Nature.com сайтаар зочилсонд баярлалаа.Таны ашиглаж буй хөтчийн хувилбар нь хязгаарлагдмал CSS дэмжлэгтэй.Хамгийн сайн ашиглахын тулд бид танд шинэчилсэн хөтөч ашиглахыг зөвлөж байна (эсвэл Internet Explorer-д нийцтэй байдлын горимыг идэвхгүй болгох).Энэ хооронд байнгын дэмжлэгийг хангахын тулд бид сайтыг ямар ч загвар, JavaScript-гүйгээр үзүүлэх болно.
Эмийн шинжилгээнд зориулж зүрхний физиологийн орчныг үнэн зөв гаргаж чаддаг найдвартай in vitro систем хэрэгтэй байна.Хүний зүрхний эд эсийн өсгөвөрлөх системийн хязгаарлагдмал байдал нь зүрхний эмийн нөлөөг буруу тайлбарлахад хүргэсэн.Энд бид зүрхний мөчлөгийн систолын болон диастолын үе шатанд зүрхний зүсмэлүүдийг цахилгаан механикаар өдөөж, физиологийн суналтанд ордог зүрхний эдийн өсгөвөрлөх загварыг (CTCM) боловсруулсан.12 хоногийн турш өсгөвөрлөсний дараа энэ арга нь зүрхний хэсгүүдийн амьдрах чадварыг хэсэгчлэн сайжруулсан боловч тэдгээрийн бүтцийн бүрэн бүтэн байдлыг бүрэн хадгалж чадаагүй юм.Тиймээс жижиг молекулын скрининг хийсний дараа 100 нМ трииодотиронин (T3) ба 1 мкМ дексаметазон (Декс) -ийг манай орчинд нэмснээр 12 хоногийн турш хэсгүүдийн бичил бүтцийг хадгалж байгааг олж мэдсэн.T3/Dex эмчилгээтэй хослуулан CTCM систем нь транскрипцийн профайл, амьдрах чадвар, бодисын солилцооны үйл ажиллагаа, бүтцийн нэгдмэл байдлыг 12 хоногийн турш зүрхний шинэ эд эстэй ижил түвшинд байлгасан.Нэмж дурдахад, өсгөвөрт зүрхний эдийг хэт их сунгах нь зүрхний гипертрофийн дохиог өдөөдөг бөгөөд энэ нь CTCM нь зүрхний суналтаас үүдэлтэй гипертрофийн нөхцлийг дуурайж чаддаг болохыг нотлох баримт юм.Дүгнэж хэлэхэд, CTCM нь зүрхний физиологи, эмгэг физиологийг өсгөвөрлөхөд урт хугацааны туршид загварчлах боломжтой бөгөөд энэ нь эмийн найдвартай скрининг хийх боломжийг олгодог.
Эмнэлзүйн судалгаа хийхээс өмнө хүний ​​зүрхний физиологийн орчныг үнэн зөв гаргаж чаддаг найдвартай in vitro систем хэрэгтэй.Ийм систем нь өөрчлөгдсөн механик суналт, зүрхний цохилт, электрофизиологийн шинж чанаруудыг дуурайдаг.Амьтны загварыг ихэвчлэн зүрхний физиологийн шинжилгээний платформ болгон ашигладаг бөгөөд хүний ​​зүрхэнд эмийн нөлөөг тусгах найдвартай байдал хязгаарлагдмал байдаг1,2.Эцсийн дүндээ зүрхний эдийн соёлын хамгийн тохиромжтой туршилтын загвар (CTCM) нь хүний ​​зүрхний физиологи, эмгэг физиологийг үнэн зөвөөр хуулбарлаж, янз бүрийн эмчилгээ, эм зүйн үйл ажиллагаанд онцгой мэдрэмжтэй, өвөрмөц загвар юм3.Ийм систем байхгүй байгаа нь зүрхний дутагдлын шинэ эмчилгээний нээлтийг хязгаарладаг4,5 ба эмийн зүрх хордлого нь зах зээлээс гарах гол шалтгаан болсон6.
Сүүлийн 10 жилийн хугацаанд зүрх судасны бус найман эм нь QT интервалыг уртасгаж ховдолын хэм алдагдал, гэнэтийн үхэлд хүргэдэг тул эмнэлзүйн хэрэглээнээс хасагдсан.Иймээс зүрх судасны үр нөлөө, хордлогыг үнэлэх найдвартай эмнэлзүйн өмнөх скринингийн стратеги хэрэгцээ улам бүр нэмэгдэж байна.Сүүлийн үед хүний ​​үүсгэсэн плюрипотент үүдэл эсээс гаралтай кардиомиоцитуудыг (hiPS-CM) эмийн скрининг болон хордлогын шинжилгээнд ашиглаж байгаа нь энэ асуудлыг хэсэгчлэн шийдэж байна.Гэсэн хэдий ч hiPS-CM-ийн төлөвшөөгүй шинж чанар, зүрхний эд эсийн олон эсийн нарийн төвөгтэй байдал байхгүй нь энэ аргын гол хязгаарлалт юм.Сүүлийн үеийн судалгаагаар аяндаа агшилт эхэлснээс хойш удалгүй зүрхний эдийн гидрогелийг бий болгохын тулд эрт үеийн hiPS-CM-ийг ашиглан энэ хязгаарлалтыг хэсэгчлэн даван туулж, цахилгаан өдөөлтийг аажмаар нэмэгдүүлж болохыг харуулсан.Гэсэн хэдий ч эдгээр hiPS-CM бичил эдүүд нь насанд хүрэгчдийн миокардийн гүйцсэн цахилгаан физиологийн болон агшилтын шинж чанаргүй байдаг.Нэмж дурдахад хүний ​​зүрхний эд нь эсийн гаднах матрицын тодорхой багц уургуудаар холбогдсон эндотелийн эсүүд, мэдрэлийн эсүүд, стромын фибробластууд зэрэг янз бүрийн төрлийн эсийн нэг төрлийн бус холимогоос бүрддэг илүү төвөгтэй бүтэцтэй байдаг.Насанд хүрэгчдийн хөхтөн амьтдын зүрхэнд кардиомиоцитын бус популяцийн нэг төрлийн бус байдал11,12,13 нь бие даасан эсийн төрлийг ашиглан зүрхний эдийг загварчлахад гол саад болж байна.Эдгээр томоохон хязгаарлалтууд нь физиологийн болон эмгэгийн нөхцөлд зүрхний булчингийн бүрэн бүтэн эдийг өсгөвөрлөх аргыг боловсруулахын ач холбогдлыг онцолж байна.
Хүний зүрхний ургуулсан нимгэн (300 мкм) хэсгүүд нь хүний ​​зүрхний булчингийн бүрэн бүтэн байдлын ирээдүйтэй загвар болох нь батлагдсан.Энэ арга нь хүний ​​зүрхний эдтэй төстэй 3D олон эсийн бүрэн системд нэвтрэх боломжийг олгодог.Гэсэн хэдий ч 2019 он хүртэл өсгөвөрлөсөн зүрхний зүслэгийг богино хугацаанд (24 цаг) өсгөвөрлөх замаар хязгаарласан.Энэ нь физик-механик суналт, агаар-шингэний интерфейс, зүрхний эд эсийн хэрэгцээг хангахгүй энгийн зөөвөрлөгч ашиглах зэрэг олон хүчин зүйлээс шалтгаална.2019 онд хэд хэдэн судалгааны бүлгүүд зүрхний эдийн өсгөвөрийн тогтолцоонд механик хүчин зүйлсийг оруулах нь соёлын амьдралыг уртасгаж, зүрхний илэрхийлэлийг сайжруулж, зүрхний эмгэгийг дуурайдаг болохыг харуулсан.17 ба 18-р гоёмсог хоёр судалгаа нь нэг тэнхлэгт механик ачаалал нь өсгөвөрлөх явцад зүрхний фенотипэд эерэг нөлөө үзүүлдэг болохыг харуулж байна.Гэсэн хэдий ч эдгээр судалгаанууд нь зүрхний мөчлөгийн динамик гурван хэмжээст физик-механик ачааллыг ашиглаагүй, учир нь зүрхний хэсгүүд нь изометрийн суналтын хүч 17 эсвэл шугаман ауксотоник ачаалал 18-ийн аль нэгээр ачаалагдсан байдаг.Эд эсийг сунгах эдгээр аргууд нь зүрхний олон генийг дарангуйлах эсвэл хэвийн бус сунгалтын хариу урвалтай холбоотой генийг хэт ихээр илэрхийлэхэд хүргэсэн.Мэдэгдэх ёсгүй, potulis et al.19 нь хүч хувиргагчийн санал хүсэлт болон хурцадмал хөтчүүдийг ашиглан зүрхний мөчлөгийг сэргээхэд зориулагдсан динамик зүрхний зүсмэл өсгөвөрлөгчийг боловсруулсан.Хэдийгээр энэ систем нь in vitro зүрхний мөчлөгийн загварчлалыг илүү нарийвчлалтай хийх боломжийг олгодог боловч аргын нарийн төвөгтэй байдал, бага нэвтрүүлэх чадвар нь энэ системийн хэрэглээг хязгаарладаг.Манай лаборатори саяхан гахайн мах болон хүний ​​зүрхний эд эсийн амьдрах чадварыг 6 хүртэл хоног байлгахын тулд цахилгаан өдөөлт, оновчтой орчинг ашиглан хялбаршуулсан өсгөвөрлөх системийг бүтээжээ.
Одоогийн гар бичмэлд бид зүрхний мөчлөгийн үед зүрхний гурван хэмжээст физиологи болон эмгэг физиологийн суналтыг товчлохын тулд хошин дохиог агуулсан гахайн зүрхний хэсгүүдийг ашиглан зүрхний эдийн өсгөвөрлөх загварыг (CTCM) дүрсэлсэн болно.Энэхүү CTCM нь эмнэлзүйн өмнөх эмийн шинжилгээнд зориулж хөхтөн амьтдын зүрхний физиологи/эмгэг физиологийг дуурайсан зардал багатай, дунд зэргийн хүчин чадалтай зүрхний системийг бий болгосноор эмнэлзүйн өмнөх эмийн таамаглалын нарийвчлалыг урьд өмнө хэзээ ч хүрч байгаагүй түвшинд хүргэж чадна.
Гемодинамик механик дохио нь in vitro 22,23,24 кардиомиоцитын үйл ажиллагааг хангахад чухал үүрэг гүйцэтгэдэг.Одоогийн гар бичмэл дээр бид физиологийн давтамж (1.2 Гц, минутанд 72 цохилт) цахилгаан болон механик өдөөлтийг өдөөх замаар насанд хүрэгчдийн зүрхний орчныг дуурайж чаддаг CTCM (Зураг 1а) боловсруулсан.Диастолын үед эдийг хэт их сунгахаас сэргийлэхийн тулд 3D хэвлэх төхөөрөмж ашиглан эд эсийн хэмжээг 25%-иар нэмэгдүүлсэн (Зураг 1б).C-PACE системээр өдөөгдсөн цахилгааны хэмнэл нь зүрхний мөчлөгийг бүрэн сэргээхийн тулд өгөгдөл цуглуулах системийг ашиглан систолын өмнө 100 мс-ийн дараа эхлэхээр тохируулсан.Эд эсийн өсгөвөрлөх систем нь программчлагдсан пневматик идэвхжүүлэгчийг (LB Engineering, Герман) ашигладаг бөгөөд уян хатан силикон мембраныг дээд танхимд зүрхний зүсмэлүүдийг тэлэхэд хүргэдэг.Систем нь даралт хувиргагчаар дамжуулан гадаад агаарын шугамд холбогдсон бөгөөд энэ нь даралт (± 1 ммМУБ) ба цаг (± 1 мс) -ийг нарийн тохируулах боломжтой болсон (Зураг 1c).
a Төхөөрөмжийн өсгөвөрлөх тасалгааны дотор хөх өнгөөр ​​харуулсан 7 мм-ийн тулгуур цагирагт эдийн хэсгийг холбоно.Өсгөвөрлөх тасалгаа нь агаарын камераас нимгэн уян хатан силикон мембранаар тусгаарлагддаг.Нэвчилтээс урьдчилан сэргийлэхийн тулд танхим бүрийн хооронд жийргэвчийг байрлуул.Төхөөрөмжийн таг нь цахилгаан өдөөлтийг өгдөг бал чулуу электродуудыг агуулдаг.б Том эдийн төхөөрөмж, чиглүүлэгч цагираг, тулгуур цагирагийн бүдүүвч дүрслэл.Эдийн хэсгүүд (хүрэн) нь төхөөрөмжийн гадна талын ирмэг дээрх ховилд байрлуулсан чиглүүлэгч цагираг бүхий том хэмжээтэй төхөөрөмж дээр байрладаг.Удирдамжийг ашиглан нийлэг нийлэг цавуугаар бүрсэн тулгуур цагирагыг зүрхний эд эсийн хэсэгт болгоомжтой байрлуулна.c Программчлагдах пневматик идэвхжүүлэгчээр (PPD) удирддаг агаарын камерын даралтын функцээр цахилгаан өдөөлт хийх хугацааг харуулсан график.Даралт мэдрэгч ашиглан цахилгаан өдөөлтийг синхрончлохын тулд өгөгдөл цуглуулах төхөөрөмжийг ашигласан.Өсгөвөрлөх тасалгааны даралт тогтоосон босго хэмжээнд хүрэхэд импульсийн дохио C-PACE-EM руу илгээгдэж, цахилгаан өдөөлтийг өдөөдөг.d Инкубаторын тавиур дээр байрлуулсан дөрвөн CTCM-ийн зураг.Дөрвөн төхөөрөмжийг нэг PPD-д хийн хэлхээгээр холбож, хийн хэлхээний даралтыг хянахын тулд даралт мэдрэгчийг цус тогтоогч хавхлагт оруулдаг.Төхөөрөмж бүр зургаан эдийн хэсэгтэй.
Нэг пневматик идэвхжүүлэгч ашиглан бид 4 CTCM төхөөрөмжийг удирдах боломжтой болсон бөгөөд тус бүр нь 6 эд эсийн хэсгийг багтаах боломжтой (Зураг 1d).CTCM-д агаарын камер дахь агаарын даралтыг шингэний камер дахь синхрон даралт болгон хувиргаж, зүрхний зүсмэлийн физиологийн тэлэлтийг өдөөдөг (Зураг 2a ба Нэмэлт кино 1).80 мм м.у.б-д эд эсийн суналтын үнэлгээ.Урлаг.эдийн хэсгүүдийн суналтыг 25% -иар харуулсан (Зураг 2b).Энэ суналтын хувь нь зүрхний хэвийн агшилтын хувьд физиологийн саркомерын урт 2.2-2.3 мкм-тэй тохирч байгааг харуулж байна17,19,25.Эд эсийн хөдөлгөөнийг тусгай камерын тохиргоог ашиглан үнэлэв (Нэмэлт Зураг 1).Эд эсийн хөдөлгөөний далайц ба хурд (Зураг 2c, d) нь зүрхний мөчлөгийн үеийн суналт, систолын болон диастолын үеийн хугацаатай тохирч байв (Зураг 2b).Өсгөвөрт 12 хоногийн турш агшилт, сулрах үед зүрхний эд эсийн сунах, хурд нь тогтмол байв (Зураг 2f).Өсгөвөрлөх явцад цахилгаан өдөөлтийн агшилтын нөлөөг үнэлэхийн тулд бид сүүдэрлэх алгоритмыг ашиглан идэвхтэй хэв гажилтыг тодорхойлох аргыг боловсруулсан (Нэмэлт Зураг 2a,b) ба цахилгаан өдөөлттэй болон өдөөлтгүй хэв гажилтыг ялгах боломжтой болсон.Зүрхний ижил хэсэг (Зураг 2f).Зүсэлтийн хөдлөх хэсэгт (R6-9) цахилгаан өдөөлтийн үед хүчдэл нь цахилгаан өдөөлт байхгүй үеийнхээс 20% их байсан нь цахилгаан өдөөлт нь агшилтын үйл ажиллагаанд хувь нэмэр оруулдаг болохыг харуулж байна.
Агаарын камерын даралт, шингэний тасалгааны даралт, эд эсийн хөдөлгөөний хэмжилтийн төлөөллийн ул мөр нь тасалгааны даралт нь шингэний тасалгааны даралтыг өөрчилдөг бөгөөд энэ нь эдийн зүсмэлийн харгалзах хөдөлгөөнийг үүсгэдэг.б суналтын хувийн (улбар шар) харгалзах эдийн хэсгүүдийн суналтын хувийн (цэнхэр) төлөөллийн ул мөр.c Зүрхний зүсмэлийн хэмжсэн хөдөлгөөн нь хэмжсэн хөдөлгөөний хурдтай тохирч байна.(г) Зүрхний зүсмэл дэх мөчлөгийн хөдөлгөөн (цэнхэр шугам) ба хурдны (улбар шар өнгийн тасархай шугам) төлөөллийн траекторууд.e Циклийн цаг (n = 19 зүсмэл, өөр өөр гахайн бүлэгт), агшилтын хугацаа (n = 19 зүсмэл бүлэгт), амрах хугацаа (n = 19 зүсмэл бүлэг, өөр өөр гахайн), эдийн хөдөлгөөн (n = 25).зүсмэлүүд) / өөр өөр гахайн бүлэг), дээд систолын хурд (n = 24 (D0), 25 (D12) зүсмэлүүд / өөр өөр гахайн бүлэг) болон оргил амралтын хурд (n = 24 (D0), 25 (D12) зүсмэлүүд / өөр өөр гахайн бүлэг).Хоёр сүүлт Оюутны t-тест нь ямар ч параметрийн хувьд мэдэгдэхүйц ялгаагүй болохыг харуулсан.f (улаан) ба цахилгаан өдөөлтгүй (цэнхэр) эд эсийн хэсгүүдийн төлөөлөгч омгийн шинжилгээ, ижил хэсгээс эд эсийн арван бүс нутгийн хэсэг.Доод талын самбарууд нь янз бүрийн хэсгүүдийн арван хэсэгт цахилгаан өдөөлттэй болон цахилгаан өдөөлтгүй эд хэсгүүдийн суналтын хувийн зөрүүг харуулсан байна. (n = өөр өөр гахайнаас 8 зүсмэл/бүлэг, Хоёр сүүлт оюутны t-тестийг хийсэн; ****p <0.0001, **p <0.01, *p <0.05). (n = өөр өөр гахайнаас 8 зүсмэл/бүлэг, Хоёр сүүлт оюутны t-тестийг хийсэн; ****p <0.0001, **p <0.01, *p <0.05). (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). (n = өөр өөр гахайн 8 хэсэг/бүлэг, хоёр сүүлт Оюутны t-тест; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05). （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0,0001，**p < 0,01，*5）. （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0,0001，**p < 0,01，*5）. (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, хоёр талын шалгуур Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = 8 хэсэг/бүлэг, өөр өөр гахайнаас авсан, хоёр сүүлт Оюутны t-тест; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05).Алдааны мөр нь дундаж ± стандарт хазайлтыг илэрхийлнэ.
Бидний өмнөх статик биомиметик зүрхний зүсмэл өсгөвөрийн системд [20, 21] бид цахилгаан өдөөлтийг хэрэглэж, дундын найрлагыг оновчтой болгосноор зүрхний зүсмэлүүдийн амьдрах чадвар, үйл ажиллагаа, бүтцийн бүрэн бүтэн байдлыг 6 хоногийн турш хадгалсан.Гэвч 10 хоногийн дараа эдгээр үзүүлэлтүүд огцом буурсан байна.Бид өмнөх статик биомиметик өсгөвөрийн систем 20, 21 хяналтын нөхцөлд (Ctrl) өсгөвөрлөсөн хэсгүүдэд хандах бөгөөд бид өмнө нь оновчтой болгосон орчноо MC нөхцөл болон нэгэн зэрэг механик болон цахилгаан өдөөлт (CTCM) дор өсгөвөрлөх болно.дуудсан.Нэгдүгээрт, цахилгаан өдөөлтгүйгээр механик өдөөлт нь эд эсийн амьдрах чадварыг 6 хоногийн турш хадгалахад хангалтгүй болохыг тогтоосон (Нэмэлт зураг 3a, b).Сонирхолтой нь, STCM ашиглан физик-механик болон цахилгаан өдөөлтийг нэвтрүүлснээр 12 хоногийн зүрхний хэсгүүдийн амьдрах чадвар нь MS-ийн нөхцөлд зүрхний шинэ хэсгүүдийнхтэй ижил хэвээр байсан боловч MTT шинжилгээгээр харуулсанчлан Ctrl нөхцөлд тийм биш юм (Зураг 1).3a).Энэ нь зүрхний мөчлөгийн механик өдөөлт, симуляци нь бидний өмнөх статик өсгөвөрийн системд мэдээлсэнээс хоёр дахин урт эд эсийн амьдрах чадварыг хадгалж чадна гэдгийг харуулж байна.Гэсэн хэдий ч зүрхний тропонин Т ба коннексин 43-ийн дархлааны тэмдэглэгээгээр эд эсийн бүтцийн нэгдмэл байдлыг үнэлэхэд коннексин 43-ийн илэрхийлэл MC эдэд 12 дахь өдөр хяналттай харьцуулахад хамаагүй өндөр байгааг харуулсан.Гэсэн хэдий ч нэг төрлийн коннексин 43 илэрхийлэл ба Z-диск үүсэх бүрэн хадгалагдаагүй (Зураг 3b).Бид эд эсийн бүтцийн нэгдмэл байдлыг хэмжихийн тулд хиймэл оюун ухааны (AI) хүрээг26, тропонин-Т болон коннексины будалт43 дээр суурилсан зурагт суурилсан гүнзгий суралцах дамжуулах хоолойг ашиглан зүрхний зүсмэлүүдийн бүтцийн нэгдмэл байдал, флюресценцийг нутагшуулах бат бэхийн хувьд автоматаар хэмждэг.Энэ арга нь лавлагаанд тайлбарласны дагуу зүрхний эд эсийн бүтцийн нэгдмэл байдлыг автоматжуулсан, шударга бус аргаар найдвартай тооцоолохын тулд Convolutional Neural Network (CNN) болон гүнзгий сургалтын тогтолцоог ашигладаг.26. MC эд нь статик хяналтын хэсгүүдтэй харьцуулахад 0-р өдөртэй харьцуулахад бүтцийн ижил төстэй байдал сайжирсан.Түүнчлэн Массоны трихромын будалт нь өсгөвөрлөлтийн 12 дахь өдрийн хяналтын нөхцөлтэй харьцуулахад MS-ийн нөхцөлд фиброзын хувь мэдэгдэхүйц бага байгааг илрүүлсэн (Зураг 3c).CTCM нь 12 дахь өдрийн зүрхний эд эсийн амьдрах чадварыг шинэхэн зүрхний эдүүдийнхтэй ижил түвшинд хүртэл нэмэгдүүлж байсан ч зүрхний хэсгүүдийн бүтцийн нэгдмэл байдлыг мэдэгдэхүйц сайжруулаагүй.
Баганан график нь статик өсгөвөрт (D12 Ctrl) эсвэл CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12/MC) 12 хоногийн турш шинэ зүрхний зүсмэлүүд (D0) эсвэл зүрхний зүсмэл өсгөвөрийн MTT амьдрах чадварын тоон үзүүлэлтийг харуулж байна. D0-тэй харьцуулахад 0.0001, D12 Ctrl-тай харьцуулахад **p < 0.01). Баганан график нь статик өсгөвөрт (D12 Ctrl) эсвэл CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl ), 12 (D12 Ctrl ), 12 (D12 pi/MCs ) хийсэн 12 хоногийн турш шинэ зүрхний зүсмэлүүд (D0) эсвэл зүрхний зүсмэл өсгөвөрийн 12 хоногийн турш амьдрах чадварын хэмжигдэхүүнийг харуулж байна. D0-тэй харьцуулахад < 0.0001, D12 Ctrl-тай харьцуулахад **p < 0.01).гистограмм нь статик өсгөвөр (D12 хяналт) эсвэл CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 хяналт). ) ) ), 12 (D12 MC) хэсэгт 12 хоногийн турш зүрхний шинэ хэсгүүдийн (D0) эсвэл зүрхний хэсгүүдийн өсгөвөрийн амьдрах чадварын тоон үзүүлэлтийг харуулав.####p < 0,0001 по сравнению с D0 ба **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0.0001 D0-тэй харьцуулахад ба **p < 0.01 D12 Ctrl). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切(D12 Ctrl) 中新鲜心脏切(D12 Ctrl) 12 天的MTT 活力的量化)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测行单向ANOVA 测行单向ANOVA 测行单向ANOVA 测行单向ANOVA 测行单向ANOVA 测试#0#0#0.，来自不同猪的12 猪的12 (D12 MC) 01，与D12 Ctrl 相比，**p <0.01)。 a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切(D12 Ctrl) 中新鲜心脏切(D12 Ctrl) 12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比；,####p < 0.0001，与D12 Ctrl 相比)**pСтатик өсгөвөрт (D12 хяналт) эсвэл CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 хяналт)), 12 (D12 MC) хэсэг/бүлэг, янз бүрийн ANOVA-ийн сорилд 12 хоногийн турш өсгөвөрлөсөн зүрхний шинэ хэсгүүдийн (D0) эсвэл зүрхний хэсгүүдийн MTT амьдрах чадварын хэмжигдэхүүнийг харуулсан гистограмм;####p < 0,0001 по сравнению с D0, **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p <0.0001 D0-тэй харьцуулахад, **p <0.01-тэй харьцуулахад D12 Ctrl).b Тропонин-Т (ногоон), коннексин 43 (улаан) ба DAPI (цэнхэр) зүрхний шинэхэн тусгаарлагдсан хэсгүүдэд (D0) эсвэл статик нөхцөлд (Ctrl) эсвэл CTCM нөхцөлд (MC) 12 хоногийн турш өсгөвөрлөсөн зүрхний хэсгүүдэд) иммунофлуоресценцийн төлөөлөл (хоосон масштаб = 100 мкм). Зүрхний эд эсийн бүтцийн нэгдмэл байдлын хиймэл оюун ухааны тоон үзүүлэлт (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) зүсмэлүүд/бүлэг тус бүр нь өөр өөр гахайн ANOVA тестийг хийсэн; ####p <0.0001 D0 ба ****0 C10-тэй харьцуулахад D0, ****p <10). Зүрхний эд эсийн бүтцийн нэгдмэл байдлын хиймэл оюун ухаанаар хэмжигдэхүүн (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) зүсмэлүүд/бүлэг тус бүр өөр өөр гахайн, нэг талын ANOVA шинжилгээг хийсэн; ####p <0.0001 D0 ба D0.020-тэй харьцуулахад C ****01). Количественная оценка структурной целостности сердечной ткани искусственным интеллектом (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) срезов/групп нь янз бүрийн свиней, проводится однофакторный тест ANOVA проводится <0#000; ##0#p ,0001 по сравнению с D12 Ctrl). Зүрхний эд эсийн бүтцийн нэгдмэл байдлыг хиймэл оюун ухаанаар тодорхойлох (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) өөр өөр гахайн хэсэг/бүлэг, нэг талын ANOVA тест хийсэн; ####p <0.0001, D0 ба D0.20-тэй харьцуулсан.人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) өөр өөр гахайн зүсмэлүүд/бүлэг тус бүр, нэг талын ANOVA тест #0 #0.縛0;比，****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) өөр өөр гахайн зүсмэлүүд/бүлэг тус бүр, нэг талын ANOVA тест ##00;#00;比，****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。 Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной ткани (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) срезов/группу каждой из разных свиней, односторонний тест ANOVA; #0#07p <0 vs D#0****p. 001 по сравнению с D12 Ctrl). Зүрхний эд эсийн бүтцийн нэгдмэл байдлыг тодорхойлох хиймэл оюун ухаан (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) хэсэг/бүлэг тус бүр өөр өөр гахай, нэг талын ANOVA тест; ####p<0.0001 vs .D0 Харьцуулахын тулд C0.10). c Массоны трихромын будгаар будсан зүрхний зүсмэлүүдийн төлөөллийн зураг (зүүн талд) болон тоон үзүүлэлт (баруун) (Нүцгэн хэмжээ нүцгэн = 500 μм) (n = 10 зүсмэл/бүлэг тус бүр өөр өөр гахайн, нэг талын ANOVA тест хийсэн; ####p < 0.0001-ийг D2-тэй харьцуулсан. D2). c Массоны трихромын будгаар будсан зүрхний зүсмэлүүдийн төлөөллийн зураг (зүүн талд) болон тоон үзүүлэлт (баруун) (Нүцгэн нүцгэн = 500 μм) (n = 10 зүсмэл/бүлэг тус бүр өөр өөр гахайн, нэг талын ANOVA тест хийсэн; #### p < 0.0000 ба ***01-ийг D1-тэй харьцуулсан). в Репрезентативные изображения (слева) и количественная оценка (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массона (масштаб без покрытия = 500 мкм) (n = 10 срезов/группу нь разных свиней, выпнолня тест, pNO0#, pNO0#; по сравнению с D0 и ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Массоны трихромын будгаар будсан зүрхний хэсгүүдийн төлөөлөл (зүүн) болон тоон үзүүлэлт (баруун) (н = 10 хэсэг/өөр өөр гахайн бүлэг, нэг талын ANOVA тест хийсэн; #### p <0 .0001 D0 ба ***10-тай харьцуулбал D0.10). c 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（裸（右）（裸（右）（裸（右）（裸=專0µ0强伺伺切片/组，每组来自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 相比，0.1*p ）. C 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 量化 （右） 裸尺度 裸尺度度度 = 500 μm） （n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 单向 单向 Anova （0#0.p Anova （0#0.相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）。 c Репрезентативные изображения (слева) и количественный анализ (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массона (чистая шкала = 500 мкм) (n = 10 срезов/группа, каждий от другой свиньова свиньи, потесперого смоперого#; ## #p < 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Массоны трихромын будгаар будсан зүрхний хэсгүүдийн төлөөлөл (зүүн) болон тоон үзүүлэлт (баруун) (n = 10 хэсэг/бүлэг, тус бүр нь өөр гахайнаас, нэг талын дисперсийн шинжилгээгээр шалгасан ;### # p < 0.0001-ийг D10-тэй харьцуулахад D1.0, ***p <0.1).Алдааны мөр нь дундаж ± стандарт хазайлтыг илэрхийлнэ.
Бид өсгөвөрлөх орчинд жижиг молекулуудыг нэмснээр кардиомиоцитын бүрэн бүтэн байдлыг сайжруулж, CTCM өсгөвөрлөх явцад фиброзын хөгжлийг бууруулж чадна гэж бид таамагласан.Тиймээс бид цөөн тооны будлиантай хүчин зүйлсийн улмаас статик хяналтын өсгөвөр20,21 ашиглан жижиг молекулуудыг шалгасан.Энэ дэлгэцэнд дексаметазон (Декс), трииодотиронин (T3), SB431542 (SB) зэргийг сонгосон.Эдгээр жижиг молекулуудыг өмнө нь hiPSC-CM өсгөвөрт саркомерын урт, Т-гуурсан хоолой, дамжуулалтын хурдыг нэмэгдүүлэх замаар кардиомиоцитуудын боловсорч гүйцэхийг өдөөх зорилгоор ашиглаж байсан.Нэмж дурдахад Dex (глюкокортикоид) ба SB хоёулаа үрэвслийг дарах чадвартай байдаг29,30.Тиймээс бид эдгээр жижиг молекулуудын нэгийг эсвэл тэдгээрийн хослолыг оруулах нь зүрхний хэсгүүдийн бүтцийн нэгдмэл байдлыг сайжруулах эсэхийг туршиж үзсэн.Эхний скрининг хийхдээ нэгдэл тус бүрийн тунг эсийн өсгөвөрлөх загварт (1 μM Dex27, 100 nM T327, 2.5 μM SB31) түгээмэл хэрэглэгддэг концентрацид үндэслэн сонгосон.12 хоногийн өсгөвөрлөсний дараа T3 ба Dex-ийн хослол нь кардиомиоцитын бүтцийн оновчтой бүрэн бүтэн байдал, хамгийн бага фиброзын өөрчлөлтийг бий болгосон (Нэмэлт зураг 4, 5).Нэмж дурдахад эдгээр T3 ба Dex-ийн концентрацийг хоёр дахин буюу хоёр дахин хэрэглэх нь хэвийн концентрацитай харьцуулахад хортой нөлөө үзүүлдэг (Нэмэлт зураг 6a,b).
Анхны скрининг хийсний дараа бид 4 өсгөвөрлөх нөхцөлийг толгой ба биечлэн харьцуулсан (Зураг 4a): Ctrl: бидний оновчтой болгосон орчинг ашиглан бидний өмнө тайлбарласан статик өсгөвөрт өсгөвөрлөсөн зүрхний хэсгүүд;20.21 TD: Лхагва гарагт T3 болон Ctrl s Dex нэмэгдсэн;MC: бидний өмнө нь оновчтой болгосон орчинг ашиглан CTCM-д өсгөвөрлөсөн зүрхний хэсгүүд;ба MT: Т3 ба Декс агуулсан CTCM нь дунд хэсэгт нэмэгдсэн.Тариалснаас хойш 12 хоногийн дараа MS болон MT эдүүдийн амьдрах чадвар нь MTT шинжилгээгээр үнэлэгдсэн шинэ эдүүдийнхтэй ижил хэвээр байв (Зураг 4b).Сонирхолтой нь, трансвелл өсгөвөрт (TD) T3 болон Dex-ийг нэмсэн нь Ctrl-ийн нөхцөлтэй харьцуулахад амьдрах чадварыг мэдэгдэхүйц сайжруулаагүй нь зүрхний хэсгүүдийн амьдрах чадварыг хадгалахад механик өдөөлт чухал үүрэг гүйцэтгэдэг болохыг харуулж байна.
Механик өдөөлт ба T3/Dex нэмэлт тэжээлийн орчинд 12 хоногийн турш үзүүлэх нөлөөг үнэлэхэд ашигласан дөрвөн өсгөвөрийн нөхцөлийг харуулсан туршилтын дизайны диаграмм. б Баганан график нь өсгөвөрлүүлснээс хойш 12 хоногийн дараа бүх 4 нөхцөлд (Ctrl, TD, MC, and MT) амьдрах чадварыг шинэ зүрхний зүсмэлүүд (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD болон D12 MT), 12 (D12 MC) -аас өөр өөр зүсмэлүүдтэй харьцуулж харуулав. 0.0001, ###p <0.001, D0-тэй харьцуулахад **p <0.01, D12 Ctrl). б Баганан график нь өсгөвөрлүүлснээс хойш 12 хоногийн дараа бүх 4 нөхцөлд (Ctrl, TD, MC, and MT) амьдрах чадварыг шинэ зүрхний зүсмэлүүд (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD болон D12 MT), 12 (D12 MC) -аас өөр өөр зүсмэлүүдтэй харьцуулж харуулав. 0.0001, ###p <0.001, D0-тэй харьцуулахад **p <0.01, D12 ctrl). b Гистограмма показывает количественную оценку жизнеспособности через 12 дней дараа культивирование всех 4 условиях культивирование (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = D12, D0, D12) 2 MT), 12 (D12 MC) срезов/группу нь разных свиней, проводится односторонний тест ANOVA; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнениюл с D12). б Зураасан график нь өсгөвөрлөсний дараах 12 хоногийн бүх 4 нөхцөлд (хяналт, TD, MC, MT) амьдрах чадварыг шинэ зүрхний хэсгүүдтэй (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD, болон D12 MT), 12 (D12 MC) өөр өөр хэсгүүдтэй харьцуулсан тоон үзүүлэлтийг харуулж байна. 0001, ###p < 0.001 эсрэг D0 ба **p < 0.01-ээр D12 Ctrl). b 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) (n = 18 C (D15) 、 TD12) D12 MT)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；####p < 0.0001，##0#p <0.0001，##0#p <0.0. .01 与D12控制）。b 4 12 (D12 MC) b Гистограмма, показывающая все 4 условия культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD и D12 MT), 2-р ангиллын MC2, 2-р ангиллын дагуу. оронны тест ANOVA;####p <0,0001, ###p <0,001 по сравнению с D0, **p <0,01 по сравнению с контролем D12). b Бүх 4 өсгөвөрлөх нөхцөлийг (хяналт, TD, MC болон MT) харуулсан гистограмм нь зүрхний шинэ хэсгүүдтэй (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD ба D12 MT), өөр өөр гахайн 12 (D12 MC) хэсэг/бүлэг, нэг талын ANOVA тесттэй (D0) харьцуулахад #0#p #0#0.<1<0. 0, **p<0.01 эсрэг хяналтын D12). c Өсгөвөрлөлтөөс хойш 12 хоногийн дараа бүх 4 нөхцөлд (Ctrl, TD, MC, MT) глюкозын урсгалын хэмжигдэхүүнийг шинэ зүрхний зүсмэлүүдтэй (D0) харьцуулсан баганын графикаар харуулав (n = 6 зүсмэл/бүлэг өөр өөр гахайн ANOVA тестийг нэг талын аргаар хийсэн; ###p < 0.001, D1.0-тэй харьцуулахад ***p <l.0). c Өсгөвөрлөлтөөс хойш 12 хоногийн дараа бүх 4 нөхцөлд (Ctrl, TD, MC, MT) глюкозын урсгалын хэмжигдэхүүнийг шинэ зүрхний зүсмэлүүдтэй (D0) харьцуулсан баганын графикаар харуулав (n = 6 зүсмэл/бүлэг өөр өөр гахайн ANOVA тестийг нэг талын аргаар хийсэн; ###p < 0.001, D1.0-тэй харьцуулахад ***p <l.0). c Гистограмма показывает количественную оценку потока глюкозы cherez 12 дней дараа культивирование всех 4 условиях культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 удаа) ся тест ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Гистограмм нь бүх 4 өсгөвөрлөлтийн нөхцөлд (хяналт, TD, MC болон MT) өсгөвөрлүүлснээс хойш 12 хоногийн дараа зүрхний шинэ хэсгүүдтэй (D0) харьцуулсан глюкозын урсгалын хэмжигдэхүүнийг харуулж байна (n = 6 хэсэг/өөр өөр гахайнаас авсан бүлэг, нэг талын ANOVA шинжилгээ хийсэн; D0 ба ***0-тай харьцуулахад ###p < 0.001. C1 <tr). c 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) 相毡片(D0) 相毡1０囸比弐弐囸糖通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试；###p < 0.001，与D01；，与D01，来自不trl 相比）。 C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （（ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 新鲜 心脏 新鲜 心脏 戇片 切片 切片 切片 创片养 后 后 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 猪 ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， 搧 缍 养 后 的 通量 定量 （n = 6 片/组测试；###p < 0.001，与D0 相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）。 c Гистограмма, показывающая количественную оценку потока глюкозы cherez 12 дней дараа культивирование для всех 4 условий культивирование (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = свежими срезами сердца (D0)) или проведены тесты ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 (хяналт). c Тарьсанаас хойш 12 хоногийн дараа глюкозын урсгалын хэмжигдэхүүнийг бүх 4 өсгөвөрлөлтийн нөхцөлд (хяналт, TD, MC, MT) зүрхний шинэ хэсгүүдтэй (D0) харьцуулсан гистограмм (n = 6 хэсэг/бүлэг, өөр өөр гахайн нэг талт ANOVA шинжилгээ хийсэн эсэх, ###p<0.00, ***p<1-тэй харьцуулахад D.0).d Шинэхэн (цэнхэр), 12 дахь өдрийн MC (ногоон), 12 дахь өдрийн MT (улаан) эдүүдийн омгийн шинжилгээний графикийг бүс нутгийн эдийн хэсгийн арван цэгт (n = 4 зүсмэл/бүлэг, нэг талын ANOVA тест; бүлгүүдийн хооронд мэдэгдэхүйц ялгаа байхгүй).e 10-12 хоногийн турш статик нөхцөлд (Ctrl) эсвэл MT нөхцөлд (MT) өсгөвөрлөсөн зүрхний хэсгүүдтэй харьцуулахад зүрхний шинэ хэсгүүдэд (D0) ялгаатай байдлаар илэрхийлэгдсэн генүүдийг харуулсан галт уулын график.f Өсгөвөрлөх нөхцөл бүрийн дагуу өсгөвөрлөсөн зүрхний хэсгүүдэд зориулсан саркомер генийн дулааны зураг.Алдааны мөр нь дундаж ± стандарт хазайлтыг илэрхийлнэ.
Өөх тосны хүчлийн исэлдэлтээс гликолиз руу шилжих бодисын солилцооны хамаарал нь кардиомиоцитын ялгавартай байдлын шинж тэмдэг юм.Төлөвшөөгүй кардиомиоцитууд нь ATP үйлдвэрлэхэд глюкозыг голчлон ашигладаг бөгөөд цөөхөн кристалтай гипопластик митохондритай байдаг5,32.Глюкозын ашиглалтын шинжилгээ нь MC болон MT нөхцөлд глюкозын ашиглалт нь 0 өдрийн эдүүдийнхтэй ижил байгааг харуулсан (Зураг 4c).Гэсэн хэдий ч Ctrl дээж нь шинэхэн эдтэй харьцуулахад глюкозын хэрэглээ мэдэгдэхүйц нэмэгдсэн байна.Энэ нь CTCM болон T3/Dex-ийн хослол нь эд эсийн амьдрах чадварыг сайжруулж, 12 хоногийн өсгөвөрлөсөн зүрхний хэсгүүдийн бодисын солилцооны фенотипийг хадгалж байгааг харуулж байна.Нэмж дурдахад, омгийн шинжилгээ нь MT болон MS нөхцөлд 12 хоногийн турш шинэ зүрхний эдэд омгийн түвшин ижил хэвээр байгааг харуулсан (Зураг 4d).
CTCM ба T3/Dex-ийн зүрхний зүсмэл эдийн дэлхийн транскрипцийн ландшафтад үзүүлэх ерөнхий нөлөөнд дүн шинжилгээ хийхийн тулд бид дөрвөн өөр өсгөвөрлөх нөхцөлийн бүх зүрхний зүсмэлүүд дээр RNAseq хийсэн (Нэмэлт мэдээлэл 1).Сонирхолтой нь, MT хэсгүүд нь зүрхний шинэ эд эстэй өндөр транскрипцийн ижил төстэй байдлыг харуулсан бөгөөд 13,642 генээс зөвхөн 16 нь ялгаатай байв.Гэсэн хэдий ч, бидний өмнө харуулсанчлан, Ctrl зүсмэлүүд нь өсгөвөрлөхөд 10-12 хоногийн дараа 1229 дифференциал илэрхийлэгдсэн генийг харуулсан (Зураг 4e).Эдгээр өгөгдлийг зүрх ба фибробласт генийн qRT-ПГУ-аар баталгаажуулсан (Нэмэлт зураг 7a-c).Сонирхолтой нь, Ctrl хэсгүүд нь зүрхний болон эсийн мөчлөгийн генүүдийн зохицуулалтыг бууруулж, үрэвслийн генийн хөтөлбөрүүдийг идэвхжүүлж байгааг харуулсан.Эдгээр өгөгдлүүд нь урт хугацааны өсгөвөрлөлтийн дараа ихэвчлэн тохиолддог дифференциаци нь МТ-ийн нөхцөлд бүрэн сулардаг болохыг харуулж байна (Нэмэлт Зураг 8a,b).Саркомерын генийг сайтар судалж үзэхэд зөвхөн МТ-ийн нөхцөлд саркомер (Зураг 4f) болон ионы сувгийг (Нэмэлт зураг 9) кодлодог генүүд хадгалагдаж, Ctrl, TD, MC нөхцөлд дарангуйлагдахаас хамгаалагдсан байдаг.Эдгээр өгөгдөл нь механик болон хошин өдөөлтийг (T3/Dex) хослуулан хэрэглэснээр зүрхний зүсмэлийн транскриптом нь өсгөвөрлөсний дараа 12 хоногийн дараа зүрхний шинэ зүсмэлүүдтэй төстэй хэвээр үлдэж болохыг харуулж байна.
Эдгээр транскрипцийн олдворууд нь зүрхний хэсгүүдийн кардиомиоцитуудын бүтцийн нэгдмэл байдал нь МТ-ийн нөхцөлд 12 хоногийн турш хамгийн сайн хадгалагддаг нь бүрэн бүтэн, орон нутгийн коннексин 43 (Зураг 5a) -аас харагдаж байна.Нэмж дурдахад, MT нөхцөлд зүрхний хэсгүүдийн фиброз нь Ctrl-тэй харьцуулахад мэдэгдэхүйц буурсан ба зүрхний шинэ хэсгүүдтэй төстэй (Зураг 5b).Эдгээр өгөгдлүүд нь механик өдөөлт ба T3/Dex эмчилгээний хослол нь зүрхний хэсгүүдийн зүрхний бүтцийг үр дүнтэй хадгалдаг болохыг харуулж байна.
a Тропонин-Т (ногоон), коннексин 43 (улаан), DAPI (цэнхэр)-ийн дархлааны флуоресценцийн дүрслэлийг шинэхэн тусгаарлагдсан зүрхний хэсгүүдэд (D0) эсвэл зүрхний дөрвөн хэсгийн өсгөвөрийн нөхцөлд 12 хоногийн турш өсгөвөрлөсөн (масштаб бар = 100 мкм).). Зүрхний эд эсийн бүтцийн нэгдмэл байдлыг (n = 7 (D0 ба D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC ба D12 MT) өөр өөр гахайн зүсмэлүүд/бүлэг, нэг талын ANOVA шинжилгээг хийсэн хиймэл оюун ухааны тоон үзүүлэлт; ####p < 0.000 ба D12 01-тэй харьцуулахад D <0.000.0. D12 Ctrl-тай харьцуулахад). Зүрхний эд эсийн бүтцийн нэгдмэл байдлыг (n = 7 (D0 ба D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC ба D12 MT) өөр өөр гахайн зүсмэлүүд/бүлэг, нэг талын ANOVA шинжилгээг хийсэн хиймэл оюун ухааны тоон үзүүлэлт; #### p < 0.000 ба D12 *p <0.000, эсвэл D <0.000.0. D12 Ctrl-тай харьцуулахад). Количественная оценка структурной целостности ткани сердца с помощью искусственного интеллект (n = 7 (D0 ба D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC ба D12 MT) срезов/группу нь разных свиней, провеный pNO0; #VA00, провеный pNO0; равнению с D0 и *p < 0,05 эсвэл ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). Төрөл бүрийн гахайнаас авсан хиймэл оюун ухаан (n = 7 (D0 ба D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC ба D12 MT) хэсэг/бүлэг, нэг талын ANOVA туршилтыг ашиглан зүрхний эд эсийн бүтцийн нэгдмэл байдлын тоон үзүүлэлт; #### p < 0.000 ба *p <0.000 ба *5.0-тай харьцуулбал D****0.0.0-тэй харьцуулахад. D12 Ctrl).对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC 和D12 和D12工智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 和*p < 0.05 相比，或****p < 0.005 相比，或****p < 0.0000.对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 （n = 7 （d0 和 d12 ctrl） （5 （d12 td 、 d12 mc ） 以巺智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ######### p < 0,0001 与D0 和*p < 0,05 書1****p < 0,05 書1****0.相比）.Төрөл бүрийн гахайн (n = 7 (D0 ба D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC ба D12 MT) хэсэг/бүлэг) хиймэл оюун ухаан ашиглан зүрхний эд эсийн бүтцийн нэгдмэл байдлыг нэг талын ANOVA тестээр тодорхойлох;#### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 эсвэл ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). #### p < 0.0001 D0-тэй харьцуулахад ба *p < 0.05 эсвэл ****p < 0.0001 D12 Ctrl). b Массоны трихромын будгаар будсан зүрхний зүсмэлүүдийн төлөөллийн зураг ба хэмжигдэхүүн (Хуваарийн мөр = 500 μм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, ба D12 MC), 9 (D12 MT) зүсмэл/бүлэг өөр өөр гахайн #NOVA#0-тай харьцуулсан шинжилгээг нэг аргаар хийсэн. D0 ба ***p < 0.001, эсвэл D12 Ctrl-тай харьцуулахад ****p < 0.0001). b Массоны трихромын будгаар будсан зүрхний зүсмэлүүдийн төлөөллийн зураг ба хэмжигдэхүүн (Хуваарийн мөр = 500 μм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, ба D12 MC), 9 (D12 MT) зүсмэл/бүлэг өөр өөр гахайн #NOVA#0-тай харьцуулсан шинжилгээг нэг аргаар хийсэн. D0 ба ***p < 0.001, эсвэл D12 Ctrl-тай харьцуулахад ****p < 0.0001). b Репрезентативные изображения ба количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массона (масштабная линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MT razpu2), 9 (сүпню MC) ется односторонний тест ANOVA; ####p < 0,0001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 эсвэл ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b Массоны трихромын будгаар будсан зүрхний хэсгүүдийн төлөөллийн зураг ба тоон үзүүлэлт (хэмжээний бар = 500 μм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD ба D12 MC), өөр өөр гахайн 9 (D12 MT) хэсэг/бүлэг, нэг талын ANOVA болон гүйцэтгэсэн ##00. <p>**##0. 001 эсвэл ****p < 0.0001 эсрэг D12 Ctrl). b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺= 500 μm）1！D1D1D）1！lD1D和D12 MC），来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方差分析；##0#0**D 0.#0**p p < 0.001，或****p <0.0001 与D12 Ctrl 相比）。 b 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 （比例 尺 尺 尺 = 500 （（0d（dn（dn l 、 d12 td 和 d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切爇 切燉切爇切切 切 切 切 切 切 切 切則 切爇則 切爇則 切爇則 切爇則 切爇則 切爇則 切爇則 切爇則 切爇 切燉片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片/组，进行单因素方差分析#0.0#（0.0. ***p < 0.001，或****p <0.0001 与D12 Ctrl 相比）。 б Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромом Массона (масштабная линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD ба D12 MC), 9 (D12 MT-ийн срезовын групп) ; ####p < 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 эсвэл ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b Массоны трихромоор будсан зүрхний хэсгүүдийн төлөөлөл болон тоон үзүүлэлтүүд (массоны бар = 500 μм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD ба D12 MC), өөр өөр гахай/бүлгээс авсан 9 (D12 MT) хэсэг, нэг ANOVA арга; #0#0, харьцуулсан; #0#0. <#0#0. ****p < 0.0001 D12 Ctrl).Алдааны мөр нь дундаж ± стандарт хазайлтыг илэрхийлнэ.
Эцэст нь CTCM-ийн зүрхний гипертрофиг дуурайх чадварыг зүрхний эдийн суналтыг нэмэгдүүлэх замаар үнэлэв.CTCM-д агаарын камерын оргил даралт 80 ммМУБ-аас 80 ммМУБ болж нэмэгдсэн.Урлаг.(хэвийн суналт) 140 ммМУБ хүртэл Урлаг.(Зураг 6а).Энэ нь суналтын 32%-иар нэмэгдсэнтэй тохирч байна (Зураг 6б), үүнийг өмнө нь гипертрофид ажиглагдсан саркомерын урттай ижил урттай болохын тулд зүрхний хэсгүүдэд шаардлагатай харгалзах хувийн сунгалт гэж үзүүлсэн.Зургаан өдрийн өсгөвөрлөх явцад зүрхний эд эсийн агшилт, тайвшралын суналт, хурд тогтмол хэвээр байв (Зураг 6c).Зургаан өдрийн турш МТ-ийн нөхцлөөс үүссэн зүрхний эдийг хэвийн сунгах (MT (Хэвийн)) эсвэл хэт сунгах (MT (OS)) нөхцөлд байлгасан.Өсгөвөрлөлтөнд дөрвөн өдрийн дараа аль хэдийн гипертрофик биомаркер NT-ProBNP нь MT (хэвийн) нөхцөлтэй харьцуулахад MT (OS) нөхцөлд орчинд мэдэгдэхүйц нэмэгдсэн байна (Зураг 7a).Үүнээс гадна, өсгөвөрлөлтийн зургаан өдрийн дараа MT (OS) дахь эсийн хэмжээ (Зураг 7б) зүрхний МТ-ийн хэсгүүдтэй харьцуулахад мэдэгдэхүйц нэмэгдсэн (хэвийн).Нэмж дурдахад, хэт сунасан эдэд NFATC4-ийн цөмийн шилжүүлэлт мэдэгдэхүйц нэмэгдсэн (Зураг 7c).Эдгээр үр дүн нь гипертензийн дараах эмгэг өөрчлөлтийн дэвшилтэт хөгжлийг харуулж байгаа бөгөөд CTCM төхөөрөмжийг сунгалтаас үүдэлтэй зүрхний гипертрофи дохиололыг судлах платформ болгон ашиглаж болно гэсэн үзэл баримтлалыг дэмжиж байна.
Агаарын камерын даралт, шингэний тасалгааны даралт, эд эсийн хөдөлгөөний хэмжилтийн төлөөллийн ул мөр нь тасалгааны даралт нь шингэний тасалгааны даралтыг өөрчилдөг бөгөөд энэ нь эдийн зүсмэлийн харгалзах хөдөлгөөнийг үүсгэдэг.b Ердийн сунасан (улбар шар) болон хэт сунасан (цэнхэр) эдүүдийн хэсгийн сунгалтын хувь ба сунгах хурдны муруй.c Циклийн цаг (n = 19 зүсмэл, өөр өөр гахайнуудаас), агшилтын хугацаа (n = 18-19 зүсмэл бүлэг, өөр өөр гахайн), амрах хугацаа (n = 19 зүсмэл бүлэг, өөр өөр гахайн) ), эдийн хөдөлгөөний далайц (n = 14, өөр өөр гахайнаас) зүсмэлүүд/бүлэг, өөр өөр гахайнуудаас) болон оргил сулрах хурд (n = 14 (D0), 15 (D6) ) хэсэг/бүлэг) өөр өөр гахайн), хоёр сүүлт Студентийн t-тест нь ямар ч параметрийн хувьд мэдэгдэхүйц ялгаагүй байсан нь эдгээр үзүүлэлтүүд нь хэт хүчдэлтэй өсгөвөрлөх 6 өдрийн турш тогтмол хэвээр байгааг харуулж байна.Алдааны мөр нь дундаж ± стандарт хазайлтыг илэрхийлнэ.
a MT хэвийн сунгах (Норм) эсвэл хэт сунах (OS) нөхцөлд (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, болон D4 MTOS) зүсмэлүүд/бүлэгүүдээр өсгөвөрлөсөн зүрхний зүсмэлүүдээс авсан өсгөвөрлөгч дэх NT-ProBNP концентрацийг баганан графикаар хэмжсэн нь хэвийн ANO01-аас ялгаатай байна. tch). a MT хэвийн суналт (Норм) эсвэл хэт сунах (OS) нөхцөлд (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, болон D4 MTOS) зүсмэлүүд/бүлэгт өсгөвөрлөсөн зүрхний зүсмэлүүдээс авсан өсгөвөрлөгч дэх NT-ProBNP концентрацийг баганан графикаар хэмжсэн нь хэвийн A2-0g-аас ялгаатай байна. сунгах).Хэвийн MT суналт (норма) эсвэл хэт суналт (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, ба D4).MTOS) нөхцөлд өсгөвөрлөсөн зүрхний зүсмэлүүдээс өсгөвөрлөх орчин дахь NT-ProBNP концентрацийн тоон гистограмм, өөр өөр пигктороос хийсэн хоёр вааранцийн шинжилгээ;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p <0.01 хэвийн сунгалттай харьцуулахад). a 在MT 正常拉伸(Норм) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP 4 (D2 MTNorm)、3（D2 MTOS、D4 MTNorm 和D4 MTOS）来自不同猪的切片/组，进行双向方差（伛游**比，p <0.01）。 a MT хэвийн сунгах (Норм) эсвэл хэт сунах (OS) нөхцөлд өсгөвөрлөсөн зүрхний зүсмэлүүд дэх NT-ProBNP концентрацийн тоон үзүүлэлт (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, D4 MTOS) өөр өөр 猪的切化取化化匪猪的切）/发发动; **хэвийн суналттай харьцуулахад, p <0.01).гистограмм Хэвийн MT сунгалт (норм) эсвэл хэт суналт (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) ба D4 MTOS) нөхцөлд өсгөвөрлөсөн зүрхний зүсмэлүүд дэх NT-ProBNP концентрацийн тоон үзүүлэлт, янз бүрийн гахайнаас авсан зүсмэлүүд/бүлэг, хоёр талын зөрүүний шинжилгээ;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p <0.01 хэвийн сунгалттай харьцуулахад). b Тропонин-T ба WGA (зүүн) болон эсийн хэмжээг тодорхойлох (баруун)-аар будсан зүрхний зүсмэлүүдийн төлөөллийн зураг (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) эс/бүлэг өөр өөр гахайн 10 өөр зүсмэлээс авсан, Хоёр сүүлт Оюутны t-тестийг хэвийн харьцуулсан ****p ****p <01; харьцуулсан). b Тропонин-T ба WGA (зүүн талд) болон эсийн хэмжээг тодорхойлох (баруун)-аар будсан зүрхний зүсмэлүүдийн төлөөллийн зураг (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) эсүүд/бүлэг өөр өөр гахайн 10 өөр зүсмэлүүд, Хоёр сүүлт Оюутны t-stretch-ийг хэвийн хэмжээнд харьцуулсан; ****p01). b Reprezentativnıe изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) болон количественного определения размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) 10-аас дээш тооны срезовын клеток/групп, ится хвостовой t-критерий Стьюдента;****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b Тропонин-T ба AZP (зүүн талд) болон эсийн хэмжээг тодорхойлох (баруун) (н = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) эсүүд/бүлэг өөр өөр гахайн 10 өөр хэсгээс авсан хоёр сүүлт Студентийн t-тестийг хэвийн ****00-тай харьцуулсан) зүрхний хэсгүүдийн төлөөллийн зураг (зүүн) ; b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的心脏切片的代脏切片的代表切片的代表开式弗），来自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾渍同猪的10 个不同切片的369），来自不同猪的10比，****p <0.0001）。 b Калкарейн-T ба WGA-аар будсан зүрхний зүсмэлүүдийн дүрслэл (зүүн) болон эсийн хэмжээ (баруун) (n = 330 (D6 MTOS), 10 өөр зүсмэлээс 369 (D6 MTNorm)) Cells/组，两方唰t，两方泾par test ，****p <0.0001). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) ба количественная оценка размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) 10-аас дээш тооны срезовын, е шалгуур Стьюдента;****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b Тропонин-T ба AZP-ээр будсан зүрхний хэсгүүдийн төлөөлөл (зүүн) болон эсийн хэмжээг тодорхойлох (баруун) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) өөр өөр гахайн 10 өөр хэсгээс авсан) Эс/бүлэг, хоёр сүүлт шалгуур Оюутны;****p < 0.0001 хэвийн ачаалалтай харьцуулахад). c Тропонин-Т ба NFATC4-ийн дархлааны тэмдэглэгээ бүхий MTOS зүрхний зүсмэлүүдийн 0 ба 6 дахь өдрийн төлөөллийн зургууд ба NFATC4-ийн CM-ийн цөмд шилжүүлэн суулгах хэмжээг тодорхойлох (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) зүсмэлүүд/бүлэг өөр өөр гахайнаас авсан, Хоёр сүүлт Оюутны хийсэн *t<p0;). c Тропонин-Т ба NFATC4-ийн дархлааны тэмдэглэгээ бүхий MTOS зүрхний зүсмэлүүдийн 0 ба 6 дахь өдрийн төлөөллийн зургууд ба NFATC4-ийг CM-ийн цөмд шилжүүлэн байршуулах хэмжээг тодорхойлох (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) зүсмэлүүд/бүлэг өөр өөр гахайн , Хоёр сүүлт Оюутны гүйцэтгэсэн ;-p0). в Срезов сердца 0 ба 6 дней MTOS, тропонина-Т ба NFATC4-ийн иммуномеченых, мөн NFATC4-ийн ядаргаа кавернозных клеток (n = 4 (D0), 3 (n = 4 (D0), MT ) , 3 (D0) -д шилжүүлэн суулгасан иммуномеченых. няетя двусторонний t-критерий Стьюдента; *p < 0,05). c Тропонин-Т ба NFATC4-ийн дархлааны тэмдэглэгээтэй MTOS-ийн 0 ба 6 хоногийн зүрхний хэсгүүдийн төлөөлөл, агуйн эсийн цөм дэх NFATC4 шилжилтийн хэмжээг тодорхойлох (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) зүсмэлүүд / өөр өөр гахайн бүлэг) Оюутны хоёр сүүлт туршилтыг хийсэн;*p <0.05). c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS 心脏切片的代表性的代表性的代表性囍囍囍囍图囍图囍图图图图图图图图图图国的NFATC4 易位至CM 细胞核的量化（n = 4 (D0)、3 (D6 MTOS) 切片/组, 进行双尾学锟t ＀05) 检*p. c Өөр өөр NFATC4 易位至CM эсийн цөмөөс 第0天和第6天MTOS зүрхний зүсмэлүүд болон NFATC4-ийн калканин-T ба NFATC4 дархлааны тэмдэглэгээний төлөөлөл зураг.双尾学生et 电影；*p < 0.05). в Репрезентативные изображения срезов сердца MTOS на 0 ба 6 день нь иммуномаркировки тропонином-Т болон NFATC4 болон количественная оценка транслокации NFATC4 болон ядра CM нь янз бүрийн свиней (n = 4 (D0), 3 (D6/MTOS), 3 (D6/MTOS) ьюдента; *p < 0,05). c 0 ба 6 дахь өдрийн MTOS зүрхний зүсмэлүүдийн тропонин-Т ба NFATC4 дархлааны тэмдэглэгээ болон өөр өөр гахайн CM-ийн цөм дэх NFATC4 шилжилтийн хэмжээг тодорхойлох дүрслэл (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) зүсмэлүүд/бүлэг, хоёр сүүлт Оюутны *0.c.s).Алдааны мөр нь дундаж ± стандарт хазайлтыг илэрхийлнэ.
Орчуулгын зүрх судасны судалгаа нь зүрхний орчныг үнэн зөв хуулбарлах эсийн загваруудыг шаарддаг.Энэхүү судалгаагаар зүрхний хэт нимгэн хэсгүүдийг өдөөж болох CTCM төхөөрөмжийг бүтээж, тодорхойлсон.CTCM систем нь физиологийн синхрончлогдсон цахилгаан механик өдөөлт, T3 болон Dex шингэний баяжуулалтыг агуулдаг.Гахайн зүрхний хэсгүүд эдгээр хүчин зүйлд өртөхөд тэдгээрийн амьдрах чадвар, бүтцийн нэгдмэл байдал, бодисын солилцооны үйл ажиллагаа, транскрипцийн илэрхийлэл нь 12 хоногийн өсгөвөрлөсний дараа зүрхний шинэ эдэд байсантай ижил хэвээр байв.Үүнээс гадна зүрхний эдийг хэт их сунгах нь зүрхний гипертрофи үүсгэдэг.Ерөнхийдөө эдгээр үр дүн нь зүрхний хэвийн фенотипийг хадгалахад физиологийн соёлын нөхцлийн чухал үүргийг дэмжиж, эмийн скрининг хийх платформыг бүрдүүлдэг.
Кардиомиоцитын үйл ажиллагаа, амьд үлдэх оновчтой орчинг бүрдүүлэхэд олон хүчин зүйл нөлөөлдөг.Эдгээр хүчин зүйлсийн хамгийн тодорхой нь (1) эс хоорондын харилцан үйлчлэл, (2) цахилгаан механик өдөөлт, (3) хошин хүчин зүйл, (4) бодисын солилцооны субстратуудтай холбоотой байдаг.Физиологийн эс хоорондын харилцан үйлчлэл нь эсийн гаднах матрицаар дэмжигдсэн олон төрлийн эсийн цогц гурван хэмжээст сүлжээг шаарддаг.Ийм нарийн төвөгтэй эсийн харилцан үйлчлэлийг бие даасан эсийн төрлүүдийг хамт өсгөвөрлөх замаар in vitro сэргээхэд хэцүү байдаг ч зүрхний хэсгүүдийн органотип шинж чанарыг ашиглан хялбархан хүрч болно.
Кардиомиоцитуудын механик суналт, цахилгаан өдөөлт нь зүрхний фенотипийг хадгалахад чухал үүрэгтэй33,34,35.Механик өдөөлтийг hiPSC-CM-ийн төлөвшүүлэх, төлөвшүүлэхэд өргөн ашигладаг байсан ч саяхан хэд хэдэн гоёмсог судалгаагаар нэг тэнхлэгт ачааллыг ашиглан өсгөвөрт зүрхний зүсмэлүүдийг механик өдөөх оролдлого хийсэн.Эдгээр судалгаагаар 2 хэмжээст нэг тэнхлэгт механик ачаалал нь өсгөвөрлөх явцад зүрхний фенотипэд эерэг нөлөө үзүүлдэг болохыг харуулж байна.Эдгээр судалгаанд зүрхний хэсгүүд нь изометрийн суналтын хүчээр17, шугаман ауксотоник ачаалалаар18 ачаалагдсан эсвэл зүрхний эргэлтийг хүч хувиргагчийн санал хүсэлт болон хурцадмал хөтчүүдийг ашиглан дахин бүтээсэн.Гэсэн хэдий ч эдгээр аргууд нь хүрээлэн буй орчны оновчлолгүйгээр эд эсийн нэг тэнхлэгт сунах аргыг ашигладаг бөгөөд энэ нь зүрхний олон генийг дарангуйлах эсвэл хэвийн бус сунгалтын хариу урвалтай холбоотой генийг хэт ихээр илэрхийлэхэд хүргэдэг.Энд тайлбарласан CTCM нь мөчлөгийн хугацаа болон физиологийн суналтын хувьд (25% сунгалт, 40% систолын, 60% диастолын, минутанд 72 цохилт) зүрхний байгалийн мөчлөгийг дуурайдаг 3D цахилгаан механик өдөөлтийг өгдөг.Хэдийгээр энэ гурван хэмжээст механик өдөөлт нь дангаараа эд эсийн бүрэн бүтэн байдлыг хангахад хангалтгүй ч эд эсийн амьдрах чадвар, үйл ажиллагаа, бүрэн бүтэн байдлыг хангахын тулд T3/Dex ашиглан хошин болон механик өдөөлтийг хослуулах шаардлагатай.
Насанд хүрэгчдийн зүрхний фенотипийг өөрчлөхөд хошин хүчин зүйл чухал үүрэг гүйцэтгэдэг.Үүнийг эсийн боловсорч гүйцэх явцыг хурдасгахын тулд өсгөвөрлөх хэрэгсэлд T3 ба Dex нэмсэн HiPS-CM судалгаанд онцолсон.T3 нь амин хүчил, элсэн чихэр, кальцийг эсийн мембранаар дамжихад нөлөөлж болно36.Нэмж дурдахад T3 нь MHC-α илэрхийлэл болон MHC-β-ийн бууралтын зохицуулалтыг дэмжиж, ургийн CM-ийн удаан таталттай миофибриллуудтай харьцуулахад боловсорч гүйцсэн кардиомиоцитуудад хурдан таталттай миофибрилүүдийн үүсэхийг дэмждэг.Гипотиреодтой өвчтөнүүдэд T3-ийн дутагдал нь миофибрилляр туузыг алдаж, аяыг хөгжүүлэх хурдыг бууруулдаг37.Декс нь глюкокортикоид рецепторуудад үйлчилдэг бөгөөд тусгаарлагдсан зүрхэнд миокардийн агшилтыг нэмэгдүүлдэг;38 Энэхүү сайжруулалт нь кальцийн ордод тулгуурласан орц (SOCE) 39,40-д үзүүлэх нөлөөтэй холбоотой гэж үзэж байна.Нэмж дурдахад Декс нь рецептортой холбогдож, дархлааны үйл ажиллагаа, үрэвслийг дарангуйлдаг эсийн доторх өргөн хариу урвал үүсгэдэг30.
Бидний үр дүнгээс харахад физик механик өдөөлт (MS) нь Ctrl-тэй харьцуулахад соёлын ерөнхий гүйцэтгэлийг сайжруулсан боловч өсгөвөрлөхөд 12 хоногийн турш амьдрах чадвар, бүтцийн бүрэн бүтэн байдал, зүрхний илэрхийлэлийг хадгалж чадаагүй байна.Ctrl-тэй харьцуулахад CTCM (MT) өсгөвөрт T3 болон Dex-ийг нэмснээр амьдрах чадварыг сайжруулж, ижил төстэй транскрипцийн профайл, бүтцийн нэгдмэл байдал, бодисын солилцооны үйл ажиллагааг шинэхэн зүрхний эдэд 12 хоногийн турш хадгалсан.Нэмж дурдахад, эд эсийн суналтын түвшинг хянах замаар STCM системийн олон талт байдлыг харуулсан STCM ашиглан зүрхний гипертрофийн загварыг бий болгосон.Зүрхний өөрчлөлт ба фиброз нь ихэвчлэн цусны эргэлтийн эсүүд нь зохих цитокин, фагоцитоз болон бусад өөрчлөлтийн хүчин зүйлсийг хангаж чаддаг бүрэн бүтэн эрхтнүүдийг хамардаг ч зүрхний хэсгүүд нь стресс, гэмтлийн хариуд фиброзын процессыг дуурайж чаддаг гэдгийг тэмдэглэх нь зүйтэй.миофибробласт руу ордог.Үүнийг зүрхний зүсмэлийн загварт өмнө нь үнэлж үзсэн.Тахикарди, брадикарди, механик цусны эргэлтийг дэмжих (механик ачаалалгүй зүрх) гэх мэт олон нөхцөлийг дуурайхын тулд CTCM параметрүүдийг даралт/цахилгаан далайц, давтамжийг өөрчлөх замаар модуляцлах боломжтой гэдгийг тэмдэглэх нь зүйтэй.Энэ нь системийг эмийн туршилтын дундаж хүчин чадалтай болгодог.CTCM-ийн хэт ачааллаас үүдэлтэй зүрхний гипертрофиг загварчлах чадвар нь энэ системийг хувийн эмчилгээнд туршиж үзэх боломжийг олгодог.Дүгнэж хэлэхэд зүрхний эд эсийн соёлыг хадгалахад механик суналт ба хошин өдөөлт маш чухал болохыг энэхүү судалгаа харуулж байна.
Хэдийгээр энд үзүүлсэн өгөгдөл нь CTCM нь бүрэн бүтэн миокардийг загварчлахад маш ирээдүйтэй платформ гэдгийг харуулж байгаа боловч энэ өсгөвөрлөх арга нь зарим хязгаарлалттай байдаг.CTCM өсгөвөрийн гол хязгаарлалт нь зүсмэлүүд дээр тасралтгүй динамик механик ачаалал өгдөг бөгөөд энэ нь мөчлөг бүрийн үед зүрхний зүсмэлийн агшилтыг идэвхтэй хянах боломжийг үгүйсгэдэг.Нэмж дурдахад зүрхний хэсгүүд (7 мм) жижиг хэмжээтэй тул уламжлалт хүчний мэдрэгч ашиглан өсгөвөрлөх системээс гадуур систолын үйл ажиллагааг үнэлэх боломж хязгаарлагдмал байдаг.Одоогийн гар бичмэлд бид оптик хүчдэлийг агшилтын функцын үзүүлэлт болгон үнэлснээр энэ хязгаарлалтыг хэсэгчлэн даван туулсан.Гэсэн хэдий ч энэхүү хязгаарлалт нь цаашид ажиллах шаардлагатай бөгөөд ирээдүйд кальцийн болон хүчдэлд мэдрэмтгий будагч бодис ашиглан оптик зураглал хийх гэх мэт соёлын зүрхний зүсмэлүүдийн үйл ажиллагааг оптик хянах аргуудыг нэвтрүүлэх замаар шийдвэрлэх боломжтой.CTCM-ийн өөр нэг хязгаарлалт нь ажлын загвар нь физиологийн стрессийг (урьдчилан ачаалал ба дараах ачаалал) зохицуулдаггүй явдал юм.CTCM-д маш том эдэд диастолын (бүрэн суналт) болон систолын (цахилгаан өдөөлтийн үеийн агшилтын урт) физиологийн суналтын 25% -ийг нөхөн сэргээхийн тулд эсрэг чиглэлд даралтыг өдөөдөг.Ирээдүйн CTCM загварт энэ хязгаарлалтыг зүрхний эдэд хоёр талаас нь хангалттай шахаж, зүрхний камерт үүсдэг даралт-эзэлхүүний яг хамаарлыг ашиглан арилгах хэрэгтэй.
Энэхүү гар бичмэлд дурьдсан хэт суналтаас үүдэлтэй дахин загварчлал нь зөвхөн гипертрофик хэт суналтын дохиог дууриах замаар хязгаарлагддаг.Тиймээс энэ загвар нь хошин болон мэдрэлийн хүчин зүйлгүйгээр (энэ системд байдаггүй) сунгалтаас үүдэлтэй гипертрофик дохиололыг судлахад тусалж чадна.CTCM-ийн олон талт байдлыг нэмэгдүүлэхийн тулд нэмэлт судалгаа хийх шаардлагатай, тухайлбал, дархлааны эсүүдтэй хамт өсгөвөрлөх, цусны сийвэнгийн хомораль хүчин зүйлсийг эргэлдүүлэх, мэдрэлийн эсүүдтэй хамт өсгөвөрлөх үед иннервация хийх нь CTCM-тэй өвчний загварчлалын боломжийг сайжруулах болно.
Энэхүү судалгаанд 13 гахайг ашигласан.Амьтны бүх процедурыг байгууллагын удирдамжийн дагуу гүйцэтгэсэн бөгөөд Луисвиллийн их сургуулийн амьтдыг арчлах, ашиглах хорооноос баталсан.Аортын нумыг хавчуулж, зүрхэнд 1 л ариутгасан кардиоплеги (110 мМ NaCl, 1.2 мм CaCl2, 16 мМ KCl, 16 мМ MgCl2, 10 мМ NaHCO3, 5 U/мл гепарин, pH4 хүртэл 7.7 хүртэл); Зүрхийг ихэвчлэн 10 минутаас бага мөсөн дээр лабораторид хүргэх хүртэл мөс шиг хүйтэн кардиоплегийн уусмалд хадгалсан. Зүрхийг ихэвчлэн 10 минутаас бага мөсөн дээр лабораторид хүргэх хүртэл мөс шиг хүйтэн кардиоплегийн уусмалд хадгалсан. сердца хранили в ледяном кардиоплегическом расстворе до транспортировки в лабораторию на льду, что обычно занимает <10 мин. зүрхийг мөсөн дээр лабораторид хүргэх хүртэл мөс шиг хүйтэн кардиоплегийн уусмалд хадгалсан бөгөөд энэ нь ихэвчлэн <10 минут болдог.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10刂钟将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10刂钟 Держите сердца в ледяной кардиоплегии до транспортировки в лабораторию на льду, обычно <10 мин. Зүрхийг мөсөн дээр лабораторид хүргэх хүртэл, ихэвчлэн <10 минут байлгана.
CTCM төхөөрөмжийг SolidWorks компьютерийн тусламжтай дизайн (CAD) программд боловсруулсан.Соёлын танхим, хуваагч, агаарын камер нь CNC тунгалаг нийлэг хуванцараар хийгдсэн.7 мм-ийн диаметртэй нөөц цагираг нь төв хэсэгт өндөр нягтралтай полиэтилен (HDPE) материалаар хийгдсэн бөгөөд доор нь зөөвөрлөгчийг битүүмжлэхэд ашигладаг силикон o-цагирагыг байрлуулах зориулалттай o-цагирагны ховилтой.Нимгэн цахиурын мембран нь өсгөвөрлөх тасалгааг тусгаарлах хавтангаас тусгаарладаг.Силикон мембран нь 0.02 ″ зузаантай силикон хуудаснаас лазераар зүсэгдсэн бөгөөд 35А хатуулагтай.Доод болон дээд силикон жийргэвч нь 1/16 инчийн зузаантай силикон хуудаснаас лазераар зүсэгдсэн бөгөөд 50А хатуулагтай.316L зэвэрдэггүй ган шураг болон далавчтай самар нь блокыг бэхлэх, агааргүй битүүмжлэлийг бий болгоход ашиглагддаг.
Зориулалтын хэвлэмэл хэлхээний самбар (ПХБ) нь C-PACE-EM системтэй нэгтгэгдэх зориулалттай.ПХБ дээрх швейцарийн машины холбогч залгуурууд нь графит электродуудтай мөнгөн бүрсэн зэс утас, хүрэл 0-60 эрэг шургаар электродуудад шургуулагдсан байдаг.Хэвлэмэл хэлхээний самбарыг 3D принтерийн нүүрэнд байрлуулсан байна.
CTCM төхөөрөмжийг програмчлагдсан пневматик идэвхжүүлэгч (PPD) удирддаг бөгөөд энэ нь зүрхний мөчлөгтэй төстэй цусны эргэлтийн хяналттай даралтыг бий болгодог.Агаарын камерын доторх даралт ихсэх тусам уян хатан силикон мембран дээшээ өргөжиж, эд эсийн доорх орчинг шахдаг.Дараа нь эд эсийн хэсэг нь шингэнийг гадагшлуулах замаар сунгаж, диастолын үед зүрхний физиологийн тэлэлтийг дуурайна.Тайвшрах оргил үед графит электродоор дамжуулан цахилгаан өдөөлтийг ашигласан бөгөөд энэ нь агаарын камер дахь даралтыг бууруулж, эд эсийн агшилтыг үүсгэсэн.Хоолойн дотор агаарын систем дэх даралтыг илрүүлэх даралт мэдрэгч бүхий цус тогтоогч хавхлага байдаг.Даралт мэдрэгчээр мэдрэгдсэн даралтыг зөөврийн компьютерт холбогдсон өгөгдөл цуглуулагч руу хийнэ.Энэ нь хийн камерын доторх даралтыг тасралтгүй хянах боломжийг олгодог.Тасалгааны хамгийн их даралтад (стандарт 80 ммМУБ, OS 140 ммМУБ) хүрэхэд өгөгдөл цуглуулах төхөөрөмжид C-PACE-EM систем рүү дохио илгээж, 2 мс-ийн турш хоёр фазын хүчдэлийн дохиог 4 В-д тохируулсан.
Зүрхний хэсгүүдийг авч, 6 цооног дахь өсгөвөрлөх нөхцөлийг дараах байдлаар гүйцэтгэв: Цутгасан зүрхийг шилжүүлэн суулгах савнаас хүйтэн (4 ° C) кардиоплеги агуулсан тавиур руу шилжүүлнэ.Зүүн ховдолыг ариутгасан ирээр тусгаарлаж, 1-2 см3 хэмжээтэй хэсэг болгон хуваасан.Эдгээр эдийн блокуудыг эдийн наалдамхай бодисоор эдийн тулгуур дээр нааж, Тиродын уусмал агуулсан чичиргээт микротомын эдийн ваннд байрлуулж, тасралтгүй хүчилтөрөгчөөр хангадаг (3 г/л 2,3-бутандион монооксим (BDM), 140 мМ NaCl (8.18 г)), (6 mM4.18g), (6 mM4.8g), 6 гр), 10 мМ HEPES (2.38 гр), 1 мМ MgCl2 (1 мл 1 М уусмал), 1.8 мм CaCl2 (1.8 мл 1 М уусмал), 1 л ddH2O хүртэл).Чичиргээт микротом нь 80 Гц давтамжтай, 2 мм-ийн хэвтээ чичиргээний далайцтай, 0.03 мм/с хурдтай 300 мкм зузаантай зүсмэлүүдийг огтлохоор тохируулсан.Уусмалыг сэрүүн байлгахын тулд эд эсийн банныг мөсөөр хүрээлж, температурыг 4 ° C-д байлгана.Нэг өсгөвөрлөх хавтанд хүрэлцэхүйц хэсгийг авах хүртэл эд хэсгүүдийг микротомын баннаас мөсөн дээр тасралтгүй хүчилтөрөгчтэй Тиродын уусмал агуулсан инкубацийн ваннд шилжүүлнэ.Трансвелл өсгөвөрлөхийн тулд эд эсийн хэсгүүдийг ариутгасан 6 мм өргөн полиуретан тулгуурт холбож, 6 мл оновчтой орчинд (199 орчин, 1x ITS нэмэлт, 10% FBS, 5 нг/мл VEGF, 10 нг/мл FGF-шүлтлэг ба 2X антибиотик-мөөгөнцөр) байрлуулсан.C-Pace-ээр дамжуулан эд эсийн хэсгүүдэд цахилгаан өдөөлтийг (10 В, давтамж 1.2 Гц) хэрэглэсэн.TD нөхцлийн хувьд шинэ T3 болон Dex-ийг 100 нМ ба 1 μM-ийн дундаж өөрчлөлт бүрт нэмсэн.Өдөрт 3 удаа орлуулахын өмнө орчин нь хүчилтөрөгчөөр ханасан байна.Эдийн хэсгүүдийг 37 ° C, 5% CO2-ийн инкубаторт өсгөвөрлөв.
CTCM өсгөвөрийн хувьд эд эсийн хэсгүүдийг өөрчилсөн Tyrode-ийн уусмал агуулсан Петрийн аяганд захиалгаар хийсэн 3D принтер дээр байрлуулсан.Энэхүү төхөөрөмж нь зүрхний зүсмэлийн хэмжээг тулгуур цагирагийн талбайн 25% -иар нэмэгдүүлэх зорилготой юм.Энэ нь Тиродын уусмалаас дунд болон диастолын үед шилжсэний дараа зүрхний хэсгүүд сунадаггүй.Гистоакрил цавуу ашиглан 300 мкм зузаантай хэсгүүдийг 7 мм диаметртэй тулгуур цагираг дээр бэхэлсэн.Эдийн хэсгүүдийг тулгуур цагирагт холбосны дараа эд эсийн илүүдэл хэсгүүдийг таслан авч, нэг төхөөрөмжид хангалттай хэсгүүдийг бэлдэж дуустал мөсөн дээр (4 ° C) Tyrode уусмалын ваннд хавсаргасан эдийн хэсгүүдийг хийнэ.Бүх төхөөрөмжийг боловсруулах нийт хугацаа 2 цагаас хэтрэхгүй байх ёстой.6 эд эсийн хэсгийг тулгуур цагиргуудад бэхлэсний дараа CTCM төхөөрөмжийг угсарсан.CTCM өсгөвөрлөх камерыг 21 мл-ийн хүчилтөрөгчөөр баяжуулсан орчинд урьдчилан дүүргэсэн байна.Эдийн хэсгүүдийг өсгөвөрлөх камерт шилжүүлж, агаарын бөмбөлгийг пипеткээр болгоомжтой арилгана.Дараа нь эд эсийн хэсгийг нүх рүү чиглүүлж, зөөлөн дарж байрлуулна.Эцэст нь электродын тагийг төхөөрөмж дээр байрлуулж, төхөөрөмжийг инкубаторт шилжүүлнэ.Дараа нь CTCM-ийг агаарын хоолой болон C-PACE-EM системд холбоно.Пневматик идэвхжүүлэгч нээгдэж, агаарын хавхлага нь CTCM-ийг нээдэг.C-PACE-EM системийг хоёр фазын хэмжилтийн үед 1.2 Гц-д 4 В-ыг 2 мс-ээр дамжуулахаар тохируулсан.Электродууд дээр бал чулуу хуримтлагдахаас зайлсхийхийн тулд өдөрт хоёр удаа тэжээлийг сольж, өдөрт нэг удаа электродыг сольсон.Шаардлагатай бол эд эсийн хэсгүүдийг өсгөвөрлөх нүхнээс нь авч, тэдгээрийн доор унасан агаарын бөмбөлгийг гадагшлуулж болно.MT эмчилгээний нөхцөлд T3/Dex-ийг 100 нМ T3 ба 1 μM Dex-тэй дундаж өөрчлөлт бүрт шинээр нэмсэн.CTCM төхөөрөмжийг инкубаторт 37°С, 5% CO2-т өсгөвөрлөв.
Зүрхний зүсмэлүүдийн сунгасан траекторийг олж авахын тулд тусгай камерын системийг боловсруулсан.SLR камерыг (Canon Rebel T7i, Canon, Токио, Япон) Navitar Zoom 7000 18-108мм макро линзтэй (Navitar, Сан Франциско, CA) ашигласан.Дүрслэлийг орчинг шинэ тэжээлээр сольсны дараа өрөөний температурт гүйцэтгэсэн.Камерыг 51 ° өнцгөөр байрлуулсан бөгөөд секундэд 30 фрэймийн хурдтайгаар видео бичлэг хийдэг.Эхлээд нээлттэй эхийн программ хангамжийг (MUSCLEMOTION43) Image-J-тэй хамт зүрхний зүсмэлүүдийн хөдөлгөөнийг хэмжихэд ашигласан.Энэхүү маскыг MATLAB (MathWorks, Natick, MA, АНУ) ашиглан дуу чимээ гаргахгүйн тулд зүрхний зүсмэлүүдийг цохих сонирхолтой бүс нутгийг тодорхойлох зорилгоор бүтээжээ.Гараар сегментчилсэн маскуудыг бүх зураг дээр фрэймийн дарааллаар хэрэглэж, дараа нь MUSCLEMOTION залгаас руу дамжуулдаг.Булчингийн хөдөлгөөн нь жишиг хүрээтэй харьцуулахад түүний хөдөлгөөнийг тооцоолохын тулд хүрээ тус бүрийн пикселийн дундаж эрчмийг ашигладаг.Мэдээллийг бүртгэж, шүүж, мөчлөгийн хугацааг тооцоолох, зүрхний мөчлөгийн үед эд эсийн суналтыг үнэлэхэд ашигласан.Бичигдсэн видеог эхний дарааллын тэг фазын дижитал шүүлтүүр ашиглан дараах боловсруулалт хийсэн.Эдийн суналтыг (оргилоос оргил хүртэл) хэмжихийн тулд бүртгэгдсэн дохионы оргил ба тэвшийг ялгахын тулд оргил ба оргилын шинжилгээг хийсэн.Нэмж дурдахад дохионы шилжилтийг арилгахын тулд 6-р эрэмбийн олон гишүүнтийг ашиглан задлах ажлыг гүйцэтгэдэг.Дэлхийн эдийн хөдөлгөөн, мөчлөгийн хугацаа, амрах хугацаа, агшилтын хугацааг тодорхойлох зорилгоор MATLAB програмын кодыг боловсруулсан (Нэмэлт хөтөлбөрийн код 44).
Механик сунгалтын үнэлгээнд зориулж бүтээсэн ижил видеог ашиглан бид эхлээд MUSCLEMOTION программ хангамжийн дагуу хөдөлгөөний оргил цэгүүдийг (дээд (дээд) ба доод (доод) хөдөлгөөний цэгүүд) харуулсан хоёр дүрсийг судаллаа.Дараа нь бид эдийн хэсгүүдийг сегментчилж, сегментчилсэн эдэд сүүдэрлэх алгоритмын хэлбэрийг ашигласан (Нэмэлт зураг 2a).Дараа нь сегментчилсэн эдийг арван доод давхаргад хувааж, гадаргуу тус бүрийн стрессийг дараах тэгшитгэлийг ашиглан тооцоолсон: Strain = (Sup-Sdown)/Sdown, энд Sup болон Sdown нь даавууны дээд ба доод сүүдэрээс тус тус хэлбэрийн зай юм (Нэмэлт Зураг .2b).
Зүрхний хэсгүүдийг 4% параформальдегид 48 цагийн турш бэхэлсэн.Тогтмол эдийг 10% ба 20% сахарозоор 1 цагийн турш, дараа нь 30% сахарозтой нэг шөнийн дотор усгүйжүүлсэн.Дараа нь хэсгүүдийг зүсэх температурын оновчтой найрлагад (OCT нэгдэл) суулгаж, изопентан/хуурай мөсөн ваннд аажмаар хөлдөөсөн.OCT шигтгээтэй блокуудыг салгах хүртэл -80 °C хэмд хадгална.Слайдыг 8 мкм зузаантай хэсэг болгон бэлтгэсэн.
Зүрхний хэсгүүдээс OCT-ийг арилгахын тулд слайдыг 95 ° C-т 5 минутын турш халаана.Слайд бүрт 1 мл PBS нэмж, тасалгааны температурт 30 минутын турш өсгөвөрлөсний дараа тасалгааны температурт 15 минутын турш PBS-д 0.1% Triton-X тохируулж хэсгүүдэд нэвчүүлнэ.Өвөрмөц бус эсрэгбиемүүдийг дээжтэй холбохоос сэргийлэхийн тулд слайд дээр 1 мл 3% BSA уусмал нэмж, тасалгааны температурт 1 цаг өсгөвөрлөнө.Дараа нь BSA-г зайлуулж, слайдыг PBS-ээр угаана.Дээж бүрийг харандаагаар тэмдэглээрэй.Анхан шатны эсрэгбиемүүдийг (1% BSA-д 1:200 харьцаагаар шингэлсэн) (connexin 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) болон troponin-T (Thermo Scientific; #MA5-12960) дараа нь BSA12-ийн эсрэг хоёрдогч эсрэгбиемүүдийг 90 минутын турш нэмсэн. хулгана Alexa Fluor 488 (Thermo Scientific; #A16079), туулайн эсрэг Alexa Fluor 594 (Thermo Scientific; #T6391) нэмэлт 90 минутын турш PBS-ээр 3 удаа угаасан. Зорилтот будгийг дэвсгэрээс ялгахын тулд бид зөвхөн хоёрдогч эсрэгбиеийг хэрэглэсэн. vectashield (Vector Laboratories) болон хумсны лакаар битүүмжилсэн. -x томруулах) болон Keyence микроскопоор 40 дахин томруулна.
5 мкг/мл PBS дахь WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) WGA будалтанд хэрэглэж, тасалгааны температурт 30 минутын турш тогтмол хэсгүүдэд хэрэглэсэн.Дараа нь слайдуудыг PBS-ээр угааж, слайд бүр дээр судан хар нэмж, 30 минутын турш өсгөвөрлөнө.Дараа нь слайдуудыг PBS-ээр угааж, vectashield шигтгэх орчинг нэмсэн.Слайдуудыг Keyence микроскопоор 40 дахин томруулж үзүүлэв.
Дээр дурдсанчлан дээжээс OCT-г устгасан.OCT-ыг авсны дараа слайдыг Bouin-ийн уусмалд шөнийн турш дүрнэ.Дараа нь слайдыг 1 цагийн турш нэрмэл усаар зайлж, дараа нь 10 минутын турш Бибрихийн зуун настын хүчлийн фуксины уусмалд хийнэ.Дараа нь слайдыг нэрмэл усаар угааж, 5% фосфомолибден/5% фосфотунгсти хүчлийн уусмалд 10 минут байлгана.Слайдуудыг зайлахгүйгээр шууд анилин цэнхэр уусмал руу 15 минутын турш шилжүүлнэ.Дараа нь слайдыг нэрмэл усаар угааж, 1% цууны хүчлийн уусмалд 2 минутын турш байрлуулна.Слайдыг 200 Н этанолд хатааж, ксилол руу шилжүүлэв.Будсан слайдуудыг 10х объектив бүхий Keyence микроскоп ашиглан дүрсэлсэн.Фиброзын талбайн хувийг Keyence Analyzer программ хангамжийг ашиглан хэмжсэн.
CyQUANT™ MTT эсийн амьдрах чадварын шинжилгээ (Invitrogen, Carlsbad, CA), каталогийн дугаар V13154, зарим өөрчлөлттэй үйлдвэрлэгчийн протоколын дагуу.Ялангуяа MTT шинжилгээний явцад эд эсийн хэмжээг жигд байлгахын тулд 6 мм-ийн диаметртэй мэс заслын цоолтуур ашигласан.Үйлдвэрлэгчийн протоколын дагуу MTT субстрат агуулсан 12 цооногийн хавтангийн нүхэнд эдийг тус тусад нь бүрсэн.Хэсэгүүдийг 37°С-т 3 цагийн турш өсгөвөрлөх ба амьд эд нь MTT субстратыг хувиргаж, нил ягаан формазаны нэгдэл үүсгэдэг.MTT уусмалыг 1 мл DMSO-ээр сольж, зүрхний хэсгүүдээс нил ягаан формазан гаргаж авахын тулд 37 ° C-т 15 минутын турш өсгөвөрлөнө.Дээжийг DMSO-д 1:10 харьцаагаар 96 нүхтэй тунгалаг ёроолтой ялтсуудад шингэлж, ягаан өнгөний эрчмийг Cytation plate reader (BioTek) ашиглан 570 нм-д хэмжсэн.Уншилтыг зүрхний зүсмэл бүрийн жинд хэвийн болгосон.
Зүрхний зүсмэл медиаг өмнө тайлбарласны дагуу глюкозын ашиглалтын шинжилгээнд зориулж 1 мкСи/мл [5-3Н]-глюкоз (Moravek Biochemicals, Brea, CA, USA) агуулсан зөөвөрлөгчөөр сольсон.4 цагийн инкубацийн дараа 100 мкл 0.2 Н HCl агуулсан задгай микроцентрифугийн хоолойд 100 мкл орчин нэмнэ.Дараа нь хоолойг 500 мкл dH2O агуулсан синтилляцийн хоолойд хийж 37°С-т 72 цагийн турш [3H]2O-г ууршуулна.Дараа нь микроцентрифугийн хоолойг синтилляцийн хоолойноос аваад 10 мл сцинтилляцийн шингэн нэмнэ.Шинтилляцийн тооллогыг Tri-Carb 2900TR шингэн сцинтилляцийн анализатор (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, USA) ашиглан хийсэн.Дараа нь глюкозын ашиглалтыг [5-3H]-глюкозын өвөрмөц идэвхжил, бүрэн бус тэнцвэр ба дэвсгэр байдал, [5-3H]-ыг шошгогүй глюкоз болгон шингэлэх, сцинтилляцийн тоолуурын үр ашгийг харгалзан тооцоолсон.Өгөгдлийг зүрхний хэсгүүдийн массаар хэвийн болгодог.
Trizol дахь эдийг нэгэн төрлийн болгосны дараа үйлдвэрлэгчийн протоколын дагуу Qiagen miRNeasy Micro Kit # 210874 ашиглан РНХ-ийг зүрхний хэсгүүдээс тусгаарласан.RNAsec номын сангийн бэлтгэл, дараалал, өгөгдлийн шинжилгээг дараах байдлаар гүйцэтгэв.
Дээжинд 1 мкг РНХ-ийг РНХ-ийн номын санг бэлтгэхэд анхан шатны материал болгон ашигласан.Үйлдвэрлэгчийн зөвлөмжийн дагуу Illumina (NEB, АНУ)-д зориулсан NEBNext UltraTM РНХ номын сангийн бэлтгэлийн иж бүрдлийг ашиглан дарааллын сангуудыг үүсгэсэн бөгөөд дээж бүрийн атрибутын дараалалд индекс код нэмсэн.Товчхондоо, мРНХ-ийг поли-Т олигонуклеотидуудтай холбосон соронзон бөмбөлгүүдийг ашиглан нийт РНХ-ээс цэвэршүүлсэн.Хэт хуваагдлыг NEBNext First Strand Synthesis Reaction Buffer (5X) дахь өндөр температурт хоёр валентын катионуудыг ашиглан гүйцэтгэдэг.Эхний хэлхээний cDNA-г санамсаргүй гексамер праймер ба M-MuLV урвуу транскриптаз (RNase H-) ашиглан нийлэгжүүлсэн.Дараа нь cDNA-ийн хоёр дахь хэлхээг ДНХ полимераз I ба RNase H ашиглан нийлэгжүүлнэ. Үлдсэн хэсгүүд нь экзонуклеаза/полимеразын үйл ажиллагааны нөлөөгөөр мохоо төгсгөлд хувирдаг.ДНХ-ийн фрагментийн 3′ төгсгөлийг аденилизаци хийсний дараа үсний хавчаартай гогцоо бүтэцтэй NEBNext адаптерийг хавсаргаж, эрлийзжүүлэхэд бэлтгэдэг.150-200 bp урттай cDNA фрагментийг сонгоход зориулагдсан.номын сангийн хэсгүүдийг AMPure XP системийг ашиглан цэвэршүүлсэн (Бекман Култер, Беверли, АНУ).Дараа нь 3 мкл USER Enzyme (NEB, USA) хэмжээтэй сонгосон cDNA-г адаптераар холбосон 37°С-т 15 минут, дараа нь 95°C-т 5 минутын турш ПГУ-ын өмнө хэрэглэнэ.Дараа нь ПГУ-ыг Phusion High-Fidelity ДНХ полимераза, бүх нийтийн ПГУ-ын праймер, Индекс (X) праймер ашиглан гүйцэтгэсэн.Эцэст нь ПГУ-ын бүтээгдэхүүнийг цэвэршүүлсэн (AMPure XP систем) болон номын сангийн чанарыг Agilent Bioanalyzer 2100 систем дээр үнэлэв.Дараа нь cDNA номын санг Novaseq секвентор ашиглан дараалуулсан.Illumina-ийн түүхий зургийн файлуудыг CASAVA Base Calling ашиглан түүхий унших болгон хөрвүүлсэн.Түүхий өгөгдөл нь унших дараалал болон харгалзах үндсэн чанарыг агуулсан FASTQ(fq) форматтай файлуудад хадгалагддаг.Шүүсэн дарааллын уншилтыг Sscrofa11.1 лавлагаа геномтой тааруулахын тулд HISAT2-г сонгоно уу.Ерөнхийдөө HISAT2 ямар ч хэмжээтэй геномыг дэмждэг бөгөөд үүнд 4 тэрбумаас дээш тооны геномууд багтдаг бөгөөд ихэнх параметрүүдэд анхдагч утгыг тохируулдаг.RNA Seq өгөгдлөөс уншсан залгалтуудыг HISAT2 ашиглан үр ашигтай тохируулж болох бөгөөд энэ нь одоогийн байгаа хамгийн хурдан систем бөгөөд бусад аргуудтай ижил эсвэл илүү нарийвчлалтай.
Транскриптийн элбэг дэлбэг байдал нь генийн илэрхийллийн түвшинг шууд илэрхийлдэг.Генийн илэрхийлэлийн түвшинг геном эсвэл экзонтой холбоотой олон тооны транскриптээр (дараалсан тоо) үнэлдэг.Уншсан тоо нь генийн илэрхийллийн түвшин, генийн урт, дарааллын гүнтэй пропорциональ байна.FPKM (сая суурь хос тутамд дараалсан мянган үндсэн хос транскриптийн фрагмент) -ийг тооцоолж, DESeq2 багцыг ашиглан дифференциал илэрхийллийн P-утгыг тодорхойлсон.Дараа нь бид суурилагдсан R-функц “p.adjust” дээр үндэслэн Бенжамин-Хочбергийн аргыг9 ашиглан P утга тус бүрээр худал илрүүлэх хурдыг (FDR) тооцоолсон.
Зүрхний хэсгүүдээс тусгаарлагдсан РНХ-ийг Thermo (Thermo, кат. № 11756050)-ийн SuperScript IV Vilo Master хольцыг ашиглан 200 нг/мкл концентрацид cDNA болгон хувиргасан.Тоон RT-ПГУ-ыг Applied Biosystems Endura Plate Microamp 384 цооногийн тунгалаг урвалын хавтан (Thermo, кат. № 4483319) болон микроамп оптик цавуу (Thermo, кат. № 4311971) ашиглан гүйцэтгэсэн.Урвалын хольц нь 5 мкл Taqman Fast Advanced Master хольц (Thermo, cat № 4444557), 0.5 μl Taqman Primer ба 3.5 μl H2O нэг нүхэнд холилдоно.Стандарт qPCR циклийг ажиллуулж, CT утгыг Applied Biosystems Quantstudio 5 бодит цагийн ПГУ-ын хэрэглүүр (384 цооногийн модуль; бүтээгдэхүүн # A28135) ашиглан хэмжсэн.Taqman праймерыг Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (S89010N), RGL1 (S89101)-аас худалдаж авсан. 8_mH), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss042415) бүх генийн дээжийн G8-ийн утгууд хэвийн болсон. APDH.
NT-ProBNP-ийн хэвлэл мэдээллийн хэрэгслийн хувилбарыг үйлдвэрлэгчийн протоколын дагуу NT-ProBNP хэрэгсэл (гахай) (Cat. No. MBS2086979, MyBioSource) ашиглан үнэлэв.Товчхондоо, дээж, стандарт тус бүрээс 250 мкл-ийг худаг бүрт давхардсанаар нэмсэн.Дээжийг нэмсний дараа цооног бүрт 50 мкл Шинжилгээний урвалж А нэмнэ.Хавтанг зөөлөн сэгсэрч, чигжээсээр битүүмжилнэ.Дараа нь шахмалыг 37 градусын температурт 1 цагийн турш өсгөвөрлөнө.Дараа нь уусмалыг соруулж, нүхийг 350 мкл 1X угаах уусмалаар 4 удаа угааж, угаах уусмалыг 1-2 минутын турш инкубаци хийнэ.Дараа нь нэг нүхэнд 100 мкл Шинжилгээний урвалж В нэмээд хавтан чигжээсээр битүүмжилнэ.Таблетыг зөөлөн сэгсэрч, 37 градусын температурт 30 минутын турш өсгөвөрлөнө.Уусмалыг соруулж, нүхийг 350 мкл 1X угаах уусмалаар 5 удаа угаана.Худаг бүрт 90 мкл субстратын уусмал нэмж, хавтанг битүүмжилнэ.Хавтанг 37 хэмд 10-20 минутын турш өсгөвөрлөнө.Цооног бүрт 50 мкл зогсоох уусмал нэмнэ.Хавтанг нэн даруй 450 нм-д тохируулсан Cytation (BioTek) хавтан уншигч ашиглан хэмжсэн.
Параметрийн 10%-ийн үнэмлэхүй өөрчлөлтийг 5%-ийн I төрлийн алдаатай илрүүлэхийн тулд >80%-ийн хүчийг өгөх бүлгийн хэмжээг сонгохын тулд чадлын шинжилгээ хийсэн. Параметрийн 10%-ийн үнэмлэхүй өөрчлөлтийг 5%-ийн I төрлийн алдаатай илрүүлэхийн тулд >80%-ийн хүчийг өгөх бүлгийн хэмжээг сонгохын тулд чадлын шинжилгээ хийсэн. Анализ мощности был выполнен для выбора размеров групп, которые обеспечат >80% мощности для обнаружения 10% абсолютного изменения параметра с 5% частотой ошибок төрөл I. 5%-ийн I төрлийн алдааны хувьтай 10%-ийн үнэмлэхүй параметрийн өөрчлөлтийг илрүүлэхийн тулд >80%-ийн хүчийг хангах бүлгийн хэмжээг сонгохын тулд чадлын шинжилгээ хийсэн.进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I变化和5％行变化和错I叄型进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I变化和5％行变化和错I叄型 Выбора размера группын хувьд боломжтой анализ хийх боломжтой, 10% абсолютного задралын параметров ба 5% частоты ошибок төрлийн I-ийн хувьд > 80% мощности. 10%-ийн үнэмлэхүй параметрийн өөрчлөлт, 5%-ийн I төрлийн алдааны түвшинг илрүүлэхийн тулд >80%-ийн хүчийг хангах бүлгийн хэмжээг сонгохын тулд чадлын шинжилгээ хийсэн.Туршилтын өмнө эд эсийн хэсгүүдийг санамсаргүй байдлаар сонгосон.Бүх дүн шинжилгээ нь харалган нөхцөл байсан бөгөөд зөвхөн бүх өгөгдөлд дүн шинжилгээ хийсний дараа дээжийг тайлсан.Статистикийн бүх шинжилгээг хийхэд GraphPad Prism программ (Сан Диего, Калифорниа) ашигласан. Бүх статистикийн хувьд р-утгыг <0.05 утгаар чухал гэж үзсэн. Бүх статистикийн хувьд p-утгууд <0.05-аас бага байх үед чухал ач холбогдолтой гэж үзсэн. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Бүх статистикийн хувьд p-утгууд <0.05-аас бага байх үед чухал ач холбогдолтой гэж үзсэн.对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的。对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的。 Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Бүх статистикийн хувьд p-утгууд <0.05-аас бага байх үед чухал ач холбогдолтой гэж үзсэн.Хоёр сүүлт Оюутны t-тестийг өгөгдөл дээр зөвхөн 2 харьцуулалтаар хийсэн.Олон бүлгийн хоорондын ач холбогдлыг тодорхойлохын тулд нэг талын эсвэл хоёр талын ANOVA ашигласан.Post hoc тест хийхдээ олон харьцуулалтыг тооцохын тулд Tukey-ийн засварыг ашигласан.RNAsec өгөгдөл нь Аргачлалын хэсэгт тайлбарласны дагуу FDR болон p.adjust-ийг тооцоолохдоо статистикийн онцгой анхаарал хандуулдаг.
Судалгааны дизайны талаар нэмэлт мэдээлэл авахыг хүсвэл энэ нийтлэлтэй холбосон Байгалийн судалгааны тайлангийн хураангуйг үзнэ үү.