Nature.com сайтаар зочилсонд баярлалаа. Та хязгаарлагдмал CSS дэмжлэгтэй хөтчийн хувилбарыг ашиглаж байна. Хамгийн сайн ашиглахын тулд бид танд шинэчилсэн хөтөч ашиглахыг зөвлөж байна (эсвэл Internet Explorer-д нийцтэй байдлын горимыг идэвхгүй болгох). Нэмж дурдахад, байнгын дэмжлэгийг хангахын тулд бид сайтыг хэв маяг, JavaScript-гүй харуулж байна.
Гурван слайдаас бүрдсэн тойргийг нэг дор харуулна. Өмнөх болон Дараагийн товчийг ашиглан гурван слайдыг нэг дор гүйлгэх, эсвэл төгсгөлд байрлах гулсагч товчлуурыг ашиглан гурван слайдыг нэг дор гүйлгэж болно.
Өөрөө угсардаг мэдрэлийн органеллууд нь хүний ​​хөгжил, өвчний загварчлалыг хийх ирээдүйтэй in vitro платформ юм. Гэсэн хэдий ч органоидууд нь in vivo-д байдаг холболтгүй бөгөөд энэ нь боловсрох явцыг хязгаарлаж, зан төлөвийг хянадаг бусад хэлхээнүүдтэй нэгдэхээс сэргийлдэг. Нярайн нүцгэн хархны соматосенсорын бор гадаргад шилжүүлэн суулгасан хүний ​​үүдэл эсээс гаралтай кортикал органоидууд нь мэдрэхүйн болон сэдэлтэй холбоотой хэлхээнд нэгдэх боловсорч гүйцсэн эсийн төрлийг хөгжүүлж байгааг энд харуулав. MRI нь хэд хэдэн үүдэл эсийн шугам, амьтдад шилжүүлэн суулгасны дараах органоид өсөлтийг илрүүлсэн бол нэг цөмт шинжилгээ нь кортикогенезийн явц, үйл ажиллагаанаас хамааралтай транскрипцийн хөтөлбөрийг илрүүлсэн. Үнэн хэрэгтээ шилжүүлэн суулгасан кортикал мэдрэлийн эсүүд нь in vitro-тэй харьцуулахад илүү нарийн төвөгтэй морфологи, синаптик, дотоод мембраны шинж чанарыг харуулдаг бөгөөд энэ нь Тимотийн синдромтой өвчтөнүүдэд мэдрэлийн эсийн согогийг илрүүлэх боломжийг олгодог. Анатомийн болон функциональ судалгаанаас үзэхэд шилжүүлэн суулгасан органеллууд таламокортик болон кортикокортикал оролтыг хүлээн авдаг бөгөөд мэдрэлийн үйл ажиллагааны in vivo бичлэг нь эдгээр оролтууд нь хүний ​​эсэд мэдрэхүйн хариу урвал үүсгэдэг болохыг харуулж байна. Эцэст нь, кортикал органоидууд нь хархны тархи даяар аксонуудыг сунгаж, тэдгээрийн оптогенетик идэвхжүүлэлт нь шагналыг эрэлхийлэх зан үйлд хүргэдэг. Тиймээс шилжүүлэн суулгасан хүний ​​бор гадаргын мэдрэлийн эсүүд төлөвшиж, зан төлөвийг хянадаг хостын хэлхээнд оролцдог. Энэ арга нь өвчтөнөөс гаралтай эсүүдэд өөр аргаар илрүүлэх боломжгүй хэлхээний түвшний фенотипийг илрүүлэхэд тусална гэж бид найдаж байна.
Хөгжиж буй хүний ​​тархи нь мэдрэхүйн туршлагаар улам боловсронгуй болсон үйл ажиллагааны мэдрэлийн хэлхээ үүсгэхийн тулд эсүүд үржиж, ялгарч, шилжин суурьшиж, холбогддог өөрийгөө зохион байгуулах гайхалтай үйл явц юм. Хүний тархины хөгжлийг, ялангуяа өвчний нөхцөл байдлыг ойлгоход тулгарч буй гол асуудал бол тархины эдэд нэвтрэх боломжгүй байдаг. Хүний бор гадаргын органоидууд (hCO; мөн хүний ​​бор гадаргын бөмбөрцөг гэгддэг) зэрэг өөрийгөө зохион байгуулдаг органеллууд 2,3,4,5,6 үүсгэдэг. Гэсэн хэдий ч хэд хэдэн хязгаарлалт нь мэдрэлийн хэлхээний хөгжил, үйл ажиллагааг ойлгоход илүү өргөн хүрээний хэрэглээг хязгаарладаг. Ялангуяа, in vivo тодорхой бичил орчин, мэдрэхүйн орц байхгүйгээс hCO боловсорч гүйцсэн эсэх нь тодорхойгүй байна. Нэмж дурдахад hCOs нь зан үйлийн үр дагаврыг бий болгох хэлхээнд нэгтгэгдээгүй тул генетикийн нарийн төвөгтэй болон зан үйлийн мэдрэлийн мэдрэлийн эмгэгийг загварчлахад ашиглах нь одоогоор хязгаарлагдмал байна.
HCO-г бүрэн бүтэн амьд тархинд шилжүүлэн суулгах нь эдгээр хязгаарлалтыг даван туулж чадна. Өмнөх судалгаагаар мэрэгч амьтдын бор гадаргад шилжүүлэн суулгасан хүний ​​мэдрэлийн эсүүд амьд үлдэж, проекцоо хийж, мэрэгч амьтдын эсүүдтэй харилцах чадвартай болохыг харуулсан7,8,9,10,11,12. Гэсэн хэдий ч эдгээр туршилтыг ихэвчлэн насанд хүрсэн амьтад дээр хийдэг бөгөөд энэ нь синаптик ба аксоны интеграцийг хязгаарлаж болзошгүй юм. Энд бид хуванцар хөгжлийн эхний үе шатанд дархлал хомсдолтой хархны анхдагч соматосенсорын бор гадаргын (S1) hiPS эсээс гаргаж авсан 3D hCO-г шилжүүлэн суулгах парадигмын талаар тайлбарлав. Шилжүүлэн суулгасан hCO (t-hCO) мэдрэлийн эсүүд ихээхэн боловсорч, мэдрэхүйн хариу урвал үүсгэдэг таламокортикал болон кортикал-кортикал оролтуудыг хүлээн авч, оготны тархинд аксональ проекцийг сунгаж, шагналыг эрэлхийлдэг. t-hCO-ийн боловсорч гүйцсэн хугацааг уртасгаснаар хүчдэлд мэдрэмтгий L хэлбэрийн CaV1.2 кальцийн сувгийн (CACNA1C-ээр кодлогдсон) мутациас үүдэлтэй хүнд генетикийн эмгэг болох Тимотийн хам шинж (TS) бүхий өвчтөнүүдэд мэдрэлийн эсийн гажиг илэрсэн.
In vivo хэлхээн дэх хүний ​​кортикал нейроныг судлахын тулд бид стереотактик байдлаар бүрэн бүтэн 3D hCO-г төрсний дараах эрт үеийн атимик хархуудын S1-д шилжүүлэн суулгасан (Зураг 1a болон Зураг 1a-c-ийн өргөтгөсөн өгөгдөл). Энэ үед thalamokortical болон corticocortical axonal проекцууд S1 innervation дуусаагүй байна (ref. 13). Тиймээс энэ арга нь t-hCO интеграцийг нэмэгдүүлэхийн зэрэгцээ эндоген хэлхээнд үзүүлэх нөлөөллийг багасгах зорилготой юм. Амьд амьтад дахь t-hCO-ийн байршлыг төсөөлөхийн тулд бид шилжүүлэн суулгаснаас хойш 2-3 сарын дараа хархуудын T2 жинтэй MRI тархины сэргээн босголтыг хийсэн (Зураг 1b ба өргөтгөсөн өгөгдөл, Зураг 1d). t-hCO-г хялбархан ажиглаж, t-hCO-ийн эзэлхүүний хэмжилтүүд нь тогтмол зүсмэлүүдээс тооцоолсонтой төстэй байсан (Өргөтгөсөн өгөгдлийн зураг 1d,e; P > 0.05). t-hCO-г хялбархан ажиглаж, t-hCO-ийн эзэлхүүний хэмжилтүүд нь тогтмол зүсмэлүүдээс тооцоолсонтой төстэй байсан (Өргөтгөсөн өгөгдлийн зураг 1d,e; P > 0.05). t-hCO легко наблюдались, а объемные измерения t-hCO нь ижил төстэй салшгүй холбоотой фиксированных срезов (расширенные данные, рис. 1d, e; P> 0,05). t-hCO амархан ажиглагдсан бөгөөд эзлэхүүний t-hCO хэмжилтүүд нь тогтмол хэсгүүдэд тооцсонтой төстэй байсан (өргөтгөсөн өгөгдөл, Зураг 1d, e; P > 0.05).很容易观察到t-hCO，并且t-hCO的体积测量值与从固定切片计算的测量值相似（扩展数据图1d、e；P > 0.05）很容易观察到t-hCO，并且t-hCO t-hCO легко наблюдался, а объемные измерения t-hCO нь ижил төстэй салшгүй холбоотой фиксированных срезов (расширенные данные, рис. 1d, e; P> 0,05). t-hCO амархан ажиглагдсан бөгөөд эзлэхүүний t-hCO хэмжилтүүд нь тогтмол хэсгүүдэд тооцсонтой төстэй байсан (өргөтгөсөн өгөгдөл, Зураг 1d, e; P > 0.05).Бид шилжүүлэн суулгаснаас хойш ойролцоогоор 2 сарын дараа шилжүүлэн суулгасан амьтдын 81% -д t-hCO-ийг тодорхойлсон (n = 72 амьтан; 10 hiPS эсийн шугамаас hCO; нэмэлт хүснэгт 1-д hiPS эсийн шугам). Эдгээрийн 87% нь тархины бор гадаргын хэсэгт байрладаг (Зураг 1в). Нэг шилжүүлэн суулгасан харханд олон цаг мөчид MRI цуврал скан хийснээр бид 3 сарын дотор t-hCO-ийн хэмжээ есөн дахин нэмэгдсэнийг олж мэдсэн (Зураг 1d ба өргөтгөсөн өгөгдөл, Зураг 1f). Шилжүүлэн суулгасны дараах 12 сарын хугацаанд шилжүүлэн суулгасан амьтдын эсэн мэнд амьдрах чадвар өндөр (74%) байсан (өргөтгөсөн өгөгдөл, Зураг 1g ба Нэмэлт Хүснэгт 2) бөгөөд илэрхий моторын болон ой санамжийн дутагдал, глиоз, цахилгаан энцефалограмм (EEG) илрээгүй. Өгөгдөл Зураг 1g ба нэмэлт хүснэгт 2). 1цагаас 3е хүртэл).
a, Туршилтын дизайны схем. hiPS эсээс гаргаж авсан hCO-г ялгах 30-60 дахь хоногт шинэ төрсөн нүцгэн хархны S1-д шилжүүлэн суулгасан. b, шилжүүлэн суулгаснаас хойш 2 сарын дараа S1-д t-hCO-г харуулсан T2 жинтэй титэм ба хэвтээ MRI зураг. Хэмжээний бар, 2 мм. c, ХиПС эсийн шугам тус бүрээр (n = 108, баар доторх тоонууд нь hIPS эсийн шугам дахь t-hCO-ийн хэмжээг харуулж байна) болон кортикал буюу кортикал байрлалд (n = 88) харуулсан сийлбэрийн амжилтын түвшингийн тоон үзүүлэлт. d, титэм артерийн MRI зураг (зүүн; масштабын бар, 3 мм) болон харгалзах 3D хэмжээст сэргээн босголт (масштаб бар, 3 мм) t-hCO 3 сарын хугацаанд нэмэгдэж байгааг харуулж байна. e, Хархны тархины бор гадар дахь t-hCO хэв маягийн тойм. Хуваарийн баар, 1 мм. f, t-hCO-ийн төлөөллийн иммуноцитохимийн зургийг зүүн дээд талаас баруун тийш харуулсан (ялгарах үед): PPP1R17 (4 сартай), NeuN (8 сартай), SOX9 ба GFAP (8 сартай), PDGFRα; (8 сар), MAP2 (8 сар) болон IBA1 (8 сар). Хуваарийн мөр, 20 мкм. HNA-ийн хавсарсан илэрхийлэл нь хүний ​​гарал үүсэлтэй эсийг илтгэнэ. g, snRNA-seq: Seurat-ийн интеграцчиллын дараа бүх өндөр чанарын t-hCO цөмүүдийн нэгдсэн олон талт ба проекц (UMAP) хэмжээсийг багасгах дүрслэл (n = 3 t-hCO дээж, n = 2 hiPS эсийн шугам). Астроцитууд, астроцитийн шугамын эсүүд; cyc prog, эргэлтийн өвөг дээдэс; GluN DL, гүн глутаматергик мэдрэлийн эсүүд; GluN DL/SP, гүн ба давхаргын доорх глутаматергик мэдрэлийн эсүүд; GluN UL, дээд давхаргын глутаматергик мэдрэлийн эсүүд; олигодендроцит, олигодендроцит; OPC, oligodendrocyte progenittor эсүүд; RELN, дахилт мэдрэлийн эсүүд. h, Генийн онтологи (GO) нэр томъёоны баяжуулалтын шинжилгээ нь t-hCO глутаматергик мэдрэлийн эсүүдтэй харьцуулахад hCO глутаматергик мэдрэлийн эсүүдтэй харьцуулахад мэдэгдэхүйц нэмэгддэг (тохируулсан P <0.05, нугалах өөрчлөлт > 2, цөмүүдийн дор хаяж 10% -д илэрхийлэгддэг). h, Генийн онтологи (GO) нэр томъёоны баяжуулалтын шинжилгээ нь t-hCO глутаматергик мэдрэлийн эсүүдтэй харьцуулахад hCO глутаматергик мэдрэлийн эсүүдтэй харьцуулахад мэдэгдэхүйц нэмэгддэг (тохируулсан P <0.05, нугалах өөрчлөлт > 2, цөмүүдийн дор хаяж 10% -д илэрхийлэгддэг). h, Анализ обогащения терминов Gene Ontology (GO) нь геновын шинж чанартай (P <0,05, кратность изменения > 2, экспрессия по крайней мере в 10% ядер) глутаматергических нервийнах t-hCO sravicheskyh t-hCO sravichesky sravico sravena. h, t-hCO глутаматергик мэдрэлийн эсүүдтэй харьцуулахад hCO глутаматергик нейронуудад мэдэгдэхүйц идэвхжүүлэлттэй (P<0.05, нугалах өөрчлөлт >2, хамгийн багадаа 10% цөм дэх илэрхийлэл) генийн хувьд Ген Онтологи (GO) нэр томъёоны баяжуулалтын шинжилгээ. h，与hCO 谷氨酸能神经元相比，t-hCO 谷氨酸能神经元中基因显着上调（调整国0.05，倍数变化> 2，在至少10% 的细胞核中表达）的基因本体论(GO) 术语毌集。 h ， 与 hco 谷氨酸 能 元 相比 ， t-hco 谷氨酸 能 神经 元 基因 显着 上调 ０05.（厐式变化 变化> 2 ， 至少 10% 的 核中 表达） 基因 基因 基因 的 的 的 的 的 的 的 的 的的 的 的 的本体论(GO) 术语富集分析。 h, генийг танин мэдэхүйн идэвхжсэн (скорректированный P <0,05, кратность изменения> 2, экспрессируется по крайней мере в 10% ядер) в глутаматергических нервных анализ t-hCO по сравнению сравнению с глутаматергических нейронами глутаматергических нэрэмжит глутаматергических нэрэмжит hCO. h, hCO glutamatergic мэдрэлийн эсүүдтэй харьцуулахад t-hCO глутаматергик мэдрэлийн эсүүдэд генүүд мэдэгдэхүйц нэмэгдсэн (тохируулсан P <0.05, нугалах өөрчлөлт > 2, цөмүүдийн дор хаяж 10% -д илэрхийлэгддэг) Баяжуулах нэр томъёоны онтологийн (GO) шинжилгээ.Тасалсан шугам нь 0.05-ийн aq утгыг заана. i, t-hCO дахь GluN эсийн төрлүүдийн UMAP дүрслэл нь 22 snRNA-seq насанд хүрэгчдийн мотор кортексийн мэдээллийн багцаас шошгоны шилжүүлгийг ашиглана. CT - кортикоталамик эсүүд, ET - тархины гаднах эсүүд, IT - дотоод теленефалик эсүүд, NP - проекцын ойролцоо.
Дараа нь бид t-hCO-ийн цитоархитектур болон эсийн ерөнхий найрлагыг үнэлэв. Хархны эндотелийн эсийг эсрэгбие будахад t-hCO-тай судасжилт илэрсэн бол IBA1-ээр будахад бүхэл бүтэн оготны микроглиа илэрсэн (Зураг 1f ба өргөтгөсөн өгөгдөл, Зураг 3c,d). Дархлаа будахад хүний ​​цөмийн эсрэгтөрөгч (HNA) эерэг эсүүд PPP1R17 (кортикал өвөг дээдэс), NeuN (нейронууд), SOX9 ба GFAP (глиалаас гаралтай эсүүд) эсвэл PDGFRa (олигодендроцитын өвөг дээдэс) -ийг хамт илэрхийлдэг (Зураг 1f). Нэг эсийн нарийвчлалтайгаар t-hCO-ийн эсийн найрлагыг судлахын тулд бид ойролцоогоор 8 сарын ялгааны дараа нэг цөмт РНХ-ийн дараалал (snRNA-seq) хийсэн. Хархны бөөмийг бөөнөөр нь шүүж, зайлуулснаар 21500 хүний ​​өндөр чанарын мононуклеар зураг гарсан (Зураг 1g ба өргөтгөсөн өгөгдөл, Зураг 4а,б). Ердийн эсийн төрлийн маркеруудын илэрхийлэл нь гүн ба өнгөц глутаматергик мэдрэлийн эсүүд, цусны эргэлтийн удам угсаа, олигодендроцитууд, астроцитын удам угсаа зэрэг гол кортикал эсийн кластеруудыг тодорхойлсон (Зураг 1g, өргөтгөсөн өгөгдөл, Зураг 4c, Нэмэлт Хүснэгт 3). SATB2 ба CTIP2-ийн дархлаажуулалт нь кортикал дэд хэвшинж байгаа хэдий ч t-hCO тодорхой анатомийн давхаргажилтыг харуулаагүй болохыг харуулсан (өргөтгөсөн өгөгдөл, Зураг 3a). үе шаттай нийцсэн snRNA-seq hCO нь олигодендроцит байхгүй, GABAergic нейрон байгааг эс тооцвол ерөнхийдөө ижил төстэй эсийн ангиллыг бий болгосон бөгөөд энэ нь өмнө нь мэдээлсэн хажуугийн эх эсүүдийн хувьд таатай in vitro нөхцлийг тусгаж болох юм15 (өргөтгөсөн өгөгдөл, Зураг 4f - i4). Дифференциал генийн экспрессийн шинжилгээ нь t-hCO ба hCO хоёрын хооронд глутаматергик нейронуудын мэдэгдэхүйц ялгааг илрүүлсэн (Нэмэлт Хүснэгт 5), үүнд синаптик дохиолол, дендритийн нутагшуулалт, хүчдэлийн хаалттай сувгийн идэвхжил зэрэг мэдрэлийн эсийн боловсорч гүйцэхтэй холбоотой генүүдийн багц идэвхжсэн (Зураг 1h ба Нэмэлт хүснэгт 5). хүснэгт 6). Үүний дагуу кортикал глутаматергик t-hCO мэдрэлийн эсүүд транскрипцийн боловсорч гүйцэх явцыг хурдасгасан.
t-hCO-ийн эдгээр транскрипцийн өөрчлөлтүүд нь in vitro болон in vivo t-hCO хоёрын морфологийн ялгаатай холбоотой эсэхийг тодруулахын тулд бид 7-8 сарын ялгаралын дараа цочмог хэсгүүдэд үе шатанд тохирсон биоцитинээр дүүрсэн hCO ба hCO-г сэргээсэн. hCO мэдрэлийн эсүүд (Зураг 2a). t-hCO мэдрэлийн эсүүд нь in vitro hCO-тай харьцуулахад мэдэгдэхүйц том, сома диаметрээс 1.5 дахин, дендритүүд хоёр дахин их, нийт дендритийн урт зургаан дахин нэмэгдсэн байна (Зураг 2b). Нэмж дурдахад, бид hCO мэдрэлийн эсүүдтэй харьцуулахад t-hCO мэдрэлийн эсүүд дэх dendritic spines нь мэдэгдэхүйц өндөр нягтралтай байгааг ажигласан (Зураг 2c). Энэ нь t-hCO мэдрэлийн эсүүд нь өргөн цар хүрээтэй dendritic сунаж, салаалж байгааг харуулж байгаа бөгөөд энэ нь эсийн тасралтгүй өсөлттэй хослуулан шилжүүлэн суулгасны дараа t-hCO-ийн эрчимтэй өсөлтөд хувь нэмэр оруулдаг (Зураг 1d ба Өргөтгөсөн мэдээлэл Зураг 1f). Энэ нь биднийг электрофизиологийн шинж чанарыг судлахад түлхэц болсон. Мембраны багтаамж нь найм дахин их (өргөтгөсөн өгөгдөл, Зураг 8d), амрах үеийн мембраны потенциал нь илүү их туйлширсан (ойролцоогоор 20 мВ) байсан ба одоогийн тарилга нь hCO нейронтой харьцуулахад t-hCO мэдрэлийн эсүүдэд хамгийн их өдөөх хурдыг өдөөдөг. in vitro (Зураг 2d), e), энэ нь t-hCO-ийн илүү том, нарийн төвөгтэй морфологийн шинж чанаруудтай нийцдэг. Нэмж дурдахад t-hCO мэдрэлийн эсүүдэд аяндаа өдөөх постсинаптик гүйдлийн үйл явдлын давтамж (EPSC) мэдэгдэхүйц өндөр байсан (Зураг 2f) нь t-hCO мэдрэлийн эсүүдэд ажиглагдсан дендрит нурууны нягтрал ихсэх нь функциональ өдөөлттэй холбоотой болохыг харуулж байна. бэлгийн синапс. Бид hCO нейронуудын төлөвшөөгүй шинж чанарыг in vitro шошготой глутаматергик мэдрэлийн эсүүдийг бүртгэж баталгаажуулсан (өргөтгөсөн өгөгдөл, Зураг 6a-c).
a, Биоцитинээр дүүрсэн hCO ба t-hCO нейронуудын 8 сарын ялгавартай байдлын дараа 3D сэргээн босголт. б, Морфологийн шинж чанарын тоон үзүүлэлт (n = 8 hCO нейрон, n = 6 t-hCO нейрон; **P = 0,0084, *P = 0,0179 ба ***P <0,0001). б, Морфологийн шинж чанарын тоон үзүүлэлт (n = 8 hCO нейрон, n = 6 t-hCO нейрон; **P = 0,0084, *P = 0,0179 ба ***P <0,0001). б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронов t-hCO; ** P = 0,0084, * P = 0,0179 и *** P <0,0001). б, морфологийн шинж чанарын тоон үзүүлэлт (n=8 hCO нейрон, n=6 t-hCO нейрон; **P=0.0084, *P=0.0179, ***P<0.0001). b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元，n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0.0084，*P7*0，，*P = 9. 0.0001）. b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元，n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0.0084，*P7*0，，*P = 9. 0.0001）. б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронов t-hCO; ** P = 0,0084, * P = 0,0179 и *** P <0,0001). б, морфологийн шинж чанарын тоон үзүүлэлт (n=8 hCO нейрон, n=6 t-hCO нейрон; **P=0.0084, *P=0.0179, ***P<0.0001).в, hCO ба t-hCO dendritic салбаруудыг 8 сарын ялгах дараа 3D сэргээн босголт. Улаан од нь дендрит нурууг илтгэнэ. Дендрит нурууны нягтын тоон үзүүлэлт (n = 8 hCO нейрон, n = 6 t-hCO нейрон; ** P = 0.0092). d, Амрах мембраны потенциалын тоон үзүүлэлт (n = 25 hCO нейрон, n = 16 t-hCO нейрон; *** P < 0.0001). d, Амрах мембраны потенциалын тоон үзүүлэлт (n = 25 hCO нейрон, n = 16 t-hCO нейрон; *** P < 0.0001). d, количественная оценка мембраны потенциал покоя (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). d, амрах мембраны потенциалын хэмжигдэхүүн (n = 25 hCO нейрон, n = 16 t-hCO нейрон; *** P < 0.0001). d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；***P < 0.0001）。 d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；***P < 0.0001）。 d, количественная оценка мембраны потенциал покоя (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). d, амрах мембраны потенциалын хэмжигдэхүүн (n = 25 hCO нейрон, n = 16 t-hCO нейрон; *** P < 0.0001). e, Гүйдлийн тарилга ихсэх замаар өдөөгдсөн hCO ба t-hCO-ийн давтагдах үйл ажиллагааны боломжит галын хэмжээ, хамгийн их галлах хурдны тоон үзүүлэлт (n = 25 hCO нейрон, n = 16 t-hCO нейрон; *** P < 0.0001). e, Гүйдлийн тарилга ихсэх замаар өдөөгдсөн hCO ба t-hCO-ийн давтагдах үйл ажиллагааны боломжит галын хэмжээ, хамгийн их галлах хурдны тоон үзүүлэлт (n = 25 hCO нейрон, n = 16 t-hCO нейрон; *** P < 0.0001). e, hCO ба t-hCO-ийн потенциалын идэвхжлийг нэмэгдүүлэх, өндөр үрэвслийг арилгах, хамгийн их сөрөг нөлөө үзүүлэх (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <00,). e, одоогийн өсөлтөөс үүдэлтэй hCO ба t-hCO-д дахин галлах үйл ажиллагааны боломжит хүчин чадал, хамгийн их галлах хурдны тоон үзүүлэлт (n = 25 hCO нейрон, n = 16 t-hCO нейрон; *** P < 0.0001). e，通过增加电流注入诱导的hCO 和t-hCO 重复动作电位放电，以及最大放电（2（电，个hCO 神经元，n = 16 个t-hCO 神经元；***P < 0.0001）。 E ， 通过 增加 电流 注入 的 的 hco 和 t-hco 重复 电位 放电 ， 以及 最 大（弈大（弖n个 hco 神经 ， n = 16 个 t-hco 神经 ； *** p <0.0001） 。 e, повторяющееся возбуждение потенциаль дествия hCO и t-hCO, вызванное увеличением подачи тока, и количественная оценка хамгийн их сөрөг нөлөөлөл (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO0; ***0; ***0). e, гүйдлийн нийлүүлэлт нэмэгдэж өдөөгдөж байгаа hCO ба t-hCO үйл ажиллагааны потенциалын давтагдах шаталт ба галын хамгийн их хурдны тоон үзүүлэлт (n = 25 hCO нейрон, n = 16 t-hCO нейрон; *** P < 0.0001). f, hCO болон t-hCO мэдрэлийн эсүүд дэх аяндаа үүсэх EPSCs (sEPSCs) 8 сарын ялгаа, синаптик үйл явдлын давтамжийн тоон үзүүлэлт (n = 25 hCO нейрон, n = 17 t-hCO нейрон; *** P < 0.0001). е, hCO ба t-hCO мэдрэлийн эсүүд дэх аяндаа үүссэн EPSCs (sEPSCs) 8 сарын ялгаа, синаптик үйл явдлын давтамжийн тоон үзүүлэлт (n = 25 hCO нейрон, n = 17 t-hCO нейрон; *** P < 0.0001). f, спонтанны EPSC (sEPSC) нь нейронуудын hCO ба t-hCO-д 8 сарын хугацаанд дифференцирууд болон количественная оценка синаптических собитууд (n = 25 нейронов hCO, n = 17 нейронов t-hCO; *** P <0,000) . f, 8 сарын хугацаанд hCO ба t-hCO мэдрэлийн эсүүд дэх аяндаа үүсэх EPSCs (sEPSCs) нь синаптик үйл явдлын хурдыг ялгах ба тоон үзүүлэлтээр (n = 25 hCO нейрон, n = 17 t-hCO нейрон; *** P <0.0001). f，分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs)，以及突触事件频率的5CO神经元，n = 17 t-hCO 神经元；***P < 0.0001） . f，分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs)，以及突触事件频率的5CO神率的量匼（n = 25 hCO 神率的量匼（n = 25hCO P <0.0001） . f, спонтанны EPSC (sEPSC) нь нейронуудын hCO ба t-hCO-д 8 сарын хугацаанд дифференцирууд болон количественная оценка синаптических собитууд (n = 25 нейронов hCO, n = 17 нейронов t-hCO; *** P <0,001). е, hCO болон t-hCO мэдрэлийн эсүүд дэх аяндаа үүссэн EPSCs (sEPSCs) 8 сарын хугацаанд синаптик үйл явдлын хурдыг ялгах, тоон тодорхойлох (n = 25 hCO нейрон, n = 17 t-hCO нейрон; *** P <0.0001).bf-ийн хувьд 1208-2-р мөрөнд байгаа hCO ба t-hCO-г зэрэгцээ хадгалсан ижил ялгах багцаас авсан. g, Генийн багц баяжуулалтын шинжилгээ (нэг талт Фишерийн нарийн тест) нь t-hCO глутаматергик нейронууд (эрт генпонез ба хоцрогдолтой) hCO глутаматергик нейронтой харьцуулахад мэдэгдэхүйц нэмэгддэг (P < 0.05, нугалалтын өөрчлөлт > 2, цөмүүдийн дор хаяж 10%-д илэрхийлэгддэг) (LRG) үйл ажиллагаанаас хамааралтай генүүд нь in vivo хулганы судалгаагаар16 ба хүний ​​өвөрмөц LRGs in vitro мэдрэлийн эсээс17. g, Генийн багц баяжуулалтын шинжилгээ (нэг талт Фишерийн нарийн тест) нь t-hCO глутаматергик нейронууд (эрт генпонез ба хоцрогдолтой) hCO глутаматергик нейронтой харьцуулахад мэдэгдэхүйц нэмэгддэг (P < 0.05, нугалалтын өөрчлөлт > 2, цөмүүдийн дор хаяж 10%-д илэрхийлэгддэг) (LRG) үйл ажиллагаанаас хамааралтай генүүд нь in vivo хулганы судалгаагаар16 ба хүний ​​өвөрмөц LRGs in vitro мэдрэлийн эсээс17. g, анализ обогащения набора генов (односторонний точ нейроны шинжилгээний Фишера) генов со значительной активацией (скорректированный P <0,05, кратность изменения > 2, экспрессия по меньшей мере в 10% ядер) глутаматергических мэдрэлийн эсийн сэлбэлт hCO наборы генов как раннего (ERG), так и позднего (LRG) генов, идэвхжсэн, идэвхжсэн, мышах in vivo16-д таних, хүний ​​биед LRG-ийн мэдрэлийн мэдрэлийн тусгай хамгаалалтыг in vitro17. g, t-hCO глутаматергик нейрон дахь мэдэгдэхүйц идэвхжүүлэлттэй (P<0.05, нугалалтын өөрчлөлт >2, илэрхийлэл) генүүдийн генийн багц баяжуулалтын шинжилгээ (Нэг сүүлт Фишерийн нарийн тест) t-hCO глутаматергик нейронуудын hCO glutamatergic нейронтой харьцуулахад (ERG) хожуу үеийн (ERG) генийн идэвхжил. хулгана16 болон мэдрэлийн эсээс авсан хүний ​​өвөрмөц LRGs in vitro17. g，t-hCO谷氨酸能神经元与hCO谷氨酸能神经元相比，t -hCO谷氨酸能神经元显着上调（调整后P<0.05，倍数变化>2，在至少10%的细胞核中表达）的基因集富集分析（单侧F isher精确检验）从体内小鼠研究中鉴定的早期反应(ERG)和晚期反应(LRG) 活性依赖性基因的基因组16 和体外神经元17 中的人类特开LRG g ， t-hco 谷氨酸 神经 元 与 hco 谷氨酸 神经 元 相比 ， t-hco 谷氨酸 神经 元 与 hco 神经 谷氨酸 神经 元 与<0.05 ， 倍数> 2 ， 至少 至少 10%的 细胞 核中 表达） 的 集富集 分析 （单式（单缧缾体内 小鼠 研究 中 的 早期 反应 反应 反应 和 晚期 反应 反应 (lrg) 活性 活性 庄 廛基和 神经元 神经元 17 中 中 17 中 17的人类特异性LRG。 g, глутаматергические нейроны t-hCO нь глутаматергическими нейронамийн hCO-ийн сравнениюг идэвхжүүлж идэвхжүүлнэ (скорректированный P<0,05, кратность изменения> 2, не менее 10% Анализ обогащения набора генов (од) (ERG) болон позднего гени, зависящие от активности ответа (LRG), идентифицированиях на мышах in vivo16 болон нейронах in vitro17, тусгай хүмүүс. g, t-hCO глутаматергийн мэдрэлийн эсүүд нь hCO глутаматергийн мэдрэлийн эсүүдтэй харьцуулахад мэдэгдэхүйц нэмэгдсэн байна (тохируулсан P<0.05, нугалах өөрчлөлт >2, дор хаяж 10% Эрт хариу урвал (ERG) ба хожуу хариу урвалын генийн баяжуулалтын шинжилгээ (нэг сүүлт Фишерийн яг тест) урвалын үйл ажиллагаанаас хамааралтай генүүд (inRG-аас хамааралтай генүүд) мэдрэлийн эсүүд.17 Хүний өвөрмөц ЗГХ.Тасархай шугам нь Bonferroni-ийн засварласан P утгыг 0.05-ыг харуулж байна. h, GluN генийн илэрхийлэл (ген бүрийн псевдо-багц ба масштаб) нь t-hCO глутаматергик нейрон дахь LRG генүүдийн snRNA-seq хуулбаруудад мэдэгдэхүйц нэмэгдсэн байна. i, t-hCO (дээд) ба hCO (доод) нейрон дахь SCG2 илэрхийлэлийг харуулсан дархлаа будалт. Цагаан сумнууд нь SCG2+ нүдийг заадаг. Хуваарийн мөр, 25 микрон. Өгөгдлийг дундаж ± стандарт хазайлтаар илэрхийлнэ.
Ex vivo зүсмэлүүдэд ажиглагдсан t-hCO-ийн идэвхжил нэмэгдсэнд үндэслэн snRNA-seq нь in vitro-тэй харьцуулахад t-hCO дахь генийн транскриптийн үйл ажиллагаанаас хамааралтай өсөлтийг илрүүлсэн. Глутаматергик t-hCO мэдрэлийн эсүүд нь хожуу хариу урвалын үйл ажиллагааг зохицуулдаг генийн өндөр түвшнийг илэрхийлсэн (Зураг 2g, h) нь хулгана болон хүний ​​мэдрэлийн эсүүд16,17-д хийсэн өмнөх судалгаагаар илэрсэн. Жишээлбэл, BDNF18, SCG2, OSTN, приматуудын өвөрмөц үйл ажиллагааг зохицуулах ген нь hCO нейронтой харьцуулахад t-hCO нейрон дахь илэрхийлэл нэмэгдсэн (Зураг 2g-i). Тиймээс t-hCO мэдрэлийн эсүүд нь транскрипц, морфологи, функциональ шинжилгээгээр hCO нейронуудтай харьцуулахад боловсорч гүйцсэн шинж чанарыг харуулсан.
Хүний тархины хөгжилтэй t-hCO боловсорч гүйцсэн хамаарлыг цаашид үнэлэхийн тулд бид ургийн болон насанд хүрэгчдийн кортикал эсийн төрлүүдийг19,20, насанд хүрэгчдийн21,22 транскриптомийн харьцуулалт, түүнчлэн хөгжлийн явцад кортикал генийн илэрхийлэл23-ийн талаарх өргөн хүрээний өгөгдлийг хийсэн (өргөтгөсөн өгөгдөл, Зураг 5). ). өмнөх ажлын 24 , дэлхийн hCO болон t-hCO транскриптомын төлөвшлийн төлөв байдлын ялгаа нь 7-8 сарын хугацаанд in vivo хөгжлийн хугацаатай ерөнхийдөө нийцэж байгаа бөгөөд ургийн амьдралын хожуу үетэй хамгийн тэнцүү байна (Өргөтгөсөн мэдээлэл Зураг 5a). Бид насанд тохирсон hCO-тай харьцуулахад t-hCO-д транскриптомын боловсорч гүйцсэн байдал, түүнчлэн синаптогенез, астрогенез, миелинжилттэй холбоотой транскриптомын идэвхжилтийг ажигласан (өргөтгөсөн өгөгдөл, Зураг 5b-d). Эсийн түвшинд бид t-hCO-д илүү нимгэн бор гадаргын дэд хэв шинжийн нотолгоог олсон бөгөөд глутаматергик мэдрэлийн эсүүд нь насанд хүрэгчдийн L2 / 3, L5, L6 нейроны дэд төрлүүдтэй давхцаж байна (Зураг 1i). Үүний эсрэгээр, глутаматергик t-hCO мэдрэлийн эсүүд болон ургийн кортикал нейронуудын хоорондох кластер давхцал нь жирэмсний дунд үед илүү хязгаарлагдмал байсан (өргөтгөсөн өгөгдөл, Зураг 5e-j). t-hCO мэдрэлийн эсүүд нь хүний ​​төрсний дараах үеийн неокортик мэдрэлийн эсүүдтэй үйл ажиллагааны хувьд төстэй эсэхийг тодорхойлохын тулд бид хүний ​​төрсний дараах бор гадаргын хурц хэсгүүдэд хүний ​​L2/3 пирамид мэдрэлийн эсүүдийн электрофизиологийн бичлэг, анатомийн сэргээн босголтыг хийсэн (өргөтгөсөн өгөгдөл, Зураг 7a). L2 / 3 пирамид мэдрэлийн эсүүдийн электрофизиологийн шинж чанар нь t-hCO пирамид мэдрэлийн эсүүдтэй төстэй байсан (өргөтгөсөн өгөгдөл, Зураг 7e). Морфологийн хувьд төрсний дараах үеийн хүний ​​дээжээс L2 / 3 мэдрэлийн эсүүд нь hCO-той харьцуулахад t-hCO-тай илүү төстэй байсан ч L2 / 3 эсүүд нь урт, ерөнхийдөө илүү олон салбар агуулсан, нурууны нягтрал ихтэй байсан (Зураг 3g ба өргөтгөсөн өгөгдөл, Зураг 7b-). G).
a, хяналтын болон TS hiPS эсийн шугамаар үйлдвэрлэсэн hCO-г нярайн харханд шилжүүлэн суулгах. б, биоцитинээр дүүрсэн t-hCO нейронуудын 8 сарын ялгавартай байдлын дараа 3D сэргээн босголт. в, дундаж дендрит уртын тоон үзүүлэлт (n = 19 хяналтын нейрон, n = 21 TS нейрон; **P = 0.0041). d, 8 сарын ялгавартай үед хяналтын болон TS t-hCO-аас 3D-reconsected dendritic салбарууд, мөн dendritic нурууны нягтын тоон үзүүлэлтүүд (n = 16 хяналтын нейрон, n = 21 TS нейрон, *** P <0.0001). d, 8 сарын ялгавартай үед хяналтын болон TS t-hCO-аас 3D-reconsected dendritic салбарууд, мөн dendritic нурууны нягтын тоон үзүүлэлтүүд (n = 16 хяналтын нейрон, n = 21 TS нейрон, *** P <0.0001). d, 3D-реконструкция дендритных ветвей из контроля и TS t-hCO cherez 8 mesyaцev дифференцировки болон количественная оценка плотности дендритных шипов (n = 16 удирдлагын нейронов, n = 21 TS нейронов, ***0 P <0,). d, 8 сарын ялгавартай байдал ба дендритийн нурууны нягтын тоон үзүүлэлтийг хянах ба t-hCO TS-ээс дендритийн салбаруудын 3D сэргээн босголт (n=16 хяналтын нейрон, n=21 TS нейрон, ***P<0.0001). d，分化8 个月时对照和TS t-hCO 的3D 重建树突分支，以及树突棘密度的量化n =16个对照神经元，n = 21 个TS 神经元，***P <0.0001）。 d ， 分化 8 个 时 对照 和 ts t-hco 的 3d 重建 分支 分支 以及 树突棘 树突棘 密度 （6n）神经 元 ， n = 21 个 ts 神经 ， *** p <0.0001 ）。 d, 3D-реконструкция дендритных ветвей контроля болон TS t-hCO через 8 месяцев дифференцировки ба количественная оценка плотности дендритных шипов (n = 16 удирдлагын нейронов, n = 21 TS нейронов, *** P <0,0). d, 8 сарын ялгаа болон дендрит нурууны нягтын тоон үзүүлэлтээр хяналтын дендритын салбарууд болон TS t-hCO-ийн 3D сэргээн босголт (n=16 хяналтын нейрон, n=21 TS нейрон, ***P<0.0001).Улаан од нь дендрит нурууг илтгэнэ. e, хяналтанд байгаа аяндаа EPSCs ба TS t-hCO мэдрэлийн эсүүд 8 сарын ялгааны дараа. f, хуримтлагдсан давтамжийн график ба синаптик үйл явдлын давтамж ба далайцын хэмжигдэхүүн (n=32 хяналтын нейрон, n=26 TS нейрон; **P=0.0076 ба P=0.8102). g, hCO болон t-hCO дахь TS ба хяналтын нейронуудын Scholl шинжилгээ. Тасархай зураасууд нь хүний ​​L2/3 төрсний дараах үеийн пирамид мэдрэлийн эсүүдийг харьцуулж харуулдаг (n = 24 хяналтын t-hCO нейрон, n = 21 TS t-hCO нейрон, n = 8 хяналтын hCO нейрон, n = 7 TS hCO нейрон). Өгөгдлийг дундаж ± стандарт хазайлтаар илэрхийлнэ
Хүний бор гадаргын мэдрэлийн эсийн морфологи, функциональ шинж чанарыг өндөр түвшинд хуулбарлах t-hCO чадвар нь биднийг өвчний фенотипийг илрүүлэхэд t-hCO ашиглаж болох эсэхийг судлахад түлхэц болсон. Бид мэдрэлийн эсүүдэд үйл ажиллагаанаас хамааралтай генийн транскрипцийг эхлүүлдэг CaV1.2 кодлогч генийн үйл ажиллагааны өсөлтийн мутациас үүдэлтэй мэдрэлийн хөгжлийн хүнд эмгэг болох TS-д анхаарлаа хандууллаа. Бид хамгийн түгээмэл орлуулалт (p.G406R) болон гурван хяналтыг (Зураг 3a) агуулсан гурван TS өвчтөнөөс hCO авсан. Шилжүүлэн суулгасны дараа бид хяналттай харьцуулахад TS-ийн мэдрэлийн эсүүдэд дендритийн морфологи өөрчлөгдсөнийг олж мэдсэн (Зураг 3b ба өргөтгөсөн өгөгдөл, Зураг 8a,b), анхдагч дендритүүдийн тоо хоёр дахин нэмэгдэж, дендритийн уртын дундаж болон ерөнхий бууралт (Зураг 3c ба өргөтгөсөн өгөгдөл, Зураг 8c). Энэ нь хяналтын мэдрэлийн эсүүдтэй харьцуулахад нурууны нягтрал нэмэгдэж, TS-д аяндаа EPSC-ийн давтамж нэмэгдсэнтэй холбоотой байв (Зураг 3d-f ба өргөтгөсөн өгөгдөл, Зураг 8g). Цаашдын шинжилгээнд хяналттай харьцуулахад t-hCO TS-д хэвийн бус дендрит салаалсан хэв шинж илэрсэн боловч ижил төстэй ялгах үе шатанд in vitro TS hCO биш (Зураг 3g). Энэ нь ДҮ-ийн үйл ажиллагаанаас хамааралтай дендрит агшилтын талаарх бидний өмнөх тайлантай нийцэж байгаа бөгөөд энэхүү шилжүүлэн суулгах платформ нь in vivo өвчний фенотипийг илрүүлэх чадварыг онцолж байна.
Дараа нь бид t-hCO эсүүд S1 харханд функциональ байдлаар ямар хэмжээгээр нэгдсэнийг асуув. Мэрэгч амьтдын S1 нь хажуу талын ховдолын суурь ба хойд таламик цөм, мөн хажуугийн мотор ба хоёрдогч соматосенсорын кортикс, эсрэг талын S1-ээс хүчтэй синаптик оролтыг хүлээн авдаг (Зураг 4a). Иннервацийн хэв маягийг сэргээхийн тулд бид hCO-г галзуугийн вирус-dG-GFP/AAV-G-ээр халдварлуулж, hCO-г 3 хоногийн дараа S1 харханд шилжүүлэн суулгалаа. Бид шилжүүлэн суулгаснаас хойш 7-14 хоногийн дараа ipsilateral S1 болон ховдолын суурь зангилааны мэдрэлийн эсүүдэд GFP-ийн нягт илэрхийлэлийг ажигласан (Зураг 4b, c). Нэмж дурдахад, thalamic marker netrin G1-ийн эсрэгбиеийн будалт нь t-hCO-д thalamic төгсгөлүүд байгааг илрүүлсэн (Зураг 4d, e). Эдгээр afferent проекцууд нь t-hCO эсүүдэд синаптик хариу урвал үүсгэж чадах эсэхийг үнэлэхийн тулд бид thalamokortical давхаргын хурц хэсгүүдэд хүний ​​эсээс бүхэл бүтэн эсийн бичлэг хийсэн. Харх S1, дотоод капсул, цагаан бодис, t-hCO-ийн ойролцоох утаснуудын цахилгаан өдөөлт эсвэл AMPA рецепторын антагонист NBQX-д өртсөн t-hCO нейрон дахь t-hCO-ийн өдөөгдсөн богино хоцролттой EPSC-д опсин илэрхийлэгч таламийн төгсгөлүүдийн оптогенетик идэвхжил. (Зураг 4f, g ба өргөтгөсөн өгөгдөл, Зураг 9a-g). Эдгээр өгөгдлүүд нь t-hCO нь хархны тархинд анатомийн хувьд нэгдмэл байдаг бөгөөд хархны эзэн эдээр идэвхждэг болохыг харуулж байна.
a, Галзуу өвчнийг илрүүлэх туршилтын бүдүүвч диаграм. b, GFP болон t-hCO болон хархны тархины бор гадаргын хоорондох хүний ​​өвөрмөц STEM121 илэрхийлэл (дээд самбар). Мөн хархны ховдолын үндсэн цөм (VB) (зүүн доод) болон ipsilateral S1 (баруун доод) дахь GFP-ийн илэрхийлэлийг үзүүлэв. Хуваарийн мөр, 50 микрон. Улаан квадратууд нь зураг авсан тархины хэсгүүдийг төлөөлдөг. в, GFP-ийг илэрхийлэх эсийн тоон үзүүлэлт (n = 4 харх). d, e - t-hCO дахь Netrin G1+ thalamic терминалууд. d нь t-hCO болон VB цөм агуулсан титмийн хэсгийг харуулж байна. Хэмжээний бар, 2 мм. e нь t-hCO (зүүн) ба VB (баруун) мэдрэлийн эсүүд дэх Netrin G1 ба STEM121 илэрхийлэлийг харуулж байна. Хуваарийн мөр, 50 микрон. Улбар шар өнгийн тасархай шугам нь t-hCO хилийг заана. f, g, S1 харх (f) эсвэл дотоод капсулд (g) цахилгаан өдөөлт хийсний дараа t-hCO мэдрэлийн эсийн одоогийн ул мөр, (ягаан) эсвэл (хар) NBQX (зүүн талд). NBQX-тай болон NBQX-гүй EPSC далайц (n = 6 S1 нейрон, *P = 0.0119; ба n = 6 дотоод капсул нейрон, **P = 0.0022) (төв). Харх S1 (f) эсвэл дотоод капсул (g) (баруун) -ын цахилгаан өдөөлтөд хариу үйлдэл үзүүлэхэд EPSC-ийг харуулсан t-hCO нейронуудын хувь. aCSF, хиймэл тархи нугасны шингэн. h, 2P дүрслэлийн туршилтын бүдүүвч диаграмм (зүүн талд). GCaMP6s-ийн t-hCO дахь илэрхийлэл (дунд). Хуваарийн мөр, 100 микрон. GCaMP6s-ийн флюресценцийн хугацаа (баруун талд). i, аяндаа үүсэх флюресценцийн Z-оноо. j, сахлаа өдөөх бүдүүвч зураг. k, нэг туршилтаар z оноо авсан 2P флюресценцийн траекторийг жишээ нүднүүдийн тэг цаг үеийн сахал хазайлттай (тасархай шугам) тохируулсан. l, тэг цаг (тасархай шугам) (улаан) эсвэл санамсаргүй байдлаар үүсгэсэн цагийн тэмдэг (саарал) дахь сахал хазайлттай зэрэгцсэн бүх эсийн популяцийн дундаж z онооны хариу. м. Оптик тэмдэглэгээний туршилтын бүдүүвч диаграм. n, Цэнхэр лазерын өдөөлт эсвэл сахлын хазайлтын үеийн жишээ t-hCO эсийн түүхий хүчдэлийн муруй. Улаан сумнууд нь гэрлийн (дээд) эсвэл сахалны хазайлтаас (доод) үүссэн анхны үсрэлтийг заана. Саарал сүүдэрлэх нь сахал хазайх үеийг илтгэнэ. o, Оргил гэрлийн долгионы хэлбэр ба сахлын хазайлтын хариу үйлдэл. p, жишээний нүднүүдийн сахалуудын хазайлттай нийцсэн нэг оролдлогын баяжуулалт. 0 нь сахлын хазайлтыг (тасархай шугам) илэрхийлнэ. q, тэг цаг (тасархай шугам) (улаан) эсвэл санамсаргүй байдлаар үүсгэгдсэн цагийн тэмдэглэгээ (саарал) дахь сахалтай хазайлттай зэрэгцүүлсэн бүх гэрэл мэдрэмтгий эсийн популяцийн дундаж z онооны шаталтын хурд. r, Сахалны хазайлтаар ихээхэн өөрчлөгдсөн гэрэл мэдрэмтгий нэгжийн эзлэх хувь (n = 3 харх) (зүүн талд). Оргил z онооны хоцролт (n = 3 харх; n = 5 (цайвар ногоон), n = 4 (хар ногоон), n = 4 (цэнхэр) сахал хазайлтын модуляцийн нэг харханд) (баруун). Өгөгдлийг дундаж ± стандарт хазайлтаар илэрхийлнэ
Дараа нь бид in vivo мэдрэхүйн өдөөлтөөр t-hCO идэвхжиж болох эсэхийг асуусан. Бид генетикийн кодлогдсон кальцийн үзүүлэлтүүд GCaMP6-г илэрхийлэх hCO-г S1 харханд шилжүүлэн суулгасан. 150 хоногийн дараа бид шилэн фотометр эсвэл хоёр фотон кальцийн дүрслэлийг хийсэн (Зураг 4h ба өргөтгөсөн өгөгдөл, Зураг 10a). Бид t-hCO эсүүд нь синхрончлогдсон хэмнэлийн үйл ажиллагааг харуулсан болохыг олж мэдсэн (Зураг 4i, Өргөтгөсөн өгөгдөл, Зураг 10b ба Нэмэлт видео 1). Оргил t-hCO идэвхжилийг тодорхойлохын тулд бид мэдээ алдуулалтанд шилжүүлэн суулгасан харханд эсийн гаднах электрофизиологийн бичлэг хийсэн (өргөтгөсөн өгөгдөл, Зураг 10c-f). Бид MRI зургуудаас стереотаксик координатуудыг үүсгэсэн; Иймд эдгээр бүртгэгдсэн нэгжүүд нь хүний ​​мэдрэлийн эсийг төлөөлдөг боловч электрофизиологи дангаараа гарал үүслийн төрлийг тодорхойлохыг зөвшөөрдөггүй. Бид үйл ажиллагааны синхрончлогдсон тэсрэлтүүдийг ажигласан (өргөтгөсөн өгөгдөл, Зураг 10d). Тэсрэлт нь 460 мс орчим үргэлжилсэн бөгөөд 2 секунд орчим чимээгүй байх хугацаанд тусгаарлагдсан (өргөтгөсөн өгөгдөл, Зураг 10d, e). Тус тусын нэгжүүд нэг тэсрэлт тутамд дунджаар гурван удаа буудсан нь нэг тэсрэлт бүрт бүртгэгдсэн нэгжийн ойролцоогоор 73% байна. Бие даасан нэгжүүдийн үйл ажиллагаа нь маш их хамааралтай байсан бөгөөд эдгээр хамаарал нь ижил нөхцөлд бүртгэгдсэн вакцинд хамрагдаагүй амьтдад тодорхойлсон нэгжүүдээс өндөр байсан (өргөтгөсөн өгөгдөл, Зураг 10f). Хүнээс гаралтай нейронуудын огцом өсөлтийн хариу урвалыг тодорхойлохын тулд бид гэрлийн мэдрэмтгий катионы сувгийн родопсин 2 (hChR2) -ийг илэрхийлдэг hCO-ээр шилжүүлэн суулгасан мэдээ алдуулалтанд орсон хархнууд дээр гэрлийн тэмдэглэгээ хийх туршилт хийсэн бөгөөд үүгээр дамжуулан t-hCO мэдрэлийн эсүүд богино хугацааны хоцрогдолтой (цэнхэр гэрлийн өдөөлтөд 10 мс-ээс бага) танигддаг. t-hCO мэдрэлийн эсүүд нь кальцийн дүрслэлд ажиглагдсан давтамжтай аяндаа үйл ажиллагааны тэсрэлт, түүнчлэн гэрлийн тэмдэглэгээ байхгүй үед t-hCO-д хийгдсэн электрофизиологийн бичлэгийг харуулсан (өргөтгөсөн өгөгдөл, Зураг. 10c-g). In vitro-д бүртгэгдсэн hCO-ийн холбогдох үе шатанд аяндаа идэвхжил ажиглагдаагүй. Мэдрэхүйн өдөөлтөөр t-hCO-г идэвхжүүлж чадах эсэхийг үнэлэхийн тулд бид хархны сахлыг t-hCO-аас холдуулсан (Зураг 4j, m ба өргөтгөсөн өгөгдөл, Зураг 10h, k). Өмнөх судалгаанаас үзэхэд8,10, t-hCO эсийн дэд хэсэг нь сахалны хазайлтанд хариу үйлдэл үзүүлэхэд идэвхжил нэмэгдсэнийг харуулсан бөгөөд өгөгдлийг санамсаргүй хугацааны тэмдэгтүүдтэй харьцуулах үед ажиглагдаагүй (Зураг 4k-q болон өргөтгөсөн өгөгдөл, Зураг. 10h-q). Үнэн хэрэгтээ опто шошготой дан нэгжүүдийн 54 орчим хувь нь сахалтай цочролын дараа сэрэлийн хурдыг мэдэгдэхүйц нэмэгдүүлж, 650 мс орчимд дээд цэгтээ хүрсэн байна (Зураг 4r). Эдгээр өгөгдлүүдийг нэгтгэснээр t-hCO нь зохих функциональ оролтыг хүлээн авдаг бөгөөд хүрээлэн буй орчны өдөөлтөөр идэвхждэг болохыг харуулж байна.
Дараа нь бид t-hCO нь зан үйлийг хянахын тулд хархны хэлхээг идэвхжүүлж чадах эсэхийг судалсан. Бид эхлээд t-hCO нейронуудын аксонууд хархны эргэн тойрон дахь эд эсэд нэвтэрч байгаа эсэхийг судалж үзсэн. Бид hCO-г EYFP (hChR2-EYFP)-тай нийлсэн hChR2 кодлогч лентивирусаар халдварласан. 110 хоногийн дараа бид EYFP-ийн илэрхийлэлийг ipsilateral кортикал хэсгүүдэд, түүний дотор сонсгол, мотор, соматосенсорын кортиксууд, түүнчлэн судал, гиппокамп, таламус зэрэг тархины доорхи хэсгүүдэд ажиглагдсан (Зураг 5a). Эдгээр эфферент төсөөлөл нь хархны эсүүдэд синаптик хариу урвал үүсгэж чадах эсэхийг үнэлэхийн тулд бид тархины хурц хэсгүүдэд хархны тархины бор гадаргын эсийг бүртгэх замаар hChR2-EYFP-ийг илэрхийлдэг t-hCO эсийг оптик байдлаар идэвхжүүлсэн. Цэнхэр гэрлээр t-hCO аксоныг идэвхжүүлснээр NBQX-ээр хаагдсан хархны пирамид кортексийн мэдрэлийн эсүүдэд богино хугацааны хоцрогдолтой EPSC-ийг үүсгэсэн (Зураг 5b-g). Нэмж дурдахад эдгээр хариу урвалыг тетродотоксин (TTX) -аар хааж, 4-аминопиридин (4-AP) -аар сэргээж болох бөгөөд энэ нь моносинаптик холболтоос үүдэлтэй болохыг харуулж байна (Зураг 5e).
a, Аксоныг хянах бүдүүвч диаграмм (зүүн талд). t-hCO EYFP илэрхийлэл (баруун талд). Хуваарийн баар, 100 микрон. A1, сонсголын хэсэг, ACC, урд талын хонгил, г. striatum, dorsal striatum, HPC, Hippocampus; Диафрагм, хажуугийн таславч, mPFC, дунд хэсгийн урд талын бор гадар, пири, пириформ кортекс, v. striatum, ховдолын судал, VPM, таламусын вентропостомедиал цөм, VTA, ховдолын тементал бүс. Улаан квадратууд нь зураг авсан тархины хэсгүүдийг төлөөлдөг. б, Өдөөлтийн туршилтын бүдүүвч зураг. c, d, Хүний (c) EYFP+ t-hCO эсвэл харх (г) EYFP- эсүүд дэх цэнхэр гэрлийн өдөөгдсөн фото гүйдэл (дээд) ба хүчдэлийн (доод) хариу урвалын жишээ. e, f, TTX ба 4-AR (ногоон), TTX (саарал) эсвэл aCSF (хар) (e) бүхий t-hCO аксоны хөх гэрлийн өдөөлтийн дараах хархны мэдрэлийн эсийн одоогийн ул мөр (ягаан) эсвэл байхгүй (хар) ) ) NBQX (e). g, харх эсийн хөх гэрлээр өдөөгдсөн хариу урвалын хоцролт (n = 16 эс); хэвтээ баар нь дундаж хоцролтыг (7.13 мс) заана (зүүн талд). NBQX-тэй эсвэл NBQX-гүй бүртгэгдсэн гэрлийн өдөөгдсөн EPSC-ийн далайц (n = 7 нүд; ***P <0.0001) (дунд). NBQX-тэй эсвэл NBQX-гүй бүртгэгдсэн гэрлийн өдөөгдсөн EPSC-ийн далайц (n = 7 нүд; ***P <0.0001) (дунд). Амплитуда вызванных светом EPSC, зарегистрированных с эсвэл NBQX (n = 7 клеток; ***P <0,0001) (в центр). NBQX-тэй эсвэл NBQX-гүй бүртгэгдсэн гэрлийн өдөөгдсөн EPSC-ийн далайц (n = 7 нүд; ***P <0.0001) (төв).使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P < 0.0001）（中）使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P < 0.0001）（中） Амплитуда вызванных светом EPSC, зарегистрированных с эсвэл NBQX (n = 7 клеток; ***P <0,0001) (в центр). NBQX-тэй эсвэл NBQX-гүй бүртгэгдсэн гэрлийн өдөөгдсөн EPSC-ийн далайц (n = 7 нүд; ***P <0.0001) (төв).Цэнхэр гэрэлд хариу үйлдэл үзүүлдэг EPSC-ийг харуулсан хархны эсийн хувь (баруун). h, Зан үйлийн даалгаврын бүдүүвч диаграм. d0, өдөр 0. i. Сургалтын 1 дэх өдөр (зүүн талд) эсвэл 15 дахь өдөр (баруун) үлгэр жишээ амьтдын гүйцэтгэл. 1 дэх өдөр (зүүн талд) эсвэл 15 дахь өдөр (баруун төв) хийсэн долоох дундаж тоо (n = 150 цэнхэр гэрлийн туршилт, n = 150 улаан гэрлийн туршилт; *** P < 0.0001). 1 дэх өдөр (зүүн талд) эсвэл 15 дахь өдөр (баруун төв) хийсэн долоох дундаж тоо (n = 150 цэнхэр гэрлийн туршилт, n = 150 улаан гэрлийн туршилт; *** P < 0.0001). Среднее количество облизываний, выполненных в день 1 (слева) эсвэл день 15 (в центре справа) (n = 150 испытаний с синим светом, n = 150 испытаний с красным светом; ***P <0,0001). 1 дэх өдөр (зүүн талд) эсвэл 15 дахь өдөр (баруун төв) хийсэн долоох дундаж тоо (n = 150 цэнхэр гэрлийн туршилт, n = 150 улаан гэрлийн туршилт; ***P <0.0001).第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验，n =次红光试验；***P < 0.0001）。第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验，n =次红光试验；***P < 0.001 Среднее количество облизываний, выполненных в день 1 (слева) эсвэл день 15 (в центре справа) (n = 150 испытаний с синим светом, n = 150 испытаний с красным светом; ***P <0,0001). 1 дэх өдөр (зүүн талд) эсвэл 15 дахь өдөр (баруун төв) хийсэн долоох дундаж тоо (n = 150 цэнхэр гэрлийн туршилт, n = 150 улаан гэрлийн туршилт; ***P <0.0001).1 дэх өдөр (зүүн голд) эсвэл 15 дахь өдөр (баруун) улаан, цэнхэр гэрлийн туршилтуудын хуримтлагдсан долоох. NS, чухал биш. j,k, 1 эсвэл 15 дахь хоногт hChR2-EYFP (j) эсвэл хяналтын флюрофор (k) илэрхийлсэн t-hCO шилжүүлэн суулгасан бүх амьтдын зан үйлийн онцлог (hChR2-EYFP: n = 9 харх, ** P = 0.0049; хяналт: n = 9, P = 0.14). l, Давуу эрхийн онооны хувьсал (n = 9 hChR2, n = 9 хяналт; **P <0.001, ***P <0.0001). l, Давуу эрхийн онооны хувьсал (n = 9 hChR2, n = 9 хяналт; **P <0.001, ***P <0.0001). l, Эволюция показателя предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 контрольных; **P <0,001, ***P <0,0001). l, Давуу эрхийн онооны хувьсал (n = 9 hChR2, n = 9 хяналт; **P <0.001, ***P <0.0001). l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2，n = 9 对照；**P <0.001，***P <0.0001）。 l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2，n = 9 对照；**P <0.001，***P <0.0001）。 l, Эволюция показателей предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 контролей; **P <0,001, ***P <0,0001). l, Давуу эрхтэй онооны хувьсал (n = 9 hChR2, n = 9 хяналт; **P <0.001, ***P <0.0001).m, S1 дэх t-hCO-ийн оптогенетик идэвхжүүлэлтийн хариуд FOS илэрхийлэл. FOS илэрхийлэл (зүүн талд), хэмжигдэхүүн (бүлэг тус бүрт n = 3; *P < 0.05, ** P < 0.01 ба *** P < 0.001) (баруун талд) -ын зургийг үзүүлэв. FOS илэрхийлэл (зүүн талд), хэмжигдэхүүн (бүлэг тус бүрт n = 3; *P < 0.05, ** P < 0.01 ба *** P < 0.001) (баруун талд) -ын зургийг үзүүлэв. Показаны изображения экспресси FOS (слева) болон количествоного определения (n = 3 на групп; * P <0,05, ** P <0,01 ба *** P <0,001) (справа). FOS илэрхийлэл (зүүн талд) болон тоон үзүүлэлтийн (бүлэг тус бүрт n = 3; *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001) зургуудыг (баруун талд) үзүүлэв.显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P < 0.05、**P < 0.01 和***P < 0.001）（右）（右）显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P < 0.05、**P < 0.01 和***P < 0.001）（右）（右） Показаны изображения экспресси FOS (слева) болон количествоного определения (n = 3 на групп; * P <0,05, ** P <0,01 ба *** P <0,001) (справа). FOS илэрхийлэл (зүүн талд) болон тоон үзүүлэлтийн (бүлэг тус бүрт n = 3; *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001) зургуудыг (баруун талд) үзүүлэв.Хуваарийн мөр, 100 микрон. Өгөгдлийг BLA, суурь талын гуйлсэн булчирхайд, MDT, dorsomedial thalamic nucleus, PAG, periaqueductal grey-ийн дундаж ± стандарт алдаагаар илэрхийлнэ.
Эцэст нь бид t-hCO нь хархны зан үйлийг зохицуулж чадах эсэхийг асуув. Үүнийг шалгахын тулд бид hChR2-EYFP-ийг илэрхийлдэг hCO-г S1-д шилжүүлэн суулгаж, 90 хоногийн дараа t-hCO-д оптик утас суулгаж, гэрэл дамжууллаа. Дараа нь бид хархуудыг өөрчилсөн оперант кондиционерийн парадигмаар сургасан (Зураг 5h). Бид амьтдыг зан үйлийн туршилтын камерт байрлуулж, санамсаргүй байдлаар 5 секундын цэнхэр (473 нм) болон улаан (635 нм) лазер өдөөлтийг хэрэглэсэн. Амьтад цэнхэр гэрлийн өдөөлтийн үед долоож байсан ч улаан гэрлийн өдөөлтөд долоохгүй бол усны шагнал авдаг. Сургалтын эхний өдөр амьтад хөх эсвэл улаан гэрлээр өдөөхөд долоох нь ямар ч ялгаагүй байв. Гэсэн хэдий ч 15 дахь өдөр hChR2-EYFP-ийг илэрхийлдэг hCO-тай шилжүүлэн суулгасан амьтад улаан гэрлийн өдөөлттэй харьцуулахад хөх гэрлээр өдөөгдсөн үед илүү идэвхтэй долоож байгааг харуулсан. Долоох зан үйлийн эдгээр өөрчлөлт нь хяналтын флюорофорыг илэрхийлдэг hCO-тай шилжүүлэн суулгасан хяналтын амьтдад ажиглагдаагүй (суралтын амжилтын түвшин: hChR2 89%, EYFP 0%, Зураг 5i-1 ба Нэмэлт видео 2). Эдгээр өгөгдөл нь t-hCO эсүүд нь хархны мэдрэлийн эсийг идэвхжүүлж, урамшуулал хүсэх зан үйлийг идэвхжүүлдэг болохыг харуулж байна. Эдгээр зан үйлийн өөрчлөлтөд ямар хархны t-hCO мэдрэлийн хэлхээ холбоотой болохыг олж мэдэхийн тулд бид 90 минутын дараа бэлтгэгдсэн амьтад болон хураасан эдэд t-hCO-г оптогенетик байдлаар идэвхжүүлсэн. Иммуногистохими нь идэвхижүүлсэн зан үйлд оролцдог тархины хэд хэдэн бүсэд үйл ажиллагаанаас хамааралтай FOS уургийн илрэлийг илрүүлсэн бөгөөд үүнд дундын урд талын бор гадар, дунд таламус, периакведуктын саарал бодис зэрэг нь өдөөгдөөгүй хяналтын амьтад эсвэл амьтдад илэрдэг. будаа. 5м). Эдгээр өгөгдлүүдийг нэгтгэснээр t-hCO нь зан үйлийг жолоодохын тулд хархны мэдрэлийн үйл ажиллагааг зохицуулж чаддаг болохыг харуулж байна.
Мэдрэлийн органоидууд нь хүний ​​хөгжил, өвчнийг in vitro-д судлах ирээдүйтэй системийг төлөөлдөг боловч тэдгээр нь in vivo байдаг хэлхээний хоорондын холбоогүйн улмаас хязгаарлагддаг. Бид in vivo хүний ​​эсийн хөгжил, үйл ажиллагааг судлахын тулд дархлаа суларсан төрсний дараах эрт үеийн хархны S1-д hCO-г шилжүүлэн суулгах шинэ платформыг боловсруулсан. t-hCO нь vitro28-д ажиглагдаагүй боловсорч гүйцсэн эсийн төрлийг бий болгодог бөгөөд t-hCO нь анатомийн болон үйл ажиллагааны хувьд мэрэгчдийн тархинд нэгтгэгддэг болохыг бид харуулсан. t-hCO-г мэрэгч амьтдын мэдрэлийн хэлхээнд нэгтгэснээр хүний ​​эсийн үйл ажиллагаа болон судлагдсан амьтдын зан үйлийн хооронд холбоо тогтоох боломжийг олгосон нь t-hCO нейронууд зан үйлийн хариу урвалыг жолоодохын тулд хархны мэдрэлийн үйл ажиллагааг зохицуулж чаддаг болохыг харуулсан.
Бидний тайлбарлаж буй платформ нь хүний ​​эсийг мэрэгчдийн тархинд шилжүүлэн суулгах өмнөх судалгаанаас хэд хэдэн давуу талтай. Нэгдүгээрт, бид hCO-г төрсний дараах эрт үеийн хархуудын хөгжиж буй бор гадарга руу шилжүүлэн суулгасан бөгөөд энэ нь анатомийн болон функциональ интеграцийг хөнгөвчлөх болно. Хоёрдугаарт, t-hCO MRI мониторинг нь амьд амьтдын залгаасын байрлал, өсөлтийг судлах боломжийг бидэнд олгож, олон амьтдын урт хугацааны судалгаа хийж, хэд хэдэн hiPS эсийн шугамын найдвартай байдлыг тогтоох боломжийг олгосон. Эцэст нь бид хүний ​​эсэд хор хөнөөл багатай, хархны тархинд хүний ​​бор гадаргын мэдрэлийн эсийг нэгтгэх, үүсгэхэд хувь нэмэр оруулдаг тусгаарлагдсан нэг эсийн суспенз биш харин бүрэн бүтэн органоидуудыг шилжүүлэн суулгасан.
Энэхүү платформд ахиц дэвшил гарсан хэдий ч цаг хугацаа, орон зайн болон төрөл зүйл хоорондын хязгаарлалт нь хөгжлийн эхний үе шатанд шилжүүлэн суулгасны дараа ч хүний ​​мэдрэлийн хэлхээг өндөр үнэнчээр бий болгоход саад болж байгааг бид хүлээн зөвшөөрч байна. Жишээлбэл, t-hCO-д ажиглагдсан аяндаа үүсэх идэвхжил нь кортикал хөгжлийн явцад ажиглагдсан хэмнэлтэй үйл ажиллагаатай төстэй хөгжлийн фенотипийг илэрхийлж байна уу, эсвэл энэ нь t-hCO-д агуулагдах дарангуйлагч эсийн төрөл байхгүйтэй холбоотой эсэх нь тодорхойгүй байна. Үүний нэгэн адил, t-hCO-д ламинаци байхгүй байгаа нь гинжин хэлхээний холболтод хэр зэрэг нөлөөлж байгаа нь тодорхойгүй байна30. Ирээдүйн ажил нь хүний ​​микроглиа, хүний ​​эндотелийн эсүүд болон GABAergic interneurons-ийн янз бүрийн хувь хэмжээ зэрэг бусад эсийн төрлүүдийг нэгтгэх, түүнчлэн өөрчлөгдсөн t-hCO-д мэдрэлийн интеграцчлал, боловсруулалт хэрхэн явагдахыг ойлгоход чиглэнэ. өвчтөнүүдээс авсан эсүүд дэх транскрипц, синаптик болон зан үйлийн түвшин.
Ерөнхийдөө энэхүү in vivo платформ нь хүний ​​тархины хөгжил, өвчний судалгааг in vitro байдлаар нөхөж чадах хүчирхэг эх сурвалж юм. Энэхүү платформ нь өвчтөнөөс гаргаж авах боломжгүй эсүүдэд шинэ хэлхээ түвшний фенотипүүдийг олж илрүүлэх, эмчилгээний шинэ стратегийг турших боломжийг олгоно гэж бид таамаглаж байна.
Бид өмнө нь тайлбарласны дагуу HiPS эсүүдээс hCO2.5 үүсгэсэн. Тэжээлийн давхарга дээр өсгөвөрлөсөн hiPS эсүүдээс hCO нийлэгжилтийг эхлүүлэхийн тулд hiPS эсийн бүрэн бүтэн колониудыг диспас (0.35 мг/мл) ашиглан өсгөвөрлөх аяганаас салгаж, hiPS эсийн өсгөвөрлөгч бүхий аяга агуулсан хэт бага бэхэлгээтэй хуванцар өсгөвөрт шилжүүлэв. (Корнинг) нь хоёр SMAD дарангуйлагч дорсоморфин (5 μM; P5499, Sigma-Aldrich) ба SB-431542 (10 μM; 1614, Tocris) болон ROCK дарангуйлагч Y-27632 (10 μM; S1049, Selleckchem) -ээр нэмэгдүүлсэн. Эхний 5 хоногт hiPS эсийн орчинг өдөр бүр сольж, дорсоморфин, SB-431542 нэмсэн. Суспензийн зургаа дахь өдөр мэдрэлийн сфероидыг нейробазал-А (10888, Life Technologies), А аминдэмгүй В-27 бэлдмэл (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), пенициллин, стрептологи (1100) агуулсан мэдрэлийн орчинд шилжүүлэв. 24 дэх өдөр хүртэл эпидермисийн өсөлтийн хүчин зүйл (EGF; 20 нг мл-1; R&D Systems) болон фибробласт өсөлтийн хүчин зүйл 2 (FGF2; 20 нг мл-1; R&D Systems)-ээр нэмэлт тэжээл өгсөн. 25-аас 42 дахь өдөр хүртэл тэжээллэг бодисыг тархины гаралтай нейротрофийн хүчин зүйл (BD-2, BD-2)-аар дүүргэсэн. нейротрофин 3 (NT3; 20 нг мл-1; Пепротек) өдөр бүр дунд зэргийн өөрчлөлттэй. Суспензийн зургаа дахь өдөр мэдрэлийн сфероидыг нейробазал-А (10888, Life Technologies), А аминдэмгүй В-27 бэлдмэл (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), пенициллин, стрептологи (1100) агуулсан мэдрэлийн орчинд шилжүүлэв. 24 дэх өдөр хүртэл эпидермисийн өсөлтийн хүчин зүйл (EGF; 20 нг мл-1; R&D Systems) болон фибробласт өсөлтийн хүчин зүйл 2 (FGF2; 20 нг мл-1; R&D Systems)-ээр нэмэлт тэжээл өгсөн. 25-аас 42 дахь өдөр хүртэл тэжээллэг бодисыг тархины гаралтай нейротрофийн хүчин зүйл (BD-2, BD-2)-аар дүүргэсэн. нейротрофин 3 (NT3; 20 нг мл-1; Пепротек) өдөр бүр дунд зэргийн өөрчлөлттэй.Суспензийн зургаа дахь өдөр мэдрэлийн сфероидыг Neurobasal-A (10888, Life Technologies), витамин А агуулаагүй В-27 бэлдмэл (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), пенициллин агуулсан мэдрэлийн орчинд шилжүүлсэн.ба стрептомицин (1:100, Life Technologies) ба дополнены эпидермальны хүчин зүйл (EGF; 20 нг/мл; R&D Systems) ба 24-аас дээш насны фибробластов (FGF2; 20 нг/мл; R&D Systems) хүчин зүйлүүд. болон стрептомицин (1:100, Life Technologies) агуулсан ба эпидермисийн өсөлтийн хүчин зүйл (EGF; 20 нг/мл; R&D Systems) болон фибробласт өсөлтийн хүчин зүйл 2 (FGF2; 20 нг/мл; R&D Systems) -ийг 24 дэх өдөр хүртэл хэрэглэнэ.25-аас 42 дахь хоногоос тархины гаралтай нейротрофийн хүчин зүйл (BDNF; 20 нг мл-1, Пепротек) болон нейротрофин 3 (NT3; 20 нг мл-1, Пепротек) хоёр өдөр тутам сольж, тэжээлт орчинд нэмсэн.在悬浮的第6 天，将神经球体转移到含有neurobasal-A（10888，Life Technologies）、不含维维甄B-生补充剂（12587，Life Technologies）、GlutaMax（1:100，Life Technologies）、青霉素的神经培养基中咏培养基中弈0:10 Technologies）并辅以表皮生长因子（EGF；20 нг мл-1；R&D Systems）和成纤维细胞生长因子2（R&2；G Системүүд）直至第24 天。在 悬浮 的 第 第 6 天 将 神经 球体 转移 含有 含有 neurobasal-a （10888 ， Life Technologies－ 维维的 b-27 补充剂 （12587 ， Life Technologies） Glutamax （1: 100 ， Life TechNOGIS青霉素 的 神经 培养 基 :（综1 100 ， Life Technologies） 表皮 生长 因子 （（（20 нг мл-1 ； r & d систем） 成 纤维 细胞 生长 细胞 生长 2（fg-2；ng 1；R&D Systems）直至第24天。 Добавку, содержащюю нейробазал-А (10888, Life Technologies), добавку В-27 без витамина А (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), 6-р сарын турш суспензии нейросфери болон переведени, Life Technologies. стрептомицин (1:100, Life Technologies) эпидермаль ногоо хүчин зүйл (EGF; 20 нг мл-1; R&D Systems) ба 20 нг мл-1 (FGF2; 20 нг мл-1) 1; 6 дахь өдөр neurosphere суспензийг neurobasal-A (10888, Life Technologies), витамин А агуулаагүй В-27 бэлдмэл (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), пенициллинээр саармагжуулсан Life Technologies (1:101) агуулсан нэмэлт тэжээлд шилжүүлэв. эпидермисийн өсөлтийн хүчин зүйл (EGF; 20 нг мл-1; R&D Systems) болон фибробласт өсөлтийн хүчин зүйл 2 (FGF2; 20 нг мл-1) 1-ээр нэмэгдүүлсэн; R&D Systems) хүртэл 24-го. R&D Systems) 24 хоног хүртэл.25-аас 42 дахь хоногоос тархины гаралтай нейротрофийн хүчин зүйл (BDNF; 20 нг мл-1, Пепротек) болон нейротрофийн хүчин зүйл 3 (NT3; 20 нг мл-1, Пепротек) хоёр өдөр тутамд өсгөвөрлөх орчинд нэмсэн. Дунд зэргийн өөрчлөлтийг нэг удаа хийнэ.43 дахь өдрөөс эхлэн hCO-ийг нэмэлт тэжээлгүй нейробазал-А орчинд (NM; 1088022, Thermo Fisher) 4-6 хоног тутам дунд зэргийн өөрчлөлттэй байлгасан. Тэжээгчгүй нөхцөлд өсгөвөрлөсөн hiPS эсүүдээс hCO авахын тулд hiPS эсийг Accutase (AT-104, Innovate Cell Technologies)-д 370С-т 7 минутын турш өсгөвөрлөж, нэг эсүүдэд салгаж, AggreWell 800 хавтан дээр (34815, STEMCELL Technologies 1 × 3 цооног тутамд) бүрсэн. ROCK дарангуйлагч Y-27632 (10 μM; S1049, Selleckchem) -ээр нэмэгдүүлсэн чухал 8 орчин. 24 цагийн дараа цооног дахь зөөвөрлөгчийг дорсоморфин (2.5 μM; P5499, Sigma-Aldrich) болон SB-431542 (10 μM4); , Токрида). 2-6 дахь өдөр Essential 6 тэжээлийг дорсоморфин болон SB-431542 нэмэлтээр өдөр бүр сольсон. Зургаа дахь өдрөөс эхлэн нейросферийн суспензийг нейробазал орчинд шилжүүлж, дээр дурдсанчлан хадгалсан.
Амьтны бүх процедурыг Стэнфордын Их Сургуулийн Лабораторийн Амьтны Арчилгааны Захиргааны Хорооноос (APLAC) баталсан амьтны арчилгааны удирдамжийн дагуу гүйцэтгэсэн. Жирэмсэн euthymic RNU (rnu/+) хархыг худалдаж авсан (Charles River Laboratories) эсвэл байрласан. Амьтдыг 12 цагийн гэрэл-харанхуйн мөчлөгт хоол хүнс, усаар хязгаарладаг байв. Гураваас долоон хоногтой нүцгэн (FOXN1–/–) хархны гөлөгнүүдийг устгахын өмнө боловсорч гүйцээгүй сахал ургаснаар тодорхойлогджээ. Гөлөг (эрэгтэй, эмэгтэй) 2-3% изофлуранаар мэдээгүйжүүлж, стереотаксик хүрээ дээр байрлуулсан. S1-ээс дээш ойролцоогоор 2-3 мм диаметртэй гавлын ясны трепанацийг дура материйн бүрэн бүтэн байдлыг хадгалахын зэрэгцээ гүйцэтгэсэн. Дараа нь гавлын ясны гадна талд 30-Г зүү (ойролцоогоор 0.3 мм) ашиглан дура-г цоолно. Дараа нь 3х3 см-ийн нимгэн парафилм дээр HCO түрхэж, илүүдлийг арилгана. 23 Г, 45° зүүнд залгасан Хамилтон тариурыг ашиглан зүүний хамгийн алслагдсан хэсэгт hCO-г зөөлөн татна. Дараа нь стереотаксик төхөөрөмжтэй холбогдсон тариурын шахуурга дээр тариурыг суулгана. Дараа нь зүүний үзүүрийг өмнө нь хийсэн 0.3 мм-ийн өргөнтэй цоорсон нүхэнд (z = 0 мм) байрлуулж, тариурыг 1-2 мм (z = ойролцоогоор -1.5 мм) нарийсгаж, зүү нь A dura mater-ийн хооронд байх хүртэл нягт битүүмжлэл үүснэ. Дараа нь тариурыг кортикал гадаргуугийн төв рүү z = -0.5 мм-ээр дээшлүүлж, hCO-г минутанд 1-2 мкл-ийн хурдаар тарина. HCO-ийн тарилга хийж дууссаны дараа зүүг минутанд 0.2-0.5 мм-ийн хурдаар татаж, арьсыг нь оёж, гөлөг бүрэн эдгэртэл нь дулаан дулаан дэвсгэр дээр нэн даруй байрлуулна. Зарим амьтдыг хоёр талт шилжүүлэн суулгасан.
Амьтны бүх процедурыг Стэнфордын Их Сургуулийн APLAC-аас баталсан амьтны арчилгааны удирдамжийн дагуу гүйцэтгэсэн. Хархыг (шилжүүлэн суулгасны дараа 60-аас дээш хоног) 5% изофлуран мэдээ алдуулалтаар өдөөж, зураг авах явцад 1-3% изофлуранаар мэдээ алдуулжээ. Дүрслэхийн тулд AVANCE ашиглан олон улсын цахилгаан компанийн (IECO) градиент хөтөч бүхий 7 Tesla идэвхтэй хамгаалагдсан хэвтээ цооногийн сканнер Bruker (Bruker Corp.), 120 мм (600 мТ/м, 1000 Т/м/с) дотоод диаметр бүхий хамгаалагдсан градиент оруулга ашигласан. III, найман сувгийн олон ороомогтой RF болон олон цөмт чадавхи, дагалдах Paravision 6.0.1 платформ. Бичлэгийг 86 мм-ийн дотоод диаметр бүхий идэвхтэй салгасан эзэлхүүний RF ороомог, зөвхөн хүлээн авах зориулалттай дөрвөн сувгийн крио хөргөлттэй RF ороомог ашиглан хийсэн. Axial 2D Turbo-RARE (давталтын хугацаа = 2500 мс, цуурай хийх хугацаа = 33 мс, 2 дундаж) 16 зүсмэл зураг авалттай, зүсмэлийн зузаан 0.6–0.8 мм, 256 × 256 дээж агуулсан. Дотор диаметр нь 2 см (Rapid MR International, LLC) бүхий квадрат дамжуулагчийн эзэлхүүний RF ороомог ашиглан дохиог хүлээн авсан. Эцэст нь, 3D дүрслэл болон эзэлхүүний шинжилгээнд зориулж суурилуулсан Imaris (BitPlane) гадаргуугийн үнэлгээний функцийг ашиглана уу. Амжилттай шилжүүлэн суулгах мэс засал нь шилжүүлэн суулгасан хагас бөмбөрцөгт тасралтгүй T2 жинтэй MRI дохионы хэсгүүд үүссэн гэж тодорхойлсон. Суулгацын татгалзал нь шилжүүлэн суулгасан тархи дахь тасралтгүй T2 жинтэй MRI дохиог үүсгэдэггүй шилжүүлэн суулгах гэж тодорхойлсон. Кортикийн доорх t-hCO-г дараагийн шинжилгээнээс хассан.
Хоёр фотоны кальцийн дүрслэлд зориулж GCaMP6s-ийг hCO-д тогтвортой илэрхийлэхийн тулд hiPS эсүүдийг pLV[Exp]-EF1a::GcaMP6s-WPRE-Puro-ээр халдварлаж, дараа нь антибиотикийг сонгов. Товчхондоо эсүүдийг EDTA-тай салгаж, полибрен (5 мкг/мл) болон 15 мкл вирусын дэргэд ойролцоогоор 300,000 эсийн нягттай 1 мл Essential 8 орчинд түдгэлзүүлсэн. Дараа нь эсүүдийг суспензэнд 60 минутын турш өсгөвөрлөж, нэг нүхэнд 50,000 эсийн нягтралтай үржүүлэв. Нийлсэний дараа эсийг 5-10 мкг мл-1 пуромициноор 5-10 хоног буюу тогтвортой колони үүсэх хүртэл эмчилнэ. Цочмог hCO халдварыг өмнө нь тайлбарласны дагуу5 зарим өөрчлөлтөөр хийсэн. Товчхондоо, 30-45 hCO хоногийн 100 мкл мэдрэлийн орчин агуулсан 1.5 мл-ийн Эппендорф микроцентрифугийн хоолойд шилжүүлнэ. Дараа нь ойролцоогоор 90 мкл орчинг зайлуулж, 3-6 мкл өндөр титртэй лентивирусыг (0.5 x 108-аас 1.2 х 109 хүртэл) хоолойд нэмж, hCO-г 30 минутын турш инкубаторт шилжүүлнэ. Дараа нь хоолой бүрт 90-100 мкл тэжээл нэмж, хоолойг инкубаторт хонуулна. Дараагийн өдөр нь hCO-г шинэ мэдрэлийн орчинд бага хавсаргасан хавтангаар шилжүүлнэ. 7 хоногийн дараа hCO-г 24 цооногтой шилэн ёроолын хавтан руу шилжүүлж, халдварын чанарыг харж, үнэлэв. pLV[Exp]-SYN1::EYFP-WPRE болон pLV[Exp]-SYN1::hChR2-EYFP-WPRE-г VectorBuilder үүсгэсэн. Лентивирусыг ихэнх туршилтуудад ашигладаг, учир нь энэ нь эзэн геномтой нэгдэж, халдвар авсан эсийн шугамд сурвалжлагч генийг илэрхийлэх боломжийг олгодог. Галзуу өвчний хяналтанд 30-45 дахь өдөр hCO-г галзуу-ΔG-eGFP болон AAV-DJ-EF1a-CVS-G-WPRE-pGHpA (плазмид №67528, Addgene)-тай хавсарч 3 хоногийн турш сайтар угааж, S1-д шилжүүлэн суулгаж, 7 хоногийн турш харханд шилжүүлэн суулгасан.
Иммуноцитохимийн шинжилгээнд амьтдад мэдээ алдуулалт хийж, PBS, дараа нь 4%-ийн параформальдегид (PFA in PBS; Electron Microscopy Sciences)-ээр зүрхний транскардиалаар сэлбэсэн. Тархийг 4% PFA-д 2 цаг буюу 4°С-т шөнийн турш тогтоон, 30%-ийн сахароз дахь PBS-д 48-72 цагийн турш крио хадгалан, 1:1, 30% сахарозонд суулгасан: OCT (Tissue-Tek OCT Compound 4583, Sakura Finetek 4583) болон coron a cr3r-ээр хийсэн. (Лейка). Зузаан хэсгүүдийн иммуногистохимийн шинжилгээг хийхийн тулд амьтдад PBS-ээр шингээж, тархийг нь задлан 300-400 μм-т вибратом (Leica) ашиглан титэм хэсэгт хувааж, хэсгүүдийг 4% PFA-тай 30 минутын турш бэхэлсэн. Дараа нь криосекция буюу зузаан хэсгүүдийг PBS-ээр угааж, тасалгааны температурт 1 цагийн турш (Илжигний хэвийн ийлдсийн 10% (NDS) ба 0.3% Triton X-100-ийг PBS-д шингэлсэн) 4 ° C-ийн температурт блоклох уусмалаар хаасан. – Инкубацийн Криосексийг нэг шөнийн дотор өсгөвөрлөж, зузаан хэсгүүдийг 5 хоногийн турш өсгөвөрлөсөн. Хэрэглэсэн үндсэн эсрэгбиемүүд нь: NeuN (хулгана, 1:500; ab104224, abcam) эсрэг CTIP2 (харх, 1:300; ab18465, abcam), эсрэг GFAP (туулай, 1:1,000; Z0334, Дако), эсрэг GFP (chick, GTX100;) GeneTex), эсрэг HNA (хулгана, 1:200; ab191181, abcam), эсрэг NeuN (туулай, 1:500; ABN78, Millipore), эсрэг PDGFRA (туулай, 1:200; sc-338, Санта Круз), эсрэг PPP1R17 (туулай, H410:2070; Эсрэг биетүүд), анти-RECA-1 (хулгана, 1:50; ab9774, abcam), эсрэг SCG2 (туулай, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), эсрэг SOX9 (ямаа, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin, R010; Системүүд), анти-STEM121 (хулгана, 1:200; Y40410, Takara Bio), эсрэг SATB2 (хулгана, 1:50; ab51502, abcam), эсрэг GAD65/67 (туулай, 1:400; ABN904, Millipore) болон эсрэг IBA1 (goat, ab17, ab10;). Хэрэглэсэн үндсэн эсрэгбие нь: NeuN (хулгана, 1:500; ab104224, abcam) эсрэг CTIP2 (харх, 1:300; ab18465, abcam), анти-GFAP (туулай, 1:1,000; Z0334, Дако), эсрэг, GFP (chick, GTX190,); GeneTex), эсрэг HNA (хулгана, 1:200; ab191181, abcam), эсрэг NeuN (туулай, 1:500; ABN78, Millipore), эсрэг PDGFRA (туулай, 1:200; sc-338, Санта Круз), эсрэг PPP1R17 (туулай, H410:2070; Эсрэг биетүүд), анти-RECA-1 (хулгана, 1:50; ab9774, abcam), эсрэг SCG2 (туулай, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9 (ямаа, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin, G061a; R&D Systems), anti-STEM121 (хулгана, 1:200; Y40410, Takara Bio), эсрэг SATB2 (хулгана, 1:50; ab51502, abcam), эсрэг GAD65/67 (туулай, 1:400; ABN904, Millipore) болон эсрэг, IBA01, (ab,0101; abcam). Использовались следующие первичные антитела: анти-NeuN (мышиные, 1:500; ab104224, abcam), анти-CTIP2 (крысиные, 1:300; ab18465, abcam), анти-GFAP (кроличьи, Z:1034), анти; (курица, 1:1000; GTX13970, GeneTex), анти-HNA (мышь, 1:200; ab191181, abcam), анти-NeuN (кролик, 1:500; ABN78, Millipore), анти-PDGFRA (кролик, 1:200, anti-PDGFRA), anti-PDGFRA (кролик, 1:200, anti-Sc3P780); (кролик, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), анти-RECA-1 (мышь, 1:50; ab9774, abcam), анти-SCG2 (кролик, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9 (козий 3070; нетрин G1a (козий, 1:100; AF1166, R&D Systems), анти-STEM121 (мышиный , 1:200; Y40410, Takara Bio), анти-SATB2 (мышь, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/640N (AB409); Millipore) ба анти-IBA1 (коза, 1 :100; аб5076, абкам). Хэрэглэсэн үндсэн эсрэгбие нь: эсрэг NeuN (хулгана, 1:500; ab104224, abcam), анти-CTIP2 (харх, 1:300; ab18465, abcam), анти-GFAP (туулай, 1:1000; Z0334, Dako), эсрэг GFP (тахиа, GTX100); эсрэг HNA (хулгана, 1:200; ab191181, abcam), эсрэг NeuN (туулай, 1:500; ABN78, Millipore), эсрэг PDGFRA (туулай, 1:200; sc-338, Санта Круз), эсрэг PPP1R17 (туулай, H1908; At1908); эсрэг RECA-1 (хулгана, 1:50; ab9774, abcam), эсрэг SCG2 (туулай, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), эсрэг SOX9 (ямаа, 1:500; AF3075, R&D Systems), netrin G1a (ямаа, R16; систем), R16; STEM121 (хулгана, 1:200; Y40410, Takara Bio), эсрэг SATB2 (хулгана, 1:50; ab51502, abcam), эсрэг GAD65/67 (туулай, 1:400; ABN904, Millipore) болон эсрэг IBA1 (ямаа, abkam, 1507).使用的一抗是：抗NeuN（小鼠＠,1:500；ab104224，abcam）抗CTIP2（大鼠＠,1:3 00；ab18465，abcam），抗GFAP（兔，1:1,000；Z0334，Дако）,抗-GF P（鸡，1:1,000；GTX13970，GeneTex），抗HNA（小鼠＠,1:200；ab1911 81，abcam），抗NeuN（兔，1:500；ABN78，Millipore），抗PDGFRA（兔， 1:200；sc-338，Санта Круз），抗PPP1R17（兔，1:200；HPA047819，Атлас抗体），抗RECA-1（小鼠＠,1:50；ab9774，abcam），抗SCG2（兔）, 1:100；20357-1-AP，Proteintech），抗SOX9（山羊，1:500；AF3075，R&D систем）， Netrin G1a（山羊（山羊（山羊6，6；11:11 Системүүд），抗STEM121（小鼠, 1:200;使用的一抗是：抗NeuN（小鼠＠,1:500；ab104224，abcam）抗CTIP2（大鼠＠，1 :300；ab18465，abcam），抗GFAP（兔，1:1,000；Z0334，Дако），抗-GFP（鸡，1:1,000；GTX13970，GeneTex），抗HNA（小鼠＠,1:200；ab 191181，abcam），抗NeuN（兔，1:500；ABN78，Millipore％弔４抗1: 200；sc-338，Санта Круз），抗PPP1R17（兔，1:200；HPA047819，Атлас抗体），抗RECA-1（小鼠＠,1:50；ab9774，abcam），抗SCG2 100；20357-1-AP，Proteintech），抗SOX9（山羊，1:500；AF3075，R&D Systems），Netrin G1a（山羊；AF；110D, 1:10D Системүүд）頏1:20, ;Y40410, Takara Bio), эсрэг SATB2 (хулгана, 1:50; ab51502, abcam), эсрэг GAD65/67 (туулай, 1:400; ABN904, Millipore) болон эсрэг IBA1 (ямаа, 1:100; ab5076, abcam)。Хэрэглэсэн үндсэн эсрэгбие нь: эсрэг NeuN (хулгана, 1:500; ab104224, abcam), анти-CTIP2 (харх, 1:300; ab18465, abcam), эсрэг GFAP (туулай, 1:1000; Z0334, Дако). , эсрэг GFP (тахиа, 1:1000; GTX13970, GeneTex), эсрэг HNA (хулгана, 1:200; ab191181, abcam), эсрэг NeuN (туулай, 1:500; ABN78, Millipore), эсрэг PDGFRA ( туулай, СНта3:20, ск13;- эсрэг PPP1R17 (туулай, 1:200; HPA047819, Атлас эсрэгбие), анти-RECA-1 (хулгана, 1:50; ab9774, abcam), эсрэг SCG2 (туулай), 1:100;20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9 (коза, 1:500; AF3075, R&D Systems), Нетрин G1a (коза, 1:100; AF1166, R&D Systems), анти -STEM121 (мышь, 1:200; Takara, Y40410) 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (кролик, 1:400; ABN904, Millipore) болон анти-IBA1 (коза, 1:100; аб5076, абкам). 20357-1-AP, Proteintech), эсрэг SOX9 (ямаа, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (ямаа, 1:100; AF1166, R&D Systems), анти-STEM121 (хулгана, 1:200, Takaramo, Biouse), 1:50; ab51502, abcam), эсрэг GAD65/67 (туулай, 1:400; ABN904, Millipore) болон эсрэг IBA1 (ямаа, 1:100; ab5076, abkam).Дараа нь хэсгүүдийг PBS-ээр угааж, хоёрдогч эсрэгбиемийг тасалгааны температурт (хөлдөөсөн хэсгүүдэд) 1 цагийн турш эсвэл 4 ° C-т (зузаан хэсгүүдэд) шөнийн турш өсгөвөрлөнө. Блоклох уусмалд 1:1000 харьцаагаар шингэлсэн Alexa Fluor хоёрдогч эсрэгбие (Life Technologies) ашигласан. PBS-ээр угаасны дараа бөөмийг Hoechst 33258 (Life Technologies) ашиглан дүрсэлсэн. Эцэст нь слайдуудыг Aquamount (Polysciences) ашиглан хавтастай (Fisher Scientific) микроскоп дээр байрлуулж, зураг дээрх Keyence флюресцент микроскоп (BZ-X анализатор) эсвэл Leica TCS SP8 конфокаль микроскоп (Las-X) дээр шинжилэв. Зургуудыг ImageJ программ (Фижи) ашиглан боловсруулсан. t-hCO болон хархны бор гадар дахь хүний ​​мэдрэлийн эсийн эзлэх хувийг тодорхойлохын тулд t-hCO-ийн төв хэсэгт, хархны бор гадаргын ирмэг дээр эсвэл ойролцоох 387.5 мкм өргөн тэгш өнцөгт дүрсийг авсан. Залгаасны ирмэгийг эдийн ил тод байдал, HNA+ цөм болон/эсвэл эд эсийн автофлуоресценцийн өөрчлөлтийг үнэлэх замаар тодорхойлсон. Зураг бүр дээр NeuN+ ба HNA+ эсийн нийт тоог ижил хэсэгт байгаа NeuN+ эсийн нийт тоонд хуваасан. Зөвхөн зургийн хавтгайд цөмтэй эсүүдийг тоолохын тулд зөвхөн Hoechst+ эсийг тооцоонд оруулсан болно. Статистикийн алдааг багасгахын тулд дор хаяж 1 мм-ээр тусгаарлагдсан хоёр зургийг дундажлав.
Дээж цуглуулахаас нэг долоо хоногийн өмнө hCO шилжүүлэн суулгах амьтдыг (ойролцоогоор 8 сараар ялгах) мэдрэхүйн сэрэл өдөөлтийг багасгахын тулд сахлаа зүссэн харанхуй өрөөнд байрлуулна. Цөмийн тусгаарлалтыг өмнө нь тайлбарласны дагуу зарим өөрчлөлтөөр хийсэн. Товчхондоо, t-hCO болон hCO-г угаалгын нунтаг-механик эсийн задрал, 2 мл шилэн даавуу бутлуур (D8938, Sigma-Aldrich/KIMBLE) ашиглан устгасан. Дараа нь түүхий бөөмийг 40 μм шүүлтүүр ашиглан шүүж, сахарозын нягтын градиент хийхээс өмнө 320 г-т 4 ° C-т 10 минутын турш центрифуг хийв. Центрифугийн алхамын дараа (4°С-т 20 минутын турш 320 грамм) дээжийг 0.04% BSA/PBS-д 0.2 нэгж μl-1 RNase дарангуйлагч (40 uµl-1, AM2682, Ambion) нэмээд 40 мкм-ийн шүүлтүүрээр дамжуулав. Дараа нь задарсан цөмүүдийг 0.02% BSA агуулсан PBS-д дахин түдгэлзүүлж, Chromium Single Cell 3′ чип дээр ачааллаа (нэг эгнээнд 8000 эс сэргэнэ гэж тооцоолсон). snRNA-seq сангуудыг Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) ашиглан бэлтгэсэн. snRNA-seq сангуудыг Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) ашиглан бэлтгэсэн. Библиотеки snRNA-seq были приготовлены с помощью Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). snRNA-seq сангуудыг Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) ашиглан бэлтгэсэн. snRNA-seq 文库是使用Chromium Single cell 3′ GEM、Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) 制备的。 snRNA-seq 文库是使用Chromium Single cell 3′ GEM、Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) 制备的。 Библиотеку snRNA-seq готовили ашиглан Chromium Single Cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). snRNA-seq номын санг Chromium Single Cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) ашиглан бэлтгэсэн.Admera Health NovaSeq S4 (Illumina) дээр янз бүрийн дээжийн сангуудыг нэгтгэж, дараалуулсан.
Цөмийн бар код тус бүрийн генийн илэрхийллийн түвшинг 10x Genomics CellRanger шинжилгээний програм хангамжийн багц (хувилбар 6.1.2) ашиглан хэмжсэн. Тодруулбал, уншилтыг mkref командаар үүсгэсэн хүний ​​(GRCh38, Ensemble, хувилбар 98) болон харх (Rnor_6.0, Ensemble, хувилбар 100) лавлагааны геномын хослолтой тааруулж, тоолохдоо –include-introns=TRUE командыг ашиглан интрон мужид буулгасан уншилтуудыг оруулсан. t-hCO дээжийн хувьд хүний ​​цөмийг бүх зурагласан уншилтын дор хаяж 95% нь хүний ​​геномтой таарч байх ёстой гэсэн консерватив шаардлагад үндэслэн тодорхойлсон. Дараачийн бүх шинжилгээг R багц (хувилбар 4.1.2) Seurat (хувилбар 4.1.1)32 ашиглан CellRanger-аас шүүсэн бар кодын массив гаралт дээр хийсэн.
Дараагийн шинжилгээнд зөвхөн өндөр чанарын цөмийг оруулахын тулд дээж тус бүрт давтагдах шүүлтүүрийн процессыг хэрэгжүүлсэн. Нэгдүгээрт, 1000-аас бага өвөрмөц гентэй чанар муутай цөмийг илрүүлж, нийт митохондрийн 20 гаруй хувийг тодорхойлж, устгадаг. Дараа нь түүхий генийн тооны матрицыг sctransform(vst.flavor=”v2″) функцийг ашиглан тогтмол сөрөг бином регрессийн аргаар хэвийн болгосон ба энэ нь мөн анхдагч параметрүүдийг ашиглан хамгийн их хувьсагч 3000 генийг тодорхойлсон. Хэмжээг бууруулах ажлыг үндсэн параметрийн CA-ийн үндсэн параметрийн өгөгдлөөр (CA) ашиглан дээд хувьсах генүүд дээр хийсэн. 30 (dims = 30-ийг өвдөгний хэсгүүдийн харааны үзлэгт үндэслэн сонгосон бөгөөд бүх дээж болон чуулгын шинжилгээнд ашигласан) Дараа нь бид генийг хэвийн бус бага (10-р хувиас доош дундаж), хэвийн бус өндөр генийн 9-ээс дээш хувь) ангилахын тулд хэд хэдэн давталттай кластер хийх (тодорхойлолт = 1) хийсэн. DoubletFinder33 багцыг ашиглан тодорхойлогдсон бага чанарын кластерууд ба/эсвэл ихрүүдийн өндөр хувийг (t-hCO дээжийн дундаж оноо (n=3)) болон hCO-ийн дээжийг (n=3) тус тусад нь IntegrateData функцээр тус тусад нь нэгтгэсэн дээрх.
Чанар муутай цөмүүдийг устгасны дараа нэгдсэн өгөгдлийн багцыг бүлэглэж (нарийвчилсан нягтрал = 0.5) UMAP34 дүрслэх зорилгоор суулгасан. Кластер тус бүрийн маркер генийг FindMarkers функцийг ашиглан генийн илэрхийлэлийн өгөгдлөөр тооцсон өгөгдмөл параметрүүдийг тодорхойлсон. Бид ургийн болон насанд хүрэгчдийн кортикал лавлагааны өгөгдлийн багцыг 19,20,21,35 маркер генийн илэрхийлэл, тайлбартай хослуулан үндсэн эсийн ангиллыг тодорхойлж, ангилдаг. Ялангуяа эргэлтийн прекурсоруудыг MKI67 ба TOP2A-ийн илэрхийлэлээр тодорхойлсон. Ургийн бөөгнөрөл нь митозын транскрипт байхгүй, ургийн метафазын хожуу үе шатанд дүрслэгдсэн олон потент глиал өвөг дээдсийн кластеруудтай давхцаж, EGFR болон OLIG1 илэрхийлэлээр тодорхойлогддог. Бид астроцит гэдэг нэр томъёог хожуу радиаль glia-аас эхлээд астроцитийн боловсорч гүйцэх хүртэлх астроцитийн ялгах хэд хэдэн төлөвийг хамруулахад ашигладаг. Астроцитийн бөөгнөрөл нь SLC1A3 ба AQP4-ийн өндөр түвшинг илэрхийлдэг бөгөөд ургийн радиаль глиа ба/эсвэл насанд хүрсэн астроцитуудын дэд төрлүүдийг харуулсан зураглалыг харуулсан. OPC нь PDGFRA ба SOX10-ийг илэрхийлдэг бол олигодендроцитууд миелинжилтийн маркеруудыг (MOG ба MYRF) илэрхийлдэг. Глутаматергийн мэдрэлийн эсүүд нь мэдрэлийн эсүүд (SYT1 ба SNAP25), GABAergic маркерууд (GAD2) байхгүй, NEUROD6, SLC17A7, BCL11B, эсвэл SATB2-ийн илэрхийлэлээр тодорхойлогддог. GluN мэдрэлийн эсүүдийг дээд (SATB2 илэрхийлэл ба BCL11B-ийн алдагдал) болон гүн (BCL11B илэрхийлэл) дэд ангилалд хуваасан. Боломжит дэд хавтан (SP) нейронууд нь гүн GluN маркеруудаас гадна ST18, SORCS1 зэрэг мэдэгдэж буй SP18 маркеруудыг илэрхийлдэг. Choroid plexus төст эсүүдийг TTR илэрхийлэлээр тодорхойлсон ба менингеал төст эсүүд нь фибробласттай холбоотой генүүд болон лавлагаа мэдээллийн багцын зурагласан пиал/судасны эсүүдийг илэрхийлсэн.
T-hCO болон hCO дэд ангиудын хоорондох генийн илэрхийлэлд ялгах шинжилгээг Libra R багц (хувилбар 1.0.0) ашиглан хэрэгжүүлсэн дээжинд хуулбарласан шинээр боловсруулсан псевдо багц аргыг ашиглан хийсэн. Тодруулбал, түүврийн хуулбар бүрт тухайн эсийн ангийн эс дэх генийн тоог нэгтгэн бүлэгт зориулж edgeR бүртгэлийн магадлалын тестийг (хувилбар 3.36.0, R багц) хийсэн. Дулааны зураглалыг дүрслэхийн тулд нэг саяд нормчлогдсон (CPM) утгыг edgeR (cpm() функц) ашиглан тооцоолж, масштабаар тооцдог (дундаж = 0, стандарт хазайлт = 1 хүрэхийн тулд). Генийн онтологийн (GO) баяжуулалтын шинжилгээг ихээхэн нэмэгдүүлсэн t-hCO GluN генийн шинжилгээг хийсэн (Бенжамин-Хочберг t-hCO GluN эсийн дор хаяж 10% -д илэрхийлэгдсэн 0.05-аас бага P утгыг засч, өөрчлөлтийг дор хаяж 2 дахин нэмэгдүүлсэн). ToppGene Suite (https://toppgene.cchmc.org/) ашиглан гүйцэтгэсэн37. Бид ToppFun програмыг өгөгдмөл параметрүүдтэй ашигладаг бөгөөд GO-ийн тайлбартай гипергеометрийн туршилтаар тооцоолсон Бенжамин-Хочбергийн залруулсан P-утгыг мэдээлдэг.
Анхдагч нэг эсийн РНХ-seq эсвэл насанд хүрэгчдийн snRNA-seq19,20,21,22-ын лавлагаа судалгаагаар манай snRNA-seq кластеруудыг тэмдэглэсэн эсийн кластеруудтай тааруулахын тулд бид хосолсон өгөгдлийн багцыг нэгтгэх аргыг хэрэглэсэн. Бид Seurat дахь SCTransform (v2) хэвийн болгох ажлын урсгалыг ашиглан өгөгдлийн багц хоорондын кластерын давхцлыг нэгтгэж, харьцуулсан (дээрхтэй ижил параметрүүдийг ашиглан). Тооцооллын үр ашгийг хангах үүднээс анхны кластер бүрт 500 хүртэлх эс буюу цөм хүртэл бие даасан өгөгдлийн багцыг санамсаргүй байдлаар оруулсан. Өмнө дурьдсантай ижил төстэй аргыг ашиглан кластерын давхцлыг лавлагааны кластерын шошготой давхцаж буй нэгтгэсэн кластер бүрийн эс эсвэл бөөмийн эзлэх хувь гэж тодорхойлсон. GluN-ийг цаашид ангилахын тулд бид GluN-ийн дэд багц өгөгдлийн Seurat-ийн TransferData ажлын урсгалыг ашиглан GluN нүднүүдэд лавлагаа өгөгдлийн олонлогын шошгыг ашигласан.
t-hCO болон hCO дээжийн дэлхийн транскриптомын боловсорч гүйцсэн байдлыг үнэлэхийн тулд бид псевдо бөөн дээжийг хүний ​​тархины хөгжлийг хамарсан том РНХ дарааллаас бүрддэг BrainSpan/psychENCODE23-тай харьцуулсан. Бид жирэмслэхээс хойш 10 долоо хоногийн дараа, дараа нь тархины бор гадаргын дээжинд идэвхтэй гэж тодорхойлсон (бидний мэдээлэлтэй хамт) 5567 генд (хөгжлийн хэлбэлзлийн 50%-иас дээш гэж тодорхойлсон) (куб загвар ашиглан насаар тайлбарласан) генийн экспрессийн хосолсон матриц дээр PCA хийсэн. Нэмж дурдахад бид өмнө нь тайлбарласны дагуу сөрөг бус матрицын хүчин зүйлчлэлийг ашиглан мэдрэлийн хөгжлийн гол транскриптомын шинж тэмдгүүдтэй холбоотой генүүдийг гаргаж авсан. Сөрөг бус матрицын хүчин зүйлчлэлийг ашиглан тооцоолсон түүврийн жинг Зураг дээр үзүүлэв. 5b-д Zhu et al.38 тайлбарласан таван гарын үсэг тус бүрийн өргөтгөсөн өгөгдөлтэй. Дахин хэлэхэд үйл ажиллагаанаас хамааралтай транскрипцийн маркеруудыг өмнө нь хэвлэгдсэн судалгаанаас гаргаж авсан. Нэмэлт Хүснэгт 3 Hrvatin et al.16-аас харааны өдөөлтийн дараа хулганы харааны бор гадаргын snRNA-seq цуглуулгаар тодорхойлсон глутаматергик мэдрэлийн эсүүдэд ERG ба LRG нь мэдэгдэхүйц нэмэгдсэн байна. Хүний баяжуулсан LRG-ийг KCl-ээр идэвхжүүлсэн хүний ​​ургийн тархины өсгөвөрөөс гаргаж авсан бөгөөд өдөөлтөөс хойш 6 цагийн дараа хураан авсан бөгөөд шүүсэн генүүд хүний ​​хувьд мэдэгдэхүйц нэмэгдсэн боловч мэрэгч амьтдын хувьд тийм ч их биш байсан (Нэмэлт Хүснэгт 4). Эдгээр генийн багцыг ашиглан генийн багц баяжуулалтын шинжилгээг нэг талын Фишерийн нарийн тест ашиглан хийсэн.
Хархыг изофлуранаар мэдээ алдуулах, тархийг нь салгаж, хүйтэн (ойролцоогоор 4 ° C) хүчилтөрөгчтэй (95% O2 ба 5% CO2) сахарозын уусмалд 234 мМ сахароз, 11 мм глюкоз, 26 мМ NaHCO3, 2M25мл агуулсан хэсгүүдэд хийнэ. NaH2PO4, 10 мМ MgSO4 ба 0.5 мМ CaCl2 (ойролцоогоор 310 мОсм). t-hCO агуулсан хархны тархины титмийн хэсгийг (300-400 мкм) өмнө тайлбарласны дагуу Leica VT1200 vibratome ашиглан хийсэн39. Дараа нь хэсгүүдийг тасалгааны тасалгааны температурт тасралтгүй хүчилтөрөгчөөр хангадаг aCSF агуулсан тасалгааны камерт шилжүүлсэн: 10 мМ глюкоз, 26 мм NaHCO3, 2.5 мм KCl, 1.25 мм NaHPO4, 1 мм MgSO4, 2 мМ CaCl26mOl (NaHCO3) (2 мМ CaCl26ms) (NaHCO3). бичлэг хийхээс дор хаяж 45 минутын өмнө. Хэсэгүүдийг дүрсэн камерт бүртгэж, aCSF (95% O2 ба 5% CO2 хуруу шилэнд) -ээр тасралтгүй шахаж байсан. Бүх өгөгдлийг тасалгааны температурт бүртгэсэн. t-hCO нейроныг 127 мМ калийн глюконат, 8 мМ NaCl, 4 мМ магнийн ATP, 0.3 мм натрийн GTP, 10 мМ HEPES, 0.6 мМ HEPES, дотоод тохируулгатай KTA, OH2 уусмалаар дүүргэсэн боросиликатын шилэн соруураар дуусгав. (290 мОсм). Сэргээхийн тулд бичлэгийн уусмалд биоцитин (0.2%) нэмсэн.
Мэдээллийг MultiClamp 700B өсгөгч (Молекул төхөөрөмж) болон Digidata 1550B дижиталчлагч (Молекул төхөөрөмж) ашиглан цуглуулж, 2 кГц-т нам дамжуулалтаар шүүж, 20 кГц-т дижитал болгож, Clampfit (Молекул төхөөрөмж), Origin (OriginPro) ашиглан дүн шинжилгээ хийсэн. 2021b, OriginLab). болон захиалгат MATLAB функцууд (Mathworks). Холболтын потенциалыг JPCalc ашиглан тооцоолж, оруулгуудыг -14 мВ-ын тооцоолсон утгад тохируулсан. IV үйл ажиллагаа нь -250-аас 750 пА хүртэлх 10-25 pA алхмаар гүйдлийн цуврал алхмуудаас бүрдэнэ.
Өмнө дурьдсанчлан hCO нейроныг нөхөх хавчаараар бүртгэх явцад таламус, цагаан бодис, S1 afferents нь thalamokortical зүсмэлүүдэд цахилгаанаар өдөөгдсөн. Товчхондоо, тархийг 3D хэвлэх ширээн дээр 10 ° өнцгөөр хазайлгаж, тархины урд хэсгийг 35 ° өнцгөөр таслав. Дараа нь тархийг зүссэн гадаргуу дээр нааж, таламокортикал цухуйсан тэнхлэгүүдийг хадгалж, хэсэгчилсэн. Хоёр туйлт вольфрамын электродуудыг (0.5 MΩ) хоёр дахь микроманипулятор дээр суурилуулсан бөгөөд нэг эсийн дөрвөн бүсийг (дотоод капсул, цагаан бодис, S1 ба hCO) өдөөх зорилгоор стратегийн хувьд байрлуулсан. 0.03-0.1 Гц давтамжтай 300 мкА фазын өдөөлтийн дараа синаптик хариуг тэмдэглэ.
hChR2 илэрхийлэгч hCO нейронуудыг 480 нм-д идэвхжүүлж, LED (Prizmatix) -ээр үүсгэсэн гэрлийн импульсийг ×40 объектив (0.9 NA; Olympus) ашиглан эсийн ойролцоох hChR2 илэрхийллийг бүртгэсэн. Гэрэлтүүлгийн талбайн диаметр нь ойролцоогоор 0.5 мм, нийт хүч нь 10-20 мВт байна. Импульсийн өргөнийг 10 мс-ээр тохируулсан бөгөөд энэ нь зан төлөвийг судлах туршилтын үед өгсөн импульстэй тохирч байна. 1-ээс 20 Гц хүртэлх янз бүрийн өдөөлтийн давтамжийг ашигласан боловч тоон үзүүлэлтийн хувьд зөвхөн цувралын эхний импульсийг ашигласан. Синаптикийг дарангуйлах эсвэл хөнгөвчлөх замд үзүүлэх нөлөөг багасгахын тулд галт тэрэгний хоорондох зай нь ихэвчлэн 30 секундээс урт байдаг. hChR2-ийн хариу моносинаптик эсэхийг шалгахын тулд бид EPSC урвал арилах хүртэл усанд TTX (1 μM) түрхэж, дараа нь 4-аминопиридин (4-AP; 100 μM) түрхсэн. Ихэвчлэн LED асаах болон EPSC үүсгэх хооронд бага зэрэг удаан сааталтайгаар хэдхэн минутын дотор хариу ирдэг. NBQX (10 μM) нь хариу урвалыг AMPA рецептороор удирддаг эсэхийг шалгахад ашигласан.
Хурц hCO хэсгүүдийг өмнө нь тайлбарласны дагуу үүсгэсэн. Товчхондоо, hCO хэсгүүдийг 4% агарозд суулгаж, 126 мМ NaCl, 2.5 мм KCl, 1.25 мм NaH2PO4, 1 мМ MgSO4, 2 мм CaCl2, 26 мм NaHCO3 ба 10-lucos (M)-д хуваасан эсүүд рүү шилжүүлэв. Leica VT1200 чичиргээ ашиглан тасалгааны температурт 200-300 μм ба тасалгааны температурт ASF-д хадгална. Дараа нь шууд SliceScope микроскоп (Scientifica) дор hCO хэсгүүдэд бүхэл эсийн нөхөөсийн бичлэгийг хийсэн. Хэсгүүдийг aCSF (95% O2 ба 5% CO2) шингээж, өрөөний температурт эсийн дохиог тэмдэглэв. 127 мМ калийн глюконат, 8 мМ NaCl, 4 мм магнийн ATP, 0.3 мм натрийн GTP, 10 мм HEPES, 0.6 мм HEPES, дотооддоо тохируулсан 0.6 мH EGTA агуулсан уусмалаар дүүргэсэн боросиликатын шилэн пипеткээр hCO нейроныг хэрэглэнэ. 290). Сэргээх зорилгоор дотоод уусмалд 0.2% Биоцитин нэмнэ.
Мэдээллийг Clampex (Clampex 11.1, Молекулын төхөөрөмжүүд) MultiClamp 700B өсгөгч (Молекул төхөөрөмж) болон Digidata 1550B дижиталчлагч (Молекул төхөөрөмж) ашиглан авч, 2 кГц-т нам дамжуулалтаар шүүж, 20 кГц-т дижитал болгож, Clamp10-д дүн шинжилгээ хийсэн. төхөөрөмжүүд) болон тусгай MATLAB функцууд (MATLAB 2019b, Mathworks). Холболтын потенциалыг JPCalc ашиглан тооцоолж, оруулгуудыг -14 мВ-ын тооцоолсон уулзварын потенциалд тохируулсан. IV ажиллагаа нь -50-аас 250 рА хүртэлх 5-10 pA алхмаар гүйдлийн цуврал алхмуудаас бүрдэнэ.
Чимхэгдсэн мэдрэлийн эсийг морфологийн нөхөн сэргээх зорилгоор дотоод уусмалд 0.2% биоцитин (Сигма-Алдрих) нэмсэн. Хакердсаны дараа эсүүд дор хаяж 15 минутын турш праймертай байдаг. Дараа нь бүртгэгдсэн мембраныг бүрэн битүүмжлэх хүртэл пипеткийг 1-2 минутын турш аажмаар татна. Физиологийн хэсгийн физиологийн процедурын дараа зүсэлтүүдийг 4% PFA-д 4°С-т шөнийн турш бэхэлж, PBS X3-аар угааж, стрептавидин-коньюгат DyLight 549 эсвэл DyLight 405 (Vector Labs) -аар 1:1000 харьцаагаар шингэлэв. Биоцитин (2%; Сигма-Олдрих) дүүргэсэн эсүүдийг тасалгааны температурт 2 цагийн турш нөхөөсний хавчаарыг бүртгэх явцад тэмдэглэв. Дараа нь хэсгүүдийг Aquamount (Thermo Scientific) ашиглан микроскопийн слайд дээр суурилуулж, дараагийн өдөр нь Leica TCS SP8 конфокаль микроскопоор тоон нүхтэй × 40 1.3, томруулдаг × 0.9-1.0, xy бүхий тосонд дүрэх объектив ашиглан дүрсэлсэн. Дээж авах хурд нь микрон тутамд ойролцоогоор 7 пиксел байна. 1 μм-ийн зайтай Z-стекийг цуваа гаргаж авсан ба нейрон бүрийн дендрит модыг бүхэлд нь хамрахын тулд z-стек мозайк болон Leica-д суурилсан автомат оёдол хийсэн. Дараа нь neuTube 40 интерфейсийг ашиглан мэдрэлийн эсүүдийг хагас гараар хянаж, SWC файлуудыг үүсгэсэн. Дараа нь файлуудыг SimpleNeuriteTracer41 Fiji залгаас руу (ImageJ, хувилбар 2.1.0; NIH) байршуулсан.
Стэнфордын их сургуулийн Байгууллагын хяналтын зөвлөлөөс баталсан протоколын дагуу хүний ​​кортикал эдийг мэдээлэлтэй зөвшөөрлийн дагуу авсан. Галд тэсвэртэй эпилепсийн мэс заслын нэг хэсэг болох урд талын бор гадаргыг (дунд фронтын гирус) тайрч авах замаар төрсний дараах үеийн хүний ​​эд эсийн хоёр дээжийг (3 ба 18 настай) авсан. Ресекцийн дараа эдийг 92 мм NMDG, 2.5 мм KCl, 1.25 мм NaH2PO4, 30 мм NaHCO3, 20 мм HEPES, 25 мм глюкоз, 2 мМбамт, 2 мМбамт5, мөс шиг хүйтэн NMDG-aCSF-д хураана. 3 мМ натрийн пируват, 0.5 мМ CaCl2 4H2O ба 10 мМ MgSO4 7H2O. Төвлөрсөн давсны хүчлээр рН 7.3-7.4 хүртэл титрлэнэ. Эд эсийг 30 минутын дотор лабораторид хүргэж, дээр дурдсан журмын дагуу титмийн зүслэгийг авсан.
Амьтны бүх процедурыг Стэнфордын Их Сургуулийн APLAC-аас баталсан амьтны арчилгааны удирдамжийн дагуу гүйцэтгэсэн. Хархыг (шилжүүлэн суулгасны дараа 140 хоногоос дээш хугацаагаар) 5% изофлураны мэдээ алдуулалтаар өдөөж, хагалгааны явцад 1-3% изофлуранаар мэдээ алдуулалт хийсэн. Амьтдыг стереотаксик системд (Kopf) байрлуулж, тасралтгүй ялгаруулдаг бупренорфин (SR) арьсан дор тарьсан. Гавлын ясыг ил гаргаж, цэвэрлэж, 3-5 ясны боолтыг оруулдаг. t-hCO-г чиглүүлэхийн тулд бид MRI зургуудаас стереотаксик координатуудыг үүсгэсэн. Сонирхож буй газарт нь нүх өрөмдөж, утаснуудыг (400 μм диаметртэй, NA 0.48, Doric) hCO гадаргуугаас 100 μм доош буулгаж, хэт ягаан туяанд тэсвэртэй шүдний цементээр (Relyx) гавлын ясанд бэхэлсэн.
Шилэн фотометрийн бичлэгийг өмнө тайлбарласны дагуу хийсэн42. Аяндаа байгаа үйл ажиллагааг бүртгэхийн тулд хархыг цэвэр торонд хийж, шилэн оптик фотометрийн өгөгдөл цуглуулах системд холбогдсон 400 микрон диаметртэй шилэн кабелийг (Дорик) суулгасан шилэн кабельд холбосон. Хөдөлгөөний үйл ажиллагааны 10 минутын бичлэгийн үеэр амьтад торыг чөлөөтэй судлах боломжтой байв. Өдөөгдсөн үйл ажиллагааг бүртгэхийн тулд хархыг (шилжүүлэн суулгаснаас хойш 140 гаруй хоногийн дараа) индукцийн 5% изофлуран, засвар үйлчилгээ хийхэд 1-3% изофлуранаар мэдээ алдуулжээ. Амьтныг стереотактик хүрээ (Kopf) -д байрлуулж, t-hCO-ийн эсрэг талын сахал нь ойролцоогоор 2 см хүртэл тайрч, пьезоэлектрик идэвхжүүлэгчтэй (PI) холбогдсон тороор дамжин өнгөрдөг. 400 μм шилэн кабелийг (Дорик) суулгасан шилэнд холбож, мэдээлэл цуглуулах системд холбосон. Дараа нь t-hCO-ийн эсрэг талын сахалуудыг 20 минутын бичлэгийн хугацаанд пьезоэлектрик хөтөчөөр санамсаргүй байдлаар 50 удаа (20 Гц-т 2 мм, үзүүлэн бүрт 2 секунд) хазайсан. Хэрэглэгчийн MATLAB кодоор хазайх хугацааг хянахын тулд Arduino MATLAB дэмжлэгийн багцыг ашиглана уу. Үйл явдлууд нь транзистор-транзистор логик (TTL) импульс ашиглан өгөгдөл цуглуулах програм хангамжтай синхрончлогддог.
Хархыг (шилжүүлэн суулгасны дараа 140 хоногоос дээш хугацаагаар) 5% изофлураны мэдээ алдуулалтаар өдөөж, хагалгааны явцад 1-3% изофлуранаар мэдээ алдуулалт хийсэн. Амьтдыг стереотаксик орчинд (Kopf) байрлуулж, бупренорфин SR болон дексаметазоныг арьсан дор тарьсан. Гавлын ясыг ил гаргаж, цэвэрлэж, 3-5 ясны боолтыг оруулдаг. t-hCO-г чиглүүлэхийн тулд бид MRI зургуудаас стереотаксик координатуудыг үүсгэсэн. Шилжүүлэн суулгасан hCO дээр шууд өндөр хурдны өрөмдлөгөөр дугуй хэлбэрийн краниотоми (ойролцоогоор 1 см диаметртэй) хийгдсэн. Яс аль болох нимгэн болсны дараа ясыг бүхэлд нь өрөмдөхийн өмнө хямсаа ашиглан аарцагны мөгөөрсөн жийргэвчийн үлдсэн хэсгийг салгаж, үндсэн t-hCO-г илрүүлнэ. Краниотомийг ариутгасан давсны уусмалаар дүүргэж, хэт ягаан туяагаар хатуурсан шүдний цементээр (Relyx) гавлын ясанд хавчуур, тусгай толгойн зүү бэхэлсэн.
Хоёр фотоны дүрслэлийг Nikon LWD (×16, 0.8 NA) объект бүхий Bruker multiphoton микроскоп ашиглан гүйцэтгэсэн. GCaMP6 дүрслэлийг 920 нм-д 1.4x z-plane томруулж, 8x дунджаар 7.5 fps хурдтайгаар гүйцэтгэсэн. Хархыг 5% изофлуран мэдээ алдуулалтаар өдөөж, 1-3% изофлурантай байлгана. Хархыг захиалгаар хийсэн толгойн бэхэлгээнд хийж линзний доор байрлуулсан байна. Хөдөлгөөний үйл ажиллагааны 3 минутын дэвсгэр бичлэгийг авсан. Бичлэг хийх 20 минутын хугацаанд 50 шахалтыг (танилцуулга бүр 100 мс урт) пикопризер ашиглан t-hCO-ийн эсрэг талын сахалтай дэвсгэрт санамсаргүй байдлаар хүргэв. Тусгай MATLAB кодоор тэсрэх хугацааг хянахын тулд Arduino MATLAB дэмжлэгийн багцыг ашиглана уу. TTL импульс ашиглан өгөгдөл цуглуулах програм хангамж (PrairieView 5.5) ашиглан үйл явдлыг синхрончлох. Шинжилгээ хийхийн тулд Фижи улсад эхлүүлсэн MoCo хөтөлбөрийн аффины засварыг ашиглан зургуудыг xy хөдөлгөөнөөр зассан. CNMF-E43 ашиглан бие даасан эсүүдээс флюресцент ул мөрийг гаргаж авах. Сонирхсон бүс бүрээр флюресценцийг гаргаж аваад dF/F муруй болгон хувиргаж, дараа нь z-оноо болгон хөрвүүлсэн.
Хархыг (шилжүүлэн суулгасны дараа 140 хоногоос дээш хугацаагаар) 5% изофлураны мэдээ алдуулалтаар өдөөж, хагалгааны явцад 1-3% изофлуранаар мэдээ алдуулалт хийсэн. Амьтдыг стереотаксик орчинд (Kopf) байрлуулж, бупренорфин SR болон дексаметазоныг арьсан дор тарьсан. t-hCO-ийн эсрэг талын сахал нь ойролцоогоор 2 см хүртэл зүсэж, пьезоэлектрик идэвхжүүлэгчтэй холбосон тороор урсдаг. Гавлын ясыг ил гаргаж, цэвэрлэнэ. Зэвэрдэггүй гангаар хийсэн шураг нь гавлын ясанд бэхлэгдсэн байна. t-hCO-г чиглүүлэхийн тулд бид MRI зургуудаас стереотаксик координатуудыг үүсгэсэн. t-hCO-ийн дөнгөж дээгүүр өндөр хурдтай өрөмдлөгөөр дугуй хэлбэртэй краниотоми (ойролцоогоор 1 см диаметртэй) хийнэ. Яс аль болох нимгэн болсны дараа ясыг бүхэлд нь өрөмдөхийн өмнө хямсаа ашиглан аарцагны мөгөөрсөн жийргэвчийн үлдсэн хэсгийг салгаж, үндсэн t-hCO-г илрүүлнэ. Бие даасан эсүүдийг 32 суваг эсвэл 64 сувгийн өндөр нягтралтай цахиурын датчик (Кэмбриж Нейротек) ашиглан газардуулгын эрэгт холбож, RHD өсгөгчөөр (Intan) урьдчилан өсгөсөн. Ариутгасан давсны уусмалаар дүүргэсэн краниотомиоор дамжуулан электродыг зорилтот хэсэгт буулгахын тулд манипулятор ашиглана. Мэдээлэл цуглуулах ажлыг Open Ephys мэдээлэл цуглуулах системийг ашиглан 30 кГц давтамжтайгаар гүйцэтгэсэн. 10 гаруй сувагт өндөр хамааралтай хэмнэлтэй аяндаа үйл ажиллагаа илэрсэн үед л бичлэг үргэлжилсэн бөгөөд энэ нь электродууд залгаас дотор байрласан болохыг харуулж байна (хоёр фотон кальцийн дүрслэлийн мэдээлэлд үндэслэн). Хөдөлгөөний үйл ажиллагааны 10 минутын дэвсгэр бичлэгийг авсан. Дараа нь t-hCO-ийн эсрэг талын сахалуудыг 20 минутын бичлэгийн хугацаанд пьезоэлектрик хөтөчөөр санамсаргүй байдлаар 50 удаа (20 Гц-т 2 мм, үзүүлэн бүрт 2 секунд) хазайсан. Arduino-д зориулсан MATLAB дэмжлэгийн багцыг (MATLAB 2019b) ашиглан өөрчлөн MATLAB кодоор хазайх хугацааг удирдана. Мэдээлэл цуглуулах программтай үйл явдлыг синхрончлохын тулд TTL импульсийг ашиглана уу.
Оптик тэмдэглэгээний туршилтын хувьд 473 нм лазертай (Омикрон) холбосон 200 микрон оптик нөхөөсийг (Дорик) краниотоми дээр байрлуулсан 200 микрон оптик утастай холбосон. Үүний өмнө шууд холбогчийг 20 мВт хүртэл тохируулна. Ариутгасан давсны уусмалаар дүүргэсэн краниотомиоор дамжуулан электродыг зорилтот хэсэгт буулгахын тулд манипулятор ашиглана. Бичлэгийн эхэнд 473 нм гэрлийн арван импульс (давтамж 2 Гц, импульсийн үргэлжлэх хугацаа 10 мс) цацагдсан. Туршилтын 70% ба түүнээс дээш хугацаанд гэрэлд мэдрэмтгий эсүүд нь 10 мс гэрлийн дотор огцом өсөлттэй эсүүд гэж тодорхойлсон.