Nature.com സന്ദർശിച്ചതിന് നന്ദി. നിങ്ങൾ ഉപയോഗിക്കുന്ന ബ്രൗസർ പതിപ്പിന് പരിമിതമായ CSS പിന്തുണ മാത്രമേ ഉള്ളൂ. മികച്ച അനുഭവത്തിനായി, നിങ്ങൾ ഒരു അപ്ഡേറ്റ് ചെയ്ത ബ്രൗസർ ഉപയോഗിക്കാൻ ഞങ്ങൾ ശുപാർശ ചെയ്യുന്നു (അല്ലെങ്കിൽ ഇന്റർനെറ്റ് എക്സ്പ്ലോററിൽ കോംപാറ്റിബിലിറ്റി മോഡ് പ്രവർത്തനരഹിതമാക്കുക). അതേസമയം, തുടർച്ചയായ പിന്തുണ ഉറപ്പാക്കാൻ, സ്റ്റൈലുകളും ജാവാസ്ക്രിപ്റ്റും ഇല്ലാതെ ഞങ്ങൾ സൈറ്റ് റെൻഡർ ചെയ്യും.
കോൺ സ്റ്റൗവറിൽ AFEX ഉപയോഗിച്ച് മുൻകൂട്ടി സംസ്കരിച്ച പെർസിസ്റ്റന്റ് ഒലിഗോസാക്കറൈഡുകളുടെ സങ്കീർണ്ണമായ വിശകലനത്തിനുള്ള പുതിയ ഇമ്മ്യൂണോളജിക്കൽ, മാസ് സ്പെക്ട്രോമെട്രിക് രീതികൾ. ഫോസിൽ ഇന്ധനങ്ങൾക്ക് സുസ്ഥിരമായ ഒരു ബദലാണ് ലിഗ്നോസെല്ലുലോസിക് ബയോമാസ്, ഭക്ഷണം, തീറ്റ, ഇന്ധനങ്ങൾ, രാസവസ്തുക്കൾ തുടങ്ങിയ ഉൽപ്പന്നങ്ങളുടെ ഉത്പാദനത്തിനായി ബയോടെക്നോളജികൾ വികസിപ്പിക്കുന്നതിന് ഇത് വ്യാപകമായി ഉപയോഗിക്കുന്നു. സസ്യകോശഭിത്തികളിൽ അടങ്ങിയിരിക്കുന്ന സങ്കീർണ്ണമായ കാർബോഹൈഡ്രേറ്റുകളെ ഗ്ലൂക്കോസ്, സൈലോസ്, അറബിനോസ് തുടങ്ങിയ ലളിതമായ പഞ്ചസാരകളാക്കി മാറ്റുന്നതിനുള്ള ചെലവ് കുറഞ്ഞ മത്സര പ്രക്രിയകളുടെ വികസനമാണ് ഈ സാങ്കേതികവിദ്യകളുടെ താക്കോൽ. ലിഗ്നോസെല്ലുലോസിക് ബയോമാസ് വളരെ ശാഠ്യമുള്ളതിനാൽ, ആവശ്യമുള്ള ഉൽപ്പന്നം ലഭിക്കുന്നതിന് അത് തെർമോകെമിക്കൽ ചികിത്സകൾക്കും (ഉദാഹരണത്തിന്, അമോണിയ ഫൈബർ എക്സ്ഫോളിയേഷൻ (AFEX), നേർപ്പിച്ച ആസിഡുകൾ (DA), അയോണിക് ദ്രാവകങ്ങൾ (IL)) ജൈവ ചികിത്സകൾക്കും (ഉദാഹരണത്തിന്, എൻസൈമാറ്റിക് ജലവിശ്ലേഷണം, മൈക്രോബയൽ ഫെർമെന്റേഷൻ) സംയോജിപ്പിച്ച് ഉപയോഗിക്കണം. എന്നിരുന്നാലും, വാണിജ്യ ഫംഗസ് എൻസൈമുകൾ ജലവിശ്ലേഷണ പ്രക്രിയയിൽ ഉപയോഗിക്കുമ്പോൾ, രൂപം കൊള്ളുന്ന ലയിക്കുന്ന പഞ്ചസാരകളിൽ 75-85% മാത്രമേ മോണോസാക്രറൈഡുകളാകൂ, ശേഷിക്കുന്ന 15-25% ലയിക്കുന്നതും അലിയാത്തതുമായ ഒലിഗോസാക്രറൈഡുകളാണ്, അവ സൂക്ഷ്മാണുക്കൾക്ക് എല്ലായ്പ്പോഴും ലഭ്യമല്ല. മുമ്പ്, കാർബൺ, ഡയറ്റോമേഷ്യസ് എർത്ത് വേർതിരിക്കൽ, വലുപ്പം ഒഴിവാക്കൽ ക്രോമാറ്റോഗ്രാഫി എന്നിവയുടെ സംയോജനം ഉപയോഗിച്ച് ലയിക്കുന്ന മുരടിച്ച ഒലിഗോസാക്രറൈഡുകൾ ഞങ്ങൾ വിജയകരമായി വേർതിരിച്ച് ശുദ്ധീകരിച്ചു, കൂടാതെ അവയുടെ എൻസൈം ഇൻഹിബിറ്ററി ഗുണങ്ങളും അന്വേഷിച്ചു. ഉയർന്ന അളവിലുള്ള പോളിമറൈസേഷൻ (ഡിപി) മെത്തിലേറ്റഡ് യൂറോണിക് ആസിഡ് പകരക്കാർ അടങ്ങിയ ഒലിഗോസാക്രറൈഡുകൾ വാണിജ്യ എൻസൈം മിശ്രിതങ്ങൾ ഉപയോഗിച്ച് പ്രോസസ്സ് ചെയ്യുന്നത് കുറഞ്ഞ ഡിപി, ന്യൂട്രൽ ഒലിഗോസാക്രറൈഡുകളെ അപേക്ഷിച്ച് കൂടുതൽ ബുദ്ധിമുട്ടാണെന്ന് ഞങ്ങൾ കണ്ടെത്തി. സസ്യ കോശഭിത്തികളിലെയും എൻസൈമാറ്റിക് ഹൈഡ്രോലൈസേറ്റുകളിലെയും ഗ്ലൈക്കൻ ബോണ്ടുകളെ ചിത്രീകരിക്കുന്നതിന് സസ്യ ബയോമാസ് ഗ്ലൈക്കാനുകൾക്ക് പ്രത്യേകമായ മോണോക്ലോണൽ ആന്റിബോഡികൾ (mAbs) ഉപയോഗിച്ച് ഗ്ലൈക്കൻ പ്രൊഫൈലിംഗ്, മാട്രിക്സ്-അസിസ്റ്റഡ് ലേസർ ഡിസോർപ്ഷൻ അയോണൈസേഷൻ, ടൈം-ഓഫ്-ഫ്ലൈറ്റ് മാസ്-സ്പെക്ട്രോമെട്രി എന്നിവയുൾപ്പെടെ നിരവധി അധിക രീതികളുടെ ഉപയോഗം ഞങ്ങൾ ഇവിടെ റിപ്പോർട്ട് ചെയ്യുന്നു. നെഗറ്റീവ് അയോണുകളുടെ ദ്വിതീയ ക്ഷയത്തിന് ശേഷം സ്പെക്ട്രോസ്കോപ്പി വഴി ലഭിച്ച ഘടന-വിജ്ഞാനപ്രദമായ ഡയഗ്നോസ്റ്റിക് കൊടുമുടികൾ, ഗ്യാസ് ക്രോമാറ്റോഗ്രാഫി, മാസ് സ്പെക്ട്രോമെട്രി (GC-MS) എന്നിവ ഉപയോഗിച്ച് ഡെറിവേറ്റൈസേഷനോടുകൂടിയും അല്ലാതെയും ഒലിഗോസാക്കറൈഡ് ബോണ്ടുകളെ ചിത്രീകരിക്കുന്നു. ഒലിഗോസാക്കറൈഡുകളുടെ ചെറിയ വലിപ്പം (DP 4–20) കാരണം, ഈ തന്മാത്രകൾ mAb ബൈൻഡിംഗിനും സ്വഭാവരൂപീകരണത്തിനും ഉപയോഗിക്കാൻ പ്രയാസമാണ്. ഈ പ്രശ്നം മറികടക്കാൻ, മൈക്രോപ്ലേറ്റ് ഉപരിതലത്തിൽ ഭൂരിഭാഗം ലോ ഡിപി ലയിക്കുന്ന ഒലിഗോസാക്കറൈഡുകളും വിജയകരമായി ലേബൽ ചെയ്ത ഒരു പുതിയ ബയോട്ടിൻ കൺജഗേഷൻ അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള ഒലിഗോസാക്കറൈഡ് ഇമ്മൊബിലൈസേഷൻ രീതി ഞങ്ങൾ പ്രയോഗിച്ചു, ഇത് പിന്നീട് നിർദ്ദിഷ്ട ലിഗേഷൻ വിശകലനത്തിനായി ഉയർന്ന ത്രൂപുട്ട് mAb സിസ്റ്റത്തിൽ ഉപയോഗിച്ചു. രോഗനിർണയ ആവശ്യങ്ങൾക്കായി ബയോമാർക്കറുകളിൽ അടങ്ങിയിരിക്കുന്ന ഒലിഗോസാക്കറൈഡുകളെ വേർതിരിച്ചെടുക്കാനും സ്വഭാവരൂപീകരണത്തിനും ഉപയോഗിക്കാവുന്ന കൂടുതൽ വിപുലമായ ഹൈ ത്രൂപുട്ട് ഗ്ലൈക്കോം അസ്സേകളുടെ വികസനം ഈ പുതിയ രീതി സഹായിക്കും.
കാർഷിക, വനവൽക്കരണം, പുല്ല്, മരം കൊണ്ടുള്ള വസ്തുക്കൾ എന്നിവ ചേർന്ന ലിഗ്നോസെല്ലുലോസിക് ബയോമാസ്, ഉയർന്ന മൂല്യമുള്ള ഉൽപ്പന്നങ്ങൾ ഉൽപ്പാദിപ്പിക്കുന്നതിന് ഭക്ഷണം, തീറ്റ, ഇന്ധനം, രാസ മുൻഗാമികൾ എന്നിവയുൾപ്പെടെയുള്ള ജൈവ അധിഷ്ഠിത ഉൽപ്പന്നങ്ങളുടെ ഉത്പാദനത്തിനുള്ള ഒരു സാധ്യതയുള്ള ഫീഡ്‌സ്റ്റോക്കാണ്. സസ്യകോശഭിത്തികളിൽ അടങ്ങിയിരിക്കുന്ന കാർബോഹൈഡ്രേറ്റുകൾ (സെല്ലുലോസ്, ഹെമിസെല്ലുലോസ് പോലുള്ളവ) രാസ സംസ്കരണത്തിലൂടെയും ബയോ ട്രാൻസ്‌ഫോർമേഷനിലൂടെയും (എൻസൈമാറ്റിക് ഹൈഡ്രോലിസിസ്, മൈക്രോബയൽ ഫെർമെന്റേഷൻ പോലുള്ളവ) മോണോസാക്രറൈഡുകളായി ഡീപോളിമറൈസ് ചെയ്യപ്പെടുന്നു. സാധാരണ പ്രീ-ട്രീറ്റ്‌മെന്റുകളിൽ അമോണിയ ഫൈബർ വികാസം (AFEX), നേർപ്പിച്ച ആസിഡ് (DA), അയോണിക് ദ്രാവകം (IL), നീരാവി സ്ഫോടനം (SE) എന്നിവ ഉൾപ്പെടുന്നു, ഇവ സസ്യകോശഭിത്തികൾ തുറന്ന് ലിഗ്നോസെല്ലുലോസ് ഉത്പാദനം കുറയ്ക്കുന്നതിന് രാസവസ്തുക്കളുടെയും താപത്തിന്റെയും സംയോജനം ഉപയോഗിക്കുന്നു3,4. പദാർത്ഥത്തിന്റെ ശാഠ്യം, 5. വാണിജ്യ സജീവ കാർബോഹൈഡ്രേറ്റ് അടങ്ങിയ എൻസൈമുകൾ (CAZymes) ഉപയോഗിച്ച് ഉയർന്ന ഖരവസ്തുക്കളുടെ ലോഡിലും ജൈവ അധിഷ്ഠിത ഇന്ധനങ്ങളും രാസവസ്തുക്കളും ഉൽപ്പാദിപ്പിക്കുന്നതിന് ട്രാൻസ്ജെനിക് യീസ്റ്റുകളോ ബാക്ടീരിയകളോ ഉപയോഗിച്ച് സൂക്ഷ്മജീവ ഫെർമെന്റേഷനിലും എൻസൈമാറ്റിക് ഹൈഡ്രോലിസിസ് നടത്തുന്നു. 6 .
വാണിജ്യ എൻസൈമുകളിലെ CAZymes, സങ്കീർണ്ണമായ കാർബോഹൈഡ്രേറ്റ്-പഞ്ചസാര ബോണ്ടുകളെ സമന്വയപരമായി പിളർത്തി മോണോസാക്രറൈഡുകൾ രൂപപ്പെടുത്തുന്ന എൻസൈമുകളുടെ സങ്കീർണ്ണമായ മിശ്രിതം കൊണ്ടാണ് നിർമ്മിച്ചിരിക്കുന്നത്. 2,7. ഞങ്ങൾ നേരത്തെ റിപ്പോർട്ട് ചെയ്തതുപോലെ, കാർബോഹൈഡ്രേറ്റുകളുമായുള്ള ലിഗ്നിന്റെ ആരോമാറ്റിക് പോളിമറുകളുടെ സങ്കീർണ്ണമായ ശൃംഖല അവയെ വളരെ എളുപ്പത്തിൽ ആഗിരണം ചെയ്യാൻ കഴിയാത്തതാക്കുന്നു, ഇത് അപൂർണ്ണമായ പഞ്ചസാര പരിവർത്തനത്തിലേക്ക് നയിക്കുന്നു, പ്രീട്രീറ്റ് ചെയ്ത ബയോമാസിന്റെ എൻസൈമാറ്റിക് ജലവിശ്ലേഷണ സമയത്ത് ഉൽ‌പാദിപ്പിക്കപ്പെടാത്ത ലൈംഗിക ഒലിഗോസാക്രറൈഡുകളുടെ 15-25% ശേഖരിക്കപ്പെടുന്നു. വിവിധ ബയോമാസ് പ്രീട്രീറ്റ്മെന്റ് രീതികളിലെ ഒരു സാധാരണ പ്രശ്നമാണിത്. ഈ തടസ്സത്തിനുള്ള ചില കാരണങ്ങളിൽ ജലവിശ്ലേഷണ സമയത്ത് എൻസൈം തടസ്സം, അല്ലെങ്കിൽ സസ്യ ബയോമാസിലെ പഞ്ചസാര ബോണ്ടുകൾ തകർക്കാൻ ആവശ്യമായ അവശ്യ എൻസൈമുകളുടെ അഭാവം അല്ലെങ്കിൽ കുറഞ്ഞ അളവ് എന്നിവ ഉൾപ്പെടുന്നു. ഒലിഗോസാക്രറൈഡുകളിലെ പഞ്ചസാര ബോണ്ടുകൾ പോലുള്ള പഞ്ചസാരകളുടെ ഘടനയും ഘടനാപരമായ സവിശേഷതകളും മനസ്സിലാക്കുന്നത്, ജലവിശ്ലേഷണ സമയത്ത് പഞ്ചസാര പരിവർത്തനം മെച്ചപ്പെടുത്താൻ നമ്മെ സഹായിക്കും, പെട്രോളിയം-ഉത്പന്നങ്ങളുമായി ജൈവസാങ്കേതിക പ്രക്രിയകളെ ചെലവ് കുറഞ്ഞ മത്സരാധിഷ്ഠിതമാക്കുന്നു.
കാർബോഹൈഡ്രേറ്റുകളുടെ ഘടന നിർണ്ണയിക്കുന്നത് വെല്ലുവിളി നിറഞ്ഞതാണ്, കൂടാതെ ലിക്വിഡ് ക്രോമാറ്റോഗ്രാഫി (LC)11,12, ന്യൂക്ലിയർ മാഗ്നറ്റിക് റെസൊണൻസ് സ്പെക്ട്രോസ്കോപ്പി (NMR)13, കാപ്പിലറി ഇലക്ട്രോഫോറെസിസ് (CE)14,15,16, മാസ് സ്പെക്ട്രോമെട്രി (MS)17 തുടങ്ങിയ രീതികളുടെ സംയോജനം ആവശ്യമാണ്. ,പതിനെട്ട്. ലേസർ ഡിസോർപ്ഷൻ ഉപയോഗിച്ചുള്ള ടൈം-ഓഫ്-ഫ്ലൈറ്റ് മാസ് സ്പെക്ട്രോമെട്രി, മാട്രിക്സ് (MALDI-TOF-MS) ഉപയോഗിച്ചുള്ള അയോണൈസേഷൻ തുടങ്ങിയ MS രീതികൾ കാർബോഹൈഡ്രേറ്റ് ഘടനകളെ തിരിച്ചറിയുന്നതിനുള്ള ഒരു വൈവിധ്യമാർന്ന രീതിയാണ്. അടുത്തിടെ, ഒലിഗോസാക്കറൈഡ് അറ്റാച്ച്മെന്റ് സ്ഥാനങ്ങൾ, അനോമെറിക് കോൺഫിഗറേഷനുകൾ, സീക്വൻസുകൾ, ബ്രാഞ്ചിംഗ് സ്ഥാനങ്ങൾ എന്നിവയുമായി ബന്ധപ്പെട്ട വിരലടയാളങ്ങൾ തിരിച്ചറിയാൻ സോഡിയം അയോൺ അഡക്റ്റുകളുടെ കൊളിഷൻ-ഇൻഡ്യൂസ്ഡ് ഡിസോസിയേഷൻ (CID) ടാൻഡം MS ഏറ്റവും വ്യാപകമായി ഉപയോഗിച്ചുവരുന്നു 20, 21 .
കാർബോഹൈഡ്രേറ്റ് ബോണ്ടുകളുടെ ആഴത്തിലുള്ള തിരിച്ചറിയലിനായി ഗ്ലൈക്കൻ വിശകലനം ഒരു മികച്ച ഉപകരണമാണ്22. സങ്കീർണ്ണമായ കാർബോഹൈഡ്രേറ്റ് ലിങ്കേജുകൾ മനസ്സിലാക്കുന്നതിനുള്ള പ്രോബുകളായി സസ്യകോശഭിത്തി ഗ്ലൈക്കാനിലേക്ക് നയിക്കുന്ന മോണോക്ലോണൽ ആന്റിബോഡികൾ (mAbs) ഈ രീതി ഉപയോഗിക്കുന്നു. വിവിധ സാക്കറൈഡുകൾ ഉപയോഗിച്ച് വിവിധ രേഖീയവും ശാഖിതവുമായ ഒലിഗോസാക്കറൈഡുകൾക്കെതിരെ രൂപകൽപ്പന ചെയ്ത 250-ലധികം mAbs ലോകമെമ്പാടും ലഭ്യമാണ്24. സസ്യകോശ തരം, അവയവം, പ്രായം, വികസന ഘട്ടം, വളർച്ചാ പരിസ്ഥിതി എന്നിവയെ ആശ്രയിച്ച് കാര്യമായ വ്യത്യാസങ്ങൾ ഉള്ളതിനാൽ, സസ്യകോശഭിത്തിയുടെ ഘടന, ഘടന, പരിഷ്കാരങ്ങൾ എന്നിവ ചിത്രീകരിക്കാൻ നിരവധി mAbs വ്യാപകമായി ഉപയോഗിച്ചുവരുന്നു25,26. അടുത്തിടെ, സസ്യ-ജന്തു വ്യവസ്ഥകളിലെ വെസിക്കിൾ ജനസംഖ്യയും ഉപകോശ മാർക്കറുകൾ, വികസന ഘട്ടങ്ങൾ അല്ലെങ്കിൽ പരിസ്ഥിതി ഉത്തേജകങ്ങൾ എന്നിവയാൽ നിർണ്ണയിക്കപ്പെടുന്ന ഗ്ലൈക്കൻ ഗതാഗതത്തിലെ അവയുടെ പങ്കിനെ മനസ്സിലാക്കുന്നതിനും എൻസൈമാറ്റിക് പ്രവർത്തനം നിർണ്ണയിക്കുന്നതിനും ഈ രീതി ഉപയോഗിച്ചുവരുന്നു. ഗ്ലൈക്കാനുകളുടെയും സൈലാനുകളുടെയും വ്യത്യസ്ത ഘടനകളിൽ പെക്റ്റിൻ (P), സൈലാൻ (X), മന്നാൻ (M), സൈലോഗ്ലൂക്കൻസ് (XylG), മിക്സഡ് ബോണ്ട് ഗ്ലൂക്കൻസ് (MLG), അറബിനോക്‌സിലാൻ (ArbX), ഗാലക്റ്റോമാനൻ (GalG), ഗ്ലൂക്കുറോണിക് ആസിഡ്-അരബിനോക്‌സിലാൻ (GArbX), അറബിനോ-ഗാലക്റ്റാൻ (ArbG) എന്നിവ ഉൾപ്പെടുന്നു.
എന്നിരുന്നാലും, ഈ ഗവേഷണ ശ്രമങ്ങളെല്ലാം ഉണ്ടായിരുന്നിട്ടും, ഉയർന്ന സോളിഡ് ലോഡ് (HSL) ജലവിശ്ലേഷണ സമയത്ത് ഒലിഗോസാക്കറൈഡ് ശേഖരണത്തിന്റെ സ്വഭാവത്തിൽ ശ്രദ്ധ കേന്ദ്രീകരിച്ചിരിക്കുന്നത് ചുരുക്കം ചില പഠനങ്ങൾ മാത്രമാണ്, അതിൽ ഒലിഗോസാക്കറൈഡ് റിലീസ്, ജലവിശ്ലേഷണ സമയത്ത് ഒലിഗോമെറിക് ശൃംഖലയുടെ നീളത്തിലെ മാറ്റങ്ങൾ, വിവിധ താഴ്ന്ന DP പോളിമറുകൾ, അവയുടെ വളവുകൾ എന്നിവ ഉൾപ്പെടുന്നു. വിതരണങ്ങൾ 30,31,32. അതേസമയം, ഗ്ലൈക്കൻ ഘടനയുടെ സമഗ്ര വിശകലനത്തിന് ഗ്ലൈക്കൻ വിശകലനം ഒരു ഉപയോഗപ്രദമായ ഉപകരണമാണെന്ന് തെളിയിക്കപ്പെട്ടിട്ടുണ്ടെങ്കിലും, ആന്റിബോഡി രീതികൾ ഉപയോഗിച്ച് വെള്ളത്തിൽ ലയിക്കുന്ന കുറഞ്ഞ DP ഒലിഗോസാക്കറൈഡുകൾ വിലയിരുത്തുന്നത് ബുദ്ധിമുട്ടാണ്. 5-10 kDa-യിൽ താഴെയുള്ള തന്മാത്രാ ഭാരമുള്ള ചെറിയ DP ഒലിഗോസാക്കറൈഡുകൾ ELISA പ്ലേറ്റുകൾ 33, 34-ൽ ബന്ധിപ്പിക്കുന്നില്ല, കൂടാതെ ആന്റിബോഡി ചേർക്കുന്നതിന് മുമ്പ് കഴുകി കളയുന്നു.
ഇതാദ്യമായി, മോണോക്ലോണൽ ആന്റിബോഡികൾ ഉപയോഗിച്ച് അവിഡിൻ-പൊതിഞ്ഞ പ്ലേറ്റുകളിൽ ഒരു ELISA അസ്സെ ഞങ്ങൾ പ്രദർശിപ്പിക്കുന്നു, ലയിക്കുന്ന റിഫ്രാക്ടറി ഒലിഗോസാക്കറൈഡുകൾക്കായുള്ള ഒരു-ഘട്ട ബയോട്ടിനൈലേഷൻ നടപടിക്രമവും ഗ്ലൈക്കോം വിശകലനവും സംയോജിപ്പിക്കുന്നു. ഹൈഡ്രോലൈസ് ചെയ്ത പഞ്ചസാര കോമ്പോസിഷനുകളുടെ ട്രൈമെഥൈൽസിലൈൽ (TMS) ഡെറിവേറ്റൈസേഷൻ ഉപയോഗിച്ച് പൂരക ഒലിഗോസാക്കറൈഡ് ലിങ്കേജുകളുടെ MALDI-TOF-MS, GC-MS അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള വിശകലനം വഴി ഗ്ലൈക്കോം വിശകലനത്തിലേക്കുള്ള ഞങ്ങളുടെ സമീപനം സാധൂകരിക്കപ്പെട്ടു. ഈ നൂതന സമീപനം ഭാവിയിൽ ഒരു ഉയർന്ന-ത്രൂപുട്ട് രീതിയായി വികസിപ്പിക്കാനും ബയോമെഡിക്കൽ ഗവേഷണത്തിൽ വിശാലമായ പ്രയോഗം കണ്ടെത്താനും കഴിയും35.
എൻസൈമുകളുടെയും ആന്റിബോഡികളുടെയും വിവർത്തനത്തിനു ശേഷമുള്ള പരിഷ്കാരങ്ങൾ, ഉദാഹരണത്തിന് ഗ്ലൈക്കോസൈലേഷൻ, 36 അവയുടെ ജൈവിക പ്രവർത്തനത്തെ ബാധിക്കുന്നു. ഉദാഹരണത്തിന്, സെറം പ്രോട്ടീനുകളുടെ ഗ്ലൈക്കോസൈലേഷനിലെ മാറ്റങ്ങൾ കോശജ്വലന ആർത്രൈറ്റിസിൽ ഒരു പ്രധാന പങ്ക് വഹിക്കുന്നു, കൂടാതെ ഗ്ലൈക്കോസൈലേഷനിലെ മാറ്റങ്ങൾ രോഗനിർണയ മാർക്കറുകളായി ഉപയോഗിക്കുന്നു37. ദഹനനാളത്തിന്റെയും കരളിന്റെയും വിട്ടുമാറാത്ത കോശജ്വലന രോഗങ്ങൾ, വൈറൽ അണുബാധകൾ, അണ്ഡാശയം, സ്തനാർബുദം, പ്രോസ്റ്റേറ്റ് കാൻസർ എന്നിവയുൾപ്പെടെ വിവിധ രോഗങ്ങളിൽ വിവിധ ഗ്ലൈക്കാനുകൾ എളുപ്പത്തിൽ പ്രത്യക്ഷപ്പെടുന്നതായി സാഹിത്യത്തിൽ റിപ്പോർട്ട് ചെയ്യപ്പെട്ടിട്ടുണ്ട്38,39,40. ആന്റിബോഡി അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള ഗ്ലൈക്കൻ ELISA രീതികൾ ഉപയോഗിച്ച് ഗ്ലൈക്കാനുകളുടെ ഘടന മനസ്സിലാക്കുന്നത് സങ്കീർണ്ണമായ MS രീതികൾ ഉപയോഗിക്കാതെ തന്നെ രോഗനിർണയത്തിൽ അധിക ആത്മവിശ്വാസം നൽകും.
പ്രീട്രീറ്റ്‌മെന്റിനും എൻസൈമാറ്റിക് ഹൈഡ്രോലിസിസിനും ശേഷം മുരടിച്ച ഒലിഗോസാക്കറൈഡുകൾ ജലവിശ്ലേഷണം ചെയ്യപ്പെടാതെ തുടരുന്നുവെന്ന് ഞങ്ങളുടെ മുൻ പഠനം തെളിയിച്ചു (ചിത്രം 1). മുമ്പ് പ്രസിദ്ധീകരിച്ച ഞങ്ങളുടെ കൃതിയിൽ, AFEX-പ്രീട്രീറ്റ് ചെയ്ത കോൺ സ്റ്റോവർ ഹൈഡ്രോലൈസേറ്റിൽ (ACSH) നിന്ന് ഒലിഗോസാക്കറൈഡുകൾ വേർതിരിച്ചെടുക്കുന്നതിനുള്ള ഒരു സജീവമാക്കിയ ചാർക്കോൾ സോളിഡ്-ഫേസ് എക്സ്ട്രാക്ഷൻ രീതി ഞങ്ങൾ വികസിപ്പിച്ചെടുത്തു. പ്രാരംഭ എക്സ്ട്രാക്ഷൻ, വേർപിരിയൽ എന്നിവയ്ക്ക് ശേഷം, ഒലിഗോസാക്കറൈഡുകൾ സൈസ് എക്‌സ്‌ക്ലൂഷൻ ക്രോമാറ്റോഗ്രാഫി (SEC) വഴി കൂടുതൽ ഭിന്നിപ്പിക്കുകയും തന്മാത്രാ ഭാരത്തിന്റെ ക്രമത്തിൽ ശേഖരിക്കുകയും ചെയ്തു. വിവിധ പ്രീട്രീറ്റ്‌മെന്റുകളിൽ നിന്ന് പുറത്തുവരുന്ന പഞ്ചസാര മോണോമറുകളും ഒലിഗോമറുകളും പഞ്ചസാര ഘടന വിശകലനം വഴി വിശകലനം ചെയ്തു. വിവിധ പ്രീട്രീറ്റ്‌മെന്റ് രീതികളിലൂടെ ലഭിച്ച പഞ്ചസാര ഒലിഗോമറുകളുടെ ഉള്ളടക്കം താരതമ്യം ചെയ്യുമ്പോൾ, മുരടിച്ച ഒലിഗോസാക്കറൈഡുകളുടെ സാന്നിധ്യം ബയോമാസിനെ മോണോസാക്കറൈഡുകളാക്കി മാറ്റുന്നതിൽ ഒരു സാധാരണ പ്രശ്നമാണ്, കൂടാതെ കുറഞ്ഞത് 10-15% മുതൽ 18% വരെ പഞ്ചസാര വിളവ് കുറയ്ക്കുന്നതിന് ഇത് കാരണമാകും. യുഎസ്. ഒലിഗോസാക്കറൈഡ് ഭിന്നസംഖ്യകളുടെ കൂടുതൽ വലിയ തോതിലുള്ള ഉൽപാദനത്തിനായി ഈ രീതി ഉപയോഗിക്കുന്നു. തത്ഫലമായുണ്ടാകുന്ന ACH ഉം വ്യത്യസ്ത തന്മാത്രാ ഭാരങ്ങളുള്ള അതിന്റെ തുടർന്നുള്ള ഭിന്നസംഖ്യകളും ഈ കൃതിയിൽ ഒലിഗോസാക്കറൈഡുകളുടെ സ്വഭാവരൂപീകരണത്തിനായി പരീക്ഷണാത്മക വസ്തുവായി ഉപയോഗിച്ചു.
പ്രീട്രീറ്റ്മെന്റിനും എൻസൈമാറ്റിക് ഹൈഡ്രോലിസിസിനും ശേഷം, സ്ഥിരമായ ഒലിഗോസാക്കറൈഡുകൾ ജലവിശ്ലേഷണം ചെയ്യപ്പെടാതെ തുടർന്നു. ഇവിടെ (A) ഒരു ഒലിഗോസാക്കറൈഡ് വേർതിരിക്കൽ രീതിയാണ്, അതിൽ സജീവമാക്കിയ കാർബണും ഡയറ്റോമേഷ്യസ് എർത്തും കൊണ്ട് നിർമ്മിച്ച ഒരു പായ്ക്ക്ഡ് ബെഡ് ഉപയോഗിച്ച് AFEX-പ്രീട്രീറ്റ് ചെയ്ത കോൺ സ്റ്റൗവർ ഹൈഡ്രോലൈസേറ്റിൽ (ACSH) നിന്ന് ഒലിഗോസാക്കറൈഡുകൾ വേർതിരിച്ചെടുക്കുന്നു; (B) ഒലിഗോസാക്കറൈഡുകൾ വേർതിരിക്കുന്നതിനുള്ള രീതി. സൈസ് എക്‌സ്‌ക്ലൂഷൻ ക്രോമാറ്റോഗ്രാഫി (SEC) വഴി ഒലിഗോസാക്കറൈഡുകൾ കൂടുതൽ വേർതിരിച്ചു; (C) വിവിധ പ്രീട്രീറ്റ്മെന്റുകളിൽ നിന്ന് പുറത്തിറങ്ങിയ സാക്കറൈഡ് മോണോമറുകളും ഒലിഗോമറുകളും (നേർപ്പിച്ച ആസിഡ്: DA, അയോണിക് ലിക്വിഡ്: IL, AFEX). എൻസൈമാറ്റിക് ഹൈഡ്രോലിസിസ് അവസ്ഥകൾ: 25% (w/w) ഉയർന്ന സോളിഡ് ലോഡിംഗ് (ഏകദേശം 8% ഗ്ലൂക്കൻ ലോഡിംഗ്), 96 മണിക്കൂർ ഹൈഡ്രോലിസിസ്, 20 mg/g വാണിജ്യ എൻസൈം ലോഡിംഗ് (Ctec2:Htec2:MP-2:1:1 അനുപാതം) കൂടാതെ (D) AFEX പ്രീ-ട്രീറ്റ് ചെയ്ത കോൺ സ്റ്റൗവറിൽ (ACS) നിന്ന് പുറത്തിറങ്ങിയ ഗ്ലൂക്കോസ്, സൈലോസ്, അറബിനോസ് എന്നിവയുടെ പഞ്ചസാര മോണോമറുകളും ഒലിഗോമറുകളും.
ഖര ബയോമാസ് അവശിഷ്ടങ്ങളിൽ നിന്ന് വേർതിരിച്ചെടുത്ത സത്തുകളിലെ ഗ്ലൈക്കാനുകളുടെ സമഗ്രമായ ഘടനാ വിശകലനത്തിന് ഗ്ലൈക്കൻ വിശകലനം ഒരു ഉപയോഗപ്രദമായ ഉപകരണമാണെന്ന് തെളിയിക്കപ്പെട്ടിട്ടുണ്ട്. എന്നിരുന്നാലും, ഈ പരമ്പരാഗത രീതി ഉപയോഗിച്ച് വെള്ളത്തിൽ ലയിക്കുന്ന സാക്കറൈഡുകൾക്ക് പ്രാതിനിധ്യം കുറവാണ്41 കാരണം കുറഞ്ഞ തന്മാത്രാ ഭാരം ഒലിഗോസാക്കറൈഡുകൾ ELISA പ്ലേറ്റുകളിൽ നിശ്ചലമാക്കാൻ പ്രയാസമാണ്, കൂടാതെ ആന്റിബോഡി ചേർക്കുന്നതിന് മുമ്പ് കഴുകി കളയുന്നു. അതിനാൽ, ആന്റിബോഡി ബൈൻഡിംഗിനും സ്വഭാവരൂപീകരണത്തിനും, അവിഡിൻ-പൊതിഞ്ഞ ELISA പ്ലേറ്റുകളിൽ ലയിക്കുന്നതും പൊരുത്തപ്പെടാത്തതുമായ ഒലിഗോസാക്കറൈഡുകൾ പൂശാൻ ഒരു ഒറ്റ-ഘട്ട ബയോട്ടിനൈലേഷൻ രീതി ഉപയോഗിച്ചു. മുമ്പ് നിർമ്മിച്ച ACSH ഉം അതിന്റെ തന്മാത്രാ ഭാരം (അല്ലെങ്കിൽ പോളിമറൈസേഷന്റെ അളവ്, DP) അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള ഒരു ഭാഗവും ഉപയോഗിച്ചാണ് ഈ രീതി പരീക്ഷിച്ചത്. കാർബോഹൈഡ്രേറ്റിന്റെ കുറയ്ക്കുന്ന അറ്റത്തേക്ക് ബയോട്ടിൻ-എൽസി-ഹൈഡ്രാസൈഡ് ചേർത്ത് ഒലിഗോസാക്കറൈഡ് ബൈൻഡിംഗ് അഫിനിറ്റി വർദ്ധിപ്പിക്കാൻ ഒറ്റ-ഘട്ട ബയോട്ടിനൈലേഷൻ ഉപയോഗിച്ചു (ചിത്രം 2). ലായനിയിൽ, കുറയ്ക്കുന്ന അറ്റത്തുള്ള ഹെമിയാസെറ്റൽ ഗ്രൂപ്പ് ബയോട്ടിൻ-എൽസി-ഹൈഡ്രാസൈഡിന്റെ ഹൈഡ്രാസൈഡ് ഗ്രൂപ്പുമായി പ്രതിപ്രവർത്തിച്ച് ഒരു ഹൈഡ്രസോൺ ബോണ്ട് ഉണ്ടാക്കുന്നു. NaCNBH3 എന്ന റിഡ്യൂസിംഗ് ഏജന്റിന്റെ സാന്നിധ്യത്തിൽ, ഹൈഡ്രസോൺ ബോണ്ട് ഒരു സ്ഥിരതയുള്ള ബയോട്ടിനൈലേറ്റഡ് എൻഡ് പ്രോഡക്റ്റായി ചുരുങ്ങുന്നു. പഞ്ചസാര റിഡ്യൂസിംഗ് എൻഡിന്റെ പരിഷ്കരണത്തോടെ, കുറഞ്ഞ DP ഒലിഗോസാക്കറൈഡുകളെ ELISA പ്ലേറ്റുകളുമായി ബന്ധിപ്പിക്കുന്നത് സാധ്യമായി, കൂടാതെ ഞങ്ങളുടെ പഠനത്തിൽ ഗ്ലൈക്കൻ-ടാർഗെറ്റുചെയ്‌ത mAbs ഉപയോഗിച്ച് അവിഡിൻ-പൊതിഞ്ഞ പ്ലേറ്റുകളിൽ ഇത് ചെയ്തു.
ബയോട്ടിനൈലേറ്റഡ് ഒലിഗോസാക്കറൈഡുകൾക്കായി ELISA അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള മോണോക്ലോണൽ ആന്റിബോഡികളുടെ സ്ക്രീനിംഗ്. ഇവിടെ (A) ന്യൂട്രാവിഡിൻ പൂശിയ പ്ലേറ്റുകളിൽ ഗ്ലൈക്കൻ-ടാർഗെറ്റുചെയ്‌ത mAbs ഉപയോഗിച്ച് ഒലിഗോസാക്കറൈഡുകളുടെ ബയോട്ടിനൈലേഷനും തുടർന്നുള്ള ELISA സ്ക്രീനിംഗും സംയോജിപ്പിച്ചിരിക്കുന്നു, (B) പ്രതിപ്രവർത്തന ഉൽപ്പന്നങ്ങളുടെ ബയോട്ടിനൈലേഷനുള്ള ഒരു-ഘട്ട നടപടിക്രമം കാണിക്കുന്നു.
ഒലിഗോസാക്കറൈഡ്-സംയോജിത ആന്റിബോഡികളുള്ള അവിഡിൻ-പൊതിഞ്ഞ പ്ലേറ്റുകൾ പ്രൈമറി, സെക്കൻഡറി ആന്റിബോഡികളിൽ ചേർത്ത് പ്രകാശ-സമയ-സെൻസിറ്റീവ് മീഡിയത്തിൽ കഴുകി. ആന്റിബോഡി ബൈൻഡിംഗ് പൂർത്തിയായ ശേഷം, പ്ലേറ്റ് ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്യുന്നതിന് TMB സബ്‌സ്‌ട്രേറ്റ് ചേർക്കുക. സൾഫ്യൂറിക് ആസിഡ് ഉപയോഗിച്ച് പ്രതികരണം ഒടുവിൽ നിർത്തി. ആന്റിബോഡി-നിർദ്ദിഷ്ട ക്രോസ്-ലിങ്കിംഗ് കണ്ടെത്തുന്നതിന് ഓരോ ആന്റിബോഡിയുടെയും ബൈൻഡിംഗ് ശക്തി നിർണ്ണയിക്കാൻ ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്ത പ്ലേറ്റുകൾ ഒരു ELISA റീഡർ ഉപയോഗിച്ച് വിശകലനം ചെയ്തു. പരീക്ഷണത്തിന്റെ വിശദാംശങ്ങൾക്കും പാരാമീറ്ററുകൾക്കും, "മെറ്റീരിയലുകളും രീതികളും" എന്ന അനുബന്ധ വിഭാഗം കാണുക.
ACSH-ൽ അടങ്ങിയിരിക്കുന്ന ലയിക്കുന്ന ഒലിഗോസാക്കറൈഡുകളും ലിഗ്നോസെല്ലുലോസിക് ഹൈഡ്രോലൈസേറ്റുകളിൽ നിന്ന് വേർതിരിച്ചെടുത്ത അസംസ്കൃതവും ശുദ്ധീകരിച്ചതുമായ ഒലിഗോസാക്കറൈഡ് ഭിന്നസംഖ്യകളും ചിത്രീകരിച്ചുകൊണ്ട്, നിർദ്ദിഷ്ട ആപ്ലിക്കേഷനുകൾക്കായി ഈ പുതുതായി വികസിപ്പിച്ച രീതിയുടെ പ്രയോജനം ഞങ്ങൾ പ്രകടമാക്കുന്നു. ചിത്രം 3-ൽ കാണിച്ചിരിക്കുന്നതുപോലെ, ബയോസൈലേറ്റഡ് ഗ്ലൈക്കോം അസ്സേ രീതികൾ ഉപയോഗിച്ച് ACSH-ൽ തിരിച്ചറിഞ്ഞ ഏറ്റവും സാധാരണമായ എപ്പിറ്റോപ്പ്-സബ്സ്റ്റിറ്റ്യൂട്ടഡ് സൈലാനുകൾ സാധാരണയായി യൂറോണിക് (U) അല്ലെങ്കിൽ മെത്തിലൂറോണിക് (MeU), പെക്റ്റിക് അറബിനോഗാലക്റ്റാനുകൾ എന്നിവയാണ്. ഹൈഡ്രോലൈസ് ചെയ്യാത്ത സോളിഡുകളുടെ (UHS) ഗ്ലൈക്കാനുകളുടെ വിശകലനത്തെക്കുറിച്ചുള്ള ഞങ്ങളുടെ മുൻ പഠനത്തിലും അവയിൽ മിക്കതും കണ്ടെത്തി.
കോശഭിത്തി ഗ്ലൈക്കാനിലേക്ക് നയിക്കുന്ന ഒരു മോണോക്ലോണൽ ആന്റിബോഡി ഉപയോഗിച്ച് റീകാൽസിട്രന്റ് ഒലിഗോസാക്കറൈഡ് എപ്പിറ്റോപ്പുകളുടെ കണ്ടെത്തൽ. "ന്യൂട്രൽ" ഭിന്നസംഖ്യ ACN ഭിന്നസംഖ്യയും "അസിഡിക്" ഭിന്നസംഖ്യ FA ഭിന്നസംഖ്യയുമാണ്. ഹീറ്റ്മാപ്പിലെ തിളക്കമുള്ള ചുവപ്പ് നിറങ്ങൾ ഉയർന്ന എപ്പിറ്റോപ്പ് ഉള്ളടക്കത്തെ സൂചിപ്പിക്കുന്നു, തിളക്കമുള്ള നീല നിറങ്ങൾ ഒരു ശൂന്യമായ പശ്ചാത്തലത്തെ സൂചിപ്പിക്കുന്നു. സ്കെയിലിലെ വർണ്ണ മൂല്യങ്ങൾ N=2 ഫോർമുലേഷനുകൾക്കുള്ള അസംസ്കൃത OD മൂല്യങ്ങളെ അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ളതാണ്. ആന്റിബോഡികൾ തിരിച്ചറിഞ്ഞ പ്രധാന എപ്പിറ്റോപ്പുകൾ വലതുവശത്ത് കാണിച്ചിരിക്കുന്നു.
പരീക്ഷിച്ച വാണിജ്യ എൻസൈം മിശ്രിതത്തിലെ ഏറ്റവും സാധാരണമായ സെല്ലുലേസുകൾക്കും ഹെമിസെല്ലുലേസുകൾക്കും ഈ നോൺ-സെല്ലുലോസ് ഘടനകളെ പിളർത്താൻ കഴിഞ്ഞില്ല, ഇതിൽ ഏറ്റവും സാധാരണയായി ഉപയോഗിക്കുന്ന വാണിജ്യ എൻസൈമുകൾ ഉൾപ്പെടുന്നു. അതിനാൽ, അവയുടെ ജലവിശ്ലേഷണത്തിന് പുതിയ സഹായ എൻസൈമുകൾ ആവശ്യമാണ്. ആവശ്യമായ നോൺ-സെല്ലുലോസ് ആക്സസറി എൻസൈമുകൾ ഇല്ലാതെ, ഈ നോൺ-സെല്ലുലോസ് ബോണ്ടുകൾ മോണോസാക്രറൈഡുകളിലേക്കുള്ള പൂർണ്ണമായ പരിവർത്തനത്തെ തടയുന്നു, അവയുടെ മാതൃ പഞ്ചസാര പോളിമറുകൾ വ്യാപകമായി ചെറിയ ശകലങ്ങളായി ഹൈഡ്രോലൈസ് ചെയ്ത് വാണിജ്യ എൻസൈം മിശ്രിതങ്ങൾ ഉപയോഗിച്ച് ലയിപ്പിച്ചാലും.
സിഗ്നൽ വിതരണത്തെയും അതിന്റെ ബൈൻഡിംഗ് ശക്തിയെയും കുറിച്ചുള്ള കൂടുതൽ പഠനത്തിൽ, ഡൈമറുകളിലെ കുറഞ്ഞ ഡിപി ഫ്രാക്ഷനുകളെ (ഡി, ഇ, എഫ്, ഡിപി) അപേക്ഷിച്ച് ഉയർന്ന ഡിപി പഞ്ചസാര ഭിന്നസംഖ്യകളിൽ (എ, ബി, സി, ഡിപി 20+ വരെ) ബൈൻഡിംഗ് എപ്പിറ്റോപ്പുകൾ കുറവാണെന്ന് കാണിച്ചു (ചിത്രം 1). ന്യൂട്രൽ ഫ്രാക്ഷനുകളേക്കാൾ നോൺ-സെല്ലുലോസ് എപ്പിറ്റോപ്പുകളിൽ ആസിഡ് ശകലങ്ങൾ കൂടുതൽ സാധാരണമാണ്. ഉയർന്ന ഡിപിയും ആസിഡ് ഭാഗങ്ങളും എൻസൈമാറ്റിക് ജലവിശ്ലേഷണത്തെ കൂടുതൽ പ്രതിരോധിക്കുന്ന ഞങ്ങളുടെ മുൻ പഠനത്തിൽ നിരീക്ഷിച്ച പാറ്റേണുമായി ഈ പ്രതിഭാസങ്ങൾ പൊരുത്തപ്പെടുന്നു. അതിനാൽ, സെല്ലുലോസ് അല്ലാത്ത ഗ്ലൈക്കൻ എപ്പിറ്റോപ്പുകളുടെയും യു, മീയു സബ്സ്റ്റിറ്റ്യൂഷനുകളുടെയും സാന്നിധ്യം ഒലിഗോസാക്കറൈഡുകളുടെ സ്ഥിരതയ്ക്ക് വളരെയധികം സംഭാവന നൽകും. കുറഞ്ഞ ഡിപി ഒലിഗോസാക്കറൈഡുകൾക്ക് ബൈൻഡിംഗും കണ്ടെത്തൽ കാര്യക്ഷമതയും പ്രശ്‌നകരമാകുമെന്ന് ശ്രദ്ധിക്കേണ്ടതാണ്, പ്രത്യേകിച്ച് എപ്പിറ്റോപ്പ് ഒരു ഡൈമെറിക് അല്ലെങ്കിൽ ട്രൈമെറിക് ഒലിഗോസാക്കറൈഡാണെങ്കിൽ. വ്യത്യസ്ത നീളമുള്ള വാണിജ്യ ഒലിഗോസാക്കറൈഡുകൾ ഉപയോഗിച്ച് ഇത് പരീക്ഷിക്കാൻ കഴിയും, ഓരോന്നിനും ഒരു പ്രത്യേക mAb-ലേക്ക് ബന്ധിപ്പിക്കുന്ന ഒരു എപ്പിറ്റോപ്പ് മാത്രമേ അടങ്ങിയിട്ടുള്ളൂ.
അങ്ങനെ, ഘടന-നിർദ്ദിഷ്ട ആന്റിബോഡികളുടെ ഉപയോഗം ചില തരം റീകാൽസിട്രന്റ് ബോണ്ടുകൾ വെളിപ്പെടുത്തി. ഉപയോഗിക്കുന്ന ആന്റിബോഡിയുടെ തരം, ഉചിതമായ ലിഗേഷൻ പാറ്റേൺ, അത് ഉത്പാദിപ്പിക്കുന്ന സിഗ്നലിന്റെ ശക്തി (ഏറ്റവും കുറഞ്ഞതും സമൃദ്ധവുമായത്) എന്നിവയെ ആശ്രയിച്ച്, പുതിയ എൻസൈമുകളെ തിരിച്ചറിയാനും കൂടുതൽ പൂർണ്ണമായ ഗ്ലൈക്കോകൺവേർഷനായി എൻസൈം മിശ്രിതത്തിലേക്ക് അർദ്ധ-ക്വാണ്ടിറ്റേറ്റീവ് ആയി ചേർക്കാനും കഴിയും. ACSH ഒലിഗോസാക്കറൈഡുകളുടെ വിശകലനം ഒരു ഉദാഹരണമായി എടുക്കുകയാണെങ്കിൽ, ഓരോ ബയോമാസ് മെറ്റീരിയലിനും നമുക്ക് ഗ്ലൈക്കൻ ബോണ്ടുകളുടെ ഒരു ഡാറ്റാബേസ് സൃഷ്ടിക്കാൻ കഴിയും. ആന്റിബോഡികളുടെ വ്യത്യസ്ത അഫിനിറ്റി കണക്കിലെടുക്കേണ്ടതുണ്ടെന്നും അവയുടെ അഫിനിറ്റി അജ്ഞാതമാണെങ്കിൽ, വ്യത്യസ്ത ആന്റിബോഡികളുടെ സിഗ്നലുകൾ താരതമ്യം ചെയ്യുമ്പോൾ ഇത് ചില ബുദ്ധിമുട്ടുകൾ സൃഷ്ടിക്കുമെന്നും ഇവിടെ ശ്രദ്ധിക്കേണ്ടതാണ്. കൂടാതെ, ഒരേ ആന്റിബോഡിയുടെ സാമ്പിളുകൾക്കിടയിൽ ഗ്ലൈക്കൻ ബോണ്ടുകളുടെ താരതമ്യം മികച്ച രീതിയിൽ പ്രവർത്തിച്ചേക്കാം. ഈ ശാഠ്യമുള്ള ബോണ്ടുകളെ പിന്നീട് CAZyme ഡാറ്റാബേസുമായി ബന്ധിപ്പിക്കാൻ കഴിയും, അതിൽ നിന്ന് നമുക്ക് എൻസൈമുകളെ തിരിച്ചറിയാനും, കാൻഡിഡേറ്റ് എൻസൈമുകൾ തിരഞ്ഞെടുക്കാനും, ബോണ്ട്-ബ്രേക്കിംഗ് എൻസൈമുകൾക്കായി പരിശോധിക്കാനും, അല്ലെങ്കിൽ ബയോഫൈനറികളിൽ ഉപയോഗിക്കുന്നതിന് ഈ എൻസൈമുകൾ പ്രകടിപ്പിക്കുന്നതിന് സൂക്ഷ്മജീവ സംവിധാനങ്ങൾ വികസിപ്പിക്കാനും കഴിയും.
ലിഗ്നോസെല്ലുലോസിക് ഹൈഡ്രോലൈസേറ്റുകളിൽ അടങ്ങിയിരിക്കുന്ന കുറഞ്ഞ തന്മാത്രാ ഭാരമുള്ള ഒലിഗോസാക്കറൈഡുകളെ ചിത്രീകരിക്കുന്നതിനുള്ള ബദൽ രീതികളെ രോഗപ്രതിരോധ രീതികൾ എങ്ങനെ പൂരകമാക്കുന്നുവെന്ന് വിലയിരുത്തുന്നതിന്, അതേ പാനലിൽ (ചിത്രം 5) ഒലിഗോസാക്കറൈഡ് ഭാഗത്ത് MALDI (ചിത്രം 4, S1-S8), GC-MS അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള TMS-ൽ നിന്ന് ഉരുത്തിരിഞ്ഞ സാക്കറൈഡുകളുടെ വിശകലനം എന്നിവ ഞങ്ങൾ നടത്തി. ഒലിഗോസാക്കറൈഡ് തന്മാത്രകളുടെ പിണ്ഡ വിതരണം ഉദ്ദേശിച്ച ഘടനയുമായി പൊരുത്തപ്പെടുന്നുണ്ടോ എന്ന് താരതമ്യം ചെയ്യാൻ MALDI ഉപയോഗിക്കുന്നു. ചിത്രം 4-ൽ ACN-A, ACN-B എന്നീ നിഷ്പക്ഷ ഘടകങ്ങളുടെ MC കാണിക്കുന്നു. ACN-A വിശകലനം DP 4–8 (ചിത്രം 4) മുതൽ DP 22 (ചിത്രം S1) വരെയുള്ള പെന്റോസ് പഞ്ചസാരകളുടെ ഒരു ശ്രേണി സ്ഥിരീകരിച്ചു, അതിന്റെ ഭാരം MeU-xylan ഒലിഗോസാക്കറൈഡുകളുമായി യോജിക്കുന്നു. ACN-B വിശകലനം DP 8-15 ഉള്ള പെന്റോസും ഗ്ലൂക്കോക്‌സിലാൻ പരമ്പരയും സ്ഥിരീകരിച്ചു. ചിത്രം S3 പോലുള്ള സപ്ലിമെന്ററി മെറ്റീരിയലുകളിൽ, FA-C അസിഡിക് മൊയിറ്റി മാസ് ഡിസ്ട്രിബ്യൂഷൻ മാപ്പുകൾ 8-15 ഡിപി ഉള്ള (Me)U സബ്സ്റ്റിറ്റ്യൂട്ട് ചെയ്ത പെന്റോസ് ഷുഗറുകളുടെ ഒരു ശ്രേണി കാണിക്കുന്നു, ഇവ ELISA-അധിഷ്ഠിത mAb സ്ക്രീനിംഗിൽ കാണപ്പെടുന്ന സബ്സ്റ്റിറ്റ്യൂട്ട് ചെയ്ത സൈലാനുകളുമായി പൊരുത്തപ്പെടുന്നു. എപ്പിറ്റോപ്പുകൾ സ്ഥിരതയുള്ളതാണ്.
ACS-ൽ ലയിക്കുന്ന നോൺ-കംപ്ലയിന്റ് ഒലിഗോസാക്കറൈഡുകളുടെ MALDI-MS സ്പെക്ട്രം. ഇവിടെ, (A) മെത്തിലേറ്റഡ് യൂറോണിക് ആസിഡ് (DP 4-8) അടങ്ങിയ ACN-A ലോ വെയ്റ്റ് റേഞ്ച് ഫ്രാക്ഷനുകൾ ഗ്ലൂക്കുറോക്‌സിലാൻ ഒലിഗോസാക്കറൈഡുകൾക്ക് പകരമായി ഉപയോഗിച്ചു, (B) ഗ്ലൂക്കുറോക്‌സിലാൻ (DP 8-15) ഉപയോഗിച്ച് എസിഎൻ-ബി സൈലാനും മെത്തിലേറ്റഡ് യൂറോണിക് ആസിഡ് ഒലിഗോസാക്കറൈഡുകളും ഉപയോഗിച്ചു.
റിഫ്രാക്ടറി ഒലിഗോസാക്കറൈഡുകളുടെ ഗ്ലൈക്കൻ അവശിഷ്ടത്തിന്റെ ഘടനയുടെ വിശകലനം. ഇവിടെ (എ) ജിസി-എംഎസ് വിശകലനം ഉപയോഗിച്ച് ലഭിച്ച വിവിധ ഒലിഗോസാക്കറൈഡ് ഭിന്നസംഖ്യകളുടെ ടിഎംഎസ് സാക്കറൈഡ് ഘടന. (ബി) ഒലിഗോസാക്കറൈഡുകളിൽ അടങ്ങിയിരിക്കുന്ന വിവിധ ടിഎംഎസ്-ഉത്ഭവിച്ച പഞ്ചസാരകളുടെ ഘടനകൾ. എസിഎൻ - ന്യൂട്രൽ ഒലിഗോസാക്കറൈഡുകൾ അടങ്ങിയ അസെറ്റോണിട്രൈൽ ഭിന്നസംഖ്യയും എഫ്എ - ആസിഡ് ഒലിഗോസാക്കറൈഡുകൾ അടങ്ങിയ ഫെറുലിക് ആസിഡ് ഭിന്നസംഖ്യയും.
ചിത്രം S9-ൽ കാണിച്ചിരിക്കുന്നതുപോലെ, ഒലിഗോസാക്കറൈഡ് ഭിന്നസംഖ്യയുടെ LC-MS വിശകലനത്തിൽ നിന്ന് മറ്റൊരു രസകരമായ നിഗമനത്തിലെത്തി (ഇലക്ട്രോണിക് സപ്ലിമെന്ററി മെറ്റീരിയലിൽ രീതികൾ കാണാം). ACN-B ഭിന്നസംഖ്യയുടെ ലിഗേഷൻ സമയത്ത് ഹെക്‌സോസിന്റെയും -OAc ഗ്രൂപ്പുകളുടെയും ശകലങ്ങൾ ആവർത്തിച്ച് നിരീക്ഷിക്കപ്പെട്ടു. ഈ കണ്ടെത്തൽ ഗ്ലൈക്കോമിലും MALDI-TOF വിശകലനത്തിലും നിരീക്ഷിച്ച വിഘടനത്തെ സ്ഥിരീകരിക്കുക മാത്രമല്ല, മുൻകൂട്ടി ചികിത്സിച്ച ലിഗ്നോസെല്ലുലോസിക് ബയോമാസിലെ സാധ്യതയുള്ള കാർബോഹൈഡ്രേറ്റ് ഡെറിവേറ്റീവുകളെക്കുറിച്ചുള്ള പുതിയ വിവരങ്ങളും നൽകുന്നു.
ടിഎംഎസ് പഞ്ചസാര ഡെറിവേറ്റൈസേഷൻ ഉപയോഗിച്ച് ഒലിഗോസാക്കറൈഡ് ഭിന്നസംഖ്യയുടെ പഞ്ചസാര ഘടനയും ഞങ്ങൾ വിശകലനം ചെയ്തു. ജിസി-എംഎസ് ഉപയോഗിച്ച്, ഒലിഗോസാക്കറൈഡ് ഭിന്നസംഖ്യയിലെ ന്യൂറൽ (നോൺ-ഡെറിവേറ്റീവ്) അസിഡിക് പഞ്ചസാരകളുടെയും (ഗ്ലൂഎ, ഗാൽഎ) അസിഡിക് പഞ്ചസാരകളുടെയും (ചിത്രം 5) ഘടന ഞങ്ങൾ നിർണ്ണയിച്ചു. ഗ്ലൂക്കുറോണിക് ആസിഡ് അസിഡിക് ഘടകങ്ങൾ സി, ഡി എന്നിവയിൽ കാണപ്പെടുന്നു, അതേസമയം ഗാലക്ചുറോണിക് ആസിഡ് അസിഡിക് ഘടകങ്ങൾ എ, ബി എന്നിവയിൽ കാണപ്പെടുന്നു, ഇവ രണ്ടും അസിഡിക് പഞ്ചസാരകളുടെ ഉയർന്ന ഡിപി ഘടകങ്ങളാണ്. ഈ ഫലങ്ങൾ ഞങ്ങളുടെ ELISA, MALDI ഡാറ്റ സ്ഥിരീകരിക്കുക മാത്രമല്ല, ഒലിഗോസാക്കറൈഡ് ശേഖരണത്തെക്കുറിച്ചുള്ള ഞങ്ങളുടെ മുൻ പഠനങ്ങളുമായി പൊരുത്തപ്പെടുന്നു. അതിനാൽ, വിവിധ ജൈവ സാമ്പിളുകളിൽ ലയിക്കുന്ന റീകാൽസിട്രന്റ് ഒലിഗോസാക്കറൈഡുകൾ കണ്ടെത്തുന്നതിന് ഒലിഗോസാക്കറൈഡുകളുടെ ബയോട്ടിനൈലേഷനും തുടർന്നുള്ള ELISA സ്ക്രീനിംഗും ഉപയോഗിച്ചുള്ള ആധുനിക രോഗപ്രതിരോധ രീതികൾ പര്യാപ്തമാണെന്ന് ഞങ്ങൾ വിശ്വസിക്കുന്നു.
ELISA-അധിഷ്ഠിത mAb സ്ക്രീനിംഗ് രീതികൾ നിരവധി വ്യത്യസ്ത രീതികളിലൂടെ സാധൂകരിക്കപ്പെട്ടതിനാൽ, ഈ പുതിയ ക്വാണ്ടിറ്റേറ്റീവ് രീതിയുടെ സാധ്യതകൾ കൂടുതൽ പര്യവേക്ഷണം ചെയ്യാൻ ഞങ്ങൾ ആഗ്രഹിച്ചു. സെൽ വാൾ ഗ്ലൈക്കനെ ലക്ഷ്യം വച്ചുള്ള ഒരു പുതിയ mAb സമീപനം ഉപയോഗിച്ച് രണ്ട് വാണിജ്യ ഒലിഗോസാക്കറൈഡുകൾ, സൈലോഹെക്സാസാക്കറൈഡ് ഒലിഗോസാക്കറൈഡ് (XHE), 23-α-L-അരബിനോഫുറാനോസിൽ-സൈലോട്രിയോസ് (A2XX) എന്നിവ വാങ്ങി പരീക്ഷിച്ചു. ബയോട്ടിനൈലേറ്റഡ് ബൈൻഡിംഗ് സിഗ്നലും ഒലിഗോസാക്കറൈഡ് സാന്ദ്രതയുടെ ലോഗ് സാന്ദ്രതയും തമ്മിലുള്ള ഒരു രേഖീയ പരസ്പരബന്ധം ചിത്രം 6 കാണിക്കുന്നു, ഇത് സാധ്യമായ ഒരു ലാങ്മുയർ അഡോർപ്ഷൻ മോഡലിനെ സൂചിപ്പിക്കുന്നു. mAbs-ൽ, CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148, CCRC-M151 എന്നിവ XHE-യുമായി പരസ്പരബന്ധിതമാണ്, കൂടാതെ CCRC-M108, CCRC-M109, LM11 എന്നിവ 1 nm മുതൽ 100 ​​നാനോ വരെ പരിധിയിൽ A2XX-മായി പരസ്പരബന്ധിതമാണ്. പരീക്ഷണ സമയത്ത് ആന്റിബോഡികളുടെ പരിമിതമായ ലഭ്യത കാരണം, ഓരോ ഒലിഗോസാക്കറൈഡ് സാന്ദ്രതയിലും പരിമിതമായ പരീക്ഷണങ്ങൾ നടത്തി. ചില ആന്റിബോഡികൾ ഒരു സബ്‌സ്‌ട്രേറ്റിന്റെ അതേ ഒലിഗോസാക്കറൈഡിനോട് വളരെ വ്യത്യസ്തമായി പ്രതികരിക്കുന്നു എന്നത് ഇവിടെ ശ്രദ്ധിക്കേണ്ടതാണ്, കാരണം അവ അല്പം വ്യത്യസ്തമായ എപ്പിറ്റോപ്പുകളുമായി ബന്ധിപ്പിക്കുകയും വളരെ വ്യത്യസ്തമായ ബൈൻഡിംഗ് അഫിനിറ്റികൾ ഉണ്ടായിരിക്കുകയും ചെയ്യും. പുതിയ mAb സമീപനം യഥാർത്ഥ സാമ്പിളുകളിൽ പ്രയോഗിക്കുമ്പോൾ കൃത്യമായ എപ്പിറ്റോപ്പ് തിരിച്ചറിയലിന്റെ സംവിധാനങ്ങളും പ്രത്യാഘാതങ്ങളും കൂടുതൽ സങ്കീർണ്ണമാകും.
വിവിധ ഗ്ലൈക്കൻ-ടാർഗെറ്റിംഗ് mAbs-ന്റെ കണ്ടെത്തൽ ശ്രേണി നിർണ്ണയിക്കാൻ രണ്ട് വാണിജ്യ ഒലിഗോസാക്കറൈഡുകൾ ഉപയോഗിച്ചു. ഇവിടെ, ഒലിഗോസാക്കറൈഡ് സാന്ദ്രതയുടെ ലോഗ് സാന്ദ്രതയുമായുള്ള രേഖീയ പരസ്പരബന്ധം (A) XHE-യുടെ mAb-യും (B) A2XX-ഉം mAb-യുമായുള്ള ലാങ്മുയർ അഡ്സോർപ്ഷൻ പാറ്റേണുകളെ സൂചിപ്പിക്കുന്നു. അനുബന്ധ എപ്പിറ്റോപ്പുകൾ പരിശോധനയിൽ സബ്‌സ്‌ട്രേറ്റുകളായി ഉപയോഗിക്കുന്ന വാണിജ്യ ഒലിഗോസാക്കറൈഡുകളുടെ ഘടനകളെ സൂചിപ്പിക്കുന്നു.
ഗ്ലൈക്കൻ-ലക്ഷ്യമിടുന്ന മോണോക്ലോണൽ ആന്റിബോഡികളുടെ ഉപയോഗം (ഗ്ലൈക്കോകോമിക് വിശകലനം അല്ലെങ്കിൽ ELISA-അധിഷ്ഠിത mAb സ്ക്രീനിംഗ്) സസ്യ ബയോമാസ് നിർമ്മിക്കുന്ന മിക്ക പ്രധാന സെൽ വാൾ ഗ്ലൈക്കാനുകളുടെയും ആഴത്തിലുള്ള സ്വഭാവരൂപീകരണത്തിനുള്ള ശക്തമായ ഒരു ഉപകരണമാണ്. എന്നിരുന്നാലും, ക്ലാസിക്കൽ ഗ്ലൈക്കൻ വിശകലനം വലിയ സെൽ വാൾ ഗ്ലൈക്കാനുകളെ മാത്രമേ ചിത്രീകരിക്കുന്നുള്ളൂ, കാരണം മിക്ക ഒലിഗോസാക്കറൈഡുകളും ELISA പ്ലേറ്റുകളിൽ കാര്യക്ഷമമായി നിശ്ചലമാക്കപ്പെടുന്നില്ല. ഈ പഠനത്തിൽ, AFEX-പ്രീട്രീറ്റ് ചെയ്ത കോൺ സ്റ്റൗവർ ഉയർന്ന ഖരവസ്തുക്കളുടെ ഉള്ളടക്കത്തിൽ എൻസൈമാറ്റിക് ആയി ഹൈഡ്രോലൈസ് ചെയ്തു. ഹൈഡ്രോലൈസേറ്റിലെ റീകാൽസിട്രന്റ് സെൽ വാൾ കാർബോഹൈഡ്രേറ്റുകളുടെ ഘടന നിർണ്ണയിക്കാൻ പഞ്ചസാര വിശകലനം ഉപയോഗിച്ചു. എന്നിരുന്നാലും, ഹൈഡ്രോലൈസേറ്റുകളിലെ ചെറിയ ഒലിഗോസാക്കറൈഡുകളുടെ mAb വിശകലനം കുറച്ചുകാണുന്നു, കൂടാതെ ELISA പ്ലേറ്റുകളിൽ ഒലിഗോസാക്കറൈഡുകൾ ഫലപ്രദമായി നിശ്ചലമാക്കുന്നതിന് അധിക ഉപകരണങ്ങൾ ആവശ്യമാണ്.
ന്യൂട്രാഅവിഡിൻ™ പൂശിയ പ്ലേറ്റുകളിൽ ഒലിഗോസാക്കറൈഡ് ബയോട്ടിനൈലേഷനും തുടർന്ന് ELISA സ്ക്രീനിംഗും സംയോജിപ്പിച്ച് mAb സ്ക്രീനിംഗിനായി ഒരു നൂതനവും കാര്യക്ഷമവുമായ ഒലിഗോസാക്കറൈഡ് ഇമ്മൊബിലൈസേഷൻ രീതി ഞങ്ങൾ ഇവിടെ റിപ്പോർട്ട് ചെയ്യുന്നു. ഇമ്മൊബിലൈസ് ചെയ്ത ബയോട്ടിനൈലേറ്റഡ് ഒലിഗോസാക്കറൈഡുകൾ റീകാൽസിട്രന്റ് ഒലിഗോസാക്കറൈഡുകളുടെ വേഗത്തിലും കാര്യക്ഷമമായും കണ്ടെത്തൽ പ്രാപ്തമാക്കുന്നതിന് ആന്റിബോഡിയോട് മതിയായ അടുപ്പം കാണിച്ചു. മാസ് സ്പെക്ട്രോമെട്രിയെ അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള ഈ മുരടിച്ച ഒലിഗോസാക്കറൈഡുകളുടെ ഘടനയുടെ വിശകലനം ഇമ്മ്യൂണോസ്ക്രീനിംഗിലേക്കുള്ള ഈ പുതിയ സമീപനത്തിന്റെ ഫലങ്ങൾ സ്ഥിരീകരിച്ചു. അതിനാൽ, ഗ്ലൈക്കൻ-ടാർഗെറ്റഡ് മോണോക്ലോണൽ ആന്റിബോഡികളുമായി ഒലിഗോസാക്കറൈഡ് ബയോട്ടിനൈലേഷനും ELISA സ്ക്രീനിംഗും സംയോജിപ്പിക്കുന്നത് ഒലിഗോസാക്കറൈഡുകളിലെ ക്രോസ്ലിങ്കുകൾ കണ്ടെത്തുന്നതിന് ഉപയോഗിക്കാമെന്നും ഒലിഗോസാക്കറൈഡുകളുടെ ഘടനയെ ചിത്രീകരിക്കുന്ന മറ്റ് ബയോകെമിക്കൽ പഠനങ്ങളിൽ വ്യാപകമായി പ്രയോഗിക്കാമെന്നും ഈ പഠനങ്ങൾ തെളിയിക്കുന്നു.
സസ്യ ബയോമാസിലെ ലയിക്കുന്ന ഒലിഗോസാക്കറൈഡുകളുടെ റീകാൽസിട്രന്റ് കാർബോഹൈഡ്രേറ്റ് ബോണ്ടുകൾ അന്വേഷിക്കാൻ കഴിവുള്ള ആദ്യത്തെ റിപ്പോർട്ടാണ് ബയോട്ടിൻ അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള ഈ ഗ്ലൈക്കൻ പ്രൊഫൈലിംഗ് രീതി. ബയോഫാസിന്റെ ചില ഭാഗങ്ങൾ ജൈവ ഇന്ധന ഉൽപാദനത്തിന്റെ കാര്യത്തിൽ ഇത്രയധികം പിടിവാശി കാണിക്കുന്നത് എന്തുകൊണ്ടാണെന്ന് മനസ്സിലാക്കാൻ ഇത് സഹായിക്കുന്നു. ഗ്ലൈക്കോം വിശകലന രീതികളിലെ ഒരു പ്രധാന വിടവ് ഈ രീതി നികത്തുകയും സസ്യ ഒലിഗോസാക്കറൈഡുകൾക്കപ്പുറം വിശാലമായ സബ്‌സ്‌ട്രേറ്റുകളിലേക്ക് അതിന്റെ പ്രയോഗം വ്യാപിപ്പിക്കുകയും ചെയ്യുന്നു. ഭാവിയിൽ, ബയോടൈനൈലേഷനായി നമുക്ക് റോബോട്ടിക്സ് ഉപയോഗിക്കാം, കൂടാതെ ELISA ഉപയോഗിച്ച് സാമ്പിളുകളുടെ ഉയർന്ന-ത്രൂപുട്ട് വിശകലനത്തിനായി ഞങ്ങൾ വികസിപ്പിച്ചെടുത്ത രീതി ഉപയോഗിക്കാം.
പയനിയർ 33A14 ഹൈബ്രിഡ് വിത്തുകളിൽ നിന്ന് വളർത്തിയ കോൺ സ്ട്രോ (CS) 2010 ൽ കൊളറാഡോയിലെ റേയിലുള്ള ക്രാമർ ഫാമുകളിൽ നിന്ന് വിളവെടുത്തു. ഭൂവുടമയുടെ അനുമതിയോടെ, ഈ ബയോമാസ് ഗവേഷണത്തിനായി ഉപയോഗിക്കാം. ഈർപ്പത്തിൽ 6% ത്തിൽ താഴെ ഉണങ്ങിയ നിലയിലാണ് സാമ്പിളുകൾ സിപ്പ്-ലോക്ക് ബാഗുകളിൽ മുറിയിലെ താപനിലയിൽ സൂക്ഷിച്ചത്. ഈർപ്പത്തിൽ 6% ത്തിൽ താഴെ ഉണങ്ങിയ നിലയിലാണ് സാമ്പിളുകൾ സിപ്പ്-ലോക്ക് ബാഗുകളിൽ മുറിയിലെ താപനിലയിൽ സൂക്ഷിച്ചത്. പ്രസ്തുത ലേഖനം സാമ്പിളുകൾ മുറിയിലെ താപനിലയിൽ സിപ്പർ ബാഗുകളിൽ <6% ഈർപ്പം വരണ്ട നിലയിൽ സൂക്ഷിച്ചു.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6% ഒബ്രജ്യ്ത് ഹ്രന്യത് വ് പകെതഹ് സൊസ്തെജ്കൊയ്-മോൾനിയെ പ്രൈ കോംനറ്റ്നോയ് ടെംപെരതുരെ സെ വ്ലജ്നൊസ്ത്യു < 6%. 6% ത്തിൽ താഴെ ഈർപ്പം ഉള്ള മുറിയിലെ താപനിലയിൽ സിപ്പർ ബാഗുകളിലാണ് സാമ്പിളുകൾ സൂക്ഷിക്കുന്നത്.പ്രാദേശിക, ദേശീയ മാർഗ്ഗനിർദ്ദേശങ്ങൾ പാലിച്ചാണ് പഠനം നടത്തിയത്. NREL പ്രോട്ടോക്കോൾ ഉപയോഗിച്ചാണ് കോമ്പോസിഷണൽ വിശകലനം നടത്തിയത്. കോമ്പോസിഷനിൽ 31.4% ഗ്ലൂക്കൻ, 18.7% സൈലാൻ, 3.3% അറബിനാൻ, 1.2% ഗാലക്ടൻ, 2.2% അസറ്റൈൽ, 14.3% ലിഗ്നിൻ, 1.7% പ്രോട്ടീൻ, 13. 4% ചാരം എന്നിവ അടങ്ങിയിരിക്കുന്നതായി കണ്ടെത്തി.
സെല്ലിക്® CTec2 (138 mg പ്രോട്ടീൻ/ml, ലോട്ട് VCNI 0001) നോവോസൈമുകളിൽ നിന്നുള്ള (ഫ്രാങ്ക്ലിന്റൺ, NC, USA) സെല്ലുലേസ്, β-ഗ്ലൂക്കോസിഡേസ്, സെല്ലിക്® HTec2 (157 mg പ്രോട്ടീൻ/ml, ലോട്ട് VHN00001) എന്നിവയുടെ സങ്കീർണ്ണ മിശ്രിതമാണ്. പെക്റ്റിൻ ഡീഗ്രേഡിംഗ് എൻസൈമുകളുടെ സങ്കീർണ്ണ മിശ്രിതമായ മൾട്ടിഫെക്റ്റ് പെക്റ്റിനേസ്® (72 mg പ്രോട്ടീൻ/mL), ഡ്യൂപോണ്ട് ഇൻഡസ്ട്രിയൽ ബയോസയൻസസ് (പാലോ ആൾട്ടോ, CA, USA) സംഭാവന ചെയ്തു. കെൽഡാൽ നൈട്രജൻ വിശകലനം ഉപയോഗിച്ച് പ്രോട്ടീൻ ഉള്ളടക്കം കണക്കാക്കി (പ്രോട്ടീൻ ഇതര നൈട്രജന്റെ സംഭാവന കുറയ്ക്കുന്നതിലൂടെ) എൻസൈം പ്രോട്ടീൻ സാന്ദ്രത നിർണ്ണയിച്ചു (AOAC രീതി 2001.11, ഡയറി വൺ കോപ്പറേറ്റീവ് ഇൻ‌കോർപ്പറേറ്റഡ് ഇൻ‌കോർപ്പറേറ്റഡ്, ഇത്താക്ക, NY, USA). ഡയറ്റോമേഷ്യസ് എർത്ത് 545 EMD മില്ലിപോറിൽ (ബില്ലെറിക്ക, MA) നിന്ന് വാങ്ങി. ആക്റ്റിവേറ്റഡ് കാർബൺ (DARCO, 100 മെഷ് ഗ്രാന്യൂളുകൾ), അവിസെൽ (PH-101), ബീച്ച് സൈലാൻ, മറ്റ് എല്ലാ രാസവസ്തുക്കളും സിഗ്മ-ആൽഡ്രിച്ചിൽ (സെന്റ് ലൂയിസ്, MO) നിന്ന് വാങ്ങി.
GLBRC (ബയോമാസ് കൺവേർഷൻ റിസർച്ച് ലബോറട്ടറി, MSU, ലാൻസിങ്, MI, USA) യിൽ AFEX പ്രീ-ട്രീറ്റ്മെന്റ് നടത്തി. 140°C യിൽ 15 മിനിറ്റ് നേരത്തേക്ക് പ്രീ-ട്രീറ്റ്മെന്റ് നടത്തി. സ്റ്റെയിൻലെസ് സ്റ്റീൽ ബെഞ്ച്‌ടോപ്പ് ബാച്ച് റിയാക്ടറിൽ (Parr Instruments Company) 60% (w/w) ലോഡിംഗ് ചെയ്യുമ്പോൾ അൺഹൈഡ്രസ് അമോണിയയും ബയോമാസും 1:1 അനുപാതത്തിൽ 46 റെസിഡൻസ് സമയം. ഇതിന് 30 മിനിറ്റ് എടുത്തു. റിയാക്ടർ 140°C ലേക്ക് കൊണ്ടുവന്നു, അമോണിയ വേഗത്തിൽ പുറത്തുവന്നു, ഇത് ബയോമാസ് വേഗത്തിൽ മുറിയിലെ താപനിലയിലേക്ക് മടങ്ങാൻ അനുവദിച്ചു. AFEX പ്രീ-ട്രീറ്റ് ചെയ്ത കോൺ സ്റ്റൗവറിന്റെ (ACS) ഘടന ട്രീറ്റ് ചെയ്യാത്ത കോൺ സ്റ്റൗവറിന്റെ (UT-CS) ഘടനയ്ക്ക് സമാനമായിരുന്നു.
ഒലിഗോസാക്കറൈഡുകളുടെ വലിയ തോതിലുള്ള ഉൽപാദനത്തിനുള്ള ഒരു പ്രാരംഭ വസ്തുവായി ഉയർന്ന ഖരവസ്തുക്കളായ ACSH 25% (w/w) (ഏകദേശം 8% ഡെക്സ്ട്രാൻ ലോഡിംഗ്) തയ്യാറാക്കി. സെല്ലിക്® Ctec2 10 mg പ്രോട്ടീൻ/g ഗ്ലൂക്കൻ (പ്രീട്രീറ്റ് ചെയ്ത ബയോമാസിൽ), Htec2 (നോവോസൈമുകൾ, ഫ്രാങ്ക്ലിന്റൺ, NC), 5 mg പ്രോട്ടീൻ/g ഗ്ലൂക്കൻ, മൾട്ടിഫെക്റ്റ് പെക്റ്റിനേസ് (ജെനെൻകോർ ഇൻക്, യുഎസ്എ) എന്നിവ ഉൾപ്പെടുന്ന ഒരു വാണിജ്യ എൻസൈം മിശ്രിതം ഉപയോഗിച്ചാണ് ACS ന്റെ എൻസൈമാറ്റിക് ജലവിശ്ലേഷണം നടത്തിയത്. 3 ലിറ്റർ, pH 4.8, 50°C, 250 rpm എന്നിവയുടെ പ്രവർത്തന വോളിയമുള്ള 5 ലിറ്റർ ബയോറിയാക്ടറിൽ എൻസൈമാറ്റിക് ജലവിശ്ലേഷണം നടത്തി. 96 മണിക്കൂർ ജലവിശ്ലേഷണത്തിന് ശേഷം, 6000 rpm-ൽ 30 മിനിറ്റ് നേരത്തേക്ക് സെൻട്രിഫ്യൂഗേഷൻ വഴിയും പിന്നീട് 14000 rpm-ൽ 30 മിനിറ്റ് നേരത്തേക്ക് ജലവിശ്ലേഷണം ചെയ്യാത്ത ഖരപദാർത്ഥങ്ങൾ നീക്കം ചെയ്യുന്നതിനായി ഹൈഡ്രോലൈസേറ്റ് ശേഖരിച്ചു. പിന്നീട് ഹൈഡ്രോലൈസേറ്റ് 0.22 mm ഫിൽറ്റർ ബീക്കറിലൂടെ അണുവിമുക്തമാക്കപ്പെട്ടു. ഫിൽറ്റർ ചെയ്ത ഹൈഡ്രോലൈസേറ്റ് 4°C താപനിലയിൽ അണുവിമുക്തമാക്കപ്പെട്ട കുപ്പികളിൽ സൂക്ഷിച്ചു, തുടർന്ന് കാർബണിൽ ഭിന്നിപ്പിച്ചു.
NREL ലബോറട്ടറി വിശകലന നടപടിക്രമങ്ങൾ അനുസരിച്ച് സത്ത് അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള ബയോമാസ് സാമ്പിളുകളുടെ ഘടനയുടെ വിശകലനം: ഘടനാ വിശകലനത്തിനായി സാമ്പിളുകൾ തയ്യാറാക്കൽ (NREL/TP-510-42620), ബയോമാസിലെ ഘടനാപരമായ കാർബോഹൈഡ്രേറ്റുകളുടെയും ലിഗ്നിന്റെയും നിർണ്ണയം (NREL/TP-510 – 42618)47.
ഓട്ടോക്ലേവ് അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള ആസിഡ് ഹൈഡ്രോലിസിസ് രീതി ഉപയോഗിച്ച് 2 മില്ലി സ്കെയിലിൽ ഹൈഡ്രോലൈസേറ്റ് സ്ട്രീമിന്റെ ഒളിഗോസാക്കറൈഡ് വിശകലനം നടത്തി. 10 മില്ലി സ്ക്രൂ ക്യാപ്പ് കൾച്ചർ ട്യൂബിൽ 69.7 µl 72% സൾഫ്യൂറിക് ആസിഡുമായി ഹൈഡ്രോലൈസേറ്റ് സാമ്പിൾ കലർത്തി 121 °C താപനിലയിൽ ഒരു ബെഞ്ച്‌ടോപ്പിൽ 1 മണിക്കൂർ ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്യുക, ഐസിൽ തണുപ്പിച്ച് ഉയർന്ന പ്രകടനമുള്ള ലിക്വിഡ് ക്രോമാറ്റോഗ്രാഫി (HPLC) വിയലിലേക്ക് ഫിൽട്ടർ ചെയ്യുക. ആസിഡ്-ഹൈഡ്രോലൈസ് ചെയ്ത സാമ്പിളിലെ മൊത്തം പഞ്ചസാര സാന്ദ്രതയിൽ നിന്ന് നോൺ-ഹൈഡ്രോലൈസ് ചെയ്ത സാമ്പിളിലെ മോണോസാക്കറൈഡുകളുടെ സാന്ദ്രത കുറച്ചാണ് ഒലിഗോസാക്കറൈഡുകളുടെ സാന്ദ്രത നിർണ്ണയിച്ചത്.
ഒരു ബയോ-റാഡ് അമിനെക്സ് HPX-87H കോളത്തിൽ ഓട്ടോസാംപ്ലർ, കോളം ഹീറ്റർ, ഐസോക്രാറ്റിക് പമ്പ്, റിഫ്രാക്റ്റീവ് ഇൻഡക്സ് ഡിറ്റക്ടർ എന്നിവ സജ്ജീകരിച്ചിരിക്കുന്ന ഷിമാഡ്‌സു HPLC സിസ്റ്റം ഉപയോഗിച്ച് ആസിഡ് ഹൈഡ്രോലൈസ് ചെയ്ത ബയോമാസിലെ ഗ്ലൂക്കോസ്, സൈലോസ്, അരബിനോസ് എന്നിവയുടെ സാന്ദ്രത വിശകലനം ചെയ്തു. കോളം 50°C-ൽ നിലനിർത്തുകയും 0.6 ml/min 5 mM H2SO4 ജലപ്രവാഹത്തിൽ ഉപയോഗിച്ച് ലഘൂകരിക്കുകയും ചെയ്തു.
ഹൈഡ്രോലൈസേറ്റ് സൂപ്പർനേറ്റന്റ് നേർപ്പിച്ച് മോണോമറിന്റെയും ഒലിഗോസാക്കറൈഡിന്റെയും ഉള്ളടക്കത്തിനായി വിശകലനം ചെയ്തു. എൻസൈമാറ്റിക് ഹൈഡ്രോലിസിസിന് ശേഷം ലഭിച്ച മോണോമെറിക് പഞ്ചസാരകൾ, ബയോ-റാഡ് (ഹെർക്കുലീസ്, CA) അമിനെക്സ് HPX-87P കോളവും ഒരു ആഷ് ഗാർഡ് കോളവും ഘടിപ്പിച്ച HPLC വിശകലനം ചെയ്തു. കോളം താപനില 80°C-ൽ നിലനിർത്തി, 0.6 ml/min എന്ന ഫ്ലോ റേറ്റ് ഉപയോഗിച്ച് മൊബൈൽ ഘട്ടമായി വെള്ളം ഉപയോഗിച്ചു. റഫറൻസുകളിൽ വിവരിച്ചിരിക്കുന്ന രീതികൾ അനുസരിച്ച് 121°C-ൽ നേർപ്പിച്ച ആസിഡിൽ ജലവിശ്ലേഷണം നടത്തിയാണ് ഒളിഗോസാക്കറൈഡുകൾ നിർണ്ണയിച്ചത്. 41, 48, 49.
മുമ്പ് വിവരിച്ച നടപടിക്രമങ്ങൾ 27, 43, 50, 51 ഉപയോഗിച്ച് അസംസ്കൃത, AFEX പ്രീ-ട്രീറ്റ് ചെയ്തതും എല്ലാ നോൺ-ഹൈഡ്രോളിസ്ഡ് ബയോമാസ് അവശിഷ്ടങ്ങളിലും (സീരിയൽ സെൽ വാൾ എക്സ്ട്രാക്റ്റുകളുടെ ഉത്പാദനവും അവയുടെ mAb സ്ക്രീനിംഗും ഉൾപ്പെടെ) സാക്കറൈഡ് വിശകലനം നടത്തി. ഗ്ലൈക്കോം വിശകലനത്തിനായി, സസ്യ കോശ ഭിത്തിയിലെ ആൽക്കഹോൾ-ലയിക്കാത്ത അവശിഷ്ടങ്ങൾ ബയോമാസ് അവശിഷ്ടങ്ങളിൽ നിന്ന് തയ്യാറാക്കുകയും അമോണിയം ഓക്സലേറ്റ് (50 mM), സോഡിയം കാർബണേറ്റ് (50 mM, 0.5% w/v), CON (1M, 4M, രണ്ടും 1% w/v സോഡിയം ബോറോഹൈഡ്രൈഡ് ഉള്ളത്), മുമ്പ് വിവരിച്ചതുപോലെ ആസിഡ് ക്ലോറൈറ്റ് തുടങ്ങിയ വർദ്ധിച്ചുവരുന്ന ആക്രമണാത്മക റിയാക്ടറുകൾ ഉപയോഗിച്ച് സീരിയൽ എക്സ്ട്രാക്ഷന് വിധേയമാക്കുകയും ചെയ്യുന്നു. തുടർന്ന് എക്സ്ട്രാക്റ്റുകൾ സെൽ വാൾ ഗ്ലൈക്കാനിലേക്ക് നയിക്കുന്ന mAb50-കളുടെ സങ്കീർണ്ണമായ പാനലിനെതിരെ ELISA-യ്ക്ക് വിധേയമാക്കി, mAb ബൈൻഡിംഗ് പ്രതികരണങ്ങൾ ഒരു ഹീറ്റ് മാപ്പായി അവതരിപ്പിച്ചു. സസ്യ കോശ ഭിത്തി ഗ്ലൈക്കാനെ ലക്ഷ്യം വച്ചുള്ള mAbs ലബോറട്ടറി സ്റ്റോക്കുകളിൽ നിന്ന് (CCRC, JIM, MAC സീരീസ്) വാങ്ങി.
ഒലിഗോസാക്കറൈഡുകളുടെ ഒരു ഘട്ട ബയോട്ടിനൈലേഷൻ. ബയോട്ടിൻ-എൽസി-ഹൈഡ്രാസൈഡുമായി കാർബോഹൈഡ്രേറ്റുകളുടെ സംയോജനം ഇനിപ്പറയുന്ന നടപടിക്രമം ഉപയോഗിച്ച് നടത്തി. ബയോട്ടിൻ-എൽസി-ഹൈഡ്രാസൈഡ് (4.6 mg/12 μmol) ഡൈമെഥൈൽ സൾഫോക്സൈഡിൽ (DMSO, 70 μl) ലയിപ്പിച്ച് 65° C താപനിലയിൽ 1 മിനിറ്റ് നേരം ശക്തമായി ഇളക്കി ചൂടാക്കി. ഗ്ലേഷ്യൽ അസറ്റിക് ആസിഡ് (30 µl) ചേർത്ത് മിശ്രിതം സോഡിയം സയനോബോറോഹൈഡ്രൈഡിലേക്ക് (6.4 mg/100 µmol) ഒഴിച്ച് 65° C താപനിലയിൽ ഏകദേശം 1 മിനിറ്റ് ചൂടാക്കിയ ശേഷം പൂർണ്ണമായും ലയിപ്പിച്ചു. തുടർന്ന്, ഉണങ്ങിയ ഒലിഗോസാക്കറൈഡിൽ (1-100 nmol) 5 മുതൽ 8 μl വരെ പ്രതിപ്രവർത്തന മിശ്രിതം ചേർത്ത് ലേബലിന്റെ 10 മടങ്ങ് അല്ലെങ്കിൽ അതിൽ കൂടുതൽ മോളാർ അധികമായി കുറയ്ക്കുന്ന അറ്റത്ത് ലഭിക്കും. പ്രതിപ്രവർത്തനം 65°C താപനിലയിൽ 2 മണിക്കൂർ നടത്തി, അതിനുശേഷം സാമ്പിളുകൾ ഉടനടി ശുദ്ധീകരിച്ചു. ലേബലിംഗ് പരീക്ഷണങ്ങളിൽ റിഡക്ഷൻ ഇല്ലാതെ സോഡിയം സയനോബോറോഹൈഡ്രൈഡ് ഉപയോഗിച്ചിട്ടില്ല, കൂടാതെ സാമ്പിളുകൾ 65°C-ൽ 2.5 മണിക്കൂർ പ്രതിപ്രവർത്തിച്ചു.
ബയോട്ടിനൈലേറ്റഡ് ഒലിഗോസാക്കറൈഡുകളുടെ സാമ്പിളുകൾ ELISA പൂശുകയും കഴുകുകയും ചെയ്തു. അവിഡിൻ-പൊതിഞ്ഞ പ്ലേറ്റിന്റെ ഓരോ കിണറിലും 25 μl ബയോട്ടിനൈലേറ്റഡ് സാമ്പിളുകൾ (5 മില്ലി 0.1 M Tris ബഫർ ലായനിയിൽ (TBS) ലയിപ്പിച്ച ഓരോ സാന്ദ്രീകൃത സാമ്പിളിന്റെയും 100 μl) ചേർത്തു. 0.1 M TBS-ൽ 10 μg/ml സാന്ദ്രതയിൽ 50 μl ബയോട്ടിൻ ഉപയോഗിച്ച് നിയന്ത്രണ കിണറുകൾ പൂശിയിരുന്നു. ശൂന്യമായ അളവുകൾക്കായി ഒരു കോട്ടിംഗായി ഡീയോണൈസ് ചെയ്ത വെള്ളം ഉപയോഗിച്ചു. ടാബ്‌ലെറ്റ് ഇരുട്ടിൽ മുറിയിലെ താപനിലയിൽ 2 മണിക്കൂർ ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്തു. ഗ്രെനിയർ ഫ്ലാറ്റ് 3A-യ്‌ക്കുള്ള പ്രോഗ്രാം നമ്പർ 11 ഉപയോഗിച്ച് 0.1 M TBS-ൽ 0.1% സ്കിംഡ് പാൽ ഉപയോഗിച്ച് പ്ലേറ്റ് 3 തവണ കഴുകുക.
പ്രാഥമിക ആന്റിബോഡികൾ ചേർക്കുകയും കഴുകുകയും ചെയ്യുക. ഓരോ കിണറിലും 40 µl പ്രാഥമിക ആന്റിബോഡി ചേർക്കുക. ഇരുണ്ട സ്ഥലത്ത് മുറിയിലെ താപനിലയിൽ 1 മണിക്കൂർ മൈക്രോപ്ലേറ്റ് ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്യുക. ഗ്രെനിയർ ഫ്ലാറ്റ് 3A-യ്‌ക്കുള്ള വാഷ് പ്രോഗ്രാം #11 ഉപയോഗിച്ച് 0.1M TBS-ൽ 0.1% പാൽ ഉപയോഗിച്ച് പ്ലേറ്റുകൾ 3 തവണ കഴുകി.
സെക്കൻഡറി ആന്റിബോഡി ചേർത്ത് കഴുകുക. ഓരോ കിണറിലും 50 µl എലി/എലി സെക്കൻഡറി ആന്റിബോഡി (0.1 M TBS-ൽ 0.1% പാലിൽ 1:5000 നേർപ്പിച്ചത്) ചേർക്കുക. ഇരുട്ടിൽ മുറിയിലെ താപനിലയിൽ 1 മണിക്കൂർ മൈക്രോപ്ലേറ്റ് ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്യുക. തുടർന്ന് ഗ്രെനിയർ ഫ്ലാറ്റ് 5A പ്ലേറ്റ് വാഷ് പ്രോഗ്രാം #12 ഉപയോഗിച്ച് 0.1 M TBS-ൽ 0.1% പാൽ ഉപയോഗിച്ച് മൈക്രോപ്ലേറ്റുകൾ 5 തവണ കഴുകി.
ഒരു സബ്‌സ്‌ട്രേറ്റ് ചേർക്കുന്നു. 3,3′,5,5′-ടെട്രാമെഥൈൽബെൻസിഡിൻ (TMB) യുടെ 50 µl ബേസ് സബ്‌സ്‌ട്രേറ്റിലേക്ക് ചേർക്കുക (15 മില്ലി ഡീയോണൈസ് ചെയ്ത വെള്ളത്തിൽ 2 തുള്ളി ബഫർ, 3 തുള്ളി TMB, 2 തുള്ളി ഹൈഡ്രജൻ പെറോക്‌സൈഡ് എന്നിവ ചേർത്ത്). TMB സബ്‌സ്‌ട്രേറ്റ് തയ്യാറാക്കുക. ഉപയോഗിക്കുന്നതിന് മുമ്പ് വോർട്ടെക്സ് ചെയ്യുക). മൈക്രോപ്ലേറ്റ് മുറിയിലെ താപനിലയിൽ 30 മിനിറ്റ് ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്യുക. ഇരുട്ടിൽ.
ഘട്ടം പൂർത്തിയാക്കി ടാബ്‌ലെറ്റ് വായിക്കുക. ഓരോ കിണറിലും 50 µl 1 N സൾഫ്യൂറിക് ആസിഡ് ചേർത്ത് ഒരു ELISA റീഡർ ഉപയോഗിച്ച് 450 മുതൽ 655 nm വരെയുള്ള ആഗിരണം രേഖപ്പെടുത്തുക.
ഈ അനലൈറ്റുകളുടെ 1 mg/ml ലായനികൾ ഡീയോണൈസ് ചെയ്ത വെള്ളത്തിൽ തയ്യാറാക്കുക: അരബിനോസ്, റാംനോസ്, ഫ്യൂക്കോസ്, സൈലോസ്, ഗാലക്ചുറോണിക് ആസിഡ് (GalA), ഗ്ലൂക്കുറോണിക് ആസിഡ് (GlcA), മാനോസ്, ഗ്ലൂക്കോസ്, ഗാലക്ടോസ്, ലാക്ടോസ്, N-അസറ്റൈൽമാനോസാമൈൻ (manNAc), N-അസറ്റൈൽഗ്ലൂക്കോസാമൈൻ. (glcNAc), N-അസറ്റൈൽഗാലക്ടോസാമൈൻ (galNAc), ഇനോസിറ്റോൾ (ആന്തരിക മാനദണ്ഡം). പട്ടിക 1 ൽ കാണിച്ചിരിക്കുന്ന 1 mg/mL പഞ്ചസാര ലായനികൾ ചേർത്ത് രണ്ട് മാനദണ്ഡങ്ങൾ തയ്യാറാക്കി. എല്ലാ വെള്ളവും നീക്കം ചെയ്യുന്നതുവരെ (സാധാരണയായി ഏകദേശം 12-18 മണിക്കൂർ) സാമ്പിളുകൾ -80° C ൽ ഫ്രീസ് ചെയ്ത് ലയോഫിലൈസ് ചെയ്യുന്നു.
ഒരു അനലിറ്റിക്കൽ ബാലൻസിൽ സ്ക്രൂ ക്യാപ് ട്യൂബുകളിലേക്ക് 100–500 µg സാമ്പിൾ ചേർക്കുക. ചേർത്ത അളവ് രേഖപ്പെടുത്തുക. സാമ്പിൾ ഒരു പ്രത്യേക സാന്ദ്രതയിലുള്ള ലായകത്തിൽ ലയിപ്പിച്ച് ട്യൂബിലേക്ക് ഒരു ദ്രാവക അലിക്വോട്ട് ആയി ചേർക്കുന്നതാണ് നല്ലത്. ഓരോ സാമ്പിൾ ട്യൂബിനും ആന്തരിക മാനദണ്ഡമായി 1 mg/ml ഇനോസിറ്റോളിന്റെ 20 µl ഉപയോഗിക്കുക. സാമ്പിളിൽ ചേർത്ത ആന്തരിക മാനദണ്ഡത്തിന്റെ അളവ് സ്റ്റാൻഡേർഡ് ട്യൂബിലേക്ക് ചേർത്ത ആന്തരിക മാനദണ്ഡത്തിന്റെ അളവിന് തുല്യമായിരിക്കണം.
ഒരു സ്ക്രൂ ക്യാപ് വിയലിൽ 8 മില്ലി അൺഹൈഡ്രസ് മെഥനോൾ ചേർക്കുക. തുടർന്ന് 4 മില്ലി 3 N. മെഥനോളിക് HCl ലായനി അടച്ചു കുലുക്കുക. ഈ പ്രക്രിയയിൽ വെള്ളം ഉപയോഗിക്കുന്നില്ല.
ഒലിഗോസാക്കറൈഡ് സാമ്പിളുകളിലും സ്റ്റാൻഡേർഡ് TMS ട്യൂബുകളിലും 500 µl 1 M HCl മെഥനോൾ ലായനി ചേർക്കുക. സാമ്പിളുകൾ രാത്രി മുഴുവൻ (168 മണിക്കൂർ) 80°C താപനിലയിൽ ഒരു തെർമൽ ബ്ലോക്കിൽ ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്തു. മെഥനോളിസിസ് ഉൽപ്പന്നം ഒരു ഡ്രൈയിംഗ് മാനിഫോൾഡ് ഉപയോഗിച്ച് മുറിയിലെ താപനിലയിൽ ഉണക്കുക. 200 µl MeOH ചേർത്ത് വീണ്ടും ഉണക്കുക. ഈ പ്രക്രിയ രണ്ടുതവണ ആവർത്തിക്കുന്നു. സാമ്പിളിൽ 200 µl മെഥനോൾ, 100 µl പിരിഡിൻ, 100 µl അസറ്റിക് അൻഹൈഡ്രൈഡ് എന്നിവ ചേർത്ത് നന്നായി ഇളക്കുക. സാമ്പിളുകൾ മുറിയിലെ താപനിലയിൽ 30 മിനിറ്റ് ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്തു. തുടർന്ന് ഉണക്കി. 200 µl മെഥനോൾ ചേർത്ത് വീണ്ടും ഉണക്കുക.
200 µl ട്രൈ-സിൽ ചേർത്ത് 20 മിനിറ്റ് ചൂടാക്കിയ ട്യൂബ് 80°C-ൽ ചൂടാക്കുക, തുടർന്ന് മുറിയിലെ താപനിലയിലേക്ക് തണുപ്പിക്കുക. ഏകദേശം 50 µl വോളിയത്തിൽ സാമ്പിൾ ഉണക്കാൻ ഒരു ഡ്രൈയിംഗ് മാനിഫോൾഡ് ഉപയോഗിക്കുക. സാമ്പിളുകൾ പൂർണ്ണമായും ഉണങ്ങാൻ ഞങ്ങൾ അനുവദിച്ചില്ല എന്നത് ശ്രദ്ധിക്കേണ്ടതാണ്.
2 മില്ലി ഹെക്സെയ്ൻ ചേർത്ത് വോർട്ടെക്സിംഗ് വഴി നന്നായി ഇളക്കുക. 5-3/4 ഇഞ്ച് വ്യാസമുള്ള ഒരു പൈപ്പറ്റിന് മുകളിൽ ഗ്ലാസ് കമ്പിളി തിരുകിക്കൊണ്ട് പാസ്ചർ പൈപ്പറ്റുകളുടെ (5-8 മില്ലീമീറ്റർ) അഗ്രഭാഗങ്ങൾ ഒരു ഗ്ലാസ് കമ്പിളി കഷണം കൊണ്ട് നിറയ്ക്കുക. സാമ്പിളുകൾ 3000 ഗ്രാം താപനിലയിൽ 2 മിനിറ്റ് നേരത്തേക്ക് സെൻട്രിഫ്യൂജ് ചെയ്തു. ലയിക്കാത്ത ഏതെങ്കിലും അവശിഷ്ടങ്ങൾ അവക്ഷിപ്തമാക്കുന്നു. സാമ്പിൾ 100-150 µl വരെ ഉണക്കുക. 80 °C പ്രാരംഭ താപനിലയിലും 2.0 മിനിറ്റിന്റെ പ്രാരംഭ സമയത്തിലും ഏകദേശം 1 μl വോളിയം GC-MS-ലേക്ക് കുത്തിവച്ചു (പട്ടിക 2).