Nature.com ला भेट दिल्याबद्दल धन्यवाद. तुम्ही वापरत असलेल्या ब्राउझर आवृत्तीमध्ये CSS साठी मर्यादित समर्थन आहे. सर्वोत्तम अनुभवासाठी, आम्ही शिफारस करतो की तुम्ही अपडेटेड ब्राउझर वापरा (किंवा इंटरनेट एक्सप्लोररमध्ये सुसंगतता मोड बंद करा). दरम्यान, सतत समर्थन सुनिश्चित करण्यासाठी, आम्ही शैली आणि जावास्क्रिप्टशिवाय साइट प्रदर्शित करू.
मानवी आतड्यांचे मॉर्फोजेनेसिस 3D एपिथेलियल मायक्रोआर्किटेक्चर आणि स्थानिक संघटनेची क्रिप्ट-व्हिलस वैशिष्ट्ये स्थापित करते. बेसल क्रिप्टमधील स्टेम सेल कोनाडाला बाह्य सूक्ष्मजीव प्रतिजन आणि त्यांच्या चयापचयांपासून संरक्षित करून आतड्यांचे होमिओस्टॅसिस राखण्यासाठी ही अद्वितीय रचना आवश्यक आहे. याव्यतिरिक्त, आतड्यांसंबंधी विली आणि स्रावित श्लेष्मा आतड्यांसंबंधी श्लेष्मल पृष्ठभागावर संरक्षणात्मक अडथळा असलेल्या कार्यात्मकपणे भिन्न उपकला पेशी सादर करतात. म्हणून, इन विट्रो आतड्यांसंबंधी मॉडेल्सच्या बांधकामासाठी 3D उपकला संरचना पुन्हा तयार करणे महत्वाचे आहे. उल्लेखनीय म्हणजे, सेंद्रिय मिमेटिक गट-ऑन-ए-चिप वाढीव शारीरिक कार्ये आणि बायोमेकॅनिक्ससह आतड्यांसंबंधी उपकलाचे उत्स्फूर्त 3D मॉर्फोजेनेसिस प्रेरित करू शकते. येथे, आम्ही मायक्रोफ्लुइडिक चिप तसेच ट्रान्सवेल एम्बेडेड हायब्रिड चिपमध्ये आतड्यांमधील आतड्यांसंबंधी मॉर्फोजेनेसिसला मजबूतपणे प्रेरित करण्यासाठी पुनरुत्पादन करण्यायोग्य प्रोटोकॉल प्रदान करतो. आम्ही डिव्हाइस फॅब्रिकेशन, पारंपारिक सेटिंग्जमध्ये तसेच मायक्रोफ्लुइडिक प्लॅटफॉर्मवर कॅको-2 किंवा आतड्यांसंबंधी ऑर्गेनॉइड उपकला पेशींचे संवर्धन, 3D मॉर्फोजेनेसिसचे प्रेरण आणि स्थापित केलेल्यांचे वैशिष्ट्यीकरण यासाठी तपशीलवार पद्धतींचे वर्णन करतो. 3D एपिथेलियामध्ये अनेक इमेजिंग पद्धतींचा वापर केला जातो. हा प्रोटोकॉल 5 दिवसांसाठी बेसोलॅटरल फ्लुइड फ्लो नियंत्रित करून फंक्शनल आतड्याच्या मायक्रोआर्किटेक्चरचे पुनरुत्पादन साध्य करतो. आमची इन विट्रो मॉर्फोजेनेसिस पद्धत शारीरिकदृष्ट्या संबंधित कातरणे ताण आणि यांत्रिक गती वापरते आणि जटिल पेशी अभियांत्रिकी किंवा हाताळणीची आवश्यकता नाही, जी इतर विद्यमान तंत्रांपेक्षा चांगली कामगिरी करू शकते. आम्ही कल्पना करतो की आमच्या प्रस्तावित प्रोटोकॉलचे बायोमेडिकल संशोधन समुदायासाठी व्यापक परिणाम असू शकतात, बायोमेडिकल, क्लिनिकल आणि फार्मास्युटिकल अनुप्रयोगांसाठी विट्रोमध्ये 3D आतड्यांसंबंधी एपिथेलियल थर पुन्हा निर्माण करण्याची पद्धत प्रदान करते.
प्रयोगांवरून असे दिसून आले आहे की आतड्यांतील एपिथेलियल कॅको-२ पेशी आतड्यांतील ऑन-ए-चिप१,२,३,४,५ किंवा बायलेयर मायक्रोफ्लुइडिक उपकरणांमध्ये संवर्धित केल्या जातात, ६,७, अंतर्निहित यंत्रणेची स्पष्ट समज नसतानाही, इन विट्रोमध्ये उत्स्फूर्त ३डी मॉर्फोजेनेसिस करू शकतात. आमच्या अलीकडील अभ्यासात, आम्हाला आढळले की कल्चर उपकरणांमधून बेसोलॅटरली स्रावित मॉर्फोजेन विरोधी काढून टाकणे आवश्यक आहे आणि ३डी एपिथेलियल मॉर्फोजेनेसिस इन विट्रोमध्ये प्रेरित करण्यासाठी पुरेसे आहे, जे कॅको-२ आणि रुग्ण-व्युत्पन्न आतड्यांसंबंधी ऑर्गेनॉइड्सने दाखवून दिले आहे. एपिथेलियल पेशींचे प्रमाणीकरण करण्यात आले. या अभ्यासात, आम्ही विशेषतः गट-ऑन-ए-चिप आणि ट्रान्सवेल इन्सर्ट असलेल्या सुधारित मायक्रोफ्लुइडिक उपकरणांमध्ये, ज्याला "हायब्रिड चिप" म्हणतात, एक शक्तिशाली Wnt विरोधी, डिककोप-१ (DKK-१) च्या पेशी उत्पादन आणि एकाग्रता वितरणावर लक्ष केंद्रित केले. आम्ही दाखवतो की ऑन-चिप आतड्यात बाह्य Wnt विरोधी (जसे की DKK-1, Wnt रिप्रेसर १, स्रावित फ्रिजल्ड-संबंधित प्रोटीन १, किंवा सॉगी-१) जोडल्याने मॉर्फोजेनेसिस रोखले जाते किंवा प्रीस्ट्रक्चर्ड ३D एपिथेलियल लेयरमध्ये व्यत्यय येतो, असे सूचित करते की कल्चर दरम्यान विरोधी ताण आतड्यांसंबंधी मॉर्फोजेनेसिससाठी जबाबदार आहे. इन विट्रो. म्हणून, एपिथेलियल इंटरफेसवर मजबूत मॉर्फोजेनेसिस साध्य करण्यासाठी एक व्यावहारिक दृष्टिकोन म्हणजे सक्रिय फ्लशिंग (उदा. गट-ऑन-ए-चिप किंवा हायब्रिड-ऑन-ए-चिप प्लॅटफॉर्ममध्ये) किंवा प्रसाराद्वारे बेसोलेटरल कंपार्टमेंटमधील Wnt विरोधी पातळी काढून टाकणे किंवा कमीत कमी राखणे. बेसोलेटरल मीडिया (उदा., ट्रान्सवेल इन्सर्टमधून मोठ्या बेसोलेटरलमध्ये) विहिरींमधील जलाशय).
या प्रोटोकॉलमध्ये, आम्ही पॉलीडायमेथिलसिलॉक्सेन (PDMS)-आधारित सच्छिद्र पडदा (पायरी 6A, 7A, 8, 9) किंवा ट्रान्सवेल इन्सर्टच्या पॉलिस्टर पडदा (पायरी 6B, 7B, 8, 9) आणि प्रेरित 3D मॉर्फोजेनेसिस इन विट्रो (पायरी 10) वर आतड्यांसंबंधी उपकला पेशींचे संवर्धन करण्यासाठी आतड्यांवरील आतड्यांसंबंधी मायक्रोडिव्हाइसेस आणि ट्रान्सवेल-इन्सर्टेबल हायब्रिड चिप्स (पायरी 1-5) तयार करण्यासाठी एक तपशीलवार पद्धत प्रदान करतो. आम्ही अनेक इमेजिंग पद्धती (पायरी 11-24) लागू करून ऊती-विशिष्ट हिस्टोजेनेसिस आणि वंश-आश्रित सेल्युलर भिन्नतेचे सूचक सेल्युलर आणि आण्विक वैशिष्ट्ये देखील ओळखली. आम्ही मानवी आतड्यांसंबंधी उपकला पेशी, जसे की Caco-2 किंवा आतड्यांसंबंधी ऑर्गेनॉइड्स वापरून मॉर्फोजेनेसिस प्रेरित करतो, ज्यामध्ये तांत्रिक तपशीलांसह सच्छिद्र पडद्याच्या पृष्ठभागावरील बदल, 2D मोनोलेयर्सची निर्मिती आणि आतड्यांसंबंधी जैवरासायनिक आणि बायोमेकॅनिकल मायक्रोएन्वायरमेंटचे पुनरुत्पादन समाविष्ट आहे. इन विट्रो. 2D एपिथेलियल मोनोलेयर्समधून 3D मॉर्फोजेनेसिस प्रेरित करण्यासाठी, आम्ही काढून टाकले कल्चरच्या बेसोलॅटरल कंपार्टमेंटमध्ये माध्यम प्रवाहित करून दोन्ही संवर्धित स्वरूपात मॉर्फोजेन विरोधी. शेवटी, आम्ही पुनर्जन्म करण्यायोग्य 3D एपिथेलियल लेयरच्या उपयुक्ततेचे प्रतिनिधित्व प्रदान करतो ज्याचा वापर मॉर्फोजेन-आश्रित एपिथेलियल वाढ, अनुदैर्ध्य यजमान-मायक्रोबायोम सह-संस्कृती, रोगजनक संसर्ग, दाहक दुखापत, एपिथेलियल बॅरियर डिसफंक्शन आणि प्रोबायोटिक-आधारित थेरपीचे मॉडेल करण्यासाठी केला जाऊ शकतो. उदाहरणे. प्रभाव.
आमचा प्रोटोकॉल मूलभूत (उदा. आतड्यांसंबंधी श्लेष्मल त्वचा जीवशास्त्र, स्टेम सेल जीवशास्त्र आणि विकासात्मक जीवशास्त्र) आणि उपयोजित संशोधन (उदा. प्रीक्लिनिकल ड्रग टेस्टिंग, रोग मॉडेलिंग, टिश्यू इंजिनिअरिंग आणि गॅस्ट्रोएन्टेरोलॉजी) व्यापक प्रभावातील शास्त्रज्ञांच्या विस्तृत श्रेणीसाठी उपयुक्त ठरू शकतो. इन विट्रोमध्ये आतड्यांसंबंधी एपिथेलियमचे 3D मॉर्फोजेनेसिस प्रेरित करण्यासाठी आमच्या प्रोटोकॉलची पुनरुत्पादनक्षमता आणि मजबूतीमुळे, आम्ही कल्पना करतो की आमची तांत्रिक रणनीती आतड्यांसंबंधी विकास, पुनर्जन्म किंवा होमिओस्टॅसिस दरम्यान पेशी सिग्नलिंगच्या गतिशीलतेचा अभ्यास करणाऱ्या प्रेक्षकांपर्यंत पोहोचवता येईल. याव्यतिरिक्त, आमचा प्रोटोकॉल नोरोव्हायरस 8, गंभीर तीव्र श्वसन सिंड्रोम कोरोनाव्हायरस 2 (SARS-CoV-2), क्लोस्ट्रिडियम डिफिसाइल, साल्मोनेला टायफिमुरियम 9 किंवा व्हिब्रिओ कॉलरा सारख्या विविध संसर्गजन्य घटकांखाली संसर्गाची चौकशी करण्यासाठी उपयुक्त आहे. रोग पॅथॉलॉजी आणि पॅथोजेनेसिसचे प्रेक्षक देखील उपयुक्त आहेत. ऑन-चिप आतड्याच्या मायक्रोफिजियोलॉजी सिस्टमचा वापर अनुदैर्ध्य सह-संस्कृती 10 आणि गॅस्ट्रोइंटेस्टाइनल (GI) ट्रॅक्ट 11 मध्ये यजमान संरक्षण, रोगप्रतिकारक प्रतिक्रिया आणि रोगजनक-संबंधित दुखापत दुरुस्तीचे त्यानंतरचे मूल्यांकन करण्यास अनुमती देऊ शकतो. गळतीच्या आतड्याच्या सिंड्रोम, सेलिआक रोग, क्रोहन रोग, अल्सरेटिव्ह कोलायटिस, पाउचिटिस किंवा इरिटेबल बोवेल सिंड्रोमशी संबंधित इतर GI विकार रुग्णाच्या 3D आतड्याच्या उपकला थरांचा वापर करून 3D आतड्याच्या उपकला थर तयार केल्यावर अनुकरण केले जाऊ शकतात, या रोगांमध्ये विलस अ‍ॅट्रोफी, क्रिप्ट शॉर्टनिंग, म्यूकोसल नुकसान किंवा बिघडलेले उपकला अडथळा समाविष्ट आहे. बायोप्सी किंवा स्टेम सेल-व्युत्पन्न आतड्यांसंबंधी ऑर्गेनॉइड्स12,13. रोगाच्या वातावरणाची उच्च जटिलता चांगल्या प्रकारे मॉडेल करण्यासाठी, वाचक 3D आतड्यांसंबंधी व्हिलस-क्रिप्ट मायक्रोआर्किटेक्चर असलेल्या मॉडेलमध्ये रोग-संबंधित पेशी प्रकार, जसे की रुग्ण परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर पेशी (PBMCs) जोडण्याचा विचार करू शकतात. ऊतक-विशिष्ट रोगप्रतिकारक पेशी, 5.
3D एपिथेलियल मायक्रोस्ट्रक्चर सेक्शनिंग प्रक्रियेशिवाय निश्चित आणि दृश्यमान केले जाऊ शकते, त्यामुळे स्पेशियल ट्रान्सक्रिप्टोमिक्स आणि हाय-रिझोल्यूशन किंवा सुपर-रिझोल्यूशन इमेजिंगवर काम करणाऱ्या दर्शकांना एपिथेलियल निचेसवरील जीन्स आणि प्रथिनांच्या स्पेशियोटेम्पोरल डायनॅमिक्सच्या आमच्या मॅपिंगमध्ये रस असू शकतो. तंत्रज्ञानात रस. मायक्रोबियल किंवा इम्यून उत्तेजनांना प्रतिसाद. शिवाय, अनुदैर्ध्य होस्ट-मायक्रोबायोम क्रॉसटॉक 10, 14 जे आतड्यांचे होमिओस्टॅसिस समन्वयित करतात ते 3D आतड्यांसंबंधी श्लेष्मल थरात विविध सूक्ष्मजीव प्रजाती, मायक्रोबियल समुदाय किंवा मल मायक्रोबायोटा, विशेषतः आतड्यांवरील चिपमध्ये सह-संवर्धन करून स्थापित केले जाऊ शकतात. प्लॅटफॉर्ममध्ये. हा दृष्टिकोन प्रयोगशाळेत पूर्वी असंस्कृत आतड्यांतील मायक्रोबायोटा जोपासण्याचा प्रयत्न करणाऱ्या म्यूकोसल इम्युनोलॉजी, गॅस्ट्रोएन्टेरोलॉजी, मानवी मायक्रोबायोम, कल्च्युरोमिक्स आणि क्लिनिकल मायक्रोबायोलॉजीचा अभ्यास करणाऱ्या प्रेक्षकांसाठी विशेषतः आकर्षक आहे. जर आमचा इन विट्रो मॉर्फोजेनेसिस प्रोटोकॉल स्केलेबल कल्चर फॉरमॅट्सशी जुळवून घेता आला, जसे की २४, ९६ किंवा ३८४ विहिरी प्लेट्समधील मल्टीवेल इन्सर्ट जे सतत बेसोलॅटरल कंपार्टमेंट्स पुन्हा भरतात, तर प्रोटोकॉल फार्मास्युटिकल, बायोमेडिकल किंवा हाय-थ्रूपुट स्क्रीनिंग किंवा व्हॅलिडेशन प्लॅटफॉर्म विकसित करणाऱ्यांना देखील प्रसारित केला जाऊ शकतो. तत्वाचा पुरावा म्हणून, आम्ही अलीकडेच २४-विहिरी प्लेट फॉरमॅटमध्ये स्केलेबल असलेल्या मल्टीप्लेक्स हाय-थ्रूपुट मॉर्फोजेनेसिस सिस्टमची व्यवहार्यता प्रदर्शित केली. याव्यतिरिक्त, मल्टीपल ऑर्गन-ऑन-ए-चिप उत्पादनांचे व्यावसायिकीकरण केले गेले आहे१६,१७,१८.म्हणून, आमच्या इन विट्रो मॉर्फोजेनेसिस पद्धतीचे प्रमाणीकरण वेगवान केले जाऊ शकते आणि ट्रान्सक्रिप्टोमिक स्तरावर इन विट्रो आतड्यांतील मॉर्फोजेनेसिसचे सेल्युलर रीप्रोग्रामिंग समजून घेण्यासाठी अनेक संशोधन प्रयोगशाळा, उद्योग किंवा सरकार आणि नियामक एजन्सींनी संभाव्यतः स्वीकारले जाऊ शकते. औषधे किंवा बायोथेरप्यूटिक्स आतड्याच्या मॉर्फोजेनेसिस प्रक्रियेच्या पुनरुत्पादनक्षमतेचे मूल्यांकन करण्यासाठी 3D गट सरोगेट्स किंवा कस्टम किंवा व्यावसायिक ऑर्गन-ऑन-ए-चिप मॉडेल्स वापरून औषध उमेदवारांचे शोषण आणि वाहतूक मूल्यांकन केले गेले.
आतड्यांसंबंधी उपकला मॉर्फोजेनेसिसचा अभ्यास करण्यासाठी मर्यादित संख्येने मानव-संबंधित प्रायोगिक मॉडेल्सचा वापर केला गेला आहे, मुख्यतः विट्रोमध्ये 3D मॉर्फोजेनेसिस प्रेरित करण्यासाठी अंमलबजावणीयोग्य प्रोटोकॉलच्या अभावामुळे. खरं तर, आतड्यांसंबंधी मॉर्फोजेनेसिसबद्दलचे सध्याचे बरेचसे ज्ञान प्राण्यांच्या अभ्यासावर आधारित आहे (उदा., झेब्राफिश20, उंदीर21 किंवा कोंबडी22). तथापि, ते श्रम-केंद्रित आणि खर्च-केंद्रित आहेत, नैतिकदृष्ट्या शंकास्पद असू शकतात आणि सर्वात महत्त्वाचे म्हणजे, मानवी विकास प्रक्रिया अचूकपणे निर्धारित करत नाहीत. हे मॉडेल बहु-मार्गी स्केलेबल पद्धतीने चाचणी करण्याच्या त्यांच्या क्षमतेमध्ये देखील खूप मर्यादित आहेत. म्हणून, विट्रोमध्ये 3D ऊती संरचनांचे पुनरुत्पादन करण्यासाठी आमचा प्रोटोकॉल विवो प्राण्यांच्या मॉडेल्समध्ये तसेच इतर पारंपारिक स्थिर 2D पेशी संस्कृती मॉडेल्सपेक्षा चांगले कामगिरी करतो. आधी वर्णन केल्याप्रमाणे, 3D उपकला संरचनांचा वापर केल्याने आम्हाला विविध श्लेष्मल किंवा रोगप्रतिकारक उत्तेजनांच्या प्रतिसादात क्रिप्ट-व्हिलस अक्षातील विभेदित पेशींच्या स्थानिक स्थानिकीकरणाचे परीक्षण करण्याची परवानगी मिळाली. 3D उपकला थर यजमान घटकांच्या प्रतिसादात (उदा., आतील विरुद्ध बाह्य श्लेष्मा थर, स्राव) सूक्ष्मजीव पेशी स्थानिक कोनाडे तयार करण्यासाठी आणि पर्यावरणीय उत्क्रांती कशी स्पर्धा करतात याचा अभ्यास करण्यासाठी जागा प्रदान करू शकतात. IgA आणि अँटीमायक्रोबियल पेप्टाइड्स). शिवाय, 3D एपिथेलियल मॉर्फोलॉजी आपल्याला हे समजून घेण्यास अनुमती देऊ शकते की आतड्यातील मायक्रोबायोटा त्याच्या समुदायांची रचना कशी करतो आणि सहक्रियात्मकपणे सूक्ष्मजीव चयापचय (उदा., शॉर्ट-चेन फॅटी अॅसिड) तयार करतो जे बेसल क्रिप्ट्समध्ये सेल्युलर संघटना आणि स्टेम सेल कोनाडे आकार देतात. ही वैशिष्ट्ये केवळ तेव्हाच प्रदर्शित केली जाऊ शकतात जेव्हा 3D एपिथेलियल थर इन विट्रो स्थापित केले जातात.
3D आतड्यांसंबंधी उपकला संरचना तयार करण्याच्या आमच्या पद्धतीव्यतिरिक्त, अनेक इन विट्रो पद्धती आहेत. आतड्यांसंबंधी ऑर्गनॉइड कल्चर ही एक अत्याधुनिक ऊती अभियांत्रिकी तंत्र आहे जी विशिष्ट मॉर्फोजेन परिस्थितीत आतड्यांसंबंधी स्टेम पेशींच्या लागवडीवर आधारित आहे23,24,25. तथापि, वाहतूक विश्लेषण किंवा होस्ट-मायक्रोबायोम सह-संस्कृतींसाठी 3D ऑर्गनॉइड मॉडेल्सचा वापर अनेकदा आव्हानात्मक असतो कारण आतड्यांसंबंधी लुमेन ऑर्गनॉइडमध्ये बंद असते आणि म्हणूनच, सूक्ष्मजीव पेशी किंवा बाह्य प्रतिजन सारख्या ल्युमिनल घटकांचा परिचय मर्यादित असतो. मायक्रोइंजेक्टर वापरून ऑर्गनॉइड लुमेनमध्ये प्रवेश सुधारला जाऊ शकतो,26,27 परंतु ही पद्धत आक्रमक आणि श्रम-केंद्रित आहे आणि त्यासाठी विशेष ज्ञान आवश्यक आहे. शिवाय, स्थिर परिस्थितीत हायड्रोजेल स्कॅफोल्डमध्ये राखलेले पारंपारिक ऑर्गनॉइड कल्चर व्हिव्हो बायोमेकॅनिक्समध्ये सक्रियपणे प्रतिबिंबित करत नाहीत.
अनेक संशोधन गटांनी वापरलेले इतर दृष्टिकोन जेल पृष्ठभागावरील वेगळ्या मानवी आतड्यांसंबंधी पेशींचे संवर्धन करून आतड्याच्या उपकला संरचनेची नक्कल करण्यासाठी प्रीस्ट्रक्चर्ड 3D हायड्रोजेल स्कॅफोल्ड्सचा वापर करतात. 3D-प्रिंटेड, मायक्रो-मिल्ड किंवा लिथोग्राफिकली फॅब्रिकेटेड मोल्ड्स वापरून हायड्रोजेल स्कॅफोल्ड्स बनवा. ही पद्धत शारीरिकदृष्ट्या संबंधित मॉर्फोजेन ग्रेडियंट्ससह विट्रोमध्ये वेगळ्या उपकला पेशींची स्वयं-व्यवस्थित व्यवस्था दर्शवते, स्कॅफोल्डमध्ये स्ट्रोमल पेशींचा समावेश करून उच्च आस्पेक्ट रेशो एपिथेलियल स्ट्रक्चर आणि स्ट्रोमा-एपिथेलियल क्रॉसटॉक स्थापित करते. तथापि, प्रीस्ट्रक्चर्ड स्कॅफोल्ड्सचे स्वरूप उत्स्फूर्त मॉर्फोजेनेटिक प्रक्रियेचे प्रदर्शन रोखू शकते. हे मॉडेल डायनॅमिक ल्युमिनल किंवा इंटरस्टिशियल फ्लो देखील प्रदान करत नाहीत, ज्यामुळे आतड्यांसंबंधी पेशींना मॉर्फोजेनेसिसमधून जाण्यासाठी आणि शारीरिक कार्य मिळविण्यासाठी आवश्यक असलेल्या द्रव कातरण्याच्या ताणाचा अभाव असतो. अलीकडील आणखी एका अभ्यासात मायक्रोफ्लुइडिक प्लॅटफॉर्ममध्ये हायड्रोजेल स्कॅफोल्ड्स आणि लेसर-एचिंग तंत्रांचा वापर करून पॅटर्न केलेल्या आतड्यांसंबंधी उपकला संरचनांचा वापर केला गेला. माऊस आतड्यांसंबंधी ऑर्गेनॉइड्स आतड्यांसंबंधी ट्यूबलर स्ट्रक्चर्स तयार करण्यासाठी एचेड पॅटर्नचे अनुसरण करतात आणि मायक्रोफ्लुइडिक्स वापरून इंट्राल्युमिनल फ्लुइड फ्लो रिकॅपिट्युलेट केले जाऊ शकतात. मॉड्यूल. तथापि, हे मॉडेल उत्स्फूर्त मॉर्फोजेनेटिक प्रक्रिया प्रदर्शित करत नाही किंवा आतड्यांमधील यांत्रिक हालचालींचा समावेश करत नाही. त्याच गटातील 3D प्रिंटिंग तंत्रे उत्स्फूर्त मॉर्फोजेनेटिक प्रक्रियांसह सूक्ष्म आतड्यांतील नळ्या तयार करण्यास सक्षम होती. ट्यूबमध्ये वेगवेगळ्या आतड्यांतील विभागांची जटिल निर्मिती असूनही, या मॉडेलमध्ये ल्युमिनल फ्लुइड फ्लो आणि यांत्रिक विकृतीचाही अभाव आहे. याव्यतिरिक्त, मॉडेलची कार्यक्षमता मर्यादित असू शकते, विशेषतः बायोप्रिंटिंग प्रक्रिया पूर्ण झाल्यानंतर, प्रायोगिक परिस्थिती किंवा पेशी-ते-पेशी परस्परसंवादांना त्रासदायक बनवते. त्याऐवजी, आमचा प्रस्तावित प्रोटोकॉल उत्स्फूर्त आतड्यांचे मॉर्फोजेनेसिस, शारीरिकदृष्ट्या संबंधित कातरणे ताण, आतड्याच्या गतिशीलतेची नक्कल करणारे बायोमेकॅनिक्स, स्वतंत्र एपिकल आणि बेसोलेटरल कंपार्टमेंटची प्रवेशयोग्यता आणि मॉड्यूलरिटीच्या जटिल जैविक सूक्ष्म वातावरणाची पुनर्निर्मिती प्रदान करतो. म्हणून, आमचा इन विट्रो 3D मॉर्फोजेनेसिस प्रोटोकॉल विद्यमान पद्धतींच्या आव्हानांवर मात करण्यासाठी एक पूरक दृष्टिकोन प्रदान करू शकतो.
आमचा प्रोटोकॉल पूर्णपणे 3D एपिथेलियल मॉर्फोजेनेसिसवर केंद्रित आहे, ज्यामध्ये कल्चरमध्ये फक्त एपिथेलियल पेशी आहेत आणि मेसेन्कायमल पेशी, एंडोथेलियल पेशी आणि रोगप्रतिकारक पेशी यासारख्या इतर प्रकारच्या आसपासच्या पेशी नाहीत. आधी वर्णन केल्याप्रमाणे, आमच्या प्रोटोकॉलचा गाभा म्हणजे सादर केलेल्या माध्यमाच्या बेसोलॅटरल बाजूला स्रावित मॉर्फोजेन इनहिबिटर काढून टाकून एपिथेलियल मॉर्फोजेनेसिसचे प्रेरण. आमच्या आतड्यांवरील-ऑन-ए-चिप आणि हायब्रिड-ऑन-ए-चिपची मजबूत मॉड्यूलॅरिटी आम्हाला लहरी 3D एपिथेलियल थर पुन्हा तयार करण्यास अनुमती देते, परंतु एपिथेलियल-मेसेन्कायमल परस्परसंवाद 33,34, एक्स्ट्रासेल्युलर मॅट्रिक्स (ECM) डिपॉझिशन 35 आणि आमच्या मॉडेलमध्ये, बेसल क्रिप्ट्समध्ये स्टेम सेल निचेस पोहोचवणारी क्रिप्ट-व्हिलस वैशिष्ट्ये यासारख्या अतिरिक्त जैविक गुंतागुंतींचा विचार करणे बाकी आहे. मेसेन्कायममधील स्ट्रोमल पेशी (उदा., फायब्रोब्लास्ट्स) ECM प्रथिनांच्या निर्मितीमध्ये आणि विवोमध्ये आतड्यांसंबंधी मॉर्फोजेनेसिसच्या नियमनात महत्त्वाची भूमिका बजावतात35,37,38. आमच्या मॉडेलमध्ये मेसेन्कायमल पेशी जोडल्याने वाढ झाली मॉर्फोजेनेटिक प्रक्रिया आणि पेशी जोडणी कार्यक्षमता. आतड्याच्या सूक्ष्म वातावरणात आण्विक वाहतूक39 आणि रोगप्रतिकारक पेशी भरती40 नियंत्रित करण्यात एंडोथेलियल थर (म्हणजेच, केशिका किंवा लिम्फॅटिक्स) महत्त्वाची भूमिका बजावते. शिवाय, जेव्हा ऊतींचे मॉडेल बहु-अवयव परस्परसंवाद प्रदर्शित करण्यासाठी डिझाइन केले जातात तेव्हा ऊती मॉडेल्समध्ये जोडले जाऊ शकणारे रक्तवहिन्यासंबंधी घटक एक पूर्व-आवश्यकता असतात. म्हणून, अवयव-स्तरीय रिझोल्यूशनसह अधिक अचूक शारीरिक वैशिष्ट्ये मॉडेल करण्यासाठी एंडोथेलियल पेशींचा समावेश करणे आवश्यक असू शकते. आतड्यांसंबंधी रोगाची नक्कल करण्याच्या संदर्भात जन्मजात रोगप्रतिकारक प्रतिक्रिया, प्रतिजन सादरीकरण, जन्मजात अनुकूली रोगप्रतिकारक क्रॉसटॉक आणि ऊती-विशिष्ट प्रतिकारशक्ती प्रदर्शित करण्यासाठी रुग्ण-व्युत्पन्न रोगप्रतिकारक पेशी देखील आवश्यक आहेत.
हायब्रिड चिप्सचा वापर गट-ऑन-अ-चिपपेक्षा अधिक सोपा आहे कारण डिव्हाइस सेटअप सोपे आहे आणि ट्रान्सवेल इन्सर्टचा वापर आतड्याच्या एपिथेलियमचे स्केलेबल कल्चर करण्यास अनुमती देतो. तथापि, पॉलिस्टर मेम्ब्रेनसह व्यावसायिकरित्या उपलब्ध ट्रान्सवेल इन्सर्ट लवचिक नसतात आणि पेरिस्टाल्टिकसारख्या हालचालींचे अनुकरण करू शकत नाहीत. शिवाय, हायब्रिड चिपमध्ये ठेवलेल्या ट्रान्सवेल इन्सर्टचा एपिकल कंपार्टमेंट एपिकल बाजूला कोणत्याही कातरण्याच्या ताणाशिवाय स्थिर राहिला. स्पष्टपणे, एपिकल कंपार्टमेंटमधील स्थिर गुणधर्म हायब्रिड चिप्समध्ये दीर्घकालीन बॅक्टेरिया सह-संस्कृतीला क्वचितच सक्षम करतात. हायब्रिड चिप्स वापरताना आपण ट्रान्सवेल इन्सर्टमध्ये 3D मॉर्फोजेनेसिसला मजबूतपणे प्रेरित करू शकतो, परंतु शारीरिकदृष्ट्या संबंधित बायोमेकॅनिक्स आणि एपिकल फ्लुइड फ्लोची कमतरता संभाव्य अनुप्रयोगांसाठी हायब्रिड चिप प्लॅटफॉर्मची व्यवहार्यता मर्यादित करू शकते.
आतड्यांवरील अवयव आणि संकरित-ऑन-ए-चिप संस्कृतींमध्ये मानवी क्रिप्ट-व्हिलस अक्षाची पूर्ण-प्रमाणात पुनर्बांधणी पूर्णपणे स्थापित केलेली नाही. मॉर्फोजेनेसिस एपिथेलियल मोनोलेयरपासून सुरू होत असल्याने, 3D मायक्रोआर्किटेक्चर्स आवश्यकतेने क्रिप्ट्स इन व्हिव्होशी मॉर्फोलॉजिकल समानता प्रदान करत नाहीत. जरी आम्ही मायक्रोइंजिनिअर्ड 3D एपिथेलियममध्ये बेसल क्रिप्ट डोमेनजवळ वाढत्या पेशींच्या संख्येचे वर्णन केले असले तरी, क्रिप्ट आणि विलस प्रदेश स्पष्टपणे सीमांकित केलेले नव्हते. जरी चिपवरील उच्च वरच्या चॅनेलमुळे मायक्रोइंजिनिअर्ड एपिथेलियमची उंची वाढते, तरीही कमाल उंची ~300-400 µm पर्यंत मर्यादित आहे. लहान आणि मोठ्या आतड्यांमधील मानवी आतड्यांसंबंधी क्रिप्ट्सची वास्तविक खोली अनुक्रमे ~135 µm आणि ~400 µm आहे आणि लहान आतड्यांसंबंधी विलीची उंची ~600 µm41 आहे.
इमेजिंगच्या दृष्टिकोनातून, 3D मायक्रोआर्किटेक्चरचे इन सिटू सुपर-रेझोल्यूशन इमेजिंग चिपवरील आतड्यांपुरते मर्यादित असू शकते, कारण ऑब्जेक्टिव्ह लेन्सपासून एपिथेलियल लेयरपर्यंतचे आवश्यक कार्य अंतर काही मिलिमीटरच्या क्रमाने असते. या समस्येवर मात करण्यासाठी, दूरच्या ऑब्जेक्टिव्हची आवश्यकता असू शकते. शिवाय, PDMS च्या उच्च लवचिकतेमुळे इमेजिंग नमुना तयार करण्यासाठी पातळ विभाग बनवणे आव्हानात्मक आहे. शिवाय, चिपवरील आतड्याच्या थर-दर-थर मायक्रोफॅब्रिकेशनमध्ये प्रत्येक थरामध्ये कायमचे चिकटणे समाविष्ट असल्याने, एपिथेलियल लेयरच्या पृष्ठभागाच्या संरचनेचे परीक्षण करण्यासाठी वरचा थर उघडणे किंवा काढून टाकणे अत्यंत आव्हानात्मक आहे. उदाहरणार्थ, स्कॅनिंग इलेक्ट्रॉन मायक्रोस्कोप (SEM) वापरून.
हायड्रोफोबिक लहान रेणूंशी संबंधित मायक्रोफ्लुइडिक-आधारित अभ्यासांमध्ये PDMS ची हायड्रोफोबिसिटी हा एक मर्यादित घटक आहे, कारण PDMS अशा हायड्रोफोबिक रेणूंना विशिष्टपणे शोषून घेऊ शकत नाही. इतर पॉलिमरिक पदार्थांसह PDMS चे पर्याय विचारात घेतले जाऊ शकतात. पर्यायी म्हणून, PDMS च्या पृष्ठभागावरील बदल (उदा. लिपोफिलिक पदार्थ 42 किंवा पॉली(इथिलीन ग्लायकॉल) 43 सह लेप) हायड्रोफोबिक रेणूंचे शोषण कमी करण्यासाठी विचारात घेतले जाऊ शकते.
शेवटी, उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग किंवा "एक-आकार-फिट-सर्व" वापरकर्ता-अनुकूल प्रायोगिक प्लॅटफॉर्म प्रदान करण्याच्या बाबतीत आमची पद्धत चांगली वैशिष्ट्यीकृत केलेली नाही. सध्याच्या प्रोटोकॉलमध्ये प्रत्येक मायक्रोडिव्हाइससाठी सिरिंज पंप आवश्यक आहे, जो CO2 इनक्यूबेटरमध्ये जागा घेतो आणि मोठ्या प्रमाणात प्रयोगांना प्रतिबंधित करतो. ही मर्यादा नाविन्यपूर्ण कल्चर फॉरमॅट्सच्या स्केलेबिलिटीद्वारे लक्षणीयरीत्या सुधारली जाऊ शकते (उदा., 24-वेल, 96-वेल, किंवा 384-वेल सच्छिद्र इन्सर्ट जे सतत पुन्हा भरण्याची आणि बेसोलॅटरल मीडिया काढून टाकण्याची परवानगी देतात).
मानवी आतड्यांसंबंधी एपिथेलियमचे 3D मॉर्फोजेनेसिस इन विट्रोमध्ये करण्यासाठी, आम्ही लुमेन-केशिका इंटरफेस तयार करण्यासाठी दोन समांतर मायक्रोचॅनेल आणि त्यांच्यामध्ये एक लवचिक सच्छिद्र पडदा असलेले मायक्रोफ्लुइडिक चिप इंटेस्टिनल डिव्हाइस वापरले. आम्ही ट्रान्सवेल इन्सर्टवर वाढलेल्या ध्रुवीकृत एपिथेलियल थरांखाली सतत बेसोलेटरल प्रवाह प्रदान करणारे सिंगल-चॅनेल मायक्रोफ्लुइडिक डिव्हाइस (एक हायब्रिड चिप) वापरण्याचे देखील प्रात्यक्षिक करतो. दोन्ही प्लॅटफॉर्ममध्ये, बेसोलेटरल कंपार्टमेंटमधून मॉर्फोजेन विरोधी काढून टाकण्यासाठी प्रवाहाचे दिशात्मक हाताळणी लागू करून विविध मानवी आतड्यांसंबंधी एपिथेलियल पेशींचे मॉर्फोजेनेसिस प्रदर्शित केले जाऊ शकते. संपूर्ण प्रायोगिक प्रक्रियेत (आकृती 1) पाच भाग असतात: (i) आतड्यांसंबंधी चिप किंवा ट्रान्सवेल इन्सर्टेबल हायब्रिड चिपचे मायक्रोफॅब्रिकेशन (पायरी 1-5; बॉक्स 1), (ii) आतड्यांसंबंधी एपिथेलियल पेशी (कॅको-2 पेशी) किंवा मानवी आतड्यांसंबंधी ऑर्गेनॉइड्स तयार करणे; बॉक्स २-५), (iii) आतड्यांसंबंधी चिप्स किंवा हायब्रिड चिप्सवर आतड्यांसंबंधी एपिथेलियल पेशींचे कल्चर (पायरी ६-९), (iv) ३D एपिथेलियल मायक्रोस्ट्रक्चरचे वैशिष्ट्यीकृत करण्यासाठी इन विट्रोमध्ये ३D मॉर्फोजेनेसिसचे प्रेरण (पायरी १०) आणि (v)) (पायरी ११-२४). शेवटी, एपिथेलियल मॉर्फोजेनेसिसची स्थानिक, ऐहिक, सशर्त किंवा प्रक्रियात्मक नियंत्रणांशी तुलना करून इन विट्रो मॉर्फोजेनेसिसची प्रभावीता प्रमाणित करण्यासाठी एक योग्य नियंत्रण गट (खाली चर्चा केली आहे) तयार करण्यात आला.
आम्ही दोन वेगवेगळ्या कल्चर प्लॅटफॉर्मचा वापर केला: सरळ चॅनेल किंवा नॉनलाइनर कॉन्व्होल्युटेड चॅनेलसह गट-ऑन-अ-चिप, किंवा मायक्रोफ्लुइडिक डिव्हाइसमध्ये ट्रान्सवेल (TW) इन्सर्ट असलेले हायब्रिड चिप्स, बॉक्स 1 आणि चरण 1 -5 मध्ये वर्णन केल्याप्रमाणे तयार केले गेले आहेत. "डिव्हाइस फॅब्रिकेशन" एकल चिप किंवा हायब्रिड चिप बनवण्याचे मुख्य टप्पे दाखवते. "मानवी आतड्यांसंबंधी एपिथेलियल सेल्सची संस्कृती" या प्रोटोकॉलमध्ये वापरल्या जाणाऱ्या पेशी स्रोत (कॅको-2 किंवा मानवी आतड्यांसंबंधी ऑर्गेनॉइड्स) आणि कल्चर प्रक्रियेचे स्पष्टीकरण देते." इन विट्रो मॉर्फोजेनेसिस" एकूण टप्पे दाखवते ज्यामध्ये कॅको-2 किंवा ऑर्गेनॉइड-व्युत्पन्न उपकला पेशी आतड्यांसंबंधी चिपवर किंवा हायब्रिड चिपच्या ट्रान्सवेल इन्सर्टवर संवर्धित केल्या जातात, त्यानंतर 3D मॉर्फोजेनेसिसचा समावेश होतो आणि वैशिष्ट्यीकृत उपकला रचना तयार केली जाते. प्रत्येक बाणाच्या खाली प्रोग्राम स्टेप नंबर किंवा बॉक्स नंबर प्रदर्शित केला जातो. अॅप्लिकेशन स्थापित आतड्यांसंबंधी उपकला थर कसे वापरले जाऊ शकतात याची उदाहरणे प्रदान करते, उदाहरणार्थ, पेशी भिन्नता वैशिष्ट्यीकरण, आतड्यांचे शरीरविज्ञान अभ्यास, होस्ट-मायक्रोबायोम इकोसिस्टमची स्थापना आणि रोग मॉडेलिंगमध्ये. इम्युनोफ्लोरेसेन्स प्रतिमा "सेल डिफरेंशिएशन" मध्ये आतड्याच्या चिपवर निर्माण होणाऱ्या 3D Caco-2 एपिथेलियल लेयरमध्ये व्यक्त केलेले न्यूक्ली, F-अ‍ॅक्टिन आणि MUC2 दर्शविले आहे. MUC2 सिग्नलिंग गॉब्लेट पेशी आणि श्लेष्माच्या पृष्ठभागावरून स्रावित होणाऱ्या श्लेष्मामध्ये असते. आतड्याच्या शरीरक्रियाविज्ञानातील फ्लोरोसेंट प्रतिमा फ्लोरोसेंट गहू जंतू अ‍ॅग्ग्लुटिनिन वापरून सियालिक अॅसिड आणि N-एसिटिलग्लुकोसामाइन अवशेषांसाठी स्टेनिंगद्वारे तयार होणारे श्लेष्मा दर्शवितात. "होस्ट-मायक्रोब को-कल्चर्स" मधील दोन ओव्हरलॅपिंग प्रतिमा चिपवर आतड्यात प्रतिनिधी होस्ट-मायक्रोबायोम सह-संस्कृती दर्शवितात. डावे पॅनेल मायक्रोइंजिनिअर्ड 3D Caco-2 एपिथेलियल पेशींसह हिरव्या फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) व्यक्त करणारे E. coli चे सह-संस्कृती दर्शविते. उजवे पॅनेल 3D Caco-2 एपिथेलियल पेशींसह सह-संस्कृती केलेले GFP E. coli चे स्थानिकीकरण दर्शविते, त्यानंतर F-अ‍ॅक्टिन (लाल) आणि न्यूक्ली (निळा) सह इम्युनोफ्लोरेसेन्स स्टेनिंग दर्शविते. रोग मॉडेलिंग बॅक्टेरियाच्या प्रतिजनांसह शारीरिक आव्हानाखाली आतड्याच्या जळजळ चिप्समध्ये निरोगी विरुद्ध गळती होणारे आतडे दर्शवते (उदा., लिपोपॉलिसॅकराइड, LPS) आणि रोगप्रतिकारक शक्तीसह पेशी (उदा., PBMC; हिरवे). 3D एपिथेलियल लेयर स्थापित करण्यासाठी Caco-2 पेशींचे संवर्धन करण्यात आले.स्केल बार, 50 µm. खालच्या ओळीतील प्रतिमा: संदर्भाच्या परवानगीने रूपांतरित "पेशींचे भेद".2. ऑक्सफर्ड युनिव्हर्सिटी प्रेस; संदर्भाच्या परवानगीने पुनरुत्पादित.5. NAS; "होस्ट-मायक्रोब को-कल्चर" संदर्भाच्या परवानगीने रूपांतरित.3. NAS; "रोग मॉडेलिंग" संदर्भाच्या परवानगीने रूपांतरित.5. NAS.
गट-ऑन-चिप आणि हायब्रिड चिप्स दोन्ही PDMS प्रतिकृती वापरून तयार करण्यात आल्या होत्या ज्या सिलिकॉन मोल्ड्सपासून सॉफ्ट लिथोग्राफी1,44 द्वारे डिमॉल्ड केल्या गेल्या होत्या आणि SU-8 सह पॅटर्न केल्या गेल्या होत्या. प्रत्येक चिपमधील मायक्रोचॅनेलची रचना शीअर स्ट्रेस आणि हायड्रोडायनामिक प्रेशर1,4,12 सारख्या हायड्रोडायनामिक्सचा विचार करून निश्चित केली जाते. मूळ गट-ऑन-ए-चिप डिझाइन (विस्तारित डेटा आकृती 1a), ज्यामध्ये दोन जोडलेल्या समांतर सरळ मायक्रोचॅनेलचा समावेश होता, तो एका जटिल गट-ऑन-ए-चिप (विस्तारित डेटा आकृती 1b) मध्ये विकसित झाला आहे ज्यामध्ये वाढलेला द्रव निवास वेळ, नॉनलाइनर फ्लो पॅटर्न आणि कल्चर्ड पेशींचे बहुअक्षीय विकृतीकरण प्रेरित करण्यासाठी वक्र मायक्रोचॅनेलची जोडी समाविष्ट आहे (आकृती 2a-f) 12. जेव्हा अधिक जटिल गट बायोमेकॅनिक्स पुन्हा तयार करण्याची आवश्यकता असते, तेव्हा जटिल गट-ऑन-ए-चिप निवडल्या जाऊ शकतात. आम्ही दाखवून दिले आहे की कंव्होल्युटेड गट-चिप देखील समान प्रमाणात एपिथेलियलसह समान वेळेच्या फ्रेममध्ये 3D मॉर्फोजेनेसिसला जोरदारपणे प्रेरित करते. मूळ गट-चिपच्या तुलनेत वाढ, कल्चर्ड पेशी प्रकाराकडे दुर्लक्ष करून. म्हणून, 3D मॉर्फोजेनेसिस प्रेरित करण्यासाठी, रेषीय आणि जटिल ऑन-चिप आतड्यांचे डिझाइन अदलाबदल करण्यायोग्य आहेत. SU-8 नमुन्यांसह सिलिकॉन मोल्डवर बरे केलेल्या PDMS प्रतिकृतींनी डिमोल्डिंगनंतर नकारात्मक वैशिष्ट्ये प्रदान केली (आकृती 2a). चिपवर आतडे तयार करण्यासाठी, तयार केलेला वरचा PDMS थर क्रमाक्रमाने सच्छिद्र PDMS फिल्मशी जोडला गेला आणि नंतर कोरोना ट्रीटर (आकृती 2b-f) वापरून अपरिवर्तनीय बंधनाद्वारे खालच्या PDMS थराशी संरेखित केला गेला. हायब्रिड चिप्स तयार करण्यासाठी, बरे केलेल्या PDMS प्रतिकृती काचेच्या स्लाईड्सशी जोडल्या गेल्या ज्यामुळे ट्रान्सवेल इन्सर्ट सामावून घेऊ शकणारे सिंगल-चॅनेल मायक्रोफ्लुइडिक डिव्हाइस तयार केले गेले (आकृती 2h आणि विस्तारित डेटा आकृती 2). बाँडिंग प्रक्रिया PDMS प्रतिकृती आणि काचेच्या पृष्ठभागावर ऑक्सिजन प्लाझ्मा किंवा कोरोना उपचाराने उपचार करून केली जाते. सिलिकॉन ट्यूबला जोडलेल्या मायक्रोफॅब्रिकेटेड डिव्हाइसचे निर्जंतुकीकरण केल्यानंतर, डिव्हाइस सेटअप आतड्यांसंबंधी एपिथेलियमचे 3D मॉर्फोजेनेसिस करण्यासाठी तयार होते (आकृती 2g).
a, SU-8 पॅटर्न असलेल्या सिलिकॉन मोल्ड्सपासून PDMS भाग तयार करण्याचे योजनाबद्ध चित्रण. न बरे केलेले PDMS द्रावण सिलिकॉन मोल्डवर (डावीकडे) ओतले गेले, 60 °C (मध्यम) वर बरे केले गेले आणि (उजवीकडे) डिमोल्ड केले गेले. डिमोल्ड केलेले PDMS तुकडे करून पुढील वापरासाठी स्वच्छ केले गेले.b, PDMS वरचा थर तयार करण्यासाठी वापरल्या जाणाऱ्या सिलिकॉन मोल्डचे छायाचित्र.c, PDMS सच्छिद्र पडदा तयार करण्यासाठी वापरल्या जाणाऱ्या सिलिकॉन मोल्डचे छायाचित्र.d, वरच्या आणि खालच्या PDMS घटकांच्या छायाचित्रांची मालिका आणि एकत्रित केलेल्या ऑन-चिप आतड्यांसंबंधी उपकरण.e, वरच्या, पडदा आणि खालच्या PDMS घटकांच्या संरेखनाची योजनाबद्ध.प्रत्येक थर प्लाझ्मा किंवा कोरोना उपचारांद्वारे अपरिवर्तनीयपणे जोडलेला असतो.f, सुपरइम्पोज्ड कॉन्व्होल्युटेड मायक्रोचॅनेल आणि व्हॅक्यूम चेंबर्ससह बनावटी आतड्यांवरील उपकरणाची योजनाबद्ध.g, मायक्रोफ्लुइडिक सेल कल्चरसाठी गट-ऑन-ए-चिपची स्थापना. सिलिकॉन ट्यूब आणि सिरिंजसह एकत्रित केलेल्या चिपवरील बनावटी आतडे कव्हरस्लिपवर ठेवण्यात आले होते. चिप डिव्हाइसवर ठेवण्यात आले होते प्रक्रियेसाठी १५० मिमी पेट्री डिशचे झाकण. सिलिकॉन ट्यूब बंद करण्यासाठी बाईंडरचा वापर केला जातो. हायब्रिड चिप्स वापरून हायब्रिड चिप फॅब्रिकेशन आणि ३डी मॉर्फोजेनेसिसचे व्हिज्युअल स्नॅपशॉट्स. आतड्यांसंबंधी ३डी मॉर्फोजेनेसिस प्रेरित करण्यासाठी आतड्यांसंबंधी एपिथेलियल पेशींचे २डी मोनोलेयर्स कल्चर करण्यासाठी स्वतंत्रपणे तयार केलेले ट्रान्सवेल इन्सर्ट हायब्रिड चिपमध्ये घातले गेले. ट्रान्सवेल इन्सर्टवर स्थापित केलेल्या सेल लेयरच्या खाली मायक्रोचॅनेलद्वारे माध्यम परफ्यूज केले जाते.स्केल बार, १ सेमी.एच संदर्भाच्या परवानगीने पुनर्मुद्रित.४. एल्सेव्हियर.
या प्रोटोकॉलमध्ये, कॅको-२ सेल लाइन आणि आतड्यांसंबंधी ऑर्गेनॉइड्सचा वापर एपिथेलियल स्रोत म्हणून करण्यात आला (आकृती ३अ). दोन्ही प्रकारच्या पेशी स्वतंत्रपणे कल्चर केल्या गेल्या (बॉक्स २ आणि बॉक्स ५) आणि ऑन-चिप गट किंवा ट्रान्सवेल इन्सर्टच्या ECM-लेपित मायक्रोचॅनेलमध्ये बीज करण्यासाठी वापरल्या गेल्या. जेव्हा पेशी संगमित असतात (> फ्लास्कमध्ये ९५% कव्हरेज), तेव्हा टी-फ्लास्कमध्ये नियमितपणे कल्चर केलेल्या कॅको-२ पेशी (पॅसेज १० आणि ५० दरम्यान) ट्रायप्सिनायझेशन फ्लुइड (बॉक्स २) द्वारे विघटित सेल सस्पेंशन तयार करण्यासाठी काढल्या जातात. स्ट्रक्चरल सूक्ष्म पर्यावरणाला आधार देण्यासाठी आतड्यांसंबंधी बायोप्सी किंवा सर्जिकल रिसेक्शनमधून मानवी आतड्यांसंबंधी ऑर्गेनॉइड्स मॅट्रिजेल स्कॅफोल्ड डोममध्ये २४-वेल प्लेट्समध्ये कल्चर केले गेले. आवश्यक मॉर्फोजेन (जसे की Wnt, R-स्पॉन्डिन आणि नोगिन) असलेले मध्यम आणि बॉक्स ३ मध्ये वर्णन केल्याप्रमाणे तयार केलेले वाढ घटक ऑर्गेनॉइड्स ~५०० µm व्यासापर्यंत वाढेपर्यंत दर दुसऱ्या दिवशी पूरक केले गेले. पूर्णपणे वाढलेले ऑर्गेनॉइड्स कापले जातात आणि आतड्यात किंवा चिपवरील ट्रान्सवेल इन्सर्टमध्ये बीजारोपण करण्यासाठी एकल पेशींमध्ये विभाजित केले जाते (बॉक्स 5). जसे आपण आधी नोंदवले आहे, रोगाच्या प्रकारानुसार ते वेगळे केले जाऊ शकते12,13 (उदा. अल्सरेटिव्ह कोलायटिस, क्रोहन रोग, कोलोरेक्टल कर्करोग, किंवा सामान्य दाता), जखमेची जागा (उदा., जखम विरुद्ध नॉन-जखम क्षेत्र) आणि ट्रॅक्टमधील गॅस्ट्रोइंटेस्टाइनल स्थान (उदा., ड्युओडेनम, जेजुनम, इलियम, सेकम, कोलन किंवा गुदाशय). आम्ही कोलोनिक ऑर्गेनॉइड्स (कोलॉइड्स) संवर्धनासाठी बॉक्स 5 मध्ये एक ऑप्टिमाइझ्ड प्रोटोकॉल प्रदान करतो ज्यांना सामान्यतः लहान आतड्यांतील ऑर्गेनॉइड्सपेक्षा मॉर्फोजेनची जास्त सांद्रता आवश्यक असते.
a, आतड्याच्या चिपमध्ये आतड्याच्या मॉर्फोजेनेसिसच्या प्रेरणासाठी कार्यप्रवाह. या प्रोटोकॉलमध्ये 3D मॉर्फोजेनेसिस प्रदर्शित करण्यासाठी Caco-2 मानवी आतड्याच्या एपिथेलियम आणि आतड्यांसंबंधी ऑर्गेनॉइड्सचा वापर केला जातो. वेगळ्या उपकला पेशी तयार केलेल्या आतड्याच्या-ऑन-ए-चिप उपकरणात (चिप तयारी) बीजित केल्या गेल्या. एकदा पेशी 0 (D0) दिवशी PDMS सच्छिद्र पडद्याशी सीड (सीड) केल्या गेल्या आणि जोडल्या गेल्या (जोडल्या गेल्या), पहिल्या 2 दिवसांसाठी एपिकल (AP) प्रवाह सुरू केला जातो आणि राखला जातो (प्रवाह, AP, D0-D2). जेव्हा संपूर्ण 2D मोनोलेयर तयार होतो तेव्हा चक्रीय स्ट्रेचिंग हालचाली (स्ट्रेच, फ्लो, AP आणि BL) सोबत बेसोलॅटरल (BL) प्रवाह देखील सुरू केला जातो. मायक्रोफ्लुइडिक कल्चरच्या 5 दिवसांनंतर आतड्यांसंबंधी 3D मॉर्फोजेनेसिस उत्स्फूर्तपणे घडले (मॉर्फोजेनेसिस, D5). फेज कॉन्ट्रास्ट प्रतिमा प्रत्येक प्रायोगिक चरण किंवा वेळेच्या बिंदूवर (बार ग्राफ, 100 µm) Caco-2 पेशींचे प्रतिनिधी आकारविज्ञान दर्शवितात. आतड्याच्या मॉर्फोजेनेसिसच्या संबंधित कॅस्केड दर्शविणारे चार योजनाबद्ध आकृत्या (शीर्ष) उजवीकडे). स्कीमॅटिकमधील डॅश केलेले बाण द्रव प्रवाहाची दिशा दर्शवतात.b, स्थापित 3D Caco-2 एपिथेलियम (डावीकडे) च्या पृष्ठभागाच्या टोपोलॉजी दर्शविणारी SEM प्रतिमा. मॅग्निफाइड एरिया (पांढरा डॅश केलेला बॉक्स) हायलाइट करणारा इनसेट 3D Caco-2 लेयर (उजवीकडे) वर पुनर्जन्मित मायक्रोविली दर्शवितो.c, स्थापित Caco-2 3D, क्लॉडिन (ZO-1, लाल) आणि सतत ब्रश बॉर्डर झिल्लीचे क्षैतिज फ्रंटल व्ह्यू ज्यावर F-अ‍ॅक्टिन (हिरवा) आणि न्यूक्ली (निळा) लेबल केलेले आहे. आतड्यांसंबंधी चिप्सवरील एपिथेलियल पेशींचे इम्युनोफ्लोरेसेन्स कॉन्फोकल व्हिज्युअलायझेशन. मधल्या स्कीमॅटिककडे निर्देशित करणारे बाण प्रत्येक कॉन्फोकल व्ह्यूसाठी फोकल प्लेनचे स्थान दर्शवितात.d, दिवस 3, 7, 9, 11 आणि 13 रोजी फेज कॉन्ट्रास्ट मायक्रोस्कोपीद्वारे प्राप्त केलेल्या चिपवर कल्चर केलेल्या ऑर्गेनॉइड्समधील मॉर्फोलॉजिकल बदलांचा वेळ कोर्स. इनसेट (वर उजवीकडे) प्रदान केलेल्या प्रतिमेचे उच्च मॅग्निफिकेशन दर्शविते.e, दिवस 7.f वर घेतलेल्या स्लाइसवर आतड्यात स्थापित ऑर्गेनॉइड 3D एपिथेलियमचा DIC फोटोमायक्रोग्राफ, एपिथेलियल लेयरवर अनुक्रमे ३ दिवस आतड्याच्या चिप्सवर वाढलेल्या स्टेम सेल्स (LGR5; मॅजेन्टा), गॉब्लेट सेल्स (MUC2; हिरवे), F-अ‍ॅक्टिन (राखाडी) आणि न्यूक्ली (सियान) साठी मार्कर दर्शविणारे आच्छादित इम्युनोफ्लोरेसेन्स प्रतिमा (डावीकडे) आणि १३-दिवस (मध्यम) ऑर्गनॉइड्स. विस्तारित डेटा आकृती ३ देखील पहा, जो MUC2 सिग्नलिंगशिवाय LGR5 सिग्नलिंग हायलाइट करतो. कल्चरच्या १३ व्या दिवशी सेलमास्क डाई (उजवीकडे) सह प्लाझ्मा मेम्ब्रेनला रंग देऊन चिपवर आतड्यात स्थापित केलेल्या 3D ऑर्गनॉइड एपिथेलियमची एपिथेलियल मायक्रोस्ट्रक्चर (उजवीकडे) दर्शविणारी फ्लोरोसेन्स प्रतिमा. अन्यथा सांगितले नसल्यास स्केल बार ५० μm आहे.b संदर्भाच्या परवानगीने पुनर्मुद्रित.२. ऑक्सफर्ड युनिव्हर्सिटी प्रेस; c संदर्भाच्या परवानगीने रूपांतरित.२. ऑक्सफर्ड युनिव्हर्सिटी प्रेस; e आणि f संदर्भाच्या परवानगीने रूपांतरित.१२ क्रिएटिव्ह कॉमन्स लायसन्स CC BY 4.0 अंतर्गत.
चिपवरील आतड्यात, यशस्वी ECM कोटिंगसाठी PDMS सच्छिद्र पडद्याच्या हायड्रोफोबिक पृष्ठभागावर बदल करणे आवश्यक आहे. या प्रोटोकॉलमध्ये, आम्ही PDMS पडद्याच्या हायड्रोफोबिसिटीमध्ये बदल करण्यासाठी दोन वेगवेगळ्या पद्धती लागू करतो. Caco-2 पेशींचे संवर्धन करण्यासाठी, PDMS पृष्ठभागाची हायड्रोफोबिसिटी कमी करण्यासाठी, ECM कोट करण्यासाठी आणि Caco-2 पेशी PDMS पडद्याशी जोडण्यासाठी केवळ UV/ओझोन उपचारांद्वारे पृष्ठभाग सक्रिय करणे पुरेसे होते. तथापि, ऑर्गेनॉइड एपिथेलियमच्या मायक्रोफ्लुइडिक कल्चरसाठी रासायनिक-आधारित पृष्ठभाग कार्यात्मकीकरण आवश्यक आहे जेणेकरून PDMS मायक्रोचॅनेलमध्ये पॉलीथिलीनिमाइन (PEI) आणि ग्लूटारल्डिहाइड अनुक्रमे लागू करून ECM प्रथिनांचे कार्यक्षम निक्षेपण साध्य होईल. पृष्ठभाग सुधारणेनंतर, कार्यात्मक PDMS पृष्ठभाग झाकण्यासाठी ECM प्रथिने जमा केली गेली आणि नंतर वेगळ्या ऑर्गेनॉइड एपिथेलियममध्ये आणली गेली. पेशी जोडल्यानंतर, पेशी पूर्ण मोनोलेयर तयार होईपर्यंत मायक्रोफ्लुइडिक सेल कल्चर फक्त माध्यमाला वरच्या मायक्रोचॅनेलमध्ये परफ्यूज करून सुरू होते, तर खालचा मायक्रोचॅनेल स्थिर स्थिती राखतो. पृष्ठभाग सक्रियकरण आणि ECM कोटिंगसाठी ही ऑप्टिमाइझ केलेली पद्धत ऑर्गेनॉइड एपिथेलियमच्या जोडणीला प्रेरित करण्यास सक्षम करते. पीडीएमएस पृष्ठभागावर 3D मॉर्फोजेनेसिस.
ट्रान्सवेल कल्चरमध्ये सेल सीडिंगपूर्वी ECM कोटिंगची देखील आवश्यकता असते; तथापि, ट्रान्सवेल कल्चरमध्ये सच्छिद्र इन्सर्टच्या पृष्ठभागास सक्रिय करण्यासाठी जटिल प्रीट्रीटमेंट चरणांची आवश्यकता नसते. ट्रान्सवेल इन्सर्टवर कॅको-२ पेशी वाढवण्यासाठी, सच्छिद्र इन्सर्टवरील ECM कोटिंग विलग केलेल्या कॅको-२ पेशींच्या जोडणीला (<१ तास) आणि घट्ट जंक्शन बॅरियर निर्मितीला (<१-२ दिवस) गती देते. ट्रान्सवेल इन्सर्टवरील कल्चर ऑर्गनॉइड्ससाठी, पृथक ऑर्गनॉइड्स ECM-लेपित इन्सर्टवर सीड केले जातात, पडद्याच्या पृष्ठभागावर जोडले जातात (<३ तास) आणि ऑर्गनॉइड्स बॅरियर अखंडतेसह संपूर्ण मोनोलेयर तयार होईपर्यंत राखले जातात. हायब्रिड चिप्सचा वापर न करता २४-वेल प्लेट्समध्ये ट्रान्सवेल कल्चर केले जातात.
स्थापित एपिथेलियल लेयरच्या बेसोलॅटरल पैलूवर द्रव प्रवाह लागू करून इन विट्रो 3D मॉर्फोजेनेसिस सुरू करता येते. चिपवरील आतड्यात, माध्यम वरच्या आणि खालच्या मायक्रोचॅनेलमध्ये परफ्यूज केले तेव्हा एपिथेलियल मॉर्फोजेनेसिस सुरू झाले (आकृती 3a). आधी वर्णन केल्याप्रमाणे, दिशात्मक स्रावित मॉर्फोजेन इनहिबिटर सतत काढून टाकण्यासाठी कनिष्ठ (बेसोलॅटरल) कंपार्टमेंटमध्ये द्रव प्रवाह सादर करणे महत्वाचे आहे. सच्छिद्र पडद्यावर बांधलेल्या पेशींना पुरेसे पोषक आणि सीरम प्रदान करण्यासाठी आणि ल्युमिनल शीअर स्ट्रेस निर्माण करण्यासाठी, आम्ही सामान्यतः चिपवर आतड्यात दुहेरी प्रवाह लागू करतो. हायब्रिड चिप्समध्ये, एपिथेलियल मोनोलेयर्स असलेले ट्रान्सवेल इन्सर्ट हायब्रिड चिप्समध्ये घातले गेले. नंतर, माध्यम मायक्रोचॅनेलद्वारे सच्छिद्र ट्रान्सवेल इन्सर्टच्या बेसोलॅटरल बाजूखाली लावले गेले. दोन्ही कल्चर प्लॅटफॉर्ममध्ये बेसोलॅटरल प्रवाह सुरू झाल्यानंतर 3-5 दिवसांनी आतड्यांसंबंधी मॉर्फोजेनेसिस झाले.
फेज कॉन्ट्रास्ट मायक्रोस्कोपी, डिफरेंशियल इंटरफेरन्स कॉन्ट्रास्ट (DIC) मायक्रोस्कोपी, SEM किंवा इम्युनोफ्लोरेसेन्स कॉन्फोकल मायक्रोस्कोपी (आकृती 3 आणि 4) यासह विविध इमेजिंग पद्धती लागू करून मायक्रोइंजिनिअर्ड 3D एपिथेलियल लेयर्सच्या आकारमानात्मक वैशिष्ट्यांचे विश्लेषण केले जाऊ शकते. 3D एपिथेलियल लेयर्सच्या आकार आणि प्रोट्र्यूशनचे निरीक्षण करण्यासाठी कल्चर दरम्यान कोणत्याही वेळी फेज कॉन्ट्रास्ट किंवा DIC इमेजिंग सहजपणे केले जाऊ शकते. PDMS आणि पॉलिस्टर फिल्म्सच्या ऑप्टिकल पारदर्शकतेमुळे, आतड्यांवरील आणि हायब्रिड चिप प्लॅटफॉर्म दोन्ही डिव्हाइसचे सेक्शनिंग किंवा डिससेम्ब्ली न करता रिअल-टाइम इन सिटू इमेजिंग प्रदान करू शकतात. इम्युनोफ्लोरेसेन्स इमेजिंग करताना (आकृती 1, 3c, f आणि 4b, c), पेशी सामान्यतः 4% (wt/vol) पॅराफॉर्मल्डिहाइड (PFA) सह निश्चित केल्या जातात, त्यानंतर ट्रायटन X-100 आणि 2% (wt/vol) ) बोवाइन सीरम अल्ब्युमिन (BSA) क्रमाने असतात. पेशी प्रकारानुसार, वेगवेगळे फिक्सेटिव्ह, पारगम्यता आणि ब्लॉकिंग एजंट असू शकतात. वापरले. वंश-आश्रित पेशी किंवा प्रदेश चिन्हकांना लक्ष्य करणारे प्राथमिक अँटीबॉडीज चिपवर स्थिर असलेल्या पेशींना हायलाइट करण्यासाठी वापरले जातात, त्यानंतर दुय्यम अँटीबॉडीज आणि काउंटरस्टेन डाई न्यूक्लियस (उदा., 4′,6-डायमिडिनो-2-फेनिलीन) इंडोल, DAPI) किंवा F-अ‍ॅक्टिन (उदा., फ्लोरोसेंटली लेबल केलेले फॅलोइडिन) यांना लक्ष्य करणारे काउंटरस्टेन डाई वापरले जातात. श्लेष्मा उत्पादन (आकृती 1, "पेशी भिन्नता" आणि "आतड्याचे शरीरविज्ञान"), सूक्ष्मजीव पेशींचे यादृच्छिक वसाहतीकरण (आकृती 1, "होस्ट-मायक्रोब सह-संस्कृती"), रोगप्रतिकारक पेशींची भरती (आकृती 1, 'रोग मॉडेलिंग') किंवा 3D एपिथेलियल मॉर्फोलॉजी (आकृती 3c,f आणि 4b,c) शोधण्यासाठी फ्लूरोसेन्स-आधारित लाइव्ह इमेजिंग देखील इन सिटू केले जाऊ शकते. रेफरीमध्ये वर्णन केल्याप्रमाणे, खालच्या मायक्रोचॅनेल लेयरपासून वरचा थर वेगळे करण्यासाठी चिपवरील आतडे सुधारित करताना. आकृती 2 मध्ये दर्शविल्याप्रमाणे, 3D एपिथेलियल मॉर्फोलॉजी तसेच एपिकल ब्रश बॉर्डरवरील मायक्रोविली SEM द्वारे दृश्यमान केले जाऊ शकते (आकृती 3b). परिमाणात्मक PCR5 किंवा एकल-सेल RNA अनुक्रमांक करून भिन्नता मार्करची अभिव्यक्ती मूल्यांकन केली जाऊ शकते. या प्रकरणात, आतड्याच्या चिप्स किंवा हायब्रिड चिप्समध्ये वाढलेल्या उपकला पेशींचे 3D थर ट्रिप्सिनायझेशनद्वारे काढले जातात आणि नंतर आण्विक किंवा अनुवांशिक विश्लेषणासाठी वापरले जातात.
a, हायब्रिड चिपमध्ये आतड्यांसंबंधी मॉर्फोजेनेसिसच्या प्रेरणासाठी कार्यप्रवाह. हायब्रिड चिप प्लॅटफॉर्ममध्ये 3D मॉर्फोजेनेसिस प्रदर्शित करण्यासाठी या प्रोटोकॉलमध्ये Caco-2 आणि आतड्यांसंबंधी ऑर्गेनॉइड्स वापरले जातात. तयार ट्रान्सवेल इन्सर्टमध्ये विभक्त एपिथेलियल पेशी सीड केल्या गेल्या (TW प्रेप; खालील आकृती पहा). एकदा पेशी सीड केल्या गेल्या (सीड केल्या गेल्या) आणि ट्रान्सवेल इन्सर्टमध्ये पॉलिस्टर झिल्लीशी जोडल्या गेल्या, तेव्हा सर्व पेशी स्थिर परिस्थितीत (TW कल्चर) कल्चर केल्या गेल्या. 7 दिवसांनंतर, एपिथेलियल पेशींचा 2D मोनोलेयर असलेला एक ट्रान्सवेल इन्सर्ट हायब्रिड चिपमध्ये एकत्रित केला गेला ज्यामुळे बेसोलेटरल फ्लो (फ्लो, BL) सादर केला गेला, ज्यामुळे शेवटी 3D एपिथेलियल लेयर (मॉर्फोजेनेसिस) तयार झाला. प्रत्येक प्रायोगिक पायरी किंवा वेळेच्या बिंदूवर सामान्य दात्या (C103 लाइन) चढत्या कोलनपासून मिळवलेल्या मानवी अवयव उपकला पेशींची आकारिकीय वैशिष्ट्ये दर्शविणारे फेज कॉन्ट्रास्ट मायक्रोग्राफ. वरच्या थरांमधील योजना प्रत्येक पायरीसाठी प्रायोगिक कॉन्फिगरेशन दर्शवितात.b, हायब्रिड चिप्स (डावीकडे स्कीमॅटिक) टॉप-डाउन कॉन्फोकल मायक्रोस्कोपीसह ऑर्गेनॉइड एपिथेलियल पेशींचे 3D मॉर्फोजेनेसिस होऊ शकतात. वेगवेगळ्या Z स्थानांवर घेतलेले दृश्ये (वरच्या, मध्य आणि खालच्या; उजवीकडे स्कीमॅटिक आणि संबंधित ठिपकेदार रेषा पहा). स्पष्ट आकारिकीय वैशिष्ट्ये दर्शविली. F-अॅक्टिन (निळसर), केंद्रक (राखाडी).c, स्थिर ट्रान्सवेलमध्ये कल्चर्ड केलेल्या ऑर्गेनॉइड-व्युत्पन्न उपकला पेशींचे फ्लोरोसेन्स कॉन्फोकल मायक्रोग्राफ (3D अँगल व्ह्यू) (TW; पांढऱ्या डॅश केलेल्या बॉक्समध्ये इनसेट) विरुद्ध हायब्रिड चिप (सर्वात मोठा पूर्ण शॉट) अनुक्रमे 2D विरुद्ध 3D आकारिकीची तुलना करते. 2D उभ्या क्रॉस-कट दृश्यांची जोडी (वरच्या उजव्या कोपऱ्यात इनसेट; "XZ") देखील 2D आणि 3D वैशिष्ट्ये दर्शवते.स्केल बार, 100 µm.c संदर्भाच्या परवानगीने पुनर्मुद्रित.4. एल्सेव्हियर.
पारंपारिक स्थिर संस्कृती परिस्थितीत समान पेशी (कॅको-२ किंवा आतड्यांसंबंधी ऑर्गेनॉइड एपिथेलियल पेशी) द्विमितीय मोनोलेयर्समध्ये संवर्धन करून नियंत्रणे तयार केली जाऊ शकतात. लक्षणीय म्हणजे, सूक्ष्म चॅनेलच्या मर्यादित आकारमान क्षमतेमुळे (म्हणजे मूळ आतड्याच्या चिप डिझाइनवरील वरच्या चॅनेलमध्ये ~४ µL) पोषक तत्वांचा ऱ्हास होऊ शकतो. म्हणून, बेसोलेटरल प्रवाहाच्या वापराच्या आधी आणि नंतर एपिथेलियल मॉर्फोलॉजीची तुलना देखील करता येते.
सॉफ्ट लिथोग्राफी प्रक्रिया स्वच्छ खोलीत करावी. चिपवरील प्रत्येक थरासाठी (वरचा आणि खालचा थर आणि पडदा) आणि हायब्रिड चिप्ससाठी, वेगवेगळे फोटोमास्क वापरले गेले आणि वेगवेगळ्या सिलिकॉन वेफर्सवर तयार केले गेले कारण मायक्रोचॅनेलची उंची वेगळी होती. चिपवरील आतड्याच्या वरच्या आणि खालच्या मायक्रोचॅनेलची लक्ष्य उंची अनुक्रमे 500 µm आणि 200 µm आहे. हायब्रिड चिपची चॅनेल लक्ष्य उंची 200 µm आहे.
एसीटोन असलेल्या डिशमध्ये ३ इंचाचा सिलिकॉन वेफर ठेवा. प्लेटला ३० सेकंदांसाठी हळूवारपणे फिरवा, नंतर वेफर हवेत वाळवा. वेफरला IPA असलेल्या प्लेटमध्ये स्थानांतरित करा, नंतर प्लेट स्वच्छ करण्यासाठी ३० सेकंदांसाठी फिरवा.
सिलिकॉन वेफरच्या पृष्ठभागावरून सेंद्रिय अवशेष जास्तीत जास्त काढून टाकण्यासाठी पिरान्हा द्रावण (हायड्रोजन पेरॉक्साइड आणि सांद्रित सल्फ्यूरिक आम्लाचे मिश्रण, १:३ (व्हॉल्यूम/व्हॉल्यूम)) पर्यायीरित्या वापरले जाऊ शकते.
पिरान्हा द्रावण अत्यंत संक्षारक आहे आणि उष्णता निर्माण करते. अतिरिक्त सुरक्षा खबरदारी आवश्यक आहे. कचरा विल्हेवाट लावण्यासाठी, द्रावण थंड होऊ द्या आणि स्वच्छ, कोरड्या कचरा कंटेनरमध्ये स्थानांतरित करा. दुय्यम कंटेनर वापरा आणि कचरा कंटेनर योग्यरित्या लेबल करा. अधिक तपशीलवार प्रक्रियांसाठी कृपया सुविधेच्या सुरक्षा मार्गदर्शक तत्त्वांचे पालन करा.
वेफर्सना २०० डिग्री सेल्सिअस गरम प्लेटवर १० मिनिटे ठेवून डिहायड्रेट करा. डिहायड्रेशननंतर, थंड होण्यासाठी वेफर हवेत पाच वेळा हलवण्यात आले.
स्वच्छ केलेल्या सिलिकॉन वेफरच्या मध्यभागी सुमारे १० ग्रॅम फोटोरेझिस्ट SU-8 2100 घाला. वेफरवर फोटोरेझिस्ट समान रीतीने पसरवण्यासाठी चिमटा वापरा. ​​फोटोरेझिस्ट कमी चिकट आणि पसरण्यास सोपे होण्यासाठी कधीकधी वेफर ६५°C गरम प्लेटवर ठेवा. वेफर थेट हॉट प्लेटवर ठेवू नका.
स्पिन कोटिंग चालवून SU-8 वेफरवर समान रीतीने वितरित केले गेले. SU-8 चे इनकमिंग रोटेशन ५-१० सेकंदांसाठी प्रोग्राम करा जेणेकरून ते १०० rpm/s च्या प्रवेगाने ५०० rpm वर प्रसारित होईल. मुख्य स्पिनला १,५०० rpm वर २०० µm जाडीच्या पॅटर्निंगसाठी सेट करा किंवा २५० µm जाडी मिळवा (चिपवरील आतड्याच्या वरच्या थरासाठी ५०० µm उंची बनवा; खाली "गंभीर पायऱ्या" पहा) १,२०० rpm वर ३० सेकंदांनी ३०० rpm/s च्या प्रवेगाने सेट करा.
सिलिकॉन वेफरवरील SU-8 पॅटर्नच्या लक्ष्य जाडीनुसार मुख्य फिरकी गती समायोजित केली जाऊ शकते.
चिपवरील आतड्याच्या वरच्या थरासाठी ५०० µm उंचीचे SU-8 नमुने तयार करण्यासाठी, या बॉक्सचे स्पिन कोटिंग आणि सॉफ्ट बेक स्टेप्स (पायऱ्या ७ आणि ८) अनुक्रमे पुनरावृत्ती करण्यात आल्या (पायऱ्या ९ पहा) जेणेकरून २५० µm चे दोन थर तयार होतील. SU-8 चा एक जाड थर, जो थरात बसवता येतो आणि या बॉक्सच्या पायरी १२ मध्ये UV एक्सपोजरद्वारे जोडता येतो, ज्यामुळे ५०० µm उंचीचा थर तयार होतो.
SU-8 लेपित वेफर्सना काळजीपूर्वक गरम प्लेटवर ६५°C वर ५ मिनिटे ठेवून सॉफ्ट बेक करा, नंतर सेटिंग ९५°C वर बदला आणि अतिरिक्त ४० मिनिटे इनक्युबेट करा.
वरच्या मायक्रोचॅनेलमध्ये SU-8 पॅटर्नची 500 μm उंची साध्य करण्यासाठी, 250 μm जाडीचे दोन SU-8 थर तयार करण्यासाठी चरण 7 आणि 8 पुन्हा करा.
यूव्ही मास्क अलाइनर वापरून, वेफरच्या एक्सपोजर वेळेची गणना करण्यासाठी उत्पादकाच्या सूचनांनुसार लॅम्प चाचणी करा. (एक्सपोजर वेळ, एमएस) = (एक्सपोजर डोस, एमजे/सेमी2)/(लॅम्प पॉवर, एमडब्ल्यू/सेमी2).
एक्सपोजर वेळ निश्चित केल्यानंतर, फोटोमास्क यूव्ही मास्क अलाइनरच्या मास्क होल्डरवर ठेवा आणि फोटोमास्क एसयू-८ कोटेड वेफरवर ठेवा.
यूव्ही फैलाव कमी करण्यासाठी फोटोमास्कचा छापील पृष्ठभाग थेट सिलिकॉन वेफरच्या SU-8 लेपित बाजूला ठेवा.
पूर्वनिर्धारित एक्सपोजर वेळेसाठी SU-8 लेपित वेफर आणि फोटोमास्क 260 mJ/cm2 UV प्रकाशात उभ्या स्थितीत उघडा (या बॉक्सची पायरी 10 पहा).
यूव्ही एक्सपोजरनंतर, २०० मायक्रॉन उंचीचे नमुने तयार करण्यासाठी प्रत्येक हॉट प्लेटवर SU-8-लेपित सिलिकॉन वेफर्स ६५°C वर ५ मिनिटे आणि ९५°C वर १५ मिनिटे बेक केले गेले. ५०० मायक्रॉन उंचीचे नमुने तयार करण्यासाठी ९५°C वर बेक केल्यानंतरचा वेळ ३० मिनिटांपर्यंत वाढवा.
डेव्हलपर एका काचेच्या डिशमध्ये ओतला जातो आणि बेक्ड वेफर डिशमध्ये ठेवला जातो. काचेच्या प्लेटच्या आकारानुसार SU-8 डेव्हलपरचे आकारमान बदलू शकते. उघड न झालेले SU-8 पूर्णपणे काढून टाकण्यासाठी पुरेसा SU-8 डेव्हलपर वापरण्याची खात्री करा. उदाहरणार्थ, 1 लिटर क्षमतेसह 150 मिमी व्यासाचा ग्लास डिश वापरताना, ~300 मिली SU-8 डेव्हलपर वापरा. ​​अधूनमधून हलक्या फिरवून 25 मिनिटांसाठी साचा विकसित करा.
विकसित साचा सुमारे १० मिली ताज्या डेव्हलपरने स्वच्छ धुवा आणि त्यानंतर पिपेट वापरून द्रावण फवारून IPA लावा.
वेफर प्लाझ्मा क्लिनरमध्ये ठेवा आणि १.५ मिनिटांसाठी ऑक्सिजन प्लाझ्मा (वातावरणीय वायू, लक्ष्य दाब १ × १०−५ टॉर, पॉवर १२५ वॅट) मध्ये ठेवा.
वेफरला व्हॅक्यूम डेसिकेटरमध्ये ठेवा ज्यामध्ये काचेची स्लाईड असेल. वेफर्स आणि स्लाईड्स शेजारी शेजारी ठेवता येतात. जर व्हॅक्यूम डेसिकेटर प्लेटने अनेक थरांमध्ये विभागले असेल, तर स्लाईड्स खालच्या चेंबरमध्ये आणि वेफर्स वरच्या चेंबरमध्ये ठेवा. काचेच्या स्लाईडवर १०० μL ट्रायक्लोरो(१H, १H, २H, २H-परफ्लुरोऑक्टाइल)सिलेन द्रावण टाका आणि सिलेनायझेशनसाठी व्हॅक्यूम लावा.
३७°C तापमानाच्या वॉटर बाथमध्ये गोठवलेल्या Caco-2 पेशींची एक कुपी वितळवा, नंतर वितळलेल्या पेशी १५ मिली ३७°C तापमानाच्या प्री-वॉर्म केलेल्या Caco-2 माध्यमाच्या T75 फ्लास्कमध्ये हलवा.
~९०% संगमावर Caco-2 पेशी पास करण्यासाठी, प्रथम Caco-2 माध्यम, PBS आणि ०.२५% ट्रिप्सिन/१ mM EDTA ३७°C पाण्याच्या बाथमध्ये गरम करा.
व्हॅक्यूम अ‍ॅस्पिरेशनद्वारे माध्यमाला अ‍ॅस्पिरेट करा. व्हॅक्यूम अ‍ॅस्पिरेशनची पुनरावृत्ती करून आणि ताजे पीबीएस घालून पेशींना ५ मिली उबदार पीबीएसने दोनदा धुवा.