Nature.com സന്ദർശിച്ചതിന് നന്ദി.നിങ്ങൾ ഉപയോഗിക്കുന്ന ബ്രൗസർ പതിപ്പിന് പരിമിതമായ CSS പിന്തുണയുണ്ട്.മികച്ച അനുഭവത്തിനായി, നിങ്ങൾ ഒരു അപ്‌ഡേറ്റ് ചെയ്‌ത ബ്രൗസർ ഉപയോഗിക്കാൻ ഞങ്ങൾ ശുപാർശ ചെയ്യുന്നു (അല്ലെങ്കിൽ Internet Explorer-ൽ അനുയോജ്യത മോഡ് പ്രവർത്തനരഹിതമാക്കുക).അതിനിടയിൽ, തുടർച്ചയായ പിന്തുണ ഉറപ്പാക്കാൻ, ഞങ്ങൾ ശൈലികളും JavaScript ഇല്ലാതെ സൈറ്റ് റെൻഡർ ചെയ്യും.
ലിക്വിഡ് ബയോപ്സി (എൽബി) എന്നത് ബയോമെഡിക്കൽ മേഖലയിൽ അതിവേഗം പ്രചാരം നേടിയുകൊണ്ടിരിക്കുന്ന ഒരു ആശയമാണ്.ഈ ആശയം പ്രധാനമായും രക്തചംക്രമണം ചെയ്യുന്ന എക്സ്ട്രാ സെല്ലുലാർ ഡിഎൻഎയുടെ (ccfDNA) ശകലങ്ങൾ കണ്ടെത്തുന്നതിനെ അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ളതാണ്, അവ പ്രധാനമായും വിവിധ ടിഷ്യൂകളിലെ കോശ മരണശേഷം ചെറിയ ശകലങ്ങളായി പുറത്തുവരുന്നു.ഈ ശകലങ്ങളുടെ ഒരു ചെറിയ ഭാഗം വിദേശ (വിദേശ) ടിഷ്യൂകളിൽ നിന്നോ ജീവികളിൽ നിന്നോ ഉത്ഭവിക്കുന്നു.നിലവിലെ പ്രവർത്തനത്തിൽ, ഉയർന്ന സമുദ്രജല ശുദ്ധീകരണ ശേഷിക്ക് പേരുകേട്ട കാവൽ ഇനമായ ചിപ്പികളിൽ ഞങ്ങൾ ഈ ആശയം പ്രയോഗിച്ചു.സമുദ്ര തീരദേശ ആവാസവ്യവസ്ഥയുടെ ജൈവവൈവിധ്യത്തെക്കുറിച്ചുള്ള വിവരങ്ങൾ നൽകുന്നതിന് വിവിധ സ്രോതസ്സുകളിൽ നിന്ന് പരിസ്ഥിതി ഡിഎൻഎ ശകലങ്ങൾ പിടിച്ചെടുക്കാൻ പ്രകൃതിദത്ത ഫിൽട്ടറുകളായി പ്രവർത്തിക്കാനുള്ള ചിപ്പികളുടെ കഴിവ് ഞങ്ങൾ ഉപയോഗിക്കുന്നു.1 മുതൽ 5 kb വരെ വലുപ്പത്തിൽ വ്യത്യാസമുള്ള ഡിഎൻഎ ശകലങ്ങൾ ചിപ്പി ഹീമോലിംഫിൽ അടങ്ങിയിട്ടുണ്ടെന്ന് ഞങ്ങളുടെ ഫലങ്ങൾ കാണിക്കുന്നു.ധാരാളം ഡിഎൻഎ ശകലങ്ങൾ വിദേശ സൂക്ഷ്മജീവികളുടെ ഉത്ഭവമാണെന്ന് ഷോട്ട്ഗൺ സീക്വൻസിങ് കാണിച്ചു.അവയിൽ, ബാക്ടീരിയ, ആർക്കിയ, വൈറസുകൾ എന്നിവയിൽ നിന്നുള്ള ഡിഎൻഎ ശകലങ്ങൾ ഞങ്ങൾ കണ്ടെത്തി, തീരദേശ സമുദ്ര ആവാസവ്യവസ്ഥയിൽ സാധാരണയായി കാണപ്പെടുന്ന വൈവിധ്യമാർന്ന ഹോസ്റ്റുകളെ ബാധിക്കുന്ന വൈറസുകൾ ഉൾപ്പെടെ.ഉപസംഹാരമായി, ഞങ്ങളുടെ പഠനം തെളിയിക്കുന്നത് ചിപ്പികളിൽ പ്രയോഗിക്കുന്ന എൽബി എന്ന ആശയം സമുദ്ര തീരദേശ ആവാസവ്യവസ്ഥയിലെ സൂക്ഷ്മജീവികളുടെ വൈവിധ്യത്തെക്കുറിച്ചുള്ള സമ്പന്നമായ എന്നാൽ ഇതുവരെ പര്യവേക്ഷണം ചെയ്യപ്പെടാത്ത അറിവിന്റെ ഉറവിടത്തെ പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നു.
സമുദ്ര ആവാസവ്യവസ്ഥയുടെ ജൈവ വൈവിധ്യത്തിൽ കാലാവസ്ഥാ വ്യതിയാനത്തിന്റെ (സിസി) സ്വാധീനം അതിവേഗം വളരുന്ന ഗവേഷണ മേഖലയാണ്.ആഗോളതാപനം സുപ്രധാനമായ ശാരീരിക സമ്മർദ്ദങ്ങൾക്ക് കാരണമാകുക മാത്രമല്ല, സമുദ്രജീവികളുടെ താപ സ്ഥിരതയുടെ പരിണാമ പരിധികൾ വർദ്ധിപ്പിക്കുകയും നിരവധി ജീവജാലങ്ങളുടെ ആവാസവ്യവസ്ഥയെ ബാധിക്കുകയും കൂടുതൽ അനുകൂലമായ സാഹചര്യങ്ങൾക്കായി തിരയാൻ അവരെ പ്രേരിപ്പിക്കുകയും ചെയ്യുന്നു [1, 2].മെറ്റാസോവുകളുടെ ജൈവവൈവിധ്യത്തെ ബാധിക്കുന്നതിനു പുറമേ, ആതിഥേയ-സൂക്ഷ്മ ജീവികളുടെ ഇടപെടലുകളുടെ സൂക്ഷ്മമായ സന്തുലിതാവസ്ഥയെ സിസി തടസ്സപ്പെടുത്തുന്നു.ഈ മൈക്രോബയൽ ഡിസ്ബാക്ടീരിയോസിസ് സമുദ്ര ആവാസവ്യവസ്ഥയ്ക്ക് ഗുരുതരമായ ഭീഷണി ഉയർത്തുന്നു, കാരണം ഇത് സമുദ്രജീവികളെ പകർച്ചവ്യാധികൾക്ക് കൂടുതൽ വിധേയമാക്കുന്നു [3, 4].കൂട്ടമരണങ്ങളിൽ SS ഒരു പ്രധാന പങ്ക് വഹിക്കുന്നുവെന്ന് വിശ്വസിക്കപ്പെടുന്നു, ഇത് ആഗോള സമുദ്ര ആവാസവ്യവസ്ഥയുടെ മാനേജ്മെന്റിന് ഗുരുതരമായ പ്രശ്നമാണ് [5, 6].പല സമുദ്രജീവികളുടെയും സാമ്പത്തികവും പാരിസ്ഥിതികവും പോഷകപരവുമായ പ്രത്യാഘാതങ്ങൾ കണക്കിലെടുക്കുമ്പോൾ ഇത് ഒരു പ്രധാന പ്രശ്നമാണ്.ധ്രുവപ്രദേശങ്ങളിൽ വസിക്കുന്ന ബിവാൾവുകൾക്ക് ഇത് പ്രത്യേകിച്ചും സത്യമാണ്, അവിടെ CK യുടെ പ്രത്യാഘാതങ്ങൾ വളരെ പെട്ടെന്നുള്ളതും കഠിനവുമാണ് [6, 7].വാസ്തവത്തിൽ, മൈറ്റിലസ് എസ്പിപി പോലുള്ള ബിവാൾവുകൾ.സമുദ്ര ആവാസവ്യവസ്ഥയിൽ സിസിയുടെ സ്വാധീനം നിരീക്ഷിക്കാൻ വ്യാപകമായി ഉപയോഗിക്കുന്നു.അവരുടെ ആരോഗ്യം നിരീക്ഷിക്കുന്നതിനായി താരതമ്യേന ധാരാളം ബയോമാർക്കറുകൾ വികസിപ്പിച്ചെടുത്തതിൽ അതിശയിക്കാനില്ല, പലപ്പോഴും എൻസൈമാറ്റിക് പ്രവർത്തനത്തെ അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള ഫംഗ്ഷണൽ ബയോ മാർക്കറുകൾ ഉൾപ്പെടുന്ന രണ്ട്-ടയർ സമീപനം അല്ലെങ്കിൽ സെൽ വയബിലിറ്റി, ഫാഗോസൈറ്റിക് ആക്റ്റിവിറ്റി [8] പോലുള്ള സെല്ലുലാർ പ്രവർത്തനങ്ങൾ ഉപയോഗിക്കുന്നു.വലിയ അളവിൽ കടൽജലം ആഗിരണം ചെയ്തതിനുശേഷം മൃദുവായ ടിഷ്യൂകളിൽ അടിഞ്ഞുകൂടുന്ന പ്രത്യേക സമ്മർദ്ദ സൂചകങ്ങളുടെ സാന്ദ്രത അളക്കുന്നതും ഈ രീതികളിൽ ഉൾപ്പെടുന്നു.എന്നിരുന്നാലും, ബിവാൾവുകളുടെ ഉയർന്ന ഫിൽട്ടറേഷൻ ശേഷിയും സെമി-ഓപ്പൺ രക്തചംക്രമണ സംവിധാനവും ലിക്വിഡ് ബയോപ്സി (എൽബി) എന്ന ആശയം ഉപയോഗിച്ച് പുതിയ ഹീമോലിംഫ് ബയോമാർക്കറുകൾ വികസിപ്പിക്കാനുള്ള അവസരം നൽകുന്നു, ഇത് രോഗിയുടെ മാനേജ്മെന്റിനുള്ള ലളിതവും കുറഞ്ഞ ആക്രമണാത്മകവുമായ സമീപനമാണ്.രക്ത സാമ്പിളുകൾ [9, 10].മനുഷ്യ എൽബിയിൽ നിരവധി തരം രക്തചംക്രമണ തന്മാത്രകൾ കണ്ടെത്താമെങ്കിലും, ഈ ആശയം പ്രാഥമികമായി പ്ലാസ്മയിലെ എക്സ്ട്രാ സെല്ലുലാർ ഡിഎൻഎ (സിസിഎഫ്ഡിഎൻഎ) ശകലങ്ങളുടെ ഡിഎൻഎ സീക്വൻസിങ് വിശകലനത്തെ അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ളതാണ്.വാസ്തവത്തിൽ, മനുഷ്യ പ്ലാസ്മയിൽ രക്തചംക്രമണം ചെയ്യുന്ന ഡിഎൻഎയുടെ സാന്നിധ്യം 20-ാം നൂറ്റാണ്ടിന്റെ മധ്യം മുതൽ അറിയപ്പെട്ടിരുന്നു [11], എന്നാൽ സമീപ വർഷങ്ങളിൽ മാത്രമാണ് ഹൈ-ത്രൂപുട്ട് സീക്വൻസിങ് രീതികളുടെ വരവ് ccfDNA അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള ക്ലിനിക്കൽ രോഗനിർണയത്തിലേക്ക് നയിച്ചത്.ഈ രക്തചംക്രമണ ഡിഎൻഎ ശകലങ്ങളുടെ സാന്നിദ്ധ്യം കോശങ്ങളുടെ മരണശേഷം ജനിതക ഡിഎൻഎയുടെ (ന്യൂക്ലിയർ, മൈറ്റോകോൺഡ്രിയൽ) നിഷ്ക്രിയമായ പ്രകാശനം മൂലമാണ്. ആരോഗ്യമുള്ള വ്യക്തികളിൽ, ccfDNA യുടെ സാന്ദ്രത സാധാരണയായി കുറവാണ് (<10 ng/mL) എന്നാൽ വിവിധ പാത്തോളജികൾ അനുഭവിക്കുന്ന രോഗികളിൽ അല്ലെങ്കിൽ സമ്മർദ്ദത്തിന് വിധേയരായ രോഗികളിൽ ഇത് 5-10 മടങ്ങ് വർദ്ധിപ്പിക്കാം, ഇത് ടിഷ്യു നാശത്തിന് കാരണമാകുന്നു. ആരോഗ്യമുള്ള വ്യക്തികളിൽ, ccfDNA യുടെ സാന്ദ്രത സാധാരണയായി കുറവാണ് (<10 ng/mL) എന്നാൽ വിവിധ പാത്തോളജികൾ അനുഭവിക്കുന്ന രോഗികളിൽ അല്ലെങ്കിൽ സമ്മർദ്ദത്തിന് വിധേയരായ രോഗികളിൽ ഇത് 5-10 മടങ്ങ് വർദ്ധിപ്പിക്കാം, ഇത് ടിഷ്യു നാശത്തിന് കാരണമാകുന്നു. പുതിയ നിയമങ്ങൾ നോയ് പട്ടോലോഗി അല്ലെങ്കിൽ പൊദ്വെര്ഗയുസ്ഛ്യ്ഹ്സ്യ സ്ത്രെഷു, പ്രിവൊദ്യസ്ഛെമു കെ പൊവ്രെജ്ഹ്ദെനിയു ത്കനെയ്. ആരോഗ്യമുള്ള ആളുകളിൽ, cccDNA യുടെ സാന്ദ്രത സാധാരണയായി കുറവാണ് (<10 ng/mL), എന്നാൽ വിവിധ പാത്തോളജികൾ ഉള്ള രോഗികളിൽ അല്ലെങ്കിൽ ടിഷ്യു നാശത്തിലേക്ക് നയിക്കുന്ന സമ്മർദ്ദത്തിലായ രോഗികളിൽ ഇത് 5-10 മടങ്ങ് വർദ്ധിക്കും.കൂടാതെ -10 倍，从而导致组织损伤。കൂടാതെ增加 5-10 ഒപ്പംccfDNA ഒബ്ыച്ച്നോ നിസ്കി (<10 ng/ml) യു ഡോറോവിഷ് ലിഡേയ്, നോ മൊഗുത് ബ്ыത് ഉവെല്യ്ഛ്യ്വെത് 5-10 ന്ыമി പതൊലൊഗിഅമി അല്ലെങ്കിൽ സ്ട്രെസ്സോം, ച്തൊ പ്രിവൊദിത് ക് പൊവ്രെജ്ഹ്ദെനിയു ത്കനെയ്. ആരോഗ്യമുള്ള വ്യക്തികളിൽ ccfDNA സാന്ദ്രത സാധാരണയായി കുറവാണ് (<10 ng/ml), എന്നാൽ വിവിധ പാത്തോളജികളോ സമ്മർദ്ദമോ ഉള്ള രോഗികളിൽ ഇത് 5-10 മടങ്ങ് വർദ്ധിപ്പിക്കാം, ഇത് ടിഷ്യു നാശത്തിന് കാരണമാകുന്നു.ccfDNA ശകലങ്ങളുടെ വലിപ്പം വളരെ വ്യത്യസ്തമാണ്, എന്നാൽ സാധാരണയായി 150 മുതൽ 200 bp വരെയാണ്.[12].ന്യൂക്ലിയർ കൂടാതെ/അല്ലെങ്കിൽ മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ജീനോമിലെ ജനിതകവും എപിജെനെറ്റിക് മാറ്റങ്ങളും കണ്ടെത്തുന്നതിന് സ്വയം-ഉത്പന്നമായ ccfDNA, അതായത്, സാധാരണ അല്ലെങ്കിൽ രൂപാന്തരപ്പെട്ട ഹോസ്റ്റ് സെല്ലുകളിൽ നിന്നുള്ള ccfDNA-യുടെ വിശകലനം, അതുവഴി നിർദ്ദിഷ്ട തന്മാത്ര-ലക്ഷ്യചികിത്സകൾ തിരഞ്ഞെടുക്കാൻ ഡോക്ടർമാരെ സഹായിക്കുന്നു [13] .എന്നിരുന്നാലും, ccfDNA, ccfDNA പോലുള്ള വിദേശ സ്രോതസ്സുകളിൽ നിന്ന് ഗർഭകാലത്തെ ഗര്ഭപിണ്ഡത്തിന്റെ കോശങ്ങളില് നിന്നോ മാറ്റിവയ്ക്കപ്പെട്ട അവയവങ്ങളില് നിന്നോ [14,15,16,17] ലഭിക്കും.ccfDNA ഒരു പകർച്ചവ്യാധി ഏജന്റിന്റെ (വിദേശ) ന്യൂക്ലിക് ആസിഡുകളുടെ സാന്നിധ്യം കണ്ടെത്തുന്നതിനുള്ള ഒരു പ്രധാന വിവര സ്രോതസ്സാണ്, ഇത് രക്ത സംസ്കാരങ്ങളാൽ തിരിച്ചറിയപ്പെടാത്ത വ്യാപകമായ അണുബാധകൾ ആക്രമണാത്മകമല്ലാത്ത കണ്ടെത്തൽ അനുവദിക്കുന്നു, രോഗബാധിതമായ ടിഷ്യുവിന്റെ ആക്രമണാത്മക ബയോപ്സി ഒഴിവാക്കുന്നു [18].വൈറൽ, ബാക്ടീരിയ രോഗകാരികളെ തിരിച്ചറിയാൻ ഉപയോഗിക്കാവുന്ന വിവരങ്ങളുടെ സമ്പന്നമായ ഉറവിടം മനുഷ്യരക്തത്തിൽ ഉണ്ടെന്നും മനുഷ്യ പ്ലാസ്മയിൽ കാണപ്പെടുന്ന ccfDNA യുടെ ഏകദേശം 1% വിദേശ ഉത്ഭവമാണെന്നും സമീപകാല പഠനങ്ങൾ തെളിയിച്ചിട്ടുണ്ട് [19].ccfDNA വിശകലനം ഉപയോഗിച്ച് ഒരു ജീവിയുടെ രക്തചംക്രമണ മൈക്രോബയോമിന്റെ ജൈവവൈവിധ്യം വിലയിരുത്താൻ കഴിയുമെന്ന് ഈ പഠനങ്ങൾ തെളിയിക്കുന്നു.എന്നിരുന്നാലും, അടുത്തിടെ വരെ, ഈ ആശയം മനുഷ്യരിലും ഒരു പരിധിവരെ മറ്റ് കശേരുക്കളിലും മാത്രമായി ഉപയോഗിച്ചിരുന്നു [20, 21].
നിലവിലെ പേപ്പറിൽ, 35 ദശലക്ഷം വർഷങ്ങൾക്ക് മുമ്പ് രൂപപ്പെട്ട ഒരു വലിയ പീഠഭൂമിക്ക് മുകളിലുള്ള ദ്വീപുകളുടെ ഒരു കൂട്ടമായ സബാന്റാർട്ടിക്ക് കെർഗുലെൻ ദ്വീപുകളിൽ സാധാരണയായി കാണപ്പെടുന്ന തെക്കൻ ഇനമായ ഓലകോമിയ അട്രയുടെ ccfDNA വിശകലനം ചെയ്യാൻ ഞങ്ങൾ LB സാധ്യത ഉപയോഗിക്കുന്നു.അഗ്നിപർവ്വത സ്ഫോടനം.ഒരു ഇൻ വിട്രോ പരീക്ഷണ സംവിധാനം ഉപയോഗിച്ച്, കടൽജലത്തിലെ ഡിഎൻഎ ശകലങ്ങൾ ചിപ്പികൾ വേഗത്തിൽ എടുത്ത് ഹീമോലിംഫ് കമ്പാർട്ടുമെന്റിൽ പ്രവേശിക്കുന്നതായി ഞങ്ങൾ കണ്ടെത്തി.മസ്സൽ ഹീമോലിംഫ് ccfDNA യിൽ സിംബയോട്ടിക് ബാക്ടീരിയയും തണുത്ത അഗ്നിപർവ്വത സമുദ്ര തീരദേശ ആവാസവ്യവസ്ഥയുടെ സാധാരണ ബയോമുകളിൽ നിന്നുള്ള DNA ശകലങ്ങളും ഉൾപ്പെടെ, സ്വന്തമല്ലാത്തതും അല്ലാത്തതുമായ ഡിഎൻഎ ശകലങ്ങൾ അടങ്ങിയിട്ടുണ്ടെന്ന് ഷോട്ട്ഗൺ സീക്വൻസിങ് തെളിയിച്ചിട്ടുണ്ട്.വ്യത്യസ്ത ഹോസ്റ്റ് ശ്രേണികളുള്ള വൈറസുകളിൽ നിന്ന് ഉരുത്തിരിഞ്ഞ വൈറൽ സീക്വൻസുകളും ഹീമോലിംഫ് ccfDNA ഉൾക്കൊള്ളുന്നു.അസ്ഥി മത്സ്യം, കടൽ അനിമോണുകൾ, ആൽഗകൾ, പ്രാണികൾ തുടങ്ങിയ ബഹുകോശ ജന്തുക്കളിൽ നിന്നുള്ള ഡിഎൻഎ ശകലങ്ങളും ഞങ്ങൾ കണ്ടെത്തി.ഉപസംഹാരമായി, സമുദ്ര ആവാസവ്യവസ്ഥയിൽ സമ്പന്നമായ ഒരു ജീനോമിക് ശേഖരം സൃഷ്ടിക്കുന്നതിന് സമുദ്ര അകശേരുക്കളിൽ എൽബി ആശയം വിജയകരമായി പ്രയോഗിക്കാൻ കഴിയുമെന്ന് ഞങ്ങളുടെ പഠനം തെളിയിക്കുന്നു.
മുതിർന്നവർ (55-70 മില്ലിമീറ്റർ നീളം) മൈറ്റിലസ് പ്ലാറ്റെൻസിസ് (എം. പ്ലാറ്റെൻസിസ്), ഔലകോമിയ അട്ര (എ. അട്ര) എന്നിവ പോർട്ട്-ഓ-ഫ്രാൻസ് (049°21.235 എസ്, 070°13.490 ഇ.) ഇടവിട്ടുള്ള പാറക്കെട്ടുകളുടെ തീരങ്ങളിൽ നിന്ന് ശേഖരിച്ചു.2018 ഡിസംബറിൽ കെർഗുലെൻ ദ്വീപുകൾ. മറ്റ് മുതിർന്ന നീല ചിപ്പികൾ (Mytilus spp.) ഒരു വാണിജ്യ വിതരണക്കാരനിൽ നിന്ന് (PEI Mussel King Inc., Prince Edward Island, Canada) വാങ്ങി, 10-20 L 32‰ കൃത്രിമ ഉപ്പുവെള്ളം അടങ്ങിയ താപനില നിയന്ത്രിത (4°C) വായുസഞ്ചാരമുള്ള ടാങ്കിൽ സ്ഥാപിച്ചു.(കൃത്രിമ കടൽ ഉപ്പ് റീഫ് ക്രിസ്റ്റൽ, തൽക്ഷണ സമുദ്രം, വിർജീനിയ, യുഎസ്എ).ഓരോ പരീക്ഷണത്തിനും, വ്യക്തിഗത ഷെല്ലുകളുടെ നീളവും ഭാരവും അളന്നു.
ഈ പ്രോഗ്രാമിനായുള്ള സൗജന്യ ഓപ്പൺ ആക്സസ് പ്രോട്ടോക്കോൾ ഓൺലൈനിൽ ലഭ്യമാണ് (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1).ചുരുക്കത്തിൽ, വിവരിച്ച പ്രകാരം എൽബി ഹീമോലിംഫ് അപഹരിക്കുന്ന പേശികളിൽ നിന്ന് ശേഖരിച്ചു [22].3 മിനിറ്റ് നേരത്തേക്ക് 1200×g-ൽ സെൻട്രിഫ്യൂഗേഷൻ വഴി ഹീമോലിംഫ് വ്യക്തമാക്കി, സൂപ്പർനാറ്റന്റ് ഉപയോഗിക്കുന്നത് വരെ ഫ്രീസ് ചെയ്തു (-20°C).cfDNA യുടെ ഒറ്റപ്പെടുത്തലിനും ശുദ്ധീകരണത്തിനുമായി, സാമ്പിളുകൾ (1.5-2.0 ml) നിർമ്മാതാവിന്റെ നിർദ്ദേശങ്ങൾ അനുസരിച്ച് ന്യൂക്ലിയോസ്നാപ്പ് cfDNA കിറ്റ് (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) ഉപയോഗിച്ച് ഉരുകുകയും പ്രോസസ്സ് ചെയ്യുകയും ചെയ്തു.കൂടുതൽ വിശകലനം ചെയ്യുന്നതുവരെ ccfDNA -80°C-ൽ സൂക്ഷിച്ചിരിക്കുന്നു.ചില പരീക്ഷണങ്ങളിൽ, QIAamp DNA ഇൻവെസ്റ്റിഗേറ്റർ കിറ്റ് (QIAGEN, Toronto, Ontario, Canada) ഉപയോഗിച്ച് ccfDNA വേർതിരിച്ചെടുക്കുകയും ശുദ്ധീകരിക്കുകയും ചെയ്തു.ശുദ്ധീകരിക്കപ്പെട്ട ഡിഎൻഎ ഒരു സാധാരണ PicoGreen അസ്സേ ഉപയോഗിച്ച് അളന്നു.ഉയർന്ന സംവേദനക്ഷമതയുള്ള ഡിഎൻഎ കിറ്റ് ഉപയോഗിച്ച് എജിലന്റ് 2100 ബയോഅനലൈസർ (എജിലന്റ് ടെക്‌നോളജീസ് ഇൻക്., സാന്താ ക്ലാര, സിഎ) ഉപയോഗിച്ച് കാപ്പിലറി ഇലക്‌ട്രോഫോറെസിസ് ഉപയോഗിച്ച് ഒറ്റപ്പെട്ട ccfDNA യുടെ ശകല വിതരണം വിശകലനം ചെയ്തു.നിർമ്മാതാവിന്റെ നിർദ്ദേശങ്ങൾ അനുസരിച്ച് ccfDNA സാമ്പിളിന്റെ 1 µl ഉപയോഗിച്ചാണ് പരിശോധന നടത്തിയത്.
ഹീമോലിംഫ് ccfDNA ശകലങ്ങൾ ക്രമപ്പെടുത്തുന്നതിനായി, Génome Québec (Montreal, Quebec, Canada) Illumina MiSeq PE75 കിറ്റിന്റെ Illumina DNA മിക്സ് കിറ്റ് ഉപയോഗിച്ച് ഷോട്ട്ഗൺ ലൈബ്രറികൾ തയ്യാറാക്കി.ഒരു സാധാരണ അഡാപ്റ്റർ (BioO) ഉപയോഗിച്ചു.NCBI സീക്വൻസ് റീഡ് ആർക്കൈവിൽ (SRR8924808, SRR8924809) റോ ഡാറ്റ ഫയലുകൾ ലഭ്യമാണ്.FastQC [23] ഉപയോഗിച്ച് അടിസ്ഥാന വായന നിലവാരം വിലയിരുത്തി.ട്രിമ്മോമാറ്റിക് [24] ക്ലിപ്പിംഗ് അഡാപ്റ്ററുകൾക്കും മോശം നിലവാരമുള്ള വായനയ്ക്കും ഉപയോഗിക്കുന്നു.ജോടിയാക്കിയ അറ്റങ്ങളുള്ള ഷോട്ട്ഗൺ റീഡുകൾ പൊരുത്തക്കേടുകൾ ഒഴിവാക്കാൻ ഏറ്റവും കുറഞ്ഞ 20 ബിപി ഓവർലാപ്പുള്ള ദൈർഘ്യമേറിയ സിംഗിൾ റീഡുകളിലേക്ക് ഫ്ലാഷ് ലയിപ്പിച്ചു [25]. ബിവാൽവ് എൻസിബിഐ ടാക്സോണമി ഡാറ്റാബേസ് (ഇ മൂല്യം <1e−3, 90% ഹോമോളജി) ഉപയോഗിച്ച് BLASTN-ൽ ലയിപ്പിച്ച വായനകൾ വ്യാഖ്യാനിച്ചു, കൂടാതെ DUST ഉപയോഗിച്ച് ലോ-കോംപ്ലക്‌സിറ്റി സീക്വൻസുകളുടെ മാസ്‌കിംഗ് നടത്തി [26]. ബിവാൽവ് എൻസിബിഐ ടാക്സോണമി ഡാറ്റാബേസ് (ഇ മൂല്യം <1e−3, 90% ഹോമോളജി) ഉപയോഗിച്ച് BLASTN-ൽ ലയിപ്പിച്ച വായനകൾ വ്യാഖ്യാനിച്ചു, കൂടാതെ DUST ഉപയോഗിച്ച് ലോ-കോംപ്ലക്‌സിറ്റി സീക്വൻസുകളുടെ മാസ്‌കിംഗ് നടത്തി [26]. ഒബ്ъഎദിനെംന്ыഎ ച്തെനിയ ബ്ыലി അനൊതിരൊവന്ы എസ് പൊമൊശ്ഛ്ജു ബ്ലാസ്റ്റ്എൻ എസ് ഇസ്പോൾസോവനിഎമ് ബസ്സി ദന്ыഹ് തക്സൊനൊമിഎസ് BI (സാധാരണ ഇ <1e-3 അല്ലെങ്കിൽ 90% ഗൊമോലോഗ്), ഒരു മാസ്കിംഗ് പോസ്റ്റുകൾ 26]. NCBI bivalve ടാക്‌സോണമി ഡാറ്റാബേസ് (ഇ മൂല്യം <1e-3, 90% ഹോമോളജി) ഉപയോഗിച്ച് BLASTN ഉപയോഗിച്ച് പൂൾ ചെയ്ത റീഡുകൾ വ്യാഖ്യാനിച്ചു, കൂടാതെ DUST ഉപയോഗിച്ച് കുറഞ്ഞ സങ്കീർണ്ണത സീക്വൻസ് മാസ്‌കിംഗ് നടത്തി [26].നിങ്ങൾ NCBI低复杂度序列的掩蔽。使用 双 壳类 ncbi 分类复杂度 序列 的。。。掩蔽 掩蔽ഒബ്ъഎദിനെംന്ыഎ ച്തെനിയ ബ്ыലി അനൊതിരൊവന്ы എസ് പൊമൊശ്ഛ്ജു ബ്ലാസ്റ്റ്എൻ എസ് ഐസ്പോൾസോവനിഎമ് തക്സൊനൊമിഛെസ്കൊയ് ബസ് ദൊസ്ത്യ്ഹെത് കോവ് എൻസിബിഐ (സാധാരണ ഇ <1e-3 അല്ലെങ്കിൽ 90% ഗൊമോലോഗി), ഒരു മാസ്കിറവണിയ പോസ്ലെഡോവതെല്നൊസ്തെയ് നൈസ്ക്കോയ് സ്ലോവ്നോസ്റ്റിക് പൊടി [26]. NCBI bivalve ടാക്സോണമിക് ഡാറ്റാബേസ് (ഇ മൂല്യം <1e-3, 90% ഹോമോളജി) ഉപയോഗിച്ച് BLASTN ഉപയോഗിച്ച് പൂൾ ചെയ്ത റീഡുകൾ വ്യാഖ്യാനിച്ചു, കൂടാതെ DUST ഉപയോഗിച്ച് കുറഞ്ഞ സങ്കീർണ്ണത സീക്വൻസ് മാസ്‌കിംഗ് നടത്തി [26].വായനകളെ രണ്ട് ഗ്രൂപ്പുകളായി തിരിച്ചിരിക്കുന്നു: ബൈവാൾവ് സീക്വൻസുകളുമായി ബന്ധപ്പെട്ടതും (ഇവിടെ സ്വയം-വായന എന്ന് വിളിക്കുന്നു) ബന്ധമില്ലാത്തതും (സ്വയം വായിക്കാത്തവ).മെഗാഹിറ്റ് ഉപയോഗിച്ച് കോണ്ടിഗുകൾ സൃഷ്ടിക്കുന്നതിനായി രണ്ട് ഗ്രൂപ്പുകളെ വെവ്വേറെ കൂട്ടിച്ചേർക്കുന്നു [27].അതേസമയം, ഏലിയൻ മൈക്രോബയോം റീഡുകളുടെ ടാക്സോണമിക് ഡിസ്ട്രിബ്യൂഷൻ ക്രാക്കൻ2 [28] ഉപയോഗിച്ച് തരംതിരിക്കുകയും ഗാലക്സിയിലെ ക്രോണ പൈ ചാർട്ട് ഗ്രാഫിക്കായി പ്രതിനിധീകരിക്കുകയും ചെയ്തു [29, 30].ഞങ്ങളുടെ പ്രാഥമിക പരീക്ഷണങ്ങളിൽ നിന്ന് ഒപ്റ്റിമൽ കിലോമീറ്ററുകൾ kmers-59 ആണെന്ന് നിർണ്ണയിച്ചു. അന്തിമ വ്യാഖ്യാനത്തിനായി BLASTN (bivalve NCBI ഡാറ്റാബേസ്, ഇ മൂല്യം <1e−10, 60% ഹോമോളജി) എന്നിവയുമായി വിന്യസിച്ചുകൊണ്ട് സ്വയം കോൺടിഗുകൾ തിരിച്ചറിഞ്ഞു. അന്തിമ വ്യാഖ്യാനത്തിനായി BLASTN (bivalve NCBI ഡാറ്റാബേസ്, ഇ മൂല്യം <1e−10, 60% ഹോമോളജി) എന്നിവയുമായി വിന്യസിച്ചുകൊണ്ട് സ്വയം കോൺടിഗുകൾ തിരിച്ചറിഞ്ഞു. ഗാതെം സോബ്സ്ട്വെന്ыഎ കോണ്ടിഗി ബൈലി ഐഡന്റിഫിഷ്യൻറോവാൻ പുതെം സോപോസ്റ്റവ്ലെനിയ എസ് ബ്ലാസ്റ്റ്എൻ ение e <1e-10 и гомология 60%) അന്തിമ വ്യാഖ്യാനത്തിനായി BLASTN (NCBI bivalve ഡാറ്റാബേസ്, ഇ മൂല്യം <1e-10, 60% ഹോമോളജി) എന്നിവയുമായി പൊരുത്തപ്പെടുത്തിക്കൊണ്ട് സ്വയം-കോൺറ്റിഗുകൾ തിരിച്ചറിഞ്ഞു.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）对齐来识识别最终注释.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% ഗാതെം ബൈലി ഐഡന്റിഫിഷ്യൽ സോബ്‌സ്‌റ്റ്‌വെന്റി കോണ്ടിഗി ഡിലിയ ഒകൊൻചതെല്‌നോയ് അനോതസി പുതെം സോപോസ്റ്റംസ് для двустворчатых моллюсков, значение e <1e-10 и гомология 60%). BLASTN (NCBI bivalve ഡാറ്റാബേസ്, ഇ മൂല്യം <1e-10, 60% ഹോമോളജി) എന്നിവയുമായി പൊരുത്തപ്പെടുത്തിക്കൊണ്ട് അന്തിമ വ്യാഖ്യാനത്തിനായി സ്വയം-കോൺറ്റിഗുകൾ തിരിച്ചറിഞ്ഞു. സമാന്തരമായി, നോൺസെൽഫ് ഗ്രൂപ്പ് കോണ്ടിഗുകൾ BLASTN (nt NCBI ഡാറ്റാബേസ്, ഇ മൂല്യം <1e−10, 60% ഹോമോളജി) ഉപയോഗിച്ച് വ്യാഖ്യാനിച്ചു. സമാന്തരമായി, നോൺസെൽഫ് ഗ്രൂപ്പ് കോണ്ടിഗുകൾ BLASTN (nt NCBI ഡാറ്റാബേസ്, ഇ മൂല്യം <1e−10, 60% ഹോമോളജി) ഉപയോഗിച്ച് വ്യാഖ്യാനിച്ചു. പറല്ലെൽനോ ചുജറോഡ്നി ഗ്രുപ്പോവ്യൂ കോണ്ടിഗി ബൈലി അനോട്ടിറോവാൻസ് പോമോസ്യു ബ്ലാസ്റ്റ്‌എൻ (ബാസ ഡാനിങ്ങ് <NCBI, 10 60%). സമാന്തരമായി, BLASTN (NT NCBI ഡാറ്റാബേസ്, ഇ മൂല്യം <1e-10, 60% ഹോമോളജി) ഉപയോഗിച്ച് വിദേശ ഗ്രൂപ്പ് കോൺടിഗുകൾ വ്യാഖ്യാനിച്ചു.平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群群平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群群 പറല്ലെൽനോ കോൺടിഗി, ഒത്നൊസ്യസ്ഛ്യ്ത് അല്ല സൊബ്സ്ത്വെംനൊയ് ഗ്രുപ്പെ, ബ്യ്ലി അനൊത്തിരൊവന്ы ന് പൊമൊശ്ഛ്ജു ബ്ലെസ്ത്ന്ы (ബ്ലാസ്റ്റ് ന് <1e-10 и гомология 60%). സമാന്തരമായി, നോൺ-സെൽഫ് ഗ്രൂപ്പ് കോണ്ടിഗുകൾ BLASTN (nt NCBI ഡാറ്റാബേസ്, ഇ മൂല്യം <1e-10, 60% ഹോമോളജി) ഉപയോഗിച്ച് വ്യാഖ്യാനിച്ചു. Nr, RefSeq പ്രോട്ടീൻ NCBI ഡാറ്റാബേസുകൾ (ഇ മൂല്യം <1e−10, 60% ഹോമോളജി) ഉപയോഗിച്ച് നോൺസെൽഫ് കോണ്ടിഗുകളിലും BLASTX നടത്തി. Nr, RefSeq പ്രോട്ടീൻ NCBI ഡാറ്റാബേസുകൾ (ഇ മൂല്യം <1e−10, 60% ഹോമോളജി) ഉപയോഗിച്ച് നോൺസെൽഫ് കോണ്ടിഗുകളിലും BLASTX നടത്തി. BLASTX ടാക്‌ജെ ബൈൽ പ്രോവെഡൻ നെസമോസ്‌റ്റോയതെല്ന്ыഹ് കോൺടിഗാഹ് സ് ഇസ്‌പോൾസോവനിം ബാസ് ഡാനിക് ബെൽക്ക എൻആർ-ബിഐസി 10 ഒലോജിയ 60%). Nr, RefSeq NCBI പ്രോട്ടീൻ ഡാറ്റാബേസുകൾ (ഇ മൂല്യം <1e-10, 60% ഹോമോളജി) ഉപയോഗിച്ച് നോൺ-സെൽഫ് കോണ്ടിഗുകളിലും BLASTX നടത്തി.还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 倌60%还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 倌60% BLASTX ടാക്‌ജെ വിപണനങ്ങൾ നെസമോസ്‌റ്റോയതെൽസ് കോൺട്ടിഗാഹ് സ് ഐസ്‌പോൾസോവനിം ബാസ് ഡാനിക് ബെൽക്ക എൻആർ & റെഫ്‌സെക് എൻ.സി.ബി.ഐ. 60%). Nr, RefSeq NCBI പ്രോട്ടീൻ ഡാറ്റാബേസുകൾ (ഇ മൂല്യം <1e-10, 60% ഹോമോളജി) ഉപയോഗിച്ച് നോൺ-സെൽഫ് കോണ്ടിഗുകളിലും BLASTX നടത്തി.നോൺ-സെൽഫ്-കോൺറ്റിഗുകളുടെ BLASTN, BLASTX പൂളുകൾ അന്തിമ കോൺടിഗുകളെ പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നു (സപ്ലിമെന്ററി ഫയൽ കാണുക).
PCR-ന് ഉപയോഗിക്കുന്ന പ്രൈമറുകൾ പട്ടിക S1-ൽ പട്ടികപ്പെടുത്തിയിട്ടുണ്ട്.ടാക് ഡിഎൻഎ പോളിമറേസ് (ബയോ ബേസിക് കാനഡ, മാർക്കം, ഓൺ) ccfDNA ടാർഗെറ്റ് ജീനുകളെ വർദ്ധിപ്പിക്കാൻ ഉപയോഗിച്ചു.ഇനിപ്പറയുന്ന പ്രതികരണ വ്യവസ്ഥകൾ ഉപയോഗിച്ചു: 3 മിനിറ്റ് നേരത്തേക്ക് 95 ° C, 1 മിനിറ്റിന് 95 ° C, 1 മിനിറ്റിന് അനീലിംഗ് താപനില സജ്ജമാക്കുക, 1 മിനിറ്റിന് 72 ° C ൽ നീട്ടൽ, 35 സൈക്കിളുകൾ, ഒടുവിൽ 10 മിനിറ്റിനുള്ളിൽ 72 ° C..95 V-ൽ SYBRTM സേഫ് ഡിഎൻഎ ജെൽ സ്റ്റെയിൻ (ഇൻവിട്രോജൻ, ബർലിംഗ്ടൺ, ഓൺ, കാനഡ) അടങ്ങിയ അഗറോസ് ജെല്ലുകളിലെ (1.5%) ഇലക്‌ട്രോഫോറെസിസ് വഴി പിസിആർ ഉൽപ്പന്നങ്ങളെ വേർതിരിക്കുന്നു.
ചിപ്പികളെ (Mytilus spp.) 500 ml ഓക്സിജൻ അടങ്ങിയ കടൽജലത്തിൽ (32 PSU) 24 മണിക്കൂർ 4 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ പരിശീലിപ്പിച്ചു.ഹ്യൂമൻ ഗാലക്റ്റിൻ-7 cDNA സീക്വൻസ് (NCBI പ്രവേശന നമ്പർ L07769) എൻകോഡ് ചെയ്യുന്ന ഒരു ഇൻസേർട്ട് അടങ്ങിയ പ്ലാസ്മിഡ് DNA 190 μg/μl എന്ന അന്തിമ സാന്ദ്രതയിൽ കുപ്പിയിലേക്ക് ചേർത്തു.ഡിഎൻഎ ചേർക്കാതെ അതേ അവസ്ഥയിൽ ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്ത ചിപ്പികളാണ് നിയന്ത്രണം.മൂന്നാമത്തെ നിയന്ത്രണ ടാങ്കിൽ ചിപ്പികളില്ലാത്ത ഡിഎൻഎ അടങ്ങിയിരുന്നു.സമുദ്രജലത്തിലെ ഡിഎൻഎയുടെ ഗുണനിലവാരം നിരീക്ഷിക്കാൻ, സൂചിപ്പിച്ച സമയത്ത് ഓരോ ടാങ്കിൽ നിന്നും കടൽജല സാമ്പിളുകൾ (20 μl; മൂന്ന് ആവർത്തനങ്ങൾ) എടുത്തു.പ്ലാസ്മിഡ് ഡിഎൻഎ കണ്ടെത്തുന്നതിന്, സൂചിപ്പിച്ച സമയങ്ങളിൽ എൽബി ചിപ്പികൾ വിളവെടുക്കുകയും qPCR, ddPCR എന്നിവ വിശകലനം ചെയ്യുകയും ചെയ്തു.സമുദ്രജലത്തിലെ ഉയർന്ന ഉപ്പിന്റെ അംശം കാരണം, എല്ലാ പിസിആർ പരിശോധനകൾക്കും മുമ്പ് പിസിആർ ഗുണനിലവാരമുള്ള വെള്ളത്തിൽ (1:10) അലിക്കോട്ടുകൾ ലയിപ്പിച്ചിരുന്നു.
ബയോറാഡ് QX200 പ്രോട്ടോക്കോൾ (മിസിസാഗ, ഒന്റാറിയോ, കാനഡ) ഉപയോഗിച്ചാണ് ഡിജിറ്റൽ ഡ്രോപ്ലെറ്റ് പിസിആർ (ഡിഡിപിസിആർ) നടത്തിയത്.ഒപ്റ്റിമൽ താപനില നിർണ്ണയിക്കാൻ താപനില പ്രൊഫൈൽ ഉപയോഗിക്കുക (പട്ടിക S1).ഒരു QX200 ഡ്രോപ്പ് ജനറേറ്റർ (BioRad) ഉപയോഗിച്ചാണ് ഡ്രോപ്പുകൾ സൃഷ്ടിച്ചത്.ddPCR ഇനിപ്പറയുന്ന രീതിയിൽ നടത്തി: 5 മിനിറ്റിന് 95 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസും 30 സെക്കൻഡിന് 95 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിന്റെ 50 സൈക്കിളുകളും 1 മിനിറ്റും 30 സെക്കൻഡിന് 72 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസും, 5 മിനിറ്റിന് 4 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസും 5 മിനിറ്റിനുള്ളിൽ 90 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസും.ഒരു QX200 ഡ്രോപ്പ് റീഡർ (BioRad) ഉപയോഗിച്ച് തുള്ളികളുടെയും പോസിറ്റീവ് പ്രതികരണങ്ങളുടെയും എണ്ണം (പകർപ്പുകളുടെ എണ്ണം/µl) അളന്നു.10,000 തുള്ളികളിൽ കുറവുള്ള സാമ്പിളുകൾ നിരസിച്ചു.ddPCR പ്രവർത്തിപ്പിക്കുമ്പോഴെല്ലാം പാറ്റേൺ നിയന്ത്രണം നടപ്പിലാക്കിയില്ല.
Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Sydney, Australia), LGALS7 നിർദ്ദിഷ്ട പ്രൈമറുകൾ എന്നിവ ഉപയോഗിച്ചാണ് qPCR നടത്തിയത്.QuantiFast SYBR ഗ്രീൻ PCR കിറ്റ് (QIAGEN) ഉപയോഗിച്ച് എല്ലാ ക്വാണ്ടിറ്റേറ്റീവ് PCR-കളും 20 µl-ൽ നടത്തി.qPCR 95 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ 15 മിനിറ്റ് ഇൻകുബേഷൻ നൽകി, തുടർന്ന് 95 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ 40 സൈക്കിളുകൾ 10 സെക്കൻഡും 60 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ 60 സെക്കൻഡും ഒരു ഡാറ്റാ ശേഖരണത്തോടെ ആരംഭിച്ചു.5 സെക്കൻഡിന് 95 ° C, 60 സെക്കൻഡിന് 65 ° C, qPCR ന്റെ അവസാനം 97 ° C എന്നിങ്ങനെ തുടർച്ചയായ അളവുകൾ ഉപയോഗിച്ച് ഉരുകുന്ന വളവുകൾ സൃഷ്ടിച്ചു.കൺട്രോൾ സാമ്പിളുകൾ ഒഴികെ ഓരോ qPCR യും മൂന്ന് തവണയായി നടത്തി.
ചിപ്പികൾ അവയുടെ ഉയർന്ന ഫിൽട്ടറേഷൻ നിരക്കിന് പേരുകേട്ടതിനാൽ, കടൽജലത്തിൽ അടങ്ങിയിരിക്കുന്ന ഡിഎൻഎ ശകലങ്ങൾ ഫിൽട്ടർ ചെയ്യാനും നിലനിർത്താനും കഴിയുമോ എന്ന് ഞങ്ങൾ ആദ്യം അന്വേഷിച്ചു.ഈ ശകലങ്ങൾ അവയുടെ സെമി-ഓപ്പൺ ലിംഫറ്റിക് സിസ്റ്റത്തിൽ അടിഞ്ഞുകൂടുന്നുണ്ടോ എന്ന കാര്യത്തിലും ഞങ്ങൾക്ക് താൽപ്പര്യമുണ്ടായിരുന്നു.നീല ചിപ്പി ടാങ്കുകളിൽ ചേർത്ത ലയിക്കുന്ന ഡിഎൻഎ ശകലങ്ങളുടെ വിധി കണ്ടെത്തുന്നതിലൂടെ ഞങ്ങൾ ഈ പ്രശ്നം പരീക്ഷണാത്മകമായി പരിഹരിച്ചു.ഡിഎൻഎ ശകലങ്ങൾ ട്രാക്കുചെയ്യുന്നത് സുഗമമാക്കുന്നതിന്, ഹ്യൂമൻ ഗാലക്റ്റിൻ-7 ജീൻ അടങ്ങിയ വിദേശ (സ്വയം അല്ല) പ്ലാസ്മിഡ് ഡിഎൻഎ ഞങ്ങൾ ഉപയോഗിച്ചു.ddPCR സമുദ്രജലത്തിലും ചിപ്പികളിലും പ്ലാസ്മിഡ് ഡിഎൻഎ ശകലങ്ങൾ കണ്ടെത്തുന്നു.ചിപ്പികളുടെ അഭാവത്തിൽ സമുദ്രജലത്തിലെ ഡിഎൻഎ ശകലങ്ങളുടെ അളവ് കാലക്രമേണ (7 ദിവസം വരെ) താരതമ്യേന സ്ഥിരമായി നിലനിന്നിരുന്നെങ്കിൽ, ചിപ്പികളുടെ സാന്നിധ്യത്തിൽ 8 മണിക്കൂറിനുള്ളിൽ ഈ നില ഏതാണ്ട് പൂർണ്ണമായും അപ്രത്യക്ഷമാകുമെന്ന് ഞങ്ങളുടെ ഫലങ്ങൾ കാണിക്കുന്നു (ചിത്രം 1 എ, ബി).ഇൻട്രാവൽവുലാർ ദ്രാവകത്തിലും ഹീമോലിംഫിലും 15 മിനിറ്റിനുള്ളിൽ എക്സോജനസ് ഡിഎൻഎയുടെ ശകലങ്ങൾ എളുപ്പത്തിൽ കണ്ടെത്തി (ചിത്രം 1 സി).എക്സ്പോഷർ കഴിഞ്ഞ് 4 മണിക്കൂർ വരെ ഈ ശകലങ്ങൾ കണ്ടെത്താനാകും.ഡിഎൻഎ ശകലങ്ങളുമായി ബന്ധപ്പെട്ട ഈ ഫിൽട്ടറിംഗ് പ്രവർത്തനം ബാക്ടീരിയകളുടെയും ആൽഗകളുടെയും ഫിൽട്ടറിംഗ് പ്രവർത്തനവുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്താവുന്നതാണ് [31].ചിപ്പികൾക്ക് അവയുടെ ദ്രാവക അറകളിൽ വിദേശ ഡിഎൻഎ ഫിൽട്ടർ ചെയ്യാനും ശേഖരിക്കാനും കഴിയുമെന്ന് ഈ ഫലങ്ങൾ സൂചിപ്പിക്കുന്നു.
കടൽജലത്തിലെ പ്ലാസ്മിഡ് ഡിഎൻഎയുടെ ആപേക്ഷിക സാന്ദ്രത, ചിപ്പികളുടെ സാന്നിധ്യത്തിൽ (എ) അല്ലെങ്കിൽ അഭാവത്തിൽ (ബി) ddPCR അളക്കുന്നു.A-ൽ, 75-ഉം 25-ഉം ശതമാനങ്ങളെ പ്രതിനിധീകരിക്കുന്ന ബോക്സുകളുടെ ബോർഡറുകൾ ഉപയോഗിച്ച് ഫലങ്ങൾ ശതമാനങ്ങളായി പ്രകടിപ്പിക്കുന്നു.ഘടിപ്പിച്ച ലോഗരിഥമിക് കർവ് ചുവപ്പിൽ കാണിച്ചിരിക്കുന്നു, ചാരനിറത്തിൽ ഷേഡുള്ള പ്രദേശം 95% ആത്മവിശ്വാസ ഇടവേളയെ പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നു.B-യിൽ, ചുവന്ന വര ശരാശരിയെ പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നു, നീല വര ഏകാഗ്രതയുടെ 95% ആത്മവിശ്വാസ ഇടവേളയെ പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നു.സി പ്ലാസ്മിഡ് ഡിഎൻഎ ചേർത്തതിനു ശേഷം വ്യത്യസ്ത സമയങ്ങളിൽ ചിപ്പികളുടെ ഹീമോലിംഫിലും വാൽവുലാർ ദ്രാവകത്തിലും പ്ലാസ്മിഡ് ഡിഎൻഎയുടെ ശേഖരണം.കണ്ടെത്തിയ കേവല പകർപ്പുകളായി ഫലങ്ങൾ അവതരിപ്പിക്കുന്നു/mL (±SE).
അടുത്തതായി, പരിമിതമായ നരവംശ സ്വാധീനമുള്ള ദ്വീപുകളുടെ വിദൂര ഗ്രൂപ്പായ കെർഗുലെൻ ദ്വീപുകളിലെ ചിപ്പി കിടക്കകളിൽ നിന്ന് ശേഖരിച്ച ചിപ്പികളിൽ ccfDNA യുടെ ഉത്ഭവം ഞങ്ങൾ അന്വേഷിച്ചു.ഈ ആവശ്യത്തിനായി, മസ്സൽ ഹീമോലിംഫുകളിൽ നിന്നുള്ള cccDNA, മനുഷ്യന്റെ cccDNA ശുദ്ധീകരിക്കാൻ സാധാരണയായി ഉപയോഗിക്കുന്ന രീതികൾ ഉപയോഗിച്ച് വേർതിരിച്ചെടുക്കുകയും ശുദ്ധീകരിക്കുകയും ചെയ്തു [32, 33].ചിപ്പികളിലെ ശരാശരി ഹീമോലിംഫ് ccfDNA സാന്ദ്രത ഓരോ മില്ലി ഹീമോലിംഫ് ശ്രേണിയിലും കുറഞ്ഞ മൈക്രോഗ്രാമിലാണെന്ന് ഞങ്ങൾ കണ്ടെത്തി (പട്ടിക S2, അനുബന്ധ വിവരങ്ങൾ കാണുക).ആരോഗ്യമുള്ള ആളുകളേക്കാൾ (ഒരു മില്ലിലിറ്ററിന് കുറഞ്ഞ നാനോഗ്രാമുകൾ) ഈ സാന്ദ്രതയുടെ പരിധി വളരെ വലുതാണ്, എന്നാൽ അപൂർവ സന്ദർഭങ്ങളിൽ, കാൻസർ രോഗികളിൽ, ccfDNA യുടെ അളവ് ഒരു മില്ലിലിറ്ററിന് നിരവധി മൈക്രോഗ്രാമിൽ എത്താം [34, 35].ഹീമോലിംഫ് ccfDNA യുടെ വലുപ്പ വിതരണത്തെക്കുറിച്ചുള്ള ഒരു വിശകലനം, ഈ ശകലങ്ങൾ 1000 bp മുതൽ 1000 bp വരെ വലുപ്പത്തിൽ വളരെ വ്യത്യാസപ്പെട്ടിരിക്കുന്നുവെന്ന് കാണിച്ചു.5000 bp വരെ (ചിത്രം 2).സിലിക്ക അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള QIAamp ഇൻവെസ്റ്റിഗേറ്റർ കിറ്റ് ഉപയോഗിച്ചാണ് സമാനമായ ഫലങ്ങൾ ലഭിച്ചത്, ccfDNA ഉൾപ്പെടെയുള്ള സാന്ദ്രത കുറഞ്ഞ DNA സാമ്പിളുകളിൽ നിന്ന് ജനിതക ഡിഎൻഎ അതിവേഗം വേർതിരിച്ചെടുക്കാനും ശുദ്ധീകരിക്കാനും ഫോറൻസിക് സയൻസിൽ സാധാരണയായി ഉപയോഗിക്കുന്ന ഒരു രീതിയാണ്.
ചിപ്പി ഹീമോലിംഫിന്റെ പ്രതിനിധി ccfDNA ഇലക്ട്രോഫോറെഗ്രാം.ന്യൂക്ലിയോസ്നാപ്പ് പ്ലാസ്മ കിറ്റും (മുകളിൽ) QIAamp DNA ഇൻവെസ്റ്റിഗേറ്റർ കിറ്റും ഉപയോഗിച്ച് വേർതിരിച്ചെടുത്തത്.ബി വയലിൻ പ്ലോട്ട് ചിപ്പികളിലെ ഹീമോലിംഫ് ccfDNA സാന്ദ്രതയുടെ (±SE) വിതരണം കാണിക്കുന്നു.കറുപ്പും ചുവപ്പും വരകൾ യഥാക്രമം മീഡിയൻ, ഒന്നും മൂന്നും ക്വാർട്ടിലുകളെ പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നു.
മനുഷ്യരിലും പ്രൈമേറ്റുകളിലും ഉള്ള ccfDNA യുടെ ഏകദേശം 1% വിദേശ സ്രോതസ്സാണ് [21, 37].ബിവാൾവുകളുടെ അർദ്ധ-തുറന്ന രക്തചംക്രമണ സംവിധാനം, സൂക്ഷ്മജീവികളാൽ സമ്പുഷ്ടമായ കടൽജലം, ചിപ്പിയുടെ സിസിഎഫ്ഡിഎൻഎയുടെ വലിപ്പം വിതരണം എന്നിവ കണക്കിലെടുത്ത്, ചിപ്പി ഹീമോലിംഫ് ccfDNA യിൽ സമ്പന്നവും വൈവിധ്യമാർന്നതുമായ മൈക്രോബയൽ ഡിഎൻഎ അടങ്ങിയിരിക്കാമെന്ന് ഞങ്ങൾ അനുമാനിക്കുന്നു.ഈ സിദ്ധാന്തം പരിശോധിക്കുന്നതിനായി, കെർഗുലെൻ ദ്വീപുകളിൽ നിന്ന് ശേഖരിച്ച ഔലകോമിയ അട്രാ സാമ്പിളുകളിൽ നിന്ന് ഞങ്ങൾ ഹീമോലിംഫ് ccfDNA ക്രമീകരിച്ചു, 10 ദശലക്ഷത്തിലധികം വായനകൾ ലഭിച്ചു, അതിൽ 97.6% ഗുണനിലവാര നിയന്ത്രണം വിജയിച്ചു.BLASTN, NCBI bivalve ഡാറ്റാബേസുകൾ (ചിത്രം. S1, അനുബന്ധ വിവരങ്ങൾ) ഉപയോഗിച്ച് സ്വയവും അല്ലാത്തതുമായ ഉറവിടങ്ങൾ അനുസരിച്ച് വായനകളെ തരംതിരിച്ചു.
മനുഷ്യരിൽ, ന്യൂക്ലിയർ, മൈറ്റോകോൺഡ്രിയൽ ഡിഎൻഎ എന്നിവ രക്തപ്രവാഹത്തിലേക്ക് വിടാൻ കഴിയും [38].എന്നിരുന്നാലും, നിലവിലെ പഠനത്തിൽ, ചിപ്പികളുടെ ന്യൂക്ലിയർ ജീനോമിക് ഡിഎൻഎ വിശദമായി വിവരിക്കാൻ സാധ്യമല്ല, കാരണം A. Atra ജീനോം ക്രമപ്പെടുത്തുകയോ വിവരിക്കുകയോ ചെയ്തിട്ടില്ല.എന്നിരുന്നാലും, bivalve ലൈബ്രറി (ചിത്രം. S2, അനുബന്ധ വിവരങ്ങൾ) ഉപയോഗിച്ച് ഞങ്ങളുടെ സ്വന്തം ഉത്ഭവത്തിന്റെ നിരവധി ccfDNA ശകലങ്ങൾ തിരിച്ചറിയാൻ ഞങ്ങൾക്ക് കഴിഞ്ഞു.ക്രമീകരിച്ച A. അട്രാ ജീനുകളുടെ പിസിആർ ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ വഴി നമ്മുടെ സ്വന്തം ഉത്ഭവത്തിന്റെ ഡിഎൻഎ ശകലങ്ങളുടെ സാന്നിധ്യം ഞങ്ങൾ സ്ഥിരീകരിച്ചു (ചിത്രം 3).അതുപോലെ, A. Atra യുടെ മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ജീനോം പൊതു ഡാറ്റാബേസുകളിൽ ലഭ്യമാണ് എന്നതിനാൽ, A. Atra യുടെ ഹീമോലിംഫിൽ മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ccfDNA ശകലങ്ങൾ ഉണ്ടെന്നതിന് തെളിവുകൾ കണ്ടെത്താനാകും.മൈറ്റോകോണ്ട്രിയൽ ഡിഎൻഎ ശകലങ്ങളുടെ സാന്നിധ്യം PCR ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ വഴി സ്ഥിരീകരിച്ചു (ചിത്രം 3).
പിസിആർ ആംപ്ലിഫൈ ചെയ്ത എ. ആട്രയുടെയും (റെഡ് ഡോട്ടുകൾ - സ്റ്റോക്ക് നമ്പർ: SRX5705969) എം. പ്ലാറ്റെൻസിസിന്റെയും (ബ്ലൂ ഡോട്ടുകൾ - സ്റ്റോക്ക് നമ്പർ: SRX5705968) ഹീമോലിംഫിൽ വിവിധ മൈറ്റോകോൺഡ്രിയൽ ജീനുകൾ ഉണ്ടായിരുന്നു.Breton et al., 2011 B-ൽ നിന്ന് സ്വീകരിച്ച ചിത്രം, A. Atra-ൽ നിന്നുള്ള ഹീമോലിംഫ് സൂപ്പർനറ്റന്റിന്റെ ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ FTA പേപ്പറിൽ സൂക്ഷിച്ചിരിക്കുന്നു.PCR മിക്‌സ് അടങ്ങിയ PCR ട്യൂബിലേക്ക് നേരിട്ട് ചേർക്കാൻ 3 mm പഞ്ച് ഉപയോഗിക്കുക.
സമുദ്രജലത്തിലെ സമൃദ്ധമായ സൂക്ഷ്മജീവികളുടെ ഉള്ളടക്കം കണക്കിലെടുത്ത്, ഹീമോലിംഫിലെ മൈക്രോബയൽ ഡിഎൻഎ സീക്വൻസുകളുടെ സ്വഭാവത്തിൽ ഞങ്ങൾ ആദ്യം ശ്രദ്ധ കേന്ദ്രീകരിച്ചു.ഇത് ചെയ്യുന്നതിന്, ഞങ്ങൾ രണ്ട് വ്യത്യസ്ത തന്ത്രങ്ങൾ ഉപയോഗിക്കുന്നു.BLAST ഉം മറ്റ് ഉപകരണങ്ങളുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്താവുന്ന കൃത്യതയോടെ സൂക്ഷ്മജീവ ശ്രേണികളെ തിരിച്ചറിയാൻ കഴിയുന്ന അൽഗോരിതം അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള സീക്വൻസ് ക്ലാസിഫിക്കേഷൻ പ്രോഗ്രാമായ Kraken2 ആണ് ആദ്യ തന്ത്രം ഉപയോഗിച്ചത് [28].6719-ലധികം വായനകൾ ബാക്ടീരിയൽ ഉത്ഭവമാണെന്ന് നിർണ്ണയിക്കപ്പെട്ടു, അതേസമയം 124 ഉം 64 ഉം യഥാക്രമം ആർക്കിയയിൽ നിന്നും വൈറസുകളിൽ നിന്നുമാണ് (ചിത്രം 4).ഏറ്റവും സമൃദ്ധമായ ബാക്ടീരിയ ഡിഎൻഎ ശകലങ്ങൾ ഫിർമിക്ക്യൂട്ടുകൾ (46%), പ്രോട്ടിയോബാക്ടീരിയ (27%), ബാക്ടീരിയോയിഡറ്റുകൾ (17%) (ചിത്രം 4a) എന്നിവയായിരുന്നു.ഈ വിതരണം മറൈൻ ബ്ലൂ മുസൽ മൈക്രോബയോമിനെക്കുറിച്ചുള്ള മുൻ പഠനങ്ങളുമായി പൊരുത്തപ്പെടുന്നു [39, 40].Gammaproteobacteria ആയിരുന്നു Proteobacteria (44%) പ്രധാന ക്ലാസ്, ഇതിൽ പല Vibrionales ഉൾപ്പെടുന്നു (ചിത്രം. 4b).ddPCR രീതി A. atra hemolymph (ചിത്രം 4c) [41] ന്റെ ccfDNA യിൽ Vibrio DNA ശകലങ്ങളുടെ സാന്നിധ്യം സ്ഥിരീകരിച്ചു.ccfDNA യുടെ ബാക്ടീരിയൽ ഉത്ഭവത്തെക്കുറിച്ചുള്ള കൂടുതൽ വിവരങ്ങൾ ലഭിക്കുന്നതിന്, ഒരു അധിക സമീപനം സ്വീകരിച്ചു (ചിത്രം. S2, അനുബന്ധ വിവരങ്ങൾ). ഈ സാഹചര്യത്തിൽ, ഓവർലാപ്പുചെയ്‌ത വായനകളെ ജോടി-എൻഡ് റീഡുകളായി കൂട്ടിച്ചേർക്കുകയും BLASTN ഉപയോഗിച്ച് സ്വയം (ബിവാൽവ്‌സ്) അല്ലെങ്കിൽ നോൺസെൽഫ് ഉത്ഭവം എന്നിങ്ങനെ തരംതിരിക്കുകയും 1e−3 ന്റെ ഇ മൂല്യവും >90% ഹോമോളജി ഉള്ള ഒരു കട്ട്ഓഫും. ഈ സാഹചര്യത്തിൽ, ഓവർലാപ്പുചെയ്‌ത വായനകളെ ജോടി-എൻഡ് റീഡുകളായി കൂട്ടിച്ചേർക്കുകയും BLASTN ഉപയോഗിച്ച് സ്വയം (ബിവാൽവ്‌സ്) അല്ലെങ്കിൽ നോൺസെൽഫ് ഉത്ഭവം എന്നിങ്ങനെ തരംതിരിക്കുകയും 1e−3 ന്റെ ഇ മൂല്യവും >90% ഹോമോളജി ഉള്ള ഒരു കട്ട്ഓഫും. В эതൊമ് സ്ലുഛെ പെരെക്ര്ыവയുത്സ്യ ഛതെനിയ ബ്ыല്യ് സോബ്രന്ы കാക് ച്തെനിയ എസ് പര്നിമി കൊന്സാമി ആൻഡ് ബ്യ്ലി ക്ലാസ്സി നിങ്ങൾ (ഡിവിഷൻ മോളിസ്കി) അല്ലെങ്കിൽ ചുഷി പോ പ്രോയിസ്ഹോഡ്ഡേനിയുടെ ഇസ്‌പോൾസോവനിം ബ്ലാസ്റ്റ്‌എൻ, സാൻചേനിയ ഇ ഗേൺസ് ഇ 1ഇ-3 0%. ഈ സാഹചര്യത്തിൽ, ഓവർലാപ്പിംഗ് റീഡുകൾ ജോടി-എൻഡ് റീഡുകളായി ശേഖരിക്കുകയും, BLASTN ഉപയോഗിച്ച് നേറ്റീവ് (ബിവാൾവ്) അല്ലെങ്കിൽ നോൺ-ഒറിജിനൽ എന്നിങ്ങനെ തരംതിരിക്കുകയും 1e-3 ന്റെ ഇ മൂല്യവും >90% ഹോമോളജി ഉള്ള കട്ട്ഓഫും.കൂടാതെ分类为自身（双壳类）或非自身来源。കൂടാതെ 0% 同源性 的 分类 自身 В эതൊമ് സ്ലുഛെ പെരെക്ര്ыവയുസ്ഛ്യെസ്യ ബ്ыല്യ് സോബ്രന്ы കാക് ച്തെനിയ എസ് പര്നിമി കൊന്സാമി ആൻഡ് ക്ലാസിഫോം ഉസ്ത്വൊര്ഛത്ыഎ മൊല്ല്യുസ്കി) അല്ലെങ്കിൽ നെസൊബ്സ്ത്വെംന്ыയ് പോ പ്രോയിസ്ഹോഡ്ഡേനിയും എസ് ഐസ്പോൾസോവനിം സാൻചെനിയി ആൻഡ് ബ്ലാസ്റ്റൺ ഗൈ> 1e-3 ഈ സാഹചര്യത്തിൽ, ഓവർലാപ്പിംഗ് റീഡുകൾ ജോടി-എൻഡ് റീഡുകളായി ശേഖരിക്കുകയും e BLASTN ഉം 1e-3 മൂല്യങ്ങളും ഒരു ഹോമോളജി ത്രെഷോൾഡും> 90% ഉപയോഗിച്ച് സ്വന്തം (bivalves) അല്ലെങ്കിൽ നോൺ-ഒറിജിനൽ ആയി തരംതിരിക്കുകയും ചെയ്തു.A. atra ജീനോം ഇതുവരെ ക്രമീകരിച്ചിട്ടില്ലാത്തതിനാൽ, MEGAHIT നെക്സ്റ്റ് ജനറേഷൻ സീക്വൻസിംഗ് (NGS) അസംബ്ലറിന്റെ ഡി നോവോ അസംബ്ലി തന്ത്രം ഞങ്ങൾ ഉപയോഗിച്ചു.മൊത്തം 147,188 കോണ്ടിഗുകൾ ഉത്ഭവത്തിന്റെ ആശ്രിത (ബിവാൾവ്) ആയി തിരിച്ചറിഞ്ഞിട്ടുണ്ട്.BLASTN, BLASTX എന്നിവ ഉപയോഗിച്ച് 1e-10 എന്ന ഇ-മൂല്യങ്ങൾ ഉപയോഗിച്ച് ഈ കോണ്ടിഗുകൾ പൊട്ടിത്തെറിച്ചു.A. atra ccfDNA-യിൽ ഉള്ള 482 നോൺ-ബൈവാൾവ് ശകലങ്ങൾ തിരിച്ചറിയാൻ ഈ തന്ത്രം ഞങ്ങളെ അനുവദിച്ചു.ഈ ഡിഎൻഎ ശകലങ്ങളിൽ പകുതിയിലേറെയും (57%) ബാക്ടീരിയയിൽ നിന്നാണ് ലഭിച്ചത്, പ്രധാനമായും സൾഫോട്രോഫിക് സിംബിയന്റുകളുൾപ്പെടെയുള്ള ഗിൽ സിംബിയന്റുകളിൽ നിന്നും ഗിൽ സിംബിയന്റുകളിൽ നിന്ന് സോളമിയ വെലം (ചിത്രം 5).
തരം തലത്തിൽ ആപേക്ഷിക സമൃദ്ധി.ബി രണ്ട് പ്രധാന ഫൈലകളുടെ (ഫിർമിക്യൂട്ടുകളും പ്രോട്ടിയോബാക്ടീരിയയും) സൂക്ഷ്മജീവികളുടെ വൈവിധ്യം.ഡിഡിപിസിആർ സി വിബ്രിയോ എസ്പിപിയുടെ പ്രതിനിധി ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ.A. മൂന്ന് അട്രാ ഹീമോലിംഫുകളിൽ 16S rRNA ജീനിന്റെ (നീല) ശകലങ്ങൾ.
മൊത്തം 482 ശേഖരിച്ച കോണ്ടിഗുകൾ വിശകലനം ചെയ്തു.മെറ്റാജെനോമിക് കോൺടിഗ് വ്യാഖ്യാനങ്ങളുടെ (പ്രോകാരിയോട്ടുകളും യൂക്കറിയോട്ടുകളും) ടാക്സോണമിക് വിതരണത്തിന്റെ പൊതുവായ പ്രൊഫൈൽ.B BLASTN ഉം BLASTX ഉം തിരിച്ചറിഞ്ഞ ബാക്ടീരിയ ഡിഎൻഎ ശകലങ്ങളുടെ വിശദമായ വിതരണം.
Euryarchaeota (65%), Crenarchaeota (24%), Thaurmarcheota (11%) (Fig. 6a) എന്നിവയുടെ ഡിഎൻഎ ശകലങ്ങൾ ഉൾപ്പെടെയുള്ള പുരാവസ്തു ഡിഎൻഎ ശകലങ്ങൾ മസ്സൽ ccfDNA-യിൽ അടങ്ങിയിട്ടുണ്ടെന്നും ക്രാക്കൻ2 വിശകലനം കാണിച്ചു.കാലിഫോർണിയൻ ചിപ്പികളുടെ സൂക്ഷ്മജീവ സമൂഹത്തിൽ മുമ്പ് കണ്ടെത്തിയിരുന്ന യൂറിയാർക്കിയോട്ടയിൽ നിന്നും ക്രെനാർക്കിയോട്ടയിൽ നിന്നും ഉരുത്തിരിഞ്ഞ DNA ശകലങ്ങളുടെ സാന്നിധ്യം അതിശയിക്കാനില്ല [42].Euryarchaeota പലപ്പോഴും അങ്ങേയറ്റത്തെ അവസ്ഥകളുമായി ബന്ധപ്പെട്ടിട്ടുണ്ടെങ്കിലും, Euryarchaeota ഉം Crenarcheota ഉം സമുദ്ര ക്രയോജനിക് പരിതസ്ഥിതിയിലെ ഏറ്റവും സാധാരണമായ പ്രോകാരിയോട്ടുകളിൽ ഒന്നാണെന്ന് ഇപ്പോൾ തിരിച്ചറിഞ്ഞിട്ടുണ്ട് [43, 44].കെർഗുലെൻ പീഠഭൂമിയിലെ അടിത്തട്ടിലുള്ള ചോർച്ചയിൽ നിന്നുള്ള വിപുലമായ മീഥേൻ ചോർച്ചയും [45] കെർഗുലെൻ ദ്വീപുകളുടെ തീരത്ത് സൂക്ഷ്മജീവികളുടെ മീഥേൻ ഉൽപ്പാദനം സാധ്യമായേക്കാവുന്നതുമായ മീഥേൻ ചോർച്ചയുടെ സമീപകാല റിപ്പോർട്ടുകൾ കണക്കിലെടുക്കുമ്പോൾ, ചിപ്പികളിൽ മെത്തനോജെനിക് സൂക്ഷ്മാണുക്കളുടെ സാന്നിധ്യം അതിശയിക്കാനില്ല.
ഞങ്ങളുടെ ശ്രദ്ധ പിന്നീട് ഡിഎൻഎ വൈറസുകളിൽ നിന്നുള്ള വായനകളിലേക്ക് മാറി.ഞങ്ങളുടെ അറിവിൽ, ചിപ്പികളുടെ വൈറസിന്റെ ഉള്ളടക്കത്തെക്കുറിച്ചുള്ള ആദ്യ ലക്ഷ്യമില്ലാത്ത പഠനമാണിത്.പ്രതീക്ഷിച്ചതുപോലെ, ഞങ്ങൾ ബാക്ടീരിയോഫേജുകളുടെ ഡിഎൻഎ ശകലങ്ങൾ (കോഡോവൈറലുകൾ) കണ്ടെത്തി (ചിത്രം 6 ബി).എന്നിരുന്നാലും, ഏറ്റവും സാധാരണമായ വൈറൽ ഡിഎൻഎ ന്യൂക്ലിയോസൈറ്റോവൈറസുകളുടെ ഒരു വിഭാഗത്തിൽ നിന്നാണ് വരുന്നത്, ന്യൂക്ലിയർ സൈറ്റോപ്ലാസ്മിക് ലാർജ് ഡിഎൻഎ വൈറസ് (NCLDV) എന്നും അറിയപ്പെടുന്നു, ഇത് ഏത് വൈറസിന്റെയും ഏറ്റവും വലിയ ജീനോം ആണ്.ഈ ഫൈലത്തിനുള്ളിൽ, മിക്ക ഡിഎൻഎ സീക്വൻസുകളും മിമിമിഡോവിരിഡേ (58%), പോക്സ്വിരിഡേ (21%) എന്നീ കുടുംബങ്ങളുടേതാണ്, അവയുടെ സ്വാഭാവിക ആതിഥേയരായ കശേരുക്കളും ആർത്രോപോഡുകളും ഉൾപ്പെടുന്നു, അതേസമയം ഈ ഡിഎൻഎ സീക്വൻസുകളുടെ ഒരു ചെറിയ ഭാഗം അറിയപ്പെടുന്ന വൈറോളജിക്കൽ ആൽഗകളുടേതാണ്.സമുദ്രത്തിലെ യൂക്കറിയോട്ടിക് ആൽഗകളെ ബാധിക്കുന്നു.അറിയപ്പെടുന്ന ഏതൊരു വൈറൽ ജനുസ്സിലും ഏറ്റവും വലിയ ജീനോം വലുപ്പമുള്ള ഭീമൻ വൈറസായ പണ്ടോറ വൈറസിൽ നിന്നും സീക്വൻസുകൾ ലഭിച്ചു.രസകരമെന്നു പറയട്ടെ, ഹീമോലിംഫ് ccfDNA സീക്വൻസിംഗ് നിർണ്ണയിക്കുന്നത് പോലെ വൈറസ് ബാധിച്ചതായി അറിയപ്പെടുന്ന ഹോസ്റ്റുകളുടെ ശ്രേണി താരതമ്യേന വലുതായിരുന്നു (ചിത്രം S3, അനുബന്ധ വിവരങ്ങൾ).ബാക്കുലോവിരിഡേ, ഇറിഡോവിരിഡേ തുടങ്ങിയ പ്രാണികളെ ബാധിക്കുന്ന വൈറസുകളും അമീബ, ആൽഗകൾ, കശേരുക്കൾ എന്നിവയെ ബാധിക്കുന്ന വൈറസുകളും ഇതിൽ ഉൾപ്പെടുന്നു.Pithovirus sibericum ജീനോമുമായി പൊരുത്തപ്പെടുന്ന ക്രമങ്ങളും ഞങ്ങൾ കണ്ടെത്തി.സൈബീരിയയിലെ 30,000 വർഷം പഴക്കമുള്ള പെർമാഫ്രോസ്റ്റിൽ നിന്നാണ് പിറ്റോവൈറസുകൾ ("സോംബി വൈറസുകൾ" എന്നും അറിയപ്പെടുന്നത്) ആദ്യമായി വേർതിരിച്ചത് [47].അതിനാൽ, ഈ വൈറസുകളുടെ എല്ലാ ആധുനിക സ്പീഷീസുകളും വംശനാശം സംഭവിച്ചിട്ടില്ലെന്നും [48] വിദൂര സബാർട്ടിക് സമുദ്ര ആവാസവ്യവസ്ഥയിൽ ഈ വൈറസുകൾ ഉണ്ടെന്നും കാണിക്കുന്ന മുൻ റിപ്പോർട്ടുകളുമായി ഞങ്ങളുടെ ഫലങ്ങൾ പൊരുത്തപ്പെടുന്നു.
അവസാനമായി, മറ്റ് മൾട്ടിസെല്ലുലാർ മൃഗങ്ങളിൽ നിന്ന് ഡിഎൻഎ ശകലങ്ങൾ കണ്ടെത്താൻ കഴിയുമോ എന്ന് ഞങ്ങൾ പരിശോധിച്ചു.nt, nr, RefSeq ലൈബ്രറികൾ (ജീനോമിക്, പ്രോട്ടീൻ) എന്നിവ ഉപയോഗിച്ച് BLASTN ഉം BLASTX ഉം മൊത്തം 482 വിദേശ കോണ്ടിഗുകളെ തിരിച്ചറിഞ്ഞു.മൾട്ടിസെല്ലുലാർ മൃഗങ്ങളുടെ ccfDNA യുടെ വിദേശ ശകലങ്ങളിൽ അസ്ഥി അസ്ഥികളുടെ ഡിഎൻഎ പ്രബലമാണെന്ന് ഞങ്ങളുടെ ഫലങ്ങൾ കാണിക്കുന്നു (ചിത്രം 5).പ്രാണികളിൽ നിന്നും മറ്റ് ജീവജാലങ്ങളിൽ നിന്നുമുള്ള ഡിഎൻഎ ശകലങ്ങളും കണ്ടെത്തിയിട്ടുണ്ട്.ഡിഎൻഎ ശകലങ്ങളുടെ താരതമ്യേന വലിയൊരു ഭാഗം തിരിച്ചറിഞ്ഞിട്ടില്ല, ഭൗമജീവികളെ അപേക്ഷിച്ച് ജീനോമിക് ഡാറ്റാബേസുകളിൽ [49] വൻതോതിൽ സമുദ്രജീവികളുടെ പ്രാതിനിധ്യം കുറവായിരിക്കാം.
നിലവിലെ പേപ്പറിൽ, ഹീമോലിംഫ് ccfDNA ഷോട്ട് സീക്വൻസിംഗിന് സമുദ്ര തീരദേശ ആവാസവ്യവസ്ഥയുടെ ഘടനയെക്കുറിച്ച് ഉൾക്കാഴ്ച നൽകാൻ കഴിയുമെന്ന് വാദിച്ചുകൊണ്ട് ഞങ്ങൾ ചിപ്പികൾക്ക് LB ആശയം പ്രയോഗിക്കുന്നു.പ്രത്യേകിച്ചും, 1) ചിപ്പിയുടെ ഹീമോലിംഫിൽ താരതമ്യേന വലിയ (~1-5 കെബി) ഡിഎൻഎ ശകലങ്ങൾ താരതമ്യേന ഉയർന്ന സാന്ദ്രത (മൈക്രോഗ്രാം ലെവലുകൾ) അടങ്ങിയിട്ടുണ്ടെന്ന് ഞങ്ങൾ കണ്ടെത്തി;2) ഈ ഡിഎൻഎ ശകലങ്ങൾ സ്വതന്ത്രവും സ്വതന്ത്രമല്ലാത്തതുമാണ് 3) ഈ ഡിഎൻഎ ശകലങ്ങളുടെ വിദേശ സ്രോതസ്സുകളിൽ, ബാക്ടീരിയ, പുരാവസ്തു, വൈറൽ ഡിഎൻഎ എന്നിവയും മറ്റ് മൾട്ടിസെല്ലുലാർ മൃഗങ്ങളുടെ ഡിഎൻഎയും ഞങ്ങൾ കണ്ടെത്തി;4) ഹീമോലിംഫിൽ ഈ വിദേശ ccfDNA ശകലങ്ങളുടെ ശേഖരണം അതിവേഗം സംഭവിക്കുകയും ചിപ്പികളുടെ ആന്തരിക ഫിൽട്ടറിംഗ് പ്രവർത്തനത്തിന് സംഭാവന നൽകുകയും ചെയ്യുന്നു.ഉപസംഹാരമായി, ഞങ്ങളുടെ പഠനം തെളിയിക്കുന്നത്, ഇതുവരെ പ്രധാനമായും ബയോമെഡിസിൻ മേഖലയിൽ പ്രയോഗിച്ചിട്ടുള്ള എൽബി എന്ന ആശയം, സെന്റിനൽ സ്പീഷീസുകളും അവയുടെ പരിസ്ഥിതിയും തമ്മിലുള്ള പ്രതിപ്രവർത്തനം നന്നായി മനസ്സിലാക്കാൻ ഉപയോഗിക്കാവുന്ന സമ്പന്നവും എന്നാൽ പര്യവേക്ഷണം ചെയ്യപ്പെടാത്തതുമായ അറിവിന്റെ ഉറവിടം എൻകോഡ് ചെയ്യുന്നു.
പ്രൈമേറ്റുകൾക്ക് പുറമേ, എലികൾ, നായ്ക്കൾ, പൂച്ചകൾ, കുതിരകൾ എന്നിവയുൾപ്പെടെയുള്ള സസ്തനികളിലും ccfDNA ഒറ്റപ്പെടൽ റിപ്പോർട്ട് ചെയ്യപ്പെട്ടിട്ടുണ്ട് [50, 51, 52].എന്നിരുന്നാലും, ഞങ്ങളുടെ അറിവിൽ, തുറന്ന രക്തചംക്രമണ സംവിധാനമുള്ള സമുദ്ര ജീവികളിൽ ccfDNA കണ്ടെത്തലും ക്രമപ്പെടുത്തലും ആദ്യമായി റിപ്പോർട്ട് ചെയ്യുന്നത് ഞങ്ങളുടെ പഠനമാണ്.ചിപ്പികളുടെ ഈ ശരീരഘടനാപരമായ സവിശേഷതയും ഫിൽട്ടറിംഗ് കഴിവും, ഭാഗികമായെങ്കിലും, മറ്റ് സ്പീഷിസുകളെ അപേക്ഷിച്ച്, ഡിഎൻഎ ശകലങ്ങൾ പ്രചരിക്കുന്നതിന്റെ വ്യത്യസ്ത വലിപ്പത്തിലുള്ള സവിശേഷതകളെ വിശദീകരിക്കും.മനുഷ്യരിൽ, രക്തത്തിൽ പ്രചരിക്കുന്ന മിക്ക ഡിഎൻഎ ശകലങ്ങളും 150 മുതൽ 200 ബിപി വരെ വലിപ്പമുള്ള ചെറിയ ശകലങ്ങളാണ്.പരമാവധി 167 bp [34, 53].DNA ശകലങ്ങളുടെ ചെറുതും എന്നാൽ പ്രധാനപ്പെട്ടതുമായ ഒരു ഭാഗം 300-നും 500 bp-നും ഇടയിലാണ്, ഏകദേശം 5% 900 bp-ൽ കൂടുതൽ നീളമുള്ളവയാണ്.[54].ഈ വലിപ്പ വിതരണത്തിനുള്ള കാരണം, പ്ലാസ്മയിലെ ccfDNA യുടെ പ്രധാന ഉറവിടം കോശങ്ങളുടെ മരണം മൂലമോ ആരോഗ്യമുള്ള വ്യക്തികളിലെ രക്തചംക്രമണ കോശങ്ങളുടെ necrosis മൂലമോ അല്ലെങ്കിൽ കാൻസർ രോഗികളിൽ ട്യൂമർ കോശങ്ങളുടെ അപ്പോപ്‌ടോസിസ് മൂലമോ (സർക്കുലേറ്റിംഗ് ട്യൂമർ DNA എന്നറിയപ്പെടുന്നു) കോശങ്ങളുടെ മരണത്തിന്റെ ഫലമായാണ് സംഭവിക്കുന്നത്., ctDNA).ചിപ്പികളിൽ ഞങ്ങൾ കണ്ടെത്തിയ ഹീമോലിംഫ് ccfDNA യുടെ വലിപ്പം വിതരണം 1000 മുതൽ 5000 bp വരെയാണ്, ഇത് മസ്സൽ ccfDNA യുടെ ഉത്ഭവം വ്യത്യസ്തമാണെന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്നു.ഇത് ഒരു യുക്തിസഹമായ സിദ്ധാന്തമാണ്, കാരണം ചിപ്പികൾക്ക് അർദ്ധ-തുറന്ന വാസ്കുലർ സിസ്റ്റമുണ്ട്, കൂടാതെ മൈക്രോബയൽ ജീനോമിക് ഡിഎൻഎയുടെ ഉയർന്ന സാന്ദ്രത അടങ്ങിയ സമുദ്ര ജല അന്തരീക്ഷത്തിലാണ് ജീവിക്കുന്നത്.വാസ്തവത്തിൽ, എക്സോജനസ് ഡിഎൻഎ ഉപയോഗിച്ചുള്ള ഞങ്ങളുടെ ലബോറട്ടറി പരീക്ഷണങ്ങൾ കാണിക്കുന്നത് ചിപ്പികൾ സമുദ്രജലത്തിൽ ഡിഎൻഎ ശകലങ്ങൾ ശേഖരിക്കുന്നു, കുറഞ്ഞത് കുറച്ച് മണിക്കൂറുകൾക്ക് ശേഷം അവ സെല്ലുലാർ ഏറ്റെടുക്കുകയും കൂടാതെ/അല്ലെങ്കിൽ റിലീസ് ചെയ്യുകയും കൂടാതെ/അല്ലെങ്കിൽ വിവിധ ഓർഗനൈസേഷനുകളിൽ സംഭരിക്കുകയും ചെയ്യുന്നു.കോശങ്ങളുടെ അപൂർവത കണക്കിലെടുത്ത് (പ്രോകാരിയോട്ടിക്, യൂക്കറിയോട്ടിക്), ഇൻട്രാവൽവുലാർ കമ്പാർട്ടുമെന്റുകളുടെ ഉപയോഗം സ്വയം ഉറവിടങ്ങളിൽ നിന്നും വിദേശ സ്രോതസ്സുകളിൽ നിന്നുമുള്ള ccfDNA യുടെ അളവ് കുറയ്ക്കും.ബിവാൾവ് സഹജമായ പ്രതിരോധശേഷിയുടെ പ്രാധാന്യവും ധാരാളം രക്തചംക്രമണമുള്ള ഫാഗോസൈറ്റുകളും കണക്കിലെടുക്കുമ്പോൾ, സൂക്ഷ്മാണുക്കളും കൂടാതെ/അല്ലെങ്കിൽ സെല്ലുലാർ അവശിഷ്ടങ്ങളും വിഴുങ്ങുമ്പോൾ വിദേശ ഡിഎൻഎ ശേഖരിക്കപ്പെടുന്ന രക്തചംക്രമണ ഫാഗോസൈറ്റുകളിൽ വിദേശ ccfDNA പോലും സമ്പുഷ്ടമാണെന്ന് ഞങ്ങൾ അനുമാനിക്കുന്നു.ഒരുമിച്ച് എടുത്താൽ, ബിവാൾവ് ഹീമോലിംഫ് ccfDNA തന്മാത്രാ വിവരങ്ങളുടെ ഒരു അദ്വിതീയ ശേഖരമാണെന്നും ഒരു സെന്റിനൽ സ്പീഷിസ് എന്ന നിലയിലുള്ള അവരുടെ പദവി ശക്തിപ്പെടുത്തുന്നുവെന്നും ഞങ്ങളുടെ ഫലങ്ങൾ കാണിക്കുന്നു.
ബാക്ടീരിയയിൽ നിന്ന് ഉരുത്തിരിഞ്ഞ ഹീമോലിംഫ് ccfDNA ശകലങ്ങളുടെ ക്രമവും വിശകലനവും ആതിഥേയ ബാക്ടീരിയ സസ്യജാലങ്ങളെക്കുറിച്ചും ചുറ്റുമുള്ള സമുദ്ര ആവാസവ്യവസ്ഥയിലെ ബാക്ടീരിയകളെക്കുറിച്ചും പ്രധാന വിവരങ്ങൾ നൽകുമെന്ന് ഞങ്ങളുടെ ഡാറ്റ സൂചിപ്പിക്കുന്നു.പരമ്പരാഗത 16S rRNA ഐഡന്റിഫിക്കേഷൻ രീതികൾ ഉപയോഗിച്ചിരുന്നെങ്കിൽ, ഒരു റഫറൻസ് ലൈബ്രറി ബയസ് കാരണം, A. Atra gill എന്ന കോമൻസൽ ബാക്ടീരിയയുടെ സീക്വൻസുകൾ ഷോട്ട് സീക്വൻസിംഗ് ടെക്നിക്കുകൾ വെളിപ്പെടുത്തിയിട്ടുണ്ട്.വാസ്തവത്തിൽ, കെർഗുലെനിലെ അതേ ചിപ്പി പാളിയിൽ എം. പ്ലാറ്റെൻസിസിൽ നിന്ന് ശേഖരിച്ച എൽബി ഡാറ്റയുടെ ഞങ്ങളുടെ ഉപയോഗം, രണ്ട് ചിപ്പി ഇനങ്ങൾക്കും ഗിൽ-അനുബന്ധ ബാക്ടീരിയൽ സിംബിയന്റുകളുടെ ഘടന ഒന്നുതന്നെയാണെന്ന് കാണിച്ചു (ചിത്രം. എസ് 4, അനുബന്ധ വിവരങ്ങൾ).ജനിതകപരമായി വ്യത്യസ്തമായ രണ്ട് ചിപ്പികളുടെ ഈ സാമ്യം, കെർഗുലെനിലെ തണുത്ത, സൾഫറസ്, അഗ്നിപർവ്വത നിക്ഷേപങ്ങളിലെ ബാക്ടീരിയൽ സമൂഹങ്ങളുടെ ഘടനയെ പ്രതിഫലിപ്പിച്ചേക്കാം [55, 56, 57, 58].പോർട്ട്-ഓ-ഫ്രാൻസ് തീരം പോലെയുള്ള ബയോടർബേറ്റഡ് തീരപ്രദേശങ്ങളിൽ നിന്ന് [59] ചിപ്പികളെ വിളവെടുക്കുമ്പോൾ ഉയർന്ന അളവിലുള്ള സൾഫർ കുറയ്ക്കുന്ന സൂക്ഷ്മാണുക്കൾ നന്നായി വിവരിച്ചിട്ടുണ്ട്.തിരശ്ചീനമായ പ്രക്ഷേപണം [60, 61] വഴി കമ്മ്യൂൺസൽ സസ്യജാലങ്ങളെ ബാധിച്ചേക്കാം എന്നതാണ് മറ്റൊരു സാധ്യത.സമുദ്ര പരിസ്ഥിതി, കടൽത്തീരത്തിന്റെ ഉപരിതലം, ചിപ്പികളിലെ സിംബയോട്ടിക് ബാക്ടീരിയയുടെ ഘടന എന്നിവ തമ്മിലുള്ള പരസ്പരബന്ധം നിർണ്ണയിക്കാൻ കൂടുതൽ ഗവേഷണം ആവശ്യമാണ്.ഈ പഠനങ്ങൾ ഇപ്പോൾ നടന്നുകൊണ്ടിരിക്കുന്നു.
ഹീമോലിംഫ് സി‌സി‌എഫ്‌ഡി‌എൻ‌എയുടെ നീളവും സാന്ദ്രതയും, അതിന്റെ ശുദ്ധീകരണത്തിന്റെ എളുപ്പവും, ദ്രുത ഷോട്ട്ഗൺ സീക്വൻസിംഗ് അനുവദിക്കുന്നതിനുള്ള ഉയർന്ന നിലവാരവും സമുദ്ര തീരദേശ ആവാസവ്യവസ്ഥയിലെ ജൈവവൈവിധ്യത്തെ വിലയിരുത്തുന്നതിന് ചിപ്പി ccfDNA ഉപയോഗിക്കുന്നതിന്റെ നിരവധി ഗുണങ്ങളിൽ ചിലതാണ്.തന്നിരിക്കുന്ന ആവാസവ്യവസ്ഥയിലെ വൈറൽ കമ്മ്യൂണിറ്റികളെ (വൈറോമുകൾ) ചിത്രീകരിക്കുന്നതിന് ഈ സമീപനം പ്രത്യേകിച്ചും ഫലപ്രദമാണ് [62, 63].ബാക്ടീരിയ, ആർക്കിയ, യൂക്കറിയോട്ടുകൾ എന്നിവയിൽ നിന്ന് വ്യത്യസ്തമായി, വൈറൽ ജീനോമുകളിൽ 16 എസ് സീക്വൻസുകൾ പോലെയുള്ള ഫൈലോജെനെറ്റിക് സംരക്ഷിത ജീനുകൾ അടങ്ങിയിട്ടില്ല.തീരദേശ സമുദ്ര ആവാസവ്യവസ്ഥയിൽ സാധാരണയായി വസിക്കുന്ന ആതിഥേയരെ ബാധിക്കുന്ന താരതമ്യേന വലിയ അളവിലുള്ള ccfDNA വൈറസ് ശകലങ്ങൾ തിരിച്ചറിയാൻ ചിപ്പികൾ പോലുള്ള സൂചക ഇനങ്ങളിൽ നിന്നുള്ള ദ്രാവക ബയോപ്സികൾ ഉപയോഗിക്കാമെന്ന് ഞങ്ങളുടെ ഫലങ്ങൾ സൂചിപ്പിക്കുന്നു.പ്രോട്ടോസോവ, ആർത്രോപോഡുകൾ, പ്രാണികൾ, സസ്യങ്ങൾ, ബാക്ടീരിയൽ വൈറസുകൾ (ഉദാ, ബാക്ടീരിയോഫേജുകൾ) എന്നിവയെ ബാധിക്കുന്ന വൈറസുകൾ ഇതിൽ ഉൾപ്പെടുന്നു.കെർഗുലെനിൽ (പട്ടിക S2, അനുബന്ധ വിവരങ്ങൾ) അതേ ചിപ്പി പാളിയിൽ ശേഖരിച്ച നീല ചിപ്പികളുടെ (എം. പ്ലാറ്റെൻസിസ്) ഹീമോലിംഫ് ccfDNA വൈറോം പരിശോധിച്ചപ്പോൾ സമാനമായ ഒരു വിതരണം കണ്ടെത്തി.ccfDNA യുടെ ഷോട്ട്ഗൺ സീക്വൻസിങ് എന്നത് മനുഷ്യരുടെയോ മറ്റ് ജീവജാലങ്ങളുടെയോ വൈറോമിനെ കുറിച്ചുള്ള പഠനത്തിൽ ആക്കം കൂട്ടുന്ന ഒരു പുതിയ സമീപനമാണ് [21, 37, 64].ബാൾട്ടിമോറിലെ ഏറ്റവും വൈവിധ്യമാർന്നതും വിശാലവുമായ തരം വൈറസുകളെ പ്രതിനിധീകരിക്കുന്ന, ഡബിൾ സ്ട്രാൻഡഡ് ഡിഎൻഎ വൈറസുകൾക്കിടയിൽ ഒരൊറ്റ ജീനും സംരക്ഷിക്കപ്പെടാത്തതിനാൽ, ഡബിൾ സ്ട്രാൻഡഡ് ഡിഎൻഎ വൈറസുകളെ പഠിക്കാൻ ഈ സമീപനം പ്രത്യേകിച്ചും ഉപയോഗപ്രദമാണ്.ഈ വൈറസുകളിൽ ഭൂരിഭാഗവും വർഗ്ഗീകരിക്കപ്പെടാതെ തുടരുന്നുവെങ്കിലും വൈറൽ ലോകത്തിന്റെ പൂർണ്ണമായും അജ്ഞാതമായ ഒരു ഭാഗത്ത് നിന്നുള്ള വൈറസുകളും ഉൾപ്പെട്ടേക്കാം [66], ചിപ്പികളായ എ. ആട്ര, എം. പ്ലാറ്റെൻസിസ് എന്നിവയുടെ വൈറോമുകളും ഹോസ്റ്റ് ശ്രേണികളും രണ്ട് സ്പീഷീസുകൾക്കിടയിൽ വീഴുന്നതായി ഞങ്ങൾ കണ്ടെത്തി.സമാനമായി (ചിത്രം S3 കാണുക, അധിക വിവരങ്ങൾ).ഈ സാമ്യം ആശ്ചര്യകരമല്ല, കാരണം ഇത് പരിസ്ഥിതിയിൽ അടങ്ങിയിരിക്കുന്ന ഡിഎൻഎ എടുക്കുന്നതിലെ സെലക്റ്റിവിറ്റിയുടെ അഭാവത്തെ പ്രതിഫലിപ്പിച്ചേക്കാം.ആർഎൻഎ വൈറോമിന്റെ സ്വഭാവരൂപീകരണത്തിനായി ശുദ്ധീകരിച്ച ആർഎൻഎ ഉപയോഗിച്ചുള്ള ഭാവി പഠനങ്ങൾ നിലവിൽ ആവശ്യമാണ്.
ഞങ്ങളുടെ പഠനത്തിൽ, കോവാർസ്‌കിയുടെയും സഹപ്രവർത്തകരുടെയും [37] ജോലിയിൽ നിന്ന് രൂപപ്പെടുത്തിയ വളരെ കർശനമായ പൈപ്പ്‌ലൈൻ ഞങ്ങൾ ഉപയോഗിച്ചു, അവർ നേറ്റീവ് ccfDNA അസംബ്ലി ചെയ്യുന്നതിന് മുമ്പും ശേഷവും പൂൾ ചെയ്ത റീഡുകളുടെയും കോണ്ടിഗുകളുടെയും രണ്ട്-ഘട്ട ഇല്ലാതാക്കൽ ഉപയോഗിച്ചു, അതിന്റെ ഫലമായി മാപ്പ് ചെയ്യാത്ത വായനകളുടെ ഉയർന്ന അനുപാതം ലഭിച്ചു.അതിനാൽ, മാപ്പ് ചെയ്യാത്ത ഈ വായനകളിൽ ചിലതിന് ഇപ്പോഴും അതിന്റേതായ ഉത്ഭവം ഉണ്ടെന്ന് ഞങ്ങൾക്ക് തള്ളിക്കളയാനാവില്ല, പ്രാഥമികമായി ഈ ചിപ്പി ഇനത്തിന് റെഫറൻസ് ജീനോം ഞങ്ങളുടെ പക്കലില്ല.സ്വയം വായിക്കുന്നതും അല്ലാത്തതുമായ വായനകൾക്കിടയിലുള്ള ചൈമറകളെക്കുറിച്ചും Illumina MiSeq PE75 സൃഷ്ടിച്ച റീഡ് ലെങ്തുകളെക്കുറിച്ചും ഞങ്ങൾ ആശങ്കാകുലരായതിനാൽ ഞങ്ങൾ ഈ പൈപ്പ് ലൈൻ ഉപയോഗിച്ചു.ഭൂരിഭാഗം അജ്ഞാത വായനകൾക്കും മറ്റൊരു കാരണം, കടൽ സൂക്ഷ്മാണുക്കളിൽ ഭൂരിഭാഗവും, പ്രത്യേകിച്ച് കെർഗുലെൻ പോലുള്ള വിദൂര പ്രദേശങ്ങളിൽ, വ്യാഖ്യാനിച്ചിട്ടില്ല എന്നതാണ്.ഞങ്ങൾ Illumina MiSeq PE75 ഉപയോഗിച്ചു, ccfDNA ശകലത്തിന്റെ നീളം ഹ്യൂമൻ ccfDNA-യ്ക്ക് സമാനമാണ്.ഭാവിയിലെ പഠനങ്ങൾക്കായി, ഹീമോലിംഫ് ccfDNA-യ്ക്ക് മനുഷ്യരെക്കാളും/അല്ലെങ്കിൽ സസ്തനികളേക്കാളും ദൈർഘ്യമേറിയ വായനയുണ്ടെന്ന് കാണിക്കുന്ന ഞങ്ങളുടെ ഫലങ്ങൾ കണക്കിലെടുക്കുമ്പോൾ, ദൈർഘ്യമേറിയ ccfDNA ശകലങ്ങൾക്ക് കൂടുതൽ അനുയോജ്യമായ ഒരു സീക്വൻസിങ് പ്ലാറ്റ്ഫോം ഉപയോഗിക്കാൻ ഞങ്ങൾ ശുപാർശ ചെയ്യുന്നു.ആഴത്തിലുള്ള വിശകലനത്തിനായി കൂടുതൽ സൂചനകൾ തിരിച്ചറിയുന്നത് ഈ രീതി വളരെ എളുപ്പമാക്കും.നിലവിൽ ലഭ്യമല്ലാത്ത സമ്പൂർണ്ണ A. atra ന്യൂക്ലിയർ ജീനോം സീക്വൻസ് നേടുന്നത് ccfDNA-യുടെ സ്വയവും അല്ലാത്തതുമായ സ്രോതസ്സുകളിൽ നിന്നുള്ള വിവേചനത്തെ വളരെയധികം സഹായിക്കുന്നു.ലിക്വിഡ് ബയോപ്സി എന്ന ആശയം ചിപ്പികളിൽ പ്രയോഗിക്കുന്നതിനുള്ള സാധ്യതയിൽ ഞങ്ങളുടെ ഗവേഷണം ശ്രദ്ധ കേന്ദ്രീകരിച്ചിരിക്കുന്നതിനാൽ, ഭാവിയിലെ ഗവേഷണങ്ങളിൽ ഈ ആശയം ഉപയോഗിക്കുന്നതിനാൽ, ചിപ്പികളുടെ സൂക്ഷ്മജീവ വൈവിധ്യത്തെക്കുറിച്ച് പഠിക്കാൻ ഈ രീതിയുടെ സാധ്യത വർദ്ധിപ്പിക്കുന്നതിന് പുതിയ ഉപകരണങ്ങളും പൈപ്പ്ലൈനുകളും വികസിപ്പിക്കുമെന്ന് ഞങ്ങൾ പ്രതീക്ഷിക്കുന്നു.സമുദ്ര ആവാസവ്യവസ്ഥ.
ഒരു നോൺ-ഇൻവേസിവ് ക്ലിനിക്കൽ ബയോമാർക്കർ എന്ന നിലയിൽ, ccfDNA യുടെ ഉയർന്ന മനുഷ്യ പ്ലാസ്മ അളവ് വിവിധ രോഗങ്ങൾ, ടിഷ്യു കേടുപാടുകൾ, സമ്മർദ്ദ സാഹചര്യങ്ങൾ [67,68,69] എന്നിവയുമായി ബന്ധപ്പെട്ടിരിക്കുന്നു.ഈ വർദ്ധനവ് ടിഷ്യു കേടുപാടുകൾക്ക് ശേഷം സ്വന്തം ഉത്ഭവത്തിന്റെ ഡിഎൻഎ ശകലങ്ങളുടെ പ്രകാശനവുമായി ബന്ധപ്പെട്ടിരിക്കുന്നു.30 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസ് താപനിലയിൽ ചിപ്പികളെ ഹ്രസ്വമായി തുറന്നുകാട്ടുന്ന കടുത്ത ചൂട് സമ്മർദ്ദം ഉപയോഗിച്ചാണ് ഞങ്ങൾ ഈ പ്രശ്നം പരിഹരിച്ചത്.മൂന്ന് സ്വതന്ത്ര പരീക്ഷണങ്ങളിൽ മൂന്ന് വ്യത്യസ്ത തരം ചിപ്പികളിൽ ഞങ്ങൾ ഈ വിശകലനം നടത്തി.എന്നിരുന്നാലും, കടുത്ത ചൂട് സമ്മർദ്ദത്തിന് ശേഷം ccfDNA ലെവലിൽ ഒരു മാറ്റവും ഞങ്ങൾ കണ്ടെത്തിയില്ല (ചിത്രം S5 കാണുക, അധിക വിവരങ്ങൾ).ചിപ്പികൾക്ക് അർദ്ധ-തുറന്ന രക്തചംക്രമണ സംവിധാനമുണ്ടെന്നും അവയുടെ ഉയർന്ന ഫിൽട്ടറിംഗ് പ്രവർത്തനം കാരണം വലിയ അളവിൽ വിദേശ ഡിഎൻഎ ശേഖരിക്കപ്പെടുന്നുവെന്നും ഈ കണ്ടെത്തൽ ഭാഗികമായെങ്കിലും വിശദീകരിച്ചേക്കാം.മറുവശത്ത്, പല അകശേരുക്കളെയും പോലെ ചിപ്പികളും സമ്മർദ്ദം മൂലമുണ്ടാകുന്ന ടിഷ്യു നാശത്തെ കൂടുതൽ പ്രതിരോധിക്കും, അതുവഴി അവയുടെ ഹീമോലിംഫിൽ ccfDNA യുടെ പ്രകാശനം പരിമിതപ്പെടുത്തുന്നു [70, 71].
ഇന്നുവരെ, ജല ആവാസവ്യവസ്ഥയിലെ ജൈവവൈവിധ്യത്തിന്റെ ഡിഎൻഎ വിശകലനം പ്രധാനമായും പരിസ്ഥിതി ഡിഎൻഎ (ഇഡിഎൻഎ) മെറ്റാബാർകോഡിംഗിൽ ശ്രദ്ധ കേന്ദ്രീകരിച്ചിരിക്കുന്നു.എന്നിരുന്നാലും, പ്രൈമറുകൾ ഉപയോഗിക്കുമ്പോൾ ഈ രീതി സാധാരണയായി ജൈവവൈവിധ്യ വിശകലനത്തിൽ പരിമിതമാണ്.ഷോട്ട്ഗൺ സീക്വൻസിംഗിന്റെ ഉപയോഗം പിസിആറിന്റെ പരിമിതികളെയും പ്രൈമർ സെറ്റുകളുടെ പക്ഷപാതപരമായ തിരഞ്ഞെടുപ്പിനെയും മറികടക്കുന്നു.അതിനാൽ, ഒരർത്ഥത്തിൽ, ഞങ്ങളുടെ രീതി അടുത്തിടെ ഉപയോഗിച്ച ഹൈ-ത്രൂപുട്ട് ഇഡിഎൻഎ ഷോട്ട്ഗൺ സീക്വൻസിങ് രീതിയോട് അടുത്താണ്, അത് വിഘടിച്ച ഡിഎൻഎയെ നേരിട്ട് ക്രമപ്പെടുത്താനും മിക്കവാറും എല്ലാ ജീവജാലങ്ങളെയും വിശകലനം ചെയ്യാനും കഴിയും [72, 73].എന്നിരുന്നാലും, സാധാരണ eDNA രീതികളിൽ നിന്ന് എൽബിയെ വേർതിരിക്കുന്ന നിരവധി അടിസ്ഥാന പ്രശ്നങ്ങൾ ഉണ്ട്.തീർച്ചയായും, ഇഡിഎൻഎയും എൽബിയും തമ്മിലുള്ള പ്രധാന വ്യത്യാസം സ്വാഭാവിക ഫിൽട്ടർ ഹോസ്റ്റുകളുടെ ഉപയോഗമാണ്.eDNA പഠിക്കുന്നതിനുള്ള ഒരു പ്രകൃതിദത്ത ഫിൽട്ടറായി സ്പോഞ്ചുകൾ, ബൈവാൾവ്സ് (ഡ്രെസ്സീന എസ്പിപി.) പോലുള്ള സമുദ്ര ജീവികളുടെ ഉപയോഗം റിപ്പോർട്ട് ചെയ്യപ്പെട്ടിട്ടുണ്ട് [74, 75].എന്നിരുന്നാലും, ഡ്രെസെനയുടെ പഠനം ടിഷ്യു ബയോപ്സി ഉപയോഗിച്ചു, അതിൽ നിന്ന് ഡിഎൻഎ വേർതിരിച്ചെടുത്തു.എൽബിയിൽ നിന്നുള്ള ccfDNA യുടെ വിശകലനത്തിന് ടിഷ്യു ബയോപ്സി, eDNA അല്ലെങ്കിൽ ടിഷ്യു ബയോപ്സി എന്നിവയുമായി ബന്ധപ്പെട്ട പ്രത്യേകവും ചിലപ്പോൾ ചെലവേറിയതുമായ ഉപകരണങ്ങളും ലോജിസ്റ്റിക്സും ആവശ്യമില്ല.വാസ്തവത്തിൽ, എൽബിയിൽ നിന്നുള്ള ccfDNA ഒരു തണുത്ത ശൃംഖല നിലനിർത്താതെ തന്നെ FTA പിന്തുണയോടെ സംഭരിക്കാനും വിശകലനം ചെയ്യാനും കഴിയുമെന്ന് ഞങ്ങൾ അടുത്തിടെ റിപ്പോർട്ട് ചെയ്തു, ഇത് വിദൂര പ്രദേശങ്ങളിലെ ഗവേഷണത്തിന് ഒരു വലിയ വെല്ലുവിളിയാണ് [76].ലിക്വിഡ് ബയോപ്സികളിൽ നിന്ന് ccfDNA വേർതിരിച്ചെടുക്കുന്നതും ലളിതമാണ് കൂടാതെ ഷോട്ട്ഗൺ സീക്വൻസിംഗിനും PCR വിശകലനത്തിനും ഉയർന്ന നിലവാരമുള്ള DNA നൽകുന്നു.eDNA വിശകലനവുമായി ബന്ധപ്പെട്ട ചില സാങ്കേതിക പരിമിതികൾ കണക്കിലെടുക്കുമ്പോൾ ഇത് ഒരു വലിയ നേട്ടമാണ് [77].സാമ്പിൾ രീതിയുടെ ലാളിത്യവും കുറഞ്ഞ വിലയും ദീർഘകാല നിരീക്ഷണ പരിപാടികൾക്ക് പ്രത്യേകിച്ചും അനുയോജ്യമാണ്.ഉയർന്ന ഫിൽട്ടറിംഗ് കഴിവിന് പുറമേ, ബിവാൾവുകളുടെ മറ്റൊരു അറിയപ്പെടുന്ന സവിശേഷത അവയുടെ മ്യൂക്കസിന്റെ രാസ മ്യൂക്കോപൊളിസാക്കറൈഡ് ഘടനയാണ്, ഇത് വൈറസുകളുടെ ആഗിരണം പ്രോത്സാഹിപ്പിക്കുന്നു [78, 79].ഇത് ജൈവവൈവിധ്യവും ഒരു നിശ്ചിത ജല ആവാസവ്യവസ്ഥയിലെ കാലാവസ്ഥാ വ്യതിയാനത്തിന്റെ ആഘാതവും ചിത്രീകരിക്കുന്നതിനുള്ള അനുയോജ്യമായ പ്രകൃതിദത്ത ഫിൽട്ടറാക്കി ബിവാൾവുകളെ മാറ്റുന്നു.ഇഡിഎൻഎയുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ ഹോസ്റ്റിൽ നിന്ന് ലഭിച്ച ഡിഎൻഎ ശകലങ്ങളുടെ സാന്നിധ്യം രീതിയുടെ പരിമിതിയായി കാണാമെങ്കിലും, ഇഡിഎൻഎയുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ അത്തരം ഒരു നേറ്റീവ് സിസിഎഫ്ഡിഎൻഎ ഉള്ളതുമായി ബന്ധപ്പെട്ട ചിലവ് ആരോഗ്യ പഠനങ്ങൾക്കായി ലഭ്യമായ വലിയ അളവിലുള്ള വിവരങ്ങൾക്ക് ഒരേസമയം മനസ്സിലാക്കാവുന്നതേയുള്ളൂ.ഓഫ്സെറ്റ് ഹോസ്റ്റ്.ഹോസ്റ്റ് ഹോസ്റ്റിന്റെ ജീനോമിലേക്ക് സംയോജിപ്പിച്ചിട്ടുള്ള വൈറൽ സീക്വൻസുകളുടെ സാന്നിധ്യം ഇതിൽ ഉൾപ്പെടുന്നു.ബിവാൾവുകളിൽ തിരശ്ചീനമായി പകരുന്ന രക്താർബുദ റിട്രോവൈറസുകളുടെ സാന്നിധ്യം കണക്കിലെടുക്കുമ്പോൾ, ചിപ്പികൾക്ക് ഇത് വളരെ പ്രധാനമാണ് [80, 81].ഇഡിഎൻഎയെക്കാൾ എൽബിയുടെ മറ്റൊരു നേട്ടം, സൂക്ഷ്മാണുക്കളെയും (അവയുടെ ജനിതകഘടനകളെയും) വിഴുങ്ങുന്ന ഹീമോലിംഫിലെ രക്തകോശങ്ങളുടെ ചംക്രമണത്തിന്റെ ഫാഗോസൈറ്റിക് പ്രവർത്തനത്തെ അത് ചൂഷണം ചെയ്യുന്നു എന്നതാണ്.ബിവാൾവുകളിലെ രക്തകോശങ്ങളുടെ പ്രധാന പ്രവർത്തനമാണ് ഫാഗോസൈറ്റോസിസ് [82].അവസാനമായി, ചിപ്പികളുടെ ഉയർന്ന ഫിൽട്ടറിംഗ് ശേഷിയും (ശരാശരി 1.5 l/h കടൽജലം) രണ്ട് ദിവസത്തെ രക്തചംക്രമണവും ഈ രീതി പ്രയോജനപ്പെടുത്തുന്നു, ഇത് സമുദ്രജലത്തിന്റെ വിവിധ പാളികളുടെ മിശ്രിതം വർദ്ധിപ്പിക്കുകയും വൈവിധ്യമാർന്ന eDNA പിടിച്ചെടുക്കാൻ അനുവദിക്കുകയും ചെയ്യുന്നു.[83, 84].അതിനാൽ, ചിപ്പികളുടെ പോഷകപരവും സാമ്പത്തികവും പാരിസ്ഥിതികവുമായ ആഘാതങ്ങൾ കണക്കിലെടുക്കുമ്പോൾ ചിപ്പിയുടെ ccfDNA വിശകലനം രസകരമായ ഒരു വഴിയാണ്.മനുഷ്യരിൽ നിന്ന് ശേഖരിക്കുന്ന എൽബിയുടെ വിശകലനത്തിന് സമാനമായി, ഈ രീതി പുറമേയുള്ള പദാർത്ഥങ്ങളോടുള്ള പ്രതികരണമായി ഹോസ്റ്റ് ഡിഎൻഎയിലെ ജനിതക, എപിജെനെറ്റിക് മാറ്റങ്ങൾ അളക്കുന്നതിനുള്ള സാധ്യതയും തുറക്കുന്നു.ഉദാഹരണത്തിന്, നാനോപോർ സീക്വൻസിംഗ് ഉപയോഗിച്ച് നേറ്റീവ് ccfDNA-യിൽ ജീനോം-വൈഡ് മെഥിലേഷൻ വിശകലനം നടത്താൻ മൂന്നാം തലമുറ സീക്വൻസിങ് സാങ്കേതികവിദ്യകൾ വിഭാവനം ചെയ്യാവുന്നതാണ്.ചിപ്പിയുടെ ccfDNA ശകലങ്ങളുടെ നീളം ദൈർഘ്യമേറിയ വായനാ സീക്വൻസിങ് പ്ലാറ്റ്‌ഫോമുകളുമായി പൊരുത്തപ്പെടുന്നതിനാൽ ഈ പ്രക്രിയ സുഗമമാക്കണം, ഇത് രാസ പരിവർത്തനങ്ങളുടെ ആവശ്യമില്ല.അതിനാൽ, കാലാവസ്ഥാ വ്യതിയാനത്തിനോ മലിനീകരണത്തിനോ വിധേയമായതിന് ശേഷമുള്ള പ്രതികരണത്തെ നിയന്ത്രിക്കുന്ന അടിസ്ഥാന സംവിധാനങ്ങളെക്കുറിച്ച് വിലപ്പെട്ട ഉൾക്കാഴ്ച നൽകാൻ ഇതിന് കഴിയും [87].എന്നിരുന്നാലും, എൽബിയുടെ ഉപയോഗം പരിമിതികളില്ലാതെയല്ല.ഇതിന് ആവാസവ്യവസ്ഥയിൽ ഇൻഡിക്കേറ്റർ സ്പീഷീസുകളുടെ സാന്നിധ്യം ആവശ്യമാണെന്ന് പറയേണ്ടതില്ലല്ലോ.മുകളിൽ സൂചിപ്പിച്ചതുപോലെ, തന്നിരിക്കുന്ന ആവാസവ്യവസ്ഥയുടെ ജൈവവൈവിധ്യം വിലയിരുത്തുന്നതിന് എൽബി ഉപയോഗിക്കുന്നതിന്, ഉറവിടത്തിൽ നിന്നുള്ള ഡിഎൻഎ ശകലങ്ങളുടെ സാന്നിധ്യം കണക്കിലെടുക്കുന്ന കർശനമായ ബയോ ഇൻഫോർമാറ്റിക്‌സ് പൈപ്പ്‌ലൈൻ ആവശ്യമാണ്.മറ്റൊരു പ്രധാന പ്രശ്നം സമുദ്ര ജീവികൾക്ക് റഫറൻസ് ജീനോമുകളുടെ ലഭ്യതയാണ്.മറൈൻ സസ്തനി ജീനോംസ് പ്രോജക്റ്റ്, അടുത്തിടെ സ്ഥാപിതമായ ഫിഷ് 10 കെ പ്രോജക്റ്റ് [88] പോലുള്ള സംരംഭങ്ങൾ ഭാവിയിൽ അത്തരം വിശകലനം സുഗമമാക്കുമെന്ന് പ്രതീക്ഷിക്കുന്നു.മറൈൻ ഫിൽട്ടർ-ഫീഡിംഗ് ജീവികളിലേക്കുള്ള എൽബി ആശയത്തിന്റെ പ്രയോഗവും സീക്വൻസിങ് സാങ്കേതികവിദ്യയിലെ ഏറ്റവും പുതിയ മുന്നേറ്റങ്ങളുമായി പൊരുത്തപ്പെടുന്നു, പാരിസ്ഥിതിക സമ്മർദ്ദത്തിന് പ്രതികരണമായി സമുദ്ര ആവാസവ്യവസ്ഥയുടെ ആരോഗ്യത്തെക്കുറിച്ചുള്ള പ്രധാന വിവരങ്ങൾ നൽകുന്നതിന് മൾട്ടി-ഓം ബയോ മാർക്കറുകൾ വികസിപ്പിക്കുന്നതിന് ഇത് അനുയോജ്യമാണ്.
എൻസിബിഐ സീക്വൻസ് റീഡ് ആർക്കൈവിൽ https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 ബയോപ്രോജക്‌ട്‌സ് SRR8924808 എന്നതിൽ ജീനോം സീക്വൻസിംഗ് ഡാറ്റ നിക്ഷേപിച്ചിട്ടുണ്ട്.
Brierley AS, Kingsford MJ കാലാവസ്ഥാ വ്യതിയാനത്തിന്റെ ആഘാതം സമുദ്രജീവിതത്തിലും ആവാസവ്യവസ്ഥയിലും.കോൾ ബയോളജി.2009;19: P602-P614.
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Almpanidou V, Bevilacqua S, et al.കാലാവസ്ഥാ വ്യതിയാനത്തിന്റെയും മറ്റ് പ്രാദേശിക സമ്മർദ്ദങ്ങളുടെയും സംയുക്ത ആഘാതങ്ങൾ സമുദ്ര പരിസ്ഥിതിയിൽ പരിഗണിക്കുക.പൊതു ശാസ്ത്ര പരിസ്ഥിതി.2021;755:142564.
കരേല്ല എഫ്, ആന്റുഫെർമോ ഇ, ഫറീന എസ്, സലാറ്റി എഫ്, മന്ദാസ് ഡി, പ്രാഡോ പി, തുടങ്ങിയവർ.).മാർച്ച് ഒന്നാം തീയതിയിലെ ശാസ്ത്രം.2020;7:48.
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. ആവർത്തിച്ചുള്ള ചൂട് സമ്മർദ്ദ സാഹചര്യങ്ങളിൽ ചൂട് സഹിഷ്ണുത കുറയ്ക്കുന്നത് നീല ചിപ്പികളുടെ ഉയർന്ന വേനൽക്കാല മരണത്തെ വിശദീകരിക്കുന്നു.ശാസ്ത്രീയ റിപ്പോർട്ട് 2019;9:17498.
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER, et al.മൃഗങ്ങളുടെ മരണത്തിന്റെ ആവൃത്തിയിലും കാരണങ്ങളിലും വ്യാപ്തിയിലും സമീപകാല മാറ്റങ്ങൾ.Proc Natl Acad Sci USA.2015;112:1083-8.
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mughetti D, Cerruti F, Hosseini S, et al.ഒന്നിലധികം നോൺ-സ്പീഷീസ്-സ്പെസിഫിക് രോഗാണുക്കൾ പിന്ന നോബിലിസിന്റെ കൂട്ട മരണത്തിന് കാരണമായേക്കാം.ജീവിതം.2020;10:238.
ബ്രാഡ്‌ലി എം, കൗട്ട്‌സ് എസ്‌ജെ, ജെങ്കിൻസ് ഇ, ഒ'ഹാര ടിഎം.ആർട്ടിക് സൂനോട്ടിക് രോഗങ്ങളിൽ കാലാവസ്ഥാ വ്യതിയാനത്തിന്റെ സാധ്യതയുള്ള ആഘാതം.ഇന്റർ ജെ സർകംപോളാർ ആരോഗ്യം.2005;64:468-77.
ബെയർ ജെ., ഗ്രീൻ എൻഡബ്ല്യു, ബ്രൂക്ക്സ് എസ്., അലൻ ഐജെ, റൂസ് എ., ഗോമസ് ടി. തുടങ്ങിയവർ.തീരദേശ മലിനീകരണ നിരീക്ഷണത്തിൽ നീല ചിപ്പികൾ (Mytilus edulis spp.) സിഗ്നൽ ജീവികൾ: ഒരു അവലോകനം.മാർ എൻവയോൺ റെസ് 2017;130:338-65.
സിരവെഗ്ന ജി, മാർസോണി എസ്, സിയീന എസ്, ബാർഡെല്ലി എ. കാൻസർ ചികിത്സയിൽ ലിക്വിഡ് ബയോപ്സിയുടെ സംയോജനം.നാറ്റ് റെവ് ക്ലീൻ ഓങ്കോൾ.2017;14:531–48.
വാൻ ജെസിഎം, മാസി സി, ഗാർസിയ-കോർബച്ചോ ജെ, മൗലിയർ എഫ്, ബ്രെന്റൺ ജെഡി, കാൽഡാസ് സി, തുടങ്ങിയവർ.ലിക്വിഡ് ബയോപ്സി പക്വത: ട്യൂമർ ഡിഎൻഎ പ്രചരിക്കാൻ അനുവദിക്കുന്നു.നാറ്റ് റെവ് കാൻസർ.2017;17:223–38.
മണ്ടൽ പി., മെറ്റൈസ് പി. മനുഷ്യ പ്ലാസ്മയിലെ ന്യൂക്ലിക് ആസിഡുകൾ.Soc Biol അനുബന്ധ സ്ഥാപനങ്ങളുടെ മീറ്റിംഗ് മിനിറ്റ്.1948;142:241-3.
Bronkhorst AJ, Ungerer W, Holdenrieder S. കാൻസർ ചികിത്സയ്ക്കുള്ള ഒരു മോളിക്യുലാർ മാർക്കർ എന്ന നിലയിൽ സെൽ-ഫ്രീ ഡിഎൻഎയ്ക്കുള്ള പുതിയ പങ്ക്.ബയോമോളാർ വിശകലനത്തിന്റെ അളവ്.2019;17:100087.
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS ലിക്വിഡ് ബയോപ്സി ക്ലിനിക്കിൽ പ്രവേശിക്കുന്നു - നടപ്പാക്കൽ പ്രശ്നങ്ങളും ഭാവിയിലെ വെല്ലുവിളികളും.നാറ്റ് റവ ക്ലിൻ ഓങ്കോൾ.2021;18:297–312.
ലോ വൈഎം, കോർബെറ്റ എൻ., ചേംബർലൈൻ പിഎഫ്, റായ് ഡബ്ല്യു., സാർജന്റ് ഐഎൽ, റെഡ്മാൻ സിഡബ്ല്യു തുടങ്ങിയവ.അമ്മയുടെ പ്ലാസ്മയിലും സെറമിലും ഗര്ഭപിണ്ഡത്തിന്റെ DNA ഉണ്ട്.ലാൻസെറ്റ്.1997;350:485-7.
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR ഗർഭാവസ്ഥയിൽ സ്ത്രീകളുടെ രക്തത്തിൽ എക്സ്ട്രാ സെല്ലുലാർ ആർഎൻഎ രക്തചംക്രമണം ഉപയോഗിച്ച് ഗർഭാവസ്ഥയുടെ ഗതിയെയും അതിന്റെ സങ്കീർണതകളെയും കുറിച്ചുള്ള പഠനം.ഡോപീഡിയാട്രിക്സ്.2020;8:605219.
Ollerich M, Sherwood K, Keown P, Schütz E, Beck J, Stegbauer J, et al.ലിക്വിഡ് ബയോപ്സി: കിഡ്നി ഗ്രാഫ്റ്റിലെ അലോജെനിക് നിഖേദ് കണ്ടുപിടിക്കാൻ ഡോണർ സെൽ-ഫ്രീ ഡിഎൻഎ ഉപയോഗിക്കുന്നു.നാറ്റ് റവ നെഫ്രോൾ.2021;17:591–603.
ജുവാൻ എഫ്‌സി, ലോ വൈഎം ഇൻനോവേഷൻസ് ഇൻ പ്രെനറ്റൽ ഡയഗ്നോസ്റ്റിക്സ്: മാതൃ പ്ലാസ്മ ജീനോം സീക്വൻസിങ്.അന്ന എം.ഡി.2016;67:419-32.
Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D, et al.രോഗബാധിതമായ ശരീരസ്രവങ്ങളുടെ അടുത്ത തലമുറയിലെ മെറ്റാജെനോമിക് സീക്വൻസിംഗിനൊപ്പം ദ്രുതഗതിയിലുള്ള രോഗകാരി കണ്ടെത്തൽ.നാറ്റ് മെഡിസിൻ.2021;27:115-24.