Nature.com сайтаар зочилсонд баярлалаа.Таны ашиглаж буй хөтчийн хувилбар нь хязгаарлагдмал CSS дэмжлэгтэй.Хамгийн сайн ашиглахын тулд бид танд шинэчилсэн хөтөч ашиглахыг зөвлөж байна (эсвэл Internet Explorer-д нийцтэй байдлын горимыг идэвхгүй болгох).Энэ хооронд байнгын дэмжлэгийг хангахын тулд бид сайтыг ямар ч загвар, JavaScript-гүйгээр үзүүлэх болно.
Шингэн биопси (LB) нь биоанагаахын салбарт хурдацтай түгээмэл болж байгаа ойлголт юм.Энэхүү үзэл баримтлал нь үндсэндээ янз бүрийн эдэд эсийн үхлийн дараа жижиг хэсгүүд хэлбэрээр ялгардаг эсийн гаднах ДНХ (ccfDNA) хэсгүүдийг илрүүлэхэд суурилдаг.Эдгээр хэсгүүдийн багахан хэсэг нь гадны (гадаадын) эд эс эсвэл организмаас гаралтай.Одоогийн ажилдаа бид далайн усыг өндөр шүүх чадвараараа алдартай харуулын төрөл болох дунгийн хувьд энэ ойлголтыг ашигласан.Бид далайн эргийн экосистемийн биологийн олон янз байдлын талаар мэдээлэл өгөхийн тулд янз бүрийн эх сурвалжаас хүрээлэн буй орчны ДНХ-ийн хэлтэрхийг авахын тулд дунгийн байгалийн шүүлтүүрийн үүргийг гүйцэтгэдэг.Бидний үр дүнгээс харахад дунгийн гемолимф нь 1-ээс 5 кб хүртэл хэмжээтэй маш их ялгаатай ДНХ-ийн хэсгүүдийг агуулдаг.Бууны дараалал нь олон тооны ДНХ-ийн хэлтэрхий нь гадны микробын гаралтай болохыг харуулсан.Тэдгээрийн дотроос бид далайн эргийн экосистемд байдаг олон төрлийн хостуудыг халдварладаг вирүс зэрэг бактери, археа, вирусын ДНХ-ийн хэсгүүдийг олсон.Дүгнэж хэлэхэд, бидний судалгаа нь дунгийн нялцгай биетний тухай ойлголт нь далайн эргийн экосистем дэх бичил биетний олон янз байдлын талаархи мэдлэгийн баялаг боловч хараахан судлагдаагүй эх сурвалж болохыг харуулж байна.
Уур амьсгалын өөрчлөлтийн (CC) далайн экосистемийн биологийн олон янз байдалд үзүүлэх нөлөө нь хурдацтай хөгжиж буй судалгааны чиглэл юм.Дэлхийн дулаарал нь физиологийн чухал стрессийг үүсгэдэг төдийгүй далайн организмын дулааны тогтвортой байдлын хувьслын хязгаарыг түлхэж, олон зүйлийн амьдрах орчинд нөлөөлж, илүү таатай нөхцлийг эрэлхийлэхэд хүргэдэг [1, 2].Метазоануудын биологийн олон янз байдалд нөлөөлөхөөс гадна CC нь эзэн ба нянгийн харилцан үйлчлэлийн нарийн тэнцвэрийг алдагдуулдаг.Энэхүү бичил биетний дисбактериоз нь далайн организмуудыг халдварт эмгэг төрүүлэгчид илүү мэдрэмтгий болгодог тул далайн экосистемд ноцтой аюул учруулж байна [3, 4].SS нь олон нийтийн үхэлд чухал үүрэг гүйцэтгэдэг гэж үздэг бөгөөд энэ нь дэлхийн далайн экосистемийг удирдахад ноцтой асуудал болж байна [5, 6].Энэ нь далайн олон зүйлийн эдийн засаг, экологи, тэжээллэг нөлөөг харгалзан үзэх чухал асуудал юм.Энэ нь ялангуяа туйлын бүс нутагт амьдардаг хос хавхлагт амьтдын хувьд үнэн бөгөөд энэ нь CK-ийн нөлөө илүү хурдан бөгөөд хүчтэй байдаг [6, 7].Үнэн хэрэгтээ Mytilus spp зэрэг хоёр хавхлагатай.далайн экосистемд CC-ийн нөлөөллийг хянахад өргөн хэрэглэгддэг.Тэдний эрүүл мэндийг хянахын тулд харьцангуй олон тооны биомаркерууд бий болсон нь гайхмаар зүйл биш бөгөөд ихэвчлэн ферментийн идэвхжил эсвэл эсийн амьдрах чадвар, фагоцитийн идэвхжил зэрэг эсийн үйл ажиллагаанд суурилсан функциональ биомаркерыг хамарсан хоёр түвшний аргыг ашигладаг [8].Эдгээр аргууд нь далайн усыг их хэмжээгээр шингээж авсны дараа зөөлөн эдэд хуримтлагдах тодорхой даралтын үзүүлэлтүүдийн концентрацийг хэмжихэд хамаарна.Гэсэн хэдий ч хоёр хавхлагын өндөр шүүх чадвар, хагас нээлттэй цусны эргэлтийн систем нь өвчтөний менежментийн энгийн бөгөөд бага инвазив арга болох шингэн биопси (LB) хэмээх ойлголтыг ашиглан шинэ гемолимфийн биомаркеруудыг боловсруулах боломжийг олгодог.цусны дээж [9, 10].Хэд хэдэн төрлийн эргэлтийн молекулыг хүний ​​​​LB-ээс олж болох боловч энэ үзэл баримтлал нь үндсэндээ цусны сийвэн дэх эргэлдэж буй эсийн гаднах ДНХ (ccfDNA) хэсгүүдийн ДНХ дарааллын шинжилгээнд суурилдаг.Үнэн хэрэгтээ хүний ​​цусны сийвэн дэх эргэлтийн ДНХ байгаа нь 20-р зууны дунд үеэс мэдэгдэж байсан [11], гэхдээ зөвхөн сүүлийн жилүүдэд өндөр үр дүнтэй дарааллын аргууд гарч ирснээр ccfDNA-д суурилсан эмнэлзүйн оношилгоо хийх боломжтой болсон.Эдгээр эргэлтийн ДНХ-ийн хэсгүүд байгаа нь зарим талаараа эсийн үхлийн дараа геномын ДНХ (цөмийн болон митохондрийн) идэвхгүй ялгардагтай холбоотой юм. Эрүүл хүмүүст ccfDNA-ийн концентраци ихэвчлэн бага (<10 нг/мл) байдаг боловч янз бүрийн эмгэгтэй эсвэл стресст өртсөн өвчтөнүүдэд 5-10 дахин нэмэгдэж, улмаар эд эс гэмтдэг. Эрүүл хүмүүст ccfDNA-ийн концентраци ихэвчлэн бага (<10 нг/мл) байдаг боловч янз бүрийн эмгэгтэй эсвэл стресст өртсөн өвчтөнүүдэд 5-10 дахин нэмэгдэж, улмаар эд эс гэмтдэг. У здоровых хүмүүсийн төвлөрсөн вккДНК в норме низкая (<10 нг/мл), гэхдээ 5-10 размераас илүү олон төрлийн эмгэг, эсвэл доод түвшний стресст орох боломжтой. Эрүүл хүмүүст cccDNA-ийн концентраци ихэвчлэн бага (<10 нг/мл) байдаг боловч янз бүрийн эмгэг бүхий өвчтөнүүдэд 5-10 дахин ихэсдэг бөгөөд энэ нь эд эсийг гэмтээхэд хүргэдэг.在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 нг/мл），但在患有各种病理或浓中，ccfDNA 的浓度通常较低，加5-10 倍，从而导致组织损伤。在 健康 个体 中 ， ccfdna 的 浓度 较 低 （（<10 нг/мл） 但 在 各 种 病理 戏 中国 戗可 增加 5-10 倍 ， 从而 组织。。。 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤损伤损伍Концентрации ccfDNA нь хүмүүст маш бага (<10 нг/мл) байдаг ч өвчтөнд 5-10 размерийн өвчин тусах эсвэл стресст өртөхөд хүргэдэг. Эрүүл хүмүүст ccfDNA-ийн концентраци ихэвчлэн бага (<10 нг/мл) байдаг боловч янз бүрийн эмгэг, стресстэй өвчтөнд 5-10 дахин нэмэгдэж, эд эсийг гэмтээж болно.ccfDNA фрагментийн хэмжээ маш олон янз байдаг боловч ихэвчлэн 150-200 bp хооронд хэлбэлздэг.[12].Өөрөө үүсэлтэй ccfDNA, өөрөөр хэлбэл, хэвийн буюу өөрчлөгдсөн хост эсээс авсан ccfDNA-ийн шинжилгээг цөмийн болон/эсвэл митохондрийн геномд байгаа генетикийн болон эпигенетик өөрчлөлтийг илрүүлэхэд ашиглаж болох бөгөөд ингэснээр эмч нарт тодорхой молекулын зорилтот эмчилгээг сонгоход тусалдаг [13].Гэсэн хэдий ч ccfDNA-г жирэмсэн үед ургийн эсээс эсвэл шилжүүлэн суулгасан эрхтнүүдээс ccfDNA гэх мэт гадны эх сурвалжаас авч болно [14,15,16,17].ccfDNA нь халдвар үүсгэгч (гадаадын) нуклейн хүчлүүд байгаа эсэхийг илрүүлэх мэдээллийн чухал эх сурвалж бөгөөд цусны өсгөвөрт тодорхойлогдоогүй өргөн тархсан халдварыг инвазив бус аргаар илрүүлэх, халдвар авсан эдэд инвазив биопси хийхээс зайлсхийх боломжийг олгодог [18].Сүүлийн үеийн судалгаагаар хүний ​​цус нь вирус, бактерийн эмгэг төрүүлэгчийг тодорхойлоход ашиглагдах мэдээллийн баялаг эх сурвалжийг агуулж байдаг ба хүний ​​цусны сийвэн дэх ccfDNA-ийн 1% орчим нь харь гаралтай болохыг харуулж байна [19].Эдгээр судалгаанууд нь ccfDNA шинжилгээг ашиглан организмын эргэлтийн микробиомын биологийн олон янз байдлыг үнэлэх боломжтойг харуулж байна.Гэсэн хэдий ч саяхныг хүртэл энэ ойлголтыг зөвхөн хүмүүст, бага хэмжээгээр бусад сээр нуруутан амьтдад хэрэглэж байсан [20, 21].
Энэхүү нийтлэлд бид 35 сая жилийн өмнө үүссэн томоохон тэгш өндөрлөг дээрх бүлэг арлуудын субантарктикийн Кергуэлэн арлуудад түгээмэл байдаг өмнөд төрөл болох Aulacomya atra-ийн ccfDNA-д шинжилгээ хийхэд LB потенциалыг ашигласан.галт уулын дэлбэрэлт.In vitro туршилтын системийг ашиглан бид далайн усан дахь ДНХ-ийн хэлтэрхийнүүд нялцгай биетүүдэд хурдан шингэж, гемолимфийн тасалгаанд ордог болохыг олж мэдсэн.Бууны дараалал нь дун гемолимфийн ccfDNA-д өөрийн болон өөрөөс бус гаралтай ДНХ-ийн хэлтэрхийнүүд, үүнд симбиотик бактери, хүйтэн галт уулын далайн эргийн экосистемд байдаг биомын ДНХ-ийн хэсгүүд агуулагддаг болохыг харуулсан.Гемолимфийн ccfDNA нь өөр өөр хост хүрээтэй вирусуудаас гаралтай вирусын дарааллыг агуулдаг.Мөн яст загас, далайн анемон, замаг, шавж зэрэг олон эст амьтдын ДНХ-ийн хэлтэрхий олдсон.Эцэст нь хэлэхэд, бидний судалгаагаар LB үзэл баримтлалыг далайн сээр нуруугүй амьтдад амжилттай хэрэглэж, далайн экосистемд баялаг геномын репертуар бий болгож болохыг харуулж байна.
Насанд хүрэгчид (55-70 мм урт) Mytilus platensis (M. platensis) болон Aulacomya atra (A. atra) нарыг Порт-о-Франсын далайн түрлэг хоорондын хадархаг эргээс (049°21.235 S, 070°13.490 E.) цуглуулсан.Кергулений арлууд 2018 оны 12-р сард. Бусад насанд хүрсэн хөх дун (Mytilus spp.)-ийг арилжааны ханган нийлүүлэгчээс (PEI Mussel King Inc., Принс Эдвард арал, Канад) авч, 10-20 л 32‰ хиймэл давсны уусмал агуулсан температурын хяналттай (4°C) агааржуулсан саванд хийсэн.(АНУ, Виржиниа, Instant Ocean, Reef Crystal, хиймэл далайн давс).Туршилт бүрийн хувьд бүрхүүлийн урт, жинг хэмжсэн.
Энэ програмын үнэгүй нээлттэй хандалтын протоколыг онлайнаар авах боломжтой (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1).Товчхондоо, LB гемолимфийг [22] тайлбарласны дагуу хулгайлах булчингаас цуглуулсан.Гемолимфийг 1200хг-т 3 минутын турш центрифугээр тодруулж, дээд давхаргыг хэрэглэх хүртэл хөлдөөсөн (-20°С).cfDNA-г тусгаарлах, цэвэршүүлэхийн тулд дээжийг (1.5-2.0 мл) гэсгээж, үйлдвэрлэгчийн зааврын дагуу NucleoSnap cfDNA иж бүрдэл (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) ашиглан боловсруулсан.ccfDNA-г дараагийн шинжилгээ хүртэл -80°С хэмд хадгалсан.Зарим туршилтаар ccfDNA-г QIAamp DNA Investigator Kit (QIAGEN, Торонто, Онтарио, Канад) ашиглан тусгаарлаж, цэвэршүүлсэн.Цэвэршүүлсэн ДНХ-г стандарт PicoGreen шинжилгээг ашиглан хэмжсэн.Тусгаарлагдсан ccfDNA-ийн фрагментийн тархалтыг Agilent 2100 биоанализатор (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) ашиглан өндөр мэдрэмжтэй ДНХ-ийн хэрэгсэл ашиглан капилляр электрофорезоор шинжлэв.Шинжилгээг үйлдвэрлэгчийн зааврын дагуу ccfDNA дээжийн 1 мкл ашиглан хийсэн.
Гемолимфийн ccfDNA хэсгүүдийн дарааллыг тогтоохын тулд Génome Québec (Монреаль, Квебек, Канад) Illumina MiSeq PE75 иж бүрдэлийн Illumina DNA Mix иж бүрдлийг ашиглан бууны сангуудыг бэлтгэсэн.Стандарт адаптер (BioO) ашигласан.Түүхий өгөгдлийн файлуудыг NCBI Sequence Read Archive (SRR8924808 ба SRR8924809) дээрээс авах боломжтой.Унших үндсэн чанарыг FastQC [23] ашиглан үнэлэв.Trimmomatic [24] нь хайчлах адаптер болон чанар муутай уншихад ашиглагдаж ирсэн.Хосолсон төгсгөлтэй бууны уншилтыг FLASH-ийг дан урт уншлага болгон нэгтгэж, таарахгүй байхын тулд хамгийн багадаа 20 бит давхцсан [25]. Нэгтгэсэн уншилтыг BLASTN-тэй хамт хоёр хавхлагатай NCBI таксономийн мэдээллийн сан (e утга < 1e−3 ба 90% гомологи) ашиглан тэмдэглэсэн бөгөөд DUST [26] ашиглан нарийн төвөгтэй байдал багатай дарааллыг далдлах ажлыг гүйцэтгэсэн. Нэгтгэсэн уншилтыг BLASTN-тэй хамт хоёр хавхлагатай NCBI таксономийн мэдээллийн сан (e утга < 1e−3 ба 90% гомологи) ашиглан тэмдэглэсэн бөгөөд DUST [26] ашиглан нарийн төвөгтэй байдал багатай дарааллыг далдлах ажлыг гүйцэтгэсэн. Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием базы данных таксономии двустворчатых моллюсков NCBI (значение e < 1e-3 и 90% гомологи), a maskirovanie postedovatelnostey bylo ispolST2 [object Window]. Цуглуулсан уншилтуудыг NCBI хоёр хавхлагын ангилал зүйн мэдээллийн санг (e утга < 1e-3 ба 90% ижил төстэй) ашиглан BLASTN ашиглан тэмдэглэж, DUST [26] ашиглан бага төвөгтэй дарааллын далдлалыг гүйцэтгэсэн.使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90% 同源性）用 BLASTN 注释）用BLASTN 注释（并的读合并的读合并的读合并的读合 的读合 的读Ｖ 读广广匶低复杂度序列的掩蔽。使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 90% 同源） 用 用 用 注释 合并 读数 合并 读数 合并 读数 （（（<1e-3 和复杂度 序列 的。。。。 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽掩蔽掩蔽掩蔽掩蔽掩蔽掩蔽蔽 掩蔽 掩蔽Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием таксономической базы данных двустворчатых моллюсков NCBI (значение e <1e-3 ба 90% гомологи), a maskirovanie postledovatelnostey bylo iskoy ispolnen2 [DUST2]. Цуглуулсан уншилтыг NCBI-ийн хос хавхлагын ангилал зүйн мэдээллийн санг (e утга <1e-3 ба 90% ижил төстэй) ашиглан BLASTN ашиглан тэмдэглэсэн бөгөөд DUST [26] ашиглан бага төвөгтэй дарааллын далдлалыг гүйцэтгэсэн.Уншлагыг хоёр хавхлагатай дараалалтай холбоотой (энд өөрөө уншдаг гэж нэрлэдэг) болон хамааралгүй (өөрийгөө уншдаггүй) гэсэн хоёр бүлэгт хуваасан.Contig үүсгэхийн тулд MEGAHIT ашиглан хоёр бүлгийг тусад нь угсарсан [27].Үүний зэрэгцээ, харь гаригийн микробиомын уншилтын ангилал зүйн тархалтыг Kraken2 [28] ашиглан ангилж, Галакси дээрх Крона дугуй графикаар графикаар дүрсэлсэн [29, 30].Бидний урьдчилсан туршилтаар хамгийн оновчтой кммерүүд нь кмер-59 болохыг тогтоосон. Дараа нь эцсийн тэмдэглэгээ хийхийн тулд BLASTN (хоёр хавхлагатай NCBI мэдээллийн сан, e утга < 1e−10 ба 60% ижил хүйстэн)-тэй уялдуулан өөрөө түгжрэлийг тодорхойлсон. Дараа нь эцсийн тэмдэглэгээ хийхийн тулд BLASTN (хоёр хавхлагатай NCBI мэдээллийн сан, e утга < 1e−10 ба 60% ижил хүйстэн)-тэй уялдуулан өөрөө түгжрэлийг тодорхойлсон. Затем собственные контиги были идентифицированы путем сопоставления с BLASTN (база данных двустворчатых моллюсков NCBI, значение e <1e-10 и гомология 60%) для окончательной аннотации. Дараа нь эцсийн тэмдэглэгээнд зориулж BLASTN (NCBI хоёр хавхлагт мэдээллийн сан, e утга <1e-10 ба 60% ижил хүйстэн)-тэй тааруулж өөрөө өөрийгөө тодорхойлсон.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）对齐来识迡以识迡别别最终注释。然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% Затем были идентифицированы собственные контиги для окончательной аннотации путем сопоставления с BLASTN (база данных NCBI для двустворчатых моллюсков, значение e <1e-10 и гомология 60%). Дараа нь BLASTN (NCBI хоёр хавхлагт мэдээллийн сан, e утга <1e-10 ба 60% ижил хүйстэн)-тэй тааруулж эцсийн тэмдэглэгээнд зориулж өөрөө өөрийгөө холбосон хэсгүүдийг тодорхойлсон. Үүний зэрэгцээ, өөрөө бус бүлгийн контигуудыг BLASTN (nt NCBI мэдээллийн сан, e утга < 1e−10 ба 60% ижил хүйстэн)-ээр тэмдэглэв. Үүний зэрэгцээ, өөрөө бус бүлгийн контигуудыг BLASTN (nt NCBI мэдээллийн сан, e утга < 1e−10 ба 60% ижил хүйстэн)-ээр тэмдэглэв. Параллельно чужеродные групповые контиги были аннотированы с помощью BLASTN (база данных nt NCBI, значение e <1e-10 и гомология 60%). Үүний зэрэгцээ гадаадын бүлгийн контигуудыг BLASTN (NT NCBI мэдээллийн сан, e утга <1e-10 ба 60% ижил хүйстэн)-ээр тэмдэглэв.平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重参绾参平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重参绾参 Параллельно контиги, не относящиеся к собственной группе, были аннотированы с помощью BLASTN (база данных nt NCBI, значение e <1e-10 и гомология 60%). Үүний зэрэгцээ, өөрөө бус бүлгийн контигуудыг BLASTN (nt NCBI мэдээллийн сан, e утга <1e-10 ба 60% ижил хүйстэн)-ээр тэмдэглэв. BLASTX-ийг мөн nr болон RefSeq уургийн NCBI мэдээллийн санг (e утга < 1e−10 ба 60% гомологи) ашиглан өөрөө бус contigs дээр явуулсан. BLASTX-ийг мөн nr болон RefSeq уургийн NCBI мэдээллийн санг (e утга < 1e−10 ба 60% гомологи) ашиглан өөрөө бус contigs дээр явуулсан. BLASTX нь бас данных белка nr болон RefSeq NCBI (значение e <1e-10 и гомология 60%)-ийг ашиглах боломжтой. BLASTX-ийг мөн nr болон RefSeq NCBI уургийн мэдээллийн санг (e утга < 1e-10 ба 60% гомологи) ашиглан өөрөө бус contig дээр хийсэн.还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 撌扺60% 吧还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 撌扺60% 吧 BLASTX нь бас данных белка nr болон RefSeq NCBI (значение e <1e-10 ба гомология 60%)-ийг ашиглахад зориулагдсан. BLASTX-ийг мөн nr болон RefSeq NCBI уургийн мэдээллийн санг (e утга <1e-10 ба 60% гомологи) ашиглан өөрөө бус контиг дээр гүйцэтгэсэн.BLASTN болон BLASTX-ийн бие даасан бус савнууд нь эцсийн контигуудыг илэрхийлдэг (Нэмэлт файлыг үзнэ үү).
ПГУ-д ашигласан праймеруудыг S1 хүснэгтэд үзүүлэв.Taq ДНХ полимераза (Bio Basic Canada, Markham, ON) нь ccfDNA зорилтот генийг олшруулахад ашигласан.Дараах урвалын нөхцлүүдийг ашигласан: 95 ° C-т 3 минут, 95 ° C-т 1 минут, 1 минутын турш бэхлэх температур, 72 ° C-д 1 минут, 35 цикл, 10 минутын дотор 72 ° C-д сунгах..ПГУ-ын бүтээгдэхүүнийг 95 В-т SYBRTM Аюулгүй ДНХ гель толбо (Invitrogen, Burlington, ON, Canada) агуулсан агароз гель (1.5%)-д электрофорезоор салгав.
Далайн дун (Mytilus spp.) 500 мл хүчилтөрөгчтэй далайн усанд (32 PSU) 4°С-т 24 цагийн турш дасан зохицсон.Хүний галактин-7 cDNA дарааллыг (NCBI элсэлтийн дугаар L07769) кодлосон оруулга агуулсан плазмидын ДНХ-ийг шилэн саванд 190 мкг/мкл эцсийн концентрацид нэмсэн.ДНХ нэмэлгүйгээр ижил нөхцөлд өсгөвөрлөсөн дун нь хяналт байв.Гурав дахь хяналтын сав нь дунгүй ДНХ агуулсан байв.Далайн усны ДНХ-ийн чанарыг хянахын тулд заасан хугацаанд сав бүрээс далайн усны дээж (20 мкл; гурван давталт) авсан.Плазмид ДНХ-ийн ул мөрийг тогтоохын тулд LB дунуудыг заасан хугацаанд хураан авч, qPCR болон ddPCR шинжилгээнд хамруулсан.Далайн усны давсны агууламж ихтэй тул бүх ПГУ-ын шинжилгээний өмнө хэсэг хэсгүүдийг ПГУ-ын чанартай усанд (1:10) шингэлсэн.
BioRad QX200 протокол (Миссиссауга, Онтарио, Канад) ашиглан дижитал дусал ПГУ (ddPCR) хийсэн.Температурын горимыг ашиглан оновчтой температурыг тодорхойлно (Хүснэгт S1).QX200 дусал үүсгэгч (BioRad) ашиглан дусал үүсгэсэн.ddPCR-ийг дараах байдлаар гүйцэтгэсэн: 5 минутын турш 95 ° C, 95 ° C-ийн 50 цикл 30 секунд ба өгөгдсөн анивалтын температур 1 минут, 72 ° C 30 секунд, 4 ° C-д 5 минут, 90 ° C хүртэл 5 минутын дотор.Дусал болон эерэг урвалын тоог (хуулбарын тоо/мкл) QX200 дусал уншигч (BioRad) ашиглан хэмжсэн.10,000-аас бага дусалтай дээжийг татгалзсан.ddPCR ажиллуулах бүрт хэв маягийн хяналт хийгдээгүй.
qPCR-ийг Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Сидней, Австрали) болон LGALS7 тусгай праймер ашиглан гүйцэтгэсэн.Бүх тоон ПГУ-ыг QuantiFast SYBR Green PCR Kit (QIAGEN) ашиглан 20 мкл-д хийсэн.qPCR-ийг 95°С-т 15 минутын инкубаци хийж, дараа нь 95°C-т 10 секунд, 60°C-д 60 секундын турш 40 циклийг нэг мэдээлэл цуглуулснаар эхлүүлсэн.qPCR-ийн төгсгөлд 95°C-т 5 секунд, 65°C-т 60 секунд, 97°C-т дараалсан хэмжилтийг ашиглан хайлах муруйг үүсгэсэн.Хяналтын дээжээс бусад тохиолдолд qPCR бүрийг гурав дахин хийсэн.
Далайн дун нь өндөр шүүлтүүрийн хурдаараа алдартай тул бид эхлээд далайн усанд агуулагдах ДНХ-ийн хэсгүүдийг шүүж, хадгалж чадах эсэхийг судалсан.Эдгээр хэлтэрхийнүүд хагас задгай тунгалгийн системд хуримтлагддаг эсэхийг бид бас сонирхож байсан.Цэнхэр дунтай саванд нэмсэн уусдаг ДНХ-ийн хэсгүүдийн хувь заяаг судлах замаар бид энэ асуудлыг туршилтаар шийдсэн.ДНХ-ийн хэлтэрхийг хянах ажлыг хөнгөвчлөхийн тулд бид хүний ​​галактин-7 генийг агуулсан гадаад (өөрөө биш) плазмидын ДНХ-г ашигласан.ddPCR нь далайн ус болон дун дахь плазмидын ДНХ-ийн хэсгүүдийг илрүүлдэг.Бидний үр дүнгээс харахад далайн усан дахь ДНХ-ийн хэлтэрхийнүүд цаг хугацааны явцад (7 хоног хүртэл) дун байхгүй үед харьцангуй тогтмол хэвээр байсан бол дунтай үед 8 цагийн дотор энэ түвшин бараг бүрэн арилдаг (Зураг 1a,b).Экзоген ДНХ-ийн хэлтэрхийнүүд нь 15 минутын дотор судсан дахь шингэн ба гемолимфээс амархан илэрсэн (Зураг 1в).Эдгээр хэлтэрхийнүүд өртсөнөөс хойш 4 цагийн дараа илрэх боломжтой.ДНХ-ийн хэсгүүдийн шүүлтүүрийн үйл ажиллагаа нь нян ба замагны шүүлтүүрийн үйл ажиллагаатай адил юм [31].Эдгээр үр дүн нь дун нь шингэний тасалгаанд гадны ДНХ-г шүүж, хуримтлуулж чаддаг болохыг харуулж байна.
ddPCR-ээр хэмжсэн дун (A) эсвэл байхгүй (B) дахь далайн усанд плазмидын ДНХ-ийн харьцангуй концентраци.А-д үр дүнг хувиар илэрхийлсэн бөгөөд хайрцагны хүрээ нь 75, 25-р хувийг илэрхийлдэг.Суурилуулсан логарифмын муруйг улаанаар харуулсан бөгөөд сааралаар сүүдэрлэсэн хэсэг нь 95% итгэлийн интервалыг илэрхийлнэ.В хэсэгт улаан шугам нь дундаж утгыг, цэнхэр шугам нь концентрацийн 95% -ийн итгэлцлийн интервалыг илэрхийлнэ.C Плазмид ДНХ нэмсэний дараа янз бүрийн хугацаанд дунгийн гемолимф ба хавхлагын шингэнд плазмидын ДНХ хуримтлагдах.Үр дүнг илэрсэн үнэмлэхүй хуулбар/мл (±SE) хэлбэрээр үзүүлэв.
Дараа нь бид антропоген нөлөөлөл хязгаарлагдмал алслагдсан арлуудын бүлэг болох Кергулен арлуудын дунгийн орноос цуглуулсан дун дахь ccfDNA-ийн гарал үүслийг судалсан.Энэ зорилгоор дунгийн гемолимфээс cccDNA-г тусгаарлаж, хүний ​​cccDNA-г цэвэршүүлэхэд түгээмэл хэрэглэгддэг аргуудаар цэвэршүүлсэн [32, 33].Бид дун дахь гемолимфийн ccfDNA дундаж концентраци нэг мл гемолимфийн мужид бага микрограмм байгааг олж тогтоосон (Хүснэгт S2, Нэмэлт мэдээллийг үзнэ үү).Энэхүү концентрацийн хүрээ нь эрүүл хүмүүсийнхээс хамаагүй их байдаг (миллитр тутамд бага нанограмм) боловч ховор тохиолдолд хорт хавдартай өвчтөнүүдэд ccfDNA-ийн түвшин нэг миллилитрт хэдэн микрограмм хүрдэг [34, 35].Гемолимфийн ccfDNA-ийн хэмжээ хуваарилалтын дүн шинжилгээ нь эдгээр хэлтэрхийнүүд нь 1000-1000 bp хүртэл хэмжээтэй маш их ялгаатай болохыг харуулсан.5000 bp хүртэл (Зураг 2).Цахиурт суурилсан QIAamp Investigator Kit-ийг ашиглан ижил төстэй үр дүнг олж авсан бөгөөд энэ нь шүүх эмнэлгийн шинжлэх ухаанд түгээмэл хэрэглэгддэг арга бөгөөд ccfDNA зэрэг бага концентрацитай ДНХ-ийн дээжээс геномын ДНХ-ийг хурдан тусгаарлаж, цэвэршүүлдэг [36].
Далайн гемолимфийн ccfDNA электрофореграммыг төлөөлөх.NucleoSnap плазмын иж бүрдэл (дээд талд) болон QIAamp ДНХ судлаачийн хэрэгслээр гаргаж авсан.B дун дахь гемолимфийн ccfDNA концентрацийн (±SE) тархалтыг харуулсан хийлийн зураг.Хар ба улаан шугамууд нь медиан болон эхний болон гурав дахь квартилуудыг тус тус илэрхийлдэг.
Хүн ба приматуудын ccfDNA-ийн ойролцоогоор 1% нь гадаад эх сурвалжтай байдаг [21, 37].Хоёр хавхлагын хагас задгай цусны эргэлтийн систем, бичил биетээр баялаг далайн ус, дунгийн ccfDNA-ийн тархалтыг харгалзан бид дун гемолимфийн ccfDNA нь бичил биетний ДНХ-ийн баялаг, олон янзын санг агуулж болно гэсэн таамаглал дэвшүүлсэн.Энэ таамаглалыг шалгахын тулд бид Кергулений арлуудаас цуглуулсан Aulacomya atra дээжээс гемолимфийн ccfDNA-г дараалуулж, 10 сая гаруй удаа уншсаны 97.6% нь чанарын хяналтад тэнцсэн.Дараа нь уншилтыг BLASTN болон NCBI хоёр хавхлагт мэдээллийн санг ашиглан өөрийн болон бус эх сурвалжийн дагуу ангилсан (Зураг S1, Нэмэлт мэдээлэл).
Хүний хувьд цөмийн болон митохондрийн ДНХ хоёулаа цусны урсгалд орж болно [38].Гэсэн хэдий ч энэ судалгаанд A. atra геномыг дараалалд оруулаагүй, тайлбарлаагүй тул дунгийн цөмийн геномын ДНХ-ийг нарийвчлан тайлбарлах боломжгүй байв.Гэсэн хэдий ч бид хос хавхлагт номын санг ашиглан өөрийн гарал үүсэлтэй хэд хэдэн ccfDNA фрагментийг тодорхойлж чадсан (Зураг S2, Нэмэлт мэдээлэл).Мөн бид дараалсан A. atra генийн ПГУ-ын чиглүүлсэн олшруулалтаар өөрийн гарал үүслийн ДНХ-ийн хэлтэрхий байгааг баталсан (Зураг 3).Үүний нэгэн адил, A. atra-ийн митохондрийн геном нь олон нийтийн мэдээллийн санд байдаг тул A. atra-ийн гемолимфэд митохондрийн ccfDNA хэлтэрхий байгаа эсэхийг нотлох баримтыг олж болно.Митохондрийн ДНХ-ийн хэлтэрхий байгаа нь ПГУ-ын олшруулалтаар батлагдсан (Зураг 3).
ПГУ-аар олшруулсан A. atra (улаан цэгүүд – хувьцааны дугаар: SRX5705969) болон M. platensis (цэнхэр цэгүүд – хувьцааны дугаар: SRX5705968)-ийн гемолимфэд янз бүрийн митохондрийн генүүд байсан.Бретон нараас зохиосон зураг, 2011 B A. atra-ийн гемолимфийн супернатантын олшруулалт FTA цаасан дээр хадгалагдсан.3 мм-ийн цоолтуур ашиглан ПГУ-ын холимог агуулсан ПГУ-ын хоолойд шууд нэмнэ.
Далайн усанд бичил биетний элбэг агуулгыг харгалзан бид эхлээд гемолимф дэх бичил биетний ДНХ-ийн дарааллыг тодорхойлоход анхаарлаа хандуулсан.Үүнийг хийхийн тулд бид хоёр өөр стратеги ашигладаг.Эхний стратегид микробын дарааллыг BLAST болон бусад хэрэглүүртэй дүйцэхүйц нарийвчлалтайгаар тодорхойлох боломжтой алгоритмд суурилсан дарааллын ангиллын программ болох Kraken2 ашигласан [28].6719 гаруй уншилт нь бактерийн гаралтай болох нь тогтоогдсон бол 124, 64 нь архей болон вирусын гаралтай байжээ (Зураг 4).Бактерийн ДНХ-ийн фрагментуудаас хамгийн их тархсан нь Firmicutes (46%), Proteobacteria (27%), Bacterioides (17%) байв (Зураг 4a).Энэхүү тархалт нь далайн хөх дунгийн бичил биетний өмнөх судалгаатай нийцэж байна [39, 40].Гаммапротеобактери нь протеобактерийн үндсэн анги (44%), үүнд олон Vibrionales багтдаг (Зураг 4б).ddPCR арга нь A. atra hemolymph-ийн ccfDNA-д Vibrio ДНХ-ийн хэлтэрхий байгааг баталсан (Зураг 4c) [41].ccfDNA-ийн бактерийн гарал үүслийн талаар нэмэлт мэдээлэл авахын тулд нэмэлт аргыг ашигласан (Зураг S2, Нэмэлт мэдээлэл). Энэ тохиолдолд давхцсан уншлагыг хосолсон уншилтаар угсарч, BLASTN, e-утгаа 1e−3, >90% ижил хүйстэнтэй таслалтыг ашиглан өөрөө (хос хавхлаг) эсвэл өөрөө бус гаралтай гэж ангилсан. Энэ тохиолдолд давхцсан уншлагыг хосолсон уншилтаар угсарч, BLASTN, e-утгаа 1e−3, >90% ижил хүйстэнтэй таслалтыг ашиглан өөрөө (хос хавхлаг) эсвэл өөрөө бус гаралтай гэж ангилсан. В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и был классифицированы как собственные (двустворчатые моллюски) эсвэл чужие по происхождению с использованием BLASTN болон значения с гомей 190-%. Энэ тохиолдолд давхцсан уншилтыг хос төгсгөлтэй уншлага гэж цуглуулж, BLASTN ба e-ийн утгыг 1e-3, >90% ижил хүйстэнтэй захын утгыг ашиглан эх (хос хавхлаг) эсвэл эх бус гэж ангилсан.在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN 和1e-3 的e 和1e-3 暄e 匀匀区%值分类为自身（双壳类）或非自身来源。在 这 种 情况 下 ， 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 ， 使用 使用 使用 使用 使用 使用 嚄用 嚄用和> 90% 同源性 的 分类 自身 （双 壳类） 非 自身。。。。。。。。 В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и классифицированы как собственные (двустворчатые моллюски) эсвэл несобственные по происхождению с происхождению с использованием значений e BLASTN ологи и 19%. Энэ тохиолдолд давхцсан уншилтыг хос төгсгөлтэй уншлага гэж цуглуулж, e BLASTN ба 1e-3 утгыг ашиглан өөрийн (хос хавхлагатай) эсвэл эх бус гэж ангилж, гомологийн босго > 90% байна.A. atra геномын дараалал хараахан гараагүй байгаа тул бид MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS) ассемблерийн де novo угсралтын стратегийг ашигласан.Нийт 147,188 контиг нь гарал үүслийн хамааралтай (хос хавхлаг) болохыг тогтоосон.Дараа нь эдгээр контигуудыг BLASTN болон BLASTX ашиглан 1e-10 гэсэн цахим утгаар дэлбэлэв.Энэхүү стратеги нь A. atra ccfDNA-д агуулагдах 482 хос хавхлагт бус фрагментийг тодорхойлох боломжийг бидэнд олгосон.Эдгээр ДНХ-ийн хэсгүүдийн талаас илүү хувийг (57%) бактери, гол төлөв заламгай симбионт, түүний дотор сульфотрофийн симбионт, заламгай симбионт Солемья велум (Зураг 5) -аас гаргаж авсан.
Төрөл бүрийн түвшинд харьцангуй элбэг дэлбэг байдал.B Хоёр үндсэн филагийн бичил биетний олон янз байдал (Firmicutes and Proteobacteria).ddPCR C Vibrio spp-ийн төлөөлөгч олшруулалт.A. Гурван атра гемолимфийн 16S рРНХ генийн хэлтэрхий (цэнхэр).
Цуглуулсан нийт 482 контиг шинжилгээнд хамрагдсан.Метагеномын контиг тэмдэглэгээний ангилал зүйн тархалтын ерөнхий дүр төрх (прокариот ба эукариотууд).B BLASTN болон BLASTX-ээр тодорхойлсон бактерийн ДНХ-ийн хэсгүүдийн нарийвчилсан тархалт.
Kraken2-ийн шинжилгээгээр мөн дунгийн ccfDNA-д Euryarchaeota (65%), Crenarchaeota (24%), Thaurmarcheota (11%) зэрэг архелийн ДНХ-ийн хэлтэрхий агуулагдаж байгааг харуулсан (Зураг 6a).Өмнө нь Калифорнийн дунгийн бичил биетний бүлгээс олдсон Euryarchaeota болон Crenarchaeota-аас гаргаж авсан ДНХ-ийн хэсгүүд байгаа нь гайхах зүйл биш юм [42].Хэдийгээр Euryarchaeota нь ихэвчлэн эрс тэс нөхцөлтэй холбоотой байдаг ч Euryarchaeota болон Crenarcheota хоёулаа далайн криоген орчинд хамгийн түгээмэл прокариотуудын нэг гэдгийг одоо хүлээн зөвшөөрдөг [43, 44].Кергуэлэн өндөрлөг [45] ёроолоос их хэмжээний метан алдагдаж, Кергулений арлуудын эрэгт [46] ажиглагдсан бичил биетний метан үүсэж болзошгүй гэсэн сүүлийн үеийн мэдээллүүдээс харахад дун дотор метаноген бичил биетүүд байгаа нь гайхмаар зүйл биш юм.
Дараа нь бидний анхаарал ДНХ-ийн вирусын уншилтад шилжсэн.Бидний мэдэж байгаагаар энэ нь дунгийн вирүсийн агууламжийг зорилтот бус аргаар хийсэн анхны судалгаа юм.Хүлээгдэж байсанчлан бид бактериофагийн (Caudovirales) ДНХ-ийн хэлтэрхий олдсон (Зураг 6б).Гэсэн хэдий ч хамгийн түгээмэл вирусын ДНХ нь нуклеоцитовирусын бүлгээс гаралтай бөгөөд үүнийг цөмийн цитоплазмын том ДНХ-ийн вирус (NCLDV) гэж нэрлэдэг бөгөөд энэ нь аливаа вирусын хамгийн том геномтой юм.Энэ бүлэгт ихэнх ДНХ-ийн дараалал нь Mimimidoviridae (58%) ба Poxviridae (21%) гэр бүлд харьяалагддаг бөгөөд тэдгээрийн байгалийн эзэн нь сээр нуруутан ба үе хөлтүүд байдаг бол эдгээр ДНХ-ийн дарааллын багахан хэсэг нь мэдэгдэж байгаа вирус судлалын замагт хамаардаг.Далайн эукариот замагт халдварладаг.Дарааллыг мөн бүх мэдэгдэж байгаа вирусын генийн хамгийн том геномтой аварга вирус болох Пандора вирусээс олж авсан.Сонирхолтой нь, гемолимфийн ccfDNA дараалалаар тодорхойлогдсон вирусын халдвар авсан нь мэдэгдэж буй хостуудын хүрээ харьцангуй том байсан (Зураг S3, Нэмэлт мэдээлэл).Үүнд Baculoviridae, Iridoviridae зэрэг шавжийг халдварладаг вирусууд, мөн амеб, замаг, сээр нуруутан амьтдыг халдварладаг вирусууд орно.Мөн бид Pithovirüs sibericum геномтой таарах дарааллыг олсон.Питовирусыг (мөн "зомби вирус" гэж нэрлэдэг) анх Сибирийн 30,000 жилийн мөнх цэвдгээс тусгаарлагдсан [47].Тиймээс бидний үр дүн эдгээр вирусын орчин үеийн бүх зүйл устаж үгүй ​​болоогүй [48] бөгөөд эдгээр вирусууд алслагдсан субарктик далайн экосистемд байж болохыг харуулсан өмнөх тайлантай нийцэж байна.
Эцэст нь бид бусад олон эст амьтдаас ДНХ-ийн хэлтэрхий олж чадах эсэхээ шалгасан.NT, nr болон RefSeq сангууд (геномын болон уураг) бүхий BLASTN болон BLASTX-ээр нийт 482 гадаад контиг илрүүлсэн.Бидний үр дүнгээс харахад олон эст амьтдын ccfDNA-ийн гадаад хэсгүүдийн дунд ясны ясны ДНХ давамгайлж байна (Зураг 5).Мөн шавьж болон бусад зүйлийн ДНХ-ийн хэлтэрхий олдсон.ДНХ-ийн хэлтэрхийний харьцангуй том хэсгийг тогтоогоогүй байгаа нь хуурай газрын зүйлүүдтэй харьцуулахад геномын мэдээллийн санд олон тооны далайн амьтдын төлөөлөл дутуу байгаатай холбоотой байж болох юм [49].
Энэхүү нийтлэлд бид дунгийн тухай LB үзэл баримтлалыг хэрэглэж, гемолимфийн ccfDNA-ийн буудлагын дараалал нь далайн эргийн экосистемийн найрлагыг ойлгох боломжийг олгодог гэж үзэж байна.Ялангуяа бид 1) дунгийн гемолимф нь харьцангуй том (~1-5 кб) эргэлдэж буй ДНХ-ийн хэсгүүдийн харьцангуй өндөр концентраци (микрограмм түвшин) агуулдаг болохыг олж мэдсэн;2) эдгээр ДНХ-ийн хэлтэрхийнүүд нь бие даасан болон бие даасан бус 3) Эдгээр ДНХ-ийн хэлтэрхийнүүдийн гадаад эх сурвалжуудын дотроос бактери, архей, вирусын ДНХ, түүнчлэн бусад олон эсийн амьтдын ДНХ-ийг олсон;4) Эдгээр гадаад ccfDNA хэлтэрхийнүүд гемолимфэд хуримтлагдах нь хурдан явагддаг бөгөөд дунгийн дотоод шүүлтүүрийн үйл ажиллагаанд хувь нэмэр оруулдаг.Эцэст нь хэлэхэд биоанагаах ухаанд голчлон хэрэглэгдэж ирсэн LB хэмээх ухагдахуун нь харуулын төрөл зүйл болон хүрээлэн буй орчны хоорондын харилцан үйлчлэлийг илүү сайн ойлгоход ашиглаж болох баялаг боловч судлагдаагүй мэдлэгийн эх сурвалжийг кодлодог болохыг бидний судалгаа харуулж байна.
Приматуудаас гадна хулгана, нохой, муур, адуу зэрэг хөхтөн амьтдад ccfDNA тусгаарлалт илэрсэн байна [50, 51, 52].Гэсэн хэдий ч бидний мэдэж байгаагаар манай судалгаа нь нээлттэй эргэлтийн системтэй далайн амьтдын ccfDNA-г илрүүлж, дарааллаар нь мэдээлсэн анхны судалгаа юм.Энэхүү анатомийн шинж чанар, дунгийн шүүх чадвар нь бусад зүйлүүдтэй харьцуулахад эргэлдэж буй ДНХ-ийн хэсгүүдийн өөр өөр хэмжээтэй шинж чанарыг дор хаяж хэсэгчлэн тайлбарлаж болно.Хүний цусанд эргэлдэж буй ихэнх ДНХ-ийн хэсгүүд нь 150-200 bp хэмжээтэй жижиг хэсгүүд байдаг.дээд тал нь 167 bp [34, 53].ДНХ-ийн фрагментуудын жижиг боловч чухал хэсэг нь 300-аас 500 bp-ийн хэмжээтэй, ойролцоогоор 5% нь 900 bp-ээс урт байдаг.[54].Ийм хэмжээний хуваарилалтын шалтгаан нь цусны сийвэн дэх ccfDNA-ийн гол эх үүсвэр нь эсийн үхлийн үр дүнд эсвэл эрүүл хүний ​​цусны эргэлтийн эсийн үхжил, эсвэл хорт хавдартай өвчтөнүүдийн хавдрын эсийн апоптозын улмаас үүсдэг (хавдарын ДНХ-ийн эргэлтэнд байдаг)., ctDNA).Бидний дунгаас олдсон гемолимфийн ccfDNA-ийн хэмжээ 1000-аас 5000 bp хооронд хэлбэлзэж байгаа нь дунгийн ccfDNA өөр гарал үүсэлтэй болохыг харуулж байна.Энэ нь логик таамаглал юм, учир нь дун нь хагас задгай судасны системтэй бөгөөд микробын геномын ДНХ-ийн өндөр концентраци агуулсан далайн усан орчинд амьдардаг.Үнэн хэрэгтээ, экзоген ДНХ ашиглан хийсэн лабораторийн туршилтууд нь дун далайн усанд ДНХ-ийн хэсгүүдийг хуримтлуулж, ядаж хэдэн цагийн дараа эсийг шингээж авсны дараа задарч, / эсвэл ялгарч, / эсвэл янз бүрийн байгууллагад хадгалагддаг болохыг харуулсан.Эсүүд (прокариот ба эукариот) ховор байдгийг харгалзан судал доторх тасалгааг ашиглах нь өөрөө болон гадаад эх үүсвэрээс ccfDNA-ийн хэмжээг бууруулна.Хоёр хавхлагт төрөлхийн дархлааны ач холбогдол, эргэлдэж буй фагоцитуудын олон тооны байдлыг харгалзан бид гадны ccfDNA хүртэл бичил биетэн ба/эсвэл эсийн хог хаягдлыг залгихад гадны ДНХ хуримтлагддаг эргэлтийн фагоцитоор баяжуулдаг гэсэн таамаглал дэвшүүлсэн.Хамтдаа авч үзвэл, бидний үр дүнгээс харахад хоёр хавхлагт гемолимфийн ccfDNA нь молекулын мэдээллийн өвөрмөц агуулах бөгөөд тэдний харуулын төрөл болох статусыг бэхжүүлдэг.
Бактерийн гаралтай гемолимфийн ccfDNA фрагментуудын дараалал, шинжилгээ нь эзэн бактерийн ургамал болон хүрээлэн буй далайн экосистемд агуулагдах бактерийн талаархи үндсэн мэдээллийг өгөх боломжтой болохыг бидний мэдээлэл харуулж байна.Буудлагын дарааллыг тогтоох аргууд нь 16S рРНХ-ийг таних уламжлалт аргуудыг ашигласан бол нэг талаар лавлагаа номын сангийн хэвийсэн байдлаас болж орхигдох байсан A. atra заламгай нянгийн дарааллыг илрүүлсэн.Үнэн хэрэгтээ бид Кергуэлэн дэх нэг дунгийн давхаргад M. platensis-аас цуглуулсан LB өгөгдлийг ашигласан нь заламгай холбоотой бактерийн симбионтуудын найрлага нь дунгийн төрөл зүйлийн хувьд ижил байгааг харуулсан (Зураг S4, Нэмэлт мэдээлэл).Генетикийн хувьд ялгаатай хоёр дунгийн ижил төстэй байдал нь Кергуэлэнгийн хүйтэн, хүхэрлэг, галт уулын ордуудын бактерийн бүлгүүдийн найрлагыг илэрхийлж болно [55, 56, 57, 58].Порт-о-Франсын эрэг гэх мэт биотурбат ихтэй далайн эргийн бүс нутгаас [59] дун түүж байхдаа хүхэр бууруулдаг бичил биетний хэмжээ өндөр байгааг сайн тодорхойлсон.Өөр нэг боломж бол коменсал дунгийн ургамал нь хэвтээ дамжуулалтаар нөлөөлж болзошгүй юм [60, 61].Далайн орчин, далайн ёроолын гадаргуу, дун дахь симбиотик бактерийн найрлага хоорондын хамаарлыг тодорхойлохын тулд илүү их судалгаа хийх шаардлагатай байна.Эдгээр судалгаанууд одоогоор үргэлжилж байна.
Гемолимфийн ccfDNA-ийн урт, концентраци, цэвэршүүлэхэд хялбар, хурдан бууны дараалал тогтоох өндөр чанар зэрэг нь далайн эргийн экосистемийн биологийн олон янз байдлыг үнэлэхэд дунгийн ccfDNA-г ашиглахын олон давуу тал юм.Энэ арга нь тухайн экосистем дэх вирусын бүлгэмдлийг (виром) тодорхойлоход онцгой үр дүнтэй байдаг [62, 63].Бактери, археа, эукариотуудаас ялгаатай нь вирусын геном нь 16S дараалал гэх мэт филогенетикийн хувьд хадгалагдсан генийг агуулдаггүй.Бидний үр дүнгээс харахад дун зэрэг үзүүлэлтийн зүйлээс шингэн биопси нь ихэвчлэн далайн эргийн экосистемд амьдардаг хостуудыг халдварладаг харьцангуй олон тооны ccfDNA вирусын хэсгүүдийг тодорхойлоход ашиглаж болно.Үүнд эгэл биетэн, үе хөлт, шавж, ургамал, бактерийн вирус (жишээ нь, бактериофаг) -ийг халдварладаг вирусууд орно.Бид Кергуэлэн дэх ижил дун давхаргад цуглуулсан хөх дунгийн (M. platensis) гемолимфийн ccfDNA виромыг судалж үзэхэд ижил төстэй тархалт илэрсэн (Хүснэгт S2, Нэмэлт мэдээлэл).ccfDNA-ийн буудлагын буудлагын дараалал нь үнэхээр хүний ​​болон бусад зүйлийн виромыг судлахад хүчээ авч буй шинэ арга юм [21, 37, 64].Энэ арга нь хоёр судалтай ДНХ-ийн вирүсийг судлахад онцгой ач холбогдолтой, учир нь Балтимор дахь хамгийн олон төрлийн, өргөн хүрээтэй вирүсийн ангиллыг төлөөлдөг бүх давхар судалтай ДНХ-ийн вирүс дунд ганц ген хадгалагдаагүй байдаг [65].Хэдийгээр эдгээр вирүсийн ихэнх нь ангилалгүй хэвээр байгаа бөгөөд вирусын ертөнцийн огт үл мэдэгдэх хэсгийн вирүсийг агуулж болох ч [66] дун A. atra болон M. platensis-ийн виромууд болон эзэн хүрээ нь хоёр зүйлийн дунд багтдаг болохыг бид олж мэдсэн.үүнтэй адил (S3 зураг, нэмэлт мэдээллийг үзнэ үү).Энэ ижил төстэй байдал нь гайхмаар зүйл биш бөгөөд энэ нь хүрээлэн буй орчинд байгаа ДНХ-ийн шингээлтийн сонгомол чанар дутагдаж байгааг харуулж байна.РНХ виромыг тодорхойлохын тулд цэвэршүүлсэн РНХ ашиглан ирээдүйн судалгаа хийх шаардлагатай байна.
Бид судалгаандаа Коварски болон түүний хамтран ажиллагсдын [37] хийсэн бүтээлээс тохируулсан маш нарийн шугам хоолойг ашигласан бөгөөд тэд уугуул ccfDNA-г угсрахаас өмнө болон дараа нэгтгэсэн уншилтууд болон контигуудыг хоёр үе шаттайгаар устгах аргыг ашигласан бөгөөд үүний үр дүнд зураглаагүй уншилтын хувь өндөр болсон.Иймээс бид эдгээр дунгийн төрөл зүйлийн лавлагаа геном байхгүй учраас эдгээр зураглаагүй уншлагын зарим нь өөрийн гэсэн гарал үүсэлтэй хэвээр байхыг үгүйсгэхгүй.Illumina MiSeq PE75-ийн үүсгэсэн өөрөө болон өөрөө бус уншлага хоорондын химер болон унших уртын талаар санаа зовж байсан учраас бид мөн энэ дамжуулах хоолойг ашигласан.Ихэнх илчлэгдээгүй байгаагийн бас нэг шалтгаан нь далайн нянгийн ихэнх хэсэг, ялангуяа Кергуэлэн зэрэг алслагдсан бүс нутагт тэмдэглэгээ хийгдээгүйтэй холбоотой юм.Бид Illumina MiSeq PE75-г ашигласан бөгөөд хүний ​​ccfDNA-тай төстэй ccfDNA фрагментийн урттай гэж үзэв.Ирээдүйн судалгааны хувьд гемолимфийн ccfDNA нь хүн ба/эсвэл хөхтөн амьтдаас илүү удаан уншдаг болохыг харуулсан бидний үр дүнг харгалзан бид урт ccfDNA фрагментуудад илүү тохиромжтой дарааллын платформ ашиглахыг зөвлөж байна.Энэ дадлага нь илүү гүнзгий дүн шинжилгээ хийх заалтуудыг тодорхойлоход илүү хялбар болгоно.Одоогоор боломжгүй A. atra цөмийн геномын бүрэн дарааллыг олж авах нь ccfDNA-г өөрийн болон өөрөө бус эх сурвалжаас ялгах ажлыг ихээхэн хөнгөвчлөх болно.Бидний судалгаанд шингэн биопсийн тухай ойлголтыг дунгийн нялцгай биетэнд хэрэглэх боломжийн талаар голчлон анхаарч ирсэн тул энэ ойлголтыг цаашдын судалгаанд ашиглахын хэрээр дунгийн бичил биетний олон янз байдлыг судлах энэхүү аргын чадавхийг нэмэгдүүлэх шинэ арга хэрэгсэл, дамжуулах хоолой бий болно гэж найдаж байна.далайн экосистем.
Инвазив бус эмнэлзүйн биомаркерын хувьд хүний ​​сийвэн дэх ccfDNA-ийн түвшин нэмэгдсэн нь янз бүрийн өвчин, эд эсийн гэмтэл, стресстэй холбоотой байдаг [67,68,69].Энэ өсөлт нь эд эс гэмтсэний дараа өөрийн гарал үүслийн ДНХ-ийн хэлтэрхий ялгарахтай холбоотой юм.Бид дун 30 ° C-ийн температурт богино хугацаанд өртсөн хурц дулааны стрессийг ашиглан энэ асуудлыг авч үзсэн.Бид энэ шинжилгээг гурван бие даасан туршилтаар гурван өөр төрлийн дун дээр хийсэн.Гэсэн хэдий ч бид цочмог дулааны стрессийн дараа ccfDNA-ийн түвшинд ямар нэгэн өөрчлөлт гарсангүй (Зураг S5, нэмэлт мэдээллийг үзнэ үү).Энэхүү нээлт нь дун нь хагас задгай цусны эргэлтийн системтэй бөгөөд өндөр шүүлтүүрийн үйл ажиллагааны улмаас гадны ДНХ-г их хэмжээгээр хуримтлуулдаг гэдгийг зарим талаараа тайлбарлаж магадгүй юм.Нөгөөтэйгүүр, дун нь олон сээр нуруугүй амьтдын нэгэн адил стрессээс үүдэлтэй эд эсийн гэмтэлд илүү тэсвэртэй байж, улмаар тэдний гемолимф дэх ccfDNA-ийн ялгаралтыг хязгаарладаг [70, 71].
Өнөөдрийг хүртэл усны экосистем дэх биологийн олон янз байдлын ДНХ-ийн шинжилгээ нь байгаль орчны ДНХ (eDNA) метабаркодлолд голчлон анхаарч ирсэн.Гэсэн хэдий ч праймерыг ашиглах үед биологийн олон янз байдлын шинжилгээнд энэ аргыг ихэвчлэн хязгаарладаг.Бууны дарааллыг ашиглах нь ПГУ-ын хязгаарлалт болон праймер багцыг хэт нэг талыг барьсан сонголтоос зайлсхийдэг.Тэгэхээр манай арга нь нэг ёсондоо сүүлийн үед хэрэглэгдэж байсан, хуваагдмал ДНХ-г шууд дараалалд оруулж, бараг бүх организмд дүн шинжилгээ хийх чадвартай, өндөр хүчин чадалтай eDNA Shotgun дараалал тогтоох аргад илүү ойр байна [72, 73].Гэсэн хэдий ч LB-ийг стандарт eDNA аргуудаас ялгах хэд хэдэн үндсэн асуудлууд байдаг.Мэдээжийн хэрэг, eDNA болон LB-ийн гол ялгаа нь байгалийн шүүлтүүрийн хостуудыг ашиглах явдал юм.Хөвөн, хос хавхлаг (Dresseina spp.) зэрэг далайн амьтдыг eDNA-г судлах байгалийн шүүлтүүр болгон ашигладаг тухай мэдээлсэн [74, 75].Гэсэн хэдий ч Драйсенагийн судалгаанд ДНХ гаргаж авсан эд эсийн биопси ашигласан.LB-ийн ccfDNA-ийн шинжилгээ нь эдийн биопси, тусгай, заримдаа үнэтэй тоног төхөөрөмж, eDNA эсвэл эдийн биопситой холбоотой логистик шаарддаггүй.Үнэн хэрэгтээ бид саяхан LB-ийн ccfDNA-г хүйтэн гинжийг хадгалахгүйгээр FTA-ийн дэмжлэгтэйгээр хадгалж, шинжлэх боломжтой гэж мэдээлсэн нь алслагдсан бүс нутагт судалгаа хийхэд томоохон сорилт болж байна [76].Шингэн биопсиноос ccfDNA гаргаж авах нь бас энгийн бөгөөд бууны дараалал тогтоох, ПГУ-ын шинжилгээ хийхэд өндөр чанартай ДНХ өгдөг.Энэ нь eDNA шинжилгээтэй холбоотой зарим техникийн хязгаарлалтыг авч үзвэл маш том давуу тал юм [77].Дээж авах аргын энгийн бөгөөд хямд өртөг нь урт хугацааны мониторингийн хөтөлбөрүүдэд ялангуяа тохиромжтой.Хос хавхлагын өндөр шүүлтүүрийн чадвараас гадна сайн мэддэг өөр нэг шинж чанар нь тэдний салс дахь химийн мукополисахаридын найрлага нь вирусын шингээлтийг дэмждэг [78, 79].Энэ нь биологийн олон янз байдал болон тухайн усны экосистем дэх уур амьсгалын өөрчлөлтийн нөлөөллийг тодорхойлоход хос хавхлагт хамгийн тохиромжтой байгалийн шүүлтүүр болдог.Хэдийгээр хостоос гаралтай ДНХ-ийн хэлтэрхий байгаа нь eDNA-тай харьцуулахад аргын хязгаарлалт гэж үзэж болох ч эрүүл мэндийн судалгаанд ашиглах боломжтой асар их хэмжээний мэдээллийн хувьд eDNA-тай харьцуулахад ийм эх ccfDNA-тай холбоотой өртөг нь нэгэн зэрэг ойлгомжтой юм.офсет хост.Үүнд эзэн хостын геномд нэгдсэн вирусын дараалал байгаа эсэх.Хос хавхлагт хэвтээ замаар дамждаг лейкемийн ретровирусууд байгаа тул энэ нь дунгийн хувьд онцгой ач холбогдолтой юм [80, 81].LB-ийн eDNA-тай харьцуулахад бас нэг давуу тал нь бичил биетүүдийг (мөн тэдгээрийн геномуудыг) шингээдэг гемолимф дэх цусны эргэлтийн эсийн фагоцитийн идэвхийг ашигладаг явдал юм.Фагоцитоз нь хоёр хавхлагт цусны эсийн үндсэн үүрэг юм [82].Эцэст нь, энэ арга нь дун (дунджаар 1.5 л/ц далайн ус) болон хоёр өдрийн эргэлтийн өндөр шүүлтүүрийн чадавхийг ашигладаг бөгөөд энэ нь далайн усны янз бүрийн давхаргын холимгийг нэмэгдүүлж, гетерологийн eDNA-г авах боломжийг олгодог.[83, 84].Тиймээс дунгийн ccfDNA шинжилгээ нь дунгийн хоол тэжээл, эдийн засаг, байгаль орчинд үзүүлэх нөлөөг харгалзан үзэх сонирхолтой арга юм.Хүнээс цуглуулсан LB-ийн шинжилгээтэй адил энэ арга нь экзоген бодисын хариу урвалын дагуу эзэн ДНХ-ийн генетик болон эпигенетик өөрчлөлтийг хэмжих боломжийг нээж өгдөг.Жишээлбэл, гурав дахь үеийн дарааллын технологийг нанопорын дараалал ашиглан уугуул ccfDNA-д геномын хэмжээнд метиляцийн шинжилгээ хийхээр төлөвлөж болно.Даяны ccfDNA фрагментуудын урт нь химийн хувиргалт хийх шаардлагагүйгээр нэг дарааллаар геномын хэмжээнд ДНХ-ийн метиляцийн шинжилгээ хийх боломжийг олгодог урт уншигдсан дарааллын платформтой төгс нийцэж байгаа нь энэхүү үйл явцыг хөнгөвчлөх ёстой.85,86] Энэ нь ДНХ-ийн олон стресст хариу үйлдэл үзүүлж, хүрээлэн буй орчны сөрөг нөлөөллийг тусгадаг болохыг харуулсан тул сонирхолтой боломж юм.Тиймээс энэ нь уур амьсгалын өөрчлөлт эсвэл бохирдуулагчид өртсөний дараах хариу арга хэмжээг зохицуулах үндсэн механизмын талаар үнэ цэнэтэй ойлголтыг өгч чадна [87].Гэсэн хэдий ч LB-ийн хэрэглээ нь хязгаарлалтгүй биш юм.Энэ нь экосистемд заагч зүйл байхыг шаарддаг гэдгийг хэлэх нь илүүц биз.Дээр дурьдсанчлан, тухайн экосистемийн биологийн олон янз байдлыг үнэлэхийн тулд LB-ийг ашиглах нь эх сурвалжаас ДНХ-ийн хэлтэрхий байгаа эсэхийг харгалздаг биоинформатикийн нарийн шугамыг шаарддаг.Өөр нэг томоохон асуудал бол далайн төрөл зүйлийн лавлагаа геномын олдоц юм.Далайн хөхтөн амьтдын геномын төсөл болон саяхан байгуулагдсан Fish10k төсөл [88] зэрэг санаачилгууд ирээдүйд ийм дүн шинжилгээ хийхэд тусална гэж найдаж байна.LB-ийн үзэл баримтлалыг далайн шүүлтүүрээр тэжээгддэг организмд хэрэглэх нь дараалал тогтоох технологийн хамгийн сүүлийн үеийн дэвшилттэй нийцэж байгаа нь хүрээлэн буй орчны стрессийн хариуд далайн амьдрах орчны эрүүл мэндийн талаар чухал мэдээлэл өгөх олон ом биомаркеруудыг боловсруулахад тохиромжтой.
Геномын дарааллын өгөгдлийг NCBI-ийн дараалал унших архивт https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 Bioprojects SRR8924808 дор хадгалсан.
Brierley AS, Kingsford MJ Уур амьсгалын өөрчлөлтийн далайн амьдрал ба экосистемд үзүүлэх нөлөө.Коул биологи.2009;19: P602–P614.
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Almpanidou V, Bevilacqua S, et al.Уур амьсгалын өөрчлөлт болон бусад орон нутгийн стрессийн хүчин зүйлийн далайн орчинд үзүүлэх нөлөөллийг авч үзье.шинжлэх ухааны ерөнхий орчин.2021;755:142564.
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P, et al.).Гуравдугаар сарын нэгний шинжлэх ухаан.2020;7:48.
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. Дахин давтагдах дулааны стрессийн нөхцөлд дулаан тэсвэрлэх чадвар буурсан нь хөх дунгийн зуны үхэл өндөр байгааг тайлбарладаг.2019 оны шинжлэх ухааны тайлан;9:17498.
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER, et al.Малын үхлийн давтамж, шалтгаан, цар хүрээний сүүлийн үеийн өөрчлөлт.Proc Natl Acad Sci АНУ.2015;112:1083-8.
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mugetti D, Cerruti F, Hosseini S, et al.Олон төрлийн өвөрмөц бус эмгэг төрүүлэгчид нь Pinna nobilis-ийн үхэлд хүргэж болзошгүй юм.Амьдрал.2020;10:238.
Брэдли М, Коуттс СЖ, Женкинс И, О'Хара ТМ.Арктикийн зоонозын өвчинд уур амьсгалын өөрчлөлтийн болзошгүй нөлөө.Int J Circumpolar Health.2005;64:468–77.
Beyer J., Greene NW, Brooks S., Allan IJ, Ruus A., Gomez T. et al.Цэнхэр дун (Mytilus edulis spp.) нь далайн эрэг орчмын бохирдлын мониторингийн дохионы организм болох: тойм.Гуравдугаар сар Environ Res 2017;130:338-65.
Siravegna G, Marsoni S, Siena S, Bardelli A. Хорт хавдрын эмчилгээнд шингэн биопсийн интеграци.Nat Rev Clean Oncol.2017;14:531–48.
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C, et al.Шингэн биопсийн боловсорч гүйцсэн байдал: Хавдрын ДНХ-ийг эргэлдүүлнэ.Нат Илч Хорт хавдар.2017;17:223–38.
Mandel P., Metais P. Хүний сийвэн дэх нуклейн хүчлүүд.Soc Biol охин компаниудын хурлын тэмдэглэл.1948;142:241-3.
Bronkhorst AJ, Ungerer W, Holdenrieder S. Хорт хавдрын эмчилгээнд молекулын маркер болох эсгүй ДНХ-ийн шинэ үүрэг.Биомоляр шинжилгээний тоон үзүүлэлт.2019;17:100087.
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS Шингэн биопси нь клиникт орж ирдэг - хэрэгжилтийн асуудлууд ба ирээдүйн сорилтууд.Nat Rev Clin Oncol.2021;18:297–312.
Lo YM, Corbetta N., Chamberlain PF, Rai W., Sargent IL, Redman CW болон бусад.Ургийн ДНХ эхийн сийвэн болон ийлдэст байдаг.Лансет.1997;350:485-7.
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR Жирэмсэн үед эмэгтэйчүүдийн цусан дахь цусны эргэлтийн эсийн гаднах РНХ-ийг ашиглан жирэмсний явц ба түүний хүндрэлийн судалгаа.Допедиатри.2020;8:605219.
Ollerich M, Sherwood K, Keown P, Schütz E, Beck J, Stegbauer J, et al.Шингэн биопси: донорын эсгүй ДНХ нь бөөрний шилжүүлэн суулгахад аллогений гэмтэл илрүүлэхэд ашиглагддаг.Нат Илч Нефрол.2021;17:591–603.
Juan FC, Lo YM Төрөхийн өмнөх оношлогооны шинэчлэл: эхийн плазмын геномын дараалал.Анна MD.2016;67:419-32.
Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D, et al.Халдвар авсан биеийн шингэний дараагийн үеийн метагеномын дарааллаар эмгэг төрүүлэгчийг хурдан илрүүлэх.Нат анагаах ухаан.2021;27:115-24.