Nature.com сайтаар зочилсонд баярлалаа.Та хязгаарлагдмал CSS дэмжлэгтэй хөтчийн хувилбарыг ашиглаж байна.Хамгийн сайн ашиглахын тулд бид танд шинэчилсэн хөтөч ашиглахыг зөвлөж байна (эсвэл Internet Explorer-д нийцтэй байдлын горимыг идэвхгүй болгох).Нэмж дурдахад, байнгын дэмжлэгийг хангахын тулд бид сайтыг хэв маяг, JavaScript-гүй харуулж байна.
Гурван слайдаас бүрдсэн тойргийг нэг дор харуулна.Өмнөх болон Дараагийн товчийг ашиглан гурван слайдыг нэг дор гүйлгэх, эсвэл төгсгөлд байрлах гулсагч товчлуурыг ашиглан гурван слайдыг нэг дор гүйлгэж болно.
Цус-тархины саад тотгор нь био эмчилгээний бодисууд төв мэдрэлийн системд хүрэхэд саад болж, улмаар мэдрэлийн өвчнийг үр дүнтэй эмчлэхэд саад болдог.Тархины шинэ зөөвөрлөгчдийг in vivo-д олж илрүүлэхийн тулд бид T7 фагийн пептидийн номын санг нэвтрүүлж, цус, тархи нугасны шингэнийг (CSF) цувралаар цуглуулсан хархны ухамсартай том усан сангийн загварыг ашигласан.Өвөрмөц фагийн клонууд дөрвөн үе шатны сонгон шалгаруулалтын дараа CSF-д их хэмжээгээр баяжуулсан.Хувь хүний ​​нэр дэвшигч пептидүүдийг туршиж үзэхэд CSF-д 1000 дахин баяжуулалт илэрсэн.Тархины пептидийн зуучлалын био идэвхжил нь тодорхойлогдсон шинэ транзит пептидтэй холбосон BACE1 пептидийн дарангуйлагчийг ашиглан тархи нугасны шингэн дэх амилоид-β-ийн түвшинг 40% бууруулснаар батлагдсан.Эдгээр үр дүн нь in vivo фагийн сонголтын аргаар тодорхойлсон пептидүүд нь эмчилгээний үр дүнтэй макромолекулуудыг тархинд системтэйгээр хүргэх ашигтай хэрэгсэл байж болохыг харуулж байна.
Төв мэдрэлийн тогтолцооны (ТМС) зорилтот эмчилгээний судалгаа нь төв мэдрэлийн тогтолцоонд чиглэсэн шинж чанартай, оновчтой эм, бодисыг тодорхойлоход голчлон төвлөрч, тархинд эмийг идэвхтэй хүргэх механизмыг илрүүлэхэд бага хүчин чармайлт гаргасан.Мансууруулах бодис, ялангуяа том молекулууд нь орчин үеийн мэдрэл судлалын эмийн хөгжлийн салшгүй хэсэг болсон тул энэ нь одоо өөрчлөгдөж эхэлж байна.Төв мэдрэлийн тогтолцооны орчин нь цус-тархины саад (BBB) ​​ба цус-тархины саад (BCBB)1-ээс бүрдэх тархины судасны саад тотгорын системээр сайн хамгаалагдсан тул тархинд эмийг хүргэхэд хүндрэл учруулдаг1,2.Том молекулын бараг бүх эм, жижиг молекулын эмийн 98 гаруй хувь нь тархинаас гадагшилдаг гэсэн тооцоо бий.Ийм учраас эмчилгээний эмийг төв мэдрэлийн систем 4,5-д үр дүнтэй, тодорхой хүргэх тархины тээврийн шинэ системийг тодорхойлох нь маш чухал юм.Гэсэн хэдий ч BBB болон BCSFB нь тархины бүх бүтцэд нэвтэрч, түүний өргөн судасжилтаар дамждаг тул эм дамжуулах маш сайн боломжийг олгодог.Тиймээс тархинд хүргэх инвазив бус аргуудыг ашиглах одоогийн хүчин чармайлт нь ихэвчлэн эндоген BBB6 рецепторыг ашиглан рецептороор дамждаг тээвэрлэлтийн (PMT) механизмд суурилдаг.Трансферрин рецепторын замыг ашигласан сүүлийн үеийн гол дэвшилтүүдийг үл харгалзан7,8, сайжруулсан шинж чанартай хүргэх шинэ системийг цаашид хөгжүүлэх шаардлагатай байна.Үүний тулд бидний зорилго бол үндсэндээ төв мэдрэлийн системд макромолекулуудыг хүргэх эсвэл рецепторын шинэ замыг нээхэд ашиглаж болох тул CSF-ийн тээвэрлэлтийг зуучлах чадвартай пептидүүдийг тодорхойлох явдал байв.Ялангуяа тархины судасны тогтолцооны өвөрмөц рецептор ба тээвэрлэгч (BBB ба BSCFB) нь био эмчилгээний эмийг идэвхтэй, тодорхой хүргэх боломжит зорилт болж чаддаг.Тархи нугасны шингэн нь ховдолын доорх болон ховдолын хөндийгөөр дамжин тархины завсрын шингэнтэй шууд харьцдаг ховдолын хөндийн хөндийн ялгарлын бүтээгдэхүүн юм4.Сүүлийн үед тархи нугасны доорх шингэн нь тархины завсрын давхаргад хэт их хэмжээгээр тархдаг болохыг харуулсан9.Бид энэхүү субарахноид урсгалын замыг ашиглан эсвэл шууд BBB-ээр дамжуулан паренхимийн орон зайд нэвтэрнэ гэж найдаж байна.Үүнд хүрэхийн тулд бид эдгээр хоёр өөр замын аль нэгээр дамждаг пептидийг хамгийн сайн тодорхойлдог in vivo фаг сонгох хүчирхэг стратегийг хэрэгжүүлсэн.
Бид одоо хамгийн их номын сангийн олон янз байдал бүхий эхний сонгон шалгаруулалтыг хянахын тулд CSF дээж авах, өндөр нэвтрүүлэх чадварын дараалал (HTS) бүхий дараалсан in vivo фагийн дэлгэцийн скрининг хийх аргыг тайлбарлаж байна.Цусыг бохирдуулахгүйн тулд байнгын суулгацтай том цистерна (CM) суваг бүхий ухамсартай хархуудад скрининг хийсэн.Хамгийн чухал нь энэ арга нь тархины зорилтот болон тархины судасны саадыг дамжин тээвэрлэх үйл ажиллагаатай пептидүүдийг хоёуланг нь сонгодог.Бид жижиг хэмжээтэй (~60 нм)10 тул T7 фагуудыг ашигласан бөгөөд тэдгээр нь эндотелийн ба/эсвэл эпители-медуллагийн саадыг эс хоорондын хөндлөн огтлолцох боломжийг олгодог цэврүүтүүдийг тээвэрлэхэд тохиромжтой гэж үзсэн.Дөрвөн удаа эргүүлсний дараа фагийн популяци тусгаарлагдсан бөгөөд энэ нь in vivo CSF-ийн баяжуулалт болон тархины бичил судаснуудын холбоог харуулсан.Хамгийн чухал нь бид илүүд үздэг, химийн хувьд нийлэгжсэн хамгийн сайн нэр дэвшигч пептидүүд нь уураг ачааг тархи нугасны шингэн рүү зөөвөрлөх чадвартай болохыг нотлон харуулж чадсан юм.Нэгдүгээрт, төв мэдрэлийн тогтолцооны фармакодинамик нөлөөг тэргүүлэх транзит пептидийг BACE1 пептидийн дарангуйлагчтай хослуулснаар тогтоосон.In vivo функциональ скринингийн стратеги нь тархины тээврийн шинэ пептидүүдийг үр дүнтэй уургийн ачаа тээвэрлэгч болохыг тодорхойлох боломжтойг харуулахаас гадна ижил төстэй функциональ сонголтын арга нь тархины тээвэрлэлтийн шинэ замыг тодорхойлоход чухал ач холбогдолтой болно гэж бид найдаж байна.
Фагийн савлагааны дараа товруу үүсгэгч нэгжүүд (PFU) дээр үндэслэн ойролцоогоор 109-ийн олон янз байдал бүхий санамсаргүй 12-мер шугаман T7 фагийн пептидийн санг зохион бүтээж, үүсгэсэн (Материал ба аргуудыг үзнэ үү).Бид энэ номын санг in vivo эргүүлэхээс өмнө сайтар судалж үзсэнийг анхаарах нь чухал.Өөрчлөгдсөн праймер ашиглан фагийн номын дээжийг ПГУ-ын олшруулалт нь HTS-д шууд хамаарах ампликонуудыг үүсгэсэн (Нэмэлт зураг 1а).a) HTS11 дарааллын алдаа, б) праймерын чанарт нөлөөлөх (NNK)1-12, в) бэлэн номын санд зэрлэг төрлийн (wt) фаг (араг ясны оруулга) байгаа тул зөвхөн баталгаажуулсан дарааллын мэдээллийг гаргаж авахын тулд дарааллыг шүүх процедурыг хэрэгжүүлсэн (Нэмэлт Зураг 1b).Эдгээр шүүлтүүрийн алхмууд нь HTS дарааллын бүх номын санд хамаарна.Стандарт номын сангийн хувьд нийт 233,868 уншлага авсан бөгөөд үүний 39% нь шүүлтүүрийн шалгуурыг давж, номын сангийн дүн шинжилгээ хийх, дараагийн шатанд сонгоход ашигласан (Нэмэлт Зураг 1c-e).Уншлага нь 36 нуклеотидын оргилтой (Нэмэлт зураг 1c) урттай 3 үндсэн хосын үржвэртэй байсан нь номын сангийн дизайныг (NNK) 1-12-ыг баталж байна.Номын сангийн гишүүдийн ойролцоогоор 11% нь 12 хэмжээст зэрлэг төрлийн (wt) нурууны PAGISRELVDKL оруулгатай байсан ба дарааллын бараг тал хувь нь (49%) нь оруулга эсвэл хасалтыг агуулж байсан.Номын сангийн номын сангийн HTS нь номын сан дахь пептидийн олон янз байдлыг баталгаажуулсан: пептидийн дарааллын 81% -иас илүү нь зөвхөн нэг удаа олдсон ба зөвхөн 1.5% нь ≥4 хувь тохиолдсон (Нэмэлт зураг 2a).Репертуар дахь бүх 12 байрлал дахь амин хүчлүүдийн (aa) давтамж нь доройтсон NKK репертуараас үүссэн кодонуудын тоогоор хүлээгдэж буй давтамжтай сайн хамааралтай байв (Нэмэлт Зураг 2b).Эдгээр оруулгуудаар кодлогдсон aa үлдэгдлийн ажиглагдсан давтамж нь тооцоолсон давтамжтай (r = 0.893) сайн хамааралтай байна (Нэмэлт зураг 2c).Фагийн сангуудыг тарилгад бэлтгэх нь эндотоксиныг өсгөх, зайлуулах үе шатуудыг агуулдаг.Энэ нь фагийн номын сангийн олон янз байдлыг бууруулж болзошгүйг өмнө нь харуулсан12,13.Тиймээс бид эндотоксиныг зайлуулсан хавтангаар олшруулсан фагийн номын санг дараалуулж, АА-ийн давтамжийг тооцоолохын тулд анхны номын сантай харьцуулсан.Анхны усан сан болон олшруулсан, цэвэршүүлсэн усан сангийн хооронд хүчтэй хамаарал (r = 0.995) ажиглагдсан (Нэмэлт зураг 2d) нь T7 фаг ашиглан ялтсууд дээр олшруулсан клонуудын хоорондох өрсөлдөөн нь томоохон хэвийх байдлыг үүсгэдэггүйг харуулж байна.Энэ харьцуулалт нь номын сангийн олон янз байдлыг (~109) HTS-тэй ч бүрэн олж авах боломжгүй тул номын сан бүрийн трипептид сэдвүүдийн давтамж дээр суурилдаг.Байрлал бүр дэх aa-ийн давтамжийн шинжилгээ нь оруулсан репертуарын сүүлийн гурван байрлалд байрлалаас хамааралтай жижиг хазайлтыг илрүүлсэн (Нэмэлт зураг 2e).Дүгнэж хэлэхэд номын сангийн чанар, олон талт байдал нь хүлээн зөвшөөрөгдөхүйц байсан бөгөөд сонгон шалгаруулалтын хэд хэдэн үе шатанд фагийн сангуудыг олшруулж, бэлтгэснээс болж зөвхөн олон янз байдалд бага зэргийн өөрчлөлт гарсан гэж бид дүгнэв.
Тархи нугасны шингэний дээж авах ажлыг BBB ба/эсвэл BCSFB-ээр дамжуулан судсаар тарьсан T7 фагийг (iv) тодорхойлоход хялбар болгохын тулд ухамсартай хархнуудын CM-д мэс заслын аргаар суваг суулгаж болно (Зураг 1a-b).Бид in vivo сонгон шалгаруулалтын эхний гурван шатанд бие даасан хоёр сонголтын гар (A ба B гар) ашигласан (Зураг 1c).Бид эхний гурван шатны сонгон шалгаруулалтад оруулсан фагийн нийт хэмжээг бууруулснаар сонгон шалгаруулалтын хатуу байдлыг аажмаар нэмэгдүүлсэн.Дөрөв дэх удаагаа эргүүлэхдээ бид А, В салбаруудаас дээжийг нэгтгэж, бие даасан гурван нэмэлт сонголт хийсэн.Энэ загварт T7 фагийн тоосонцрын in vivo шинж чанарыг судлахын тулд зэрлэг төрлийн фаг (PAGISRELVDKL мастер оруулга) нь харханд сүүлний судсаар тарьсан.Тархи нугасны шингэн ба цуснаас фагуудыг өөр өөр цаг хугацаанд сэргээх нь харьцангуй жижиг T7 икосаэдр фагууд цусны тасалгаанаас хурдан цэвэршсэн үе шаттай болохыг харуулсан (Нэмэлт зураг 3).Удирдах титр болон хархуудын цусны эзэлхүүн дээр үндэслэн бид жингийн ойролцоогоор 1% -ийг тооцоолсон.судсаар тарьснаас хойш 10 минутын дараа цусанд хэрэглэсэн тунгаас фаг илэрсэн.Энэхүү анхны хурдацтай бууралтын дараа анхдагч клиренс удааширч, хагас задралын хугацаа 27.7 минут байсан.Хамгийн чухал нь CSF тасалгаанаас маш цөөхөн фагуудыг гаргаж авсан нь CSF тасалгаа руу зэрлэг төрлийн фагийн шилжилт хөдөлгөөн бага байгааг харуулж байна (Нэмэлт зураг 3).Бүх дээж авах хугацаанд (0-250 минут) тархи нугасны шингэнд дунджаар цусан дахь T7 фагийн 1 х 10-3% титр, анх дусаасан фагийн 4 х 10-8% л илэрсэн.Тархи нугасны шингэн дэх зэрлэг фагийн хагас задралын хугацаа (25.7 минут) цусанд ажиглагдсантай төстэй байсан.Эдгээр өгөгдлүүд нь CM-сувагтай хархуудад CSF тасалгааг цуснаас тусгаарлах саад нь бүрэн бүтэн байдгийг харуулж байгаа бөгөөд энэ нь фагийн сангуудыг in vivo сонгоход цуснаас CSF тасалгаа руу амархан дамждаг клонуудыг тодорхойлох боломжийг олгодог.
(a) Том усан сангаас тархи нугасны шингэнийг (CSF) дахин дээж авах аргыг тохируулах.(б) Цус-тархины саад тотгор (BBB) ​​болон цус-тархины саадыг давж буй пептидийг тодорхойлоход ашигладаг төв мэдрэлийн тогтолцооны (төв мэдрэлийн системийн) саад тотгорын эсийн байршлыг харуулсан диаграмм.(в) In vivo фагийн дэлгэцийн скринингийн схем.Сонголт бүрт фагуудыг (сумны доторх амьтны таних тэмдэг) судсаар тарьсан.Хоёр бие даасан өөр салбар (A, B) нь 4-р шатны шалгаруулалт хүртэл тусад нь хадгалагдана.Сонгон шалгаруулалтын 3 ба 4-р шатанд CSF-ээс гаргаж авсан фагийн клон бүрийг гараар дараалуулсан.(г) T7 пептидийн сан (2 х 1012 фаг/амьтан) судсаар тарьсны дараа хоёр сувагтай харханд сонгон шалгаруулах эхний шатанд цус (улаан хүрээ) болон тархи нугасны шингэнээс (ногоон гурвалжин) тусгаарлагдсан фагийн кинетик.Цэнхэр квадратууд нь цусны нийт эзэлхүүнийг харгалзан тарьсан фагийн хэмжээнээс тооцоолсон цусан дахь фагийн анхны дундаж концентрацийг заана.Хар дөрвөлжин нь цусан дахь фагийн агууламжаас экстраполяцилагдсан y шугамын огтлолцох цэгийг заана.(e,f) Пептидээс олдсон бүх боломжит давхцаж буй трипептид сэдвүүдийн харьцангуй давтамж, тархалтыг харуул.1000 уншлагад олдсон хээний тоог харуулав.Чухал ач холбогдол бүхий (p<0.001) баяжуулсан хээг улаан цэгээр тэмдэглэв.(д) Тарьсан номын сангийн трипептид мотивийн харьцангуй давтамжийг №1.1 ба №1.2-ын амьтдын цуснаас гаралтай фагтай харьцуулсан корреляцийн тархалтын график.(е) Цус болон тархи нугасны шингэнээс тусгаарлагдсан №1.1 ба №1.2 амьтны фагийн трипептид мотивийн харьцангуй давтамжийг харьцуулсан корреляцийн тархалтын график.(g, h) Цусан дахь баяжсан фагийн (g) тарилгын сангууд болон CSF (h)-аар баяжуулсан фагийн цустай харьцуулсан дарааллын ID дүрслэл.Нэг үсэгтэй кодын хэмжээ нь тухайн байрлалд тухайн амин хүчил хэр олон удаа тохиолддогийг илэрхийлдэг.Ногоон = туйл, нил ягаан = төвийг сахисан, цэнхэр = үндсэн, улаан = хүчиллэг, хар = гидрофобик амин хүчлүүд.Зураг 1а, б-г Эдуард Урич боловсруулж, үйлдвэрлэсэн.
Бид фагийн пептидийн санг CM багажийн хоёр харханд (А ба В бүлэг) тарьсан ба тархи нугасны шингэн ба цуснаас тусгаарлагдсан фаг (Зураг 1d).Номын сангийн анхны хурдацтай цэвэрлэгээ нь зэрлэг төрлийн фагтай харьцуулахад мэдэгдэхүйц бага байв.Хоёр амьтны тарьсан номын сангийн хагас задралын дундаж хугацаа нь цусан дахь 24.8 минут, зэрлэг төрлийн фагийнхтай адил, CSF-д 38.5 минут байв.Амьтан бүрээс цус, тархи нугасны шингэний фагийн дээжийг HTS-д хамруулж, бүх тодорхойлсон пептидүүдэд богино трипептид мотив байгаа эсэхийг шинжлэв.Трипептидийн мотивийг сонгосон бөгөөд учир нь тэдгээр нь бүтэц үүсэх, пептид-уургийн харилцан үйлчлэлд хамгийн бага үндэс суурь болдог14,15.Бид тарьсан фагийн номын сан болон хоёр амьтны цуснаас гаргаж авсан клонуудын хооронд хэв маягийн тархалтад сайн хамаарал байгааг олж мэдсэн (Зураг 1e).Өгөгдөл нь номын сангийн бүрэлдэхүүнийг зөвхөн цусны тасалгаанд бага зэрэг баяжуулсан болохыг харуулж байна.Амин хүчлийн давтамж болон зөвшилцлийн дарааллыг Weblogo16 програм хангамжийн дасан зохицох аргыг ашиглан байрлал бүр дээр үргэлжлүүлэн шинжлэв.Сонирхолтой нь бид цусан дахь гликиний үлдэгдэлд хүчтэй баяжуулалтыг олсон (Зураг 1г).Цусыг CSF-ээс сонгогдсон клонуудтай харьцуулж үзэхэд хүчтэй сонгон шалгаруулалт, зарим нэг хэв маягийн сонголтгүй болсон (Зураг 1f), тодорхой амин хүчлүүд нь 12 гишүүнтэй (Зураг 1h) урьдчилан тодорхойлсон байрлалд илүү давуу талтай байсан.Анхаарах зүйл бол бие даасан амьтад тархи нугасны шингэнд ихээхэн ялгаатай байсан бол цусан дахь глицин баяжуулах нь хоёр амьтанд ажиглагдсан (Нэмэлт зураг 4a-j).№1.1 ба №1.2 амьтдын тархи нугасны шингэн дэх дарааллын өгөгдлийг нарийн шүүсний дараа нийт 964 ба 420 өвөрмөц 12-мер пептидүүдийг олж авсан (Нэмэлт зураг 1d-e).Тусгаарлагдсан фагийн клонуудыг олшруулж, in vivo сонгон шалгаруулалтын хоёр дахь шатанд хамруулсан.Хоёр дахь шатны сонгон шалгаруулалтаас гаргаж авсан фагийг амьтан бүрт HTS-д хамруулсан бөгөөд бүх тодорхойлсон пептидүүдийг трипептид сэдвүүдийн илрэлийг шинжлэхийн тулд сэдвийг таних программын орц болгон ашигласан (Зураг 2a, b, ef).CSF-ээс сэргээгдсэн фагийн эхний мөчлөгтэй харьцуулахад бид А ба В мөчрүүдэд CSF-ийн олон хээг сонгон авч, сонгон авч хаяхыг ажигласан (Зураг 2).Тэдгээр нь тууштай дарааллын өөр өөр хэв маягийг илэрхийлж байгаа эсэхийг тодорхойлохын тулд сүлжээг таних алгоритмыг ашигласан.CSF-ээр сэргээсэн 12 хэмжээст дарааллын хооронд тодорхой ижил төстэй байдал ажиглагдсан байна. Альтернатив ангилалд A (Зураг 2c, d) болон B ангилалд (Зураг 2g, h).Салбар бүрт нэгтгэсэн шинжилгээгээр 12-мер пептидийн өөр өөр сонголтын профайлыг илрүүлсэн (Нэмэлт зураг 5c,d), эхний шатны сонгон шалгаруулалттай харьцуулахад хоёр дахь шатны сонгон шалгаруулалтын дараа нэгтгэсэн клонуудын хувьд цаг хугацааны явцад CSF/цусны титрийн харьцаа нэмэгдсэн (Нэмэлт зураг 5e).).
Тархи нугасны шингэн дэх мотив ба пептидийг хоёр дараалсан in vivo функциональ фагийн дэлгэцийн сонголтоор баяжуулах.
Амьтан (амьтан №1.1 ба №1.2) эхний тойргоос гаргаж авсан бүх тархи нугасны шингэний фагуудыг нэгтгэж, олшруулж, HT дараалалд оруулж, дахин тарьсан (2 х 1010 фаг/амьтан) 2 SM сувагтай харх (#1.1 → #).2.1 ба 2.2, 1.2 → 2.3 ба 2.4).(a,b,e,f) Эхний болон хоёр дахь сонголтын шатанд CSF-аас гаралтай бүх фагуудын трипептид мотивийн харьцангуй давтамжийг харьцуулсан корреляцийн тархалтын графикууд.Хоёр чиглэлийн пептидүүдээс олдсон бүх боломжит давхцаж буй трипептидүүдийг төлөөлөх сэдвүүдийн харьцангуй давтамж ба тархалт.1000 уншлагад олдсон хээний тоог харуулав.Харьцуулсан номын сангийн аль нэгэнд мэдэгдэхүйц (p < 0.001) сонгогдсон эсвэл хасагдсан хээг улаан цэгээр тодруулсан.(c, d, g, h) In vivo сонголтын 2 ба 1-р шатанд үндэслэсэн CSF-ээр баялаг 12 амин хүчлийн урт дарааллын бүх дарааллын лого дүрслэл.Нэг үсэгтэй кодын хэмжээ нь тухайн байрлалд тухайн амин хүчил хэр олон удаа тохиолддогийг илэрхийлдэг.Логог дүрслэхийн тулд хоёр сонгон шалгаруулалтын хооронд бие даасан амьтдаас гаргаж авсан CSF дарааллын давтамжийг харьцуулж, хоёрдугаар шатанд баяжуулсан дарааллыг үзүүлэв: (в) #1.1–#2.1 (г) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 ба (h) #1.2–#2.4.(c, d) амьтдын өгөгдсөн байрлал дахь хамгийн их баяжуулсан амин хүчлүүд №.2.1 ба үгүй.2.2 буюу (g, h) амьтдын тоо.2.3 ба үгүй.2.4-ийг өнгөөр ​​харуулсан.Ногоон = туйл, нил ягаан = төвийг сахисан, цэнхэр = үндсэн, улаан = хүчиллэг, хар = гидрофобик амин хүчлүүд.
Гурав дахь шатны сонгон шалгаруулалтын дараа бид хоёр амьтнаас тусгаарлагдсан 332 CSF-ээр сэргээсэн фагийн клонуудаас 124 өвөрмөц пептидийн дарааллыг (#3.1 ба №3.2) тодорхойлсон (Нэмэлт зураг 6a).LGSVS (18.7%) дараалал хамгийн өндөр харьцангуй хувьтай байсан бол PAGISRELVDKL (8.2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2.2%), SARGSWREIVSLS (2.2%) зэрлэг төрлийн оруулгууд удаалсан байна.Сүүлийн дөрөв дэх шатанд бид гурван тусдаа амьтнаас бие даан сонгосон хоёр мөчрийг нэгтгэсэн (Зураг 1c).CSF-ээс олж авсан 925 дараалсан фагийн клонуудаас дөрөв дэх шатанд бид 64 өвөрмөц пептидийн дарааллыг (Нэмэлт зураг 6b) олсон бөгөөд тэдгээрийн дунд зэрлэг фагийн харьцангуй хувь хэмжээ 0.8% хүртэл буурсан байна.Дөрөв дэх шатанд хамгийн түгээмэл CSF клонууд нь LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3.6%) болон RLSSVD3.2% байв.%)).Сонгосон пептидийн уртын муж нь NNK номын сангийн дизайнд доройтсон кодонуудыг ашиглах үед номын сангийн праймер дахь нуклеотид оруулах/устгах эсвэл дутуу зогсоох кодонуудаас шалтгаална.Эрт зогсох кодонууд нь богино пептид үүсгэдэг бөгөөд тэдгээр нь тааламжтай aa сэдлийг агуулдаг тул сонгогддог.Синтетик сангуудын праймеруудад оруулах/устгаснаас урт пептидүүд үүсч болно.Энэ нь зохион бүтээсэн зогсолтын кодоныг хүрээний гадна байрлуулж, урсгалын дагуу шинэ зогсоох кодон гарч ирэх хүртэл уншина.Ерөнхийдөө бид оролтын өгөгдлүүдийг түүврийн гаралтын өгөгдөлтэй харьцуулах замаар бүх дөрвөн сонгон шалгаруулалтын баяжуулалтын хүчин зүйлийг тооцсон.Эхний ээлжинд скрининг хийхдээ бид зэрлэг төрлийн фагийн титрүүдийг тусгай бус суурь лавлагаа болгон ашигласан.Сонирхолтой нь, сөрөг фагийн сонголт нь эхний CSF мөчлөгт маш хүчтэй байсан боловч цусанд биш (Зураг 3a), энэ нь пептидийн номын сангийн ихэнх гишүүдийн CSF тасалгаанд идэвхгүй тархах магадлал багатай эсвэл харьцангуй фагууд бактериопыг бодвол цусны урсгалаас илүү үр дүнтэй хадгалагдах эсвэл зайлуулах хандлагатай байдагтай холбоотой байж болох юм.Гэсэн хэдий ч хоёр дахь ээлжинд CSF-ийн фагуудын хүчтэй сонголт нь хоёр давхаргад ажиглагдсан нь өмнөх үе нь CSF-ийн шингээлтийг дэмждэг пептидүүдийг харуулсан фагуудаар баяжуулсан болохыг харуулж байна (Зураг 3a).Дахин хэлэхэд цусыг мэдэгдэхүйц баяжуулахгүйгээр.Мөн гурав, дөрөв дэх шатанд фагийн клонууд CSF-ээр ихээхэн баяжуулсан.Сүүлийн хоёр шатны сонгон шалгаруулалтын хоорондох өвөрмөц пептидийн дараалал тус бүрийн харьцангуй давтамжийг харьцуулж үзэхэд бид дөрөв дэх шатны сонгон шалгаруулалтад дараалал бүр илүү баяжсан болохыг олж мэдсэн (Зураг 3б).Бүх 64 өвөрмөц пептидийн дарааллаас пептидийн чиглэлийг хоёуланг нь ашиглан нийт 931 трипептид мотивийг гаргаж авсан.Дөрөв дэх шатанд хамгийн их баяжуулсан хээг тарьсан номын сантай харьцуулахад бүх үе шатанд баяжуулалтын профайлыг илүү нарийвчлан шалгасан (таслах: 10% баяжуулалт) (Нэмэлт Зураг 6c).Сонгон шалгаруулалтын ерөнхий загвараас харахад судлагдсан сэдвүүдийн ихэнх нь сонгон шалгаруулалтын хоёр салбарын өмнөх бүх шатанд баяжуулсан байна.Гэсэн хэдий ч зарим хээг (жишээ нь, SGL, VSG, LGS GSV) голчлон A альтернатив давхаргаас авсан бол заримыг (жишээ нь FGW, RTN, WGF, NTR) өөр төрлийн Б-ээр баяжуулсан.
Стрептавидины ачаалалтай хавсарсан CSF-ээр баяжуулсан фагаар харуулсан пептид болон биотинжүүлсэн удирдагч пептидүүдийн CSF тээвэрлэлтийг баталгаажуулах.
(a) Тарилгын (оролт = I) фагийн (PFU) титр болон тодорхойлогдсон CSF фагийн титр (гаралт = O) дээр үндэслэн бүх дөрвөн тойрогт (R1-R4) тооцоолсон баяжуулалтын харьцаа.Сүүлийн гурван тойргийн (R2-R4) баяжуулах хүчин зүйлсийг өмнөх тойрог болон эхний тойрогт (R1) жингийн мэдээлэлтэй харьцуулан тооцсон.Нээлттэй баар нь тархи нугасны шингэн, сүүдэртэй баар нь плазм юм.(***p<0.001, Оюутны t-тест дээр үндэслэсэн).(б) Сонголтын 4-р шатны дараа CSF-д цуглуулсан бүх фагуудтай харьцуулсан харьцаагаар нь эрэмбэлсэн хамгийн элбэг фагийн пептидүүдийн жагсаалт.Хамгийн түгээмэл зургаан фагийн клоныг сонгон шалгаруулах 3, 4-р шатанд (дотоод) өнгөөр ​​ялгаж, дугаарлаж, баяжуулах хүчин зүйлсийг нь зааж өгсөн болно.(c,d) 4-р тойргийн хамгийн баяжуулсан зургаан фагийн клон, хоосон фаг болон эцэг эхийн фагийн пептидийн сангуудыг CSF дээж авах загварт тус тусад нь шинжилсэн.CSF болон цусны дээжийг заасан хугацаанд цуглуулсан.(в) Тэнцүү хэмжээтэй 6 нэр дэвшигч фагийн клон (2 х 1010 фаг/амьтан), хоосон фаг (№1779) (2 х 1010 фаг/амьтан) болон нөөц фагийн пептидийн сан (2 х 1012 фаг/амьтан) 3-аас доошгүй ширхэгийг сүүлээр нь салгаж судсаар тарина.Тарьсан фагийн клон болон фагийн пептидийн сан бүрийн CSF-ийн фармакокинетикийг цаг хугацааны явцад үзүүлэв.(г) нь дээж авах хугацааны туршид сэргээгдсэн бүх фаг/мл-ийн CSF/цусны дундаж харьцааг харуулав.(д) Дөрвөн нийлэг удирдагч пептид ба нэг стрептавидиныг стрептавидинтай N төгсгөлөөр нь холбож, дараа нь тарилга (сүүлний судал, 10 мг стрептавидин/кг) хийсэн.Дор хаяж гурван интубацийн харх (N = 3).).CSF-ийн дээжийг заасан хугацаанд цуглуулж, стрептавидины концентрацийг CSF-ийн эсрэг стрептавидины ELISA-аар хэмжсэн (nd = илрээгүй).(*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ANOVA тест дээр үндэслэсэн).(е) Хамгийн их баяжуулсан фагийн пептидийн клоны №2002 (ягаан) амин хүчлийн дарааллыг сонгон шалгаруулах 4-р шатны сонгосон фагийн пептидийн бусад клонуудтай харьцуулсан байдал.Ижил ба ижил төстэй амин хүчлийн хэсгүүдийг өнгөөр ​​ялгадаг.
Дөрөв дэх шатанд баяжуулсан бүх фагуудаас (Зураг 3б) CSF дээж авах загварт цаашид ганцаарчилсан шинжилгээнд зориулж зургаан нэр дэвшигч клоныг сонгосон.Зургаан нэр дэвшигч фаг, хоосон фаг (оруулга байхгүй) болон профагийн пептидийн сангуудыг ижил хэмжээгээр судалтай гурван CM амьтанд тарьж, фармакокинетикийг CSF (Зураг 3c) болон цусны (Нэмэлт зураг 7) шинжилгээгээр тодорхойлсон.Туршилтанд хамрагдсан бүх фагийн клонууд нь CSF тасалгааг хоосон хяналтын фагийн (#1779) түвшингээс 10-1000 дахин өндөр түвшинд онилсон.Жишээлбэл, №2020 ба №2077 клонууд нь хяналтын фагийнхаас 1000 дахин их CSF титртэй байсан.Сонгосон пептид бүрийн фармакокинетик үзүүлэлтүүд өөр өөр байдаг ч тэдгээр нь бүгд CSF-ийн өндөр чадвартай байдаг.№1903 ба №2011 клонууд цаг хугацааны явцад тогтмол буурч байгааг бид ажигласан бол №2077, №2002, 2009 клонуудын хувьд эхний 10 минутын өсөлт нь идэвхтэй тээвэрлэлтийг илтгэж болох боловч баталгаажуулах шаардлагатай.#2020, #2002, #2077 клонууд өндөр түвшинд тогтворжсон бол #2009 клонны CSF концентраци эхний өсөлтийн дараа аажмаар буурчээ.Дараа нь бид CSF нэр дэвшигч бүрийн харьцангуй давтамжийг цусан дахь концентрацитай харьцуулсан (Зураг 3d).Дээж авах бүх хугацаанд CSF-ийн нэр дэвшигч бүрийн дундаж титрийг цусны титртэй харьцуулсан нь зургаан нэр дэвшигчийн гурвынх нь цусны CSF-ээр мэдэгдэхүйц баяжуулсан болохыг харуулж байна.Сонирхолтой нь №2077 клон нь цусны тогтвортой байдлыг харуулсан (Нэмэлт Зураг 7).Пептидүүд нь фагийн тоосонцороос өөр ачааг CSF тасалгаанд идэвхтэй тээвэрлэх чадвартай гэдгийг батлахын тулд бид пептидүүд фагийн бөөмстэй холбогддог N-төгсгөлд биотиноор үүсмэл дөрвөн удирдагч пептидийг нэгтгэсэн.Биотинжүүлсэн пептидүүдийг (2002, 2009, 2020 ба 2077) стрептавидин (SA)-тай нэгтгэж, фагийн геометрийг зарим талаараа дуурайсан мультимер хэлбэрийг олж авсан.Энэхүү формат нь ачаа тээвэрлэгч уургийн пептид болох цус, тархи нугасны шингэн дэх SA-ийн өртөлтийг хэмжих боломжийг бидэнд олгосон.Хамгийн чухал нь синтетик пептидүүдийг энэхүү SA-коньюгат форматаар хэрэглэх үед фагийн өгөгдлийг ихэвчлэн хуулбарлах боломжтой байв (Зураг 3e).Холимог пептидүүд нь анхны өртөлт багатай, 48 цагийн дотор илрэх боломжгүй түвшинд илүү хурдан CSF цэвэршсэн байна.Эдгээр пептидийн фагийн клонуудыг CSF-ийн орон зайд хүргэх замын талаар ойлголттой болохын тулд бид судсаар тарьснаас хойш 1 цагийн дараа фагийн тоосонцорыг шууд илрүүлэхийн тулд иммуногистохими (IHC) ашиглан фагийн пептидийн бие даасан цохилтын нутагшуулалтад дүн шинжилгээ хийсэн.№2002, №2077, №2009 клонуудыг тархины хялгасан судсанд хүчтэй будгаар илрүүлэх боломжтой байсан бол хяналтын фаг (#1779) болон №2020 клоныг илрүүлээгүй (Нэмэлт Зураг 8).Энэ нь эдгээр пептидүүд нь BBB-ийг гатлах замаар тархинд тодорхой нөлөө үзүүлдэг болохыг харуулж байна.Энэ таамаглалыг шалгахын тулд нэмэлт нарийвчилсан дүн шинжилгээ хийх шаардлагатай, учир нь BSCFB-ийн маршрут ч бас оролцож болно.Хамгийн их баяжуулсан клоны (#2002) амин хүчлийн дарааллыг бусад сонгосон пептидүүдтэй харьцуулж үзэхэд тэдгээрийн зарим нь ижил төстэй амин хүчлийн өргөтгөлтэй байдаг нь ижил төстэй тээвэрлэлтийн механизмыг илтгэж болно (Зураг 3f).
Цусны сийвэнгийн өвөрмөц дүр төрх, цаг хугацааны явцад CSF мэдэгдэхүйц нэмэгдсэн тул фагийн дэлгэцийн клон №2077-ийг 48 цагийн урт хугацаанд үргэлжлүүлэн судалж, SA-ийн тогтвортой түвшинтэй холбоотой ажиглагдсан CSF-ийн хурдацтай өсөлтийг хуулбарлах боломжтой болсон (Зураг 4a).Бусад тодорхойлогдсон фагийн клонуудын тухайд №2077 нь тархины хялгасан судаснуудад хүчтэй будагдсан бөгөөд өндөр нарийвчлалтайгаар үзэхэд хялгасан судасны маркер лектинтэй мэдэгдэхүйц коллокализаци, паренхимийн орон зайд бага зэрэг будсан байж магадгүй (Зураг 4b).Төв мэдрэлийн системд пептидийн зуучлагч фармакологийн үр нөлөөг олж авах боломжтой эсэхийг судлахын тулд бид i) №2077 транзит пептид ба ii) BACE1 дарангуйлагч пептидийн биотинжүүлсэн хувилбаруудыг хоёр өөр харьцаагаар SA-тай хольсон туршилт хийсэн.Нэг хослолын хувьд бид зөвхөн BACE1 пептидийн дарангуйлагчийг ашигласан бол нөгөөд нь BACE1 пептидийн дарангуйлагчийг №2077 пептидтэй 1:3 харьцаатай ашигласан.Хоёр дээжийг судсаар тарьж, цус, тархи нугасны шингэний бета-амилоид пептид 40 (Abeta40) түвшинг цаг хугацааны явцад хэмжсэн.Абета40-ийг тархины паренхим дэх BACE1-ийн дарангуйллыг илэрхийлдэг тул CSF-д хэмжсэн.Хүлээгдэж буйгаар хоёр цогцолбор нь Abeta40-ийн цусан дахь түвшинг мэдэгдэхүйц бууруулсан (Зураг 4c, d).Гэсэн хэдий ч, зөвхөн пептидийн холимог агуулсан дээж №.2077 болон SA-тай нийлсэн BACE1 пептидийн дарангуйлагч нь тархи нугасны шингэн дэх Abeta40-ыг мэдэгдэхүйц бууруулсан (Зураг 4c).Өгөгдөл нь пептидийн дугаарыг харуулж байна.2077 нь 60 кДа SA уургийг төв мэдрэлийн системд зөөвөрлөх чадвартай бөгөөд BACE1 пептидийн SA-коньюгат дарангуйлагчидтай фармакологийн нөлөө үзүүлдэг.
(a) Т7 фагийн клональ тарилга (2 × 10 фаг/амьтан) CSF пептидийн №2077 (RLSSVDSDLSGC) ба тарилгагүй хяналтын фагийн (#1779) урт хугацааны фармакокинетик профайлыг дор хаяж гурван CM-интубацитай харханд харуулсан.(б) Фаг тарьсан харханд (2 × 10 10 фаг/амьтан) кортикал бичил судаснуудын төвлөрсөн микроскопийн зураг, №2077 пептид ба судаснуудын (лектин) эсрэг будгийг харуулсан.Эдгээр фагийн клонуудыг 3 харханд өгч, сэлбэхээс өмнө 1 цагийн турш эргэлдүүлэхийг зөвшөөрөв.Тархины хэсгүүдийг хувааж, T7 фагийн капсидын эсрэг поликлональ FITC шошготой эсрэгбиемүүдээр будсан.Судсаар хийх, дараа нь бэхлэхээс 10 минутын өмнө DyLight594 шошготой лектиныг судсаар тарьсан.Флюресцент зураг нь хялгасан судас болон тархины судаснуудын люмен дэх микро судас, фагуудын (ногоон) гэрэлтсэн хэсгийн лектин (улаан) будгийг харуулсан.Хуваарийн баар нь 10 μм-тэй тохирч байна.(в, г) Биотинжүүлсэн BACE1 дарангуйлагч пептидийг дангаар нь эсвэл биотинжүүлсэн транзит пептид №2077-тай хослуулан стрептавидинтэй холбож, дараа нь доод тал нь гурван сувагтай CM харханд судсаар тарьсан (10 мг стрептавидин/кг).BACE1 пептидийн дарангуйлагчийн нөлөөгөөр Aβ40-ийн бууралтыг цус (улаан) болон тархи нугасны шингэн (улбар шар) дахь Aβ1-40 ELISA-аар заасан цаг хугацааны цэгүүдэд хэмжсэн.Илүү тодорхой болгохын тулд график дээр тасархай шугамыг 100% масштабаар зурсан болно.(в) Транзит пептид №2077 ба BACE1 дарангуйлагч пептидтэй холбосон стрептавидиныг 3:1 харьцаагаар хэрэглэсэн хархуудын цусан дахь Aβ40 (улаан гурвалжин) болон тархи нугасны шингэн (улбар шар гурвалжин) хувь хэмжээгээр буурсан.(г) Стрептавидиныг зөвхөн BACE1 дарангуйлагч пептидтэй хослуулан хэрэглэсэн хархны цусан дахь Aβ40 (улаан хүрээ) болон тархи нугасны шингэн (улбар шар өнгийн дугуй) хувь хэмжээгээр буурсан.Хяналт дахь Aβ-ийн концентраци 420 пг/мл (стандарт хазайлт = 101 пг/мл) байв.
Фагийн дэлгэцийг биоанагаахын судалгааны хэд хэдэн салбарт амжилттай ашиглаж байна17.Энэ аргыг in vivo судасны олон янз байдлын судалгаа18,19, түүнчлэн тархины судаснууд20,21,22,23,24,25,26 чиглэсэн судалгаанд ашигласан.Энэхүү судалгаанд бид энэхүү сонгон шалгаруулах аргыг зөвхөн тархины судаснуудад чиглэсэн пептидийг шууд тодорхойлоход төдийгүй цус-тархины саадыг даван туулах идэвхтэй тээвэрлэлтийн шинж чанартай нэр дэвшигчдийг илрүүлэхэд өргөжүүлсэн.Одоо бид CM интубацитай хархуудад in vivo сонгох процедурын хөгжлийг тайлбарлаж, CSF-ийн шинж чанартай пептидүүдийг тодорхойлох боломжийг харуулж байна.12-мер санамсаргүй пептидийн номын санг харуулсан T7 фаг ашиглан бид T7 фаг нь тархины цусан хангамжийн саад тотгорт дасан зохицоход хангалттай жижиг (ойролцоогоор 60 нм диаметртэй)10 бөгөөд ингэснээр цус-тархины саад тотгор эсвэл choroid plexus-ийг шууд дайран өнгөрдөг болохыг харуулж чадсан.Сувагтай CM хархнаас CSF цуглуулах нь in vivo функциональ скрининг сайн хяналттай арга байсан бөгөөд олборлосон фаг нь зөвхөн судасжилттай холбогдоод зогсохгүй цус-тархины саадыг дамжих тээвэрлэгчийн үүрэг гүйцэтгэдэг болохыг бид ажигласан.Цаашилбал, цусыг нэгэн зэрэг цуглуулж, CSF болон цусны гаралтай фагуудад HTS-ийг хэрэглэснээр бид цусны өтгөрөлт, сонгон шалгаруулалтын хооронд тэлэх чадвар нь бидний CSF-ийн сонголтод нөлөөлөөгүй гэдгийг баталсан.Гэсэн хэдий ч цусны тасалгаа нь сонгон шалгаруулах процедурын нэг хэсэг юм, учир нь CSF тасалгаанд хүрэх чадвартай фагууд тархинд өөрсдийгөө баяжуулахын тулд хангалттай удаан амьд үлдэж, цусны урсгалд эргэлддэг.HTS-ийн түүхий өгөгдлөөс найдвартай дарааллын мэдээллийг гаргаж авахын тулд бид шинжилгээний ажлын урсгал дахь платформд зориулсан дарааллын алдаануудад тохируулсан шүүлтүүрүүдийг хэрэгжүүлсэн.Шинжилгээний аргад кинетик параметрүүдийг оруулснаар бид цусан дахь зэрлэг төрлийн T7 фагийн хурдацтай фармакокинетикийг (t½ ~ 28 мин) баталж, тархи нугасны шингэн дэх хагас задралын хугацааг (минутанд t½ ~ 26 мин) тодорхойлсон).Цус болон CSF-ийн ижил төстэй фармакокинетик профайлыг үл харгалзан цусан дахь фагийн концентрацийн зөвхөн 0.001% -ийг CSF-д илрүүлж чадсан нь зэрлэг төрлийн T7 фагийн цус-тархины саадыг даван туулах чадвар бага байгааг харуулж байна.Цөөн тооны клонууд төв мэдрэлийн системд хүрч чаддаг тул in vivo panning стратеги, ялангуяа цусны эргэлтээс хурдан арилдаг фагийн системд зориулсан эхний шатны сонголтын ач холбогдлыг энэ ажил онцолж байна.Тиймээс эхний шатанд номын сангийн төрөл зүйл багассан нь маш их байсан, учир нь энэ маш хатуу CSF загварт зөвхөн хязгаарлагдмал тооны клон цуглуулсан.Энэхүү in vivo эргүүлэх стратеги нь CSF тасалгаанд идэвхтэй хуримтлал үүсгэх, цусны тасалгаанд клоны амьд үлдэх, эхний 10 минутын дотор цуснаас T7 фагийн клоныг хурдан арилгах зэрэг хэд хэдэн сонголтын алхмуудыг багтаасан (Зураг 1d ба Нэмэлт зураг 4M).).Тиймээс эхний тойргийн дараа CSF-д өөр өөр фагийн клонууд тодорхойлогдсон боловч бие даасан амьтдад ижил анхны усан санг ашигласан.Энэ нь олон тооны номын сангийн гишүүдтэй эх номын сангуудыг сонгон шалгаруулах хэд хэдэн хатуу алхмуудын үр дүнд олон янз байдал мэдэгдэхүйц буурдаг болохыг харуулж байна.Тиймээс санамсаргүй үйл явдлууд нь эхний сонгон шалгаруулалтын салшгүй хэсэг болж, үр дүнд ихээхэн нөлөөлнө.Анхны номын санд байгаа олон клонууд нь CSF баяжуулах хандлагатай маш төстэй байсан байх.Гэсэн хэдий ч туршилтын ижил нөхцөлд ч гэсэн анхны сан дахь тодорхой клон тус бүрийн тоо цөөн байдаг тул сонгон шалгаруулалтын үр дүн өөр байж болно.
CSF-ээр баяжуулсан хээ нь цусанд агуулагдахаас ялгаатай.Сонирхолтой нь бид бие даасан амьтдын цусан дахь глицинээр баялаг пептид рүү шилжиж байгааг тэмдэглэв.(Зураг 1g, Нэмэлт зураг 4e, 4f).Глицин пептид агуулсан фаг нь илүү тогтвортой байж, эргэлтээс гарах магадлал багатай байж болно.Гэсэн хэдий ч эдгээр глицинээр баялаг пептидүүд нь тархи нугасны шингэний дээжинд илрээгүй нь эмчилсэн номын сангууд нэг нь цусанд, нөгөө нь тархи нугасны шингэнд хуримтлагдах хоёр өөр шат дамждаг болохыг харуулж байна.Дөрөв дэх удаагийн сонгон шалгаруулалтын үр дүнд бий болсон CSF-ээр баяжуулсан клонуудыг өргөнөөр туршиж үзсэн.Тус тусад нь туршсан бараг бүх клонууд нь хоосон хяналтын фагтай харьцуулахад CSF-ээр баяжуулсан болох нь батлагдсан.Нэг пептидийн цохилтыг (#2077) илүү нарийвчлан судалсан.Энэ нь бусад цохилттой харьцуулахад плазмын хагас задралын хугацааг харуулсан (Зураг 3d ба Нэмэлт зураг 7) бөгөөд сонирхолтой нь энэ пептид нь C төгсгөлд цистеины үлдэгдэл агуулсан байв.Пептидүүдэд цистеин нэмэх нь альбумин 29-тэй холбогдож фармакокинетик шинж чанарыг сайжруулдаг болохыг саяхан харуулсан.Энэ нь одоогоор №2077 пептидийн хувьд тодорхойгүй байгаа бөгөөд цаашид судлах шаардлагатай.Зарим пептидүүд нь CSF-ийн баяжуулалтад валентын хамаарлыг харуулсан (өгөгдлөө харуулаагүй), энэ нь T7 капсидын гадаргуугийн геометртэй холбоотой байж болох юм.Бидний ашигласан T7 систем нь фагийн тоосонцор бүрт пептид бүрийн 5-15 хувийг харуулсан.IHC-ийг хархны тархины бор гадаргад судсаар тарьсан нэр дэвшигч хар тугалга фагийн клонууд дээр хийсэн (Нэмэлт зураг 8).Өгөгдөл нь дор хаяж гурван клон (№ 2002, № 2009, № 2077) BBB-тэй харилцан үйлчлэлцсэн болохыг харуулсан.Энэхүү BBB харилцан үйлчлэл нь CSF хуримтлагдах эсвэл эдгээр клонуудыг шууд BCSFB руу шилжүүлэхэд хүргэдэг эсэхийг тодорхойлох хэвээр байна.Сонгосон пептидүүд нийлэгжиж, уургийн ачаатай холбогдох үед CSF-ийн тээвэрлэх чадвараа хадгалж үлддэгийг бид харуулж байна.N-терминалтай биотинжуулсан пептидүүдийг SA-тай холбох нь цус болон тархи нугасны шингэн дэх фагийн клоноор олж авсан үр дүнг үндсэндээ давтдаг (Зураг 3e).Эцэст нь бид хар тугалганы пептид №2077 нь SA-тай нийлсэн BACE1-ийн биотинжүүлсэн пептидийн дарангуйлагчийн тархины үйл ажиллагааг дэмжиж, CSF дахь Abeta40-ийн түвшинг мэдэгдэхүйц бууруулж төв мэдрэлийн системд тодорхой фармакодинамик нөлөө үзүүлдэг болохыг харуулж байна (Зураг 4).Бид бүх хитүүдийн пептидийн дарааллын гомологийн хайлтыг хийснээр мэдээллийн санд ямар ч гомологийг тодорхойлж чадсангүй.T7 номын сангийн хэмжээ нь ойролцоогоор 109, харин 12-mers-ийн онолын номын сангийн хэмжээ нь 4 x 1015 гэдгийг анхаарах нь чухал. Тиймээс бид 12-мер пептидийн номын сангийн олон талт орон зайн багахан хэсгийг л сонгосон бөгөөд энэ нь зэргэлдээх дарааллын зайг үнэлэх замаар илүү оновчтой пептидүүдийг тодорхойлох боломжтой гэсэн үг юм.Таамаглалаар бид эдгээр пептидийн байгалийн гомологийг олж чадаагүйн нэг шалтгаан нь хувьслын явцад тодорхой пептидийн сэдлийг тархинд хяналтгүй нэвтрэхээс урьдчилан сэргийлэхийн тулд сонголтоо хассан байж магадгүй юм.
Хамтдаа авч үзвэл бидний үр дүн нь тархины судасны саадыг in vivo-д илүү нарийвчлан тодорхойлох, тээвэрлэх системийг тодорхойлох цаашдын ажилд үндэс суурь болж өгдөг.Энэ аргын үндсэн тохиргоо нь зөвхөн тархины судсыг холбох шинж чанартай клонуудыг тодорхойлох функциональ сонгон шалгаруулах стратеги дээр суурилдаг бөгөөд амжилттай клонууд нь төв мэдрэлийн тогтолцооны тасалгаа руу in vivo биологийн саад тотгорыг даван туулах дотоод идэвхжилтэй байх чухал үе шатыг агуулдаг.Эдгээр пептидийн тээвэрлэлтийн механизм, тэдгээрийн тархины бүсэд өвөрмөц бичил судастай холбогдохыг илүүд үздэгийг тодруулахад оршино.Энэ нь BBB болон рецепторыг зөөвөрлөх шинэ замыг нээхэд хүргэж болзошгүй юм.Тодорхойлсон пептидүүд нь тархины судасны рецепторууд эсвэл BBB эсвэл BCSFB-ээр дамждаг эргэлтийн лигандуудтай шууд холбогдож чадна гэж бид найдаж байна.Энэ ажилд илрүүлсэн CSF-ийн тээвэрлэлтийн үйл ажиллагаа бүхий пептидийн векторуудыг цаашид судлах болно.Бид одоогоор эдгээр пептидийн тархины өвөрмөц байдлыг BBB ба/эсвэл BCSFB-ийг давах чадварыг судалж байна.Эдгээр шинэ пептидүүд нь шинэ рецепторууд эсвэл замуудыг илрүүлэх, биологийн бодис зэрэг макромолекулуудыг тархинд хүргэх өндөр үр ашигтай шинэ платформуудыг хөгжүүлэхэд маш үнэ цэнэтэй хэрэгсэл болно.
Өмнө нь тайлбарласан аргын өөрчлөлтийг ашиглан том цистерна (CM) суваг хийнэ.Мэдээ алдуулахгүй Wistar хархыг (200-350 гр) стереотаксик аппарат дээр суурилуулж, гавлын ясыг ил гаргахын тулд хуссан, асептик байдлаар бэлтгэсэн хуйханд дунд зүсэлт хийсэн.Дээд талын туузны хэсэгт хоёр цооног өрөмдөж, бэхэлгээний боолтыг нүхэнд бэхлэнэ.Зэвэрдэггүй ган сувгийг CM-д стереотактик чиглүүлэхийн тулд хажуугийн Дагзны оройд нэмэлт нүх өрөмдсөн.Сувагны эргэн тойронд шүдний цемент түрхэж, боолтоор бэхлэнэ.Фотооор хатгаж, цементээр хатууруулсны дараа арьсны шархыг 4/0 супрамидын оёдолоор битүүмжилсэн.Суваг зөв байрлуулсан нь тархи нугасны шингэн (CSF) аяндаа алдагдах замаар нотлогддог.Хархыг стереотаксик аппаратаас салгаж, мэс заслын дараах зохих эмчилгээ, өвдөлт намдаах эмчилгээ хийлгэж, тархи нугасны шингэнд цусны шинж тэмдэг илрэх хүртэл дор хаяж нэг долоо хоног эдгэрнэ.Wistar хархыг (Crl:WI/Han) Чарльз голоос (Франц) авсан.Бүх хархыг эмгэг төрүүлэгчгүй тодорхой нөхцөлд байлгасан.Амьтанд хийсэн бүх туршилтыг Швейцарийн Базель хотын мал эмнэлгийн албанаас зөвшөөрч, Амьтны тусгай зөвшөөрлийн №2474 (Тархи нугасны шингэн ба хархны тархи дахь эмчилгээний нэр дэвшигчдийн түвшинг хэмжих замаар идэвхтэй тархины тээвэрлэлтийн үнэлгээ)-ийн дагуу хийсэн.
Хархыг гартаа CM сувгаар болгоомжтой байлга.Сувагнаас Датураг аваад аяндаа урсаж буй 10 мкл тархи нугасны шингэнийг цуглуулна.Сувгийн нэвтрэлт нь эцэстээ эвдэрсэн тул энэ судалгаанд зөвхөн цусны бохирдол, өнгө өөрчлөгдсөн шинж тэмдэггүй тархи нугасны шингэний тунгалаг дээжийг оруулсан болно.Үүний зэрэгцээ сүүлний үзүүр дэх жижиг зүслэгээс ойролцоогоор 10-20 мкл цусыг гепарин (Сигма-Алдрих) бүхий хоолой болгон авсан.T7 фаг судсаар тарьсны дараа CSF болон цусыг янз бүрийн цэгүүдэд цуглуулсан.CSF-ийн дээж бүрийг цуглуулахын өмнө ойролцоогоор 5-10 мкл шингэнийг хаясан бөгөөд энэ нь катетерийн үхсэн хэмжээтэй тохирч байна.
Номын сангуудыг T7Select системийн гарын авлагад тайлбарласны дагуу T7Select 10-3b векторыг ашиглан үүсгэсэн (Novagen, Rosenberg нар, InNovations 6, 1-6, 1996).Товчхондоо, санамсаргүй 12-мер ДНХ-ийн оруулгыг дараах форматаар нэгтгэв.
NNK кодоныг давхар зогсоох кодонууд болон оруулга дахь амин хүчлийн хэт их илэрхийлэлээс зайлсхийх зорилгоор ашигласан.N нь нуклеотид бүрийн гараар холилдсон эквимоляр харьцаа, K нь аденин ба цитозины нуклеотидын гараар холилдсон эквимоляр харьцаа юм.Нэг судалтай бүсүүдийг dNTP (Novagen) болон Klenow enzyme (New England Biolabs) -аар Кленов буферт (New England Biolabs) 3 цагийн турш 37°С-т инкубацийн аргаар давхар судалтай ДНХ болгон хувиргав.Урвалын дараа хоёр хэлхээтэй ДНХ-ийг EtOH хур тунадасны аргаар олж авсан.Үүссэн ДНХ-г хязгаарлах ферментүүд EcoRI болон HindIII (хоёулаа Roche-ээс) шингээж авсан.Хагарч, цэвэршүүлсэн (QIAquick, Qiagen) оруулгыг (T4 ligase, New England Biolabs) дараа нь 10В капсидын генийн 348-р амин хүчлийн дараа урьдчилан задалсан T7 вектор руу холбосон.Холбох урвалыг in vitro савлахаас өмнө 16 хэмд 18 цагийн турш өсгөвөрлөсөн.Фагийн савлагааг in vitro T7Select 10-3b клонжуулах хэрэгсэлд (Novagen) хавсаргасан зааврын дагуу гүйцэтгэсэн бөгөөд савлагааны уусмалыг гэдэсний савханцар (BLT5615, Novagen) ашиглан задрахын тулд нэг удаа олшруулсан.Лизатуудыг центрифуг хийж, титрлээд -80°С-т глицеролын уусмал болгон хөлдөөв.
Өмчлөлийн 454/Roche-amplicon хайлуулах праймерыг ашиглан шөл эсвэл хавтан дээр олшруулсан фагийн хувьсах бүсийн ПГУ-ын шууд олшруулалт.Урагш нийлүүлэх праймер нь хувьсах бүс (NNK) 12 (загварт хамаарах), GS FLX Титан адаптер А, дөрвөн үндсэн номын сангийн түлхүүрийн дарааллыг (TCAG) агуулдаг (Нэмэлт Зураг 1a):
Урвуу хайлуулах праймер нь мөн эмульсийн ПГУ-ын үед клонол олшруулахад шаардлагатай бөмбөлгүүдийг барихад зориулагдсан биотин ба GS FLX титан адаптер В-ийг агуулдаг.
Дараа нь ампликонуудыг 454 GS-FLX Titanium протоколын дагуу 454/Roche пиростик дараалалд хамруулсан.Гараар Sanger дараалал тогтоохын тулд (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA Analyzer) T7 фагийн ДНХ-ийг ПГУ-аар олшруулж, дараах праймер хосоор дараалуулсан:
Тусдаа товрууны оруулгад Roche Fast Start ДНХ Полимеразын хэрэгсэл (үйлдвэрлэгчийн зааврын дагуу) ашиглан ПГУ-ын олшруулалт хийсэн.Халуун эхлэл (95 ° C-д 10 минут) ба 35 удаа нэмэгдүүлэх цикл (95 ° C-д 50 сек, 50 ° C-д 1 минут, 72 ° C-д 1 минут) хийнэ.
Номын сангаас фаг, зэрлэг төрлийн фаг, CSF болон цуснаас аврагдсан фаг эсвэл бие даасан клонуудыг сүрьеэгийн шөл (Sigma Aldrich) эсвэл 500 см2 аяганд (Thermo Scientific) Escherichia coli BL5615-д 37°C-т 4 цагийн турш өсгөв.Хавтангуудыг Tris-EDTA буферээр (Fluka Analytical) зайлж эсвэл ариутгасан пипеткийн үзүүрээр товруу цуглуулах замаар ялтсуудаас фаг гаргаж авсан.Фагуудыг өсгөвөрийн супернатант буюу экстракцийн буферээс нэг удаагийн полиэтилен гликол (PEG 8000) тунадас (Промега) бүхий тусгаарлаж, Tris-EDTA буферт дахин түдгэлзүүлсэн.
Олшруулсан фагийг судсаар (IV) тарихаас өмнө (500 мкл/амьтанд) эндотоксин арилгах бөмбөлгүүдийг (Miltenyi Biotec) ашиглан 2-3 удаагийн эндотоксиныг зайлуулсан.Эхний шатанд 2 × 1012 фагуудыг нэвтрүүлсэн;хоёрдугаарт, 2 × 1010 фаг;гурав, дөрөв дэх сонголтын шатанд нэг амьтанд 2×109 фаг.Заасан хугацаанд цуглуулсан CSF болон цусны дээж дэх фагийн агууламжийг үйлдвэрлэгчийн зааврын дагуу товруу тоолох замаар тодорхойлсон (T7Select системийн гарын авлага).Фагийн сонгон шалгаруулалтыг цэвэршүүлсэн сангуудыг сүүлний судсанд судсаар тарих, эсвэл өмнөх сонгон шалгаруулалтын үе дэх CSF-ээс гаргаж авсан фагийг дахин тарих замаар гүйцэтгэсэн ба дараагийн хураалтыг 10 мин, 30 мин, 60 мин, 90 мин, 120 мин, 180 мин, цусны дээж 240F-д тус тус хийсэн.Сонгосон хоёр салбарыг тус тусад нь хадгалж, эхний гурван шатны шалгаруулалтын явцад дүн шинжилгээ хийсэн нийт дөрвөн үе in vivo panning хийсэн.Эхний хоёр шатны сонгон шалгаруулалтаас CSF-ээс гаргаж авсан бүх фагийн оруулгад 454/Roche пироскевенц хамрагдсан бол сүүлийн хоёр шатны шалгаруулалтаас CSF-ээс гаргаж авсан бүх клоныг гараар дараалалд оруулсан.Эхний шатны сонгон шалгаруулалтын бүх цусны фагуудыг мөн 454/Roche пиросиквенцийн шинжилгээнд хамруулсан.Фагийн клоныг тарихад сонгосон фагуудыг E. coli (BL5615)-д 500 см2 хавтан дээр 37°С-т 4 цагийн турш өсгөв.Тус тусад нь сонгож, гараар дараалсан клонуудыг сүрьеэгийн орчинд үржүүлэв.Фагийн олборлолт, цэвэршүүлэх, эндотоксиныг зайлуулсны дараа (дээр дурдсанчлан) 300 мкл хэмжээтэй 2 × 1010 фаг/амьтны сүүлний нэг судсанд судсаар тарьсан.
Дараалсан өгөгдлийг урьдчилан боловсруулах, чанарын шүүлтүүр хийх.Raw 454/Roche өгөгдлийг нийлүүлэгчийн программ хангамжийг ашиглан хоёртын стандарт урсгалын зургийн форматаас (sff) Pearson хүний ​​уншигдах формат руу (fasta) хөрвүүлсэн.Нуклеотидын дарааллын цаашдын боловсруулалтыг доор тайлбарласны дагуу өмчлөлийн C программууд болон скриптүүд (хэрэглээгүй програм хангамжийн багц) ашиглан гүйцэтгэсэн.Анхдагч өгөгдлийн шинжилгээнд олон үе шаттай шүүлтүүрийн хатуу журам орно.Хүчинтэй 12мер оруулгатай ДНХ-ийн дараалал агуулаагүй уншлагыг шүүж авахын тулд уншлагыг Neuloschun test ашиглан эхлэх шошго (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), зогсоох шошго (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) болон дэвсгэр оруулга (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCG)-д дараалуулсан.тэгшитгэл бүрт 2 хүртэлх зөрчил гаргах боломжийг олгодог31.Тиймээс эхлэх, зогсоох шошгогүй унших болон дэвсгэр оруулга агуулсан уншлага, өөрөөр хэлбэл зөвшөөрөгдөх тооноос хэтэрсэн зэрэгцүүлэлтийг сангаас хассан.Үлдсэн уншилтын хувьд, эхлэлийн тэмдэгээс эхлээд зогсолтын тэмдэг хүртэл дуусдаг N-mer ДНХ-ийн дарааллыг анхны уншлагын дарааллаас хасч, цааш нь боловсруулсан (цаашид "оруулга" гэх).Оруулахыг орчуулсны дараа праймерын 5′ төгсгөлд байрлах эхний зогсолтын кодоноос хойшхи хэсгийг оруулгаас хасна.Үүнээс гадна праймерын 3′ төгсгөлд бүрэн бус кодон үүсэхэд хүргэдэг нуклеотидуудыг мөн устгасан.Зөвхөн дэвсгэр дараалал агуулсан оруулгыг оруулахгүйн тулд "PAG" амин хүчлийн загвараар эхэлсэн орчуулагдсан оруулгыг мөн хассан.3-аас бага амин хүчлийн урттай пептидүүдийг номын сангаас хасав.Эцэст нь оруулгын сан дахь илүүдлийг арилгаж, өвөрмөц оруулга бүрийн давтамжийг тодорхойлно.Энэхүү шинжилгээний үр дүнд нуклеотидын дараалал (оруулга) ба тэдгээрийн (уншсан) давтамжийн жагсаалтыг оруулсан болно (Нэмэлт Зураг 1c ба 2).
Бүлэг N-mer ДНХ-ийн оруулгуудыг дарааллын ижил төстэй байдлаар нь: 454/Рошын тусгай дарааллын алдааг (жишээ нь, гомополимер өргөтгөлүүдийг дараалалд оруулахтай холбоотой асуудлууд) арилгах, ач холбогдол багатай илүүдлийг арилгахын тулд өмнө нь шүүсэн N-mer ДНХ-ийн дарааллын оруулгыг (оруулгыг) ижил төстэй байдлаар нь ангилдаг.Дараах байдлаар тодорхойлогдсон давталтын алгоритмыг ашиглан оруулах (2 хүртэл тохирохгүй суурийг зөвшөөрнө): оруулгыг эхлээд давтамжаар нь (хамгийн ихээс бага хүртэл), хэрэв тэдгээр нь ижил байвал хоёрдогч байдлаар уртаар (хамгийн уртаас богино) эрэмбэлнэ.Тиймээс хамгийн олон удаа, хамгийн урт оруулгууд нь эхний "бүлэг" -ийг тодорхойлдог.Бүлгийн давтамжийг гол давтамжаар тохируулсан.Дараа нь эрэмбэлэгдсэн жагсаалтад үлдсэн оруулга бүрийг Needleman-Wunsch-ийн хос шугамаар бүлэгт нэмэхийг оролдсон.Хэрэв зэрэгцүүлэхэд тохирохгүй байх, оруулах, хассан тоо нь 2-оос хэтрээгүй бол оруулгыг бүлэгт нэмж оруулах ба нийт бүлгийн давтамжийг хэр олон удаа нэмсэнээр нэмэгдүүлнэ.Бүлэгт нэмсэн оруулга нь ашигласан гэж тэмдэглэгдсэн бөгөөд цаашдын боловсруулалтаас хасагдана.Хэрэв оруулах дарааллыг аль хэдийн байгаа бүлэгт нэмэх боломжгүй бол оруулах дарааллыг тохирох давтамжтай шинэ бүлэг үүсгэхэд ашиглаж, ашигласан гэж тэмдэглэнэ.Оруулах дараалал бүрийг шинэ бүлэг үүсгэхэд ашигласан эсвэл аль хэдийн байгаа бүлэгт оруулах боломжтой үед давталт дуусна.Эцсийн эцэст, нуклеотидуудаас бүрдсэн бүлэглэсэн оруулгууд нь эцэст нь пептидийн дараалал (пептидийн номын сан) болж хувирдаг.Энэхүү шинжилгээний үр дүн нь дараалсан уншилтын тоог бүрдүүлдэг оруулгын багц ба тэдгээрийн харгалзах давтамж юм (Нэмэлт зураг 2).
Motif Generation: Өвөрмөц пептидийн жагсаалтад үндэслэн доор үзүүлсэн шиг бүх боломжит амин хүчлийн загваруудыг (aa) агуулсан номын сан үүсгэсэн.3-р урттай боломжит загвар бүрийг пептидээс гаргаж авсан бөгөөд түүний урвуу загварыг бүх хэв маягийг (трипептид) агуулсан нийтлэг мотив номын сангийн хамт нэмсэн.Маш их давтагдах хээтэй номын сангуудыг дараалуулж, илүүдлийг арилгасан.Дараа нь мотив номын сан дахь трипептид бүрийн хувьд бид тооцооллын хэрэгслээр номын санд байгаа эсэхийг шалгасан.Энэ тохиолдолд олдсон мотивийн трипептид агуулсан пептидийн давтамжийг нэмж, мотивийн номын санд байгаа мотивд онооно ("сэдгийн тоо").Сэдвийг үүсгэх үр дүн нь уншсан зүйлсийг шүүж, бүлэглэж, орчуулах үед харгалзах сэдвийг үүсгэдэг трипептидүүдийн (сүүд) болон тэдгээрийн тус тусын утгуудыг агуулсан хоёр хэмжээст массив юм.Дээр дэлгэрэнгүй тайлбарласны дагуу хэмжүүрүүд.
Мотивийн тоо болон харгалзах тараах талбайг хэвийн болгох: Дээж тус бүрийн хээний тоог ашиглан хэвийн болгосон.
Энд ni нь i сэдвийг агуулсан уншсан тоо юм.Тиймээс, vi нь дээж дэх i motif агуулсан уншилтын (эсвэл пептидүүдийн) давтамжийн хувийг илэрхийлнэ.Нормчлогдоогүй тооны мотивийн P утгыг Фишерийн нарийн тест ашиглан тооцоолсон.Мотивийн тооны коррелограммын тухайд Спирманы хамаарлыг R-тэй мотивуудын хэвийн тоог ашиглан тооцоолсон.
Пептидийн номын сангийн байрлал бүрт амин хүчлүүдийн агуулгыг дүрслэн харуулахын тулд 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com) вэб логограммуудыг бүтээсэн.Нэгдүгээрт, 12-мер пептидийн байрлал бүрийн амин хүчлүүдийн агууламж 20х12 матрицад хадгалагддаг.Дараа нь байрлал бүрт ижил харьцангуй амин хүчлийн агуулгыг агуулсан 1000 пептидийн багцыг fasta-sequence форматаар үүсгэж, 3-р вэб лого руу оруулснаар байрлал тус бүрт харьцангуй амин хүчлийн агуулгын график дүрслэлийг үүсгэдэг.өгөгдсөн пептидийн номын сангийн хувьд.Олон хэмжээст өгөгдлийн багцыг дүрслэн харуулахын тулд дулааны зураглалыг R-д дотооддоо боловсруулсан хэрэглүүрийг (biosHeatmap, хараахан гараагүй байгаа R багц) ашиглан бүтээсэн.Дулааны зурагт үзүүлсэн дендрограммуудыг Евклидийн зайны хэмжүүрээр Уордын шаталсан кластерын аргыг ашиглан тооцоолсон.Мотивийн онооны өгөгдлийн статистик дүн шинжилгээ хийхдээ Фишерийн нарийн тестийг ашиглан хэвийн бус онооны P утгыг тооцоолсон.Бусад өгөгдлийн багцын P-утгыг Оюутны t-тест эсвэл ANOVA ашиглан R-д тооцоолсон.
Сонгосон фагийн клонууд болон оруулгагүй фагуудыг сүүлний судсаар (300 мкл PBS-д 2 × 1010 фаг/амьтан) судсаар тарьсан.Судсаар хийхээс 10 минутын өмнө ижил амьтдад 100 мкл DyLight594 шошготой лектин (Vector Laboratories Inc., DL-1177) судсаар тарьсан.Фагийн тарилга хийснээс хойш 60 минутын дараа хархуудад 50 мл PBS, дараа нь 50 мл 4% PFA/PBS-ийг зүрхээр нь нэвчүүлсэн.Тархины дээжийг 4% PFA/PBS-т шөнийн турш нэмж тогтоож, 30% сахарозонд 4°С-т шөнийн турш дэвтээв.Дээжийг OCT хольцонд хөлдөөсөн байна.Хөлдөөсөн дээжийн иммуногистохимийн шинжилгээг тасалгааны температурт 30 μм хэмжээтэй криозод 1% BSA-аар хааж, T7 фагийн (Novus NB 600-376A) эсрэг поликлональ FITC шошготой эсрэгбиемүүдээр 4 ° C температурт өсгөвөрлөсөн.Шөнийн турш өсгөвөрлөнө.Эцэст нь зүсмэлүүдийг PBS-ээр 3 удаа угааж, төвлөрсөн лазер микроскопоор (Leica TCS SP5) шалгасан.
Хамгийн багадаа 98% цэвэршилттэй бүх пептидүүдийг АНУ-ын GenScript-ээр нийлэгжүүлж, биотинжуулж, лиофилижүүлсэн.Биотин нь N-төгсгөлд нэмэлт гурвалсан глицин зайлагчаар холбогддог.Масс спектрометр ашиглан бүх пептидийг шалгана уу.
Стрептавидиныг (Sigma S0677) DMSO/incubat-т 5-10% -ийн биотинжүүлсэн пептид, биотинжүүлсэн BACE1 дарангуйлагч пептид, эсвэл биотинжүүлсэн BACE1 дарангуйлагч пептид ба BACE1 дарангуйлагч пептидийн 5 дахин их хэмжээний эквимоляртай хольсон.Тарилгын өмнө тасалгааны температурт 1 цаг байлгана.Стрептавидинтэй хавсарсан пептидүүдийг 10 мг/кг тунгаар тархины хөндийтэй хархын сүүлний судлын аль нэгэнд нь судсаар тарьсан.
Стрептавидин-пептидийн цогцолборын концентрацийг ELISA-аар үнэлэв.Nunc Maxisorp микротитр хавтангууд (Сигма) 1.5 мкг/мл хулганы эсрэг стрептавидины эсрэгбие (Thermo, MA1-20011) -аар 4°С-т шөнийн турш бүрсэн.Тасалгааны температурт 2 цагийн турш блоклосны дараа (блоклох буфер: 140 нМ NaCL, 5 мм EDTA, 0.05% NP40, 0.25% желатин, 1% BSA) хавтанг 0.05% Tween-20/PBS (угаах буфер) -аар угааж, 3 секундын турш шахаж, дээжийг шахаж, шингэрүүлсэн. 1:10,000, CSF 1:115).Дараа нь хавтанг илрүүлэгч эсрэгбиетэй (1 мкг/мл, стрептавидин-HRP, Novus NB120-7239) 4°С-т шөнийн турш өсгөвөрлөсөн.Угаах гурван алхамын дараа стрептавидиныг TMB субстратын уусмалд (Roche) 20 минутын турш өсгөвөрлөх замаар илрүүлсэн.1M H2SO4-ээр өнгө үүсэхийг зогсоосны дараа 450 нм-ийн гэрэл шингээлтийг хэмжинэ.
Стрептавидин-пептид-BACE1 дарангуйлагчийн цогцолборын үйл ажиллагааг үйлдвэрлэгчийн протокол (Wako, 294-64701) дагуу Aβ(1-40) ELISA-аар үнэлэв.Товчхондоо, CSF дээжийг стандарт шингэрүүлэгч (1:23) -д шингэлж, BNT77 барих эсрэгбиемээр бүрсэн 96 цооногийн ялтсуудад 4°С-т шөнийн турш өсгөвөрлөсөн.Угаалгын таван алхам хийсний дараа HRP-тэй холбосон BA27 эсрэгбие нэмж, 4°С-т 2 цагийн турш өсгөвөрлөж, дараа нь таван угаах алхам хийсэн.Aβ(1-40) нь өрөөний температурт 30 минутын турш TMB уусмалд өсгөвөрлөх замаар илрүүлсэн.Өнгөний хөгжлийг зогсоох уусмалаар зогсоосны дараа шингээлтийг 450 нм-д хэмжинэ.Плазмын дээжийг Aβ(1-40) ELISA-аас өмнө хатуу фазын олборлолтод хамруулсан.Цусны сийвэнг 0.2% DEA (Sigma) дээр 96 цооногтой хавтан дээр нэмж, тасалгааны температурт 30 минутын турш өсгөвөрлөнө.SPE хавтангуудыг (Oasis, 186000679) ус, 100% метанолоор дараалан угаасны дараа плазмын дээжийг SPE хавтан дээр нэмж, бүх шингэнийг зайлуулсан.Дээжийг угааж (эхлээд 5% метанол, дараа нь 30% метанол), 2% NH4OH/90% метанолоор угаана.Элюатыг 55°С-т тогтмол N2 гүйдлээр 99 минутын турш хатаасны дараа дээжийг стандарт шингэрүүлэгчээр багасгаж, дээр дурдсанчлан Aβ(1–40) хэмжсэн.
Энэ өгүүллийг хэрхэн иш татах вэ: Urich, E. et al.In vivo-д тодорхойлогдсон дамжин өнгөрөх пептидүүдийг ашиглан тархинд ачаа хүргэх.шинжлэх ухаан.5, 14104;doi: 10.1038/srep14104 (2015).
Likhota J., Skjorringe T., Thomsen LB болон Moos T. Зорилтот эмчилгээг ашиглан тархинд макромолекулын эмийг хүргэх.Neurochemistry сэтгүүл 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C., and Martinez-Martinez, P. Цус-тархины саадыг дамжин пептид ба уургийн эмийг хүргэх.Prog Neurobiol 87, 212-251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
Пардридж, В.М. Цус-тархины саад: тархины эмийн хөгжилд саад тотгор учруулдаг.NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
Johanson, KE, Duncan, JA, Stopa, EG, and Byrd, A. Choroid plexus-CSF замаар тархи руу чиглэсэн эмийн дамжуулалтыг сайжруулах хэтийн төлөв.Эмийн судалгаа 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
Пардридж, WM Тархи хүргэх зорилгоор молекулын трояны морины тусламжтайгаар био эм бэлдмэлийг шинэчлэх.Bioconjug Chem 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008).
Пардридж, WM рецептороор дамждаг пептидийг цус-тархины саадыг даван туулах.Endocr Rev. 7, 314–330 (1986).
Niewoehner, J. et al.Нэг валент молекулын шаттл ашиглан тархины нэвчилт, эмчилгээний эсрэгбиеийн үр нөлөөг нэмэгдүүлэх.Нейрон 81, 49-60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
Bien-Lee, N. et al.Трансферрин рецептор (TfR) тээвэрлэлт нь TfR эсрэгбиеийн ойрын хувилбаруудын тархинд шингээлтийг тодорхойлдог.J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).