Nature.com сайтад зочилсонд баярлалаа. Таны ашиглаж буй хөтчийн хувилбар нь CSS-г хязгаарлагдмал дэмждэг. Хамгийн сайн ашиглахын тулд бид танд шинэчилсэн хөтөч ашиглахыг зөвлөж байна (эсвэл Internet Explorer дээр нийцтэй байдлын горимыг унтраах). Энэ хооронд үргэлжлүүлэн дэмжлэг үзүүлэхийн тулд бид сайтыг загвар болон JavaScript-гүй харуулах болно.
Хүний гэдэсний морфогенез нь 3D хучуур эдийн микроархитектур, орон зайн зохион байгуулалтын крипт-виллусын шинж чанарыг бий болгодог. Энэхүү өвөрмөц бүтэц нь суурь крипт дэх үүдэл эсийн үүрийг экзоген микробын эсрэгтөрөгч болон тэдгээрийн метаболитуудаас хамгаалж гэдэсний гомеостазыг хадгалахад шаардлагатай байдаг. Үүнээс гадна гэдэсний янз бүрийн салст бүрхүүлийн эпителийн эсүүд, салст бүрхэвчийг хамгаалдаг. гэдэсний салст бүрхүүлийн гадаргуу дээр саад тотгор учруулдаг. Иймээс 3D хучуур эдийн бүтцийг сэргээх нь in vitro гэдэсний загваруудыг бүтээхэд маш чухал юм. Чип дээрх органик дуураймал гэдэс нь гэдэсний хучуур эдэд аяндаа 3D морфогенезийг өдөөж, биофизикийн үйл ажиллагааг сайжруулж, сайжруулдаг. Микрофлюидик чип, мөн Transwell суулгагдсан эрлийз чип дээр гэдэсний дотор гэдэсний морфогенезийг хүчтэй өдөөх хуулбарлах протокол. Бид төхөөрөмж үйлдвэрлэх, Caco-2 эсвэл гэдэсний органоид хучуур эдийн эсийг уламжлалт тохиргоо, түүнчлэн бичил платформ, 3D платформ дээр өсгөвөрлөх дэлгэрэнгүй аргуудыг тайлбарласан. Морфогенез, тогтсон 3 хэмжээст хучуур эдийн шинж чанарыг дүрслэх олон аргыг ашиглан тодорхойлох. Энэхүү протокол нь үндсэн хажуугийн шингэний урсгалыг 5 өдрийн турш хянах замаар гэдэсний функциональ бичил архитектурыг нөхөн сэргээх боломжийг олгодог. Манай in vitro морфогенезийн арга нь физиологийн хувьд хамааралтай шилжилтийн ачаалал, механик хөдөлгөөнийг ашигладаг бөгөөд бид эсийн нарийн төвөгтэй хэлбэрийг бий болгох, бусад нарийн төвөгтэй механизм шаарддаггүй. Бидний санал болгож буй протокол нь биоанагаах ухааны судалгааны нийгэмлэгт өргөн нөлөө үзүүлж, биоанагаах ухаан, эмнэлзүйн болон эмийн хэрэглээнд зориулж in vitro гэдэсний 3D хучуур эдийн давхаргыг нөхөн сэргээх аргыг санал болгож байна.
Туршилтаар гэдэсний хучуур эдийн како-2 эсүүд нь чип дээрх 1,2,3,4,5 эсвэл хоёр давхаргат микрофлюидик төхөөрөмж6,7-д өсгөвөрлөсөн нь үндсэн механизмын талаар тодорхой ойлголтгүйгээр in vitro аяндаа 3D морфогенезид ордог болохыг харуулж байна. Саяхан хийсэн судалгаагаар бид баз-хөрчний сүвэгчидийн өсгөвөрлөгчийг устгасан болохыг олж мэдсэн. Энэ нь in vitro 3D хучуур эдийн морфогенезийг өдөөхөд шаардлагатай бөгөөд хангалттай бөгөөд үүнийг Caco-2 болон өвчтөнөөс гаралтай гэдэсний органоидууд нотолсон. Эпителийн эсийг баталгаажуулсан. Энэхүү судалгаагаар бид Wnt-ийн хүчтэй антагонист болох Диккопф-1 (DKK-1)-ийн эсийн үйлдвэрлэл, концентрацийн тархалтад онцгой анхаарал хандуулсан бөгөөд "Эрлийз чип" гэж нэрлэгддэг Трансвелл оруулга агуулсан бичил шингэний төхөөрөмж болон хувиргасан. Бид үүнийг харуулсан. Дарангуйлагч 1, үрчлээстэй холбоотой уураг 1, эсвэл Согги-1) нь чип дээрх гэдэс рүү ялгардаг нь морфогенезийг дарангуйлдаг эсвэл урьдчилан бүтэцлэгдсэн 3D хучуур эдийн давхаргыг тасалдуулж, өсгөвөрлөх явцад антагонист стресс нь гэдэсний морфогенезийг in vitro хариуцдаг болохыг харуулж байна. идэвхтэй угаах (жишээ нь, чип дээр гэдэс эсвэл эрлийз платформ) эсвэл тархах замаар суурь хажуугийн тасалгааны Wnt антагонистуудын түвшинг арилгах эсвэл хамгийн бага хэмжээнд байлгах явдал юм.
Энэ протоколд бид полидиметилсилоксан (PDMS)-д суурилсан сүвэрхэг мембран (алхам 6А, 7А, 8, В, полиэстер 69-ийн мембран) дээр гэдэсний хучуур эдийн эсийг өсгөвөрлөхийн тулд чип дээрх гэдэсний бичил төхөөрөмж болон Transwell-ийн оруулгатай эрлийз чип (алхам 1-5) үйлдвэрлэх дэлгэрэнгүй аргыг өгдөг. 7B, 8, 9) ба өдөөгдсөн 3D морфогенезийг in vitro (алхам 10). Бид мөн олон дүрслэлийн аргыг (11-24-р алхам) ашиглан эд эсийн өвөрмөц гистогенез ба удамшлаас хамааралтай эсийн ялгааг илтгэх эсийн болон молекулын шинж чанарыг тодорхойлсон. эсвэл гэдэсний органоидуудыг сүвэрхэг мембраны гадаргууг өөрчлөх, 2 хэмжээст нэг давхарга үүсгэх, гэдэсний биохимийн болон биомеханик бичил орчны нөхөн үржих зэрэг техникийн дэлгэрэнгүй мэдээлэл бүхий хоёр өсгөвөрийн форматаар. in vitro. 2 хэмжээст хучуур эдийн нэг давхаргаас 3 хэмжээст морфогенезийг өдөөхийн тулд бид хоёр хэмжээст хучуур эдийн нэг давхаргаас 3 хэмжээст морфогенезийг бий болгохын тулд бид морфоген болон хажуугийн өсгөвөрт хоёуланд нь морфоген болон хажуугийн өсгөвөрийг устгасан. өсгөвөрийн тасалгаа. Эцэст нь, бид морфогенээс хамааралтай хучуур эдийн өсөлт, уртын дагуух хост-микробиомын хамтын соёл, эмгэг төрүүлэгчийн халдвар, үрэвсэлт гэмтэл, эпителийн саад тотгорын үйл ажиллагаа, мөн пробиотик.амп-д суурилсан эпителийн саад тотгорыг загварчлахад ашиглаж болох нөхөн төлжих боломжтой 3D хучуур эдийн давхаргын хэрэглээний дүрслэлийг өгдөг.
Манай протокол нь суурь (гэдэсний салст бүрхүүлийн биологи, үүдэл эсийн биологи, хөгжлийн биологи) болон хэрэглээний судалгаа (жишээ нь, эмнэлзүйн өмнөх эмийн шинжилгээ, өвчний загварчлал, эдийн инженерчлэл, гастроэнтерологи) зэрэг өргөн хүрээний эрдэмтдэд ашигтай байж болох юм. epithelium in vitro, бид бидний техникийн стратегийг гэдэсний хөгжил, нөхөн төлжилт эсвэл гомеостазын үед эсийн дохиоллын динамикийг судалж буй үзэгчдэд түгээх боломжтой гэж бид төсөөлж байна. Үүнээс гадна манай протокол нь Норовирус 8, Амьсгалын замын цочмог хам шинж (Coronavirus-CoCV2triicidi) зэрэг янз бүрийн халдварт өвчний халдварыг илрүүлэхэд тустай. Salmonella Typhimurium 9 эсвэл Vibrio cholerae. Өвчний эмгэг судлал, эмгэг жамыг судлах нь бас ашигтай байдаг. Чип дээрх гэдэсний микрофизиологийн системийг ашиглах нь уртын дагуу хамтран өсгөвөрлөх 10, дараа нь ходоод гэдэсний замын (ГДС) 11 .Гэдэсний халдварт өвчин үүсгэгчтэй холбоотой гэмтэл, дархлааны хариу урвалыг үнэлэх боломжийг олгодог. Өвчтөний 3 хэмжээст гэдэсний хучуур эдийн давхаргыг ашиглан гэдэсний эпителийн давхаргыг бэлтгэх үед шархлаат колит, уутны үрэвсэл, цочромтгой гэдэсний хам шинжийг дуурайж болно, эдгээр өвчинд хавсарсан хатингаршил, крипт богиносох, салст бүрхэвчийн гэмтэл, эсхүл эсийн эсийн эсийн саад бэрхшээл зэрэг багтана. Органоидууд12,13. Өвчний орчны нарийн төвөгтэй байдлыг илүү сайн загварчлахын тулд уншигчид 3D гэдэсний хилэнц-крипт бичил архитектурыг агуулсан загварт өвчтөний захын цусны мононуклеар эсүүд (PBMCs) зэрэг өвчинд хамааралтай эсийн төрлийг нэмэх талаар бодож болно. эд эсийн өвөрмөц дархлааны эсүүд, 5.
3D хучуур эдийн бичил бүтцийг огтлолт хийхгүйгээр засч, дүрслэн харуулах боломжтой тул орон зайн транскриптомик болон өндөр нягтралтай эсвэл хэт нягтралтай дүрслэл дээр ажиллаж байгаа үзэгчид эпителийн үүрэн дээрх ген, уургийн орон зайн цаг хугацааны динамикийн зураглалыг сонирхож магадгүй юм. Технологийг сонирхож байна. Бичил биет болон дархлааны өдөөлтөд үзүүлэх хариу үйлдэл. Цаашилбал, янз бүрийн бичил биет, бичил биетний бүлгэмдэл, ялангуяа ялгадас-микробиотип-ыг хамтран өсгөвөрлөх замаар гэдэсний гомеостазыг зохицуулдаг уртын дагуух хост-микробиомын хөндлөн холбоо 10, 14-ийг гэдэсний 3 хэмжээст давхаргад тогтоож болно. Энэ арга нь салст бүрхүүлийн дархлаа судлал, гастроэнтерологи, хүний ​​микробиом, соёл судлал, эмнэлзүйн микробиологийн чиглэлээр суралцаж буй үзэгчдийн сонирхлыг татдаг. Хэрэв бидний in vitro морфогенезийн протоколыг өргөн цар хүрээтэй өсгөвөрлөх боломжтой бол лабораторид ургуулах боломжтой. 384 худгийн хавтангууд нь суурийн хажуугийн хэсгүүдийг тасралтгүй нөхөж байдаг тул уг протоколыг хүнсний үйлдвэрлэлд зориулсан эм, биоанагаах ухаан эсвэл өндөр хүчин чадалтай скрининг эсвэл баталгаажуулалтын платформ хөгжүүлж буй хүмүүст түгээх боломжтой. Зарчмын нотолгоо болгон бид саяхан олон талт өндөр нэвтрүүлэх чадвартай хавтангийн хэлбэрийг нэмэх боломжтойг харуулсан. Чип дээрх олон эрхтэн бүтээгдэхүүн худалдаанд гарсан16,17,18.Тиймээс манай in vitro морфогенезийн аргын баталгаажуулалтыг хурдасгаж, олон судалгааны лаборатори, аж үйлдвэр, засгийн газар, зохицуулах агентлагууд ашиглан эсийн дахин программчлалыг эмийн бодис, биотофогенезийн транскрипт болон биотослогийн түвшинд нэвтрүүлэх боломжтой. Гэдэсний морфогенезийн үйл явцын нөхөн үржих чадварыг үнэлэхийн тулд 3D гэдэсний орлуулагчийг эсвэл чип дээрх эрхтний захиалгат эсвэл арилжааны загварыг ашиглан нэр дэвшигчдийг үнэлэв.
Гэдэсний хучуур эдийн морфогенезийг судлахын тулд хүнтэй холбоотой цөөн тооны туршилтын загварыг ашигласан бөгөөд энэ нь голчлон in vitro 3D морфогенезийг өдөөх боломжтой протокол байхгүйгээс шалтгаалж байна. Үнэн хэрэгтээ гэдэсний морфогенезийн талаарх одоогийн мэдлэгийн ихэнх нь амьтны судалгаанд (жишээ нь, тахиа, тахиа, 20, 20, тахиа) тулгуурласан байдаг. зардал их шаарддаг, ёс суртахууны хувьд эргэлзээтэй байж болох ба хамгийн чухал нь хүний ​​хөгжлийн үйл явцыг нарийн тодорхойлж чаддаггүй. Эдгээр загварууд нь мөн олон талт масштабаар турших чадвараараа маш хязгаарлагдмал байдаг. Иймээс in vitro 3D эдийн бүтцийг нөхөн сэргээх манай протокол нь in vivo амьтдын загвар, түүнчлэн өмнөх уламжлалт эсийн өсгөвөрлөх загвараас илүү сайн байдаг. 3D хучуур эдийн бүтэц нь янз бүрийн салст бүрхэвч эсвэл дархлааны өдөөлтөд хариу үйлдэл үзүүлэх крипт-виллусын тэнхлэгт ялгаатай эсүүдийн орон зайн байршлыг судлах боломжийг бидэнд олгосон. 3D хучуур эдийн давхаргууд нь бичил биетний эсүүд орон зайн орон зайг бий болгохын тулд хэрхэн өрсөлдөж байгааг судлах боломжийг олгодог ба хост хүчин зүйлс (жишээ нь: салст бүрхүүлийн дотоод давхарга, салст бүрхүүлийн эсрэг, салст бүрхэвч, биологийн эсрэг давхарга) -ийн хариуд экологийн хувьслыг судлах боломжийг олгодог. пептид).Цаашилбал, 3D хучуур эдийн морфологи нь гэдэсний бичил биетүүд өөрийн бүлгүүдийг хэрхэн бүтцэд оруулж, эсийн зохион байгуулалтыг бүрдүүлдэг бичил биетний метаболитуудыг (жишээ нь, богино гинжин өөхний хүчил) үүсгэж, суурь крипт дэх үүдэл эсийн үүрийг синергетик байдлаар үүсгэдэгийг ойлгох боломжийг бидэнд олгодог.
Гэдэсний хучуур эдийн 3D бүтцийг бий болгох манай аргаас гадна хэд хэдэн in vitro аргууд байдаг. Гэдэсний эрхтэний өсгөвөр нь гэдэсний үүдэл эсийг тодорхой морфогенийн нөхцөлд тариалахад суурилсан хамгийн орчин үеийн эдийн инженерчлэлийн арга юм23,24,25. Гэсэн хэдий ч, 3D organoid загваруудыг ашиглах нь ихэвчлэн кробикулын шинжилгээнд зориулагдсан байдаг. Учир нь гэдэсний люмен нь органоид дотор хаалттай байдаг тул бичил биетний эс эсвэл экзоген эсрэгтөрөгч гэх мэт гэрлийн бүрэлдэхүүн хэсгүүдийг нэвтрүүлэх нь хязгаарлагдмал байдаг. Органоид люмен руу нэвтрэх боломжийг микроинжектор ашиглан сайжруулж болно,26,27 гэхдээ энэ арга нь инвазив бөгөөд хөдөлмөр их шаарддаг бөгөөд гүйцэтгэхийн тулд тусгай мэдлэг шаарддаг.Цаашилбал, статик нөхцөлд гидрогелийн тавцанд хадгалсан уламжлалт органоид өсгөвөр нь идэвхтэй in vivo биомеханикийг үнэн зөв тусгадаггүй.
Хэд хэдэн судалгааны бүлгүүдийн ашигладаг бусад аргууд нь хүний ​​гэдэсний тусгаарлагдсан эсийг гель гадаргуу дээр өсгөвөрлөх замаар гэдэсний хучуур эдийн бүтцийг дуурайхын тулд урьдчилан бүтэцлэгдсэн 3D гидрогелийн бэхэлгээг ашигладаг. 3D хэвлэсэн, бичил тээрэмдсэн эсвэл литографийн аргаар үйлдвэрлэсэн хөгц ашиглан гидрогелийн шатыг үйлдвэрлэдэг. Энэ арга нь эпителиол эсүүдээр бие даасан бүтэцтэй болохыг харуулж байна. физиологийн хувьд хамааралтай морфогений градиент, өндөр харьцаатай хучуур эдийн бүтэц, строма-эпителийн хөндлөн огтлолцолыг барилгын тавцанд стромын эсийг оруулан тогтоодог. Гэсэн хэдий ч урьдчилан бүтэцлэгдсэн шатуудын шинж чанар нь өөрөө аяндаа морфогенетик процессыг харуулахаас сэргийлж чаддаг. Эдгээр загварууд нь мөн шингэний хоорондын урсгал, динамик стресс, шингэний дутагдлыг үүсгэдэггүй. Гэдэсний эсүүд морфогенезид орж, физиологийн функцийг олж авах шаардлагатай байдаг. Саяхны өөр нэг судалгаанд лазераар сийлбэрлэх арга техникийг ашиглан бичил шингэний платформ дахь гидрогелийн бэхэлгээ, хээтэй гэдэсний хучуур эдийн бүтцийг ашигласан. Хулганы гэдэсний органоидууд сийлсэн хэв маягийг дагаж гэдэсний гуурсан хоолойн бүтцийг бий болгож, доторх шингэнийг шингэний бичил шингэнээр дүүргэж болно. модуль.Гэвч энэ загвар нь аяндаа үүсдэг морфогенетик процессыг харуулдаггүй бөгөөд гэдэсний механик биологийн хөдөлгөөнийг агуулдаггүй. Нэг бүлгийн 3D хэвлэх техник нь аяндаа морфогенетик процесс бүхий жижиг гэдэсний гуурсуудыг бүтээх боломжтой байсан. Хэдийгээр гуурсан дотор гэдэсний янз бүрийн сегментүүдийг нарийн төвөгтэй аргаар үйлдвэрлэдэг ч энэ загвар нь шингэний урсгалын механик шинж чанаргүй, ажиллах чадваргүй байж болно. хязгаарлагдмал, ялангуяа био хэвлэх үйл явц дууссаны дараа туршилтын нөхцөл эсвэл эс хоорондын харилцан үйлчлэлд саад учруулдаг. Үүний оронд бидний санал болгож буй протокол нь гэдэсний аяндаа морфогенез, физиологийн хувьд хамааралтай шилжилтийн стресс, гэдэсний хөдөлгөөнийг дуурайдаг биомеханик, бие даасан оройн болон суурь хажуугийн тасалгааны хүртээмж, модулийн бичил цоорхой, модулийн бичил цоорхойг сэргээдэг. Манай in vitro 3D морфогенезийн протокол нь одоо байгаа аргуудын сорилтыг даван туулах нэмэлт хандлагыг хангаж чадна.
Манай протокол нь бүхэлдээ 3D хучуур эдийн морфогенезид чиглэгддэг бөгөөд зөвхөн өсгөвөрт нь зөвхөн хучуур эдийн эсүүд байх ба мезенхимийн эсүүд, эндотелийн эсүүд, дархлааны эсүүд гэх мэт бусад төрлийн эсүүд байдаггүй. Өмнө дурьдсанчлан, бидний протоколын гол цөм нь хажуугийн нялцгай биетийг дарангуйлах замаар эпителийн морфогенезийг өдөөх явдал юм. Чип дээрх гэдэс ба чип дээрх эрлийз хоёрын бат бөх модуль чанар нь долгионт 3D хучуур эдийн давхаргыг дахин бүтээх боломжийг олгодог бол эпители-мезенхимийн харилцан үйлчлэл33,34, эсийн гаднах матриц (ECM) хуримтлал 35, криптлогийн загвар зэрэг нэмэлт биологийн нарийн төвөгтэй байдлыг бий болгодог. Суурийн криптүүдийн хувьд цаашид авч үзэх шаардлагатай хэвээр байна. Мезенхим дэх стромын эсүүд (жишээ нь, фибробластууд) нь ECM уургийн үйлдвэрлэл, гэдэсний морфогенезийн зохицуулалтад гол үүрэг гүйцэтгэдэг35,37,38. Манай загварт мезенхимийн эсийг нэмсэн нь морфогенетик процесс болон эсийн хавсралтын давхаргын үр нөлөөг сайжруулсан. гэдэсний бичил орчинд молекулын тээвэрлэлт39 болон дархлааны эсийн элсэлтийг40 зохицуулахад чухал үүрэг гүйцэтгэдэг.Цаашилбал, эд эсийн загварууд нь олон эрхтний харилцан үйлчлэлийг харуулахад зориулагдсан байх үед эд эсийн загвар хооронд холбогдож болох судасжилтын бүрэлдэхүүн хэсгүүд нь урьдчилсан нөхцөл болдог.Тиймээс илүү нарийн эрхтний физиологийн онцлогтой эндотелийн эсүүдийг оруулах шаардлагатай байж магадгүй юм. resolution. Өвчтөний дархлааны эсүүд нь гэдэсний өвчнийг дуурайж байгаа нөхцөлд төрөлхийн дархлааны хариу урвал, эсрэгтөрөгчийн илрэл, төрөлхийн дасан зохицох дархлааны харилцан хамаарал, эд эсийн өвөрмөц дархлааг харуулахад зайлшгүй шаардлагатай.
Гибрид чипийг ашиглах нь чип дээрх гэдэстэй харьцуулахад илүү хялбар байдаг, учир нь төхөөрөмжийн тохиргоо нь илүү хялбар бөгөөд Transwell оруулга нь гэдэсний хучуур эдийг өргөжүүлэх боломжтой болгодог. Гэсэн хэдий ч худалдаанд гарсан полиэфир мембрантай Transwell оруулга нь уян хатан биш бөгөөд перисталтик шиг хөдөлгөөнийг дуурайж чадахгүй. Цаашилбал, Трансвеллийн оруулга нь гэдэсний хучуур эдийг өсгөвөрлөх боломжийг олгодог. Оройн хэсэгт огтлох ачаалалгүйгээр хөдөлгөөнгүй хэвээр байв. Оройн тасалгааны статик шинж чанар нь эрлийз чип дэх бактерийн урт хугацааны хамтын өсгөвөрлөх боломжийг ховорхон идэвхжүүлдэг нь ойлгомжтой. Бид эрлийз чипийг ашиглах үед Трансвелл оруулгад 3D морфогенезийг хүчтэйгээр өдөөж чаддаг ч шингэний хомсдол нь физиологийн болон биомеханик чанарыг хязгаарлаж болзошгүй. боломжит хэрэглээнд зориулсан гибрид чип платформууд.
Чип дээрх гэдэс ба эрлийз өсгөвөрт хүний ​​крипт-виллусын тэнхлэгийн бүрэн хэмжээний сэргээн босголт бүрэн тогтоогдоогүй байна. Морфогенез нь эпителийн нэг давхаргаас эхэлдэг тул 3D бичил архитектурууд нь бидний эсийн пропорциональ шинж чанартай морфологийн ижил төстэй байдлыг хангах албагүй. бичил инженерчлэгдсэн 3D хучуур эд дэх суурь криптийн домэйн, крипт болон хавсарсан хэсгүүд нь тодорхой заагаагүй байна. Хэдийгээр чип дээрх дээд сувгууд нь бичил инженерчилсэн хучуур эдийн өндрийг ихэсгэхэд хүргэдэг ч хамгийн дээд өндөр нь ~300–400 μм-ээр хязгаарлагддаг хэвээр байна. Хүний гэдэсний болон бүдүүн гэдэсний криптийн бодит гүн ~3μм байна. ба ~400 μм тус тус, нарийн гэдэсний ноосны өндөр ~600 μм41 байна.
Дүрслэлийн үүднээс авч үзвэл объектив линзээс эпителийн давхарга хүртэлх зай нь хэдэн миллиметрийн хэмжээтэй байдаг тул 3D бичил архитектурын in situ өндөр нарийвчлалтай дүрслэл нь чип дээрх гэдэс дотор хязгаарлагдаж болно. Энэ асуудлыг даван туулахын тулд алсын зайг ашиглах шаардлагатай байж болно. Цаашлаад нарийн зүсэлт хийхэд зориулж нарийн зүсэлт хийх бэлтгэлтэй байх шаардлагатай. PDMS.Цаашилбал, чип дээрх гэдэсний давхаргын микрофабрикац нь давхарга бүрийн хооронд байнгын наалдацтай байдаг тул эпителийн давхаргын гадаргуугийн бүтцийг шалгахын тулд дээд давхаргыг нээх эсвэл арилгах нь маш хэцүү байдаг. Жишээлбэл, сканнерийн электрон микроскоп (SEM) ашиглан.
PDMS-ийн гидрофобик чанар нь гидрофобик жижиг молекулуудтай холбоотой бичил шингэнд суурилсан судалгаанд хязгаарлагдмал хүчин зүйл болсон, учир нь PDMS нь ийм гидрофобик молекулуудыг өвөрмөц бусаар шингээж чаддаг. PDMS-ийн өөр хувилбаруудыг бусад полимер материалтай хамт авч үзэж болно. Эсвэл PDMS-ийн гадаргууг өөрчлөх (жишээ нь, полиэтилол эсвэл полиэтилийн материал (жишээ нь) гликол) 43 ) нь гидрофобик молекулуудын шингээлтийг багасгахад чиглэгдэж болно.
Эцэст нь хэлэхэд, бидний арга нь өндөр хүчин чадалтай скрининг буюу "нэг хэмжээст" хэрэглэгчдэд ээлтэй туршилтын платформоор хангагдсанаараа тийм ч сайн тодорхойлогдоогүй байна. Одоогийн протокол нь нэг микро төхөөрөмжид тариурын шахуургыг шаарддаг бөгөөд энэ нь CO2 инкубаторт зай эзэлдэг бөгөөд том хэмжээний туршилт хийхээс сэргийлдэг. Энэхүү хязгаарлалтыг шинэчилсэн соёл, 2, 4, 4, 4, 4, 4, 4, 4, 4, 4, 4, 4, 4, 3-р төрлийн өсгөвөрлөгчүүдийн форматаар сайжруулж болно. 96-худаг, эсвэл 384-худагтай сүвэрхэг оруулга нь суурь хажуугийн орчинг тасралтгүй дүүргэх, зайлуулах боломжийг олгодог).
Хүний гэдэсний хучуур эдийн 3D морфогенезийг in vitro болгохын тулд бид хоёр зэрэгцээ бичил суваг, хооронд нь уян харимхай сүвэрхэг мембран агуулсан микрофлюидик чип гэдэсний төхөөрөмжийг ашиглан люмен-капилляр интерфэйсийг үүсгэсэн. Мөн бид нэг сувгийн микрофлюидик төхөөрөмжийг (энэ нь тасралтгүй hyblarized polateral chipneath) ашигладаг болохыг харуулж байна. Трансвеллийн оруулга дээр ургасан хучуур эдийн давхаргууд. Хоёр платформд хүний ​​гэдэсний янз бүрийн хучуур эдийн эсийн морфогенезийг үндсэн хажуугийн тасалгаанаас морфоген антагонистуудыг зайлуулах урсгалын чиглэлтэй манипуляцийг ашиглан харуулж болно. Туршилтын бүх үйл явц (Зураг 1) нь таван хэсгээс бүрдэнэ: (i) Трансвеллийн бичил биетний бичил схемийн (1-5-р алхам; Шигтгээ 1), (ii) гэдэсний хучуур эдийн эсүүд (Како-2 эсүүд) эсвэл хүний ​​гэдэсний органоидуудыг бэлтгэх; хайрцаг 2-5), (iii) гэдэсний чипс эсвэл эрлийз чип дээр гэдэсний хучуур эдийн эсийн өсгөвөр (алхам 6-9), (iv) 3D морфогенезийн in vitro (алхам 10) ба (v) ) 3D хучуур эдийн бичил бүтцийг тодорхойлох (тохирсон 2-р бүлэг, 1-р бүлэгт хяналт). доор) нь эпителийн морфогенезийг орон зайн, цаг хугацааны, нөхцөлт эсвэл процедурын хяналттай харьцуулах замаар in vitro морфогенезийн үр нөлөөг батлах зорилготой юм.
Бид хоёр өөр соёлын платформ ашигласан: шулуун сувагтай эсвэл шугаман бус нугалсан суваг бүхий чип дээр гэдэс эсвэл 1-р хайрцганд тайлбарласны дагуу бичил шингэний төхөөрөмж доторх Transwell (TW) оруулга агуулсан эрлийз чип, 1-5-р алхам. "Төхөөрөмжийн үйлдвэрлэл" нь нэг чип эсвэл хүний ​​гибкулитал чип хийх үндсэн алхмуудыг харуулж байна. "Эс" хэсэгт энэ протоколд ашигласан эсийн эх үүсвэр (Како-2 эсвэл хүний ​​гэдэсний органоидууд) болон өсгөвөрлөх аргачлалыг тайлбарласан болно. "In vitro морфогенез" нь Како-2 буюу органоидоос гаралтай хучуур эдийн эсийг гэдэсний чип дээр эсвэл Трансвеллийн оруулга дээр өсгөвөрлөж, дараа нь эрлийз хэлбэрийн чипфоген үүсэх замаар өсгөвөрлөж буй ерөнхий үе шатуудыг харуулав. эпителийн бүтэц. Програмын алхамын дугаар эсвэл хайрцгийн дугаарыг сум бүрийн доор харуулав. Уг програм нь эсийн ялгах шинж чанар, гэдэсний физиологийн судалгаа, бичил биетний экосистемийг бий болгох, өвчний загварчлал зэрэгт гэдэсний эпителийн тогтсон давхаргыг хэрхэн ашиглаж болох жишээг өгдөг. "MUC2, nucleiacting" болон "DUC2iacter" дахь иммунофлуоресценцийн зураг Гэдэсний чип дээр үүссэн 3D Caco-2 хучуур эдийн давхаргад илэрхийлэгддэг.MUC2 дохио нь шилний эсүүд болон салст бүрхүүлийн гадаргуугаас ялгардаг салст байдаг. Гэдэсний физиологийн флюресцент зургууд нь флюресцент туяаны хоёр давхаргыг ашиглан сиалийн хүчил болон N-ацетилглюкозамин үлдэгдэлд будахад үүссэн салстыг харуулж байна. "Хүлээн авагч-микробын хамтын соёл" нь гэдэс доторх хост-микробиомын хамтын өсгөврийг чип дээр харуулдаг. Зүүн талын самбарт бичил инженерчлэгдсэн 3D Caco-2 хучуур эдийн эсүүдтэй ногоон флюресцент уураг (GFP) илэрхийлдэг E. coli-ийн хамтын өсгөвөрийг харуулж байна. Баруун талын самбарт GFP E. Caco-2 colied colicoli, coli3-тай GFP-ийн локалчлалыг харуулж байна. дараа нь F-актин (улаан) ба цөм (цэнхэр) -ээр иммунофлуоресценцээр будсан. Өвчний загварчлал нь бактерийн эсрэгтөрөгч (жишээ нь, липополисахарид, LPS) болон дархлааны эсүүд (жишээ нь, PBMC-3-ийн ногоон эсийг үүсгэсэн) физиологийн сорилтын дор гэдэсний үрэвслийн чипс дэх эрүүл болон гоожиж буй гэдэсний байдлыг харуулж байна. давхарга.Хамшгийн мөр, 50 μм. Доод эгнээнд байгаа зургууд: "Эсийн ялгарал" нь лавлагааны зөвшөөрлөөр тохируулсан.2. Оксфордын их сургуулийн хэвлэл; Ref.5-ын зөвшөөрлөөр хуулбарласан. NAS; "Хүлээн авагч-микробын хамтын соёл"-ыг лавлах 3-ын зөвшөөрлөөр тохируулсан. NAS; лавлагааны зөвшөөрлөөр тохируулсан “Өвчний загварчлал”.5. NAS.
Гэдэсний чип болон эрлийз чипс хоёулаа зөөлөн литографийн аргаар цахиур хэвнээс буулгаж, SU-8-аар хэвлэсэн PDMS хуулбарыг ашиглан үйлдвэрлэсэн. Чип тус бүрийн бичил сувгийн дизайныг зүсэлтийн ачаалал, гидродинамик даралт гэх мэт гидродинамикийг харгалзан тодорхойлно. Хоёр зэрэгцсэн зэрэгцээ шулуун бичил сувгаас бүрдэх ба чип дээр нарийн төвөгтэй гэдэс болж хувирсан (Өргөтгөсөн өгөгдлийн зураг. 1b) нь шингэний оршин суух хугацааг нэмэгдүүлэх, шугаман бус урсгалын хэв маяг, өсгөвөрлөсөн эсийн олон тэнхлэгт хэв гажилтыг өдөөх хос муруй микро сувгуудыг багтаасан (Зураг 212-ыг илүү их биоханиктай болгох шаардлагатай). дахин бүтээгдсэн, нарийн төвөгтэй гэдэс дээр чипийг сонгож болно. Гэдэсний чип нь ургасан эсийн төрлөөс үл хамааран 3 хэмжээст хэлбэрийн морфогенезийг ижил төстэй хугацаанд хүчтэй өдөөдөг болохыг харуулсан. сольж болно. SU-8 хэв маягаар цахиурын хэвэнд хатаасан PDMS хуулбарууд нь хэв буулгасны дараа сөрөг шинж чанартай болсон (Зураг 2a). Гэдэсийг чип дээр үйлдвэрлэхийн тулд бэлтгэсэн PDMS дээд давхаргыг сүвэрхэг PDMS хальсанд дараалан холбож, дараа нь эргэлт буцалтгүй даавуугаар эмчлэх замаар доод PDMS давхаргатай зэрэгцүүлэв. эрлийз чипс, хатаасан PDMS хуулбарыг шилэн слайдтай холбож, Transwell оруулгыг багтаах боломжтой нэг сувгийн микрофлюидик төхөөрөмжийг бий болгосон (Зураг 2h ба Өргөтгөсөн өгөгдлийн зураг. 2). Холбох процессыг PDMS хуулбарын гадаргууг боловсруулах, шилэнд хүчилтөрөгчийн плазмыг ариутгах эсвэл ариутгасан микроонафагаар бэхлэх замаар гүйцэтгэдэг. силикон хоолой, төхөөрөмжийн тохиргоо нь гэдэсний хучуур эдийн 3D морфогенезийг хийхэд бэлэн болсон (Зураг 2g).
a, SU-8 хээтэй цахиурын хөгцөөс PDMS хэсгүүдийг бэлтгэх бүдүүвч зураг. Хагараагүй PDMS уусмалыг цахиур хөгц (зүүн талд) дээр цутгаж, 60 ° C (дунд талд) ба хэвийг нь буулгаж (баруун талд) буулгасан. Цутгасан PDMS-ийг хэсэг болгон хувааж, цаашдын хэрэглээнд зориулж цэвэрлэв. PDMS-ийн сүвэрхэг мембраныг үйлдвэрлэхэд ашигладаг цахиур хөгц.d, PDMS-ийн дээд ба доод бүрэлдэхүүн хэсгүүд болон угсарсан чип дээрх гэдэсний төхөөрөмжийн цуврал зураг.e, Дээд, мембран, доод PDMS-ийн бүрэлдэхүүн хэсгүүдийн тэгшитгэлийн бүдүүвч. Давхарга бүрийг плазмаар эсвэл титэмтэй гонматик боловсруулалтаар эргэлт буцалтгүй холбодог. ууссан нугалсан бичил суваг ба вакуум камер.g, Микрофлюидик эсийн өсгөвөрлөх зориулалттай чип дээр гэдэсний суулгац. Силикон хоолой ба тариураар угсарсан чип дээрх үйлдвэрлэсэн гэдэсийг таглаа дээр байрлуулсан. Чип төхөөрөмжийг 150 мм-ийн тагны таган дээр байрлуулсан. Гибрид чипийг ашиглан эрлийз чип үйлдвэрлэх, 3 хэмжээст морфогенезийн агшин зуурын зургууд. Гэдэсний хучуур эдийн эсийн 2 хэмжээст нэг давхаргыг өсгөвөрлөхөд бие даан бэлтгэсэн трансвелл оруулга нь гэдэсний 3 хэмжээст морфогенезийг өдөөхийн тулд эрлийз чипэнд оруулав. Тэвчээр нь бичил сувгийн давхаргад нэвчсэн байна. бар, 1 см.ц Лавлагааны зөвшөөрөлтэйгээр дахин хэвлэв.4. Elsevier.
Энэ протоколд Како-2 эсийн шугам ба гэдэсний органоидуудыг хучуур эдийн эх үүсвэр болгон ашигласан (Зураг 3a). Хоёр төрлийн эсийг бие даан өсгөвөрлөсөн (Шигтгээ 2 ба Хайрцаг 5) ба чип дээрх гэдэсний ECM-ээр бүрсэн бичил суваг эсвэл Трансвеллийн оруулгыг үржүүлэхэд ашигласан. Эсүүд хоорондоо нийлсэн үед (95%) Т колбонд агуулагдах како-2 эсийг (10-аас 50-р хэсгүүдийн хооронд) трипсинизацийн шингэнээр (хайрцаг 2) ялгаж салсан эсийн суспензийг бэлтгэхийн тулд хураан авдаг. Гэдэсний биопси эсвэл мэс заслын тайралтаас авсан хүний ​​гэдэсний органоидуудыг 24 цооногтой микрострууралын хавтанг дэмжихийн тулд Матригелийн тавцангийн бөмбөгөрт өсгөвөрлөнө. Морфоген (Wnt, R-spondin, Noggin гэх мэт) болон 3-р хайрцагт тайлбарласны дагуу бэлтгэсэн өсөлтийн хүчин зүйлсийг органоидууд ~500 мкм диаметртэй болтол өдөр бүр нэмэгдүүлсэн. Бүрэн ургасан органоидуудыг цуглуулж, гэдэс эсвэл Трансвеллийн оруулгад үржүүлэх зорилгоор нэг эсэд задалдаг (өмнө нь өөр өөр чип дээр тэмдэглэсэн байдаг). өвчний төрөл 12,13 (жишээ нь шархлаат колит, Кроны өвчин, бүдүүн гэдэсний хорт хавдар эсвэл хэвийн донор), гэмтлийн газар (жишээ нь, гэмтэлгүй хэсэг гэх мэт) болон гэдэсний ходоод гэдэсний байрлал (жишээ нь, 12, 12-р гэдэс, бүдүүн гэдэс, бүдүүн гэдэс, шулуун гэдэс). (колоидууд) нь нарийн гэдэсний органоидуудаас илүү их хэмжээний морфоген шаарддаг.
a, Гэдэсний чип дэх гэдэсний морфогенезийг өдөөх ажлын урсгал. 3D морфогенезийг харуулахын тулд Caco-2 хүний ​​гэдэсний хучуур эд ба гэдэсний органоидуудыг энэ протоколд ашигладаг. Тусгаарлагдсан хучуур эдийн эсийг бэлтгэсэн гэдэс дээр суулгасан төхөөрөмжид суулгаж (эсийг хавсаргасан) (эсийг хавсаргасан). (хавсаргасан) PDMS-ийн сүвэрхэг мембранд 0-р өдөр (D0), оройн (AP) урсгалыг эхлүүлж, эхний 2 өдрийн турш хадгална (урсгал, AP, D0-D2). Суурийн хажуугийн (BL) урсгалыг мөн мөчлөгт суналтын хөдөлгөөнүүд (суналт, урсгал, AP болон BL) хамт эхлүүлнэ. 5 хоногийн бичил шингэн өсгөвөрлөсний дараа аяндаа үүссэн (морфогенез, D5). Фазын тодосгогч зургууд нь туршилтын алхам эсвэл цаг хугацааны цэг бүрт Caco-2 эсийн төлөөллийн морфологийг харуулж байна (бадан график, 100 μм). Дөрвөн бүдүүвч диаграмм нь гэдэсний морфогенезийн чиглэлийг (баруун тийш зурсан шингэний чиглэлийг) харуулж байна. урсгал.b, тогтсон 3D Caco-2 хучуур эдийн гадаргуугийн топологийг харуулсан SEM зураг (зүүн талд). Томруулсан хэсгийг тодруулсан оруулга (цагаан тасархай хайрцаг) нь 3D Caco-2 давхарга (баруун) дээрх шинэчлэгдсэн микровиллийг харуулж байна (баруун).c, Суурилуулсан Caco-2 3D-ийн хэвтээ нүүрэн талын харагдац, claudin (ZO- хүрээтэй) мембраны тасралтгүй харагдац (ZO- хүрээтэй F1) ба бөөм (цэнхэр) Гэдэсний чип дээрх хучуур эдийн эсийн иммунофлуоресценцийн төвлөрсөн дүрслэл. Дунд бүдүүвчийг харуулсан сумнууд нь төвлөрсөн харагдац бүрийн фокусын хавтгайн байршлыг заана.d, фазын тодосгогч микроскопоор олж авсан чип дээр өсгөвөрлөсөн organoids-ийн морфологийн өөрчлөлтийн цаг хугацааны явц 9, 11, 3, 11, 13-ны баруун талд). өгөгдсөн зургийн өндөр томруулж байгааг харуулж байна.e, 7.f-ийн өдөр авсан зүсмэл дээр гэдсэнд тогтсон органоид 3D хучуур эдийн DIC фото бичил зураг, Үүдэл эс (LGR5; ягаан), аяга эс (MUC2; ногоон), F-актин (саарал) болон 3 өдрийн туршид ургасан бөөмийг харуулсан маркеруудыг харуулсан давхардсан иммунофлуоресценцийн зураг. Эпителийн давхарга дээрх (зүүн) ба 13 хоногийн (дунд) органоидууд. MUC2 дохиололгүйгээр LGR5 дохиололыг онцолсон Өргөтгөсөн өгөгдлийн Зураг 3-ыг үзнэ үү. Гэдсэнд тогтсон 3 хэмжээст органоид хучуур эдийн эпителийн бичил бүтцийг (баруун талд) харуулсан флюресценцийн зураг (баруун талд C) пласма 1-ийн мембраныг чип дээр будсан. соёл.Өөрөөр заагаагүй бол масштабын мөр 50 μм байна.b Лавлагааны зөвшөөрлөөр дахин хэвлэсэн.2. Оксфордын их сургуулийн хэвлэл; в Лавлагааны зөвшөөрлөөр тохируулсан.2. Оксфордын их сургуулийн хэвлэл; e ба f-г лавлагааны дагуу зөвшөөрөлтэйгээр тохируулсан.12 Creative Commons License CC BY 4.0.
Чип дээрх гэдэс дотор, ECM амжилттай бүрэхийн тулд PDMS сүвэрхэг мембраны гидрофобик гадаргууг өөрчлөх шаардлагатай. Энэхүү протоколд бид PDMS мембраны гидрофобик чанарыг өөрчлөх хоёр өөр аргыг хэрэглэнэ. Како-2 эсийг өсгөвөрлөхийн тулд зөвхөн хэт ягаан туяа/озоны боловсруулалтаар гадаргууг идэвхжүүлэх нь PDMS-ийн гидрофобик чанарыг бууруулж, PDMS2-ийн гадаргууг холбоход хангалттай байсан. PDMS мембран. Гэсэн хэдий ч, органоид хучуур эдийн бичил шингэн өсгөвөрлөхийн тулд полиэтиленэймин (PEI) болон глутаральдегидийг PDMS-ийн бичил сувагт дараалан түрхэх замаар ECM уургийг үр ашигтай хуримтлуулахын тулд химийн үндсэн дээр гадаргуугийн функциональжуулалт шаардлагатай. хучуур эд.Эсүүд наалдсаны дараа бичил шингэн эсийн өсгөвөр нь эсүүд бүрэн нэг давхарга үүсгэх хүртэл дээд микро суваг руу зөвхөн тэжээлт бодисыг шингээж эхэлдэг бол доод микро суваг нь статик нөхцөлийг хадгалж байдаг. Гадаргууг идэвхжүүлэх, ECM бүрэх оновчтой арга нь органоид хучуур эдийг бэхлэх боломжийг олгодог.
Transwell өсгөвөр нь мөн эсийн үрийг суулгахаас өмнө ECM бүрэх шаардлагатай; Гэсэн хэдий ч Transwell өсгөвөр нь сүвэрхэг оруулгын гадаргууг идэвхжүүлэхийн тулд нарийн төвөгтэй урьдчилсан боловсруулалт хийх шаардлагагүй. Трансвелл оруулга дээр Caco-2 эсийг ургуулахын тулд сүвэрхэг оруулга дээр ECM бүрэх нь салангид Како-2 эсийн бэхлэлтийг хурдасгах (<1 цаг) ба нягт уулзвар үүсэх саадыг (<1-2 хоног) хурдасгадаг. оруулга, мембраны гадаргууд наалдсан (<3 цаг) ба органоидууд нь саад бэрхшээлийн бүрэн бүтэн нэг давхарга үүсгэх хүртэл хадгалагдана. Трансвеллийн өсгөвөрийг 24 цооногийн хавтанд эрлийз чипс ашиглахгүйгээр гүйцэтгэнэ.
In vitro 3D морфогенезийг тогтсон хучуур эдийн давхаргын суурь тал руу шингэний урсгалыг түрхэх замаар эхлүүлж болно. Чип дээрх гэдсэнд эпителийн морфогенез нь орчинг дээд ба доод бичил суваг руу нэвчүүлэх үед эхэлдэг (Зураг 3a). Өмнө дурьдсанчлан, шингэний урсгалыг тасралтгүй нэвтрүүлэх нь чухал юм. чиглэлтэй ялгардаг морфоген дарангуйлагчид. Сүвэрхэг мембран дээр холбогдсон эсүүдэд хангалттай шим тэжээл, ийлдсийг хангаж, гэрлийн шилжилтийн стрессийг бий болгохын тулд бид ихэвчлэн чип дээр гэдэс дотор давхар урсгалыг хийдэг. Гибрид чипүүдэд эпителийн нэг давхарга агуулсан Transwell оруулгыг эрлийз чипсэнд суулгаж өгдөг. Дараа нь порlateral хэсгийн доод хэсэгт дунд хэсгийг түрхсэн. microchannel.Гэдэсний морфогенез нь өсгөвөрлөх платформын аль алинд нь суурь хажуугийн урсгал эхэлснээс хойш 3-5 хоногийн дараа болсон.
Микро инженерчлэгдсэн 3D хучуур эдийн давхаргын морфологийн шинж чанарыг фазын тодосгогч микроскоп, дифференциал интерференцийн тодосгогч (DIC) микроскопи, SEM эсвэл иммунофлуоресцент конфокаль микроскоп (Зураг 3, 4) зэрэг дүрслэлийн янз бүрийн аргуудыг ашиглан шинжилж болно. 3D хучуур эдийн давхаргууд. PDMS болон полиэстр материалтай хальсны оптик ил тод байдлын улмаас чип дээрх гэдэс ба эрлийз чип платформууд нь төхөөрөмжийг огтлох, задлах шаардлагагүйгээр бодит цаг хугацаанд зураг авах боломжтой. Ердийн иммунофлуоресценцийн дүрслэл хийх үед (Зураг 3, f4, эсүүдтэй хамт) 4% (жин/хэлбэр) параформальдегид (PFA), араас нь Triton X-100 ба 2% (х/х) үхрийн сийвэнгийн альбумин (BSA)-ийг дарааллаар нь авна. Эсийн төрлөөс хамааран янз бүрийн бэхэлгээ, нэвчүүлэгч, хориглогч бодисуудыг хэрэглэж болно. Эсийн удамшлаас хамааралтай эсүүдэд чиглэсэн үндсэн эсрэгбиемүүдийг хэрэглэдэг. чип, дараа нь хоёрдогч эсрэгбие, цөм (жишээ нь, 4′,6-диамидино-2-фенилен) индол, DAPI) эсвэл F-актин (жишээ нь, флюресцентээр тэмдэглэгдсэн фаллоидин)-д чиглэсэн эсрэг будгийн будагтай хамт. Флюресцентэд суурилсан амьд дүрслэлийг мөн газар дээр нь хийж болно. физиологи”), бичил биетний эсийг санамсаргүй колоничлох (Зураг 1, “Хос-микробын хамтын соёл”), дархлааны эсийг элсүүлэх (Зураг 1, 'Өвчний загварчлал') эсвэл 3D хучуур эдийн морфологийн контур (Зураг 3c,f ба 4b,c-ийн доод давхаргыг чипээс тусгаарлах). 2-р зурагт үзүүлсэн шиг бичил сувгийн давхарга, 3D хучуур эдийн морфологи болон оройн сойзны хил дээрх микровиллийг SEM-ээр дүрсэлж болно (Зураг 3б). Ялгах маркеруудын илэрхийлэлийг тоон ПЗР5 эсвэл нэг эсийн РНХ-ийн дараалал тогтоох замаар үнэлж болно. Энэ тохиолдолд эпителийн давхарга эсвэл g3D эсүүд ургадаг. эрлийз чипсийг трипсинжуулалтаар хурааж аваад молекул эсвэл генетикийн шинжилгээнд ашигладаг.
a, Эрлийз чип дэх гэдэсний морфогенезийг өдөөх ажлын урсгал. Энэхүү протоколд эрлийз чип платформ дахь 3 хэмжээст морфогенезийг харуулахын тулд Caco-2 болон гэдэсний органоидуудыг ашигладаг. Салангид хучуур эдийн эсүүдийг бэлтгэсэн Transwell оруулгад суулгасан (доорх зургийг үзнэ үү). Transwell inserts дахь полиэстр материалтай мембрануудад бүх эсийг статик нөхцөлд өсгөвөрлөв (TW өсгөвөр). 7 хоногийн дараа хучуур эдийн эсийн 2D нэг давхарга агуулсан нэг Трансвелл оруулгыг эрлийз чипэнд нэгтгэн үндсэн хажуугийн урсгалыг (Урсгал, BL) нэвтрүүлсэн бөгөөд энэ нь эцэстээ 3D микроэпилитийн давхаргыг (3D микроэзэзийн контур) үүсгэхэд хүргэсэн. Туршилтын үе шат бүр эсвэл цаг хугацааны цэг бүрт хэвийн донороос гаралтай хүний ​​эрхтний хучуур эдийн эсийн морфологийн онцлогийг харуулсан (C103 шугам) бүдүүн гэдэсний өгсөх хэсэг. Дээд давхаргууд дахь схемүүд нь алхам бүрийн туршилтын тохиргоог харуулж байна.b, Гибрид чипүүд (зүүн схем) нь 3D хэлбэрт хүргэж болно. байрлал (дээд, дунд, доод; баруун бүдүүвч ба харгалзах тасархай шугамуудыг харна уу). илэрхий морфологийн шинж чанарыг харуулсан.F-актин (цэнхэр), цөм (саарал).c, эрлийз чиптэй (хамгийн том бүрэн хэмжээний зураг авалт) ба 2D-тэй харьцуулахад статик Трансвелл (TW; цагаан тасархай хайрцагт) өсгөвөрлөсөн органоид гаралтай хучуур эдийн эсүүдийн флюресценцийн төвлөрсөн микрографи (3D өнцгөөс харах). 2D босоо хөндлөн огтлолын (баруун дээд буланд оруулсан; "XZ") нь мөн 2D болон 3D онцлогуудыг харуулдаг. Хуваарийн мөр, 100 μm.c Лавлагааны зөвшөөрлөөр дахин хэвлэсэн.4. Elsevier.
Уламжлалт статик өсгөвөрлөлтийн нөхцөлд ижил эсүүдийг (Како-2 эсвэл гэдэсний органоид хучуур эдийн эсүүд) хоёр хэмжээст моно давхарга болгон өсгөвөрлөх замаар хяналтыг бэлтгэж болно. Анхаарах зүйл бол бичил сувгийн багтаамж хязгаарлагдмал (өөрөөр хэлбэл, гэдэсний чип, хажуугийн эпителийн загвар, эпителийн үндсэн загвар дээрх дээд сувагт ~4 мкл) хязгаарлагдмал байдлаас шалтгаалан шим тэжээлийн хомсдол үүсч болзошгүй. урсгалыг мөн харьцуулж болно.
Зөөлөн литографийн процессыг цэвэрхэн өрөөнд хийх ёстой. Чип (дээд ба доод давхарга, мембран) болон эрлийз чип дээрх давхарга бүрт өөр өөр фотомаскуудыг ашиглаж, тусдаа цахиур хавтан дээр үйлдвэрлэсэн, учир нь бичил сувгийн өндөр нь өөр өөр байсан. Чип дээрх гэдэсний дээд ба доод микро сувгийн зорилтот өндөр нь 500 μм, зорилтот сувгийн өндөр нь 500 μм байна. эрлийз чип нь 200 микрон.
3 инчийн цахиурын ялтсыг ацетонтой аяганд хийнэ. Хавтсыг 30 секундын турш зөөлөн эргүүлж, дараа нь агаарт хатаана. Өргөсийг IPA-тай таваг руу шилжүүлж, дараа нь 30 секундын турш эргүүлж цэвэрлэнэ.
Пиранхагийн уусмалыг (устөрөгчийн хэт исэл ба төвлөрсөн хүхрийн хүчлийн холимог, 1: 3 (хэлбэр/боть)) нэмэлтээр цахиур ялтсын гадаргуугаас органик үлдэгдлийг арилгахад ашиглаж болно.
Пиранхагийн уусмал нь маш идэмхий бөгөөд дулаан үүсгэдэг. Аюулгүй байдлын нэмэлт арга хэмжээ авах шаардлагатай. Хог хаягдлыг зайлуулахын тулд уусмалыг хөргөөд цэвэр, хуурай хогны саванд шилжүүлнэ. Хоёрдогч савыг ашиглаж, хог хаягдлын савыг зохих ёсоор шошгоно уу. Илүү нарийвчилсан процедурын хувьд байгууламжийн аюулгүй байдлын удирдамжийг дагаж мөрдөнө үү.
Өрөөнийг 200°С-ийн халуун тавган дээр 10 минутын турш тавьж усгүйжүүлнэ. Шингэн алдсны дараа вафель нь агаарт таван удаа сэгсэрч хөргөнө.
Цэвэрлэсэн цахиурын СУ-8 2100-ийн голд ~10 гр фоторезистийг хийнэ. Фоторезистийг вафель дээр жигд тараахын тулд хясаа ашиглана. Фоторезистийг наалдамхай болгож, тараахад хялбар болгохын тулд хааяа 65°С халуун таваг дээр байрлуул.
SU-8 нь эргэлдэгч бүрээсийг ажиллуулснаар вафель дээр жигд тархсан. SU-8-ийн орж ирж буй эргэлтийг 5-10 секундын турш 100 эрг/мин хурдатгалтайгаар 500 эрг/минутаар тараах программчил. Чип дээрх гэдэсний дээд давхаргын хувьд 500 μм өндөр; доорх "Чухал алхмууд" -ыг үзнэ үү) 1200 эрг / мин-д 30 секундын хурдатгалаар тохируулна.
Үндсэн эргэлтийн хурдыг цахиур хавтан дээрх SU-8 загварын зорилтот зузаанын дагуу тохируулж болно.
Чип дээрх гэдэсний дээд давхаргад зориулж 500 μм өндөртэй SU-8 загварыг бүтээхийн тулд энэ хайрцгийн ээрэх бүрэх, зөөлөн жигнэх үе шатуудыг (7 ба 8-р алхам) дараалан давтаж (9-р алхамыг үзнэ үү) 250 мкм-ийн хоёр давхаргыг гаргаж авсан. 500 микрон өндөр.
SU-8 бүрсэн өрөмийг зөөлөн жигнэж, 65 ° C-т халуун тавган дээр 5 минутын турш болгоомжтой хийж, дараа нь тохиргоог 95 ° C болгож, нэмэлт 40 минутын турш өсгөвөрлөнө.
Дээд талын бичил суваг дахь SU-8 загварын 500 μм өндөрт хүрэхийн тулд 7 ба 8-р алхамуудыг давтаж 250 μм зузаантай SU-8 давхаргыг үүсгэнэ.
Хэт ягаан туяаны маск тохируулагчийг ашиглан вафельд өртөх хугацааг тооцоолохын тулд үйлдвэрлэгчийн зааврын дагуу чийдэнгийн туршилтыг хийнэ.(өрчлөх хугацаа, мс) = (өрчлөх тун, мЖ/см2)/(дэнлүүний хүч, мВт/см2).
Нөлөөлөх хугацааг тодорхойлсны дараа хэт ягаан туяаны маск тэгшлэгчийн маск эзэмшигч дээр гэрэл зургийн маскыг байрлуулж, SU-8 бүрсэн вафель дээр фото маскыг байрлуулна.
Хэт ягаан туяаны тархалтыг багасгахын тулд гэрэл зургийн маскын хэвлэсэн гадаргууг цахиурын СУ-8 бүрсэн тал дээр шууд байрлуулна.
Урьдчилан тогтоосон өртөлтийн хугацаанд 260 мЖ/см2 хэт ягаан туяанд SU-8 бүрсэн валь болон фото маскыг босоо байдлаар ил гарга (энэ хайрцагны 10-р алхамыг үзнэ үү).
Хэт ягаан туяанд өртсөний дараа SU-8 бүрсэн цахиурын ялтсуудыг 65°С-т 5 минут, 95°С-т 15 минутын турш халуун хавтан тус бүр дээр жигнэж, 200 μм өндөртэй хээ гаргана. 50 μм өндөртэй хээ гаргахын тулд жигнэсний дараах хугацааг 95 ° C-т 30 минут хүртэл сунгана.
Хөгжүүлэгчийг шилэн аяганд юүлж, шатаасан талстыг аяганд хийнэ. SU-8 хөгжүүлэгчийн хэмжээ нь шилэн хавтангийн хэмжээнээс хамаарч өөр өөр байж болно. Ил гаргаагүй SU-8-ийг бүрэн арилгахын тулд хангалттай хэмжээний SU-8 хөгжүүлэгч ашиглахаа мартуузай. Жишээ нь, 150 мм-ийн диаметртэй, 1 литрийн багтаамжтай шилэн таваг ашиглахдаа ~L30De mol SU-30-ийн багтаамжтай. 25 минутын турш хааяа зөөлөн эргүүлнэ.
Боловсруулсан хэвийг ~10 мл шинэхэн боловсруулагчаар зайлж, дараа нь IPA-аар уусмалыг пипеткээр цацна.
Өрөөнийг плазм цэвэрлэгч дотор хийж, хүчилтөрөгчийн плазмд (агаар мандлын хий, зорилтот даралт 1 × 10−5 Торр, хүч 125 Вт) 1.5 минут байлгана.
Өрөөнийг дотор нь шилэн слайдтай вакуум хатаагчинд хийнэ. Өрөө болон гулсуурыг зэрэгцүүлэн байрлуулж болно.Хэрэв вакуум хатаагчийг хавтангаар хэд хэдэн давхаргад хуваасан бол гулсуурыг доод камерт, талстыг дээд камерт байрлуулна. 100 мкл трихлоро (H,H1H2, 2Н-перфтороктил)силаны уусмалыг шилэн дээр хийж, силанжуулах зорилгоор вакуум хийнэ.
Хөлдөөсөн Caco-2 эсийн нэг шилийг 37°С-ийн усан ваннд гэсгээж, гэсгээсэн эсүүдийг 15 мл 37°C-т урьдчилан халаасан Caco-2 тэжээл агуулсан T75 колбонд хийнэ.
Како-2 эсийг ~90%-ийн нийлбэрт нэвтрүүлэхийн тулд эхлээд Caco-2 орчин, PBS, 0.25% трипсин/1 мМ EDTA-г 37°C усан ваннд халаана.
Вакуум сорох замаар орчинг соруулна. Вакуум соруулалтыг давтаж, шинэ PBS нэмж 5 мл бүлээн PBS-ээр эсүүдийг хоёр удаа угаана.