ഫേജും ഞങ്ങൾ കുത്തിവച്ചു (ചിത്രം 1d). വൈൽഡ്-ടൈപ്പ് ഫേജുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ ലൈബ്രറിയുടെ പ്രാരംഭ ദ്രുത ക്ലിയറൻസ് കുറവായിരുന്നു. രണ്ട് മൃഗങ്ങളിലും കുത്തിവച്ച ലൈബ്രറിയുടെ ശരാശരി അർദ്ധായുസ്സ് വൈൽഡ്-ടൈപ്പ് ഫേജിന് സമാനമായി രക്തത്തിൽ 24.8 മിനിറ്റും സി‌എസ്‌എഫിൽ 38.5 മിനിറ്റും ആയിരുന്നു. ഓരോ മൃഗത്തിൽ നിന്നുമുള്ള രക്തത്തിന്റെയും സെറിബ്രോസ്പൈനൽ ഫ്ലൂയിഡ് ഫേജ് സാമ്പിളുകൾ എച്ച്‌ടി‌എസിന് വിധേയമാക്കി, ഒരു ചെറിയ ട്രൈപെപ്റ്റൈഡ് മോട്ടിഫിന്റെ സാന്നിധ്യത്തിനായി എല്ലാ തിരിച്ചറിഞ്ഞ പെപ്റ്റൈഡുകളും വിശകലനം ചെയ്തു. ഘടന രൂപീകരണത്തിനും പെപ്റ്റൈഡ്-പ്രോട്ടീൻ ഇടപെടലുകൾക്കും കുറഞ്ഞ അടിസ്ഥാനം നൽകുന്നതിനാലാണ് ട്രൈപെപ്റ്റൈഡ് മോട്ടിഫുകൾ തിരഞ്ഞെടുത്തത്. കുത്തിവച്ച ഫേജ് ലൈബ്രറിയും രണ്ട് മൃഗങ്ങളുടെയും രക്തത്തിൽ നിന്ന് വേർതിരിച്ചെടുത്ത ക്ലോണുകളും തമ്മിലുള്ള മോട്ടിഫുകളുടെ വിതരണത്തിൽ ഞങ്ങൾ ഒരു നല്ല ബന്ധം കണ്ടെത്തി (ചിത്രം 1e). ലൈബ്രറിയുടെ ഘടന രക്ത കമ്പാർട്ടുമെന്റിൽ നേരിയ തോതിൽ മാത്രമേ സമ്പുഷ്ടമായിട്ടുള്ളൂ എന്ന് ഡാറ്റ സൂചിപ്പിക്കുന്നു. Weblogo16 സോഫ്റ്റ്‌വെയറിന്റെ ഒരു അഡാപ്റ്റേഷൻ ഉപയോഗിച്ച് ഓരോ സ്ഥാനത്തും അമിനോ ആസിഡ് ഫ്രീക്വൻസികളും കൺസെൻസസ് സീക്വൻസുകളും കൂടുതൽ വിശകലനം ചെയ്തു. രസകരമെന്നു പറയട്ടെ, രക്തത്തിലെ ഗ്ലൈസിൻ അവശിഷ്ടങ്ങളിൽ ശക്തമായ സമ്പുഷ്ടീകരണം ഞങ്ങൾ കണ്ടെത്തി (ചിത്രം 1g). CSF-ൽ നിന്ന് തിരഞ്ഞെടുത്ത ക്ലോണുകളുമായി രക്തം താരതമ്യം ചെയ്തപ്പോൾ, ശക്തമായ തിരഞ്ഞെടുപ്പും മോട്ടിഫുകളുടെ ചില തിരഞ്ഞെടുപ്പ് മാറ്റലും നിരീക്ഷിക്കപ്പെട്ടു (ചിത്രം 1f), കൂടാതെ 12 അംഗങ്ങളിൽ (ചിത്രം 1h) മുൻകൂട്ടി നിശ്ചയിച്ച സ്ഥാനങ്ങളിൽ ചില അമിനോ ആസിഡുകൾ മുൻഗണന നൽകി. ശ്രദ്ധേയമായി, വ്യക്തിഗത മൃഗങ്ങൾ സെറിബ്രോസ്പൈനൽ ദ്രാവകത്തിൽ ഗണ്യമായി വ്യത്യാസപ്പെട്ടിരുന്നു, അതേസമയം രണ്ട് മൃഗങ്ങളിലും രക്തത്തിലെ ഗ്ലൈസിൻ സമ്പുഷ്ടീകരണം നിരീക്ഷിക്കപ്പെട്ടു (അനുബന്ധ ചിത്രം 4a-j). #1.1, #1.2 എന്നീ മൃഗങ്ങളുടെ സെറിബ്രോസ്പൈനൽ ദ്രാവകത്തിലെ സീക്വൻസ് ഡാറ്റ കർശനമായി ഫിൽട്ടർ ചെയ്ത ശേഷം, ആകെ 964 ഉം 420 ഉം അദ്വിതീയ 12-മെർ പെപ്റ്റൈഡുകൾ ലഭിച്ചു (അനുബന്ധ ചിത്രം 1d-e). ഒറ്റപ്പെട്ട ഫേജ് ക്ലോണുകൾ വർദ്ധിപ്പിക്കുകയും ഇൻ വിവോ സെലക്ഷന്റെ രണ്ടാം റൗണ്ടിന് വിധേയമാക്കുകയും ചെയ്തു. രണ്ടാം റൗണ്ട് സെലക്ഷനിൽ നിന്ന് വേർതിരിച്ചെടുത്ത ഫേജിനെ ഓരോ മൃഗത്തിലും HTS-ന് വിധേയമാക്കി, ട്രൈപെപ്റ്റൈഡ് മോട്ടിഫുകളുടെ സംഭവം വിശകലനം ചെയ്യുന്നതിനായി തിരിച്ചറിഞ്ഞ എല്ലാ പെപ്റ്റൈഡുകളും ഒരു മോട്ടിഫ് റെക്കഗ്നിഷൻ പ്രോഗ്രാമിലേക്കുള്ള ഇൻപുട്ടായി ഉപയോഗിച്ചു (ചിത്രം 2a, b, ef). CSF-ൽ നിന്ന് വീണ്ടെടുക്കപ്പെട്ട ഫേജിന്റെ ആദ്യ സൈക്കിളുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ, A, B എന്നീ ശാഖകളിലെ CSF-ലെ നിരവധി മോട്ടിഫുകളുടെ കൂടുതൽ തിരഞ്ഞെടുപ്പും തിരഞ്ഞെടുപ്പ് റദ്ദാക്കലും ഞങ്ങൾ നിരീക്ഷിച്ചു (ചിത്രം 2). അവ സ്ഥിരതയുള്ള ശ്രേണിയുടെ വ്യത്യസ്ത പാറ്റേണുകളെ പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നുണ്ടോ എന്ന് നിർണ്ണയിക്കാൻ ഒരു നെറ്റ്‌വർക്ക് ഐഡന്റിഫിക്കേഷൻ അൽഗോരിതം പ്രയോഗിച്ചു. ആൾട്ടർനേറ്റീവ് ക്ലേഡ് A (ചിത്രം 2c, d) യിലും ക്ലേഡ് B (ചിത്രം 2g, h) യിലും CSF വീണ്ടെടുത്ത 12-ഡൈമൻഷണൽ സീക്വൻസുകൾക്കിടയിൽ വ്യക്തമായ സാമ്യം നിരീക്ഷിക്കപ്പെട്ടു. ഓരോ ശാഖയിലും പൂൾ ചെയ്ത വിശകലനം 12-മെർ പെപ്റ്റൈഡുകൾക്കുള്ള വ്യത്യസ്ത സെലക്ഷൻ പ്രൊഫൈലുകളും (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം 5c,d) ആദ്യ റൗണ്ട് സെലക്ഷനുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ പൂൾ ചെയ്ത ക്ലോണുകൾക്ക് കാലക്രമേണ CSF/രക്ത ടൈറ്റർ അനുപാതത്തിൽ വർദ്ധനവും വെളിപ്പെടുത്തി (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം 5e). ).
ഇൻ വിവോ ഫങ്ഷണൽ ഫേജ് ഡിസ്പ്ലേ സെലക്ഷന്റെ രണ്ട് തുടർച്ചയായ റൗണ്ടുകൾ വഴി സെറിബ്രോസ്പൈനൽ ദ്രാവകത്തിലെ മോട്ടിഫുകളുടെയും പെപ്റ്റൈഡുകളുടെയും സമ്പുഷ്ടീകരണം.
ഓരോ മൃഗത്തിന്റെയും (മൃഗങ്ങൾ #1.1 ഉം #1.2 ഉം) ആദ്യ റൗണ്ടിൽ നിന്ന് വീണ്ടെടുത്ത എല്ലാ സെറിബ്രോസ്പൈനൽ ഫ്ലൂയിഡ് ഫേജുകളും പൂൾ ചെയ്തു, ആംപ്ലിഫൈ ചെയ്തു, HT-സീക്വൻസ് ചെയ്തു, ഒരുമിച്ച് വീണ്ടും കുത്തിവച്ചു (2 x 1010 ഫേജുകൾ/മൃഗം) 2 SM കാനുലേറ്റഡ് എലികൾ (#1.1 → #). 2.1 ഉം 2.2 ഉം, 1.2 → 2.3 ഉം 2.4 ഉം). (a,b,e,f) ഒന്നും രണ്ടും സെലക്ഷൻ റൗണ്ടുകളിലെ എല്ലാ CSF-ഉത്ഭവിച്ച ഫേജുകളുടെയും ട്രൈപെപ്റ്റൈഡ് മോട്ടിഫുകളുടെ ആപേക്ഷിക ആവൃത്തി താരതമ്യം ചെയ്യുന്ന പരസ്പരബന്ധ സ്കാറ്റർപ്ലോട്ടുകൾ. രണ്ട് ഓറിയന്റേഷനുകളിലും പെപ്റ്റൈഡുകളിൽ കാണപ്പെടുന്ന എല്ലാ സാധ്യമായ ഓവർലാപ്പിംഗ് ട്രൈപെപ്റ്റൈഡുകളെ പ്രതിനിധീകരിക്കുന്ന മോട്ടിഫുകളുടെ ആപേക്ഷിക ആവൃത്തിയും വിതരണവും. 1000 റീഡിംഗുകളിൽ കണ്ടെത്തിയ മോട്ടിഫുകളുടെ എണ്ണം കാണിച്ചിരിക്കുന്നു. താരതമ്യം ചെയ്ത ലൈബ്രറികളിൽ ഒന്നിൽ (p < 0.001) തിരഞ്ഞെടുത്തതോ ഒഴിവാക്കിയതോ ആയ മോട്ടിഫുകൾ ചുവന്ന ഡോട്ടുകൾ ഉപയോഗിച്ച് ഹൈലൈറ്റ് ചെയ്തിരിക്കുന്നു. (c, d, g, h) ഇൻ വിവോ സെലക്ഷന്റെ 2, 1 റൗണ്ടുകളെ അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള എല്ലാ CSF-സമ്പന്നമായ 12 അമിനോ ആസിഡ് ലോംഗ് സീക്വൻസുകളുടെയും സീക്വൻസ് ലോഗോ പ്രാതിനിധ്യം. ഒറ്റ അക്ഷര കോഡിന്റെ വലുപ്പം ആ സ്ഥാനത്ത് ആ അമിനോ ആസിഡ് എത്ര തവണ സംഭവിക്കുന്നുവെന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്നു. ലോഗോയെ പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നതിന്, രണ്ട് സെലക്ഷൻ റൗണ്ടുകൾക്കിടയിലുള്ള വ്യക്തിഗത മൃഗങ്ങളിൽ നിന്ന് വേർതിരിച്ചെടുത്ത CSF സീക്വൻസുകളുടെ ആവൃത്തി താരതമ്യം ചെയ്യുകയും രണ്ടാം റൗണ്ടിലെ സമ്പുഷ്ടമായ സീക്വൻസുകൾ കാണിക്കുകയും ചെയ്യുന്നു: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 ഉം (h) #1.2–#2.4 ഉം. (c, d) മൃഗങ്ങൾ നമ്പർ 2.1 ഉം നമ്പർ 2.2 ഉം അല്ലെങ്കിൽ (g, h) നമ്പർ 2.3 ഉം നമ്പർ 2.4 ഉം മൃഗങ്ങളിൽ നൽകിയിരിക്കുന്ന സ്ഥാനത്ത് ഏറ്റവും സമ്പുഷ്ടമായ അമിനോ ആസിഡുകൾ നിറത്തിൽ കാണിച്ചിരിക്കുന്നു. പച്ച = ധ്രുവം, പർപ്പിൾ = ന്യൂട്രൽ, നീല = ബേസിക്, ചുവപ്പ് = അസിഡിക്, കറുപ്പ് = ഹൈഡ്രോഫോബിക് അമിനോ ആസിഡുകൾ.
മൂന്നാം റൗണ്ട് തിരഞ്ഞെടുപ്പിനുശേഷം, രണ്ട് മൃഗങ്ങളിൽ നിന്ന് വേർതിരിച്ചെടുത്ത 332 CSF-പുനർനിർമ്മിച്ച ഫേജ് ക്ലോണുകളിൽ നിന്ന് 124 അദ്വിതീയ പെപ്റ്റൈഡ് സീക്വൻസുകൾ (#3.1 ഉം #3.2 ഉം) ഞങ്ങൾ തിരിച്ചറിഞ്ഞു (അനുബന്ധ ചിത്രം 6a). LGSVS (18.7%) എന്ന ശ്രേണിയിലാണ് ഏറ്റവും ഉയർന്ന ആപേക്ഷിക അനുപാതം ഉണ്ടായിരുന്നത്, തുടർന്ന് വൈൽഡ്-ടൈപ്പ് ഇൻസേർട്ടുകൾ PAGISRELVDKL (8.2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2.2%), SARGSWREIVSLS (2.2%) എന്നിവയുണ്ട്. അവസാന നാലാം റൗണ്ടിൽ, മൂന്ന് വ്യത്യസ്ത മൃഗങ്ങളിൽ നിന്ന് സ്വതന്ത്രമായി തിരഞ്ഞെടുത്ത രണ്ട് ശാഖകൾ ഞങ്ങൾ സംയോജിപ്പിച്ചു (ചിത്രം 1c). CSF-ൽ നിന്ന് കണ്ടെടുത്ത 925 ക്രമീകരിച്ച ഫേജ് ക്ലോണുകളിൽ, നാലാം റൗണ്ടിൽ 64 അദ്വിതീയ പെപ്റ്റൈഡ് സീക്വൻസുകൾ ഞങ്ങൾ കണ്ടെത്തി (അനുബന്ധ ചിത്രം 6b), അവയിൽ വൈൽഡ്-ടൈപ്പ് ഫേജിന്റെ ആപേക്ഷിക അനുപാതം 0.8% ആയി കുറഞ്ഞു. നാലാം റൗണ്ടിലെ ഏറ്റവും സാധാരണമായ CSF ക്ലോണുകൾ LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3.6%), RLSSVDSDLSGC (3, 2%) എന്നിവയായിരുന്നു. NNK ലൈബ്രറി രൂപകൽപ്പനയ്ക്കായി ഡീജനറേറ്റ് കോഡോണുകൾ ഉപയോഗിക്കുമ്പോൾ ലൈബ്രറി പ്രൈമറുകളിലെ ന്യൂക്ലിയോടൈഡ് ഇൻസേർഷനുകൾ/ഇല്ലാതാക്കൽ അല്ലെങ്കിൽ അകാല സ്റ്റോപ്പ് കോഡോണുകൾ എന്നിവ മൂലമാണ് തിരഞ്ഞെടുത്ത പെപ്റ്റൈഡുകളുടെ ദൈർഘ്യ ശ്രേണി. അകാല സ്റ്റോപ്പ് കോഡോണുകൾ ചെറിയ പെപ്റ്റൈഡുകൾ സൃഷ്ടിക്കുകയും അനുകൂലമായ aa മോട്ടിഫ് അടങ്ങിയിരിക്കുന്നതിനാൽ തിരഞ്ഞെടുക്കപ്പെടുകയും ചെയ്യുന്നു. സിന്തറ്റിക് ലൈബ്രറികളുടെ പ്രൈമറുകളിലെ ഇൻസേർഷനുകൾ/ഇല്ലാതാക്കൽ എന്നിവയിൽ നിന്ന് ദൈർഘ്യമേറിയ പെപ്റ്റൈഡുകൾ ഉണ്ടാകാം. ഇത് രൂപകൽപ്പന ചെയ്ത സ്റ്റോപ്പ് കോഡോണിനെ ഫ്രെയിമിന് പുറത്ത് സ്ഥാപിക്കുകയും ഒരു പുതിയ സ്റ്റോപ്പ് കോഡോൺ താഴേക്ക് ദൃശ്യമാകുന്നതുവരെ അത് വായിക്കുകയും ചെയ്യുന്നു. പൊതുവേ, ഇൻപുട്ട് ഡാറ്റയെ സാമ്പിൾ ഔട്ട്പുട്ട് ഡാറ്റയുമായി താരതമ്യം ചെയ്തുകൊണ്ട് നാല് സെലക്ഷൻ റൗണ്ടുകളുടെയും സമ്പുഷ്ടീകരണ ഘടകങ്ങൾ ഞങ്ങൾ കണക്കാക്കി. ആദ്യ റൗണ്ട് സ്ക്രീനിംഗിനായി, വൈൽഡ്-ടൈപ്പ് ഫേജ് ടൈറ്ററുകളെ ഒരു നിർദ്ദിഷ്ടമല്ലാത്ത പശ്ചാത്തല റഫറൻസായി ഞങ്ങൾ ഉപയോഗിച്ചു. രസകരമെന്നു പറയട്ടെ, ആദ്യ CSF സൈക്കിളിൽ നെഗറ്റീവ് ഫേജ് സെലക്ഷൻ വളരെ ശക്തമായിരുന്നു, പക്ഷേ രക്തത്തിൽ അല്ല (ചിത്രം 3a), പെപ്റ്റൈഡ് ലൈബ്രറിയിലെ മിക്ക അംഗങ്ങളുടെയും നിഷ്ക്രിയ വ്യാപനത്തിന്റെ കുറഞ്ഞ സാധ്യത മൂലമാകാം ഇത്. ബാക്ടീരിയോഫേജുകളേക്കാൾ കൂടുതൽ കാര്യക്ഷമമായി നിലനിർത്തപ്പെടുകയോ രക്തപ്രവാഹത്തിൽ നിന്ന് നീക്കം ചെയ്യപ്പെടുകയോ ചെയ്യുന്ന പ്രവണതയുണ്ട്. എന്നിരുന്നാലും, രണ്ടാം റൗണ്ട് പാനിംഗിൽ, രണ്ട് ക്ലേഡുകളിലും CSF-ലെ ഫേജുകളുടെ ശക്തമായ തിരഞ്ഞെടുപ്പ് നിരീക്ഷിക്കപ്പെട്ടു, ഇത് സൂചിപ്പിക്കുന്നത് മുൻ റൗണ്ട് CSF ആഗിരണം പ്രോത്സാഹിപ്പിക്കുന്ന പെപ്റ്റൈഡുകൾ പ്രദർശിപ്പിക്കുന്ന ഫേജുകളാൽ സമ്പുഷ്ടമായിരുന്നു എന്നാണ് (ചിത്രം 3a). വീണ്ടും, കാര്യമായ രക്ത സമ്പുഷ്ടീകരണം ഇല്ലാതെ. മൂന്നാമത്തെയും നാലാമത്തെയും റൗണ്ടുകളിൽ, ഫേജ് ക്ലോണുകൾ CSF-ൽ ഗണ്യമായി സമ്പുഷ്ടമായി. അവസാന രണ്ട് റൗണ്ട് തിരഞ്ഞെടുപ്പുകൾക്കിടയിലുള്ള ഓരോ അദ്വിതീയ പെപ്റ്റൈഡ് സീക്വൻസിന്റെയും ആപേക്ഷിക ആവൃത്തി താരതമ്യം ചെയ്യുമ്പോൾ, നാലാമത്തെ റൗണ്ട് തിരഞ്ഞെടുപ്പിൽ സീക്വൻസുകൾ കൂടുതൽ സമ്പുഷ്ടമാണെന്ന് ഞങ്ങൾ കണ്ടെത്തി (ചിത്രം 3b). രണ്ട് പെപ്റ്റൈഡ് ഓറിയന്റേഷനുകളും ഉപയോഗിച്ച് 64 അദ്വിതീയ പെപ്റ്റൈഡ് സീക്വൻസുകളിൽ നിന്നും ആകെ 931 ട്രൈപെപ്റ്റൈഡ് മോട്ടിഫുകൾ വേർതിരിച്ചെടുത്തു. നാലാം റൗണ്ടിലെ ഏറ്റവും സമ്പുഷ്ടമായ മോട്ടിഫുകൾ, ഇൻജെക്റ്റഡ് ലൈബ്രറിയുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ എല്ലാ റൗണ്ടുകളിലുമുള്ള അവയുടെ സമ്പുഷ്ടീകരണ പ്രൊഫൈലുകൾക്കായി കൂടുതൽ സൂക്ഷ്മമായി പരിശോധിച്ചു (കട്ട്-ഓഫ്: 10% സമ്പുഷ്ടീകരണം) (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം 6c). രണ്ട് സെലക്ഷൻ ബ്രാഞ്ചുകളുടെയും മുൻ റൗണ്ടുകളിൽ മിക്ക പഠന മോട്ടിഫുകളും സമ്പുഷ്ടമാണെന്ന് തിരഞ്ഞെടുപ്പിന്റെ പൊതുവായ പാറ്റേണുകൾ കാണിച്ചു. എന്നിരുന്നാലും, ചില മോട്ടിഫുകൾ (ഉദാ. SGL, VSG, LGS GSV) പ്രധാനമായും ആൾട്ടർനേറ്റീവ് ക്ലേഡ് A-യിൽ നിന്നുള്ളവയായിരുന്നു, മറ്റുള്ളവ (ഉദാ. FGW, RTN, WGF, NTR) ആൾട്ടർനേറ്റീവ് ക്ലേഡ് B-യിൽ സമ്പുഷ്ടമായിരുന്നു.
സ്ട്രെപ്റ്റാവിഡിൻ പേലോഡുകളുമായി സംയോജിപ്പിച്ച CSF-സമ്പുഷ്ടമായ ഫേജ്-ഡിസ്പ്ലേഡ് പെപ്റ്റൈഡുകളുടെയും ബയോട്ടിനൈലേറ്റഡ് ലീഡർ പെപ്റ്റൈഡുകളുടെയും CSF ഗതാഗതത്തിന്റെ സാധൂകരണം.
(എ) ഇൻജെക്റ്റഡ് (ഇൻപുട്ട് = I) ഫേജ് (PFU) ടൈറ്ററുകളും നിർണ്ണയിച്ച CSF ഫേജ് ടൈറ്ററുകളും (ഔട്ട്പുട്ട് = O) അടിസ്ഥാനമാക്കി നാല് റൗണ്ടുകളിലും (R1-R4) കണക്കാക്കിയ സമ്പുഷ്ടീകരണ അനുപാതങ്ങൾ. അവസാന മൂന്ന് റൗണ്ടുകളിലെ (R2-R4) സമ്പുഷ്ടീകരണ ഘടകങ്ങൾ മുൻ റൗണ്ടുമായും ആദ്യ റൗണ്ടുമായും (R1) വെയ്റ്റ് ഡാറ്റ ഉപയോഗിച്ച് താരതമ്യം ചെയ്താണ് കണക്കാക്കിയത്. തുറന്ന ബാറുകൾ സെറിബ്രോസ്പൈനൽ ദ്രാവകമാണ്, ഷേഡഡ് ബാറുകൾ പ്ലാസ്മയാണ്. (***p<0.001, വിദ്യാർത്ഥിയുടെ ടി-ടെസ്റ്റിനെ അടിസ്ഥാനമാക്കി). (ബി) ഏറ്റവും സമൃദ്ധമായ ഫേജ് പെപ്റ്റൈഡുകളുടെ പട്ടിക, തിരഞ്ഞെടുപ്പിന്റെ 4-ാം റൗണ്ടിനുശേഷം CSF-ൽ ശേഖരിച്ച എല്ലാ ഫേജുകളുമായും അവയുടെ ആപേക്ഷിക അനുപാതമനുസരിച്ച് റാങ്ക് ചെയ്‌തിരിക്കുന്നു. ഏറ്റവും സാധാരണമായ ആറ് ഫേജ് ക്ലോണുകൾ നിറത്തിലും അക്കങ്ങളിലും സെലക്ഷന്റെ 3-നും 4-നും ഇടയിൽ (ഇൻസെറ്റുകൾ) ഹൈലൈറ്റ് ചെയ്‌തിരിക്കുന്നു. (സി,ഡി) നാലാം റൗണ്ടിൽ നിന്നുള്ള ആറ് ഏറ്റവും സമ്പുഷ്ടമായ ഫേജ് ക്ലോണുകൾ, ശൂന്യമായ ഫേജ്, പാരന്റൽ ഫേജ് പെപ്റ്റൈഡ് ലൈബ്രറികൾ എന്നിവ ഒരു CSF സാമ്പിൾ മോഡലിൽ വ്യക്തിഗതമായി വിശകലനം ചെയ്‌തു. സൂചിപ്പിച്ച സമയ പോയിന്റുകളിൽ CSF ഉം രക്ത സാമ്പിളുകളും ശേഖരിച്ചു. (സി) 6 കാൻഡിഡേറ്റ് ഫേജ് ക്ലോണുകളുടെ തുല്യ അളവ് (2 x 1010 ഫേജുകൾ/മൃഗങ്ങൾ), ശൂന്യമായ ഫേജുകൾ (#1779) (2 x 1010 ഫേജുകൾ/മൃഗങ്ങൾ), സ്റ്റോക്ക് ഫേജ് പെപ്റ്റൈഡ് ലൈബ്രറികൾ (2 x 1012 ഫേജുകൾ/മൃഗങ്ങൾ). കുറഞ്ഞത് 3 CM എങ്കിലും കുത്തിവയ്ക്കുക. കാനുലേറ്റഡ് മൃഗത്തിന് വാൽ സിര വഴി വെവ്വേറെ കുത്തിവയ്ക്കുന്നു. കുത്തിവച്ച ഓരോ ഫേജ് ക്ലോണിന്റെയും ഫേജ് പെപ്റ്റൈഡ് ലൈബ്രറിയുടെയും CSF ഫാർമക്കോകിനറ്റിക്സ് കാലക്രമേണ കാണിച്ചിരിക്കുന്നു. (ഡി) സാമ്പിൾ സമയത്ത് വീണ്ടെടുക്കപ്പെട്ട എല്ലാ ഫേജുകൾക്കും/mL നും ശരാശരി CSF/രക്ത അനുപാതം കാണിക്കുന്നു. (ഇ) നാല് സിന്തറ്റിക് ലീഡർ പെപ്റ്റൈഡുകളും ഒരു സ്ക്രാംബിൾഡ് കൺട്രോളും അവയുടെ N-ടെർമിനസ് (ടെട്രാമർ ഡിസ്പ്ലേ) വഴി ബയോട്ടിനുമായി സ്ട്രെപ്റ്റാവിഡിനുമായി ബന്ധിപ്പിച്ചു, തുടർന്ന് കുത്തിവയ്പ്പ് (ടെയിൽ വെയിൻ iv, 10 മില്ലിഗ്രാം സ്ട്രെപ്റ്റാവിഡിൻ/കിലോഗ്രാം). കുറഞ്ഞത് മൂന്ന് ഇൻട്യൂബേറ്റഡ് എലികൾ (N = 3). സൂചിപ്പിച്ച സമയ പോയിന്റുകളിൽ CSF സാമ്പിളുകൾ ശേഖരിക്കുകയും CSF ആന്റി-സ്ട്രെപ്റ്റാവിഡിൻ ELISA ഉപയോഗിച്ച് സ്ട്രെപ്റ്റാവിഡിൻ സാന്ദ്രത അളക്കുകയും ചെയ്തു (nd = കണ്ടെത്തിയില്ല). (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ANOVA പരിശോധനയെ അടിസ്ഥാനമാക്കി). (f) ഏറ്റവും സമ്പുഷ്ടമായ ഫേജ് പെപ്റ്റൈഡ് ക്ലോൺ #2002 (പർപ്പിൾ) ന്റെ അമിനോ ആസിഡ് ശ്രേണിയുടെ നാലാം റൗണ്ട് തിരഞ്ഞെടുപ്പിൽ നിന്ന് തിരഞ്ഞെടുത്ത മറ്റ് ഫേജ് പെപ്റ്റൈഡ് ക്ലോണുകളുമായി താരതമ്യം ചെയ്യുക. സമാനവും സമാനമായതുമായ അമിനോ ആസിഡ് ശകലങ്ങൾ വർണ്ണ-കോഡ് ചെയ്തിരിക്കുന്നു.
നാലാം റൗണ്ടിലെ (ചിത്രം 3b) എല്ലാ സമ്പുഷ്ടമായ ഫേജുകളിൽ നിന്നും, CSF സാമ്പിൾ മോഡലിൽ കൂടുതൽ വ്യക്തിഗത വിശകലനത്തിനായി ആറ് കാൻഡിഡേറ്റ് ക്ലോണുകൾ തിരഞ്ഞെടുത്തു. മൂന്ന് കാനുലേറ്റഡ് CM മൃഗങ്ങളിലേക്ക് തുല്യ അളവിൽ ആറ് കാൻഡിഡേറ്റ് ഫേജ്, ശൂന്യമായ ഫേജ് (ഇൻസേർട്ട് ഇല്ല), പ്രൊഫേജ് പെപ്റ്റൈഡ് ലൈബ്രറികൾ എന്നിവ കുത്തിവച്ചു, കൂടാതെ CSF (ചിത്രം 3c) ലും രക്തത്തിലും (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം 7) ഫാർമക്കോകിനറ്റിക്സ് നിർണ്ണയിക്കപ്പെട്ടു. പരീക്ഷിച്ച എല്ലാ ഫേജ് ക്ലോണുകളും ശൂന്യമായ കൺട്രോൾ ഫേജിന്റെ (#1779) ലെവലിൽ CSF കമ്പാർട്ടുമെന്റിനെ ലക്ഷ്യം വച്ചുള്ളതാണ്. ഉദാഹരണത്തിന്, #2020, #2077 ക്ലോണുകൾക്ക് കൺട്രോൾ ഫേജിനേക്കാൾ ഏകദേശം 1000 മടങ്ങ് ഉയർന്ന CSF ടൈറ്ററുകൾ ഉണ്ടായിരുന്നു. തിരഞ്ഞെടുത്ത ഓരോ പെപ്റ്റൈഡിന്റെയും ഫാർമക്കോകൈനറ്റിക് പ്രൊഫൈൽ വ്യത്യസ്തമാണ്, പക്ഷേ അവയ്‌ക്കെല്ലാം ഉയർന്ന CSF ഹോമിംഗ് കഴിവുണ്ട്. #1903, #2011 എന്നീ ക്ലോണുകൾക്ക് കാലക്രമേണ സ്ഥിരമായ കുറവ് ഞങ്ങൾ നിരീക്ഷിച്ചു, അതേസമയം #2077, #2002, #2009 എന്നീ ക്ലോണുകൾക്ക് ആദ്യ 10 മിനിറ്റിനുള്ളിൽ വർദ്ധനവ് സജീവമായ ഗതാഗതത്തെ സൂചിപ്പിക്കാമെങ്കിലും അത് പരിശോധിക്കേണ്ടതുണ്ട്. ക്ലോണുകൾ #2020, #2002, #2077 എന്നിവ ഉയർന്ന തലങ്ങളിൽ സ്ഥിരത കൈവരിച്ചു, അതേസമയം പ്രാരംഭ വർദ്ധനവിന് ശേഷം ക്ലോൺ #2009 ന്റെ CSF സാന്ദ്രത പതുക്കെ കുറഞ്ഞു. തുടർന്ന് ഓരോ CSF കാൻഡിഡേറ്റിന്റെയും ആപേക്ഷിക ആവൃത്തിയെ അതിന്റെ രക്ത സാന്ദ്രതയുമായി താരതമ്യം ചെയ്തു (ചിത്രം 3d). എല്ലാ സാമ്പിൾ സമയങ്ങളിലും ഓരോ CSF കാൻഡിഡേറ്റിന്റെയും ശരാശരി ടൈറ്ററും അതിന്റെ രക്ത ടൈറ്ററും തമ്മിലുള്ള പരസ്പരബന്ധം ആറ് കാൻഡിഡേറ്റുകളിൽ മൂന്നെണ്ണം രക്ത CSF-ൽ ഗണ്യമായി സമ്പുഷ്ടമാണെന്ന് കാണിച്ചു. രസകരമെന്നു പറയട്ടെ, ക്ലോൺ #2077 ഉയർന്ന രക്ത സ്ഥിരത കാണിച്ചു (അനുബന്ധ ചിത്രം 7). പെപ്റ്റൈഡുകൾക്ക് തന്നെ ഫേജ് കണികകൾ ഒഴികെയുള്ള മറ്റ് ചരക്കുകളെ CSF കമ്പാർട്ടുമെന്റിലേക്ക് സജീവമായി കൊണ്ടുപോകാൻ കഴിയുമെന്ന് സ്ഥിരീകരിക്കാൻ, പെപ്റ്റൈഡുകൾ ഫേജ് കണികയുമായി ബന്ധിപ്പിക്കുന്ന N-ടെർമിനസിൽ ബയോട്ടിൻ ഉപയോഗിച്ച് നിർമ്മിച്ച നാല് ലീഡർ പെപ്റ്റൈഡുകൾ ഞങ്ങൾ സമന്വയിപ്പിച്ചു. ബയോട്ടിനൈലേറ്റഡ് പെപ്റ്റൈഡുകൾ (നമ്പർ 2002, 2009, 2020, 2077) സ്ട്രെപ്റ്റാവിഡിനുമായി (SA) സംയോജിപ്പിച്ച് ഫേജ് ജ്യാമിതിയെ അനുകരിക്കുന്ന മൾട്ടിമെറിക് രൂപങ്ങൾ നേടി. കാർഗോ-ട്രാൻസ്പോർട്ടിംഗ് പ്രോട്ടീൻ പെപ്റ്റൈഡുകളായി രക്തത്തിലും സെറിബ്രോസ്പൈനൽ ദ്രാവകത്തിലും SA എക്സ്പോഷർ അളക്കാനും ഈ ഫോർമാറ്റ് ഞങ്ങളെ അനുവദിച്ചു. പ്രധാനമായും, ഈ SA-കൺജുഗേറ്റഡ് ഫോർമാറ്റിൽ സിന്തറ്റിക് പെപ്റ്റൈഡുകൾ നൽകുമ്പോൾ ഫേജ് ഡാറ്റ പലപ്പോഴും പുനർനിർമ്മിക്കാൻ കഴിയും (ചിത്രം 3e). സ്ക്രാംബിൾഡ് പെപ്റ്റൈഡുകൾക്ക് 48 മണിക്കൂറിനുള്ളിൽ കണ്ടെത്താനാകാത്ത അളവിലുള്ള പ്രാരംഭ എക്സ്പോഷർ കുറവും വേഗത്തിലുള്ള CSF ക്ലിയറൻസും ഉണ്ടായിരുന്നു. ഈ പെപ്റ്റൈഡ് ഫേജ് ക്ലോണുകളുടെ CSF സ്ഥലത്തേക്കുള്ള ഡെലിവറി പാതകളെക്കുറിച്ച് ഉൾക്കാഴ്ച നേടുന്നതിന്, ഇൻട്രാവണസ് കുത്തിവയ്പ്പിന് 1 മണിക്കൂർ കഴിഞ്ഞ് ഫേജ് കണികകളെ നേരിട്ട് കണ്ടെത്തുന്നതിന് ഇമ്മ്യൂണോഹിസ്റ്റോകെമിസ്ട്രി (IHC) ഉപയോഗിച്ച് വ്യക്തിഗത ഫേജ് പെപ്റ്റൈഡ് ഹിറ്റുകളുടെ പ്രാദേശികവൽക്കരണം ഞങ്ങൾ വിശകലനം ചെയ്തു. ശ്രദ്ധേയമായി, ക്ലോണുകൾ #2002, #2077, #2009 എന്നിവ തലച്ചോറിലെ കാപ്പിലറികളിലെ ശക്തമായ സ്റ്റെയിനിംഗ് വഴി കണ്ടെത്താമായിരുന്നു, അതേസമയം കൺട്രോൾ ഫേജ് (#1779) ഉം ക്ലോൺ #2020 ഉം കണ്ടെത്തിയില്ല (അനുബന്ധ ചിത്രം 8). ഈ പെപ്റ്റൈഡുകൾ BBB കൃത്യമായി കടക്കുന്നതിലൂടെ തലച്ചോറിൽ സ്വാധീനം ചെലുത്തുന്നുവെന്ന് ഇത് സൂചിപ്പിക്കുന്നു. BSCFB റൂട്ടും ഉൾപ്പെട്ടിരിക്കാമെന്നതിനാൽ, ഈ സിദ്ധാന്തം പരിശോധിക്കുന്നതിന് കൂടുതൽ വിശദമായ വിശകലനം ആവശ്യമാണ്. ഏറ്റവും സമ്പുഷ്ടമായ ക്ലോണിന്റെ (#2002) അമിനോ ആസിഡ് ശ്രേണിയെ മറ്റ് തിരഞ്ഞെടുത്ത പെപ്റ്റൈഡുകളുമായി താരതമ്യം ചെയ്യുമ്പോൾ, അവയിൽ ചിലതിന് സമാനമായ അമിനോ ആസിഡ് എക്സ്റ്റൻഷനുകൾ ഉണ്ടെന്ന് ശ്രദ്ധിക്കപ്പെട്ടു, ഇത് സമാനമായ ഒരു ഗതാഗത സംവിധാനത്തെ സൂചിപ്പിക്കാം (ചിത്രം 3f).
അതിന്റെ സവിശേഷമായ പ്ലാസ്മ പ്രൊഫൈലും കാലക്രമേണ CSF ലെ ഗണ്യമായ വർദ്ധനവും കാരണം, ഫേജ് ഡിസ്പ്ലേ ക്ലോൺ #2077 48 മണിക്കൂർ ദൈർഘ്യമുള്ള കാലയളവിൽ കൂടുതൽ പര്യവേക്ഷണം ചെയ്യപ്പെട്ടു, കൂടാതെ സുസ്ഥിരമായ SA ലെവലുകളുമായി ബന്ധപ്പെട്ട് നിരീക്ഷിച്ച CSF ലെ ദ്രുതഗതിയിലുള്ള വർദ്ധനവ് പുനർനിർമ്മിക്കാൻ കഴിഞ്ഞു (ചിത്രം 4a). തിരിച്ചറിഞ്ഞ മറ്റ് ഫേജ് ക്ലോണുകളെ സംബന്ധിച്ചിടത്തോളം, #2077 തലച്ചോറിലെ കാപ്പിലറികൾക്കായി ശക്തമായി കളങ്കപ്പെടുത്തി, ഉയർന്ന റെസല്യൂഷനിൽ കാണുമ്പോൾ കാപ്പിലറി മാർക്കർ ലെക്റ്റിനുമായി ഗണ്യമായ കോലോക്കലൈസേഷൻ കാണിച്ചു, ഒരുപക്ഷേ പാരെൻചൈമൽ സ്പേസിൽ ചില സ്റ്റെയിനിംഗുകളും (ചിത്രം 4b). സിഎൻഎസിൽ പെപ്റ്റൈഡ്-മധ്യസ്ഥതയുള്ള ഫാർമക്കോളജിക്കൽ ഇഫക്റ്റുകൾ ലഭിക്കുമോ എന്ന് അന്വേഷിക്കാൻ, i) #2077 ട്രാൻസിറ്റ് പെപ്റ്റൈഡിന്റെയും ii) BACE1 ഇൻഹിബിറ്റർ പെപ്റ്റൈഡിന്റെയും ബയോട്ടിനൈലേറ്റഡ് പതിപ്പുകൾ SA യുമായി രണ്ട് വ്യത്യസ്ത അനുപാതങ്ങളിൽ കലർത്തിയ ഒരു പരീക്ഷണം ഞങ്ങൾ നടത്തി. ഒരു കോമ്പിനേഷനായി ഞങ്ങൾ BACE1 പെപ്റ്റൈഡ് ഇൻഹിബിറ്റർ മാത്രമേ ഉപയോഗിച്ചുള്ളൂ, മറ്റൊന്നിനായി ഞങ്ങൾ BACE1 പെപ്റ്റൈഡ് ഇൻഹിബിറ്ററിന്റെ 1:3 അനുപാതം #2077 പെപ്റ്റൈഡിലേക്ക് ഉപയോഗിച്ചു. രണ്ട് സാമ്പിളുകളും ഇൻട്രാവെൻസായി നൽകുകയും രക്തത്തിലെയും സെറിബ്രോസ്പൈനൽ ദ്രാവകത്തിലെയും ബീറ്റാ-അമിലോയിഡ് പെപ്റ്റൈഡ് 40 (അബെറ്റ40) ന്റെ അളവ് കാലക്രമേണ അളക്കുകയും ചെയ്തു. തലച്ചോറിലെ പാരെൻചൈമയിലെ BACE1 ഇൻഹിബിഷനെ പ്രതിഫലിപ്പിക്കുന്നതിനാലാണ് അബെറ്റ40 CSF-ൽ അളന്നത്. പ്രതീക്ഷിച്ചതുപോലെ, രണ്ട് കോംപ്ലക്സുകളും അബെറ്റ40 ന്റെ രക്തത്തിലെ അളവ് ഗണ്യമായി കുറച്ചു (ചിത്രം 4c, d). എന്നിരുന്നാലും, പെപ്റ്റൈഡ് നമ്പർ 2077 ന്റെ മിശ്രിതവും SA യുമായി സംയോജിപ്പിച്ച BACE1 പെപ്റ്റൈഡിന്റെ ഒരു ഇൻഹിബിറ്ററും അടങ്ങിയ സാമ്പിളുകൾ മാത്രമാണ് സെറിബ്രോസ്പൈനൽ ദ്രാവകത്തിൽ അബെറ്റ40 ൽ ഗണ്യമായ കുറവുണ്ടാക്കിയത് (ചിത്രം 4c). പെപ്റ്റൈഡ് നമ്പർ 2077 ന് 60 kDa SA പ്രോട്ടീൻ CNS ലേക്ക് കൊണ്ടുപോകാൻ കഴിയുമെന്നും BACE1 പെപ്റ്റൈഡിന്റെ SA-സംയോജിത ഇൻഹിബിറ്ററുകളുമായി ഫാർമക്കോളജിക്കൽ ഇഫക്റ്റുകൾ ഉണ്ടാക്കുന്നുവെന്നും ഡാറ്റ കാണിക്കുന്നു.
(എ) കുറഞ്ഞത് മൂന്ന് CM-ഇൻട്യൂബേറ്റഡ് എലികളിൽ CSF പെപ്റ്റൈഡ് #2077 (RLSSVDSDLSGC) യുടെയും കുത്തിവയ്ക്കാത്ത നിയന്ത്രണ ഫേജിന്റെയും (#1779) ദീർഘകാല ഫാർമക്കോകൈനറ്റിക് പ്രൊഫൈലുകൾ കാണിക്കുന്ന T7 ഫേജിന്റെ ക്ലോണൽ കുത്തിവയ്പ്പ് (2 × 10 ഫേജുകൾ/മൃഗം). (ബി) ഫേജ്-ഇൻജക്റ്റ് ചെയ്ത എലികളിലെ (2 × 10 ഫേജുകൾ/മൃഗം) പ്രതിനിധി കോർട്ടിക്കൽ മൈക്രോവെസ്സലുകളുടെ കോൺഫോക്കൽ മൈക്രോസ്കോപ്പിക് ചിത്രം, പെപ്റ്റൈഡ് #2077 ന്റെയും വെസലുകളുടെയും (ലെക്റ്റിൻ) കൌണ്ടർസ്റ്റെയിനിംഗ് കാണിക്കുന്നു. ഈ ഫേജ് ക്ലോണുകൾ 3 എലികൾക്ക് നൽകി, പെർഫ്യൂഷന് മുമ്പ് 1 മണിക്കൂർ പ്രചരിക്കാൻ അനുവദിച്ചു. T7 ഫേജ് കാപ്സിഡിനെതിരെ പോളിക്ലോണൽ FITC-ലേബൽ ചെയ്ത ആന്റിബോഡികൾ ഉപയോഗിച്ച് തലച്ചോറിനെ വിഭജിച്ച് സ്റ്റെയിൻ ചെയ്തു. പെർഫ്യൂഷനും തുടർന്നുള്ള ഫിക്സേഷനും പത്ത് മിനിറ്റ് മുമ്പ്, DyLight594-ലേബൽ ചെയ്ത ലെക്റ്റിൻ ഇൻട്രാവെൻസായി നൽകി. കാപ്പിലറികളുടെയും പെരിവാസ്കുലർ ബ്രെയിൻ ടിഷ്യുവിന്റെയും ല്യൂമനിൽ മൈക്രോവെസ്സലുകളുടെയും ഫേജുകളുടെയും (പച്ച) ലുമിനൽ വശത്തിന്റെ ലെക്റ്റിൻ സ്റ്റെയിനിംഗ് (ചുവപ്പ്) കാണിക്കുന്ന ഫ്ലൂറസെന്റ് ചിത്രങ്ങൾ. സ്കെയിൽ ബാർ 10 µm ന് തുല്യമാണ്. (c, d) ബയോട്ടിനൈലേറ്റഡ് BACE1 ഇൻഹിബിറ്ററി പെപ്റ്റൈഡ് ഒറ്റയ്ക്കോ ബയോട്ടിനൈലേറ്റഡ് ട്രാൻസിറ്റ് പെപ്റ്റൈഡ് #2077 മായി സംയോജിപ്പിച്ചോ സ്ട്രെപ്റ്റാവിഡിനുമായി ബന്ധിപ്പിച്ചു, തുടർന്ന് കുറഞ്ഞത് മൂന്ന് കാനുലേറ്റഡ് CM എലികളുടെ (10 mg സ്ട്രെപ്റ്റാവിഡിൻ/kg) ഇൻട്രാവണസ് കുത്തിവയ്പ്പ് നടത്തി. സൂചിപ്പിച്ച സമയ പോയിന്റുകളിൽ രക്തത്തിലും (ചുവപ്പ്) സെറിബ്രോസ്പൈനൽ ദ്രാവകത്തിലും (ഓറഞ്ച്) Aβ1-40 ELISA ഉപയോഗിച്ച് Aβ40 ലെ BACE1 പെപ്റ്റൈഡ് ഇൻഹിബിറ്റർ-മധ്യസ്ഥത കുറയ്ക്കൽ അളന്നു. മികച്ച വ്യക്തതയ്ക്കായി, ഗ്രാഫിൽ 100% സ്കെയിലിൽ ഒരു ഡോട്ട് ലൈൻ വരയ്ക്കുന്നു. (സി) 3:1 അനുപാതത്തിൽ ട്രാൻസിറ്റ് പെപ്റ്റൈഡ് #2077, BACE1 ഇൻഹിബിറ്ററി പെപ്റ്റൈഡ് എന്നിവയുമായി സംയോജിപ്പിച്ച സ്ട്രെപ്റ്റാവിഡിൻ ഉപയോഗിച്ച് ചികിത്സിച്ച എലികളിൽ രക്തത്തിലെ (ചുവന്ന ത്രികോണങ്ങൾ) Aβ40 ലും സെറിബ്രോസ്പൈനൽ ദ്രാവകത്തിലെ (ഓറഞ്ച് ത്രികോണങ്ങൾ) Aβ40 ലും ശതമാനം കുറവ്. (ഡി) BACE1 ഇൻഹിബിറ്ററി പെപ്റ്റൈഡുമായി മാത്രം സംയോജിപ്പിച്ച സ്ട്രെപ്റ്റാവിഡിൻ ഉപയോഗിച്ച് ചികിത്സിച്ച എലികളിൽ രക്തത്തിലെ Aβ40 (ചുവന്ന വൃത്തങ്ങൾ) ലും സെറിബ്രോസ്പൈനൽ ദ്രാവകത്തിലെ (ഓറഞ്ച് വൃത്തങ്ങൾ) ശതമാന കുറവ്. നിയന്ത്രണത്തിലെ Aβ സാന്ദ്രത 420 pg/ml ആയിരുന്നു (സ്റ്റാൻഡേർഡ് ഡീവിയേഷൻ = 101 pg/ml).
ബയോമെഡിക്കൽ ഗവേഷണത്തിന്റെ നിരവധി മേഖലകളിൽ ഫേജ് ഡിസ്പ്ലേ വിജയകരമായി പ്രയോഗിച്ചിട്ടുണ്ട്. ഇൻ വിവോ വാസ്കുലർ വൈവിധ്യ പഠനങ്ങൾക്കും 18,19 സെറിബ്രൽ വെസലുകളെ ലക്ഷ്യം വച്ചുള്ള പഠനങ്ങൾക്കും 20,21,22,23,24,25,26 ഈ രീതി ഉപയോഗിച്ചു. ഈ പഠനത്തിൽ, സെറിബ്രൽ വെസലുകളെ ലക്ഷ്യം വച്ചുള്ള പെപ്റ്റൈഡുകളെ നേരിട്ട് തിരിച്ചറിയുന്നതിലേക്ക് മാത്രമല്ല, രക്ത-തലച്ചോറിലെ തടസ്സം കടക്കാൻ സജീവമായ ഗതാഗത ഗുണങ്ങളുള്ള സ്ഥാനാർത്ഥികളെ കണ്ടെത്തുന്നതിലേക്കും ഈ തിരഞ്ഞെടുപ്പ് രീതിയുടെ പ്രയോഗം ഞങ്ങൾ വ്യാപിപ്പിച്ചു. സിഎം ഇൻട്യൂബേറ്റഡ് എലികളിൽ ഒരു ഇൻ വിവോ സെലക്ഷൻ നടപടിക്രമത്തിന്റെ വികസനം ഞങ്ങൾ ഇപ്പോൾ വിവരിക്കുകയും CSF ഹോമിംഗ് ഗുണങ്ങളുള്ള പെപ്റ്റൈഡുകളെ തിരിച്ചറിയാനുള്ള അതിന്റെ കഴിവ് പ്രകടിപ്പിക്കുകയും ചെയ്യുന്നു. 12-മെർ റാൻഡം പെപ്റ്റൈഡുകളുടെ ഒരു ലൈബ്രറി പ്രദർശിപ്പിക്കുന്ന T7 ഫേജ് ഉപയോഗിച്ച്, T7 ഫേജ് രക്ത-തലച്ചോറിലെ തടസ്സവുമായി പൊരുത്തപ്പെടാൻ കഴിയുന്നത്ര ചെറുതാണെന്നും (ഏകദേശം 60 nm വ്യാസം) 10 ഉണ്ടെന്നും അതുവഴി രക്ത-തലച്ചോറിലെ തടസ്സം അല്ലെങ്കിൽ കോറോയിഡ് പ്ലെക്സസ് നേരിട്ട് കടക്കുന്നുവെന്നും ഞങ്ങൾക്ക് തെളിയിക്കാൻ കഴിഞ്ഞു. കാനുലേറ്റഡ് സിഎം എലികളിൽ നിന്നുള്ള സിഎസ്എഫ് വിളവെടുപ്പ് നന്നായി നിയന്ത്രിതമായ ഇൻ വിവോ ഫങ്ഷണൽ സ്ക്രീനിംഗ് രീതിയാണെന്നും വേർതിരിച്ചെടുത്ത ഫേജ് വാസ്കുലേച്ചറുമായി ബന്ധിപ്പിച്ചിരിക്കുന്നതായി മാത്രമല്ല, രക്ത-തലച്ചോറിലെ തടസ്സത്തിലുടനീളം ഒരു ട്രാൻസ്പോർട്ടറായി പ്രവർത്തിക്കുന്നുണ്ടെന്നും ഞങ്ങൾ നിരീക്ഷിച്ചു. കൂടാതെ, ഒരേസമയം രക്തം ശേഖരിച്ച് സിഎസ്എഫിലേക്കും രക്തത്തിൽ നിന്ന് ഉരുത്തിരിഞ്ഞ ഫേജുകളിലേക്കും എച്ച്ടിഎസ് പ്രയോഗിക്കുന്നതിലൂടെ, സിഎസ്എഫിന്റെ ഞങ്ങളുടെ തിരഞ്ഞെടുപ്പിനെ രക്ത സമ്പുഷ്ടീകരണമോ തിരഞ്ഞെടുപ്പിന്റെ റൗണ്ടുകൾക്കിടയിൽ വികാസത്തിനുള്ള യോഗ്യതയോ സ്വാധീനിച്ചിട്ടില്ലെന്ന് ഞങ്ങൾ സ്ഥിരീകരിച്ചു. എന്നിരുന്നാലും, സിഎസ്എഫ് കമ്പാർട്ടുമെന്റിൽ എത്താൻ കഴിവുള്ള ഫേജുകൾ തലച്ചോറിൽ സ്വയം സമ്പുഷ്ടമാക്കാൻ ആവശ്യമായത്ര സമയം രക്തപ്രവാഹത്തിൽ അതിജീവിക്കുകയും പ്രചരിക്കുകയും വേണം എന്നതിനാൽ, രക്ത കമ്പാർട്ടുമെന്റ് തിരഞ്ഞെടുക്കൽ പ്രക്രിയയുടെ ഭാഗമാണ്. അസംസ്കൃത എച്ച്ടിഎസ് ഡാറ്റയിൽ നിന്ന് വിശ്വസനീയമായ ക്രമ വിവരങ്ങൾ വേർതിരിച്ചെടുക്കുന്നതിന്, വിശകലന വർക്ക്ഫ്ലോയിൽ പ്ലാറ്റ്ഫോം-നിർദ്ദിഷ്ട ക്രമ പിശകുകൾക്ക് അനുയോജ്യമായ ഫിൽട്ടറുകൾ ഞങ്ങൾ നടപ്പിലാക്കി. സ്ക്രീനിംഗ് രീതിയിൽ ചലനാത്മക പാരാമീറ്ററുകൾ ഉൾപ്പെടുത്തിക്കൊണ്ട്, രക്തത്തിലെ വൈൽഡ്-ടൈപ്പ് ടി7 ഫേജുകളുടെ (t½ ~ 28 മിനിറ്റ്) ദ്രുത ഫാർമക്കോകിനറ്റിക്സ് ഞങ്ങൾ സ്ഥിരീകരിച്ചു24, 27, 28, കൂടാതെ മിനിറ്റിൽ സെറിബ്രോസ്പൈനൽ ദ്രാവകത്തിൽ (t½ ~ 26 മിനിറ്റ്) അവയുടെ അർദ്ധായുസ്സ് നിർണ്ണയിക്കുകയും ചെയ്തു. രക്തത്തിലും സി‌എസ്‌എഫിലും സമാനമായ ഫാർമക്കോകൈനറ്റിക് പ്രൊഫൈലുകൾ ഉണ്ടായിരുന്നിട്ടും, സി‌എസ്‌എഫിൽ ഫേജിന്റെ രക്ത സാന്ദ്രതയുടെ 0.001% മാത്രമേ കണ്ടെത്താൻ കഴിഞ്ഞുള്ളൂ, ഇത് രക്ത-തലച്ചോറ് തടസ്സത്തിലുടനീളം വൈൽഡ്-ടൈപ്പ് ടി 7 ഫേജിന്റെ കുറഞ്ഞ പശ്ചാത്തല ചലനശേഷിയെ സൂചിപ്പിക്കുന്നു. ഇൻ വിവോ പാനിംഗ് തന്ത്രങ്ങൾ ഉപയോഗിക്കുമ്പോൾ, പ്രത്യേകിച്ച് രക്തചംക്രമണത്തിൽ നിന്ന് വേഗത്തിൽ മായ്‌ക്കപ്പെടുന്ന ഫേജ് സിസ്റ്റങ്ങൾക്ക്, കുറച്ച് ക്ലോണുകൾക്ക് മാത്രമേ സി‌എൻ‌എസ് കമ്പാർട്ടുമെന്റിൽ എത്താൻ കഴിയൂ എന്നതിനാൽ, ആദ്യ റൗണ്ടിൽ, ലൈബ്രറി വൈവിധ്യത്തിലെ കുറവ് വളരെ വലുതായിരുന്നു, കാരണം വളരെ കർശനമായ ഈ സി‌എസ്‌എഫ് മോഡലിൽ പരിമിതമായ എണ്ണം ക്ലോണുകൾ മാത്രമേ ഒടുവിൽ ശേഖരിച്ചുള്ളൂ. സി‌എസ്‌എഫ് കമ്പാർട്ടുമെന്റിൽ സജീവമായ ശേഖരണം, രക്ത കമ്പാർട്ടുമെന്റിലെ ക്ലോൺ അതിജീവനം, ആദ്യ 10 മിനിറ്റിനുള്ളിൽ രക്തത്തിൽ നിന്ന് ടി 7 ഫേജ് ക്ലോണുകൾ വേഗത്തിൽ നീക്കംചെയ്യൽ തുടങ്ങിയ നിരവധി തിരഞ്ഞെടുപ്പ് ഘട്ടങ്ങൾ ഈ ഇൻ വിവോ പാനിംഗ് തന്ത്രത്തിൽ ഉൾപ്പെടുന്നു (ചിത്രം 1d, അനുബന്ധ ചിത്രം 4M). അങ്ങനെ, ആദ്യ റൗണ്ടിനുശേഷം, സി‌എസ്‌എഫിൽ വ്യത്യസ്ത ഫേജ് ക്ലോണുകൾ തിരിച്ചറിഞ്ഞു, എന്നിരുന്നാലും വ്യക്തിഗത മൃഗങ്ങൾക്ക് ഒരേ പ്രാരംഭ പൂൾ ഉപയോഗിച്ചു. ഇത് സൂചിപ്പിക്കുന്നത്, ധാരാളം ലൈബ്രറി അംഗങ്ങളുള്ള ഉറവിട ലൈബ്രറികൾക്ക് ഒന്നിലധികം കർശനമായ തിരഞ്ഞെടുപ്പ് ഘട്ടങ്ങൾ വൈവിധ്യത്തിൽ ഗണ്യമായ കുറവുണ്ടാക്കുന്നു എന്നാണ്. അതിനാൽ, ക്രമരഹിതമായ സംഭവങ്ങൾ പ്രാരംഭ തിരഞ്ഞെടുപ്പ് പ്രക്രിയയുടെ ഒരു അവിഭാജ്യ ഘടകമായി മാറും, ഇത് ഫലത്തെ വളരെയധികം സ്വാധീനിക്കും. യഥാർത്ഥ ലൈബ്രറിയിലെ പല ക്ലോണുകൾക്കും സമാനമായ CSF സമ്പുഷ്ടീകരണ പ്രവണത ഉണ്ടായിരുന്നിരിക്കാൻ സാധ്യതയുണ്ട്. എന്നിരുന്നാലും, അതേ പരീക്ഷണ സാഹചര്യങ്ങളിൽ പോലും, പ്രാരംഭ പൂളിലെ ഓരോ പ്രത്യേക ക്ലോണിന്റെയും എണ്ണം കുറവായതിനാൽ തിരഞ്ഞെടുപ്പ് ഫലങ്ങൾ വ്യത്യാസപ്പെടാം.
CSF-ൽ സമ്പുഷ്ടമാക്കിയ മോട്ടിഫുകൾ രക്തത്തിലുള്ളവയിൽ നിന്ന് വ്യത്യസ്തമാണ്. രസകരമെന്നു പറയട്ടെ, വ്യക്തിഗത മൃഗങ്ങളുടെ രക്തത്തിൽ ഗ്ലൈസിൻ സമ്പുഷ്ടമായ പെപ്റ്റൈഡുകളിലേക്കുള്ള ആദ്യ മാറ്റം ഞങ്ങൾ ശ്രദ്ധിച്ചു. (ചിത്രം 1g, അനുബന്ധ ചിത്രം 4e, 4f). ഗ്ലൈസിൻ പെപ്റ്റൈഡുകൾ അടങ്ങിയ ഫേജ് കൂടുതൽ സ്ഥിരതയുള്ളതും രക്തചംക്രമണത്തിൽ നിന്ന് നീക്കം ചെയ്യാനുള്ള സാധ്യത കുറവുമാണ്. എന്നിരുന്നാലും, ഈ ഗ്ലൈസിൻ സമ്പുഷ്ടമായ പെപ്റ്റൈഡുകൾ സെറിബ്രോസ്പൈനൽ ദ്രാവക സാമ്പിളുകളിൽ കണ്ടെത്തിയില്ല, ഇത് സൂചിപ്പിക്കുന്നത് ക്യൂറേറ്റഡ് ലൈബ്രറികൾ രണ്ട് വ്യത്യസ്ത തിരഞ്ഞെടുപ്പ് ഘട്ടങ്ങളിലൂടെ കടന്നുപോയി എന്നാണ്: ഒന്ന് രക്തത്തിലും മറ്റൊന്ന് സെറിബ്രോസ്പൈനൽ ദ്രാവകത്തിൽ അടിഞ്ഞുകൂടാൻ അനുവദിച്ചു. നാലാമത്തെ റൗണ്ട് തിരഞ്ഞെടുപ്പിന്റെ ഫലമായുണ്ടായ CSF-സമ്പുഷ്ടമാക്കിയ ക്ലോണുകൾ വിപുലമായി പരീക്ഷിച്ചു. വ്യക്തിഗതമായി പരിശോധിച്ച മിക്കവാറും എല്ലാ ക്ലോണുകളും ശൂന്യമായ നിയന്ത്രണ ഫേജുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ CSF-ൽ സമ്പുഷ്ടമാണെന്ന് സ്ഥിരീകരിച്ചു. ഒരു പെപ്റ്റൈഡ് ഹിറ്റ് (#2077) കൂടുതൽ വിശദമായി പരിശോധിച്ചു. മറ്റ് ഹിറ്റുകളെ അപേക്ഷിച്ച് ഇത് കൂടുതൽ പ്ലാസ്മ അർദ്ധായുസ്സ് കാണിച്ചു (ചിത്രം 3d ഉം സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം 7 ഉം), രസകരമെന്നു പറയട്ടെ, ഈ പെപ്റ്റൈഡിൽ സി-ടെർമിനസിൽ ഒരു സിസ്റ്റൈൻ അവശിഷ്ടം അടങ്ങിയിരിക്കുന്നു. ആൽബുമിൻ 29 മായി ബന്ധിപ്പിക്കുന്നതിലൂടെ പെപ്റ്റൈഡുകളിൽ സിസ്റ്റൈൻ ചേർക്കുന്നത് അവയുടെ ഫാർമക്കോകൈനറ്റിക് ഗുണങ്ങൾ മെച്ചപ്പെടുത്തുമെന്ന് അടുത്തിടെ തെളിയിക്കപ്പെട്ടിട്ടുണ്ട്. പെപ്റ്റൈഡ് #2077 ന് നിലവിൽ ഇത് അജ്ഞാതമാണ്, കൂടുതൽ പഠനം ആവശ്യമാണ്. ചില പെപ്റ്റൈഡുകൾ CSF സമ്പുഷ്ടീകരണത്തിൽ ഒരു വാലൻസ്-ആശ്രിതത്വം കാണിച്ചു (ഡാറ്റ കാണിച്ചിട്ടില്ല), ഇത് T7 കാപ്സിഡിന്റെ പ്രദർശിപ്പിച്ച ഉപരിതല ജ്യാമിതിയുമായി ബന്ധപ്പെട്ടിരിക്കാം. ഞങ്ങൾ ഉപയോഗിച്ച T7 സിസ്റ്റം ഓരോ ഫേജ് കണികയ്ക്കും ഓരോ പെപ്റ്റൈഡിന്റെയും 5-15 പകർപ്പുകൾ കാണിച്ചു. എലികളുടെ സെറിബ്രൽ കോർട്ടെക്സിലേക്ക് ഇൻട്രാവെൻസായി കുത്തിവച്ച കാൻഡിഡേറ്റ് ലെഡ് ഫേജ് ക്ലോണുകളിൽ IHC നടത്തി (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം 8). കുറഞ്ഞത് മൂന്ന് ക്ലോണുകളെങ്കിലും (നമ്പർ 2002, നമ്പർ 2009, നമ്പർ 2077) BBB യുമായി സംവദിച്ചതായി ഡാറ്റ കാണിച്ചു. ഈ BBB പ്രതിപ്രവർത്തനം CSF ന്റെ ശേഖരണത്തിൽ കലാശിക്കുന്നുണ്ടോ അതോ BCSFB യിലേക്ക് ഈ ക്ലോണുകൾ നേരിട്ട് നീങ്ങുന്നതിലേക്ക് നയിക്കുന്നുണ്ടോ എന്ന് നിർണ്ണയിക്കേണ്ടതുണ്ട്. പ്രധാനമായും, തിരഞ്ഞെടുത്ത പെപ്റ്റൈഡുകൾ സംശ്ലേഷണം ചെയ്ത് പ്രോട്ടീൻ കാർഗോയുമായി ബന്ധിപ്പിച്ചിരിക്കുമ്പോൾ അവയുടെ CSF ഗതാഗത ശേഷി നിലനിർത്തുന്നുവെന്ന് ഞങ്ങൾ കാണിക്കുന്നു. N-ടെർമിനൽ ബയോട്ടിനൈലേറ്റഡ് പെപ്റ്റൈഡുകളെ SA യുമായി ബന്ധിപ്പിക്കുന്നത് രക്തത്തിലെയും സെറിബ്രോസ്പൈനൽ ദ്രാവകത്തിലെയും അവയുടെ ഫേജ് ക്ലോണുകളുമായി ലഭിച്ച ഫലങ്ങൾ ആവർത്തിക്കുന്നു (ചിത്രം 3e). അവസാനമായി, SA യുമായി സംയോജിപ്പിച്ച BACE1 ന്റെ ബയോട്ടിനൈലേറ്റഡ് പെപ്റ്റൈഡ് ഇൻഹിബിറ്ററിന്റെ മസ്തിഷ്ക പ്രവർത്തനത്തെ പ്രോത്സാഹിപ്പിക്കാൻ ലെഡ് പെപ്റ്റൈഡ് #2077 ന് കഴിയുമെന്ന് ഞങ്ങൾ കാണിക്കുന്നു, ഇത് CSF ലെ Abeta40 ലെവലുകൾ ഗണ്യമായി കുറയ്ക്കുന്നതിലൂടെ CNS ൽ വ്യക്തമായ ഫാർമകോഡൈനാമിക് ഇഫക്റ്റുകൾ ഉണ്ടാക്കുന്നു (ചിത്രം 4). എല്ലാ ഹിറ്റുകളുടെയും പെപ്റ്റൈഡ് സീക്വൻസ് ഹോമോളജി തിരയൽ നടത്തി ഡാറ്റാബേസിലെ ഏതെങ്കിലും ഹോമോലോഗുകളെ തിരിച്ചറിയാൻ ഞങ്ങൾക്ക് കഴിഞ്ഞില്ല. T7 ലൈബ്രറിയുടെ വലിപ്പം ഏകദേശം 109 ആണെന്നും, 12-mers-ന്റെ സൈദ്ധാന്തിക ലൈബ്രറി വലുപ്പം 4 x 1015 ആണെന്നും ശ്രദ്ധിക്കേണ്ടത് പ്രധാനമാണ്. അതിനാൽ, 12-mer പെപ്റ്റൈഡ് ലൈബ്രറിയുടെ വൈവിധ്യ സ്ഥലത്തിന്റെ ഒരു ചെറിയ ഭാഗം മാത്രമേ ഞങ്ങൾ തിരഞ്ഞെടുത്തിട്ടുള്ളൂ, അതായത് ഈ തിരിച്ചറിഞ്ഞ ഹിറ്റുകളുടെ തൊട്ടടുത്തുള്ള സീക്വൻസ് സ്പേസ് വിലയിരുത്തുന്നതിലൂടെ കൂടുതൽ ഒപ്റ്റിമൈസ് ചെയ്ത പെപ്റ്റൈഡുകൾ തിരിച്ചറിയാൻ കഴിയും. സാങ്കൽപ്പികമായി, ഈ പെപ്റ്റൈഡുകളുടെ സ്വാഭാവിക ഹോമോലോഗുകൾ നമുക്ക് കണ്ടെത്താൻ കഴിയാത്തതിന്റെ ഒരു കാരണം പരിണാമ സമയത്ത് ചില പെപ്റ്റൈഡ് മോട്ടിഫുകൾ തലച്ചോറിലേക്ക് അനിയന്ത്രിതമായി പ്രവേശിക്കുന്നത് തടയുന്നതിന് തിരഞ്ഞെടുക്കൽ മാറ്റുക എന്നതായിരിക്കാം.
ഒരുമിച്ച് എടുത്താൽ, സെറിബ്രോവാസ്കുലർ ബാരിയറിന്റെ ഗതാഗത സംവിധാനങ്ങളെ ഇൻ വിവോയിൽ കൂടുതൽ വിശദമായി തിരിച്ചറിയുന്നതിനും ചിത്രീകരിക്കുന്നതിനുമുള്ള ഭാവി പ്രവർത്തനങ്ങൾക്ക് ഞങ്ങളുടെ ഫലങ്ങൾ ഒരു അടിസ്ഥാനം നൽകുന്നു. സെറിബ്രൽ വാസ്കുലർ ബൈൻഡിംഗ് ഗുണങ്ങളുള്ള ക്ലോണുകളെ തിരിച്ചറിയുക മാത്രമല്ല, വിജയകരമായ ക്ലോണുകൾക്ക് ഇൻ വിവോയിൽ ജൈവ തടസ്സങ്ങൾ മറികടക്കാൻ ആന്തരിക പ്രവർത്തനം ഉള്ള ഒരു നിർണായക ഘട്ടവും ഉൾപ്പെടുന്ന ഒരു ഫങ്ഷണൽ സെലക്ഷൻ തന്ത്രത്തെ അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ളതാണ് ഈ രീതിയുടെ അടിസ്ഥാന സജ്ജീകരണം. ഈ പെപ്റ്റൈഡുകളുടെ ഗതാഗത സംവിധാനവും തലച്ചോറിന്റെ പ്രത്യേക മൈക്രോവാസ്കുലേച്ചറുമായി ബന്ധിപ്പിക്കുന്നതിനുള്ള അവയുടെ മുൻഗണനയും വ്യക്തമാക്കുക എന്നതാണ്. ഇത് ബിബിബിയുടെയും റിസപ്റ്ററുകളുടെയും ഗതാഗതത്തിനായി പുതിയ പാതകൾ കണ്ടെത്തുന്നതിലേക്ക് നയിച്ചേക്കാം. തിരിച്ചറിഞ്ഞ പെപ്റ്റൈഡുകൾക്ക് സെറിബ്രോവാസ്കുലർ റിസപ്റ്ററുകളുമായോ ബിബിബി അല്ലെങ്കിൽ ബിസിഎസ്എഫ്ബി വഴി കൊണ്ടുപോകുന്ന രക്തചംക്രമണ ലിഗാൻഡുകളുമായോ നേരിട്ട് ബന്ധിപ്പിക്കാൻ കഴിയുമെന്ന് ഞങ്ങൾ പ്രതീക്ഷിക്കുന്നു. ഈ കൃതിയിൽ കണ്ടെത്തിയ സിഎസ്എഫ് ഗതാഗത പ്രവർത്തനമുള്ള പെപ്റ്റൈഡ് വെക്റ്ററുകൾ കൂടുതൽ അന്വേഷിക്കും. ബിബിബിയും/അല്ലെങ്കിൽ ബിസിഎസ്എഫ്ബിയും കടക്കാനുള്ള കഴിവിനായി ഈ പെപ്റ്റൈഡുകളുടെ തലച്ചോറിന്റെ പ്രത്യേകത ഞങ്ങൾ നിലവിൽ അന്വേഷിക്കുകയാണ്. പുതിയ റിസപ്റ്ററുകളുടെയോ പാതകളുടെയോ സാധ്യതകൾ കണ്ടെത്തുന്നതിനും ബയോളജിക്സ് പോലുള്ള മാക്രോമോളിക്യൂളുകളെ തലച്ചോറിലേക്ക് എത്തിക്കുന്നതിനുള്ള പുതിയ ഉയർന്ന കാര്യക്ഷമമായ പ്ലാറ്റ്‌ഫോമുകൾ വികസിപ്പിക്കുന്നതിനും ഈ പുതിയ പെപ്റ്റൈഡുകൾ വളരെ വിലപ്പെട്ട ഉപകരണങ്ങളായിരിക്കും.
മുമ്പ് വിവരിച്ച രീതിയുടെ ഒരു പരിഷ്ക്കരണം ഉപയോഗിച്ച് വലിയ സിസ്റ്റേർണ (CM) കാനുലേറ്റ് ചെയ്യുക. അനസ്തേഷ്യ നൽകിയ വിസ്റ്റാർ എലികളെ (200-350 ഗ്രാം) ഒരു സ്റ്റീരിയോടാക്സിക് ഉപകരണത്തിൽ ഘടിപ്പിക്കുകയും ഷേവ് ചെയ്തതും അസെപ്റ്റിക്കലായി തയ്യാറാക്കിയതുമായ തലയോട്ടിയിൽ തലയോട്ടി വെളിപ്പെടുത്തുന്നതിന് ഒരു മീഡിയൻ മുറിവ് ഉണ്ടാക്കുകയും ചെയ്തു. മുകളിലെ സാഷിന്റെ ഭാഗത്ത് രണ്ട് ദ്വാരങ്ങൾ തുരന്ന് ദ്വാരങ്ങളിലെ ഫിക്സിംഗ് സ്ക്രൂകൾ ഉറപ്പിക്കുക. CM-ലേക്ക് ഒരു സ്റ്റെയിൻലെസ് സ്റ്റീൽ കാനുലയുടെ സ്റ്റീരിയോടാക്റ്റിക് ഗൈഡൻസിനായി ലാറ്ററൽ ആൻസിപിറ്റൽ ക്രെസ്റ്റിൽ ഒരു അധിക ദ്വാരം തുരന്നു. കാനുലയ്ക്ക് ചുറ്റും ഡെന്റൽ സിമന്റ് പുരട്ടി സ്ക്രൂകൾ ഉപയോഗിച്ച് ഉറപ്പിക്കുക. ഫോട്ടോ-ക്യൂറിംഗിനും സിമന്റ് കാഠിന്യത്തിനും ശേഷം, ചർമ്മത്തിലെ മുറിവ് 4/0 സുപ്രമിഡ് സ്യൂച്ചർ ഉപയോഗിച്ച് അടച്ചു. സെറിബ്രോസ്പൈനൽ ദ്രാവകത്തിന്റെ (CSF) സ്വയമേവയുള്ള ചോർച്ചയിലൂടെ കാനുലയുടെ ശരിയായ സ്ഥാനം സ്ഥിരീകരിക്കുന്നു. സ്റ്റീരിയോടാക്സിക് ഉപകരണത്തിൽ നിന്ന് എലിയെ നീക്കം ചെയ്യുക, ഉചിതമായ ശസ്ത്രക്രിയാനന്തര പരിചരണവും വേദന മാനേജ്മെന്റും സ്വീകരിക്കുക, സെറിബ്രോസ്പൈനൽ ദ്രാവകത്തിൽ രക്തത്തിന്റെ ലക്ഷണങ്ങൾ കാണുന്നതുവരെ കുറഞ്ഞത് ഒരു ആഴ്ചയെങ്കിലും അത് സുഖം പ്രാപിക്കാൻ അനുവദിക്കുക. വിസ്റ്റാർ എലികളെ (Crl:WI/Han) ചാൾസ് നദിയിൽ (ഫ്രാൻസ്) നിന്നാണ് എടുത്തത്. എല്ലാ എലികളെയും പ്രത്യേക രോഗകാരികളില്ലാത്ത അവസ്ഥയിലാണ് സൂക്ഷിച്ചിരുന്നത്. എല്ലാ മൃഗ പരീക്ഷണങ്ങളും സ്വിറ്റ്സർലൻഡിലെ ബാസൽ നഗരത്തിലെ വെറ്ററിനറി ഓഫീസ് അംഗീകരിച്ചു, കൂടാതെ മൃഗ ലൈസൻസ് നമ്പർ 2474 (എലിയുടെ സെറിബ്രോസ്പൈനൽ ഫ്ലൂയിഡിലും തലച്ചോറിലും തെറാപ്പിറ്റിക് കാൻഡിഡേറ്റുകളുടെ ലെവലുകൾ അളക്കുന്നതിലൂടെ സജീവ മസ്തിഷ്ക ഗതാഗതത്തിന്റെ വിലയിരുത്തൽ) അനുസരിച്ചാണ് നടത്തിയത്.
സിഎം കാനുല കയ്യിൽ പിടിച്ചുകൊണ്ട് എലിയെ സൌമ്യമായി ബോധവതിയാക്കി നിർത്തുക. കാനുലയിൽ നിന്ന് ഡാറ്റുറ നീക്കം ചെയ്ത് 10 µl സ്വയമേവ ഒഴുകുന്ന സെറിബ്രോസ്പൈനൽ ദ്രാവകം ശേഖരിക്കുക. കാനുലയുടെ പേറ്റൻസി ഒടുവിൽ തകരാറിലായതിനാൽ, രക്തത്തിലെ മാലിന്യത്തിന്റെയോ നിറവ്യത്യാസത്തിന്റെയോ തെളിവുകളില്ലാത്ത വ്യക്തമായ സെറിബ്രോസ്പൈനൽ ദ്രാവക സാമ്പിളുകൾ മാത്രമേ ഈ പഠനത്തിൽ ഉൾപ്പെടുത്തിയിട്ടുള്ളൂ. സമാന്തരമായി, വാലിന്റെ അഗ്രഭാഗത്തുള്ള ഒരു ചെറിയ മുറിവിൽ നിന്ന് ഏകദേശം 10-20 μl രക്തം ഹെപ്പാരിൻ (സിഗ്മ-ആൽഡ്രിച്ച്) ഉള്ള ട്യൂബുകളിലേക്ക് എടുത്തു. T7 ഫേജ് ഇൻട്രാവണസ് കുത്തിവച്ച ശേഷം വിവിധ സമയ പോയിന്റുകളിൽ CSF ഉം രക്തവും ശേഖരിച്ചു. ഓരോ CSF സാമ്പിളും ശേഖരിക്കുന്നതിന് മുമ്പ് ഏകദേശം 5-10 μl ദ്രാവകം ഉപേക്ഷിച്ചു, ഇത് കത്തീറ്ററിന്റെ നിർജ്ജീവമായ അളവിന് തുല്യമാണ്.
T7Select സിസ്റ്റം മാനുവലിൽ (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996) വിവരിച്ചിരിക്കുന്നതുപോലെ T7Select 10-3b വെക്റ്റർ ഉപയോഗിച്ചാണ് ലൈബ്രറികൾ സൃഷ്ടിച്ചത്. ചുരുക്കത്തിൽ, ഒരു റാൻഡം 12-mer DNA ഇൻസേർട്ട് ഇനിപ്പറയുന്ന ഫോർമാറ്റിൽ സമന്വയിപ്പിച്ചു:
ഇൻസേർട്ടിൽ ഇരട്ട സ്റ്റോപ്പ് കോഡണുകളും അമിനോ ആസിഡ് അമിതപ്രയോഗവും ഒഴിവാക്കാൻ NNK കോഡൺ ഉപയോഗിച്ചു. ഓരോ ന്യൂക്ലിയോടൈഡിന്റെയും മാനുവൽ മിക്സഡ് ഇക്വുമോളാർ അനുപാതമാണ് N, കൂടാതെ അഡിനൈൻ, സൈറ്റോസിൻ ന്യൂക്ലിയോടൈഡുകളുടെ മാനുവൽ മിക്സഡ് ഇക്വാമോളാർ അനുപാതമാണ് K. ക്ലെനോ ബഫറിൽ (ന്യൂ ഇംഗ്ലണ്ട് ബയോലാബ്സ്) 3 മണിക്കൂർ 37°C താപനിലയിൽ dNTP (നോവാജെൻ), ക്ലെനോ എൻസൈം (ന്യൂ ഇംഗ്ലണ്ട് ബയോലാബ്സ്) എന്നിവ ഉപയോഗിച്ച് കൂടുതൽ ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്തുകൊണ്ട് സിംഗിൾ സ്ട്രാൻഡഡ് പ്രദേശങ്ങളെ ഡബിൾ സ്ട്രാൻഡഡ് ഡിഎൻഎയിലേക്ക് പരിവർത്തനം ചെയ്തു. പ്രതിപ്രവർത്തനത്തിനുശേഷം, EtOH അവശിഷ്ടം വഴി ഡബിൾ സ്ട്രാൻഡഡ് ഡിഎൻഎ വീണ്ടെടുക്കപ്പെട്ടു. തത്ഫലമായുണ്ടാകുന്ന ഡിഎൻഎയെ നിയന്ത്രണ എൻസൈമുകളായ EcoRI, HindIII (രണ്ടും റോച്ചെയിൽ നിന്ന്) ഉപയോഗിച്ച് ദഹിപ്പിച്ചു. പിളർന്നതും ശുദ്ധീകരിച്ചതുമായ (QIAquick, Qiagen) ഇൻസേർട്ട് (T4 ligase, New England Biolabs) 10B കാപ്സിഡ് ജീനിന്റെ അമിനോ ആസിഡ് 348 ന് ശേഷം ഒരു പ്രീ-ക്ലീവ്ഡ് T7 വെക്റ്ററിലേക്ക് ഇൻ-ഫ്രെയിമിൽ ലിഗേറ്റ് ചെയ്തു. ഇൻ വിട്രോ പാക്കേജിംഗിന് മുമ്പ് 18 മണിക്കൂർ 16° C താപനിലയിൽ ലിഗേഷൻ പ്രതികരണങ്ങൾ ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്തു. T7Select 10-3b ക്ലോണിംഗ് കിറ്റിൽ (നോവാജെൻ) നൽകിയിരിക്കുന്ന നിർദ്ദേശങ്ങൾക്കനുസൃതമായി ഫേജ് പാക്കേജിംഗ് ഇൻ വിട്രോയിൽ നടത്തി, പാക്കേജിംഗ് ലായനിയെ എസ്ഷെറിച്ചിയ കോളി (BLT5615, നോവാജെൻ) ഉപയോഗിച്ച് ലൈസിസിലേക്ക് ഒരിക്കൽ ആംപ്ലിഫൈ ചെയ്തു. ലൈസേറ്റുകളെ സെൻട്രിഫ്യൂജ് ചെയ്ത്, ടൈറ്ററേറ്റ് ചെയ്ത്, -80° C താപനിലയിൽ ഗ്ലിസറോളിന്റെ സ്റ്റോക്ക് ലായനിയായി ഫ്രീസ് ചെയ്തു.
പ്രൊപ്രൈറ്ററി 454/റോഷ്-ആംപ്ലിക്കോൺ ഫ്യൂഷൻ പ്രൈമറുകൾ ഉപയോഗിച്ച് ബ്രൂത്തിലോ പ്ലേറ്റിലോ ആംപ്ലിഫൈ ചെയ്ത ഫേജ് വേരിയബിൾ മേഖലകളുടെ നേരിട്ടുള്ള പിസിആർ ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ. ഫോർവേഡ് ഫ്യൂഷൻ പ്രൈമറിൽ വേരിയബിൾ മേഖല (NNK) 12 (ടെംപ്ലേറ്റ്-നിർദ്ദിഷ്ട), GS FLX ടൈറ്റാനിയം അഡാപ്റ്റർ A, ഒരു ഫോർ-ബേസ് ലൈബ്രറി കീ സീക്വൻസ് (TCAG) എന്നിവ ഉൾക്കൊള്ളുന്ന സീക്വൻസുകൾ അടങ്ങിയിരിക്കുന്നു (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം 1a):
റിവേഴ്സ് ഫ്യൂഷൻ പ്രൈമറിൽ ബീഡുകൾ പിടിച്ചെടുക്കുന്നതിനായി ഘടിപ്പിച്ചിരിക്കുന്ന ബയോട്ടിനും എമൽഷൻ പിസിആർ സമയത്ത് ക്ലോണൽ ആംപ്ലിഫിക്കേഷന് ആവശ്യമായ ജിഎസ് എഫ്എൽഎക്സ് ടൈറ്റാനിയം അഡാപ്റ്റർ ബിയും അടങ്ങിയിരിക്കുന്നു:
തുടർന്ന് 454 GS-FLX ടൈറ്റാനിയം പ്രോട്ടോക്കോൾ അനുസരിച്ച് ആംപ്ലിക്കോണുകൾ 454/റോച്ചെ പൈറോസീക്വൻസിങ്ങിന് വിധേയമാക്കി. മാനുവൽ സാംഗർ സീക്വൻസിങ്ങിനായി (അപ്ലൈഡ് ബയോസിസ്റ്റംസ് ഹിറ്റാച്ചി 3730 xl DNA അനലൈസർ), T7 ഫേജ് DNA പിസിആർ ഉപയോഗിച്ച് ആംപ്ലിഫൈ ചെയ്യുകയും ഇനിപ്പറയുന്ന പ്രൈമർ ജോഡികൾ ഉപയോഗിച്ച് ക്രമപ്പെടുത്തുകയും ചെയ്തു:
റോച്ചെ ഫാസ്റ്റ് സ്റ്റാർട്ട് ഡിഎൻഎ പോളിമറേസ് കിറ്റ് ഉപയോഗിച്ച് (നിർമ്മാതാവിന്റെ നിർദ്ദേശങ്ങൾ അനുസരിച്ച്) വ്യക്തിഗത പ്ലാക്കുകളിൽ നിന്നുള്ള ഇൻസേർട്ടുകൾ പിസിആർ ആംപ്ലിഫിക്കേഷന് വിധേയമാക്കി. ഒരു ഹോട്ട് സ്റ്റാർട്ട് (95 °C-ൽ 10 മിനിറ്റ്), 35 ബൂസ്റ്റ് സൈക്കിളുകൾ (95 °C-ൽ 50 സെക്കൻഡ്, 50 °C-ൽ 1 മിനിറ്റ്, 72 °C-ൽ 1 മിനിറ്റ്) എന്നിവ നടത്തുക.
ലൈബ്രറികളിൽ നിന്നുള്ള ഫേജ്, വൈൽഡ്-ടൈപ്പ് ഫേജ്, CSF, രക്തം എന്നിവയിൽ നിന്ന് രക്ഷപ്പെടുത്തിയ ഫേജ്, അല്ലെങ്കിൽ വ്യക്തിഗത ക്ലോണുകൾ എന്നിവയെ Escherichia coli BL5615-ൽ TB ബ്രൂത്തിൽ (സിഗ്മ ആൽഡ്രിച്ച്) അല്ലെങ്കിൽ 500 cm2 ഡിഷുകളിൽ (തെർമോ സയന്റിഫിക്) 37°C-ൽ 4 മണിക്കൂർ നേരം ആംപ്ലിഫൈ ചെയ്തു. ട്രിസ്-ഇഡിടിഎ ബഫർ (ഫ്ലൂക്ക അനലിറ്റിക്കൽ) ഉപയോഗിച്ച് പ്ലേറ്റുകൾ കഴുകിയോ അണുവിമുക്തമായ പൈപ്പറ്റ് ടിപ്പുകൾ ഉപയോഗിച്ച് പ്ലാക്കുകൾ ശേഖരിച്ചോ പ്ലേറ്റുകളിൽ നിന്ന് ഫേജ് വേർതിരിച്ചെടുത്തു. പോളിയെത്തിലീൻ ഗ്ലൈക്കോൾ (PEG 8000) പ്രിസിപിറ്റേഷൻ (പ്രോമെഗ) ഒരു റൗണ്ട് ഉപയോഗിച്ച് കൾച്ചർ സൂപ്പർനേറ്റന്റിൽ നിന്നോ എക്സ്ട്രാക്ഷൻ ബഫറിൽ നിന്നോ ഫേജിനെ വേർതിരിച്ചെടുത്തു, ട്രിസ്-ഇഡിടിഎ ബഫറിൽ വീണ്ടും സസ്പെൻഡ് ചെയ്തു.
ഇൻട്രാവണസ് (IV) കുത്തിവയ്പ്പിന് (500 μl/മൃഗം) മുമ്പ്, എൻഡോടോക്സിൻ റിമൂവൽ ബീഡുകൾ (മിൽറ്റെനി ബയോടെക്) ഉപയോഗിച്ച് ആംപ്ലിഫൈഡ് ഫേജിനെ 2-3 റൗണ്ട് എൻഡോടോക്സിൻ റിമൂവൽ പരിശോധനയ്ക്ക് വിധേയമാക്കി. ആദ്യ റൗണ്ടിൽ, 2×1012 ഫേജുകൾ അവതരിപ്പിച്ചു; രണ്ടാമത്തേതിൽ, 2×1010 ഫേജുകൾ; മൂന്നാമത്തെയും നാലാമത്തെയും സെലക്ഷൻ റൗണ്ടുകളിൽ, ഒരു മൃഗത്തിന് 2×109 ഫേജുകൾ. CSF-ലെയും സൂചിപ്പിച്ച സമയ പോയിന്റുകളിൽ ശേഖരിച്ച രക്ത സാമ്പിളുകളിലെയും ഫേജിന്റെ ഉള്ളടക്കം നിർമ്മാതാവിന്റെ നിർദ്ദേശങ്ങൾക്കനുസൃതമായി പ്ലാക്ക് എണ്ണുന്നതിലൂടെ നിർണ്ണയിക്കപ്പെട്ടു (T7Select സിസ്റ്റം മാനുവൽ). ശുദ്ധീകരിച്ച ലൈബ്രറികൾ വാൽ സിരയിലേക്ക് ഇൻട്രാവണസ് കുത്തിവച്ചോ അല്ലെങ്കിൽ മുൻ സെലക്ഷൻ റൗണ്ടിൽ നിന്ന് CSF-ൽ നിന്ന് വേർതിരിച്ചെടുത്ത ഫേജ് വീണ്ടും കുത്തിവച്ചോ ഫേജ് തിരഞ്ഞെടുപ്പ് നടത്തി, തുടർന്നുള്ള വിളവെടുപ്പുകൾ യഥാക്രമം 10 മിനിറ്റ്, 30 മിനിറ്റ്, 60 മിനിറ്റ്, 90 മിനിറ്റ്, 120 മിനിറ്റ്, 180 മിനിറ്റ്, 240 മിനിറ്റ് എന്നിങ്ങനെ CSF, രക്ത സാമ്പിളുകൾ എന്നിവയിൽ നടത്തി. ആകെ നാല് റൗണ്ട് ഇൻ വിവോ പാനിംഗ് നടത്തി, അതിൽ തിരഞ്ഞെടുത്ത രണ്ട് ശാഖകളും വെവ്വേറെ സംഭരിക്കുകയും ആദ്യ മൂന്ന് റൗണ്ട് സെലക്ഷനിൽ വിശകലനം ചെയ്യുകയും ചെയ്തു. ആദ്യ രണ്ട് റൗണ്ട് സെലക്ഷനിൽ നിന്ന് CSF-ൽ നിന്ന് വേർതിരിച്ചെടുത്ത എല്ലാ ഫേജ് ഇൻസേർട്ടുകളും 454/റോച്ചെ പൈറോസീക്വൻസിംഗിനു വിധേയമാക്കി, അതേസമയം അവസാന രണ്ട് റൗണ്ട് സെലക്ഷനിൽ നിന്ന് CSF-ൽ നിന്ന് വേർതിരിച്ചെടുത്ത എല്ലാ ക്ലോണുകളും സ്വമേധയാ ക്രമീകരിച്ചു. ആദ്യ റൗണ്ട് സെലക്ഷനിൽ നിന്നുള്ള എല്ലാ രക്ത ഫേജുകളും 454/റോച്ചെ പൈറോസീക്വൻസിംഗിനും വിധേയമാക്കി. ഫേജ് ക്ലോണുകളുടെ കുത്തിവയ്പ്പിനായി, തിരഞ്ഞെടുത്ത ഫേജുകൾ E. coli (BL5615)-ൽ 500 cm2 പ്ലേറ്റുകളിൽ 37°C-ൽ 4 മണിക്കൂർ നേരത്തേക്ക് ആംപ്ലിഫൈ ചെയ്തു. വ്യക്തിഗതമായി തിരഞ്ഞെടുത്തതും സ്വമേധയാ ക്രമീകരിച്ചതുമായ ക്ലോണുകൾ TB മീഡിയത്തിൽ പ്രചരിപ്പിച്ചു. ഫേജ് എക്സ്ട്രാക്ഷൻ, എൻഡോടോക്സിൻ ശുദ്ധീകരണം, നീക്കം ചെയ്യൽ (മുകളിൽ വിവരിച്ചതുപോലെ) എന്നിവയ്ക്ക് ശേഷം, 300 μl-ൽ 2×1010 ഫേജുകൾ/മൃഗം ഒരു വാൽ സിരയിലേക്ക് ഇൻട്രാവെൻസായി കുത്തിവച്ചു.
സീക്വൻസ് ഡാറ്റയുടെ പ്രീപ്രോസസ്സിംഗും ഗുണപരമായ ഫിൽട്ടറിംഗും. വെണ്ടർ സോഫ്റ്റ്‌വെയർ ഉപയോഗിച്ച് റോ 454/റോച്ചെ ഡാറ്റ ഒരു ബൈനറി സ്റ്റാൻഡേർഡ് സ്ട്രീം മാപ്പ് ഫോർമാറ്റിൽ (sff) നിന്ന് പിയേഴ്സൺ ഹ്യൂമൻ റീഡബിൾ ഫോർമാറ്റിലേക്ക് (fasta) പരിവർത്തനം ചെയ്തു. താഴെ വിവരിച്ചിരിക്കുന്നതുപോലെ പ്രൊപ്രൈറ്ററി സി പ്രോഗ്രാമുകളും സ്ക്രിപ്റ്റുകളും (റിലീസ് ചെയ്യാത്ത സോഫ്റ്റ്‌വെയർ പാക്കേജ്) ഉപയോഗിച്ചാണ് ന്യൂക്ലിയോടൈഡ് സീക്വൻസിന്റെ കൂടുതൽ പ്രോസസ്സിംഗ് നടത്തിയത്. പ്രാഥമിക ഡാറ്റയുടെ വിശകലനത്തിൽ കർശനമായ മൾട്ടി-സ്റ്റേജ് ഫിൽട്ടറിംഗ് നടപടിക്രമങ്ങൾ ഉൾപ്പെടുന്നു. സാധുവായ 12mer ഇൻസേർട്ട് DNA സീക്വൻസ് അടങ്ങിയിട്ടില്ലാത്ത റീഡുകൾ ഫിൽട്ടർ ചെയ്യുന്നതിന്, ആഗോള നീഡിൽമാൻ-വുൺഷ് ടെസ്റ്റ് ഉപയോഗിച്ച് സ്റ്റാർട്ട് ലേബൽ (GTGATGTCGGGATCCGAATTC), സ്റ്റോപ്പ് ലേബൽ (TAAGCTTGCGGCCGCACTCAGTA), ബാക്ക്ഗ്രൗണ്ട് ഇൻസേർട്ട് (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGAC) എന്നിവയിലേക്ക് റീഡുകൾ ക്രമാനുഗതമായി വിന്യസിച്ചു. ഓരോ അലൈൻമെന്റിനും 2 വരെ പൊരുത്തക്കേടുകൾ അനുവദിക്കുന്ന വിന്യാസം31. അതിനാൽ, സ്റ്റാർട്ട്, സ്റ്റോപ്പ് ടാഗുകളില്ലാത്ത വായനകളും പശ്ചാത്തല ഇൻസേർട്ടുകൾ അടങ്ങിയ റീഡുകളും, അതായത്, അനുവദനീയമായ പൊരുത്തക്കേടുകളുടെ എണ്ണം കവിയുന്ന അലൈൻമെന്റുകളും ലൈബ്രറിയിൽ നിന്ന് നീക്കം ചെയ്തു. ശേഷിക്കുന്ന റീഡുകളെ സംബന്ധിച്ചിടത്തോളം, സ്റ്റാർട്ട് മാർക്കിൽ നിന്ന് ആരംഭിച്ച് സ്റ്റോപ്പ് മാർക്കിന് മുമ്പ് അവസാനിക്കുന്ന N-mer DNA ശ്രേണി യഥാർത്ഥ റീഡ് സീക്വൻസിൽ നിന്ന് വേർതിരിച്ചെടുത്ത് കൂടുതൽ പ്രോസസ്സ് ചെയ്തു (ഇനി മുതൽ "ഇൻസേർട്ട്" എന്ന് വിളിക്കുന്നു). ഇൻസേർട്ട് വിവർത്തനം ചെയ്തതിനുശേഷം, പ്രൈമറിന്റെ 5′ അറ്റത്തുള്ള ആദ്യ സ്റ്റോപ്പ് കോഡോണിന് ശേഷമുള്ള ഭാഗം ഇൻസേർട്ടിൽ നിന്ന് നീക്കം ചെയ്യുന്നു. കൂടാതെ, പ്രൈമറിന്റെ 3′ അറ്റത്തുള്ള അപൂർണ്ണമായ കോഡോണുകളിലേക്ക് നയിക്കുന്ന ന്യൂക്ലിയോടൈഡുകളും നീക്കം ചെയ്തു. പശ്ചാത്തല സീക്വൻസുകൾ മാത്രം അടങ്ങിയ ഇൻസേർട്ടുകൾ ഒഴിവാക്കാൻ, അമിനോ ആസിഡ് പാറ്റേൺ "PAG" ൽ ആരംഭിക്കുന്ന വിവർത്തനം ചെയ്ത ഇൻസേർട്ടുകളും നീക്കം ചെയ്തു. 3-ൽ താഴെ അമിനോ ആസിഡുകളുടെ പോസ്റ്റ്-ട്രാൻസ്ലേഷൻ നീളമുള്ള പെപ്റ്റൈഡുകൾ ലൈബ്രറിയിൽ നിന്ന് നീക്കം ചെയ്തു. ഒടുവിൽ, ഇൻസേർട്ട് പൂളിലെ ആവർത്തനം നീക്കം ചെയ്യുകയും ഓരോ അദ്വിതീയ ഇൻസേർട്ടിന്റെയും ആവൃത്തി നിർണ്ണയിക്കുകയും ചെയ്യുക. ഈ വിശകലനത്തിന്റെ ഫലങ്ങളിൽ ന്യൂക്ലിയോടൈഡ് സീക്വൻസുകളുടെ (ഇൻസേർട്ടുകൾ) ഒരു പട്ടികയും അവയുടെ (വായിച്ച) ആവൃത്തികളും (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രങ്ങൾ 1c, 2) ഉൾപ്പെടുത്തിയിട്ടുണ്ട്.
ഗ്രൂപ്പ് N-mer DNA ഇൻസേർട്ടുകൾ ക്രമം സാമ്യം അനുസരിച്ച്: 454/Roche-നിർദ്ദിഷ്ട സീക്വൻസിംഗ് പിശകുകൾ (ഹോമോപൊളിമർ എക്സ്റ്റൻഷനുകളുടെ സീക്വൻസിംഗ് പ്രശ്നങ്ങൾ പോലുള്ളവ) ഇല്ലാതാക്കുന്നതിനും പ്രാധാന്യം കുറഞ്ഞ ആവർത്തനങ്ങൾ നീക്കം ചെയ്യുന്നതിനും, മുമ്പ് ഫിൽട്ടർ ചെയ്ത N-mer DNA സീക്വൻസ് ഇൻസേർട്ടുകൾ (ഇൻസേർട്ടുകൾ) സമാനത അനുസരിച്ച് തരംതിരിക്കുന്നു. ഇനിപ്പറയുന്ന രീതിയിൽ നിർവചിച്ചിരിക്കുന്ന ഒരു ആവർത്തന അൽഗോരിതം ഉപയോഗിച്ച് ഇൻസേർട്ടുകൾ (അനുവദനീയമായ 2 പൊരുത്തപ്പെടാത്ത ബേസുകൾ വരെ): ഇൻസേർട്ടുകൾ ആദ്യം അവയുടെ ആവൃത്തി അനുസരിച്ച് (ഏറ്റവും ഉയർന്നത് മുതൽ ഏറ്റവും കുറഞ്ഞത് വരെ) അടുക്കുന്നു, അവ സമാനമാണെങ്കിൽ, അവയുടെ ദ്വിതീയ നീളം അനുസരിച്ച് തരംതിരിക്കുന്നു (ഏറ്റവും ദൈർഘ്യമേറിയത് മുതൽ ഏറ്റവും ചെറുത് വരെ). അങ്ങനെ, ഏറ്റവും ഇടയ്ക്കിടെയുള്ളതും ദൈർഘ്യമേറിയതുമായ ഇൻസേർട്ടുകൾ ആദ്യത്തെ "ഗ്രൂപ്പ്" നിർവചിക്കുന്നു. ഗ്രൂപ്പ് ഫ്രീക്വൻസി കീ ഫ്രീക്വൻസിയിലേക്ക് സജ്ജീകരിച്ചിരിക്കുന്നു. തുടർന്ന്, അടുക്കിയ പട്ടികയിൽ ശേഷിക്കുന്ന ഓരോ ഇൻസേർട്ടും പെയർവൈസ് നീഡിൽമാൻ-വൺഷ് അലൈൻമെന്റ് വഴി ഗ്രൂപ്പിലേക്ക് ചേർക്കാൻ ശ്രമിച്ചു. ഒരു വിന്യാസത്തിലെ പൊരുത്തക്കേടുകൾ, ഇൻസേർട്ടുകൾ അല്ലെങ്കിൽ ഇല്ലാതാക്കലുകൾ എന്നിവയുടെ എണ്ണം 2 ന്റെ പരിധി കവിയുന്നില്ലെങ്കിൽ, ഗ്രൂപ്പിലേക്ക് ഒരു ഇൻസേർഷൻ ചേർക്കുന്നു, കൂടാതെ എത്ര തവണ ഇൻസേർഷൻ ചേർത്തു എന്നതിലൂടെ മൊത്തത്തിലുള്ള ഗ്രൂപ്പ് ഫ്രീക്വൻസി വർദ്ധിപ്പിക്കുന്നു. ഒരു ഗ്രൂപ്പിലേക്ക് ചേർത്ത ഇൻസേർട്ടുകളെ ഉപയോഗിച്ചതായി അടയാളപ്പെടുത്തുകയും കൂടുതൽ പ്രോസസ്സിംഗിൽ നിന്ന് ഒഴിവാക്കുകയും ചെയ്യുന്നു. നിലവിലുള്ള ഒരു ഗ്രൂപ്പിലേക്ക് ഇൻസേർട്ട് സീക്വൻസ് ചേർക്കാൻ കഴിയുന്നില്ലെങ്കിൽ, ഉചിതമായ ഇൻസേർട്ട് ഫ്രീക്വൻസി ഉള്ള ഒരു പുതിയ ഗ്രൂപ്പ് സൃഷ്ടിക്കാൻ ഇൻസേർട്ട് സീക്വൻസ് ഉപയോഗിക്കുന്നു, കൂടാതെ ഉപയോഗിച്ചതായി അടയാളപ്പെടുത്തുന്നു. ഓരോ ഇൻസേർട്ട് സീക്വൻസും ഒരു പുതിയ ഗ്രൂപ്പ് രൂപീകരിക്കാൻ ഉപയോഗിച്ചു കഴിയുമ്പോഴോ അല്ലെങ്കിൽ നിലവിലുള്ള ഒരു ഗ്രൂപ്പിൽ ഉൾപ്പെടുത്താൻ കഴിയുമ്പോഴോ ആവർത്തനം അവസാനിക്കുന്നു. എല്ലാത്തിനുമുപരി, ന്യൂക്ലിയോടൈഡുകൾ അടങ്ങിയ ഗ്രൂപ്പുചെയ്‌ത ഇൻസേർട്ടുകൾ ഒടുവിൽ പെപ്റ്റൈഡ് സീക്വൻസുകളിലേക്ക് (പെപ്റ്റൈഡ് ലൈബ്രറികൾ) വിവർത്തനം ചെയ്യപ്പെടുന്നു. ഈ വിശകലനത്തിന്റെ ഫലം തുടർച്ചയായ റീഡുകളുടെ എണ്ണം സൃഷ്ടിക്കുന്ന ഒരു കൂട്ടം ഇൻസേർട്ടുകളും അവയുടെ അനുബന്ധ ഫ്രീക്വൻസികളുമാണ് (അനുബന്ധ ചിത്രം 2).
മോട്ടിഫ് ജനറേഷൻ: അദ്വിതീയ പെപ്റ്റൈഡുകളുടെ പട്ടികയെ അടിസ്ഥാനമാക്കി, താഴെ കാണിച്ചിരിക്കുന്നതുപോലെ സാധ്യമായ എല്ലാ അമിനോ ആസിഡ് പാറ്റേണുകളും (aa) ഉൾക്കൊള്ളുന്ന ഒരു ലൈബ്രറി സൃഷ്ടിച്ചു. 3 നീളമുള്ള ഓരോ സാധ്യമായ പാറ്റേണും പെപ്റ്റൈഡിൽ നിന്ന് വേർതിരിച്ചെടുക്കുകയും അതിന്റെ വിപരീത പാറ്റേണിനൊപ്പം എല്ലാ പാറ്റേണുകളും (ട്രൈപെപ്റ്റൈഡുകൾ) അടങ്ങിയ ഒരു പൊതു മോട്ടിഫ് ലൈബ്രറിയും ചേർക്കുകയും ചെയ്തു. വളരെ ആവർത്തിച്ചുള്ള മോട്ടിഫുകളുടെ ലൈബ്രറികൾ ക്രമീകരിച്ച് ആവർത്തനം നീക്കം ചെയ്തു. തുടർന്ന്, മോട്ടിഫ് ലൈബ്രറിയിലെ ഓരോ ട്രൈപെപ്റ്റൈഡിനും, കമ്പ്യൂട്ടേഷണൽ ഉപകരണങ്ങൾ ഉപയോഗിച്ച് ലൈബ്രറിയിൽ അതിന്റെ സാന്നിധ്യം ഞങ്ങൾ പരിശോധിച്ചു. ഈ സാഹചര്യത്തിൽ, കണ്ടെത്തിയ മോട്ടിഫ് ട്രൈപെപ്റ്റൈഡ് അടങ്ങിയ പെപ്റ്റൈഡിന്റെ ആവൃത്തി ചേർത്ത് മോട്ടിഫ് ലൈബ്രറിയിലെ മോട്ടിഫിലേക്ക് നിയോഗിക്കുന്നു ("മോട്ടിഫുകളുടെ എണ്ണം"). മോട്ടിഫ് ജനറേഷന്റെ ഫലം ട്രൈപെപ്റ്റൈഡുകളുടെ (മോട്ടിഫുകൾ) എല്ലാ സംഭവങ്ങളും അവയുടെ മൂല്യങ്ങളും ഉൾക്കൊള്ളുന്ന ഒരു ദ്വിമാന ശ്രേണിയാണ്, റീഡുകൾ ഫിൽട്ടർ ചെയ്യുകയും ഗ്രൂപ്പുചെയ്യുകയും വിവർത്തനം ചെയ്യുകയും ചെയ്യുമ്പോൾ അനുബന്ധ മോട്ടിഫിൽ കലാശിക്കുന്ന സീക്വൻസിംഗ് റീഡുകളുടെ എണ്ണമാണിത്. മുകളിൽ വിശദമായി വിവരിച്ചിരിക്കുന്ന മെട്രിക്സ്.
മോട്ടിഫുകളുടെയും അനുബന്ധ സ്‌കാറ്റർപ്ലോട്ടുകളുടെയും എണ്ണത്തിന്റെ സാധാരണവൽക്കരണം: ഓരോ സാമ്പിളിനുമുള്ള മോട്ടിഫുകളുടെ എണ്ണം
ഇവിടെ ni എന്നത് വിഷയം i അടങ്ങിയ റീഡുകളുടെ എണ്ണമാണ്. അങ്ങനെ, സാമ്പിളിലെ മോട്ടിഫ് i അടങ്ങിയ റീഡുകളുടെ (അല്ലെങ്കിൽ പെപ്റ്റൈഡുകളുടെ) ശതമാന ആവൃത്തിയെ vi പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നു. ഫിഷറിന്റെ കൃത്യമായ പരിശോധന ഉപയോഗിച്ച് നോർമലൈസ് ചെയ്യാത്ത മോട്ടിഫുകളുടെ പി-മൂല്യങ്ങൾ കണക്കാക്കി. മോട്ടിഫുകളുടെ എണ്ണത്തിന്റെ കോറിലോഗ്രാമുകളെ സംബന്ധിച്ചിടത്തോളം, R ഉപയോഗിച്ചുള്ള നോർമലൈസ് ചെയ്ത മോട്ടിഫുകളുടെ എണ്ണം ഉപയോഗിച്ചാണ് സ്പിയർമാന്റെ പരസ്പരബന്ധങ്ങൾ കണക്കാക്കിയത്.
പെപ്റ്റൈഡ് ലൈബ്രറിയിലെ ഓരോ സ്ഥാനത്തും അമിനോ ആസിഡുകളുടെ ഉള്ളടക്കം ദൃശ്യവൽക്കരിക്കുന്നതിന്, വെബ് ലോഗോഗ്രാമുകൾ 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com) സൃഷ്ടിച്ചു. ആദ്യം, 12-മെർ പെപ്റ്റൈഡിന്റെ ഓരോ സ്ഥാനത്തും അമിനോ ആസിഡുകളുടെ ഉള്ളടക്കം 20×12 മാട്രിക്സിൽ സൂക്ഷിക്കുന്നു. തുടർന്ന്, ഓരോ സ്ഥാനത്തും ഒരേ ആപേക്ഷിക അമിനോ ആസിഡ് ഉള്ളടക്കം അടങ്ങിയ 1000 പെപ്റ്റൈഡുകളുടെ ഒരു സെറ്റ് ഫാസ്റ്റ-സീക്വൻസ് ഫോർമാറ്റിൽ ജനറേറ്റ് ചെയ്യുകയും വെബ്-ലോഗോ 3-ലേക്ക് ഇൻപുട്ടായി നൽകുകയും ചെയ്യുന്നു, ഇത് ഓരോ സ്ഥാനത്തും ആപേക്ഷിക അമിനോ ആസിഡ് ഉള്ളടക്കത്തിന്റെ ഗ്രാഫിക്കൽ പ്രാതിനിധ്യം സൃഷ്ടിക്കുന്നു. നൽകിയിരിക്കുന്ന ഒരു പെപ്റ്റൈഡ് ലൈബ്രറിക്ക്. മൾട്ടിഡൈമൻഷണൽ ഡാറ്റാസെറ്റുകൾ ദൃശ്യവൽക്കരിക്കുന്നതിന്, R-ൽ ആന്തരികമായി വികസിപ്പിച്ച ഒരു ഉപകരണം ഉപയോഗിച്ച് ഹീറ്റ് മാപ്പുകൾ സൃഷ്ടിച്ചു (ബയോസ് ഹീറ്റ്മാപ്പ്, ഇതുവരെ പുറത്തിറക്കാത്ത ഒരു R പാക്കേജ്). യൂക്ലിഡിയൻ ഡിസ്റ്റൻസ് മെട്രിക് ഉപയോഗിച്ച് വാർഡിന്റെ ഹൈറാർക്കിക്കൽ ക്ലസ്റ്ററിംഗ് രീതി ഉപയോഗിച്ചാണ് ഹീറ്റ് മാപ്പുകളിൽ അവതരിപ്പിച്ചിരിക്കുന്ന ഡെൻഡ്രോഗ്രാമുകൾ കണക്കാക്കിയത്. മോട്ടിഫ് സ്കോറിംഗ് ഡാറ്റയുടെ സ്ഥിതിവിവരക്കണക്ക് വിശകലനത്തിനായി, ഫിഷറിന്റെ കൃത്യമായ പരിശോധന ഉപയോഗിച്ച് അൺനോർമലൈസ് ചെയ്ത സ്കോറിംഗിനായുള്ള പി മൂല്യങ്ങൾ കണക്കാക്കി. മറ്റ് ഡാറ്റാസെറ്റുകൾക്കായുള്ള പി-മൂല്യങ്ങൾ R-ൽ വിദ്യാർത്ഥിയുടെ ടി-ടെസ്റ്റ് അല്ലെങ്കിൽ ANOVA ഉപയോഗിച്ച് കണക്കാക്കി.
തിരഞ്ഞെടുത്ത ഫേജ് ക്ലോണുകളും ഇൻസേർട്ടുകളില്ലാത്ത ഫേജുകളും വാൽ സിരയിലൂടെ ഇൻട്രാവെൻസായി കുത്തിവച്ചു (300 μl PBS-ൽ 2×1010 ഫേജുകൾ/മൃഗം). പെർഫ്യൂഷനും തുടർന്നുള്ള ഫിക്സേഷനും പത്ത് മിനിറ്റ് മുമ്പ്, അതേ മൃഗങ്ങൾക്ക് 100 μl DyLight594-ലേബൽ ചെയ്ത ലെക്റ്റിൻ (വെക്ടർ ലബോറട്ടറീസ് ഇൻകോർപ്പറേറ്റഡ്, DL-1177) ഇൻട്രാവെൻസായി കുത്തിവച്ചു. ഫേജ് കുത്തിവയ്പ്പിന് 60 മിനിറ്റിനുശേഷം, എലികളെ 50 മില്ലി PBS ഉപയോഗിച്ച് ഹൃദയത്തിലൂടെ പെർഫ്യൂസ് ചെയ്തു, തുടർന്ന് 50 മില്ലി 4% PFA/PBS ഉപയോഗിച്ചു. തലച്ചോറിന്റെ സാമ്പിളുകൾ 4% PFA/PBS-ൽ രാത്രി മുഴുവൻ ഉറപ്പിക്കുകയും 30% സുക്രോസിൽ രാത്രി മുഴുവൻ 4°C-ൽ മുക്കിവയ്ക്കുകയും ചെയ്തു. സാമ്പിളുകൾ OCT മിശ്രിതത്തിൽ ഫ്ലാഷ് ഫ്രീസ് ചെയ്യുന്നു. ശീതീകരിച്ച സാമ്പിളുകളുടെ ഇമ്മ്യൂണോഹിസ്റ്റോകെമിക്കൽ വിശകലനം മുറിയിലെ താപനിലയിൽ 1% BSA ഉപയോഗിച്ച് തടഞ്ഞ 30 µm ക്രയോസെക്ഷനുകളിൽ നടത്തി, 4 °C ൽ T7 ഫേജിനെതിരെ (നോവസ് NB 600-376A) പോളിക്ലോണൽ FITC-ലേബൽ ചെയ്ത ആന്റിബോഡികൾ ഉപയോഗിച്ച് ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്തു. രാത്രി മുഴുവൻ ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്തു. ഒടുവിൽ, ഭാഗങ്ങൾ PBS ഉപയോഗിച്ച് 3 തവണ കഴുകി, ഒരു കൺഫോക്കൽ ലേസർ മൈക്രോസ്കോപ്പ് (Leica TCS SP5) ഉപയോഗിച്ച് പരിശോധിച്ചു.
98% എങ്കിലും ശുദ്ധതയുള്ള എല്ലാ പെപ്റ്റൈഡുകളും GenScript USA സമന്വയിപ്പിച്ചു, ബയോടൈനൈലേറ്റ് ചെയ്തു, ലയോഫിലൈസ് ചെയ്തു. N-ടെർമിനസിൽ ഒരു അധിക ട്രിപ്പിൾ ഗ്ലൈസിൻ സ്‌പെയ്‌സർ വഴി ബയോട്ടിൻ ബന്ധിപ്പിച്ചിരിക്കുന്നു. മാസ് സ്പെക്ട്രോമെട്രി ഉപയോഗിച്ച് എല്ലാ പെപ്റ്റൈഡുകളും പരിശോധിക്കുക.
സ്ട്രെപ്റ്റാവിഡിൻ (സിഗ്മ S0677) 5 മടങ്ങ് തുല്യമോളാർ അധിക ബയോട്ടിനൈലേറ്റഡ് പെപ്റ്റൈഡ്, ബയോട്ടിനൈലേറ്റഡ് BACE1 ഇൻഹിബിറ്ററി പെപ്റ്റൈഡ്, അല്ലെങ്കിൽ ബയോട്ടിനൈലേറ്റഡ് BACE1 ഇൻഹിബിറ്ററി പെപ്റ്റൈഡ്, BACE1 ഇൻഹിബിറ്ററി പെപ്റ്റൈഡ് എന്നിവയുടെ സംയോജനം (3:1 അനുപാതം) 5-10% DMSO/PBS-ൽ ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്തു. കുത്തിവയ്പ്പിന് 1 മണിക്കൂർ മുമ്പ് മുറിയിലെ താപനിലയിൽ. സെറിബ്രൽ അറയുള്ള എലികളുടെ വാൽ സിരകളിൽ ഒന്നിലേക്ക് 10 mg/kg എന്ന അളവിൽ സ്ട്രെപ്റ്റാവിഡിൻ-സംയോജിത പെപ്റ്റൈഡുകൾ ഇൻട്രാവെൻസായി കുത്തിവച്ചു.
സ്ട്രെപ്റ്റാവിഡിൻ-പെപ്റ്റൈഡ് കോംപ്ലക്സുകളുടെ സാന്ദ്രത ELISA വിലയിരുത്തി. നങ്ക് മാക്സിസോർപ്പ് മൈക്രോടൈറ്റർ പ്ലേറ്റുകൾ (സിഗ്മ) 4°C-ൽ 1.5 μg/ml മൗസ് ആന്റി-സ്ട്രെപ്റ്റാവിഡിൻ ആന്റിബോഡി (തെർമോ, MA1-20011) ഉപയോഗിച്ച് രാത്രി മുഴുവൻ പൂശിയിരുന്നു. മുറിയിലെ താപനിലയിൽ 2 മണിക്കൂർ നേരത്തേക്ക് (തടയുന്ന ബഫർ: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0.05% NP40, 0.25% ജെലാറ്റിൻ, 1% BSA) തടഞ്ഞതിനുശേഷം, പ്ലേറ്റ് 0.05% Tween-20/PBS (വാഷ് ബഫർ) ഉപയോഗിച്ച് 3 തവണ കഴുകി. ബ്ലോക്കിംഗ് ബഫർ (പ്ലാസ്മ 1:10,000, CSF 1:115) ഉപയോഗിച്ച് നേർപ്പിച്ച കിണറുകളിൽ CSF, പ്ലാസ്മ സാമ്പിളുകൾ ചേർത്തു. തുടർന്ന് പ്ലേറ്റ് 4°C-ൽ ഒറ്റരാത്രികൊണ്ട് ഡിറ്റക്ഷൻ ആന്റിബോഡി (1 μg/ml, ആന്റി-സ്ട്രെപ്റ്റാവിഡിൻ-HRP, നോവസ് NB120-7239) ഉപയോഗിച്ച് ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്തു. മൂന്ന് വാഷിംഗ് സ്റ്റെപ്പുകൾക്ക് ശേഷം, TMB സബ്‌സ്‌ട്രേറ്റ് ലായനിയിൽ (റോച്ചെ) 20 മിനിറ്റ് വരെ ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്തപ്പോൾ സ്ട്രെപ്റ്റാവിഡിൻ കണ്ടെത്തി. 1M H2SO4 ഉപയോഗിച്ച് കളർ ഡെവലപ്‌മെന്റ് നിർത്തിയ ശേഷം, 450 nm ൽ ആഗിരണം അളക്കുക.
നിർമ്മാതാവിന്റെ പ്രോട്ടോക്കോൾ (വാക്കോ, 294-64701) അനുസരിച്ച് സ്ട്രെപ്റ്റാവിഡിൻ-പെപ്റ്റൈഡ്-BACE1 ഇൻഹിബിറ്റർ കോംപ്ലക്സിന്റെ പ്രവർത്തനം Aβ(1-40) ELISA വിലയിരുത്തി. ചുരുക്കത്തിൽ, CSF സാമ്പിളുകൾ സ്റ്റാൻഡേർഡ് ഡൈല്യൂയന്റിൽ (1:23) ലയിപ്പിച്ച് BNT77 ക്യാപ്‌ചർ ആന്റിബോഡി കൊണ്ട് പൊതിഞ്ഞ 96-കിണർ പ്ലേറ്റുകളിൽ 4°C-ൽ രാത്രി മുഴുവൻ ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്തു. അഞ്ച് വാഷിംഗ് ഘട്ടങ്ങൾക്ക് ശേഷം, HRP-സംയോജിത BA27 ആന്റിബോഡി ചേർത്ത് 4°C-ൽ 2 മണിക്കൂർ ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്തു, തുടർന്ന് അഞ്ച് വാഷിംഗ് ഘട്ടങ്ങൾ. TMB ലായനിയിൽ 30 മിനിറ്റ് മുറിയിലെ താപനിലയിൽ ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്തുകൊണ്ട് Aβ(1–40) കണ്ടെത്തി. സ്റ്റോപ്പ് ലായനി ഉപയോഗിച്ച് കളർ ഡെവലപ്‌മെന്റ് നിർത്തിയ ശേഷം, 450 nm-ൽ ആഗിരണം അളക്കുക. Aβ(1–40) ELISA-യ്ക്ക് മുമ്പ് പ്ലാസ്മ സാമ്പിളുകൾ സോളിഡ് ഫേസ് എക്സ്ട്രാക്ഷന് വിധേയമാക്കി. 96-കിണർ പ്ലേറ്റുകളിൽ പ്ലാസ്മ 0.2% DEA (സിഗ്മ) യിൽ ചേർത്ത് 30 മിനിറ്റ് മുറിയിലെ താപനിലയിൽ ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്തു. SPE പ്ലേറ്റുകൾ (Oasis, 186000679) വെള്ളവും 100% മെഥനോളും ഉപയോഗിച്ച് തുടർച്ചയായി കഴുകിയ ശേഷം, പ്ലാസ്മ സാമ്പിളുകൾ SPE പ്ലേറ്റുകളിലേക്ക് ചേർക്കുകയും എല്ലാ ദ്രാവകവും നീക്കം ചെയ്യുകയും ചെയ്തു. സാമ്പിളുകൾ കഴുകി (ആദ്യം 5% മെഥനോൾ, തുടർന്ന് 30% മെഥനോൾ) 2% NH4OH/90% മെഥനോൾ ഉപയോഗിച്ച് ഇല്യൂട്ടേറ്റ് ചെയ്തു. സ്ഥിരമായ N2 കറന്റിൽ 55°C യിൽ 99 മിനിറ്റ് നേരം എലുയേറ്റ് ഉണക്കിയ ശേഷം, സാമ്പിളുകൾ സ്റ്റാൻഡേർഡ് ഡില്യൂയന്റുകളായി കുറയ്ക്കുകയും മുകളിൽ വിവരിച്ചതുപോലെ Aβ(1–40) അളക്കുകയും ചെയ്തു.
ഈ ലേഖനം എങ്ങനെ ഉദ്ധരിക്കാം: യൂറിച്ച്, ഇ. തുടങ്ങിയവർ. ഇൻ വിവോയിൽ തിരിച്ചറിഞ്ഞ ട്രാൻസിറ്റ് പെപ്റ്റൈഡുകൾ ഉപയോഗിച്ച് തലച്ചോറിലേക്കുള്ള കാർഗോ ഡെലിവറി. ശാസ്ത്രം. 5, 14104; doi:10.1038/srep14104 (2015).
ലിഖോട്ട ജെ., സ്‌ക്‌ജോറിഞ്ച് ടി., തോംസെൻ എൽബി, മൂസ് ടി. ടാർഗെറ്റഡ് തെറാപ്പി ഉപയോഗിച്ച് തലച്ചോറിലേക്ക് മാക്രോമോളിക്യുലാർ മരുന്നുകളുടെ വിതരണം. ജേണൽ ഓഫ് ന്യൂറോകെമിസ്ട്രി 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
ബ്രാസ്‌ജെവിക്, ഐ., സ്റ്റെയിൻബുഷ്, എച്ച്‌ഡബ്ല്യു, ഷ്മിറ്റ്‌സ്, സി., മാർട്ടിനെസ്-മാർട്ടിനെസ്, പി. രക്ത-തലച്ചോറ് തടസ്സത്തിലുടനീളം പെപ്റ്റൈഡും പ്രോട്ടീൻ മരുന്നുകളും വിതരണം ചെയ്യുന്നു. പ്രോഗ് ന്യൂറോബയോൾ 87, 212–251, 10.1016/ജെ.പിന്യൂറോബിയോ.2008.12.002 (2009).
പാർഡ്രിഡ്ജ്, ഡബ്ല്യു.എം. രക്ത-തലച്ചോറ് തടസ്സം: തലച്ചോറിലെ മയക്കുമരുന്ന് വികസനത്തിലെ ഒരു തടസ്സം. ന്യൂറോആർഎക്സ് 2, 3–14, 10.1602/ന്യൂറോക്സ്.2.1.3 (2005).
ജോഹാൻസൺ, കെ.ഇ, ഡങ്കൻ, ജെ.എ, സ്റ്റോപ്പ, ഇ.ജി, ബൈർഡ്, എ. കോറോയിഡ് പ്ലെക്സസ്-സി.എസ്.എഫ് പാതയിലൂടെ തലച്ചോറിലേക്ക് മെച്ചപ്പെട്ട മയക്കുമരുന്ന് വിതരണത്തിനും ലക്ഷ്യമിടലിനുമുള്ള സാധ്യതകൾ. ഫാർമസ്യൂട്ടിക്കൽ റിസർച്ച് 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
പാഡ്രിഡ്ജ്, ഡബ്ല്യുഎം തലച്ചോറിന്റെ ഡെലിവറിക്ക് മോളിക്യുലാർ ട്രോജൻ ഹോഴ്‌സുകൾ ഉപയോഗിച്ചുള്ള ബയോഫാർമസ്യൂട്ടിക്കലുകളുടെ ആധുനികവൽക്കരണം. ബയോകോൺജഗ് കെം 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008).
പാർഡ്രിഡ്ജ്, രക്ത-തലച്ചോറ് തടസ്സത്തിലൂടെ WM റിസപ്റ്റർ-മധ്യസ്ഥതയുള്ള പെപ്റ്റൈഡ് ഗതാഗതം. എൻഡോക്ർ റെവ. 7, 314–330 (1986).
നീവോനർ, ജെ. തുടങ്ങിയവർ. മോണോവാലന്റ് മോളിക്യുലാർ ഷട്ടിൽ ഉപയോഗിച്ച് തെറാപ്പിറ്റിക് ആന്റിബോഡികളുടെ തലച്ചോറിന്റെ നുഴഞ്ഞുകയറ്റവും ഫലപ്രാപ്തിയും വർദ്ധിപ്പിക്കുക. ന്യൂറോൺ 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
ബീൻ-ലീ, എൻ. തുടങ്ങിയവർ. ട്രാൻസ്ഫെറിൻ റിസപ്റ്റർ (TfR) ഗതാഗതം TfR ആന്റിബോഡികളുടെ അഫിനിറ്റി വകഭേദങ്ങളുടെ മസ്തിഷ്ക ആഗിരണം നിർണ്ണയിക്കുന്നു. J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).