Nature.com സന്ദർശിച്ചതിന് നന്ദി.പരിമിതമായ CSS പിന്തുണയുള്ള ഒരു ബ്രൗസർ പതിപ്പാണ് നിങ്ങൾ ഉപയോഗിക്കുന്നത്.മികച്ച അനുഭവത്തിനായി, നിങ്ങൾ ഒരു അപ്‌ഡേറ്റ് ചെയ്‌ത ബ്രൗസർ ഉപയോഗിക്കാൻ ഞങ്ങൾ ശുപാർശ ചെയ്യുന്നു (അല്ലെങ്കിൽ Internet Explorer-ൽ അനുയോജ്യത മോഡ് പ്രവർത്തനരഹിതമാക്കുക).കൂടാതെ, നിലവിലുള്ള പിന്തുണ ഉറപ്പാക്കാൻ, ഞങ്ങൾ ശൈലികളും JavaScript ഇല്ലാതെ സൈറ്റ് കാണിക്കുന്നു.
ഒരേസമയം മൂന്ന് സ്ലൈഡുകളുടെ ഒരു കറൗസൽ പ്രദർശിപ്പിക്കുന്നു.ഒരേ സമയം മൂന്ന് സ്ലൈഡുകളിലൂടെ നീങ്ങാൻ മുമ്പത്തേതും അടുത്തതും ബട്ടണുകൾ ഉപയോഗിക്കുക, അല്ലെങ്കിൽ ഒരു സമയം മൂന്ന് സ്ലൈഡുകളിലൂടെ നീങ്ങാൻ അവസാനത്തെ സ്ലൈഡർ ബട്ടണുകൾ ഉപയോഗിക്കുക.
രക്ത-മസ്തിഷ്ക തടസ്സവും രക്ത-മസ്തിഷ്ക തടസ്സവും ബയോതെറാപ്പിറ്റിക് ഏജന്റുമാരെ കേന്ദ്ര നാഡീവ്യൂഹത്തിലെ ലക്ഷ്യങ്ങളിൽ എത്തുന്നതിൽ നിന്ന് തടയുന്നു, അതുവഴി ന്യൂറോളജിക്കൽ രോഗങ്ങളുടെ ഫലപ്രദമായ ചികിത്സയെ തടസ്സപ്പെടുത്തുന്നു.വിവോയിലെ പുതിയ ബ്രെയിൻ ട്രാൻസ്‌പോർട്ടറുകൾ കണ്ടെത്തുന്നതിന്, ഞങ്ങൾ ഒരു T7 ഫേജ് പെപ്റ്റൈഡ് ലൈബ്രറിയും എലികളുടെ ഒരു വലിയ കുളം മോഡൽ ഉപയോഗിച്ച് രക്തവും സെറിബ്രോസ്പൈനൽ ദ്രാവകവും (CSF) സീരിയലായി ശേഖരിക്കുകയും അവതരിപ്പിച്ചു.നാല് റൗണ്ട് തിരഞ്ഞെടുപ്പിന് ശേഷം CSF-ൽ നിർദ്ദിഷ്‌ട ഫേജ് ക്ലോണുകൾ വളരെയധികം സമ്പുഷ്ടമാക്കി.വ്യക്തിഗത കാൻഡിഡേറ്റ് പെപ്റ്റൈഡുകളുടെ പരിശോധനയിൽ CSF-ൽ 1000-ലധികം മടങ്ങ് സമ്പുഷ്ടീകരണം കണ്ടെത്തി.തിരിച്ചറിഞ്ഞ നോവൽ ട്രാൻസിറ്റ് പെപ്റ്റൈഡുമായി ബന്ധിപ്പിച്ചിട്ടുള്ള BACE1 പെപ്റ്റൈഡ് ഇൻഹിബിറ്റർ ഉപയോഗിച്ച് സെറിബ്രോസ്പൈനൽ ദ്രാവകത്തിലെ അമിലോയിഡ്-β-ന്റെ അളവ് 40% കുറച്ചാണ് തലച്ചോറിലേക്കുള്ള പെപ്റ്റൈഡ്-മധ്യസ്ഥമായ ഡെലിവറിയുടെ ബയോ ആക്ടിവിറ്റി സ്ഥിരീകരിച്ചത്.വിവോ ഫേജ് തിരഞ്ഞെടുക്കൽ രീതികൾ വഴി തിരിച്ചറിഞ്ഞ പെപ്റ്റൈഡുകൾ, ചികിൽസാ ഫലത്തോടെ തലച്ചോറിലേക്ക് മാക്രോമോളികുലുകൾ വ്യവസ്ഥാപിതമായി വിതരണം ചെയ്യുന്നതിനുള്ള ഉപയോഗപ്രദമായ വാഹനങ്ങളായിരിക്കുമെന്ന് ഈ ഫലങ്ങൾ സൂചിപ്പിക്കുന്നു.
സെൻട്രൽ നാഡീവ്യൂഹം (സിഎൻഎസ്) ടാർഗെറ്റുചെയ്‌ത തെറാപ്പി ഗവേഷണം പ്രധാനമായും ശ്രദ്ധ കേന്ദ്രീകരിച്ചിരിക്കുന്നത് ഒപ്റ്റിമൈസ് ചെയ്ത മരുന്നുകളെയും സിഎൻഎസ്-ടാർഗെറ്റിംഗ് ഗുണങ്ങൾ പ്രകടിപ്പിക്കുന്ന ഏജന്റുമാരെയും തിരിച്ചറിയുന്നതിലാണ്.മയക്കുമരുന്ന് വിതരണം, പ്രത്യേകിച്ച് വലിയ തന്മാത്രകൾ, ആധുനിക ന്യൂറോ സയൻസ് മയക്കുമരുന്ന് വികസനത്തിന്റെ അവിഭാജ്യ ഘടകമായതിനാൽ ഇത് ഇപ്പോൾ മാറാൻ തുടങ്ങിയിരിക്കുന്നു.കേന്ദ്ര നാഡീവ്യൂഹത്തിന്റെ പരിസ്ഥിതി സെറിബ്രോവാസ്കുലർ ബാരിയർ സിസ്റ്റത്താൽ നന്നായി സംരക്ഷിക്കപ്പെടുന്നു, അതിൽ രക്ത-മസ്തിഷ്ക തടസ്സവും (ബിബിബി) രക്ത-മസ്തിഷ്ക തടസ്സവും (ബിസിബിബി) 1 ഉൾപ്പെടുന്നു, ഇത് തലച്ചോറിലേക്ക് മരുന്നുകൾ എത്തിക്കുന്നത് വെല്ലുവിളിയാക്കുന്നു1,2.മിക്കവാറും എല്ലാ വലിയ തന്മാത്ര മരുന്നുകളും 98% ചെറിയ തന്മാത്ര മരുന്നുകളും തലച്ചോറിൽ നിന്ന് പുറന്തള്ളപ്പെടുന്നുവെന്ന് കണക്കാക്കപ്പെടുന്നു3.അതുകൊണ്ടാണ് CNS 4,5 ലേക്ക് ചികിത്സാ മരുന്നുകളുടെ കാര്യക്ഷമവും നിർദ്ദിഷ്ടവുമായ ഡെലിവറി നൽകുന്ന പുതിയ മസ്തിഷ്ക ഗതാഗത സംവിധാനങ്ങൾ തിരിച്ചറിയുന്നത് വളരെ പ്രധാനമാണ്.എന്നിരുന്നാലും, BBB, BCSFB എന്നിവ മസ്തിഷ്കത്തിന്റെ എല്ലാ ഘടനകളിലേക്കും അതിന്റെ വിപുലമായ വാസ്കുലേച്ചറിലൂടെ തുളച്ചുകയറുകയും പ്രവേശിക്കുകയും ചെയ്യുന്നതിനാൽ മയക്കുമരുന്ന് വിതരണത്തിനുള്ള മികച്ച അവസരവും നൽകുന്നു.അതിനാൽ, മസ്തിഷ്കത്തിലേക്ക് എത്തിക്കുന്നതിനുള്ള ആക്രമണാത്മകമല്ലാത്ത രീതികൾ ഉപയോഗിക്കുന്നതിനുള്ള നിലവിലെ ശ്രമങ്ങൾ പ്രധാനമായും എൻഡോജെനസ് BBB6 റിസപ്റ്റർ ഉപയോഗിച്ച് റിസപ്റ്റർ-മെഡിയേറ്റഡ് ട്രാൻസ്പോർട്ട് (PMT) മെക്കാനിസത്തെ അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ളതാണ്.ട്രാൻസ്ഫർറിൻ റിസപ്റ്റർ പാത്ത്വേ7,8 ഉപയോഗിച്ചുള്ള സമീപകാല പ്രധാന മുന്നേറ്റങ്ങൾ ഉണ്ടായിരുന്നിട്ടും, മെച്ചപ്പെട്ട പ്രോപ്പർട്ടികൾ ഉള്ള പുതിയ ഡെലിവറി സിസ്റ്റങ്ങളുടെ കൂടുതൽ വികസനം ആവശ്യമാണ്.ഇതിനായി, സി‌എസ്‌എഫ് ഗതാഗതത്തിന് മധ്യസ്ഥത വഹിക്കാൻ കഴിവുള്ള പെപ്റ്റൈഡുകൾ തിരിച്ചറിയുക എന്നതായിരുന്നു ഞങ്ങളുടെ ലക്ഷ്യം, കാരണം അവ തത്വത്തിൽ സിഎൻഎസിലേക്ക് മാക്രോമോളിക്യൂളുകൾ എത്തിക്കുന്നതിനോ പുതിയ റിസപ്റ്റർ പാതകൾ തുറക്കുന്നതിനോ ഉപയോഗിക്കാം.പ്രത്യേകിച്ചും, സെറിബ്രോവാസ്കുലർ സിസ്റ്റത്തിന്റെ (BBB, BSCFB) നിർദ്ദിഷ്ട റിസപ്റ്ററുകളും ട്രാൻസ്പോർട്ടറുകളും ബയോതെറാപ്പിക് മരുന്നുകളുടെ സജീവവും നിർദ്ദിഷ്ടവുമായ ഡെലിവറിക്ക് സാധ്യതയുള്ള ലക്ഷ്യങ്ങളായി വർത്തിക്കും.സെറിബ്രോസ്പൈനൽ ഫ്ലൂയിഡ് (സിഎസ്എഫ്) കോറോയിഡ് പ്ലെക്സസിന്റെ (സിഎസ്) ഒരു സ്രവ ഉൽപ്പന്നമാണ്, ഇത് സബാരക്നോയിഡ് സ്പേസ്, വെൻട്രിക്കുലാർ സ്പേസ് എന്നിവയിലൂടെ തലച്ചോറിന്റെ ഇന്റർസ്റ്റീഷ്യൽ ദ്രാവകവുമായി നേരിട്ട് ബന്ധപ്പെടുന്നു.തലച്ചോറിന്റെ ഇന്റർസ്റ്റീഷ്യത്തിലേക്ക് സബ്അരക്നോയിഡ് സെറിബ്രോസ്പൈനൽ ദ്രാവകം അമിതമായി വ്യാപിക്കുന്നതായി അടുത്തിടെ തെളിഞ്ഞു.ഈ സബ്അരക്നോയിഡ് ഇൻഫ്ലോ ട്രാക്റ്റ് ഉപയോഗിച്ച് അല്ലെങ്കിൽ നേരിട്ട് BBB വഴി പാരൻചൈമൽ സ്പേസ് ആക്സസ് ചെയ്യാൻ ഞങ്ങൾ പ്രതീക്ഷിക്കുന്നു.ഇത് നേടുന്നതിന്, ഈ രണ്ട് വ്യത്യസ്ത പാതകളിൽ ഏതെങ്കിലും ഒന്നിലൂടെ കൈമാറ്റം ചെയ്യപ്പെടുന്ന പെപ്റ്റൈഡുകളെ മികച്ച രീതിയിൽ തിരിച്ചറിയുന്ന ശക്തമായ ഒരു വിവോ ഫേജ് സെലക്ഷൻ തന്ത്രം ഞങ്ങൾ നടപ്പിലാക്കി.
ഏറ്റവും ഉയർന്ന ലൈബ്രറി വൈവിധ്യമുള്ള പ്രാരംഭ സെലക്ഷൻ റൗണ്ടുകൾ നിരീക്ഷിക്കുന്നതിന്, CSF സാമ്പിളിനൊപ്പം ഉയർന്ന ത്രൂപുട്ട് സീക്വൻസിംഗും (HTS) ഉള്ള ഒരു സീക്വൻഷ്യൽ ഇൻ വിവോ ഫേജ് ഡിസ്പ്ലേ സ്ക്രീനിംഗ് രീതി ഞങ്ങൾ ഇപ്പോൾ വിവരിക്കുന്നു.രക്തം മലിനമാകാതിരിക്കാൻ ശാശ്വതമായി ഘടിപ്പിച്ച വലിയ സിസ്റ്റെർന (CM) ക്യാനുല ഉപയോഗിച്ച് ബോധമുള്ള എലികളിൽ സ്ക്രീനിംഗ് നടത്തി.പ്രധാനമായി, ഈ സമീപനം സെറിബ്രോവാസ്കുലർ തടസ്സത്തിലൂടെയുള്ള ഗതാഗത പ്രവർത്തനങ്ങളുള്ള മസ്തിഷ്ക-ലക്ഷ്യവും പെപ്റ്റൈഡുകളും തിരഞ്ഞെടുക്കുന്നു.T7 phages അവയുടെ ചെറിയ വലിപ്പം കാരണം (~60 nm)10 ഞങ്ങൾ ഉപയോഗിച്ചു, കൂടാതെ എൻഡോതെലിയൽ കൂടാതെ/അല്ലെങ്കിൽ എപ്പിത്തീലിയൽ-മെഡുള്ള ബാരിയറിന്റെ ട്രാൻസ് സെല്ലുലാർ ക്രോസിംഗ് അനുവദിക്കുന്ന വെസിക്കിളുകളുടെ ഗതാഗതത്തിന് അവ അനുയോജ്യമാണെന്ന് നിർദ്ദേശിച്ചു.നാല് റൗണ്ട് പാനിംഗിന് ശേഷം, വിവോ സിഎസ്‌എഫ് സമ്പുഷ്ടീകരണത്തിലും സെറിബ്രൽ മൈക്രോവെസൽ അസോസിയേഷനിലും ശക്തമായി കാണിക്കുന്ന ഫേജ് പോപ്പുലേഷനുകൾ ഒറ്റപ്പെട്ടു.പ്രധാനമായും, തിരഞ്ഞെടുത്തതും രാസപരമായി സമന്വയിപ്പിച്ചതുമായ മികച്ച കാൻഡിഡേറ്റ് പെപ്റ്റൈഡുകൾക്ക് പ്രോട്ടീൻ ചരക്ക് സെറിബ്രോസ്പൈനൽ ദ്രാവകത്തിലേക്ക് കൊണ്ടുപോകാൻ കഴിയുമെന്ന് തെളിയിച്ചുകൊണ്ട് ഞങ്ങളുടെ കണ്ടെത്തലുകൾ സ്ഥിരീകരിക്കാൻ ഞങ്ങൾക്ക് കഴിഞ്ഞു.ഒന്നാമതായി, BACE1 പെപ്റ്റൈഡിന്റെ ഒരു ഇൻഹിബിറ്ററുമായി ഒരു മുൻനിര ട്രാൻസിറ്റ് പെപ്റ്റൈഡ് സംയോജിപ്പിച്ചാണ് CNS-ന്റെ ഫാർമകോഡൈനാമിക് ഇഫക്റ്റുകൾ സ്ഥാപിച്ചത്.വിവോ ഫങ്ഷണൽ സ്ക്രീനിംഗ് തന്ത്രങ്ങൾക്ക് നോവൽ ബ്രെയിൻ ട്രാൻസ്പോർട്ട് പെപ്റ്റൈഡുകളെ ഫലപ്രദമായ പ്രോട്ടീൻ കാർഗോ കാരിയറുകളായി തിരിച്ചറിയാൻ കഴിയുമെന്ന് തെളിയിക്കുന്നതിനൊപ്പം, നവീനമായ മസ്തിഷ്ക ഗതാഗത പാതകൾ തിരിച്ചറിയുന്നതിൽ സമാനമായ പ്രവർത്തനപരമായ തിരഞ്ഞെടുപ്പ് സമീപനങ്ങളും പ്രധാനമാകുമെന്ന് ഞങ്ങൾ പ്രതീക്ഷിക്കുന്നു.
പ്ലാക്ക്-ഫോർമിംഗ് യൂണിറ്റുകളെ (PFU) അടിസ്ഥാനമാക്കി, ഫേജ് പാക്കേജിംഗ് ഘട്ടത്തിന് ശേഷം, ഏകദേശം 109 വൈവിധ്യങ്ങളുള്ള റാൻഡം 12-മെർ ലീനിയർ T7 ഫേജ് പെപ്റ്റൈഡുകളുടെ ഒരു ലൈബ്രറി രൂപകൽപ്പന ചെയ്യുകയും സൃഷ്ടിക്കുകയും ചെയ്തു (മെറ്റീരിയലുകളും രീതികളും കാണുക).വിവോ പാനിംഗിൽ മുമ്പ് ഞങ്ങൾ ഈ ലൈബ്രറിയെ ശ്രദ്ധാപൂർവ്വം വിശകലനം ചെയ്തു എന്നത് ശ്രദ്ധിക്കേണ്ടതാണ്.പരിഷ്‌ക്കരിച്ച പ്രൈമറുകൾ ഉപയോഗിച്ച് ഫാജ് ലൈബ്രറി സാമ്പിളുകളുടെ PCR ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ HTS-ന് നേരിട്ട് ബാധകമായ ആംപ്ലിക്കോണുകൾ സൃഷ്ടിച്ചു (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം. 1a).a) HTS11 സീക്വൻസിംഗ് പിശകുകൾ, b) പ്രൈമറുകളുടെ (NNK) 1-12 ഗുണനിലവാരത്തെ ബാധിക്കുന്നതിനാൽ, സ്റ്റാൻഡ്‌ബൈ ലൈബ്രറിയിലെ വൈൽഡ്-ടൈപ്പ് (wt) ഫേജിന്റെ (അസ്ഥികൂടം ഉൾപ്പെടുത്തലുകൾ) സാന്നിധ്യം, പരിശോധിച്ച ക്രമ വിവരങ്ങൾ മാത്രം എക്‌സ്‌ട്രാക്‌റ്റുചെയ്യുന്നതിന് ഒരു സീക്വൻസ് ഫിൽട്ടറിംഗ് നടപടിക്രമം നടപ്പിലാക്കി (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം).ഈ ഫിൽട്ടർ ഘട്ടങ്ങൾ എല്ലാ HTS സീക്വൻസിങ് ലൈബ്രറികൾക്കും ബാധകമാണ്.സ്റ്റാൻഡേർഡ് ലൈബ്രറിക്കായി, മൊത്തം 233,868 റീഡുകൾ ലഭിച്ചു, അതിൽ 39% ഫിൽട്ടർ മാനദണ്ഡങ്ങൾ പാസാക്കി, ലൈബ്രറി വിശകലനത്തിനും തുടർന്നുള്ള റൗണ്ടുകൾക്കുള്ള തിരഞ്ഞെടുപ്പിനും ഉപയോഗിച്ചു (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം 1c-e).വായനകൾ പ്രധാനമായും 3 ബേസ് ജോഡികളുടെ നീളമുള്ള ഗുണിതങ്ങളായിരുന്നു, 36 ന്യൂക്ലിയോടൈഡുകളിൽ (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം 1c), ലൈബ്രറി ഡിസൈൻ (NNK) 1-12 സ്ഥിരീകരിക്കുന്നു.ശ്രദ്ധേയമായി, ഏകദേശം 11% ലൈബ്രറി അംഗങ്ങളിൽ 12-ഡൈമൻഷണൽ വൈൽഡ്-ടൈപ്പ് (wt) ബാക്ക്‌ബോൺ PAGISRELVDKL ഉൾപ്പെടുത്തൽ അടങ്ങിയിരിക്കുന്നു, കൂടാതെ പകുതിയോളം സീക്വൻസുകളിൽ (49%) ഉൾപ്പെടുത്തലുകളോ ഇല്ലാതാക്കലുകളോ അടങ്ങിയിരിക്കുന്നു.ലൈബ്രറി ലൈബ്രറിയിലെ എച്ച്ടിഎസ്, ലൈബ്രറിയിലെ പെപ്റ്റൈഡുകളുടെ ഉയർന്ന വൈവിധ്യം സ്ഥിരീകരിച്ചു: 81% പെപ്റ്റൈഡ് സീക്വൻസുകൾ ഒരിക്കൽ മാത്രം കണ്ടെത്തി, ≥4 പകർപ്പുകളിൽ 1.5% മാത്രമേ സംഭവിച്ചിട്ടുള്ളൂ (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം 2a).ശേഖരത്തിലെ എല്ലാ 12 സ്ഥാനങ്ങളിലുമുള്ള അമിനോ ആസിഡുകളുടെ (എഎ) ആവൃത്തികൾ ഡീജനറേറ്റ് എൻ‌കെ‌കെ റെപ്പർട്ടറി (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം 2 ബി) സൃഷ്ടിക്കുന്ന കോഡണുകളുടെ എണ്ണത്തിന് പ്രതീക്ഷിക്കുന്ന ആവൃത്തികളുമായി നന്നായി ബന്ധപ്പെട്ടിരിക്കുന്നു.ഈ ഇൻസെർട്ടുകൾ എൻകോഡ് ചെയ്‌ത aa അവശിഷ്ടങ്ങളുടെ നിരീക്ഷിച്ച ആവൃത്തി കണക്കാക്കിയ ആവൃത്തിയുമായി (r = 0.893) നന്നായി ബന്ധപ്പെട്ടിരിക്കുന്നു (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം. 2c).കുത്തിവയ്പ്പിനായി ഫേജ് ലൈബ്രറികൾ തയ്യാറാക്കുന്നതിൽ എൻഡോടോക്സിൻ വർദ്ധിപ്പിക്കുന്നതിനും നീക്കം ചെയ്യുന്നതിനുമുള്ള ഘട്ടങ്ങൾ ഉൾപ്പെടുന്നു.ഇത് ഫേജ് ലൈബ്രറികളുടെ വൈവിധ്യം കുറയ്ക്കുമെന്ന് മുമ്പ് തെളിയിക്കപ്പെട്ടിട്ടുണ്ട്12,13.അതിനാൽ, ഞങ്ങൾ എൻഡോടോക്സിൻ നീക്കം ചെയ്ത ഒരു പ്ലേറ്റ്-ആംപ്ലിഫൈഡ് ഫേജ് ലൈബ്രറി ക്രമീകരിച്ച് AA യുടെ ആവൃത്തി കണക്കാക്കാൻ യഥാർത്ഥ ലൈബ്രറിയുമായി താരതമ്യം ചെയ്തു.ഒറിജിനൽ പൂളും ആംപ്ലിഫൈഡ് ആൻഡ് പ്യൂരിഫൈഡ് പൂളും (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം. 2d) തമ്മിൽ ശക്തമായ പരസ്പരബന്ധം (r = 0.995) നിരീക്ഷിച്ചു, T7 ഫേജ് ഉപയോഗിച്ച് പ്ലേറ്റുകളിൽ വർദ്ധിപ്പിച്ച ക്ലോണുകൾ തമ്മിലുള്ള മത്സരം വലിയ പക്ഷപാതത്തിന് കാരണമാകുന്നില്ലെന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്നു.ലൈബ്രറികളുടെ വൈവിധ്യം (~109) HTS ഉപയോഗിച്ച് പോലും പൂർണ്ണമായി പകർത്താൻ കഴിയാത്തതിനാൽ, ഈ താരതമ്യം ഓരോ ലൈബ്രറിയിലെയും ട്രൈപ്‌റ്റൈഡ് മോട്ടിഫുകളുടെ ആവൃത്തിയെ അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ളതാണ്.ഓരോ സ്ഥാനത്തും aa യുടെ ആവൃത്തി വിശകലനം നൽകിയ ശേഖരത്തിന്റെ അവസാന മൂന്ന് സ്ഥാനങ്ങളിൽ ഒരു ചെറിയ സ്ഥാന-ആശ്രിത പക്ഷപാതം വെളിപ്പെടുത്തി (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം 2e).ഉപസംഹാരമായി, ലൈബ്രറിയുടെ ഗുണനിലവാരവും വൈവിധ്യവും സ്വീകാര്യമാണെന്ന് ഞങ്ങൾ നിഗമനം ചെയ്തു, കൂടാതെ നിരവധി റൗണ്ട് തിരഞ്ഞെടുപ്പുകൾക്കിടയിൽ ഫാജ് ലൈബ്രറികളുടെ ആംപ്ലിഫിക്കേഷനും തയ്യാറാക്കലും കാരണം വൈവിധ്യത്തിൽ ചെറിയ മാറ്റങ്ങൾ മാത്രമേ നിരീക്ഷിക്കപ്പെട്ടിട്ടുള്ളൂ.
BBB കൂടാതെ/അല്ലെങ്കിൽ BCSFB (ചിത്രം 1a-b) വഴി ഞരമ്പിലൂടെ (iv) കുത്തിവച്ച T7 ഫേജിനെ തിരിച്ചറിയാൻ സുഗമമാക്കുന്നതിന്, ബോധമുള്ള എലികളുടെ മുഖ്യമന്ത്രിയിൽ ഒരു കാനുല ശസ്ത്രക്രിയയിലൂടെ ഇംപ്ലാന്റ് ചെയ്യുന്നതിലൂടെ സീരിയൽ സെറിബ്രോസ്പൈനൽ ഫ്ലൂയിഡ് സാമ്പിൾ നടത്താം.ഇൻ വിവോ സെലക്ഷന്റെ ആദ്യ മൂന്ന് റൗണ്ടുകളിൽ ഞങ്ങൾ രണ്ട് സ്വതന്ത്ര തിരഞ്ഞെടുപ്പ് ആയുധങ്ങൾ (ആയുധങ്ങൾ എ, ബി) ഉപയോഗിച്ചു (ചിത്രം 1 സി).തിരഞ്ഞെടുക്കലിന്റെ ആദ്യ മൂന്ന് റൗണ്ടുകളിൽ അവതരിപ്പിച്ച ഫേജിന്റെ ആകെ അളവ് കുറച്ചുകൊണ്ട് ഞങ്ങൾ തിരഞ്ഞെടുപ്പിന്റെ കർശനത ക്രമേണ വർദ്ധിപ്പിച്ചു.നാലാം റൗണ്ട് പാനിങ്ങിനായി, ഞങ്ങൾ എ, ബി ശാഖകളിൽ നിന്നുള്ള സാമ്പിളുകൾ സംയോജിപ്പിച്ച് മൂന്ന് അധിക സ്വതന്ത്ര തിരഞ്ഞെടുപ്പുകൾ നടത്തി.ഈ മോഡലിലെ T7 phage കണങ്ങളുടെ in vivo പ്രോപ്പർട്ടികൾ പഠിക്കാൻ, വൈൽഡ്-ടൈപ്പ് ഫേജ് (PAGISRELVDKL മാസ്റ്റർ ഇൻസേർട്ട്) വാൽ സിര വഴി എലികളിലേക്ക് കുത്തിവച്ചു.സെറിബ്രോസ്പൈനൽ ദ്രാവകത്തിൽ നിന്നും രക്തത്തിൽ നിന്നും വ്യത്യസ്ത സമയ പോയിന്റുകളിൽ നിന്നുള്ള ഫേജുകൾ വീണ്ടെടുക്കുന്നത് താരതമ്യേന ചെറിയ T7 ഐക്കോസഹെഡ്രൽ ഫേജുകൾക്ക് രക്ത കമ്പാർട്ടുമെന്റിൽ നിന്ന് ദ്രുതഗതിയിലുള്ള പ്രാരംഭ ക്ലിയറൻസ് ഘട്ടമുണ്ടെന്ന് കാണിച്ചു (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം. 3).നൽകിയ ടൈറ്ററുകളും എലികളുടെ രക്തത്തിന്റെ അളവും അടിസ്ഥാനമാക്കി, ഞങ്ങൾ ഏകദേശം 1% wt മാത്രമേ കണക്കാക്കൂ.ഇൻട്രാവൈനസ് കുത്തിവയ്പ്പിന് 10 മിനിറ്റിനുശേഷം, നൽകിയ ഡോസിൽ നിന്നുള്ള ഫാേജ് രക്തത്തിൽ കണ്ടെത്തി.ഈ പ്രാരംഭ ദ്രുതഗതിയിലുള്ള തകർച്ചയ്ക്ക് ശേഷം, 27.7 മിനിറ്റിന്റെ അർദ്ധായുസ്സ് ഉപയോഗിച്ച് മന്ദഗതിയിലുള്ള പ്രാഥമിക ക്ലിയറൻസ് അളക്കപ്പെട്ടു.പ്രധാനമായി, CSF കമ്പാർട്ടുമെന്റിൽ നിന്ന് വളരെ കുറച്ച് ഫേജുകൾ മാത്രമേ വീണ്ടെടുത്തിട്ടുള്ളൂ, ഇത് CSF കമ്പാർട്ടുമെന്റിലേക്ക് വൈൽഡ്-ടൈപ്പ് ഫേജ് മൈഗ്രേഷന്റെ താഴ്ന്ന പശ്ചാത്തലത്തെ സൂചിപ്പിക്കുന്നു (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം. 3).ശരാശരി, രക്തത്തിൽ T7 ഫേജിന്റെ ഏകദേശം 1 x 10-3% ടൈറ്ററുകളും തുടക്കത്തിൽ ഇൻഫ്യൂസ് ചെയ്ത 4 x 10-8% ഫേജുകളും സെറിബ്രോസ്പൈനൽ ദ്രാവകത്തിൽ മുഴുവൻ സാംപ്ലിംഗ് കാലയളവിലും (0-250 മിനിറ്റ്) കണ്ടെത്തി.സെറിബ്രോസ്പൈനൽ ഫ്ലൂയിഡിലെ വൈൽഡ്-ടൈപ്പ് ഫേജിന്റെ അർദ്ധായുസ്സ് (25.7 മിനിറ്റ്) രക്തത്തിൽ കാണപ്പെടുന്നതിന് സമാനമാണ് എന്നത് ശ്രദ്ധേയമാണ്.സി‌എസ്‌എഫ് കമ്പാർട്ടുമെന്റിനെ രക്തത്തിൽ നിന്ന് വേർതിരിക്കുന്ന തടസ്സം സി‌എം-കാൻ‌യുലേറ്റഡ് എലികളിൽ കേടുകൂടാതെയുണ്ടെന്ന് ഈ ഡാറ്റ തെളിയിക്കുന്നു, ഇത് രക്തത്തിൽ നിന്ന് സി‌എസ്‌എഫ് കമ്പാർട്ടുമെന്റിലേക്ക് എളുപ്പത്തിൽ കൊണ്ടുപോകുന്ന ക്ലോണുകളെ തിരിച്ചറിയാൻ ഫാജ് ലൈബ്രറികളുടെ വിവോ സെലക്ഷനെ അനുവദിക്കുന്നു.
(എ) ഒരു വലിയ കുളത്തിൽ നിന്ന് സെറിബ്രോസ്പൈനൽ ദ്രാവകം (സിഎസ്എഫ്) വീണ്ടും സാമ്പിൾ ചെയ്യുന്നതിനുള്ള ഒരു രീതി സജ്ജീകരിക്കുന്നു.(ബി) കേന്ദ്ര നാഡീവ്യൂഹം (സിഎൻഎസ്) തടസ്സത്തിന്റെ സെല്ലുലാർ സ്ഥാനവും രക്ത-മസ്തിഷ്ക തടസ്സവും (ബിബിബി) രക്ത-മസ്തിഷ്ക തടസ്സവും മറികടക്കുന്ന പെപ്റ്റൈഡുകളെ തിരിച്ചറിയാൻ ഉപയോഗിക്കുന്ന തിരഞ്ഞെടുപ്പ് തന്ത്രവും കാണിക്കുന്ന ഡയഗ്രം.(സി) വിവോ ഫേജ് ഡിസ്പ്ലേ സ്ക്രീനിംഗ് ഫ്ലോചാർട്ടിൽ.തിരഞ്ഞെടുക്കലിന്റെ ഓരോ റൗണ്ടിലും, ഫേജുകൾ (അമ്പടയാളങ്ങൾക്കുള്ളിലെ അനിമൽ ഐഡന്റിഫയറുകൾ) ഇൻട്രാവെൻസായി കുത്തിവയ്ക്കപ്പെട്ടു.സെലക്ഷന്റെ നാലാമത്തെ റൗണ്ട് വരെ രണ്ട് സ്വതന്ത്ര ഇതര ശാഖകൾ (എ, ബി) വെവ്വേറെ സൂക്ഷിക്കുന്നു.സെലക്ഷൻ റൗണ്ടുകൾ 3, 4 എന്നിവയ്ക്കായി, CSF-ൽ നിന്ന് വേർതിരിച്ചെടുത്ത ഓരോ ഫാജ് ക്ലോണും സ്വമേധയാ ക്രമീകരിച്ചു.(ഡി) T7 പെപ്റ്റൈഡ് ലൈബ്രറിയുടെ (2 x 1012 ഫേജുകൾ/മൃഗങ്ങൾ) ഇൻട്രാവണസ് കുത്തിവയ്‌പ്പിന് ശേഷം രണ്ട് കാനുലേറ്റഡ് എലികളിൽ ആദ്യ റൗണ്ട് തിരഞ്ഞെടുക്കുമ്പോൾ, രക്തത്തിൽ നിന്നും (ചുവന്ന വൃത്തങ്ങൾ) സെറിബ്രോസ്പൈനൽ ദ്രാവകത്തിൽ നിന്നും (പച്ച ത്രികോണങ്ങൾ) വേർതിരിച്ചെടുത്ത ഫാജിന്റെ ചലനാത്മകത.ബ്ലൂ സ്ക്വയറുകൾ രക്തത്തിലെ ഫാജിന്റെ ശരാശരി പ്രാരംഭ സാന്ദ്രതയെ സൂചിപ്പിക്കുന്നു, മൊത്തം രക്തത്തിന്റെ അളവ് കണക്കിലെടുത്ത് കുത്തിവച്ച ഫാജിന്റെ അളവിൽ നിന്ന് കണക്കാക്കുന്നു.ബ്ലഡ് ഫേജ് സാന്ദ്രതയിൽ നിന്ന് എക്സ്ട്രാപോളേറ്റ് ചെയ്ത y ലൈനിന്റെ വിഭജന പോയിന്റിനെ കറുത്ത ചതുരങ്ങൾ സൂചിപ്പിക്കുന്നു.(e,f) പെപ്റ്റൈഡിൽ കാണപ്പെടുന്ന സാധ്യമായ എല്ലാ ഓവർലാപ്പിംഗ് ട്രൈപ്‌റ്റൈഡ് മോട്ടിഫുകളുടെയും ആപേക്ഷിക ആവൃത്തിയും വിതരണവും അവതരിപ്പിക്കുക.1000 റീഡിംഗുകളിൽ കണ്ടെത്തിയ മോട്ടിഫുകളുടെ എണ്ണം കാണിച്ചിരിക്കുന്നു.ശ്രദ്ധേയമായി (p <0.001) സമ്പുഷ്ടമാക്കിയ മോട്ടിഫുകൾ ചുവന്ന ഡോട്ടുകൾ കൊണ്ട് അടയാളപ്പെടുത്തിയിരിക്കുന്നു.(ഇ) ഇൻജക്‌റ്റ് ചെയ്‌ത ലൈബ്രറിയുടെ ട്രൈപ്‌റ്റൈഡ് മോട്ടിഫിന്റെ ആപേക്ഷിക ആവൃത്തിയും മൃഗങ്ങളിൽ നിന്നുള്ള രക്തത്തിൽ നിന്ന് ഉരുത്തിരിഞ്ഞ ഫേജും #1.1, #1.2 എന്നിവയുമായി താരതമ്യം ചെയ്യുന്ന പരസ്പരബന്ധം സ്‌കാറ്റർപ്ലോട്ട്.(എഫ്) രക്തത്തിലും സെറിബ്രോസ്പൈനൽ ദ്രവത്തിലും വേർതിരിക്കപ്പെടുന്ന അനിമൽ ഫേജ് ട്രൈപ്‌റ്റൈഡ് മോട്ടിഫുകളുടെ #1.1, #1.2 എന്നിവയുടെ ആപേക്ഷിക ആവൃത്തികളെ താരതമ്യം ചെയ്യുന്ന പരസ്പരബന്ധ സ്‌കാറ്റർപ്ലോട്ട്.(g, h) രണ്ട് മൃഗങ്ങളിലും ഒരു റൗണ്ട് ഇൻ വിവോ സെലക്ഷന് ശേഷം രക്തത്തിൽ (ജി) സമ്പുഷ്ടമായ ഫാജിന്റെ സീക്വൻസ് ഐഡി പ്രതിനിധാനം, ഇൻജക്‌റ്റ് ചെയ്‌ത ലൈബ്രറികൾ, സിഎസ്‌എഫ് (എച്ച്) എന്നിവയിൽ സമ്പുഷ്ടമാക്കിയ ഫാജുകൾ.ഒരു അക്ഷര കോഡിന്റെ വലിപ്പം ആ സ്ഥാനത്ത് എത്ര തവണ ആ അമിനോ ആസിഡ് സംഭവിക്കുന്നുവെന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്നു.പച്ച = ധ്രുവം, ധൂമ്രനൂൽ = ന്യൂട്രൽ, നീല = അടിസ്ഥാനം, ചുവപ്പ് = അമ്ലവും കറുപ്പ് = ഹൈഡ്രോഫോബിക് അമിനോ ആസിഡുകളും.ചിത്രം 1a, b രൂപകൽപ്പന ചെയ്തതും നിർമ്മിച്ചതും എഡ്വേർഡ് യൂറിച്ച് ആണ്.
ഞങ്ങൾ രണ്ട് CM ഇൻസ്ട്രുമെന്റ് എലികളിലേക്കും (ക്ലേഡുകൾ എ, ബി) സെറിബ്രോസ്പൈനൽ ദ്രാവകത്തിൽ നിന്നും രക്തത്തിൽ നിന്നും വേർതിരിച്ചെടുത്ത ഫേജിലേക്കും ഞങ്ങൾ ഒരു ഫാജ് പെപ്റ്റൈഡ് ലൈബ്രറി കുത്തിവച്ചു (ചിത്രം 1d).വൈൽഡ്-ടൈപ്പ് ഫേജുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ ലൈബ്രറിയുടെ പ്രാരംഭ ദ്രുത ക്ലിയറൻസ് വളരെ കുറവായിരുന്നു.രണ്ട് മൃഗങ്ങളിലും കുത്തിവച്ച ലൈബ്രറിയുടെ ശരാശരി അർദ്ധായുസ്സ് 24.8 മിനിറ്റ് രക്തത്തിൽ, വൈൽഡ്-ടൈപ്പ് ഫേജിന് സമാനമായതും, CSF-ൽ 38.5 മിനിറ്റും ആയിരുന്നു.ഓരോ മൃഗത്തിൽ നിന്നുമുള്ള രക്തവും സെറിബ്രോസ്പൈനൽ ഫ്ലൂയിഡ് ഫേജ് സാമ്പിളുകളും എച്ച്ടിഎസിന് വിധേയമാക്കി, തിരിച്ചറിഞ്ഞ എല്ലാ പെപ്റ്റൈഡുകളും ഒരു ഹ്രസ്വ ട്രൈപെപ്റ്റൈഡ് രൂപത്തിന്റെ സാന്നിധ്യത്തിനായി വിശകലനം ചെയ്തു.ട്രൈപെപ്റ്റൈഡ് മോട്ടിഫുകൾ തിരഞ്ഞെടുത്തത് അവ ഘടന രൂപീകരണത്തിനും പെപ്റ്റൈഡ്-പ്രോട്ടീൻ ഇടപെടലുകൾക്കും ഏറ്റവും കുറഞ്ഞ അടിസ്ഥാനം നൽകുന്നതിനാലാണ് 14,15.കുത്തിവച്ച ഫേജ് ലൈബ്രറിയും രണ്ട് മൃഗങ്ങളുടെയും രക്തത്തിൽ നിന്ന് വേർതിരിച്ചെടുത്ത ക്ലോണുകളും തമ്മിലുള്ള മോട്ടിഫുകളുടെ വിതരണത്തിൽ ഞങ്ങൾ നല്ല ബന്ധം കണ്ടെത്തി (ചിത്രം 1e).ഗ്രന്ഥശാലയുടെ ഘടന രക്ത കമ്പാർട്ടുമെന്റിൽ ചെറിയ അളവിൽ മാത്രമേ സമ്പുഷ്ടമായിട്ടുള്ളൂവെന്ന് ഡാറ്റ സൂചിപ്പിക്കുന്നു.Weblogo16 സോഫ്റ്റ്‌വെയറിന്റെ അഡാപ്റ്റേഷൻ ഉപയോഗിച്ച് ഓരോ സ്ഥാനത്തും അമിനോ ആസിഡ് ആവൃത്തികളും സമവായ ക്രമങ്ങളും കൂടുതൽ വിശകലനം ചെയ്തു.രസകരമെന്നു പറയട്ടെ, രക്തത്തിലെ ഗ്ലൈസിൻ അവശിഷ്ടങ്ങളിൽ ശക്തമായ സമ്പുഷ്ടീകരണം ഞങ്ങൾ കണ്ടെത്തി (ചിത്രം 1g).CSF-ൽ നിന്ന് തിരഞ്ഞെടുത്ത ക്ലോണുകളുമായി രക്തത്തെ താരതമ്യം ചെയ്തപ്പോൾ, ശക്തമായ തിരഞ്ഞെടുപ്പും ചില രൂപമാറ്റങ്ങളും നിരീക്ഷിച്ചു (ചിത്രം. 1f), 12-അംഗങ്ങളിൽ (ചിത്രം 1h) മുൻകൂട്ടി നിശ്ചയിച്ച സ്ഥാനങ്ങളിൽ ചില അമിനോ ആസിഡുകൾ മുൻഗണന നൽകുന്നു.ശ്രദ്ധേയമായി, സെറിബ്രോസ്പൈനൽ ദ്രാവകത്തിൽ വ്യക്തിഗത മൃഗങ്ങൾക്ക് കാര്യമായ വ്യത്യാസമുണ്ട്, അതേസമയം രണ്ട് മൃഗങ്ങളിലും രക്തത്തിലെ ഗ്ലൈസിൻ സമ്പുഷ്ടീകരണം നിരീക്ഷിക്കപ്പെട്ടു (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം. 4a-j).മൃഗങ്ങളുടെ #1.1, #1.2 സെറിബ്രോസ്പൈനൽ ഫ്ലൂയിഡിലെ സീക്വൻസ് ഡാറ്റയുടെ കർശനമായ ഫിൽട്ടറിംഗിന് ശേഷം, മൊത്തം 964, 420 അദ്വിതീയ 12-മെർ പെപ്റ്റൈഡുകൾ ലഭിച്ചു (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം. 1d-e).ഒറ്റപ്പെട്ട ഫേജ് ക്ലോണുകൾ വർദ്ധിപ്പിക്കുകയും വിവോ സെലക്ഷന്റെ രണ്ടാം റൗണ്ടിന് വിധേയമാക്കുകയും ചെയ്തു.രണ്ടാം റൗണ്ട് സെലക്ഷനിൽ നിന്ന് വേർതിരിച്ചെടുത്ത ഫേജുകൾ ഓരോ മൃഗത്തിലും HTS-ന് വിധേയമാക്കി, എല്ലാ തിരിച്ചറിഞ്ഞ പെപ്റ്റൈഡുകളും ട്രൈപ്‌റ്റൈഡ് മോട്ടിഫുകളുടെ സംഭവവികാസങ്ങൾ വിശകലനം ചെയ്യുന്നതിനായി ഒരു മോട്ടിഫ് റെക്കഗ്നിഷൻ പ്രോഗ്രാമിലേക്ക് ഇൻപുട്ടായി ഉപയോഗിച്ചു (ചിത്രം 2a, b, ef).CSF-ൽ നിന്ന് വീണ്ടെടുത്ത ഫേജിന്റെ ആദ്യ സൈക്കിളുമായി താരതമ്യം ചെയ്യുമ്പോൾ, A, B ശാഖകളിൽ CSF-ലെ പല രൂപഭാവങ്ങളും കൂടുതൽ തിരഞ്ഞെടുക്കുന്നതും ഒഴിവാക്കുന്നതും ഞങ്ങൾ നിരീക്ഷിച്ചു (ചിത്രം 2).സ്ഥിരമായ ക്രമത്തിന്റെ വ്യത്യസ്ത പാറ്റേണുകളെ അവ പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നുണ്ടോ എന്ന് നിർണ്ണയിക്കാൻ ഒരു നെറ്റ്‌വർക്ക് ഐഡന്റിഫിക്കേഷൻ അൽഗോരിതം പ്രയോഗിച്ചു.ഇതര ക്ലേഡ് എ (ചിത്രം 2 സി, ഡി), ക്ലേഡ് ബി (ചിത്രം 2 ജി, എച്ച്) എന്നിവയിൽ സിഎസ്എഫ് വീണ്ടെടുത്ത 12-ഡൈമൻഷണൽ സീക്വൻസുകൾ തമ്മിൽ വ്യക്തമായ സാമ്യം നിരീക്ഷിക്കപ്പെട്ടു.ഓരോ ബ്രാഞ്ചിലെയും പൂൾ ചെയ്ത വിശകലനം 12-മെർ പെപ്റ്റൈഡുകളുടെ (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം. 5c,d) വ്യത്യസ്ത സെലക്ഷൻ പ്രൊഫൈലുകളും ആദ്യ റൗണ്ട് സെലക്ഷനുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ രണ്ടാം റൗണ്ട് തിരഞ്ഞെടുപ്പിന് ശേഷം പൂൾ ചെയ്ത ക്ലോണുകളുടെ കാലക്രമേണ CSF/ബ്ലഡ് ടൈറ്റർ അനുപാതത്തിലെ വർദ്ധനവും വെളിപ്പെടുത്തി (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം. 5e).).
സെറിബ്രോസ്പൈനൽ ഫ്ലൂയിഡിലെ മോട്ടിഫുകളുടെയും പെപ്റ്റൈഡുകളുടെയും സമ്പുഷ്ടീകരണം, ഇൻ വിവോ ഫങ്ഷണൽ ഫെയ്ജ് ഡിസ്പ്ലേ സെലക്ഷന്റെ തുടർച്ചയായ രണ്ട് റൗണ്ടുകൾ.
ഓരോ മൃഗത്തിന്റെയും ആദ്യ റൗണ്ടിൽ നിന്ന് വീണ്ടെടുത്ത എല്ലാ സെറിബ്രോസ്പൈനൽ ഫ്ലൂയിഡ് ഫേജുകളും (മൃഗങ്ങൾ #1.1, #1.2) പൂൾ ചെയ്തു, ആംപ്ലിഫൈ ചെയ്തു, എച്ച്ടി-സീക്വൻസുചെയ്‌ത് ഒരുമിച്ച് വീണ്ടും കുത്തിവയ്ക്കപ്പെട്ടു (2 x 1010 ഫേജുകൾ/മൃഗങ്ങൾ) 2 എസ്എം കാനലേറ്റഡ് എലികൾ (#1.1 → #).2.1, 2.2, 1.2 → 2.3, 2.4).(a,b,e,f) ആദ്യത്തേയും രണ്ടാമത്തെയും സെലക്ഷൻ റൗണ്ടുകളിലെ എല്ലാ CSF-ഉത്ഭവിച്ച ഫേജുകളുടെയും ട്രൈപ്‌റ്റൈഡ് മോട്ടിഫുകളുടെ ആപേക്ഷിക ആവൃത്തി താരതമ്യം ചെയ്യുന്ന പരസ്പരബന്ധം സ്‌കാറ്റർപ്ലോട്ടുകൾ.രണ്ട് ഓറിയന്റേഷനുകളിലും പെപ്റ്റൈഡുകളിൽ കാണപ്പെടുന്ന എല്ലാ ഓവർലാപ്പിംഗ് ട്രൈപ്‌റ്റൈഡുകളേയും പ്രതിനിധീകരിക്കുന്ന മോട്ടിഫുകളുടെ ആപേക്ഷിക ആവൃത്തിയും വിതരണവും.1000 റീഡിംഗുകളിൽ കണ്ടെത്തിയ മോട്ടിഫുകളുടെ എണ്ണം കാണിച്ചിരിക്കുന്നു.താരതമ്യപ്പെടുത്തിയ ലൈബ്രറികളിലൊന്നിൽ ഗണ്യമായി (p <0.001) തിരഞ്ഞെടുത്തതോ ഒഴിവാക്കിയതോ ആയ മോട്ടിഫുകൾ ചുവന്ന ഡോട്ടുകൾ ഉപയോഗിച്ച് ഹൈലൈറ്റ് ചെയ്തിരിക്കുന്നു.(c, d, g, h) വിവോ സെലക്ഷനിലെ റൗണ്ടുകൾ 2, 1 എന്നിവയെ അടിസ്ഥാനമാക്കി എല്ലാ CSF-സമ്പന്നമായ 12 അമിനോ ആസിഡ് ദൈർഘ്യമുള്ള സീക്വൻസുകളുടെയും സീക്വൻസ് ലോഗോ പ്രാതിനിധ്യം.ഒരു അക്ഷര കോഡിന്റെ വലിപ്പം ആ സ്ഥാനത്ത് എത്ര തവണ ആ അമിനോ ആസിഡ് സംഭവിക്കുന്നുവെന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്നു.ലോഗോയെ പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നതിന്, രണ്ട് സെലക്ഷൻ റൗണ്ടുകൾക്കിടയിൽ വ്യക്തിഗത മൃഗങ്ങളിൽ നിന്ന് വേർതിരിച്ചെടുത്ത CSF സീക്വൻസുകളുടെ ആവൃത്തി താരതമ്യം ചെയ്യുകയും രണ്ടാം റൗണ്ടിലെ സമ്പുഷ്ടമായ സീക്വൻസുകൾ കാണിക്കുകയും ചെയ്യുന്നു: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3, (h) #1.2–#2.4.(c, d) മൃഗങ്ങളിൽ നൽകിയിരിക്കുന്ന സ്ഥാനത്ത് ഏറ്റവും സമ്പുഷ്ടമായ അമിനോ ആസിഡുകൾ.2.1, നമ്പർ.മൃഗങ്ങളിൽ 2.2 അല്ലെങ്കിൽ (ജി, എച്ച്).2.3, നമ്പർ.2.4 നിറത്തിൽ കാണിച്ചിരിക്കുന്നു.പച്ച = ധ്രുവം, ധൂമ്രനൂൽ = ന്യൂട്രൽ, നീല = അടിസ്ഥാനം, ചുവപ്പ് = അമ്ലവും കറുപ്പ് = ഹൈഡ്രോഫോബിക് അമിനോ ആസിഡുകളും.
മൂന്നാം റൗണ്ട് തിരഞ്ഞെടുപ്പിന് ശേഷം, രണ്ട് മൃഗങ്ങളിൽ നിന്ന് വേർതിരിച്ചെടുത്ത 332 CSF-പുനർനിർമ്മിച്ച ഫാജ് ക്ലോണുകളിൽ നിന്ന് 124 അദ്വിതീയ പെപ്റ്റൈഡ് സീക്വൻസുകൾ (#3.1, #3.2) ഞങ്ങൾ തിരിച്ചറിഞ്ഞു (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം 6a).LGSVS (18.7%) എന്ന ശ്രേണിക്ക് ഏറ്റവും ഉയർന്ന ആപേക്ഷിക അനുപാതമുണ്ട്, തുടർന്ന് PAGISRELVDKL (8.2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2.2%), SARGSWREIVSLS (2.2%) എന്ന വൈൽഡ്-ടൈപ്പ് ഇൻസെർട്ടുകൾ.അവസാന നാലാമത്തെ റൗണ്ടിൽ, മൂന്ന് വ്യത്യസ്ത മൃഗങ്ങളിൽ നിന്ന് സ്വതന്ത്രമായി തിരഞ്ഞെടുത്ത രണ്ട് ശാഖകൾ ഞങ്ങൾ ശേഖരിക്കുന്നു (ചിത്രം 1 സി).CSF-ൽ നിന്ന് വീണ്ടെടുത്ത 925 സീക്വൻസ്ഡ് ഫേജ് ക്ലോണുകളിൽ, നാലാം റൗണ്ടിൽ ഞങ്ങൾ 64 അദ്വിതീയ പെപ്റ്റൈഡ് സീക്വൻസുകൾ (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം. 6b) കണ്ടെത്തി, അവയിൽ വൈൽഡ്-ടൈപ്പ് ഫേജിന്റെ ആപേക്ഷിക അനുപാതം 0.8% ആയി കുറഞ്ഞു.നാലാം റൗണ്ടിലെ ഏറ്റവും സാധാരണമായ CSF ക്ലോണുകൾ LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC, RPQKINGARVC (3.6%) എസ്ഡി (3.6%) എന്നിവയായിരുന്നു.%)).NNK ലൈബ്രറി രൂപകല്പനയ്ക്കായി ഡീജനറേറ്റ് കോഡണുകൾ ഉപയോഗിക്കുമ്പോൾ, ലൈബ്രറി പ്രൈമറുകളിൽ ന്യൂക്ലിയോടൈഡ് ഉൾപ്പെടുത്തലുകൾ/ഇല്ലാതാക്കലുകൾ അല്ലെങ്കിൽ അകാല സ്റ്റോപ്പ് കോഡണുകൾ എന്നിവ മൂലമാണ് തിരഞ്ഞെടുത്ത പെപ്റ്റൈഡുകളുടെ ദൈർഘ്യ പരിധി.അകാല സ്റ്റോപ്പ് കോഡണുകൾ ചെറിയ പെപ്റ്റൈഡുകൾ സൃഷ്ടിക്കുന്നു, അവയിൽ അനുകൂലമായ aa മോട്ടിഫ് അടങ്ങിയിരിക്കുന്നതിനാൽ അവ തിരഞ്ഞെടുക്കപ്പെടുന്നു.ദൈർഘ്യമേറിയ പെപ്റ്റൈഡുകൾ സിന്തറ്റിക് ലൈബ്രറികളുടെ പ്രൈമറുകളിൽ ഉൾപ്പെടുത്തലുകൾ/ഇല്ലാതാക്കലുകളുടെ ഫലമായി ഉണ്ടായേക്കാം.ഇത് രൂപകൽപ്പന ചെയ്ത സ്റ്റോപ്പ് കോഡണിനെ ഫ്രെയിമിന് പുറത്ത് സ്ഥാപിക്കുകയും ഒരു പുതിയ സ്റ്റോപ്പ് കോഡൺ താഴേക്ക് ദൃശ്യമാകുന്നതുവരെ അത് വായിക്കുകയും ചെയ്യുന്നു.പൊതുവേ, ഇൻപുട്ട് ഡാറ്റയെ സാമ്പിൾ ഔട്ട്‌പുട്ട് ഡാറ്റയുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തി നാല് സെലക്ഷൻ റൗണ്ടുകൾക്കുമുള്ള സമ്പുഷ്ടീകരണ ഘടകങ്ങൾ ഞങ്ങൾ കണക്കാക്കുന്നു.ആദ്യ റൗണ്ട് സ്ക്രീനിംഗിനായി, ഞങ്ങൾ വൈൽഡ്-ടൈപ്പ് ഫാജ് ടൈറ്ററുകൾ ഒരു നോൺ-സ്പെസിഫിക് പശ്ചാത്തല റഫറൻസായി ഉപയോഗിച്ചു.രസകരമെന്നു പറയട്ടെ, ആദ്യ CSF സൈക്കിളിൽ നെഗറ്റീവ് ഫേജ് തിരഞ്ഞെടുക്കൽ വളരെ ശക്തമായിരുന്നു, പക്ഷേ രക്തത്തിലല്ല (ചിത്രം 3a), ഇത് പെപ്റ്റൈഡ് ലൈബ്രറിയിലെ മിക്ക അംഗങ്ങളുടെയും CSF കമ്പാർട്ടുമെന്റിലേക്കോ ആപേക്ഷിക ഫേജുകളിലേക്കോ നിഷ്ക്രിയ വ്യാപനത്തിന്റെ കുറഞ്ഞ സംഭാവ്യത മൂലമാകാം.എന്നിരുന്നാലും, രണ്ടാം റൗണ്ട് പാനിംഗിൽ, രണ്ട് ക്ലേഡുകളിലും CSF-ലെ ഫേജുകളുടെ ശക്തമായ സെലക്ഷൻ നിരീക്ഷിക്കപ്പെട്ടു, മുൻ റൗണ്ട് CSF ആപ്തീകരണത്തെ പ്രോത്സാഹിപ്പിക്കുന്ന പെപ്റ്റൈഡുകൾ പ്രദർശിപ്പിക്കുന്ന ഫേജുകളാൽ സമ്പുഷ്ടമായിരുന്നു (ചിത്രം 3a).വീണ്ടും, കാര്യമായ രക്ത സമ്പുഷ്ടീകരണമില്ലാതെ.മൂന്നാമത്തെയും നാലാമത്തെയും റൗണ്ടുകളിൽ, ഫാജ് ക്ലോണുകൾ CSF-ൽ ഗണ്യമായി സമ്പുഷ്ടമാക്കി.തിരഞ്ഞെടുക്കലിന്റെ അവസാന രണ്ട് റൗണ്ടുകൾക്കിടയിലുള്ള ഓരോ അദ്വിതീയ പെപ്റ്റൈഡ് സീക്വൻസിന്റെയും ആപേക്ഷിക ആവൃത്തി താരതമ്യം ചെയ്യുമ്പോൾ, നാലാം റൗണ്ട് സെലക്ഷനിൽ സീക്വൻസുകൾ കൂടുതൽ സമ്പന്നമാണെന്ന് ഞങ്ങൾ കണ്ടെത്തി (ചിത്രം 3 ബി).രണ്ട് പെപ്റ്റൈഡ് ഓറിയന്റേഷനുകളും ഉപയോഗിച്ച് എല്ലാ 64 തനതായ പെപ്റ്റൈഡ് സീക്വൻസുകളിൽ നിന്നും ആകെ 931 ട്രൈപെപ്റ്റൈഡ് മോട്ടിഫുകൾ വേർതിരിച്ചെടുത്തു.നാലാമത്തെ റൗണ്ടിലെ ഏറ്റവും സമ്പുഷ്ടമായ മോട്ടിഫുകൾ കുത്തിവച്ച ലൈബ്രറിയുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ എല്ലാ റൗണ്ടുകളിലുമുള്ള അവയുടെ സമ്പുഷ്ടീകരണ പ്രൊഫൈലുകൾ കൂടുതൽ സൂക്ഷ്മമായി പരിശോധിച്ചു (കട്ട്-ഓഫ്: 10% സമ്പുഷ്ടീകരണം) (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം. 6c).രണ്ട് സെലക്ഷൻ ബ്രാഞ്ചുകളുടെയും മുമ്പത്തെ എല്ലാ റൗണ്ടുകളിലും പഠിച്ച ഉദ്ദേശ്യങ്ങളിൽ ഭൂരിഭാഗവും സമ്പുഷ്ടമാണെന്ന് തിരഞ്ഞെടുക്കലിന്റെ പൊതുവായ പാറ്റേണുകൾ കാണിച്ചു.എന്നിരുന്നാലും, ചില മോട്ടിഫുകൾ (ഉദാ. SGL, VSG, LGS GSV) പ്രധാനമായും ഇതര ക്ലേഡ് എയിൽ നിന്നുള്ളവയാണ്, മറ്റുള്ളവ (ഉദാ. FGW, RTN, WGF, NTR) ബദൽ ക്ലേഡ് ബിയിൽ സമ്പുഷ്ടമാണ്.
സ്‌ട്രെപ്റ്റാവിഡിൻ പേലോഡുകളുമായി സംയോജിപ്പിച്ച് സിഎസ്‌എഫ്-സമ്പുഷ്ടമാക്കിയ ഫെയ്‌ജ്-ഡിസ്‌പ്ലേഡ് പെപ്റ്റൈഡുകളുടെയും ബയോട്ടിനൈലേറ്റഡ് ലീഡർ പെപ്റ്റൈഡുകളുടെയും സിഎസ്‌എഫ് ഗതാഗതത്തിന്റെ മൂല്യനിർണ്ണയം.
(എ) നാല് റൗണ്ടുകളിലും (R1-R4) കണക്കാക്കിയ സമ്പുഷ്ടീകരണ അനുപാതങ്ങൾ കുത്തിവച്ച (ഇൻപുട്ട് = I) ഫേജ് (PFU) ടൈറ്ററുകളും നിർണ്ണയിച്ച CSF ഫേജ് ടൈറ്ററുകളും (ഔട്ട്പുട്ട് = O) അടിസ്ഥാനമാക്കിയാണ്.കഴിഞ്ഞ മൂന്ന് റൗണ്ടുകളുടെ (R2-R4) സമ്പുഷ്ടീകരണ ഘടകങ്ങൾ മുൻ റൗണ്ടും ആദ്യ റൗണ്ടും (R1) വെയ്റ്റ് ഡാറ്റയുമായി താരതമ്യം ചെയ്താണ് കണക്കാക്കിയത്.തുറന്ന ബാറുകൾ സെറിബ്രോസ്പൈനൽ ദ്രാവകമാണ്, ഷേഡുള്ള ബാറുകൾ പ്ലാസ്മയാണ്.(***p<0.001, വിദ്യാർത്ഥികളുടെ ടി-ടെസ്റ്റ് അടിസ്ഥാനമാക്കി).(ബി) സെലക്ഷൻ 4-ാം റൗണ്ടിന് ശേഷം CSF-ൽ ശേഖരിച്ച എല്ലാ ഫേജുകളുടെയും ആപേക്ഷിക അനുപാതം അനുസരിച്ച് റാങ്ക് ചെയ്ത ഏറ്റവും സമൃദ്ധമായ ഫാജ് പെപ്റ്റൈഡുകളുടെ ലിസ്റ്റ്.ഏറ്റവും സാധാരണമായ ആറ് ഫേജ് ക്ലോണുകൾ വർണ്ണത്തിലും അക്കത്തിലും അവയുടെ സമ്പുഷ്ടീകരണ ഘടകങ്ങളിലും 3-ഉം 4-ഉം റൗണ്ടുകൾക്കിടയിൽ (ഇൻസെറ്റുകൾ) ഹൈലൈറ്റ് ചെയ്തിട്ടുണ്ട്.(c,d) റൗണ്ട് 4-ൽ നിന്നുള്ള ഏറ്റവും സമ്പുഷ്ടമായ ആറ് ഫേജ് ക്ലോണുകൾ, ശൂന്യമായ ഫേജ്, പാരന്റൽ ഫേജ് പെപ്റ്റൈഡ് ലൈബ്രറികൾ എന്നിവ ഒരു CSF സാമ്പിൾ മോഡലിൽ വ്യക്തിഗതമായി വിശകലനം ചെയ്തു.സിഎസ്എഫും രക്തസാമ്പിളുകളും സൂചിപ്പിച്ച സമയ പോയിന്റുകളിൽ ശേഖരിച്ചു..കാലക്രമേണ കുത്തിവച്ച ഓരോ ഫാജ് ക്ലോണിന്റെയും ഫേജ് പെപ്റ്റൈഡ് ലൈബ്രറിയുടെയും CSF ഫാർമക്കോകിനറ്റിക്സ് കാണിക്കുന്നു.(d) സാമ്പിളിംഗ് സമയത്ത് വീണ്ടെടുക്കപ്പെട്ട എല്ലാ phages/mL-ന്റെ ശരാശരി CSF/രക്ത അനുപാതം കാണിക്കുന്നു.(ഇ) നാല് സിന്തറ്റിക് ലീഡർ പെപ്റ്റൈഡുകളും ഒരു സ്ക്രാംബിൾഡ് കൺട്രോളും ബയോട്ടിനുമായി അവയുടെ എൻ-ടെർമിനസ് (ടെട്രാമർ ഡിസ്പ്ലേ) വഴി സ്ട്രെപ്റ്റാവിഡിനുമായി ബന്ധിപ്പിച്ചു, തുടർന്ന് കുത്തിവയ്പ്പും (ടെയിൽ വെയിൻ iv, 10 മില്ലിഗ്രാം സ്ട്രെപ്റ്റാവിഡിൻ/കിലോഗ്രാം).കുറഞ്ഞത് മൂന്ന് ഇൻട്യൂബേറ്റഡ് എലികൾ (N = 3).).സൂചിപ്പിച്ച സമയ പോയിന്റുകളിൽ CSF സാമ്പിളുകൾ ശേഖരിക്കുകയും സ്ട്രെപ്റ്റാവിഡിൻ സാന്ദ്രത CSF ആന്റി-സ്ട്രെപ്റ്റാവിഡിൻ ELISA (nd = കണ്ടുപിടിക്കപ്പെട്ടിട്ടില്ല) അളക്കുകയും ചെയ്തു.(*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ANOVA ടെസ്റ്റിനെ അടിസ്ഥാനമാക്കി).(എഫ്) ഏറ്റവും സമ്പുഷ്ടമായ ഫെയ്‌ജ് പെപ്‌റ്റൈഡ് ക്ലോണിന്റെ #2002 (പർപ്പിൾ) അമിനോ ആസിഡ് സീക്വൻസിന്റെ നാലാം റൗണ്ട് സെലക്ഷനിൽ നിന്ന് തിരഞ്ഞെടുത്ത മറ്റ് ഫെയ്‌ജ് പെപ്റ്റൈഡ് ക്ലോണുകളുമായുള്ള താരതമ്യം.സമാനവും സമാനവുമായ അമിനോ ആസിഡ് ശകലങ്ങൾ വർണ്ണ കോഡുചെയ്തവയാണ്.
നാലാം റൗണ്ടിലെ എല്ലാ സമ്പുഷ്ടമായ ഫേജുകളിൽ നിന്നും (ചിത്രം 3 ബി), CSF സാമ്പിൾ മോഡലിൽ കൂടുതൽ വ്യക്തിഗത വിശകലനത്തിനായി ആറ് കാൻഡിഡേറ്റ് ക്ലോണുകൾ തിരഞ്ഞെടുത്തു.ആറ് കാൻഡിഡേറ്റ് ഫേജ്, ശൂന്യമായ ഫേജ് (ഇൻസേർട്ട് ഇല്ല), പ്രോഫേജ് പെപ്റ്റൈഡ് ലൈബ്രറികൾ എന്നിവയുടെ തുല്യ അളവിൽ മൂന്ന് കാന്യൂലേറ്റഡ് സിഎം മൃഗങ്ങളിലേക്ക് കുത്തിവയ്ക്കപ്പെട്ടു, കൂടാതെ CSF (ചിത്രം 3 സി), രക്തം (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം 7) പരിശോധനകളിൽ ഫാർമക്കോകിനറ്റിക്സ് നിർണ്ണയിക്കപ്പെട്ടു.പരീക്ഷിച്ച എല്ലാ ഫേജ് ക്ലോണുകളും സിഎസ്എഫ് കമ്പാർട്ട്മെന്റിനെ ലക്ഷ്യമാക്കി ശൂന്യമായ കൺട്രോൾ ഫേജിനേക്കാൾ 10-1000 മടങ്ങ് ഉയർന്ന തലത്തിലാണ് (#1779).ഉദാഹരണത്തിന്, #2020, #2077 എന്നീ ക്ലോണുകൾക്ക് കൺട്രോൾ ഫേജിനേക്കാൾ 1000 മടങ്ങ് ഉയർന്ന CSF ടൈറ്ററുകൾ ഉണ്ടായിരുന്നു.തിരഞ്ഞെടുത്ത ഓരോ പെപ്റ്റൈഡിന്റെയും ഫാർമക്കോകൈനറ്റിക് പ്രൊഫൈൽ വ്യത്യസ്തമാണ്, എന്നാൽ അവയ്‌ക്കെല്ലാം ഉയർന്ന CSF ഹോമിംഗ് കഴിവുണ്ട്.#1903, #2011 എന്നീ ക്ലോണുകൾക്ക് കാലക്രമേണ സ്ഥിരമായ കുറവ് ഞങ്ങൾ നിരീക്ഷിച്ചു, അതേസമയം #2077, #2002, #2009 എന്നീ ക്ലോണുകളുടെ ആദ്യ 10 മിനിറ്റിനുള്ളിലെ വർദ്ധനവ് സജീവമായ ഗതാഗതത്തെ സൂചിപ്പിക്കുമെങ്കിലും അത് പരിശോധിക്കേണ്ടതുണ്ട്.ക്ലോണുകൾ #2020, #2002, #2077 എന്നിവ ഉയർന്ന തലത്തിൽ സ്ഥിരത കൈവരിച്ചു, അതേസമയം ക്ലോണിന്റെ #2009 ന്റെ CSF കോൺസൺട്രേഷൻ പ്രാരംഭ വർദ്ധനവിന് ശേഷം പതുക്കെ കുറഞ്ഞു.ഓരോ സി‌എസ്‌എഫ് കാൻഡിഡേറ്റിന്റെയും ആപേക്ഷിക ആവൃത്തിയെ ഞങ്ങൾ അതിന്റെ രക്ത സാന്ദ്രതയുമായി താരതമ്യം ചെയ്തു (ചിത്രം 3 ഡി).ഓരോ സി‌എസ്‌എഫ് സ്ഥാനാർത്ഥിയുടെയും ശരാശരി ടൈറ്ററിന്റെ എല്ലാ സാമ്പിൾ സമയങ്ങളിലും അതിന്റെ ബ്ലഡ് ടൈറ്ററിന്റെ പരസ്പരബന്ധം കാണിക്കുന്നത് ആറ് സ്ഥാനാർത്ഥികളിൽ മൂന്ന് പേരും രക്ത സി‌എസ്‌എഫിൽ ഗണ്യമായി സമ്പുഷ്ടമാണെന്ന്.രസകരമെന്നു പറയട്ടെ, ക്ലോൺ #2077 ഉയർന്ന രക്ത സ്ഥിരത കാണിച്ചു (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം 7).CSF കമ്പാർട്ടുമെന്റിലേക്ക് ഫാജ് കണങ്ങൾ ഒഴികെയുള്ള ചരക്കുകൾ സജീവമായി കൊണ്ടുപോകാൻ പെപ്റ്റൈഡുകൾക്ക് തന്നെ കഴിയുമെന്ന് സ്ഥിരീകരിക്കാൻ, പെപ്റ്റൈഡുകൾ ഫാജ് കണവുമായി ബന്ധിപ്പിക്കുന്ന എൻ-ടെർമിനസിൽ ബയോട്ടിൻ ഉപയോഗിച്ച് ഡെറിവേറ്റൈസ് ചെയ്ത നാല് ലീഡർ പെപ്റ്റൈഡുകൾ ഞങ്ങൾ സമന്വയിപ്പിച്ചു.ബയോട്ടിനൈലേറ്റഡ് പെപ്റ്റൈഡുകൾ (നമ്പർ 2002, 2009, 2020, 2077) സ്ട്രെപ്റ്റാവിഡിൻ (എസ്‌എ) യുമായി സംയോജിപ്പിച്ച്, ഫേജ് ജ്യാമിതിയെ അനുകരിക്കുന്ന മൾട്ടിമെറിക് രൂപങ്ങൾ ലഭിക്കും.കാർഗോ ട്രാൻസ്പോർട്ടിംഗ് പ്രോട്ടീൻ പെപ്റ്റൈഡുകളായി രക്തത്തിലും സെറിബ്രോസ്പൈനൽ ദ്രാവകത്തിലും എസ്എ എക്സ്പോഷർ അളക്കാനും ഈ ഫോർമാറ്റ് ഞങ്ങളെ അനുവദിച്ചു.പ്രധാനമായും, ഈ SA-സംയോജിത ഫോർമാറ്റിൽ (ചിത്രം 3e) സിന്തറ്റിക് പെപ്റ്റൈഡുകൾ നൽകുമ്പോൾ ഫാജ് ഡാറ്റ പലപ്പോഴും പുനർനിർമ്മിക്കാവുന്നതാണ്.സ്‌ക്രാംബിൾഡ് പെപ്റ്റൈഡുകൾക്ക് പ്രാരംഭ എക്സ്പോഷർ കുറവും 48 മണിക്കൂറിനുള്ളിൽ കണ്ടെത്താനാകാത്ത അളവുകളുള്ള വേഗത്തിലുള്ള CSF ക്ലിയറൻസും ഉണ്ടായിരുന്നു.CSF സ്‌പെയ്‌സിലേക്കുള്ള ഈ പെപ്‌റ്റൈഡ് ഫേജ് ക്ലോണുകളുടെ ഡെലിവറി പാതകളെക്കുറിച്ച് ഉൾക്കാഴ്‌ച നേടുന്നതിന്, വിവോയിലെ ഇൻട്രാവണസ് കുത്തിവയ്‌പ്പിന് 1 മണിക്കൂർ കഴിഞ്ഞ് ഫാേജ് കണങ്ങളെ നേരിട്ട് കണ്ടെത്തുന്നതിന് ഇമ്മ്യൂണോഹിസ്റ്റോകെമിസ്ട്രി (ഐഎച്ച്‌സി) ഉപയോഗിച്ച് വ്യക്തിഗത ഫാേജ് പെപ്റ്റൈഡ് ഹിറ്റുകളുടെ പ്രാദേശികവൽക്കരണം ഞങ്ങൾ വിശകലനം ചെയ്തു.ശ്രദ്ധേയമായി, ക്ലോണുകൾ #2002, #2077, #2009 എന്നിവ ബ്രെയിൻ കാപ്പിലറികളിലെ ശക്തമായ കറയാൽ കണ്ടെത്താനാകും, അതേസമയം കൺട്രോൾ ഫേജും (#1779) ക്ലോണും #2020 കണ്ടെത്താനായില്ല (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം 8).ഇത് സൂചിപ്പിക്കുന്നത് ഈ പെപ്റ്റൈഡുകൾ BBB ക്രോസ് ചെയ്യുന്നതിലൂടെ മസ്തിഷ്കത്തിൽ സ്വാധീനം ചെലുത്തുന്നു എന്നാണ്.ഈ സിദ്ധാന്തം പരിശോധിക്കുന്നതിന് കൂടുതൽ വിശദമായ വിശകലനം ആവശ്യമാണ്, കാരണം BSCFB റൂട്ടും ഉൾപ്പെട്ടേക്കാം.തിരഞ്ഞെടുത്ത മറ്റ് പെപ്റ്റൈഡുകളുമായി ഏറ്റവും സമ്പുഷ്ടമായ ക്ലോണിന്റെ (#2002) അമിനോ ആസിഡ് ശ്രേണി താരതമ്യം ചെയ്യുമ്പോൾ, അവയിൽ ചിലതിന് സമാനമായ അമിനോ ആസിഡ് വിപുലീകരണങ്ങളുണ്ടെന്ന് ശ്രദ്ധിക്കപ്പെട്ടു, ഇത് സമാനമായ ഗതാഗത സംവിധാനത്തെ സൂചിപ്പിക്കാം (ചിത്രം 3f).
അതിന്റെ തനതായ പ്ലാസ്മ പ്രൊഫൈലും കാലക്രമേണ CSF-ൽ ഗണ്യമായ വർദ്ധനവും കാരണം, 48-മണിക്കൂറിനുള്ളിൽ ഫേജ് ഡിസ്പ്ലേ ക്ലോൺ #2077 കൂടുതൽ പര്യവേക്ഷണം ചെയ്യപ്പെടുകയും സുസ്ഥിരമായ SA ലെവലുമായി ബന്ധപ്പെട്ട് CSF-ന്റെ ദ്രുതഗതിയിലുള്ള വർദ്ധനവ് പുനർനിർമ്മിക്കാൻ സാധിച്ചു (ചിത്രം 4a).തിരിച്ചറിഞ്ഞ മറ്റ് ഫേജ് ക്ലോണുകളെ സംബന്ധിച്ചിടത്തോളം, #2077 മസ്തിഷ്ക കാപ്പിലറികൾക്ക് ശക്തമായി നിറം നൽകി, ഉയർന്ന റെസല്യൂഷനിൽ കാണുമ്പോൾ കാപ്പിലറി മാർക്കർ ലെക്റ്റിനുമായി കാര്യമായ കൊളോക്കലൈസേഷൻ കാണിക്കുകയും പാരൻചൈമൽ സ്‌പെയ്‌സിൽ ചില പാടുകൾ ഉണ്ടാകുകയും ചെയ്തു (ചിത്രം 4 ബി).സിഎൻഎസിൽ പെപ്റ്റൈഡ്-മെഡിയേറ്റഡ് ഫാർമക്കോളജിക്കൽ ഇഫക്റ്റുകൾ ലഭിക്കുമോ എന്ന് അന്വേഷിക്കാൻ, ഞങ്ങൾ ഒരു പരീക്ഷണം നടത്തി, അതിൽ i) #2077 ട്രാൻസിറ്റ് പെപ്റ്റൈഡും ii) BACE1 ഇൻഹിബിറ്റർ പെപ്റ്റൈഡും രണ്ട് വ്യത്യസ്ത അനുപാതങ്ങളിൽ SA-യുമായി കലർത്തി.ഒരു കോമ്പിനേഷനായി ഞങ്ങൾ BACE1 പെപ്റ്റൈഡ് ഇൻഹിബിറ്റർ മാത്രം ഉപയോഗിച്ചു, മറ്റൊന്നിന് BACE1 പെപ്റ്റൈഡ് ഇൻഹിബിറ്ററിന്റെ 1:3 അനുപാതം #2077 പെപ്റ്റൈഡിലേക്ക് ഉപയോഗിച്ചു.രണ്ട് സാമ്പിളുകളും ഇൻട്രാവണസ് ആയി നൽകുകയും ബീറ്റാ-അമിലോയ്ഡ് പെപ്റ്റൈഡ് 40 (അബെറ്റ 40) ന്റെ രക്തത്തിന്റെയും സെറിബ്രോസ്പൈനൽ ദ്രാവകത്തിന്റെയും അളവ് കാലക്രമേണ അളക്കുകയും ചെയ്തു.മസ്തിഷ്ക പാരൻചൈമയിലെ BACE1 തടസ്സത്തെ പ്രതിഫലിപ്പിക്കുന്നതിനാൽ CSF-ൽ Abeta40 അളന്നു.പ്രതീക്ഷിച്ചതുപോലെ, രണ്ട് കോംപ്ലക്സുകളും Abeta40 ന്റെ രക്തത്തിന്റെ അളവ് ഗണ്യമായി കുറച്ചു (ചിത്രം 4c, d).എന്നിരുന്നാലും, പെപ്റ്റൈഡ് സംഖ്യയുടെ മിശ്രിതം അടങ്ങിയ സാമ്പിളുകൾ മാത്രം.2077, BACE1 പെപ്റ്റൈഡിന്റെ ഇൻഹിബിറ്റർ SA യുമായി സംയോജിപ്പിച്ചത് സെറിബ്രോസ്പൈനൽ ദ്രാവകത്തിൽ Abeta40-ൽ ഗണ്യമായ കുറവുണ്ടാക്കി (ചിത്രം 4c).ഡാറ്റ കാണിക്കുന്നത് പെപ്റ്റൈഡ് നമ്പർ.2077 ന് 60 kDa SA പ്രോട്ടീൻ CNS-ലേക്ക് കൊണ്ടുപോകാൻ കഴിയും, കൂടാതെ BACE1 പെപ്റ്റൈഡിന്റെ SA- സംയോജിത ഇൻഹിബിറ്ററുകൾ ഉപയോഗിച്ച് ഫാർമക്കോളജിക്കൽ ഇഫക്റ്റുകൾ പ്രേരിപ്പിക്കുകയും ചെയ്യുന്നു.
(a) CSF പെപ്റ്റൈഡ് #2077 (RLSSVDSDLSGC) ന്റെ ദീർഘകാല ഫാർമക്കോകൈനറ്റിക് പ്രൊഫൈലുകൾ കാണിക്കുന്ന T7 ഫേജിന്റെ ക്ലോണൽ കുത്തിവയ്പ്പ് (2 × 10 ഫേജുകൾ/മൃഗങ്ങൾ), കുറഞ്ഞത് മൂന്ന് CM-intubated എലികളിൽ ഇൻജക്റ്റ് ചെയ്യാത്ത കൺട്രോൾ ഫേജും (#1779).(ബി) പെപ്റ്റൈഡ് #2077-ന്റെയും പാത്രങ്ങളുടെയും (ലെക്റ്റിൻ) കൌണ്ടർസ്റ്റൈനിംഗ് കാണിക്കുന്ന ഫെയ്ജ്-ഇഞ്ചെക്റ്റഡ് എലികളിലെ (2 × 10 10 ഫേജുകൾ/മൃഗങ്ങൾ) കോർട്ടിക്കൽ മൈക്രോവെസലുകളുടെ കോൺഫോക്കൽ മൈക്രോസ്കോപ്പിക് ചിത്രം.ഈ ഫാജ് ക്ലോണുകൾ 3 എലികൾക്ക് നൽകുകയും പെർഫ്യൂഷന് മുമ്പ് 1 മണിക്കൂർ പ്രചരിക്കാൻ അനുവദിക്കുകയും ചെയ്തു.T7 phage capsid-ന് എതിരെ പോളിക്ലോണൽ FITC-ലേബൽ ചെയ്ത ആന്റിബോഡികൾ ഉപയോഗിച്ച് തലച്ചോറുകൾ വിഭജിക്കപ്പെടുകയും സ്റ്റെയിൻ ചെയ്യുകയും ചെയ്തു.പെർഫ്യൂഷനും തുടർന്നുള്ള ഫിക്സേഷനും പത്ത് മിനിറ്റ് മുമ്പ്, DyLight594-ലേബൽ ചെയ്ത ലെക്റ്റിൻ ഇൻട്രാവെൻസായി നൽകപ്പെട്ടു.കാപ്പിലറികളുടെയും പെരിവാസ്കുലർ മസ്തിഷ്ക കോശങ്ങളുടെയും ല്യൂമനിലെ മൈക്രോവെസലുകളുടെയും ഫേജുകളുടെയും (പച്ച) ലുമിനൽ വശത്തെ ലെക്റ്റിൻ സ്റ്റെയിനിംഗ് (ചുവപ്പ്) കാണിക്കുന്ന ഫ്ലൂറസെന്റ് ചിത്രങ്ങൾ.സ്കെയിൽ ബാർ 10 µm ആണ്.(c, d) ബയോട്ടിനൈലേറ്റഡ് BACE1 ഇൻഹിബിറ്ററി പെപ്റ്റൈഡ് ഒറ്റയ്‌ക്കോ ബയോട്ടിനൈലേറ്റഡ് ട്രാൻസിറ്റ് പെപ്റ്റൈഡ് #2077 മായി സംയോജിപ്പിച്ചോ സ്‌ട്രെപ്റ്റാവിഡിനുമായി യോജിപ്പിച്ചു, തുടർന്ന് കുറഞ്ഞത് മൂന്ന് കാനുലേറ്റഡ് സിഎം എലികളുടെ (10 മില്ലിഗ്രാം സ്‌ട്രെപ്റ്റാവിഡിൻ/കിലോ) ഇൻട്രാവണസ് കുത്തിവയ്‌പ്പ് നടത്തി.Aβ40-ലെ BACE1 പെപ്റ്റൈഡ് ഇൻഹിബിറ്റർ-മെഡിയേറ്റഡ് റിഡക്ഷൻ Aβ1-40 ELISA രക്തത്തിലും (ചുവപ്പ്), സെറിബ്രോസ്പൈനൽ ദ്രാവകത്തിലും (ഓറഞ്ച്) സൂചിപ്പിച്ച സമയ പോയിന്റുകളിൽ അളന്നു.മികച്ച വ്യക്തതയ്ക്കായി, ഗ്രാഫിൽ 100% സ്കെയിലിൽ ഒരു ഡോട്ട് ഇട്ട രേഖ വരയ്ക്കുന്നു.(സി) 3:1 അനുപാതത്തിൽ ട്രാൻസിറ്റ് പെപ്റ്റൈഡ് #2077, BACE1 ഇൻഹിബിറ്ററി പെപ്റ്റൈഡ് എന്നിവയുമായി സംയോജിപ്പിച്ച് സ്ട്രെപ്റ്റാവിഡിൻ ഉപയോഗിച്ച് ചികിത്സിച്ച എലികളിൽ രക്തത്തിലെ Aβ40 (ചുവന്ന ത്രികോണങ്ങൾ), സെറിബ്രോസ്പൈനൽ ദ്രാവകം (ഓറഞ്ച് ത്രികോണങ്ങൾ) എന്നിവയുടെ ശതമാനം കുറയുന്നു.(ഡി) സ്ട്രെപ്റ്റാവിഡിൻ ഉപയോഗിച്ച് ചികിത്സിച്ച എലികളുടെ രക്തത്തിലെ Aβ40 (ചുവന്ന വൃത്തങ്ങൾ), സെറിബ്രോസ്പൈനൽ ദ്രാവകം (ഓറഞ്ച് സർക്കിളുകൾ) എന്നിവയിൽ BACE1 ഇൻഹിബിറ്ററി പെപ്റ്റൈഡുമായി മാത്രം ചേർന്ന് ശതമാനം കുറവ്.നിയന്ത്രണത്തിലെ Aβ സാന്ദ്രത 420 pg/ml ആയിരുന്നു (സാധാരണ വ്യതിയാനം = 101 pg/ml).
ബയോമെഡിക്കൽ ഗവേഷണത്തിന്റെ വിവിധ മേഖലകളിൽ ഫേജ് ഡിസ്പ്ലേ വിജയകരമായി പ്രയോഗിച്ചു17.ഈ രീതി വിവോ വാസ്കുലർ ഡൈവേഴ്‌സിറ്റി പഠനങ്ങളിലും 20,21,22,23,24,25,26 സെറിബ്രൽ പാത്രങ്ങളെ ലക്ഷ്യമിടുന്ന പഠനങ്ങളിലും ഉപയോഗിച്ചു.ഈ പഠനത്തിൽ, സെറിബ്രൽ പാത്രങ്ങളെ ടാർഗെറ്റുചെയ്യുന്ന പെപ്റ്റൈഡുകളുടെ നേരിട്ടുള്ള തിരിച്ചറിയലിലേക്ക് മാത്രമല്ല, രക്ത-മസ്തിഷ്ക തടസ്സം മറികടക്കാൻ സജീവമായ ഗതാഗത ഗുണങ്ങളുള്ള ഉദ്യോഗാർത്ഥികളെ കണ്ടെത്തുന്നതിലേക്കും ഞങ്ങൾ ഈ തിരഞ്ഞെടുപ്പ് രീതിയുടെ പ്രയോഗം വിപുലീകരിച്ചു.CM intubated rats-ൽ ഒരു in vivo തിരഞ്ഞെടുക്കൽ നടപടിക്രമത്തിന്റെ വികസനം ഞങ്ങൾ ഇപ്പോൾ വിവരിക്കുകയും CSF ഹോമിംഗ് പ്രോപ്പർട്ടികൾ ഉള്ള പെപ്റ്റൈഡുകളെ തിരിച്ചറിയാനുള്ള അതിന്റെ കഴിവ് പ്രകടിപ്പിക്കുകയും ചെയ്യുന്നു.12-മെർ റാൻഡം പെപ്റ്റൈഡുകളുടെ ഒരു ലൈബ്രറി പ്രദർശിപ്പിക്കുന്ന T7 phage ഉപയോഗിച്ച്, T7 phage രക്ത-മസ്തിഷ്ക തടസ്സവുമായി പൊരുത്തപ്പെടാൻ ആവശ്യമായത്ര ചെറുതാണ് (ഏകദേശം 60 nm വ്യാസം)കാനലേറ്റഡ് സിഎം എലികളിൽ നിന്നുള്ള സിഎസ്എഫ് വിളവെടുപ്പ് വിവോ ഫങ്ഷണൽ സ്ക്രീനിംഗ് രീതിയിൽ നന്നായി നിയന്ത്രിതമാണെന്നും, വേർതിരിച്ചെടുത്ത ഫേജ് വാസ്കുലേച്ചറുമായി ബന്ധിപ്പിക്കുക മാത്രമല്ല, രക്ത-മസ്തിഷ്ക തടസ്സത്തിന് കുറുകെയുള്ള ഒരു ട്രാൻസ്പോർട്ടറായി പ്രവർത്തിക്കുകയും ചെയ്യുന്നുവെന്നും ഞങ്ങൾ നിരീക്ഷിച്ചു.കൂടാതെ, ഒരേസമയം രക്തം ശേഖരിക്കുകയും CSF-ലേയ്ക്കും രക്തത്തിൽ നിന്ന് ഉരുത്തിരിഞ്ഞ ഫേജുകളിലേക്കും HTS പ്രയോഗിക്കുകയും ചെയ്യുന്നതിലൂടെ, CSF-ന്റെ തിരഞ്ഞെടുപ്പിനെ രക്ത സമ്പുഷ്ടീകരണമോ തിരഞ്ഞെടുപ്പിന്റെ റൗണ്ടുകൾക്കിടയിലുള്ള വികാസത്തിനുള്ള ഫിറ്റ്നസോ സ്വാധീനിച്ചിട്ടില്ലെന്ന് ഞങ്ങൾ സ്ഥിരീകരിച്ചു.എന്നിരുന്നാലും, രക്ത കമ്പാർട്ടുമെന്റ് തിരഞ്ഞെടുക്കൽ പ്രക്രിയയുടെ ഭാഗമാണ്, കാരണം സി‌എസ്‌എഫ് കമ്പാർട്ടുമെന്റിൽ എത്താൻ കഴിവുള്ള ഫേജുകൾ അതിജീവിക്കുകയും തലച്ചോറിനെ സമ്പുഷ്ടമാക്കുന്നതിന് രക്തപ്രവാഹത്തിൽ ദീർഘനേരം പ്രചരിക്കുകയും വേണം.റോ എച്ച്ടിഎസ് ഡാറ്റയിൽ നിന്ന് വിശ്വസനീയമായ സീക്വൻസ് വിവരങ്ങൾ എക്‌സ്‌ട്രാക്‌റ്റുചെയ്യുന്നതിന്, വിശകലന വർക്ക്ഫ്ലോയിലെ പ്ലാറ്റ്‌ഫോം-നിർദ്ദിഷ്ട സീക്വൻസിംഗ് പിശകുകൾക്ക് അനുയോജ്യമായ ഫിൽട്ടറുകൾ ഞങ്ങൾ നടപ്പിലാക്കി.സ്‌ക്രീനിംഗ് രീതിയിലേക്ക് ചലനാത്മക പാരാമീറ്ററുകൾ ഉൾപ്പെടുത്തിക്കൊണ്ട്, രക്തത്തിലെ വൈൽഡ്-ടൈപ്പ് T7 ഫേജുകളുടെ (t½ ~ 28 മിനിറ്റ്) ദ്രുത ഫാർമക്കോകിനറ്റിക്‌സ് ഞങ്ങൾ സ്ഥിരീകരിച്ചു, കൂടാതെ സെറിബ്രോസ്പൈനൽ ദ്രാവകത്തിൽ (t½ ~ 26 മിനിറ്റ്) മിനിറ്റിൽ അവയുടെ അർദ്ധായുസ്സ് നിർണ്ണയിക്കുകയും ചെയ്തു.രക്തത്തിലും സി‌എസ്‌എഫിലും സമാനമായ ഫാർമക്കോകൈനറ്റിക് പ്രൊഫൈലുകൾ ഉണ്ടായിരുന്നിട്ടും, സി‌എസ്‌എഫിൽ ഫാജിന്റെ രക്ത സാന്ദ്രതയുടെ 0.001% മാത്രമേ കണ്ടെത്താനാകൂ, ഇത് രക്ത-മസ്തിഷ്ക തടസ്സത്തിലുടനീളം വൈൽഡ്-ടൈപ്പ് ടി 7 ഫാജിന്റെ പശ്ചാത്തല ചലനാത്മകതയെ സൂചിപ്പിക്കുന്നു.വിവോ പാനിംഗ് സ്ട്രാറ്റജികളിൽ ഉപയോഗിക്കുമ്പോൾ ആദ്യ റൗണ്ട് സെലക്ഷന്റെ പ്രാധാന്യം ഈ വർക്ക് എടുത്തുകാണിക്കുന്നു, പ്രത്യേകിച്ച് ചില ക്ലോണുകൾക്ക് CNS കമ്പാർട്ട്മെന്റിൽ എത്താൻ കഴിയുന്നതിനാൽ, രക്തചംക്രമണത്തിൽ നിന്ന് അതിവേഗം മായ്‌ക്കപ്പെടുന്ന ഫേജ് സിസ്റ്റങ്ങൾക്ക്.അങ്ങനെ, ആദ്യ റൗണ്ടിൽ, ലൈബ്രറി വൈവിധ്യത്തിലെ കുറവ് വളരെ വലുതായിരുന്നു, കാരണം വളരെ കർശനമായ ഈ സി‌എസ്‌എഫ് മോഡലിൽ പരിമിതമായ എണ്ണം ക്ലോണുകൾ മാത്രമാണ് ഒടുവിൽ ശേഖരിക്കപ്പെട്ടത്.CSF കമ്പാർട്ടുമെന്റിലെ സജീവമായ ശേഖരണം, രക്ത കമ്പാർട്ടുമെന്റിലെ ക്ലോൺ അതിജീവനം, ആദ്യ 10 മിനിറ്റിനുള്ളിൽ T7 phage ക്ലോണുകൾ രക്തത്തിൽ നിന്ന് ദ്രുതഗതിയിൽ നീക്കം ചെയ്യുക (ചിത്രം 1d, സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം 4M) എന്നിങ്ങനെയുള്ള നിരവധി തിരഞ്ഞെടുപ്പ് ഘട്ടങ്ങൾ ഈ ഇൻ vivo പാനിംഗ് തന്ത്രത്തിൽ ഉൾപ്പെടുന്നു.).അങ്ങനെ, ആദ്യ റൗണ്ടിന് ശേഷം, CSF-ൽ വ്യത്യസ്ത ഫേജ് ക്ലോണുകൾ തിരിച്ചറിഞ്ഞു, എന്നിരുന്നാലും വ്യക്തിഗത മൃഗങ്ങൾക്ക് ഒരേ പ്രാരംഭ കുളം ഉപയോഗിച്ചു.ധാരാളം ലൈബ്രറി അംഗങ്ങളുള്ള ഉറവിട ലൈബ്രറികൾക്കായി ഒന്നിലധികം കർശനമായ തിരഞ്ഞെടുപ്പ് നടപടികൾ വൈവിധ്യത്തിൽ ഗണ്യമായ കുറവുണ്ടാക്കുമെന്ന് ഇത് സൂചിപ്പിക്കുന്നു.അതിനാൽ, റാൻഡം ഇവന്റുകൾ പ്രാരംഭ തിരഞ്ഞെടുപ്പ് പ്രക്രിയയുടെ അവിഭാജ്യ ഘടകമായി മാറും, ഇത് ഫലത്തെ വളരെയധികം സ്വാധീനിക്കും.യഥാർത്ഥ ലൈബ്രറിയിലെ പല ക്ലോണുകൾക്കും സമാനമായ CSF സമ്പുഷ്ടീകരണ പ്രവണത ഉണ്ടായിരിക്കാൻ സാധ്യതയുണ്ട്.എന്നിരുന്നാലും, അതേ പരീക്ഷണാടിസ്ഥാനത്തിൽ പോലും, പ്രാരംഭ പൂളിലെ ഓരോ പ്രത്യേക ക്ലോണിന്റെയും എണ്ണം കുറവായതിനാൽ തിരഞ്ഞെടുപ്പ് ഫലങ്ങൾ വ്യത്യാസപ്പെടാം.
CSF-ൽ സമ്പുഷ്ടമായ രൂപങ്ങൾ രക്തത്തിലുള്ളതിൽ നിന്ന് വ്യത്യസ്തമാണ്.കൗതുകകരമെന്നു പറയട്ടെ, വ്യക്തിഗത മൃഗങ്ങളുടെ രക്തത്തിൽ ഗ്ലൈസിൻ അടങ്ങിയ പെപ്റ്റൈഡുകളിലേക്കുള്ള ആദ്യ മാറ്റം ഞങ്ങൾ ശ്രദ്ധിച്ചു.(ചിത്രം. 1g, അനുബന്ധ ചിത്രം. 4e, 4f).ഗ്ലൈസിൻ പെപ്‌റ്റൈഡുകൾ അടങ്ങിയ ഫേജ് കൂടുതൽ സ്ഥിരതയുള്ളതും രക്തചംക്രമണത്തിൽ നിന്ന് പുറത്തെടുക്കാനുള്ള സാധ്യത കുറവുമാണ്.എന്നിരുന്നാലും, സെറിബ്രോസ്പൈനൽ ഫ്ലൂയിഡ് സാമ്പിളുകളിൽ ഈ ഗ്ലൈസിൻ അടങ്ങിയ പെപ്റ്റൈഡുകൾ കണ്ടെത്തിയില്ല, ക്യൂറേറ്റഡ് ലൈബ്രറികൾ രണ്ട് വ്യത്യസ്ത തിരഞ്ഞെടുപ്പ് ഘട്ടങ്ങളിലൂടെ കടന്നുപോയി എന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്നു: ഒന്ന് രക്തത്തിലും മറ്റൊന്ന് സെറിബ്രോസ്പൈനൽ ദ്രാവകത്തിലും അടിഞ്ഞുകൂടാൻ അനുവദിച്ചു.നാലാം റൗണ്ട് തിരഞ്ഞെടുപ്പിന്റെ ഫലമായുണ്ടാകുന്ന CSF-സമ്പന്നമായ ക്ലോണുകൾ വിപുലമായി പരീക്ഷിക്കപ്പെട്ടു.ബ്ലാങ്ക് കൺട്രോൾ ഫേജുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ വ്യക്തിഗതമായി പരീക്ഷിച്ച മിക്കവാറും എല്ലാ ക്ലോണുകളും CSF-ൽ സമ്പുഷ്ടമാണെന്ന് സ്ഥിരീകരിച്ചു.ഒരു പെപ്റ്റൈഡ് ഹിറ്റ് (#2077) കൂടുതൽ വിശദമായി പരിശോധിച്ചു.മറ്റ് ഹിറ്റുകളുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ ഇത് പ്ലാസ്മയുടെ അർദ്ധായുസ്സ് കാണിച്ചു (ചിത്രം 3d, അനുബന്ധ ചിത്രം 7), രസകരമെന്നു പറയട്ടെ, ഈ പെപ്റ്റൈഡിൽ സി-ടെർമിനസിലെ സിസ്റ്റൈൻ അവശിഷ്ടം അടങ്ങിയിരുന്നു.പെപ്റ്റൈഡുകളിലേക്ക് സിസ്റ്റൈൻ ചേർക്കുന്നത് ആൽബുമിൻ 29 ലേക്ക് ബന്ധിപ്പിക്കുന്നതിലൂടെ അവയുടെ ഫാർമക്കോകിനറ്റിക് ഗുണങ്ങൾ മെച്ചപ്പെടുത്തുമെന്ന് അടുത്തിടെ തെളിയിക്കപ്പെട്ടിട്ടുണ്ട്.പെപ്റ്റൈഡ് #2077-ന് ഇത് നിലവിൽ അജ്ഞാതമാണ്, കൂടുതൽ പഠനം ആവശ്യമാണ്.ചില പെപ്റ്റൈഡുകൾ CSF സമ്പുഷ്ടീകരണത്തിൽ ഒരു വാലൻസ്-ആശ്രിതത്വം കാണിച്ചു (ഡാറ്റ കാണിച്ചിട്ടില്ല), ഇത് T7 ക്യാപ്‌സിഡിന്റെ പ്രദർശിപ്പിച്ചിരിക്കുന്ന ഉപരിതല ജ്യാമിതിയുമായി ബന്ധപ്പെട്ടിരിക്കാം.ഞങ്ങൾ ഉപയോഗിച്ച T7 സിസ്റ്റം ഓരോ പെപ്റ്റൈഡിന്റെയും 5-15 പകർപ്പുകൾ ഒരു ഫാജ് കണികയിൽ കാണിച്ചു.എലികളുടെ സെറിബ്രൽ കോർട്ടക്സിലേക്ക് ഇൻട്രാവണസായി കുത്തിവച്ച കാൻഡിഡേറ്റ് ലെഡ് ഫേജ് ക്ലോണുകളിൽ IHC നടത്തി (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം 8).കുറഞ്ഞത് മൂന്ന് ക്ലോണുകളെങ്കിലും (നമ്പർ 2002, നമ്പർ 2009, നമ്പർ 2077) ബിബിബിയുമായി സംവദിച്ചതായി ഡാറ്റ കാണിക്കുന്നു.ഈ BBB ഇടപെടൽ CSF-ന്റെ ശേഖരണത്തിന് കാരണമാകുമോ അതോ ഈ ക്ലോണുകളുടെ ചലനം നേരിട്ട് BCSFB-ലേയ്‌ക്ക് കാരണമാകുമോ എന്ന് നിർണ്ണയിക്കേണ്ടതുണ്ട്.പ്രധാനമായും, തിരഞ്ഞെടുത്ത പെപ്റ്റൈഡുകൾ സംശ്ലേഷണം ചെയ്യപ്പെടുകയും പ്രോട്ടീൻ കാർഗോയുമായി ബന്ധിപ്പിക്കുകയും ചെയ്യുമ്പോൾ അവയുടെ CSF ഗതാഗത ശേഷി നിലനിർത്തുന്നുവെന്ന് ഞങ്ങൾ കാണിക്കുന്നു.എൻ-ടെർമിനൽ ബയോട്ടിനൈലേറ്റഡ് പെപ്റ്റൈഡുകളെ എസ്എയുമായി ബന്ധിപ്പിക്കുന്നത്, രക്തത്തിലും സെറിബ്രോസ്പൈനൽ ദ്രവത്തിലും അതത് ഫേജ് ക്ലോണുകൾ ഉപയോഗിച്ച് ലഭിച്ച ഫലങ്ങൾ പ്രധാനമായും ആവർത്തിക്കുന്നു (ചിത്രം 3e).അവസാനമായി, ലെഡ് പെപ്റ്റൈഡ് #2077 ന് SA-യുമായി സംയോജിപ്പിച്ചിരിക്കുന്ന BACE1-ന്റെ ബയോട്ടിനൈലേറ്റഡ് പെപ്റ്റൈഡ് ഇൻഹിബിറ്ററിന്റെ മസ്തിഷ്ക പ്രവർത്തനത്തെ പ്രോത്സാഹിപ്പിക്കാൻ കഴിയുമെന്ന് ഞങ്ങൾ കാണിക്കുന്നു, ഇത് CSF-ലെ Abeta40 ലെവലുകൾ ഗണ്യമായി കുറയ്ക്കുന്നതിലൂടെ CNS-ൽ ഫാർമകോഡൈനാമിക് പ്രഭാവം ഉണ്ടാക്കുന്നു (ചിത്രം 4).എല്ലാ ഹിറ്റുകളുടെയും പെപ്റ്റൈഡ് സീക്വൻസ് ഹോമോളജി തിരയൽ നടത്തി ഡാറ്റാബേസിലെ ഏതെങ്കിലും ഹോമോലോഗുകൾ തിരിച്ചറിയാൻ ഞങ്ങൾക്ക് കഴിഞ്ഞില്ല.T7 ലൈബ്രറിയുടെ വലുപ്പം ഏകദേശം 109 ആണെന്നത് ശ്രദ്ധിക്കേണ്ടതാണ്, അതേസമയം 12-mers-ന്റെ സൈദ്ധാന്തിക ലൈബ്രറി വലുപ്പം 4 x 1015 ആണ്. അതിനാൽ, 12-mer പെപ്‌റ്റൈഡ് ലൈബ്രറിയുടെ വൈവിധ്യ സ്ഥലത്തിന്റെ ഒരു ചെറിയ ഭാഗം മാത്രമേ ഞങ്ങൾ തിരഞ്ഞെടുത്തിട്ടുള്ളൂ, ഇത് കൂടുതൽ ഒപ്റ്റിമൈസ് ചെയ്‌ത സ്‌പെയ്‌സുകളെ തിരിച്ചറിയാൻ കഴിയും.സാങ്കൽപ്പികമായി, ഈ പെപ്റ്റൈഡുകളുടെ സ്വാഭാവിക ഹോമോലോഗുകളൊന്നും ഞങ്ങൾ കണ്ടെത്താത്തതിന്റെ ഒരു കാരണം പരിണാമസമയത്ത് ചില പെപ്റ്റൈഡ് രൂപങ്ങൾ തലച്ചോറിലേക്ക് അനിയന്ത്രിതമായ പ്രവേശനം തടയുന്നതിനുള്ള തിരഞ്ഞെടുപ്പ് ഒഴിവാക്കാം.
ഒരുമിച്ച് എടുത്താൽ, വിവോയിലെ സെറിബ്രോവാസ്കുലർ തടസ്സത്തിന്റെ ഗതാഗത സംവിധാനങ്ങൾ കൂടുതൽ വിശദമായി തിരിച്ചറിയുന്നതിനും സ്വഭാവമാക്കുന്നതിനുമുള്ള ഭാവി പ്രവർത്തനങ്ങൾക്ക് ഞങ്ങളുടെ ഫലങ്ങൾ അടിസ്ഥാനം നൽകുന്നു.ഈ രീതിയുടെ അടിസ്ഥാന സജ്ജീകരണം, സെറിബ്രൽ വാസ്കുലർ ബൈൻഡിംഗ് പ്രോപ്പർട്ടികൾ ഉള്ള ക്ലോണുകളെ തിരിച്ചറിയുക മാത്രമല്ല, സിഎൻഎസ് കമ്പാർട്ടുമെന്റിലേക്ക് വിവോയിലെ ജൈവിക തടസ്സങ്ങൾ മറികടക്കാൻ വിജയകരമായ ക്ലോണുകൾക്ക് അന്തർലീനമായ പ്രവർത്തനമുള്ള ഒരു നിർണായക ഘട്ടം ഉൾക്കൊള്ളുന്ന ഒരു ഫംഗ്ഷണൽ സെലക്ഷൻ തന്ത്രത്തെ അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ളതാണ്.ഈ പെപ്റ്റൈഡുകളുടെ ഗതാഗത സംവിധാനവും മസ്തിഷ്ക മേഖലയ്ക്ക് പ്രത്യേകമായ മൈക്രോവാസ്കുലേച്ചറുമായി ബന്ധിപ്പിക്കുന്നതിനുള്ള അവരുടെ മുൻഗണനയും വ്യക്തമാക്കുക എന്നതാണ്.ഇത് ബിബിബിയുടെയും റിസപ്റ്ററുകളുടെയും ഗതാഗതത്തിനായി പുതിയ പാതകൾ കണ്ടെത്തുന്നതിലേക്ക് നയിച്ചേക്കാം.തിരിച്ചറിഞ്ഞ പെപ്റ്റൈഡുകൾക്ക് സെറിബ്രോവാസ്കുലർ റിസപ്റ്ററുകളുമായോ BBB അല്ലെങ്കിൽ BCSFB വഴി കൈമാറ്റം ചെയ്യപ്പെടുന്ന രക്തചംക്രമണ ലിഗാൻഡുകളുമായോ നേരിട്ട് ബന്ധിപ്പിക്കാൻ കഴിയുമെന്ന് ഞങ്ങൾ പ്രതീക്ഷിക്കുന്നു.ഈ സൃഷ്ടിയിൽ കണ്ടെത്തിയ CSF ഗതാഗത പ്രവർത്തനമുള്ള പെപ്റ്റൈഡ് വെക്റ്ററുകൾ കൂടുതൽ അന്വേഷിക്കും.BBB കൂടാതെ/അല്ലെങ്കിൽ BCSFB കടക്കാനുള്ള ഈ പെപ്റ്റൈഡുകളുടെ മസ്തിഷ്ക സവിശേഷതയെക്കുറിച്ച് ഞങ്ങൾ ഇപ്പോൾ അന്വേഷിക്കുകയാണ്.ഈ പുതിയ പെപ്റ്റൈഡുകൾ പുതിയ റിസപ്റ്ററുകളുടെയോ പാതകളുടെയോ സാധ്യത കണ്ടെത്തുന്നതിനും ബയോളജിക്സ് പോലുള്ള മാക്രോമോളിക്യൂളുകൾ തലച്ചോറിലേക്ക് എത്തിക്കുന്നതിനുള്ള ഉയർന്ന കാര്യക്ഷമമായ പുതിയ പ്ലാറ്റ്‌ഫോമുകൾ വികസിപ്പിക്കുന്നതിനും വളരെ വിലപ്പെട്ട ഉപകരണങ്ങളായിരിക്കും.
മുമ്പ് വിവരിച്ച രീതിയുടെ പരിഷ്‌ക്കരണം ഉപയോഗിച്ച് വലിയ സിസ്റ്റെർന (CM) കാനുലേറ്റ് ചെയ്യുക.അനസ്‌തെറ്റിസ് ചെയ്‌ത വിസ്റ്റാർ എലികളെ (200-350 ഗ്രാം) ഒരു സ്റ്റീരിയോടാക്‌സിക് ഉപകരണത്തിൽ കയറ്റുകയും തലയോട്ടി തുറന്നുകാട്ടുന്നതിനായി ഷേവ് ചെയ്‌ത് അസെപ്‌റ്റിക് ആയി തയ്യാറാക്കിയ തലയോട്ടിയിൽ ഒരു മീഡിയൻ മുറിവുണ്ടാക്കുകയും ചെയ്‌തു.മുകളിലെ സാഷിന്റെ ഭാഗത്ത് രണ്ട് ദ്വാരങ്ങൾ തുരന്ന് ദ്വാരങ്ങളിൽ ഫിക്സിംഗ് സ്ക്രൂകൾ ഉറപ്പിക്കുക.സ്റ്റെയിൻലെസ് സ്റ്റീൽ കാനുലയുടെ സ്റ്റീരിയോടാക്റ്റിക് മാർഗ്ഗനിർദ്ദേശത്തിനായി ലാറ്ററൽ ആൻസിപിറ്റൽ ക്രെസ്റ്റിൽ ഒരു അധിക ദ്വാരം മുഖ്യമന്ത്രിയിലേക്ക് തുളച്ചു.കാനുലയ്ക്ക് ചുറ്റും ഡെന്റൽ സിമന്റ് പുരട്ടി സ്ക്രൂകൾ ഉപയോഗിച്ച് ഉറപ്പിക്കുക.ഫോട്ടോ-ക്യൂറിംഗും സിമന്റ് കാഠിന്യവും കഴിഞ്ഞ്, തൊലിയിലെ മുറിവ് 4/0 സുപ്രമിഡ് തുന്നൽ കൊണ്ട് അടച്ചു.സെറിബ്രോസ്പൈനൽ ഫ്ലൂയിഡിന്റെ (സിഎസ്എഫ്) സ്വതസിദ്ധമായ ചോർച്ചയിലൂടെ കാനുലയുടെ ശരിയായ സ്ഥാനം സ്ഥിരീകരിക്കുന്നു.സ്റ്റീരിയോടാക്‌സിക് ഉപകരണത്തിൽ നിന്ന് എലിയെ നീക്കം ചെയ്യുക, ഉചിതമായ ശസ്ത്രക്രിയാനന്തര പരിചരണവും വേദന നിയന്ത്രണവും സ്വീകരിക്കുക, സെറിബ്രോസ്പൈനൽ ദ്രാവകത്തിൽ രക്തത്തിന്റെ ലക്ഷണങ്ങൾ കാണുന്നതുവരെ കുറഞ്ഞത് ഒരാഴ്ചയെങ്കിലും വീണ്ടെടുക്കാൻ അനുവദിക്കുക.വിസ്റ്റാർ എലികളെ (Crl:WI/Han) ലഭിച്ചത് ചാൾസ് നദിയിൽ (ഫ്രാൻസ്) നിന്നാണ്.എല്ലാ എലികളെയും പ്രത്യേക രോഗകാരികളില്ലാത്ത അവസ്ഥയിലാണ് സൂക്ഷിച്ചിരിക്കുന്നത്.എല്ലാ മൃഗ പരീക്ഷണങ്ങളും സ്വിറ്റ്സർലൻഡിലെ ബേസൽ നഗരത്തിലെ വെറ്ററിനറി ഓഫീസ് അംഗീകരിച്ചു, കൂടാതെ അനിമൽ ലൈസൻസ് നമ്പർ 2474 (സെറിബ്രോസ്പൈനൽ ഫ്ലൂയിഡിലും എലിയുടെ മസ്തിഷ്കത്തിലും ചികിത്സാ കാൻഡിഡേറ്റുകളുടെ ലെവലുകൾ അളക്കുന്നതിലൂടെ സജീവമായ മസ്തിഷ്ക ഗതാഗതത്തിന്റെ വിലയിരുത്തൽ) അനുസരിച്ചാണ് നടത്തിയത്.
കൈയിൽ മുഖ്യമന്ത്രി കനൂലയുമായി എലിയെ സൌമ്യമായി സൂക്ഷിക്കുക.ക്യാനുലയിൽ നിന്ന് ഡാറ്റുറ നീക്കം ചെയ്ത് 10 µl സ്വയമേവ ഒഴുകുന്ന സെറിബ്രോസ്പൈനൽ ദ്രാവകം ശേഖരിക്കുക.ക്യാനുലയുടെ പേറ്റൻസി ആത്യന്തികമായി വിട്ടുവീഴ്ച ചെയ്തതിനാൽ, രക്തത്തിലെ മലിനീകരണത്തിന്റെയോ നിറവ്യത്യാസത്തിന്റെയോ തെളിവുകളില്ലാത്ത വ്യക്തമായ സെറിബ്രോസ്പൈനൽ ദ്രാവക സാമ്പിളുകൾ മാത്രമാണ് ഈ പഠനത്തിൽ ഉൾപ്പെടുത്തിയത്.സമാന്തരമായി, ഏകദേശം 10-20 μl രക്തം വാലിന്റെ അറ്റത്തുള്ള ഒരു ചെറിയ മുറിവിൽ നിന്ന് ഹെപ്പാരിൻ (സിഗ്മ-ആൽഡ്രിച്ച്) ഉള്ള ട്യൂബുകളിലേക്ക് എടുത്തു.ടി 7 ഫാജിന്റെ ഇൻട്രാവണസ് കുത്തിവയ്പ്പിന് ശേഷം വിവിധ സമയ പോയിന്റുകളിൽ സിഎസ്എഫും രക്തവും ശേഖരിച്ചു.ഓരോ CSF സാമ്പിളും ശേഖരിക്കുന്നതിന് മുമ്പ് ഏകദേശം 5-10 μl ദ്രാവകം ഉപേക്ഷിച്ചു, ഇത് കത്തീറ്ററിന്റെ നിർജ്ജീവമായ അളവുമായി യോജിക്കുന്നു.
T7Select സിസ്റ്റം മാനുവലിൽ (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996) വിവരിച്ചിരിക്കുന്നത് പോലെ T7Select 10-3b വെക്റ്റർ ഉപയോഗിച്ചാണ് ലൈബ്രറികൾ സൃഷ്ടിച്ചത്.ചുരുക്കത്തിൽ, ക്രമരഹിതമായ 12-മെർ ഡിഎൻഎ ഉൾപ്പെടുത്തൽ ഇനിപ്പറയുന്ന ഫോർമാറ്റിൽ സമന്വയിപ്പിച്ചു:
എൻഎൻകെ കോഡൺ ഡബിൾ സ്റ്റോപ്പ് കോഡണുകളും ഇൻസേർട്ടിലെ അമിനോ ആസിഡ് ഓവർ എക്സ്പ്രഷനും ഒഴിവാക്കാൻ ഉപയോഗിച്ചു.N എന്നത് ഓരോ ന്യൂക്ലിയോടൈഡിന്റെയും സ്വമേധയാ സമ്മിശ്ര ഇക്വിമോളാർ അനുപാതമാണ്, കൂടാതെ K എന്നത് അഡിനൈൻ, സൈറ്റോസിൻ ന്യൂക്ലിയോടൈഡുകൾ എന്നിവയുടെ സ്വമേധയാ കലർന്ന സമമൂല അനുപാതമാണ്.37 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ 3 മണിക്കൂർ ക്ലെനോ ബഫറിൽ (ന്യൂ ഇംഗ്ലണ്ട് ബയോലാബ്‌സ്) dNTP (നോവാഗൻ), ക്ലെനോ എൻസൈം (ന്യൂ ഇംഗ്ലണ്ട് ബയോലാബ്‌സ്) എന്നിവ ഉപയോഗിച്ച് കൂടുതൽ ഇൻകുബേഷൻ വഴി ഒറ്റ സ്ട്രാൻഡഡ് പ്രദേശങ്ങൾ ഡബിൾ സ്ട്രാൻഡഡ് ഡിഎൻഎ ആക്കി മാറ്റി.പ്രതികരണത്തിന് ശേഷം, EtOH മഴയിലൂടെ ഇരട്ട-സ്ട്രാൻഡഡ് ഡിഎൻഎ വീണ്ടെടുക്കപ്പെട്ടു.തത്ഫലമായുണ്ടാകുന്ന ഡിഎൻഎ നിയന്ത്രണ എൻസൈമുകളായ EcoRI, HindIII എന്നിവ ഉപയോഗിച്ച് ദഹിപ്പിക്കപ്പെട്ടു (രണ്ടും റോച്ചിൽ നിന്ന്).10B ക്യാപ്‌സിഡ് ജീനിന്റെ 348 അമിനോ ആസിഡിന് ശേഷം, പിളർന്ന് ശുദ്ധീകരിക്കപ്പെട്ട (QIAquick, Qiagen) ഇൻസേർട്ട് (T4 ലിഗേസ്, ന്യൂ ഇംഗ്ലണ്ട് ബയോലാബ്‌സ്) ഇൻ-ഫ്രെയിമിൽ പ്രീ-ക്ലീവ്ഡ് T7 വെക്‌ടറിലേക്ക് ലിഗേറ്റ് ചെയ്തു.വിട്രോ പാക്കേജിംഗിന് മുമ്പ് 18 മണിക്കൂർ നേരത്തേക്ക് 16 ° C. താപനിലയിൽ ലിഗേഷൻ പ്രതികരണങ്ങൾ ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്തു.T7Select 10-3b ക്ലോണിംഗ് കിറ്റ് (Novagen) നൽകിയിട്ടുള്ള നിർദ്ദേശങ്ങൾക്കനുസൃതമായി വിട്രോയിലെ Phage പാക്കേജിംഗ് നടത്തി, കൂടാതെ Escherichia coli (BLT5615, Novagen) ഉപയോഗിച്ച് ലിസിസിലേക്ക് പാക്കേജിംഗ് സൊല്യൂഷൻ ഒരിക്കൽ വർദ്ധിപ്പിച്ചു.ഗ്ലിസറോളിന്റെ ഒരു സ്റ്റോക്ക് ലായനിയായി ലൈസെറ്റുകൾ സെൻട്രിഫ്യൂജ് ചെയ്യുകയും ടൈട്രേറ്റ് ചെയ്യുകയും -80 ° C. യിൽ ഫ്രീസ് ചെയ്യുകയും ചെയ്തു.
പ്രൊപ്രൈറ്ററി 454/റോഷ്-ആംപ്ലിക്കൺ ഫ്യൂഷൻ പ്രൈമറുകൾ ഉപയോഗിച്ച് ചാറിലോ പ്ലേറ്റിലോ ആംപ്ലിഫൈ ചെയ്ത ഫാജ് വേരിയബിൾ മേഖലകളുടെ നേരിട്ടുള്ള പിസിആർ ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ.ഫോർവേഡ് ഫ്യൂഷൻ പ്രൈമറിൽ വേരിയബിൾ റീജിയൻ (NNK) 12 (ടെംപ്ലേറ്റ്-നിർദ്ദിഷ്ടം), GS FLX ടൈറ്റാനിയം അഡാപ്റ്റർ എ, നാല്-ബേസ് ലൈബ്രറി കീ സീക്വൻസ് (TCAG) (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം 1a):
റിവേഴ്‌സ് ഫ്യൂഷൻ പ്രൈമറിൽ മുത്തുകൾ ക്യാപ്‌ചർ ചെയ്യാൻ ഘടിപ്പിച്ചിട്ടുള്ള ബയോട്ടിൻ, എമൽഷൻ PCR സമയത്ത് ക്ലോണൽ ആംപ്ലിഫിക്കേഷന് ആവശ്യമായ GS FLX ടൈറ്റാനിയം അഡാപ്റ്റർ B എന്നിവയും അടങ്ങിയിരിക്കുന്നു:
454 GS-FLX ടൈറ്റാനിയം പ്രോട്ടോക്കോൾ അനുസരിച്ച് ആംപ്ലിക്കോണുകൾ 454/റോച്ചെ പൈറോസെൻസിങ്ങിന് വിധേയമാക്കി.മാനുവൽ സാംഗർ സീക്വൻസിംഗിനായി (അപ്ലൈഡ് ബയോസിസ്റ്റംസ് ഹിറ്റാച്ചി 3730 xl DNA അനലൈസർ), T7 ഫേജ് ഡിഎൻഎ പിസിആർ ആംപ്ലിഫൈ ചെയ്യുകയും ഇനിപ്പറയുന്ന പ്രൈമർ ജോഡികൾ ഉപയോഗിച്ച് ക്രമപ്പെടുത്തുകയും ചെയ്തു:
റോച്ചെ ഫാസ്റ്റ് സ്റ്റാർട്ട് ഡിഎൻഎ പോളിമറേസ് കിറ്റ് (നിർമ്മാതാവിന്റെ നിർദ്ദേശങ്ങൾ അനുസരിച്ച്) ഉപയോഗിച്ച് വ്യക്തിഗത ഫലകങ്ങളിൽ നിന്നുള്ള ഇൻസെർട്ടുകൾ PCR ആംപ്ലിഫിക്കേഷന് വിധേയമാക്കി.ഒരു ഹോട്ട് സ്റ്റാർട്ടും (95 °C-ൽ 10 മിനിറ്റ്) 35 ബൂസ്റ്റ് സൈക്കിളുകളും (95 °C-ൽ 50 സെ, 50 °C-ൽ 1 മിനിറ്റ്, 72 °C-ൽ 1 മിനിറ്റ്) നടത്തുക.
ലൈബ്രറികളിൽ നിന്നുള്ള ഫേജ്, വൈൽഡ്-ടൈപ്പ് ഫേജ്, CSF, രക്തം എന്നിവയിൽ നിന്ന് രക്ഷിച്ച ഫേജ് അല്ലെങ്കിൽ വ്യക്തിഗത ക്ലോണുകൾ ടിബി ചാറിൽ (സിഗ്മ ആൽഡ്രിച്ച്) Escherichia coli BL5615 അല്ലെങ്കിൽ 500 cm2 വിഭവങ്ങളിൽ (തെർമോ സയന്റിഫിക്) 4 മണിക്കൂർ 37 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ വർദ്ധിപ്പിച്ചു.ട്രൈസ്-ഇ‌ഡി‌ടി‌എ ബഫർ (ഫ്ലൂക്ക അനലിറ്റിക്കൽ) ഉപയോഗിച്ച് പ്ലേറ്റുകൾ കഴുകുകയോ അണുവിമുക്തമായ പൈപ്പറ്റ് ടിപ്പുകൾ ഉപയോഗിച്ച് ഫലകങ്ങൾ ശേഖരിക്കുകയോ ചെയ്‌ത് പ്ലേറ്റുകളിൽ നിന്ന് ഫേജ് വേർതിരിച്ചെടുത്തു.ഒരു റൗണ്ട് പോളിയെത്തിലീൻ ഗ്ലൈക്കോൾ (പിഇജി 8000) മഴ (പ്രോമെഗ) ഉപയോഗിച്ച് കൾച്ചർ സൂപ്പർനാറ്റന്റ് അല്ലെങ്കിൽ എക്‌സ്‌ട്രാക്ഷൻ ബഫറിൽ നിന്ന് ഫാജിനെ വേർതിരിച്ച് ട്രൈസ്-ഇഡിടിഎ ബഫറിൽ പുനഃസ്ഥാപിച്ചു.
ഇൻട്രാവണസ് (IV) കുത്തിവയ്പ്പിന് (500 μl/മൃഗം) മുമ്പ് എൻഡോടോക്സിൻ റിമൂവൽ ബീഡ്സ് (മിൽറ്റെനി ബയോടെക്) ഉപയോഗിച്ച് 2-3 റൗണ്ട് എൻഡോടോക്സിൻ നീക്കം ചെയ്യലിന് വിധേയമാക്കിയിട്ടുണ്ട്.ആദ്യ റൗണ്ടിൽ, 2×1012 ഫേജുകൾ അവതരിപ്പിച്ചു;രണ്ടാമത്തേതിൽ, 2×1010 ഫേജുകൾ;മൂന്നാമത്തെയും നാലാമത്തെയും സെലക്ഷൻ റൗണ്ടുകളിൽ, ഓരോ മൃഗത്തിനും 2×109 ഫേജുകൾ.നിർമ്മാതാവിന്റെ നിർദ്ദേശങ്ങൾ (T7Select സിസ്റ്റം മാനുവൽ) അനുസരിച്ച് ശിലാഫലകം എണ്ണിക്കൊണ്ടാണ് CSF-ലും സൂചിപ്പിച്ച സമയ പോയിന്റുകളിൽ ശേഖരിക്കുന്ന രക്ത സാമ്പിളുകളിലും ഫേജ് ഉള്ളടക്കം നിർണ്ണയിക്കുന്നത്.ശുദ്ധീകരിച്ച ലൈബ്രറികൾ ടെയിൽ സിരയിലേക്ക് ഇൻട്രാവണസ് ഇഞ്ചക്ഷൻ വഴിയോ മുൻ സെലക്ഷൻ റൗണ്ടിൽ നിന്ന് CSF-ൽ നിന്ന് വേർതിരിച്ചെടുത്ത ഫേജ് വീണ്ടും കുത്തിവയ്ക്കുന്നതിലൂടെയോ ഫേജ് തിരഞ്ഞെടുക്കൽ നടത്തി, തുടർന്നുള്ള വിളവുകൾ യഥാക്രമം 10 മിനിറ്റ്, 30 മിനിറ്റ്, 60 മിനിറ്റ്, 90 മിനിറ്റ്, 120 മിനിറ്റ്, CSF സാമ്പിൾ, 18040 മിനിറ്റ് എന്നിവയിൽ നടത്തി.ആകെ നാല് റൗണ്ട് ഇൻ വിവോ പാനിംഗുകൾ നടത്തി, അതിൽ തിരഞ്ഞെടുത്ത രണ്ട് ശാഖകൾ വെവ്വേറെ സംഭരിക്കുകയും തിരഞ്ഞെടുക്കലിന്റെ ആദ്യ മൂന്ന് റൗണ്ടുകളിൽ വിശകലനം ചെയ്യുകയും ചെയ്തു.സെലക്ഷന്റെ ആദ്യ രണ്ട് റൗണ്ടുകളിൽ നിന്ന് CSF-ൽ നിന്ന് എക്‌സ്‌ട്രാക്‌റ്റുചെയ്‌ത എല്ലാ ഫേജ് ഇൻസെർട്ടുകളും 454/റോച്ചെ പൈറോസെക്‌സിംഗിന് വിധേയമാക്കി, അതേസമയം അവസാന രണ്ട് റൗണ്ടുകളിൽ നിന്ന് CSF-ൽ നിന്ന് എക്‌സ്‌ട്രാക്റ്റുചെയ്‌ത എല്ലാ ക്ലോണുകളും സ്വമേധയാ ക്രമീകരിച്ചു.ആദ്യ റൗണ്ട് സെലക്ഷൻ മുതലുള്ള എല്ലാ ബ്ലഡ് ഫേജുകളും 454/റോച്ചെ പൈറോസെൻസിംഗിന് വിധേയമാക്കി.ഫേജ് ക്ലോണുകളുടെ കുത്തിവയ്പ്പിനായി, തിരഞ്ഞെടുത്ത ഫേജുകൾ E. coli (BL5615) ൽ 500 cm2 പ്ലേറ്റുകളിൽ 37 ° C താപനിലയിൽ 4 മണിക്കൂർ വർദ്ധിപ്പിച്ചു.വ്യക്തിഗതമായി തിരഞ്ഞെടുത്തതും സ്വമേധയാ ക്രമീകരിച്ചതുമായ ക്ലോണുകൾ ടിബി മീഡിയത്തിൽ പ്രചരിപ്പിച്ചു.ഫേജ് വേർതിരിച്ചെടുക്കൽ, എൻഡോടോക്സിൻ (മുകളിൽ വിവരിച്ചതുപോലെ) ശുദ്ധീകരിക്കുകയും നീക്കം ചെയ്യുകയും ചെയ്ത ശേഷം, 300 μl ലെ 2×1010 ഫേജുകൾ/മൃഗങ്ങൾ ഒരു വാൽ സിരയിലേക്ക് ഇൻട്രാവെൻസായി കുത്തിവയ്ക്കപ്പെട്ടു.
സീക്വൻസ് ഡാറ്റയുടെ പ്രീപ്രോസസ്സിംഗും ഗുണപരമായ ഫിൽട്ടറിംഗും.റോ 454/റോച്ചെ ഡാറ്റ ബൈനറി സ്റ്റാൻഡേർഡ് സ്ട്രീം മാപ്പ് ഫോർമാറ്റിൽ നിന്ന് (എസ്എഫ്എഫ്) വെണ്ടർ സോഫ്‌റ്റ്‌വെയർ ഉപയോഗിച്ച് പിയേഴ്‌സൺ ഹ്യൂമൻ റീഡബിൾ ഫോർമാറ്റിലേക്ക് (ഫാസ്റ്റ) പരിവർത്തനം ചെയ്‌തു.ന്യൂക്ലിയോടൈഡ് സീക്വൻസിൻറെ കൂടുതൽ പ്രോസസ്സിംഗ്, താഴെ വിവരിച്ചിരിക്കുന്നതു പോലെ പ്രൊപ്രൈറ്ററി സി പ്രോഗ്രാമുകളും സ്ക്രിപ്റ്റുകളും (റിലീസ് ചെയ്യാത്ത സോഫ്റ്റ്വെയർ പാക്കേജ്) ഉപയോഗിച്ചാണ് നടത്തിയത്.പ്രാഥമിക ഡാറ്റയുടെ വിശകലനത്തിൽ കർശനമായ മൾട്ടി-സ്റ്റേജ് ഫിൽട്ടറിംഗ് നടപടിക്രമങ്ങൾ ഉൾപ്പെടുന്നു.സാധുതയുള്ള 12mer ഇൻസേർട്ട് ഡിഎൻഎ സീക്വൻസ് അടങ്ങിയിട്ടില്ലാത്ത റീഡുകൾ ഫിൽട്ടർ ചെയ്യാൻ, റീഡുകൾ സ്റ്റാർട്ട് ലേബൽ (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), സ്റ്റോപ്പ് ലേബൽ (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA), ഗ്ലോബൽ ടെസ്റ്റ് ഉപയോഗിച്ചുള്ള പശ്ചാത്തല ഇൻസേർട്ട് (CCCTGCAGGAGGATATCGGGleman ഉപയോഗിച്ചുള്ള ഗ്ലോബൽ ടെസ്റ്റ്) എന്നിവയ്ക്ക് തുടർച്ചയായി വിന്യസിച്ചു.ഓരോ വിന്യാസത്തിലും 2 പൊരുത്തക്കേടുകൾ വരെ അനുവദിക്കുന്ന വിന്യാസം31.അതിനാൽ, സ്റ്റാർട്ട് ആന്റ് സ്റ്റോപ്പ് ടാഗുകളില്ലാത്ത റീഡുകളും ബാക്ക്ഗ്രൗണ്ട് ഇൻസെർട്ടുകൾ അടങ്ങിയ റീഡുകളും, അതായത്, അനുവദനീയമായ പൊരുത്തക്കേടുകളുടെ എണ്ണം കവിയുന്ന വിന്യാസങ്ങൾ, ലൈബ്രറിയിൽ നിന്ന് നീക്കം ചെയ്തു.ശേഷിക്കുന്ന റീഡുകളെ സംബന്ധിച്ചിടത്തോളം, സ്റ്റാർട്ട് മാർക്കിൽ നിന്ന് നീണ്ടുനിൽക്കുന്ന N-mer DNA ക്രമം, യഥാർത്ഥ റീഡ് സീക്വൻസിൽ നിന്ന് ഒഴിവാക്കി കൂടുതൽ പ്രോസസ്സ് ചെയ്തു (ഇനി മുതൽ "ഇൻസേർട്ട്" എന്ന് വിളിക്കുന്നു).ഇൻസേർട്ടിന്റെ വിവർത്തനത്തിന് ശേഷം, പ്രൈമറിന്റെ 5′ അറ്റത്തുള്ള ആദ്യ സ്റ്റോപ്പ് കോഡണിന് ശേഷമുള്ള ഭാഗം ഇൻസേർട്ടിൽ നിന്ന് നീക്കം ചെയ്യപ്പെടും.കൂടാതെ, പ്രൈമറിന്റെ 3′ അറ്റത്തുള്ള അപൂർണ്ണമായ കോഡണുകളിലേക്ക് നയിക്കുന്ന ന്യൂക്ലിയോടൈഡുകളും നീക്കം ചെയ്യപ്പെട്ടു.ബാക്ക്ഗ്രൗണ്ട് സീക്വൻസുകൾ മാത്രം അടങ്ങിയ ഇൻസെർട്ടുകൾ ഒഴിവാക്കുന്നതിന്, "PAG" എന്ന അമിനോ ആസിഡ് പാറ്റേണിൽ തുടങ്ങുന്ന വിവർത്തനം ചെയ്ത ഉൾപ്പെടുത്തലുകളും നീക്കം ചെയ്തു.3 അമിനോ ആസിഡുകളിൽ താഴെയുള്ള വിവർത്തനത്തിനു ശേഷമുള്ള പെപ്റ്റൈഡുകൾ ലൈബ്രറിയിൽ നിന്ന് നീക്കം ചെയ്തു.അവസാനമായി, ഇൻസേർട്ട് പൂളിലെ ആവർത്തനം നീക്കം ചെയ്യുകയും ഓരോ അദ്വിതീയ ഇൻസെർട്ടിന്റെയും ആവൃത്തി നിർണ്ണയിക്കുകയും ചെയ്യുക.ഈ വിശകലനത്തിന്റെ ഫലങ്ങളിൽ ന്യൂക്ലിയോടൈഡ് സീക്വൻസുകളുടെയും (ഇൻസേർട്ടുകളുടെയും) അവയുടെ (വായന) ആവൃത്തികളുടെയും ഒരു ലിസ്റ്റ് ഉൾപ്പെടുന്നു (സപ്ലിമെന്ററി കണക്കുകൾ 1c, 2).
സീക്വൻസ് സമാനത പ്രകാരം ഗ്രൂപ്പ് N-mer DNA ഉൾപ്പെടുത്തലുകൾ: 454/Roche-നിർദ്ദിഷ്‌ട സീക്വൻസിംഗ് പിശകുകൾ (ഹോമോപോളിമർ വിപുലീകരണങ്ങൾ ക്രമപ്പെടുത്തുന്നതിലെ പ്രശ്‌നങ്ങൾ പോലുള്ളവ) ഇല്ലാതാക്കുന്നതിനും പ്രാധാന്യമില്ലാത്ത ആവർത്തനങ്ങൾ നീക്കം ചെയ്യുന്നതിനും, മുമ്പ് ഫിൽട്ടർ ചെയ്‌ത N-mer DNA സീക്വൻസ് ഇൻസേർട്ടുകൾ (ഇൻസേർട്ടുകൾ) സമാനതയാൽ അടുക്കുന്നു.ഇനിപ്പറയുന്ന രീതിയിൽ നിർവചിച്ചിരിക്കുന്ന ഒരു ആവർത്തന അൽഗോരിതം ഉപയോഗിച്ച് ഇൻസെർഷനുകൾ (2 നോൺ-മാച്ചിംഗ് ബേസുകൾ വരെ അനുവദനീയമാണ്): ഉൾപ്പെടുത്തലുകളെ ആദ്യം അവയുടെ ആവൃത്തി (ഏറ്റവും താഴ്ന്നത്) അനുസരിച്ച് അടുക്കുന്നു, അവ സമാനമാണെങ്കിൽ, അവയുടെ ദ്വിതീയ തരം നീളം (ദൈർഘ്യമേറിയത് മുതൽ ചെറുത്) ).അങ്ങനെ, ഏറ്റവും പതിവുള്ളതും ദൈർഘ്യമേറിയതുമായ ഉൾപ്പെടുത്തലുകൾ ആദ്യ "ഗ്രൂപ്പ്" നിർവചിക്കുന്നു.ഗ്രൂപ്പ് ഫ്രീക്വൻസി കീ ഫ്രീക്വൻസിയിലേക്ക് സജ്ജീകരിച്ചിരിക്കുന്നു.തുടർന്ന്, അടുക്കിയ ലിസ്റ്റിൽ ശേഷിക്കുന്ന ഓരോ ഉൾപ്പെടുത്തലും ജോടിയായി നീഡിൽമാൻ-വുൺഷ് വിന്യാസം വഴി ഗ്രൂപ്പിലേക്ക് ചേർക്കാൻ ശ്രമിച്ചു.ഒരു വിന്യാസത്തിലെ പൊരുത്തക്കേടുകൾ, ഉൾപ്പെടുത്തലുകൾ അല്ലെങ്കിൽ ഇല്ലാതാക്കലുകൾ എന്നിവയുടെ എണ്ണം 2-ന്റെ പരിധി കവിയുന്നില്ലെങ്കിൽ, ഗ്രൂപ്പിലേക്ക് ഒരു ഇൻസെർഷൻ ചേർക്കപ്പെടും, ഒപ്പം ചേർക്കൽ എത്ര തവണ ചേർത്തു എന്നതിനനുസരിച്ച് മൊത്തത്തിലുള്ള ഗ്രൂപ്പ് ആവൃത്തി വർദ്ധിപ്പിക്കും.ഒരു ഗ്രൂപ്പിലേക്ക് ചേർത്ത ഇൻസെർട്ടുകൾ ഉപയോഗിച്ചതായി അടയാളപ്പെടുത്തുകയും തുടർന്നുള്ള പ്രോസസ്സിംഗിൽ നിന്ന് ഒഴിവാക്കുകയും ചെയ്യുന്നു.ഇതിനകം നിലവിലുള്ള ഒരു ഗ്രൂപ്പിലേക്ക് ഇൻസേർട്ട് സീക്വൻസ് ചേർക്കാൻ കഴിയുന്നില്ലെങ്കിൽ, ഉചിതമായ ഇൻസേർട്ട് ഫ്രീക്വൻസി ഉപയോഗിച്ച് ഒരു പുതിയ ഗ്രൂപ്പ് സൃഷ്ടിക്കാൻ ഇൻസേർട്ട് സീക്വൻസ് ഉപയോഗിക്കുകയും ഉപയോഗിച്ചതായി അടയാളപ്പെടുത്തുകയും ചെയ്യുന്നു.ഓരോ ഇൻസെർഷൻ സീക്വൻസും ഒരു പുതിയ ഗ്രൂപ്പ് രൂപീകരിക്കാൻ ഉപയോഗിക്കുമ്പോൾ അല്ലെങ്കിൽ നിലവിലുള്ള ഗ്രൂപ്പിൽ ഉൾപ്പെടുത്താൻ കഴിയുമ്പോൾ ആവർത്തനം അവസാനിക്കുന്നു.എല്ലാത്തിനുമുപരി, ന്യൂക്ലിയോടൈഡുകൾ അടങ്ങിയ ഗ്രൂപ്പ് ഇൻസെർട്ടുകൾ ഒടുവിൽ പെപ്റ്റൈഡ് സീക്വൻസുകളിലേക്ക് (പെപ്റ്റൈഡ് ലൈബ്രറികൾ) വിവർത്തനം ചെയ്യപ്പെടുന്നു.ഈ വിശകലനത്തിന്റെ ഫലം, തുടർച്ചയായ വായനകളുടെ എണ്ണം (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം 2) ഉൾക്കൊള്ളുന്ന ഒരു കൂട്ടം ഉൾപ്പെടുത്തലുകളും അവയുടെ അനുബന്ധ ആവൃത്തികളും ആണ്.
മോട്ടിഫ് ജനറേഷൻ: അദ്വിതീയ പെപ്റ്റൈഡുകളുടെ ഒരു ലിസ്റ്റ് അടിസ്ഥാനമാക്കി, താഴെ കാണിച്ചിരിക്കുന്നതുപോലെ സാധ്യമായ എല്ലാ അമിനോ ആസിഡ് പാറ്റേണുകളും (എഎ) ഉൾക്കൊള്ളുന്ന ഒരു ലൈബ്രറി സൃഷ്ടിച്ചു.പെപ്‌റ്റൈഡിൽ നിന്ന് 3 നീളമുള്ള സാധ്യമായ ഓരോ പാറ്റേണും വേർതിരിച്ചെടുക്കുകയും എല്ലാ പാറ്റേണുകളും (ട്രിപെപ്റ്റൈഡുകൾ) അടങ്ങുന്ന ഒരു പൊതു മോട്ടിഫ് ലൈബ്രറിയോടൊപ്പം അതിന്റെ വിപരീത പാറ്റേണും ചേർക്കുകയും ചെയ്തു.വളരെ ആവർത്തിച്ചുള്ള മോട്ടിഫുകളുടെ ലൈബ്രറികൾ ക്രമപ്പെടുത്തുകയും ആവർത്തനങ്ങൾ നീക്കം ചെയ്യുകയും ചെയ്തു.തുടർന്ന്, മോട്ടിഫ് ലൈബ്രറിയിലെ ഓരോ ട്രൈപ്‌റ്റൈഡിനും, കമ്പ്യൂട്ടേഷണൽ ടൂളുകൾ ഉപയോഗിച്ച് ലൈബ്രറിയിൽ അതിന്റെ സാന്നിധ്യം ഞങ്ങൾ പരിശോധിച്ചു.ഈ സാഹചര്യത്തിൽ, കണ്ടെത്തിയ മോട്ടിഫ് ട്രൈപ്‌റ്റൈഡ് അടങ്ങിയ പെപ്റ്റൈഡിന്റെ ആവൃത്തി കൂട്ടിച്ചേർക്കുകയും മോട്ടിഫ് ലൈബ്രറിയിലെ (“മോട്ടിഫുകളുടെ എണ്ണം”) മോട്ടിഫിലേക്ക് നൽകുകയും ചെയ്യുന്നു.ട്രിപ്‌റ്റൈഡുകളുടെ (മോട്ടിഫുകളുടെ) എല്ലാ സംഭവങ്ങളും അവയുടെ മൂല്യങ്ങളും അടങ്ങുന്ന ഒരു ദ്വിമാന ശ്രേണിയാണ് മോട്ടിഫ് ജനറേഷന്റെ ഫലം, റീഡുകൾ ഫിൽട്ടർ ചെയ്യുകയും ഗ്രൂപ്പുചെയ്യുകയും വിവർത്തനം ചെയ്യുകയും ചെയ്യുമ്പോൾ അനുബന്ധ മോട്ടിഫിൽ കലാശിക്കുന്ന സീക്വൻസിംഗ് റീഡുകളുടെ എണ്ണമാണിത്.മുകളിൽ വിശദമായി വിവരിച്ചിരിക്കുന്ന മെട്രിക്സ്.
മോട്ടിഫുകളുടെയും അനുബന്ധ സ്കാറ്റർപ്ലോട്ടുകളുടെയും എണ്ണം നോർമലൈസേഷൻ: ഓരോ സാമ്പിളിനുമുള്ള മോട്ടിഫുകളുടെ എണ്ണം നോർമലൈസ് ചെയ്തു
ഇവിടെ ni എന്നത് വിഷയം i ഉൾക്കൊള്ളുന്ന വായനകളുടെ എണ്ണമാണ്.അങ്ങനെ, സാമ്പിളിലെ മോട്ടിഫ് i അടങ്ങിയ റീഡുകളുടെ (അല്ലെങ്കിൽ പെപ്റ്റൈഡുകൾ) ശതമാനം ആവൃത്തിയെ vi പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നു.ഫിഷറിന്റെ കൃത്യമായ പരിശോധന ഉപയോഗിച്ച് നോൺ-നോർമലൈസ്ഡ് മോട്ടിഫുകളുടെ പി-മൂല്യങ്ങൾ കണക്കാക്കി.പ്രേരണകളുടെ എണ്ണത്തിന്റെ കോറെലോഗ്രാമുകളെ സംബന്ധിച്ച്, R ഉപയോഗിച്ചുള്ള നോർമലൈസ് ചെയ്ത ഉദ്ദേശ്യങ്ങളുടെ എണ്ണം ഉപയോഗിച്ച് സ്പിയർമാന്റെ പരസ്പര ബന്ധങ്ങൾ കണക്കാക്കി.
പെപ്റ്റൈഡ് ലൈബ്രറിയിലെ ഓരോ സ്ഥാനത്തും അമിനോ ആസിഡുകളുടെ ഉള്ളടക്കം ദൃശ്യവൽക്കരിക്കാൻ, വെബ് ലോഗോഗ്രാമുകൾ 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com) സൃഷ്ടിച്ചു.ആദ്യം, 12-മെർ പെപ്റ്റൈഡിന്റെ ഓരോ സ്ഥാനത്തും അമിനോ ആസിഡുകളുടെ ഉള്ളടക്കം 20×12 മാട്രിക്സിൽ സൂക്ഷിക്കുന്നു.തുടർന്ന്, ഓരോ സ്ഥാനത്തും ഒരേ ആപേക്ഷിക അമിനോ ആസിഡിന്റെ ഉള്ളടക്കം അടങ്ങിയ 1000 പെപ്റ്റൈഡുകളുടെ ഒരു സെറ്റ് ഫാസ്റ്റ-സീക്വൻസ് ഫോർമാറ്റിൽ സൃഷ്ടിക്കുകയും വെബ് ലോഗോ 3-ലേക്ക് ഇൻപുട്ടായി നൽകുകയും ചെയ്യുന്നു, ഇത് ഓരോ സ്ഥാനത്തും ആപേക്ഷിക അമിനോ ആസിഡ് ഉള്ളടക്കത്തിന്റെ ഗ്രാഫിക്കൽ പ്രാതിനിധ്യം സൃഷ്ടിക്കുന്നു.തന്നിരിക്കുന്ന പെപ്റ്റൈഡ് ലൈബ്രറിക്ക്.മൾട്ടിഡൈമൻഷണൽ ഡാറ്റാസെറ്റുകൾ ദൃശ്യവൽക്കരിക്കുന്നതിന്, R-ൽ ആന്തരികമായി വികസിപ്പിച്ച ഉപകരണം ഉപയോഗിച്ച് ഹീറ്റ് മാപ്പുകൾ സൃഷ്ടിച്ചു (biosHeatmap, ഇതുവരെ റിലീസ് ചെയ്യാത്ത R പാക്കേജ്).ഹീറ്റ് മാപ്പുകളിൽ അവതരിപ്പിച്ചിരിക്കുന്ന ഡെൻഡ്രോഗ്രാമുകൾ യൂക്ലിഡിയൻ ഡിസ്റ്റൻസ് മെട്രിക് ഉപയോഗിച്ച് വാർഡിന്റെ ഹൈറാർക്കിക്കൽ ക്ലസ്റ്ററിംഗ് രീതി ഉപയോഗിച്ച് കണക്കാക്കുന്നു.മോട്ടിഫ് സ്‌കോറിംഗ് ഡാറ്റയുടെ സ്റ്റാറ്റിസ്റ്റിക്കൽ വിശകലനത്തിനായി, ഫിഷറിന്റെ കൃത്യമായ പരിശോധന ഉപയോഗിച്ച് സാധാരണമല്ലാത്ത സ്‌കോറിംഗിനായുള്ള പി മൂല്യങ്ങൾ കണക്കാക്കുന്നു.മറ്റ് ഡാറ്റാസെറ്റുകൾക്കായുള്ള പി-മൂല്യങ്ങൾ വിദ്യാർത്ഥികളുടെ ടി-ടെസ്റ്റ് അല്ലെങ്കിൽ ANOVA ഉപയോഗിച്ച് R-ൽ കണക്കാക്കുന്നു.
തിരഞ്ഞെടുത്ത ഫേജ് ക്ലോണുകളും ഇൻസേർട്ടുകളില്ലാത്ത ഫേജുകളും ടെയിൽ സിരയിലൂടെ ഇൻട്രാവെൻസായി കുത്തിവയ്ക്കപ്പെട്ടു (300 μl PBS-ൽ 2×1010 phages/മൃഗങ്ങൾ).പെർഫ്യൂഷനും തുടർന്നുള്ള ഫിക്സേഷനും പത്ത് മിനിറ്റ് മുമ്പ്, അതേ മൃഗങ്ങൾക്ക് 100 μl DyLight594-ലേബൽ ചെയ്ത ലെക്റ്റിൻ (Vector Laboratories Inc., DL-1177) ഉപയോഗിച്ച് ഇൻട്രാവെൻസായി കുത്തിവച്ചു.ഫേജ് കുത്തിവയ്പ്പിന് 60 മിനിറ്റിനുശേഷം, എലികൾ ഹൃദയത്തിലൂടെ 50 മില്ലി പിബിഎസും തുടർന്ന് 50 മില്ലി 4% പിഎഫ്എ/പിബിഎസും നൽകി.മസ്തിഷ്ക സാമ്പിളുകൾ 4% PFA/PBS-ൽ ഒറ്റരാത്രികൊണ്ട് ഉറപ്പിക്കുകയും 30% സുക്രോസിൽ ഒറ്റരാത്രികൊണ്ട് 4°C-ൽ കുതിർക്കുകയും ചെയ്തു.OCT മിശ്രിതത്തിൽ സാമ്പിളുകൾ ഫ്ലാഷ് ഫ്രീസ് ചെയ്യുന്നു.ശീതീകരിച്ച സാമ്പിളുകളുടെ ഇമ്മ്യൂണോഹിസ്റ്റോകെമിക്കൽ വിശകലനം 30 µm ക്രയോസെക്ഷനുകളിൽ 1% BSA ഉപയോഗിച്ച് തടഞ്ഞു, 4 °C താപനിലയിൽ T7 phage (Novus NB 600-376A) നെതിരെ പോളിക്ലോണൽ FITC-ലേബൽ ചെയ്ത ആന്റിബോഡികൾ ഉപയോഗിച്ച് ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്തു.ഒറ്റരാത്രികൊണ്ട് ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്യുക.അവസാനമായി, വിഭാഗങ്ങൾ PBS ഉപയോഗിച്ച് 3 തവണ കഴുകി, ഒരു കൺഫോക്കൽ ലേസർ മൈക്രോസ്കോപ്പ് (Leica TCS SP5) ഉപയോഗിച്ച് പരിശോധിച്ചു.
കുറഞ്ഞത് 98% ശുദ്ധിയുള്ള എല്ലാ പെപ്റ്റൈഡുകളും ജെൻ‌സ്‌ക്രിപ്റ്റ് യു‌എസ്‌എ സമന്വയിപ്പിക്കുകയും ബയോട്ടിനൈലേറ്റ് ചെയ്യുകയും ലയോഫിലൈസ് ചെയ്യുകയും ചെയ്തു.എൻ-ടെർമിനസിലെ ഒരു അധിക ട്രിപ്പിൾ ഗ്ലൈസിൻ സ്‌പെയ്‌സർ വഴി ബയോട്ടിൻ ബന്ധിക്കപ്പെട്ടിരിക്കുന്നു.മാസ് സ്പെക്ട്രോമെട്രി ഉപയോഗിച്ച് എല്ലാ പെപ്റ്റൈഡുകളും പരിശോധിക്കുക.
സ്ട്രെപ്റ്റാവിഡിൻ (സിഗ്മ S0677) ബയോട്ടിനൈലേറ്റഡ് പെപ്റ്റൈഡിന്റെ 5-മടങ്ങ് ഇക്വിമോളാർ അധികവും, ബയോട്ടിനൈലേറ്റഡ് BACE1 ഇൻഹിബിറ്ററി പെപ്റ്റൈഡും അല്ലെങ്കിൽ ബയോട്ടിനൈലേറ്റഡ് BACE1 ഇൻഹിബിറ്ററി പെപ്റ്റൈഡും അല്ലെങ്കിൽ BACE1 ഇൻഹിബിറ്ററി പെപ്റ്റൈഡും BACE1 ഇൻഹിബിറ്ററി പെപ്റ്റൈഡും BACE1 ഇൻഹിബിറ്ററി PBS.കുത്തിവയ്പ്പിന് മുമ്പ് ഊഷ്മാവിൽ 1 മണിക്കൂർ.സെറിബ്രൽ അറയുള്ള എലികളുടെ വാൽ സിരകളിലൊന്നിലേക്ക് 10 മില്ലിഗ്രാം / കിലോഗ്രാം എന്ന അളവിൽ സ്ട്രെപ്‌റ്റാവിഡിൻ-സംയോജിപ്പിച്ച പെപ്റ്റൈഡുകൾ ഇൻട്രാവെനസ് ആയി കുത്തിവച്ചു.
സ്ട്രെപ്റ്റാവിഡിൻ-പെപ്റ്റൈഡ് കോംപ്ലക്സുകളുടെ സാന്ദ്രത ELISA വിലയിരുത്തി.Nunc Maxisorp microtiter പ്ലേറ്റുകൾ (സിഗ്മ) 1.5 μg/ml മൗസ് ആന്റി-സ്ട്രെപ്റ്റാവിഡിൻ ആന്റിബോഡി (തെർമോ, MA1-20011) ഉപയോഗിച്ച് ഒറ്റരാത്രികൊണ്ട് 4 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ പൊതിഞ്ഞു.2 മണിക്കൂർ റൂം ടെമ്പറേച്ചറിൽ ബ്ലോക്ക് ചെയ്‌തതിന് ശേഷം (ബ്ലോക്കിംഗ് ബഫർ: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0.05% NP40, 0.25% ജെലാറ്റിൻ, 1% BSA) പ്ലേറ്റ് 0.05% Tween-20/PBS (വാഷ് ബഫർ) ഉപയോഗിച്ച് കഴുകുക. ma 1:10,000, CSF 1:115).ഡിറ്റക്ഷൻ ആന്റിബോഡി (1 μg/ml, anti-streptavidin-HRP, Novus NB120-7239) ഉപയോഗിച്ച് പ്ലേറ്റ് 4 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ ഒറ്റരാത്രികൊണ്ട് ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്തു.മൂന്ന് വാഷിംഗ് ഘട്ടങ്ങൾക്ക് ശേഷം, 20 മിനിറ്റ് വരെ TMB സബ്‌സ്‌ട്രേറ്റ് ലായനിയിൽ (റോഷ്) ഇൻകുബേഷൻ വഴി സ്‌ട്രെപ്റ്റാവിഡിൻ കണ്ടെത്തി.1M H2SO4 ഉപയോഗിച്ച് വർണ്ണ വികസനം നിർത്തിയ ശേഷം, 450 nm-ൽ ആഗിരണം അളക്കുക.
സ്ട്രെപ്റ്റാവിഡിൻ-പെപ്റ്റൈഡ്-BACE1 ഇൻഹിബിറ്റർ കോംപ്ലക്‌സിന്റെ പ്രവർത്തനം നിർമ്മാതാവിന്റെ പ്രോട്ടോക്കോൾ (വാക്കോ, 294-64701) അനുസരിച്ച് Aβ(1-40) ELISA വിലയിരുത്തി.ചുരുക്കത്തിൽ, CSF സാമ്പിളുകൾ സ്റ്റാൻഡേർഡ് ഡിലൂയൻറിൽ (1:23) നേർപ്പിക്കുകയും BNT77 ക്യാപ്‌ചർ ആന്റിബോഡി പൊതിഞ്ഞ 96 കിണർ പ്ലേറ്റുകളിൽ ഒറ്റരാത്രികൊണ്ട് 4°C താപനിലയിൽ ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്യുകയും ചെയ്തു.അഞ്ച് വാഷിംഗ് ഘട്ടങ്ങൾക്ക് ശേഷം, എച്ച്ആർപി-കൺജഗേറ്റഡ് ബിഎ27 ആന്റിബോഡി ചേർത്ത് 4 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ 2 മണിക്കൂർ ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്തു, തുടർന്ന് അഞ്ച് വാഷിംഗ് സ്റ്റെപ്പുകൾ.ഊഷ്മാവിൽ 30 മിനിറ്റ് TMB ലായനിയിൽ ഇൻകുബേഷൻ വഴി Aβ(1-40) കണ്ടെത്തി.സ്റ്റോപ്പ് ലായനി ഉപയോഗിച്ച് വർണ്ണ വികസനം നിർത്തിയ ശേഷം, 450 nm-ൽ ആഗിരണം അളക്കുക.Aβ(1-40) ELISA യ്ക്ക് മുമ്പ് പ്ലാസ്മ സാമ്പിളുകൾ സോളിഡ് ഫേസ് എക്സ്ട്രാക്ഷന് വിധേയമാക്കി.96 കിണർ പ്ലേറ്റുകളിൽ പ്ലാസ്മ 0.2% ഡിഇഎ (സിഗ്മ) ലേക്ക് ചേർക്കുകയും 30 മിനിറ്റ് ഊഷ്മാവിൽ ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്യുകയും ചെയ്തു.വെള്ളവും 100% മെഥനോൾ ഉപയോഗിച്ച് SPE പ്ലേറ്റുകൾ (Oasis, 186000679) തുടർച്ചയായി കഴുകിയ ശേഷം, പ്ലാസ്മ സാമ്പിളുകൾ SPE പ്ലേറ്റുകളിലേക്ക് ചേർക്കുകയും എല്ലാ ദ്രാവകങ്ങളും നീക്കം ചെയ്യുകയും ചെയ്തു.സാമ്പിളുകൾ കഴുകി (ആദ്യം 5% മെഥനോൾ, പിന്നെ 30% മെഥനോൾ) കൂടാതെ 2% NH4OH/90% മെഥനോൾ ഉപയോഗിച്ച് നീക്കം ചെയ്തു.സ്ഥിരമായ N2 കറന്റിൽ 99 മിനിറ്റ് നേരത്തേക്ക് 55 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ എലുവേറ്റ് ഉണക്കിയ ശേഷം, സാമ്പിളുകൾ സ്റ്റാൻഡേർഡ് ഡില്യൂന്റുകളിൽ കുറയ്ക്കുകയും മുകളിൽ വിവരിച്ചതുപോലെ Aβ(1-40) അളക്കുകയും ചെയ്തു.
ഈ ലേഖനം എങ്ങനെ ഉദ്ധരിക്കാം: Urich, E. et al.വിവോയിൽ തിരിച്ചറിഞ്ഞ ട്രാൻസിറ്റ് പെപ്റ്റൈഡുകൾ ഉപയോഗിച്ച് തലച്ചോറിലേക്കുള്ള കാർഗോ ഡെലിവറി.ശാസ്ത്രം.5, 14104;doi:10.1038/srep14104 (2015).
Likhota J., Skjorringe T., Thomsen LB, Moos T. ടാർഗെറ്റഡ് തെറാപ്പി ഉപയോഗിച്ച് തലച്ചോറിലേക്ക് മാക്രോമോളികുലാർ മരുന്നുകൾ വിതരണം ചെയ്യുന്നു.ജേണൽ ഓഫ് ന്യൂറോകെമിസ്ട്രി 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C., and Martinez-Martinez, P. രക്ത-മസ്തിഷ്ക തടസ്സത്തിലൂടെ പെപ്റ്റൈഡ്, പ്രോട്ടീൻ മരുന്നുകൾ വിതരണം ചെയ്യുന്നു.പ്രോഗ് ന്യൂറോബയോൾ 87, 212-251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
Pardridge, WM രക്ത-മസ്തിഷ്ക തടസ്സം: മസ്തിഷ്ക മയക്കുമരുന്ന് വികസനത്തിൽ ഒരു തടസ്സം.NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
Johanson, KE, Duncan, JA, Stopa, EG, and Byrd, A. മെച്ചപ്പെട്ട മയക്കുമരുന്ന് ഡെലിവറി, കോറോയിഡ് പ്ലെക്സസ്-സിഎസ്എഫ് പാത്ത്വേ വഴി തലച്ചോറിലേക്ക് ലക്ഷ്യമിടുന്നതിനുള്ള സാധ്യതകൾ.ഫാർമസ്യൂട്ടിക്കൽ റിസർച്ച് 22, 1011-1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
Pardridge, WM മസ്തിഷ്കപ്രസവത്തിനായി മോളിക്യുലാർ ട്രോജൻ ഹോഴ്സുകളുള്ള ബയോഫാർമസ്യൂട്ടിക്കൽസിന്റെ ആധുനികവൽക്കരണം.ബയോകോൺജഗ് കെം 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008).
പർഡ്രിഡ്ജ്, രക്ത-മസ്തിഷ്ക തടസ്സത്തിലൂടെയുള്ള ഡബ്ല്യുഎം റിസപ്റ്റർ-മെഡിയേറ്റഡ് പെപ്റ്റൈഡ് ഗതാഗതം.എൻഡോക്ർ റവ. 7, 314–330 (1986).
നിവോഹെനർ, ജെ. തുടങ്ങിയവർ.മോണോവാലന്റ് മോളിക്യുലാർ ഷട്ടിലുകൾ ഉപയോഗിച്ച് മസ്തിഷ്കത്തിന്റെ നുഴഞ്ഞുകയറ്റവും ചികിത്സാ ആന്റിബോഡികളുടെ ഫലപ്രാപ്തിയും വർദ്ധിപ്പിക്കുക.ന്യൂറോൺ 81, 49-60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
ബിയാൻ-ലീ, എൻ. എറ്റ്.ട്രാൻസ്‌ഫെറിൻ റിസപ്റ്റർ (ടിഎഫ്ആർ) ട്രാൻസ്‌പോർട്ട് ടിഎഫ്ആർ ആന്റിബോഡികളുടെ അഫിനിറ്റി വേരിയന്റുകളുടെ മസ്തിഷ്‌ക ഗ്രഹണം നിർണ്ണയിക്കുന്നു.J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).