Nature.com ला भेट दिल्याबद्दल धन्यवाद. तुम्ही वापरत असलेल्या ब्राउझर आवृत्तीला CSS साठी मर्यादित समर्थन आहे. सर्वोत्तम अनुभवासाठी, आम्ही शिफारस करतो की तुम्ही अपडेटेड ब्राउझर वापरा (किंवा Internet Explorer मधील सुसंगतता मोड बंद करा). दरम्यान, सतत समर्थन सुनिश्चित करण्यासाठी, आम्ही शैली आणि JavaScript शिवाय साइट प्रदर्शित करू.
मानवी आतडे मॉर्फोजेनेसिस 3D एपिथेलियल मायक्रोआर्किटेक्चर आणि स्पेसियल ऑर्गनायझेशनची क्रिप्ट-व्हिलस वैशिष्ट्ये स्थापित करते. बेसल क्रिप्टमधील स्टेम सेल कोनाडाला एक्सोजेनस मायक्रोबियल प्रतिजन आणि त्यांच्या चयापचयांपासून संरक्षित करून आतडे होमिओस्टॅसिस राखण्यासाठी ही अनोखी रचना आवश्यक आहे. शिवाय, आतड्यांसंबंधी पेशींचे संरक्षण करणारे विविध पेशी आणि पेशींचे संरक्षण करते. आतड्यांसंबंधी श्लेष्मल पृष्ठभागावरील अडथळा. म्हणूनच, इन विट्रो गट मॉडेल्सच्या निर्मितीसाठी 3D उपकला संरचना पुन्हा तयार करणे महत्त्वपूर्ण आहे. विशेष म्हणजे, सेंद्रिय मिमेटिक गट-ऑन-ए-चिप आतड्यांसंबंधी उत्स्फूर्त 3D मॉर्फोजेनेसिसला प्रेरित करू शकते, जैव epithheld फंक्शन प्रदान करते. मायक्रोफ्लुइडिक चिप तसेच ट्रान्सवेल एम्बेडेड हायब्रिड चिपमध्ये आतड्यांसंबंधी मॉर्फोजेनेसिस मजबूतपणे प्रवृत्त करण्यासाठी पुनरुत्पादक प्रोटोकॉल. आम्ही डिव्हाइस फॅब्रिकेशन, Caco-2 किंवा आतड्यांसंबंधी ऑर्गनॉइड एपिथेलियल सेल्सच्या संवर्धनासाठी तपशीलवार पद्धतींचे वर्णन करतो. आहे, आणि एकाधिक इमेजिंग पद्धतींचा वापर करून स्थापित 3D एपिथेलियाचे वैशिष्ट्यीकरण .हा प्रोटोकॉल 5 दिवसांसाठी बेसोलॅटरल फ्लुइड प्रवाह नियंत्रित करून फंक्शनल गट मायक्रोआर्किटेक्चरचे पुनरुत्पादन प्राप्त करतो. आमची इन विट्रो मॉर्फोजेनेसिस पद्धत शारीरिकदृष्ट्या संबंधित कातर तणाव आणि यांत्रिक गती वापरते आणि आम्हाला विद्यमान पेशी किंवा इतर जटिल तंत्रज्ञानाची आवश्यकता नसते ज्यामुळे आम्हाला पेशी किंवा दृश्‍य निर्माण करण्याची आवश्यकता नसते. बायोमेडिकल, क्लिनिकल आणि फार्मास्युटिकल ऍप्लिकेशन्ससाठी विट्रोमध्ये 3D आतड्यांसंबंधी उपकला स्तर पुन्हा निर्माण करण्याची पद्धत प्रदान करून, बायोमेडिकल संशोधन समुदायासाठी प्रस्तावित प्रोटोकॉलचे व्यापक परिणाम होऊ शकतात.
प्रयोगांवरून असे दिसून आले आहे की आतड्यांसंबंधी उपकला कोको-2 पेशी आतड्यांवरील 1,2,3,4,5 किंवा बाईलेअर मायक्रोफ्लुइडिक उपकरणांमध्ये संवर्धन केलेल्या 6,7 अंतर्निहित यंत्रणा स्पष्ट न समजल्याशिवाय उत्स्फूर्त 3D मॉर्फोजेनेसिस करू शकतात. s विट्रोमध्ये 3D एपिथेलियल मॉर्फोजेनेसिस प्रेरित करण्यासाठी आवश्यक आणि पुरेसे आहे, जे Caco-2 आणि रुग्ण-व्युत्पन्न आतड्यांसंबंधी ऑर्गनॉइड्सद्वारे प्रदर्शित केले गेले आहे.एपिथेलियल पेशींचे प्रमाणीकरण करण्यात आले. या अभ्यासात, आम्ही विशेषत: एक शक्तिशाली Wnt विरोधी, Dickkopf-1 (DKK-1) च्या सेल उत्पादनावर आणि एकाग्रता वितरणावर लक्ष केंद्रित केले, आतडे-ऑन-ए-चिप आणि सुधारित मायक्रोफ्लुइडिक उपकरणे ज्यामध्ये ट्रान्सवेल इन्सर्ट्स आहेत, ज्यांना "हायब्रीड डेस्ट्रोजेन डी डब्ल्यूके चिपॉनिस्ट्स" असे संबोधले जाते. -1, Wnt repressor 1, secreted frizzled-related protein 1, or Soggy-1) ऑन-चिप आतडे मॉर्फोजेनेसिस प्रतिबंधित करते किंवा पूर्वरचित 3D एपिथेलियल लेयरमध्ये व्यत्यय आणते, असे सूचित करते की संस्कृती दरम्यान विरोधाभासी ताण आतड्यांसंबंधी मॉर्फोजेनेसिससाठी जबाबदार आहे, रॉबॅप्रोसिसमध्ये व्हिट्रोप्रोसिस साध्य करण्यासाठी. एलिअल इंटरफेस म्हणजे सक्रिय फ्लशिंग (उदा. गट-ऑन-ए-चिप किंवा हायब्रीड-ऑन-ए-चिप प्लॅटफॉर्म्समध्ये) किंवा डिफ्यूजन द्वारे बेसोलॅटरल कंपार्टमेंटमधील Wnt प्रतिस्पर्ध्याची पातळी काढून टाकणे किंवा कमीतकमी राखणे .बॅसोलॅटरल मीडिया (उदा. ट्रान्सवेल मोठ्या बेसोलॅटरल विहिरीमध्ये समाविष्ट केल्यापासून).
या प्रोटोकॉलमध्ये, आंत्र-ऑन-ए-चिप मायक्रोडिव्हाइसेस आणि ट्रान्सवेल-इन्सर्टेबल हायब्रीड चिप्स (चरण 1-5) पॉलीडिमेथिलसिलॉक्सेन (पीडीएमएस) वर आधारित सच्छिद्र झिल्ली (स्टेप्स 6A, 7, 6A, 7) मधील आंतड्याच्या उपकला पेशींचे संवर्धन करण्यासाठी आम्ही तपशीलवार पद्धत प्रदान करतो. 6B, 7B, 8, 9) आणि प्रेरित 3D मॉर्फोजेनेसिस इन विट्रो (पायरी 10).आम्ही पेशी-विशिष्ट हिस्टोजेनेसिस आणि वंश-आश्रित सेल्युलर भिन्नता दर्शविणारी सेल्युलर आणि आण्विक वैशिष्ट्ये देखील ओळखली अनेक इमेजिंग पद्धती लागू करून (चरण 11-24). 2 किंवा आतड्यांसंबंधी ऑर्गनॉइड्स, दोन कल्चर फॉरमॅटमध्ये तांत्रिक तपशीलांसह सच्छिद्र झिल्लीचे पृष्ठभाग सुधारणे, 2D मोनोलेयर्सची निर्मिती, आणि आतड्यांसंबंधी बायोकेमिकल आणि बायोमेकॅनिकल मायक्रोएनवायरमेंटचे पुनरुत्पादन. इन विट्रो. 2D मधून 3D मॉर्फोजेनेसिस प्रेरित करण्यासाठी, आम्ही 2D मॉर्फोजेन कल्चर काढून टाकतो. संस्कृतीच्या बेसोलेटरल कंपार्टमेंटमध्ये मध्यम. शेवटी, आम्ही पुनरुत्पादक 3D एपिथेलियल लेयरच्या उपयुक्ततेचे प्रतिनिधित्व करतो ज्याचा वापर मॉर्फोजेन-आश्रित एपिथेलियल वाढ, अनुदैर्ध्य होस्ट-मायक्रोबायोम सह-संस्कृती, रोगजनक संसर्ग, दाहक इजा आणि ऍपिथेलॅम्पिक रोग, ऍप्लिकेशनल इजा, ऍपिथेलिअल ऍप्लिकेशन्स. .प्रभाव.
आमचा प्रोटोकॉल मूलभूत (उदा. आतड्यांसंबंधी श्लेष्मल जीवशास्त्र, स्टेम सेल जीवशास्त्र आणि विकासात्मक जीवशास्त्र) आणि उपयोजित संशोधन (उदा. प्रीक्लिनिकल औषध चाचणी, रोग मॉडेलिंग, ऊतक अभियांत्रिकी आणि गॅस्ट्रोएन्टेरोलॉजी) मधील विस्तृत श्रेणीतील शास्त्रज्ञांसाठी उपयुक्त असू शकतो. आतड्यांसंबंधी एपिथेलियम इन विट्रो, आम्ही कल्पना करतो की आमची तांत्रिक रणनीती आतड्यांसंबंधी विकास, पुनरुत्पादन किंवा होमिओस्टॅसिस दरम्यान सेल सिग्नलिंगच्या गतिशीलतेचा अभ्यास करणार्‍या प्रेक्षकांपर्यंत प्रसारित केली जाऊ शकते .याशिवाय, आमचा प्रोटोकॉल विविध संसर्गजन्य घटक जसे की Norovirus 8, Severe-Corravirus-2 (Severe-Corravirus-2) संक्रामक घटकांखालील संसर्गाची चौकशी करण्यासाठी उपयुक्त आहे. ium difficile, Salmonella Typhimurium 9 किंवा Vibrio cholerae.रोग पॅथॉलॉजी आणि पॅथोजेनेसिसचे प्रेक्षक देखील उपयुक्त आहेत. ऑन-चिप आतडे मायक्रोफिजियोलॉजी प्रणालीचा वापर अनुदैर्ध्य सह-संस्कृती 10 आणि यजमान संरक्षण, रोगप्रतिकारक प्रतिसाद आणि गॅस्ट्रोइंटेस्टाइनल ट्रॅक्टमध्ये रोगजनक-संबंधित इजा दुरुस्तीचे त्यानंतरच्या मूल्यांकनास अनुमती देऊ शकते. s रोग, अल्सरेटिव्ह कोलायटिस, पाउचाइटिस, किंवा चिडचिडे आतड्यांसंबंधी सिंड्रोमचे अनुकरण केले जाऊ शकते जेव्हा रुग्णाच्या 3D आतड्यांसंबंधी उपकला स्तरांचा वापर करून 3D आतड्यांसंबंधी उपकला स्तर तयार केले जातात, या रोगांमध्ये विलस ऍट्रोफी, क्रिप्ट शॉर्टनिंग, म्यूकोसल डॅमेज किंवा इम्पेडेरिथ-बॅरसेल-बॅरिटेम-बॅरिएटिव्ह. oids12,13. रोगाच्या वातावरणाच्या उच्च जटिलतेचे चांगले मॉडेल करण्यासाठी, वाचक 3D आतड्यांसंबंधी विलस-क्रिप्ट मायक्रोआर्किटेक्चर्स असलेल्या मॉडेलमध्ये रोग-संबंधित पेशी प्रकार, जसे की पेशंट पेरिफेरल ब्लड मोनोन्यूक्लियर सेल्स (PBMCs) जोडण्याचा विचार करू शकतात.ऊतक-विशिष्ट रोगप्रतिकारक पेशी, 5.
सेक्शनिंग प्रक्रियेशिवाय 3D एपिथेलियल मायक्रोस्ट्रक्चर निश्चित केले जाऊ शकते आणि दृश्यमान केले जाऊ शकते, स्थानिक ट्रान्सक्रिप्टॉमिक्स आणि उच्च-रिझोल्यूशन किंवा सुपर-रिझोल्यूशन इमेजिंगवर काम करणार्या दर्शकांना एपिथेलियल कोनाड्यांवरील जीन्स आणि प्रोटीनच्या स्पॅटिओटेम्पोरल डायनॅमिक्सच्या मॅपिंगमध्ये स्वारस्य असू शकते.तंत्रज्ञानामध्ये स्वारस्य आहे. मायक्रोबियल किंवा रोगप्रतिकारक उत्तेजनांना प्रतिसाद. शिवाय, अनुदैर्ध्य होस्ट-मायक्रोबायोम क्रॉसस्टॉक 10, 14 जे आतड्यांसंबंधी होमिओस्टॅसिसचे समन्वय साधतात ते 3D आतड्यांसंबंधी श्लेष्मल थरामध्ये विविध सूक्ष्मजीव प्रजातींचे सह-संवर्धन करून स्थापित केले जाऊ शकते.प्लॅटफॉर्ममध्ये. हा दृष्टीकोन म्यूकोसल इम्युनोलॉजी, गॅस्ट्रोएन्टेरोलॉजी, मानवी मायक्रोबायोम, कल्चरोमिक्स आणि क्लिनिकल मायक्रोबायोलॉजीचा अभ्यास करणार्‍या प्रेक्षकांसाठी विशेषतः आकर्षक आहे जे प्रयोगशाळेत पूर्वीच्या असंस्कृत आतड्यांसंबंधी मायक्रोबायोटा विकसित करू इच्छितात. जर आमचा इन विट्रो मॉर्फोजेनेसिस प्रोटोकॉल प्लॅटवेल 49 किंवा स्केलेबल कल्चर 49 मध्ये स्केलेबल 49 मध्ये अनुकूल केला जाऊ शकतो. बेसोलॅटरल कंपार्टमेंट्स सतत भरून काढणाऱ्या tes, फूड इंडस्ट्रीसाठी फार्मास्युटिकल, बायोमेडिकल किंवा हाय-थ्रूपुट स्क्रीनिंग किंवा व्हॅलिडेशन प्लॅटफॉर्म विकसित करणाऱ्यांना देखील प्रोटोकॉल प्रसारित केला जाऊ शकतो. तत्त्वाचा पुरावा म्हणून, आम्ही अलीकडेच मल्टीप्लेक्स हाय-थ्रूपुट सिस्टम मॉर्गन 4-मल्टिपल ऍडिशनल सिस्टीम किंवा मॉर्गेनल 2 साठी मल्टीप्लेक्स हाय-थ्रूपुट सिस्टमची व्यवहार्यता दर्शविली आहे. -ए-चिप उत्पादनांचे व्यापारीकरण केले गेले आहे16,17,18. त्यामुळे, आमच्या इन विट्रो मॉर्फोजेनेसिस पद्धतीचे प्रमाणीकरण वेगवान केले जाऊ शकते आणि अनेक संशोधन प्रयोगशाळा, उद्योग किंवा सरकारी आणि नियामक एजन्सीद्वारे इन विट्रो गट मॉर्फोजेनेसिसचे सेल्युलर रीप्रोग्रॅमिंग समजून घेण्यासाठी संभाव्यपणे स्वीकारले जाऊ शकते आणि ट्रान्सक्रिप्टोमिक्स किंवा ड्रग्स ट्रान्सक्रिप्टोमॅटिक स्तरावर बायोमेट्रिक्स ट्रान्स्क्रिप्टोसेस किंवा ड्रग्स ट्रान्स्क्रिप्टोसेस म्हणून वापरले जाते. आतडे मॉर्फोजेनेसिस प्रक्रियेच्या पुनरुत्पादनक्षमतेचे मूल्यांकन करण्यासाठी 3D आतडे सरोगेट्स वापरणे किंवा सानुकूल किंवा व्यावसायिक ऑर्गन-ऑन-ए-चिप मॉडेल वापरणे.
मर्यादित संख्येने मानवी-संबंधित प्रायोगिक मॉडेल्सचा उपयोग आतड्यांसंबंधी एपिथेलियल मॉर्फोजेनेसिसचा अभ्यास करण्यासाठी केला गेला आहे, मुख्यत: विट्रोमध्ये 3 डी मॉर्फोजेनेसिसला प्रवृत्त करण्यासाठी अंमलबजावणी करण्यायोग्य प्रोटोकॉलच्या अभावामुळे, जीयूटी मॉर्फोजेनेसिसबद्दलचे बरेचसे ज्ञान प्राण्यांच्या अभ्यासावर आधारित आहे (उदा. झेब्राफिश 20, माईस 21) मानवी विकासात्मक प्रक्रिया अचूकपणे निश्चित करू नका. बहु-मार्ग स्केलेबल पद्धतीने चाचणी घेण्याची त्यांच्या क्षमतेत हे मॉडेल देखील फारच मर्यादित आहेत. म्हणूनच, व्हिव्हो प्राण्यांच्या मॉडेल्समध्ये विट्रो आउटफॉर्म्समध्ये 3 डी टिशू स्ट्रक्चर्सचे पुनरुत्पादन करण्याचा आमचा प्रोटोकॉल तसेच इतर पारंपारिक 2 डी सेल संस्कृतीच्या मॉडेलची तपासणी करण्याइतकेच, 3 डी एपिथची तपासणी करण्यासाठी 3 डी एपिटिल्सची तपासणी केली गेली आहे. विविध म्यूकोसल किंवा रोगप्रतिकारक उत्तेजन .3 डी एपिथेलियल लेयर्स मायक्रोबियल पेशी यजमान घटकांना प्रतिसाद म्हणून स्थानिक कोनाडा आणि पर्यावरणीय उत्क्रांतीची स्थापना कशी करतात याचा अभ्यास करण्यासाठी एक जागा प्रदान करू शकतात (उदा. आतील विरूद्ध बाह्य श्लेष्माचे थर, आयजीएचे स्राव आणि अँटिमिक्रोबियल पेप्टाइड्स, फर्ड एपिथ हेरॉउंट्स आणि फर्ड एपिथर हे कसे मानतात. बेसल क्रिप्ट्समध्ये सेल्युलर ऑर्गनायझेशन आणि स्टेम सेल कोनाडा आकार देणारी मायक्रोबियल मेटाबोलिट्स (उदा. शॉर्ट-चेन फॅटी ids सिडस्) तयार करते. ही वैशिष्ट्ये केवळ तेव्हाच दर्शविली जाऊ शकतात जेव्हा 3 डी एपिथेलियल थर विट्रोमध्ये स्थापित केल्या जातात.
3D आतड्यांसंबंधी उपकला संरचना तयार करण्याच्या आमच्या पद्धती व्यतिरिक्त, अनेक इन विट्रो पद्धती आहेत. आतड्यांसंबंधी ऑर्गनॉइड कल्चर हे एक अत्याधुनिक टिशू अभियांत्रिकी तंत्र आहे जे विशिष्ट मॉर्फोजेन परिस्थितीत आतड्यांसंबंधी स्टेम सेलच्या लागवडीवर आधारित आहे आव्हानात्मक कारण आतड्यांसंबंधी ल्युमेन ऑर्गनॉइडमध्ये बंद आहे आणि म्हणूनच, सूक्ष्मजीव पेशी किंवा बाह्य प्रतिजन सारख्या ल्युमिनल घटकांचा परिचय मर्यादित आहे.मायक्रोइंजेक्टर,26,27 वापरून ऑर्गनॉइड ल्युमेन्समध्ये प्रवेश सुधारला जाऊ शकतो परंतु ही पद्धत आक्रमक आणि श्रम-केंद्रित आहे आणि कार्य करण्यासाठी विशेष ज्ञान आवश्यक आहे. शिवाय, स्थिर परिस्थितीत हायड्रोजेल स्कॅफोल्ड्समध्ये ठेवलेल्या पारंपारिक ऑर्गनॉइड संस्कृती व्हिव्हो बायोमेकॅनिक्समध्ये अचूकपणे सक्रिय प्रतिबिंबित करत नाहीत.
अनेक संशोधन गटांद्वारे नियोजित इतर पध्दती जेल पृष्ठभागावर विलग मानवी आतड्यांसंबंधी पेशींचे संवर्धन करून आतड्याच्या उपकला संरचनाची नक्कल करण्यासाठी पूर्वरचित 3D हायड्रोजेल स्कॅफोल्डचा वापर करतात. 3D-प्रिंटेड, मायक्रो-मिल्ड किंवा लिथोग्राफिक पद्धतीने तयार केलेल्या पेशींची रचना करून हायड्रोजेल स्कॅफोल्ड तयार करतात. शारीरिकदृष्ट्या संबंधित मॉर्फोजेन ग्रेडियंटसह विट्रो, स्कॅफोल्डमध्ये स्ट्रोमल पेशींचा समावेश करून उच्च गुणोत्तर एपिथेलियल स्ट्रक्चर आणि स्ट्रोमा-एपिथेलियल क्रॉसस्टॉक स्थापित करते. तथापि, प्रीस्ट्रक्चर्ड स्कॅफोल्ड्सचे स्वरूप उत्स्फूर्त मॉर्फोजेनेटिक प्रक्रियेच्या प्रदर्शनास प्रतिबंध करू शकते. या मॉडेल्सची कमतरता किंवा इंटरफ्लोज देखील प्रदान करत नाही. आतड्यांसंबंधी पेशींना मॉर्फोजेनेसिस आणि शारीरिक कार्य प्राप्त करणे आवश्यक आहे यावर ताण. आणखी एका अलीकडील अभ्यासात मायक्रोफ्लुइडिक प्लॅटफॉर्ममध्ये हायड्रोजेल स्कॅफोल्ड्सचा वापर केला गेला आणि लेसर-एचिंग तंत्राचा वापर करून आंतड्याच्या उपकला संरचनांचा वापर केला गेला. माऊस आतड्यांसंबंधी ऑर्गनॉइड्स नक्षीदार नमुन्यांचा वापर करून आतड्यांसंबंधी रीफ्लुइड स्ट्रक्चर तयार करू शकतात आणि मायक्रोफ्लुइड प्लॅटफॉर्म तयार करू शकतात. ics module.तथापि, हे मॉडेल उत्स्फूर्त मॉर्फोजेनेटिक प्रक्रिया प्रदर्शित करत नाही किंवा आतड्यांसंबंधी यांत्रिक हालचालींचा समावेश करत नाही. त्याच गटातील 3D मुद्रण तंत्र उत्स्फूर्त मॉर्फोजेनेटिक प्रक्रियेसह सूक्ष्म आतड्यांसंबंधी नळ्या तयार करण्यास सक्षम होते. या मॉडेलच्या आतड्यांमधील गुंतागुंतीच्या फॅब्रिकेशनमध्ये आणि ल्यूमिनिकल फ्लूच्या वेगवेगळ्या भागांमध्ये देखील कमतरता आहे. याव्यतिरिक्त, मॉडेलची कार्यक्षमता मर्यादित असू शकते, विशेषत: बायोप्रिंटिंग प्रक्रिया पूर्ण झाल्यानंतर, प्रायोगिक परिस्थिती किंवा सेल-टू-सेल परस्परसंवादांना त्रासदायक ठरू शकते. त्याऐवजी, आमचा प्रस्तावित प्रोटोकॉल उत्स्फूर्त आतडे मॉर्फोजेनेसिस, शारीरिकदृष्ट्या संबंधित शिअर स्ट्रेस, बायोमेकॅनिक्स जे आतड्याच्या गतिशीलतेची नक्कल करते, बायोमेकॅनिक्स आणि कॉम्प्लेक्स मायक्रोसॉलॉजिकल ऍक्सेसिबिलिटी आणि कॉम्प्लेक्स मायक्रोसोलॉजिकल ऍक्सेसिटी प्रदान करते. मॉड्यूलरिटीचे वातावरण. त्यामुळे, आमचा इन विट्रो 3D मॉर्फोजेनेसिस प्रोटोकॉल विद्यमान पद्धतींच्या आव्हानांवर मात करण्यासाठी एक पूरक दृष्टीकोन प्रदान करू शकतो.
आमचा प्रोटोकॉल पूर्णपणे थ्रीडी एपिथेलियल मॉर्फोजेनेसिसवर केंद्रित आहे, ज्यामध्ये केवळ संस्कृतीतील एपिथेलियल पेशी आहेत आणि इतर कोणत्याही प्रकारच्या आसपासच्या पेशी जसे की मेसेन्कायमल पेशी, एंडोथेलियल पेशी आणि रोगप्रतिकारक पेशी नाहीत. आधी वर्णन केल्याप्रमाणे, आमच्या प्रोटोकॉलचा मुख्य भाग म्हणजे एपिथेलियल मॉर्फोजेनेसिसचा समावेश आहे. मध्यम. आमच्या गट-ऑन-ए-चिप आणि हायब्रीड-ऑन-ए-चिपची मजबूत मॉड्यूलरिटी आम्हाला अंड्युलेटिंग 3D एपिथेलियल लेयर पुन्हा तयार करण्यास अनुमती देते, अतिरिक्त जैविक गुंतागुंत जसे की एपिथेलियल-मेसेन्कायमल इंटरॅक्शन 33,34, एक्सट्रॅसेल्युलर मॅट्रिक्स (ECM) आणि क्रिप्टोसेल 3D मधील विशिष्ट वैशिष्ट्ये, जे आमच्या सेलमध्ये जमा करतात. बेसल क्रिप्ट्समधील कोनाड्यांचा आणखी विचार करणे बाकी आहे. मेसेन्काइममधील स्ट्रोमल पेशी (उदा., फायब्रोब्लास्ट्स) ECM प्रथिनांच्या निर्मितीमध्ये आणि vivo35,37,38 मधील आतड्यांसंबंधी मॉर्फोजेनेसिसच्या नियमनात महत्त्वाची भूमिका बजावतात. आमच्या मॉडेलमध्ये मेसेन्कायमल पेशींच्या जोडणीमुळे मॉर्फोजेनेटिक लेयर, कॅप्शनल लेयर आणि कॅप्शनल प्रक्रिया सुधारते. ) आतड्याच्या सूक्ष्म वातावरणात आण्विक वाहतूक 39 आणि रोगप्रतिकारक पेशी भरती 40 चे नियमन करण्यात महत्त्वाची भूमिका बजावते. शिवाय, ऊतक मॉडेल्समध्ये जोडले जाऊ शकणारे व्हॅस्क्युलेचर घटक ही एक पूर्व शर्त असते जेव्हा टिश्यू मॉडेल्स बहु-अवयवीय परस्परसंवाद प्रदर्शित करण्यासाठी डिझाइन केले जातात. त्यामुळे पेशी किंवा पेशींच्या अंतिम वैशिष्ट्यांचा समावेश करणे आवश्यक आहे. रेझोल्यूशन. पेशंट-व्युत्पन्न रोगप्रतिकारक पेशी जन्मजात रोगप्रतिकारक प्रतिक्रिया, प्रतिजन सादरीकरण, जन्मजात अनुकूली प्रतिकारशक्ती क्रॉसस्टॉक आणि आतड्यांसंबंधी रोगाची नक्कल करण्याच्या संदर्भात ऊतक-विशिष्ट प्रतिकारशक्ती प्रदर्शित करण्यासाठी देखील आवश्यक आहेत.
गट-ऑन-ए-चिपपेक्षा हायब्रीड चिप्सचा वापर अधिक सोपा आहे कारण डिव्हाइस सेटअप सोपा आहे आणि ट्रान्सवेल इन्सर्टचा वापर आतड्यांतील एपिथेलियमच्या स्केलेबल कल्चरला अनुमती देतो. तथापि, पॉलिस्टर झिल्लीसह व्यावसायिकरित्या उपलब्ध ट्रान्सवेल इन्सर्ट लवचिक नसतात आणि पेरिस्टॅल्टिक-सदृश थेरब्रीकल हालचालींमध्ये ट्रान्सवेल इन्सर्टचे अनुकरण करू शकत नाहीत. d चिप अ‍ॅपिकल बाजूवर कातरणेचा ताण न ठेवता स्थिर राहिली. स्पष्टपणे, एपिकल कंपार्टमेंटमधील स्थिर गुणधर्म क्वचितच हायब्रिड चिप्समध्ये दीर्घकालीन जीवाणू सह-संस्कृती सक्षम करतात. आम्ही ट्रान्सवेल इन्सर्टमध्ये 3D मॉर्फोजेनेसिस मजबूतपणे प्रवृत्त करू शकतो. आयडी प्रवाह संभाव्य अनुप्रयोगांसाठी हायब्रिड चिप प्लॅटफॉर्मची व्यवहार्यता मर्यादित करू शकतो.
गट-ऑन-ए-चिप आणि हायब्रिड-ऑन-ए-चिप संस्कृतींमध्ये मानवी क्रिप्ट-व्हिलस अक्षांची पूर्ण-प्रमाणात पुनर्रचना पूर्णपणे स्थापित केली गेली नाही. मॉर्फोजेनेसिस एपिथेलियल मोनोलेयरपासून सुरू होत असल्याने, 3D मायक्रोआर्किटेक्चर्स क्रिप्टोसेल लोकसंख्येच्या जवळील मॉर्फोलॉजिकल समानता प्रदान करत नाहीत. मायक्रोइंजिनियर केलेल्या 3D एपिथेलियममधील बेसल क्रिप्ट डोमेन, क्रिप्ट आणि विलस क्षेत्र स्पष्टपणे सीमांकित केले गेले नाहीत. जरी चिपवरील उच्च वरच्या चॅनेलमुळे मायक्रोइंजिनियर केलेल्या एपिथेलियमची उंची वाढते, तरीही कमाल उंची ~300-400 पर्यंत मर्यादित आहे. es अनुक्रमे ~135 µm आणि ~ 400 µm आहे आणि लहान आतड्याच्या विलीची उंची ~ 600 µm41 आहे.
इमेजिंगच्या दृष्टिकोनातून, 3D मायक्रोआर्किटेक्चर्सचे सुपर-रिझोल्यूशन इमेजिंग चिपवरील आतड्यांपुरते मर्यादित असू शकते, कारण वस्तुनिष्ठ लेन्सपासून एपिथेलियल लेयरपर्यंत आवश्यक कार्य अंतर काही मिलिमीटरच्या क्रमाने आहे. या समस्येवर मात करण्यासाठी, दूरच्या उद्दिष्टाची आवश्यकता असू शकते. शिवाय, उच्च इमॅजिंग सेक्शन तयार करण्यासाठी, उच्च यंत्रसामग्री तयार करणे आवश्यक आहे. PDMS चे. शिवाय, चिपवरील आतड्याच्या थर-बाय-लेयर मायक्रोफॅब्रिकेशनमध्ये प्रत्येक थरामध्ये कायमस्वरूपी चिकटपणाचा समावेश असल्याने, एपिथेलियल लेयरच्या पृष्ठभागाच्या संरचनेचे परीक्षण करण्यासाठी वरचा स्तर उघडणे किंवा काढून टाकणे अत्यंत आव्हानात्मक आहे. उदाहरणार्थ, स्कॅनिंग इलेक्ट्रॉन मायक्रोस्कोप (SEM) वापरून.
हायड्रोफोबिक लहान रेणूंशी संबंधित मायक्रोफ्लूइडिक-आधारित अभ्यासांमध्ये PDMS ची हायड्रोफोबिसिटी मर्यादित घटक आहे, कारण PDMS अशा हायड्रोफोबिक रेणूंना विशिष्टपणे शोषू शकत नाही. PDMS चे पर्याय इतर पॉलिमेरिक सामग्रीसह मानले जाऊ शकतात. वैकल्पिकरित्या, PDMS किंवा पृष्ठभाग मॉडिफिकेशन (पीडीएमएस 2, पॉलीपॅथी 4) सह पृथक्करण. ene glycol) 43 ) हायड्रोफोबिक रेणूंचे शोषण कमी करण्यासाठी मानले जाऊ शकते.
शेवटी, उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग किंवा "एक-आकार-फिट-ऑल" वापरकर्ता-अनुकूल प्रायोगिक प्लॅटफॉर्म प्रदान करण्याच्या दृष्टीने आमची पद्धत चांगली वैशिष्ट्यीकृत नाही. सध्याच्या प्रोटोकॉलमध्ये प्रति मायक्रोडिव्हाइस एक सिरिंज पंप आवश्यक आहे, जो CO2 इनक्यूबेटरमध्ये जागा घेतो आणि मोठ्या प्रमाणात प्रयोगांना प्रतिबंधित करतो. ही मर्यादा लक्षणीयरीत्या सुधारली जाऊ शकते. , किंवा 384-वेल सच्छिद्र इन्सर्ट जे सतत भरपाई आणि बेसोलॅटरल मीडिया काढून टाकण्यास अनुमती देतात).
विट्रोमध्ये मानवी आतड्यांसंबंधी एपिथेलियमचे 3D मॉर्फोजेनेसिस प्रेरित करण्यासाठी, आम्ही दोन समांतर मायक्रोचॅनेल आणि दरम्यान एक लवचिक सच्छिद्र झिल्ली असलेले मायक्रोफ्लुइडिक चिप आतड्यांसंबंधी उपकरण वापरले आणि एक ल्युमेन-केशिका इंटरफेस तयार केला. आम्ही एका सिंगल-चॅनल मायक्रोफ्लूइड यंत्राचा वापर देखील दर्शवितो जे सतत मायक्रोफ्लूइड यंत्राचा वापर करतात. ट्रान्सवेल इन्सर्ट्सवर वाढलेले ध्रुवीकृत एपिथेलियल स्तर. दोन्ही प्लॅटफॉर्ममध्ये, विविध मानवी आतड्यांसंबंधी उपकला पेशींचे मॉर्फोजेनेसिस बेसोलॅटरल कंपार्टमेंटमधून मॉर्फोजेन विरोधी काढून टाकण्यासाठी प्रवाहाच्या दिशात्मक हाताळणीद्वारे प्रदर्शित केले जाऊ शकते. संपूर्ण प्रायोगिक प्रक्रिया (आकृती 1) मध्ये पाच मायक्रोवेल किंवा मायक्रोवेल भाग असतात. चिप (चरण 1-5; बॉक्स 1), (ii) आतड्यांसंबंधी उपकला पेशी (Caco-2 पेशी) किंवा मानवी आतड्यांसंबंधी ऑर्गनॉइड्स तयार करणे;बॉक्स 2-5), (iii) आतड्यांसंबंधी चिप्स किंवा हायब्रिड चिप्सवरील आतड्यांसंबंधी उपकला पेशींचे संवर्धन (चरण 6-9), (iv) 3D मॉर्फोजेनेसिस इन विट्रो (चरण 10) आणि (v) ) 3D एपिथेलियल नियंत्रण वैशिष्ट्यीकृत करण्यासाठी (पायरी 10) आणि (v) ) पुढील 1-2-4 खाली योग्य मायक्रोस्ट्रक्चर, 1-2-4 नियंत्रणाखाली. एपिथेलियल मॉर्फोजेनेसिसची स्थानिक, तात्पुरती, सशर्त किंवा प्रक्रियात्मक नियंत्रणांशी तुलना करून इन विट्रो मॉर्फोजेनेसिसची प्रभावीता प्रमाणित करण्यासाठी डिझाइन केले होते.
आम्ही दोन भिन्न कल्चर प्लॅटफॉर्म वापरले: स्ट्रेट चॅनेल किंवा नॉनलाइनर कंव्होल्युटेड चॅनेलसह गट-ऑन-ए-चिप, किंवा मायक्रोफ्लुइडिक डिव्हाइसमध्ये ट्रान्सवेल (TW) इन्सर्ट असलेली संकरित चिप्स, बॉक्स 1 मध्ये वर्णन केल्याप्रमाणे बनावट आहेत आणि चरण 1 -5. "डिव्हाइस फॅब्रिकेशन" एक सिंगल चॅनेल्पची किंवा सिंगल चॅनेल्पची बनवण्याची मुख्य पायरी दर्शवते. lial Cells” या प्रोटोकॉलमध्ये वापरल्या जाणार्‍या सेल स्रोत (Caco-2 किंवा मानवी आतड्यांसंबंधी ऑर्गनॉइड्स) आणि संस्कृती प्रक्रियेचे स्पष्टीकरण देते.”इन विट्रो मॉर्फोजेनेसिस” एकूण पायऱ्या दाखवते ज्यामध्ये Caco-2 किंवा ऑर्गनॉइड-व्युत्पन्न एपिथेलियल पेशी आतड्यांसंबंधी चिपवर किंवा ट्रान्सव्हिल इन्सर्ट ऑफ मॉर्फोजेन इन्सर्ट 3 द्वारे संवर्धित होतात. वैशिष्ट्यीकृत एपिथेलियल स्ट्रक्चरची निर्मिती.प्रोग्राम चरण क्रमांक किंवा बॉक्स क्रमांक प्रत्येक बाणाच्या खाली प्रदर्शित केला जातो. ऍप्लिकेशनमध्ये स्थापित आतड्यांसंबंधी उपकला स्तर कसे वापरले जाऊ शकतात याची उदाहरणे प्रदान करते, उदाहरणार्थ, सेल डिफरेंशन कॅरेक्टरायझेशन, गट फिजियोलॉजी स्टडीज, होस्ट-मायक्रोबायोम इकोसिस्टम्सची स्थापना, आणि रोग मॉडेलिंग "एफ-मुन्सोरेलेन्स इमेजिंग" दर्शविते. ऍक्टिन आणि MUC2 आतड्यांच्या चिपवर निर्माण झालेल्या 3D Caco-2 एपिथेलियल लेयरमध्ये व्यक्त केले गेले. MUC2 सिग्नलिंग गॉब्लेट पेशींमध्ये आणि श्लेष्मल पृष्ठभागांमधून स्रावित श्लेष्मामध्ये असते. आतड्याच्या फिजिओलॉजीमधील फ्लोरोसेंट प्रतिमा सियालिक ऍसिड आणि एन-एसीसेल्यूसेंटिग्लुसेसेंटिग्लूसेसेंटिग्लुसेल्यूसेल्टीज वापरून श्लेष्मा तयार करतात. in.“होस्ट-मायक्रोब को-कल्चर्स” मधील दोन आच्छादित प्रतिमा एका चिपवर आतड्यातील प्रतिनिधी होस्ट-मायक्रोबायोम सह-संस्कृती दर्शवतात. डाव्या पॅनेलमध्ये E. coli ची सह-संस्कृती दर्शविते जी मायक्रोइंजिनियर केलेल्या 3D Caco-2 सह ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) व्यक्त करते. GF सह-पॅथील कोशिकासह स्थानिक सह-संस्कार दर्शविते. 3D Caco-2 एपिथेलियल पेशी, त्यानंतर F-actin (लाल) आणि केंद्रक (निळा) सह इम्युनोफ्लोरेसेन्स स्टेनिंग. रोग मॉडेलिंग बॅक्टेरियाच्या प्रतिजन (उदा., lipopolysaccharide, PMCB, LPSC, इम्युनोफ्लोरेसेन्स) आणि आतडे जळजळ चिप्समध्ये निरोगी विरुद्ध गळती आतडे दर्शवते.हिरवा).Caco-2 पेशी 3D एपिथेलियल लेयर स्थापित करण्यासाठी संवर्धित केल्या गेल्या. स्केल बार, 50 µm. तळाच्या पंक्तीमधील प्रतिमा: संदर्भाच्या परवानगीने रुपांतरित “पेशींचे भेद”.ऑक्सफर्ड युनिव्हर्सिटी प्रेस;Ref.5 च्या परवानगीने पुनरुत्पादित.एनएएस;"होस्ट-मायक्रोब सह-संस्कृती" संदर्भ 3 च्या परवानगीने रुपांतरित.एनएएस;"डिसीज मॉडेलिंग" संदर्भाच्या परवानगीने रुपांतरित.5.NAS.
दोन्ही गट-ऑन-चिप आणि हायब्रीड चिप्स PDMS प्रतिकृती वापरून तयार केल्या होत्या ज्या सॉफ्ट लिथोग्राफी 1,44 द्वारे सिलिकॉन मोल्ड्समधून डिमॉल्ड केल्या होत्या आणि SU-8 सह नमुना केल्या होत्या. प्रत्येक चिपमधील मायक्रोचॅनेलची रचना हायड्रोडायनामिक्स जसे की शिअर स्ट्रेस आणि हायड्रोडायनॅमिक प्रेशर, ओरिजिनल डिझाईन 1,44 द्वारे तयार केली जाते. डेटा अंजीर 1a), ज्यामध्ये दोन समांतर सरळ मायक्रोचॅनल्सचा समावेश आहे, एक जटिल आतडे-ऑन-ए-चिप (विस्तारित डेटा अंजीर 1b) मध्ये विकसित झाला आहे ज्यामध्ये वाढीव द्रव निवास वेळ, नॉनलाइनर फ्लो पॅटर्न आणि बहु-रेषीय फ्लो सेल्स (डब्लूडब्लू 2) संवर्धनासाठी वक्र मायक्रोचॅनेलची जोडी समाविष्ट आहे. अधिक जटिल आतडे बायोमेकॅनिक्स पुन्हा तयार करणे आवश्यक आहे, जटिल आतडे-ऑन-ए-चिप्स निवडल्या जाऊ शकतात. आम्ही हे दाखवून दिले आहे की गोंधळलेली आतडे-चिप देखील मूळ गट-चिपच्या तुलनेत उपकला वाढीच्या समान कालावधीसह 3D मॉर्फोजेनेसिस मजबूतपणे प्रेरित करते. चीप गट डिझाईन्स अदलाबदल करण्यायोग्य आहेत. पीडीएमएस प्रतिकृती सिलिकॉन मोल्ड्सवर SU-8 पॅटर्नसह बरे केले जातात ज्यामध्ये डिमोल्डिंगनंतर नकारात्मक वैशिष्ट्ये प्रदान केली जातात (चित्र.2a).चिपवर आतडे तयार करण्यासाठी, तयार केलेला वरचा PDMS थर एका सच्छिद्र PDMS फिल्मशी क्रमाक्रमाने बांधला गेला आणि नंतर कोरोना ट्रीटर (Fig. 2b–f) वापरून अपरिवर्तनीय बाँडिंगद्वारे खालच्या PDMS लेयरशी संरेखित करण्यात आला. हायब्रीड चिप्स तयार करण्यासाठी, PDMS ला सिंगल-फ्लूड्स बनवले गेले. ट्रान्सवेल इन्सर्ट्स सामावून घेणारी idic उपकरणे (Fig. 2h आणि विस्तारित डेटा Fig. 2). बाँडिंग प्रक्रिया PDMS प्रतिकृती आणि काचेच्या पृष्ठभागावर ऑक्सिजन प्लाझ्मा किंवा कोरोना उपचार करून केली जाते. सिलिकॉन ट्यूबमध्ये जोडलेल्या मायक्रोफॅब्रिकेटेड यंत्राच्या निर्जंतुकीकरणानंतर, सिलिकॉन सेटअप 3 च्या सिलिकॉन ट्यूबमध्ये तयार करण्यात आले होते. हेलियम (आकृती 2g).
a, SU-8 नमुना असलेल्या सिलिकॉन मोल्ड्समधून PDMS भाग तयार करण्याचे योजनाबद्ध चित्रण. असुरक्षित PDMS द्रावण सिलिकॉन मोल्डवर (डावीकडे) ओतले गेले, 60 °C (मध्यम) वर बरे केले गेले आणि (उजवीकडे) पाडले गेले. पाडलेल्या PDMS चे तुकडे केले गेले आणि PDMS तयार करण्यासाठी, फोटोग्राफ तयार करण्यासाठी moldc लेयर तयार केले गेले. PDMS सच्छिद्र झिल्ली तयार करण्यासाठी वापरल्या जाणार्‍या सिलिकॉन मोल्डचा. वरच्या आणि खालच्या PDMS घटकांच्या छायाचित्रांची मालिका आणि एकत्र केलेले ऑन-चिप आतड्यांसंबंधी उपकरण. उदा, वरच्या, पडद्याच्या आणि खालच्या PDMS घटकांच्या संरेखनाची योजनाबद्ध. प्रत्येक स्तरावर प्लॅस्टिक किंवा प्लॅस्टिकच्या उपचारांद्वारे अपरिवर्तनीयपणे बदल केला जातो. सुपरइम्पोज्ड कंव्हॉल्युटेड मायक्रोचॅनल्स आणि व्हॅक्यूम चेंबर्ससह ut-ऑन-ए-चिप डिव्हाइस. मायक्रोफ्लुइडिक सेल कल्चरसाठी गट-ऑन-ए-चिपचा सेटअप. सिलिकॉन ट्यूब आणि सिरिंजसह एकत्रित केलेल्या चिपवर फॅब्रिकेटेड आतडे कव्हरस्लिपवर ठेवण्यात आले होते. डिव्हाईसवर lidrip0 ची डिस्‍ट्रीप 5 डिस्‍प्‍टरिंग प्रक्रिया केली गेली होती. सिलिकॉन tube.h बंद करण्यासाठी वापरले जाते, हायब्रिड चिप फॅब्रिकेशनचे व्हिज्युअल स्नॅपशॉट आणि हायब्रीड चिप्स वापरून 3D मॉर्फोजेनेसिस. ट्रान्सवेल इन्सर्ट टू कल्चर टू स्वतंत्रपणे तयार केलेले आतड्यांसंबंधी एपिथेलियल पेशींचे 2D मोनोलेयर्स हायब्रिड चिपमध्ये घालण्यात आले होते. ट्रान्सवेल इन्सर्टवर स्थापित सेल लेयरच्या खाली मायक्रोचॅनेलद्वारे.स्केल बार, 1 सेमी.ता. संदर्भाच्या परवानगीने पुनर्मुद्रित.4.एल्सव्हियर.
या प्रोटोकॉलमध्ये, Caco-2 सेल लाइन आणि आतड्यांसंबंधी ऑर्गनॉइड्स एपिथेलियल स्त्रोत म्हणून वापरण्यात आले (चित्र 3a). दोन्ही प्रकारच्या पेशी स्वतंत्रपणे संवर्धित केल्या गेल्या (बॉक्स 2 आणि बॉक्स 5) आणि ऑन-चिप आतडे किंवा ट्रान्सवेल इन्सर्ट्सच्या ECM-कोटेड मायक्रोचॅनल्सच्या बीजारोपण करण्यासाठी वापरल्या गेल्या. जेव्हा पेशींमध्ये Caco-2 %5% संवर्धन होते तेव्हा पेशींचे संवर्धन होते. (पॅसेज 10 आणि 50 मधील) टी-फ्लॅस्कमध्ये ट्रिप्सिनायझेशन फ्लुइड (बॉक्स 2) द्वारे डिसॉसिएटेड सेल सस्पेंशन तयार करण्यासाठी कापणी केली जाते. आतड्यांसंबंधी बायोप्सी किंवा सर्जिकल रीसेक्शन्समधून मानवी आतड्यांसंबंधी ऑर्गनॉइड्स 24-वेल-वेल सपोर्टिंग प्लॅक्‍टोरॅन्‍स प्‍लॅक्‍सॅन्‍युरल सपोर्टिंग प्‍लॅक्‍रॉन्‍समध्‍ये मॅट्रिजेल स्‍कॅफोल्‍ड डोममध्‍ये संवर्धन केले जातात. जसे की Wnt, R-spondin आणि Noggin) आणि बॉक्स 3 मध्ये वर्णन केल्यानुसार तयार केलेले वाढ घटक प्रत्येक दुसर्या दिवशी ऑर्गनॉइड्सचा व्यास ~500 µm पर्यंत वाढला जाईपर्यंत पूरक होते. पूर्ण वाढलेले ऑर्गनॉइड्सची कापणी केली जाते आणि आतड्यांवरील बीजारोपण करण्यासाठी एकल पेशींमध्ये विलग केले जाते किंवा ट्रान्सवेल रोगाची नोंद केली जाते (आम्ही आधीच्या वेगवेगळ्या रोगांनुसार 500 μm पर्यंत वाढू शकतो). प्रकार12,13 (उदा. अल्सरेटिव्ह कोलायटिस, क्रोहन रोग, कोलोरेक्टल कॅन्सर, किंवा सामान्य दाता), जखम साइट (उदा., घाव विरुद्ध घाव नसलेले क्षेत्र) आणि ट्रॅक्टमधील गॅस्ट्रोइंटेस्टाइनल स्थान (उदा., ड्युओडेनम, जेजुनम, इलियम, सेकम, कोलन, किंवा गुदाशय).आम्ही एक इंक्युलॉइड किंवा कोकोलॉइड प्रोटोलॉइड प्रदान करतो. सामान्यत: लहान आतड्यांसंबंधी ऑर्गनॉइड्सपेक्षा मॉर्फोजेन्सची जास्त सांद्रता आवश्यक असते.
a, आतडे चिपमध्ये आतडे मॉर्फोजेनेसिसच्या प्रेरणासाठी कार्यप्रवाह. Caco-2 मानवी आतड्यांसंबंधी एपिथेलियम आणि आतड्यांसंबंधी ऑर्गनॉइड्सचा वापर या प्रोटोकॉलमध्ये 3D मॉर्फोजेनेसिस प्रदर्शित करण्यासाठी केला जातो. पृथक एपिथेलियल पेशी तयार केलेल्या आतड्यांसंबंधी पेशी (अटॅच्ड सेल्स) (अटॅच्ड सेल्स) तयार केल्या जातात (आतड्यांवरील ऍपिथेलियम सेल्स) सीड केले जातात. ) 0 (D0) दिवशी PDMS सच्छिद्र झिल्लीकडे, apical (AP) प्रवाह सुरू केला जातो आणि पहिले 2 दिवस (प्रवाह, AP, D0-D2) चालू ठेवला जातो. चक्रीय स्ट्रेचिंग हालचालींसह बेसोलॅटरल (BL) प्रवाह देखील सुरू केला जातो (स्ट्रेच, फ्लो, AP आणि BL) moD3 पूर्ण झाल्यानंतर 2 दिवस पूर्ण होतो. मायक्रोफ्लुइडिक कल्चर (मॉर्फोजेनेसिस, D5) च्या 5 दिवसांनंतर उत्स्फूर्तपणे लाल. फेज कॉन्ट्रास्ट प्रतिमा प्रत्येक प्रायोगिक पायरी किंवा टाइम पॉईंटवर Caco-2 पेशींचे प्रातिनिधिक आकारविज्ञान दर्शवितात (बार आलेख, 100 µm). चार योजनाबद्ध आकृत्या दर्शवितात ज्यात संबंधित कॅसकेड्स ऑफ द मॉर्फोजेनच्या दिशा दर्शवितात. द्रव प्रवाह.b, स्थापित 3D Caco-2 एपिथेलियम (डावीकडे) चे पृष्ठभाग टोपोलॉजी दर्शविणारी SEM प्रतिमा. मॅग्निफाइड एरिया (पांढरा डॅश केलेला बॉक्स) हायलाइट करणारा इनसेट 3D Caco-2 स्तरावर (उजवीकडे) पुनर्जन्मित मायक्रोव्हिली दर्शवितो. c, स्थापित Caco-2 lambranes बॉर्डरचे क्षैतिज फ्रंटल व्ह्यू, सतत क्लॉउड बॉर्डर (उजवीकडे). -अॅक्टिन (हिरवा) आणि केंद्रक (निळा) इम्युनोफ्लोरेसेन्स कॉन्फोकल व्हिज्युअलायझेशन आंतड्याच्या चिप्सवरील एपिथेलियल पेशींचे. मधल्या स्कीमॅटिककडे निर्देशित करणारे बाण प्रत्येक कॉन्फोकल व्ह्यूसाठी फोकल प्लेनचे स्थान दर्शवितात. डी, चिपद्वारे संवर्धित ऑर्गनॉइड्समधील मॉर्फोलॉजिकल बदलांचा कालावधी, 19 दिवसांत, मायक्रो 19 आणि 3 दिवसांवर कॉन्फोकल द्वारे संवर्धन केले जाते. 13. इनसेट (वर उजवीकडे) प्रदान केलेल्या प्रतिमेचे उच्च विस्तार दर्शविते. म्हणजे, 7.f दिवशी घेतलेल्या स्लाइसवर आतड्यात ऑर्गनॉइड 3D एपिथेलियमचा DIC फोटोमायक्रोग्राफ, स्टेम सेलसाठी मार्कर दर्शविणारी आच्छादित इम्युनोफ्लोरेसेन्स प्रतिमा (LGR5;किरमिजी, गॉब्लेट पेशी (MUC2; हिरवा), F-actin (ग्रे) आणि न्यूक्ली (निळसर) 3 दिवसांपर्यंत आतड्यांवरील चिप्सवर वाढतात, अनुक्रमे (डावीकडे) आणि 13-दिवस (मध्यम) ऑर्गनॉइड्स एपिथेलियल लेयरवर. विस्तारित डेटा आकृती 3 देखील पहा, जे एलजीआरएमयू 5 चिन्हांकित न करता चिन्हांकित करते. कल्चरच्या 13 व्या दिवशी सेलमास्क डाईने (उजवीकडे) प्लाझ्मा झिल्ली डागून चिपवर आतड्यात 3D ऑर्गनॉइड एपिथेलियमची इथेलियल मायक्रोस्ट्रक्चर (उजवीकडे) स्थापित केली. अन्यथा नमूद केल्याशिवाय स्केल बार 50 μm आहे. b संदर्भाच्या परवानगीने पुनर्मुद्रित केले.ऑक्सफर्ड युनिव्हर्सिटी प्रेस;c संदर्भाच्या परवानगीने रुपांतरित.2.ऑक्सफर्ड युनिव्हर्सिटी प्रेस;e आणि f संदर्भाद्वारे परवानगीने रुपांतरित केले. 12 क्रिएटिव्ह कॉमन्स लायसन्स CC BY 4.0 अंतर्गत.
चिपवरील आतड्यात, यशस्वी ECM कोटिंगसाठी PDMS सच्छिद्र झिल्लीच्या हायड्रोफोबिक पृष्ठभागामध्ये सुधारणा करणे आवश्यक आहे. या प्रोटोकॉलमध्ये, आम्ही PDMS झिल्लीची हायड्रोफोबिसिटी सुधारण्यासाठी दोन भिन्न पद्धती लागू करतो. Caco-2 पेशींच्या संवर्धनासाठी, PDMS ची पृष्ठभागावरील सक्रियता एकट्याने यूव्ही/हायड्रोफोबिक ट्रीटमेंट द्वारे पृष्ठभागाची सक्रियता कमी केली होती. ECM कोट करा आणि Caco-2 पेशी PDMS झिल्लीला जोडा. तथापि, ऑर्गनॉइड एपिथेलियमच्या मायक्रोफ्लुइडिक कल्चरला PDMS वर पॉलीथिलीनेमाइन (PEI) आणि ग्लुटाराल्डिहाइड अनुक्रमे लागू करून ECM प्रथिनांचे कार्यक्षम निक्षेप प्राप्त करण्यासाठी रासायनिक-आधारित पृष्ठभाग कार्यशीलतेची आवश्यकता असते, PDMS मायक्रो चॅनेलच्या पृष्ठभागावर ईसीएम मॉड-प्रथिने कव्हर करण्यासाठी ईसीएम प्रथिनांचा समावेश होतो. पृष्ठभाग आणि नंतर पृथक ऑर्गनॉइड एपिथेलियममध्ये प्रवेश केला जातो. पेशी जोडल्यानंतर, पेशी पूर्ण मोनोलेयर बनत नाही तोपर्यंत मायक्रोफ्लुइडिक सेल कल्चर केवळ माध्यमाला परफ्यूज करून वरच्या मायक्रोचॅनेलमध्ये सुरू होते, तर खालच्या मायक्रोचॅनेलमध्ये स्थिर स्थिती कायम राहते. पृष्ठभाग सक्रिय करण्यासाठी ही अनुकूल पद्धत आणि ECM लेप 3 वरील ऍक्टिमेटिक ऍप्टिथेलियममध्ये जोडण्यास सक्षम करते. PDMS पृष्ठभाग.
ट्रान्सवेल कल्चरला सेल सीडिंगपूर्वी ईसीएम कोटिंगची आवश्यकता असते;तथापि, ट्रान्सवेल कल्चर्सना सच्छिद्र इन्सर्टची पृष्ठभाग सक्रिय करण्यासाठी जटिल प्रीट्रीटमेंट चरणांची आवश्यकता नसते. ट्रान्सवेल इन्सर्टवर Caco-2 पेशी वाढवण्यासाठी, सच्छिद्र इन्सर्टवर ECM कोटिंग विलग झालेल्या Caco-2 पेशींच्या जोडणीला गती देते (<1 तास) आणि घट्ट जंक्शन बॅरियर फॉर्मेशन (<1-2 कल्चर किंवा ट्रान्सवेल इन्सर्ट्सवर सीओ-2) किंवा सीओलॉइड ऑन टी. ECM-कोटेड इन्सर्ट, झिल्लीच्या पृष्ठभागाशी जोडलेले (<3 h) आणि ऑर्गनॉइड्स अडथळा अखंडतेसह संपूर्ण मोनोलेयर तयार होईपर्यंत राखले जातात .संकरित चिप्सचा वापर न करता 24-वेल प्लेट्समध्ये ट्रान्सवेल कल्चर केले जातात.
इन विट्रो 3D मॉर्फोजेनेसिस स्थापित केलेल्या एपिथेलियल लेयरच्या बेसोलॅटरल पैलूवर द्रव प्रवाह लागू करून सुरू केले जाऊ शकते. चिपवरील आतड्यात, एपिथेलियल मॉर्फोजेनेसिस सुरू होते जेव्हा माध्यम वरच्या आणि खालच्या मायक्रोचॅनल्समध्ये परफ्यूज केले जाते (चित्र 3a,).त्याचे वर्णन पूर्वी फ्लूओला फ्लूमध्ये केले जाते. डायरेक्शनल स्रावित मॉर्फोजेन इनहिबिटर सतत काढून टाकण्यासाठी कंपार्टमेंट. सच्छिद्र झिल्लीवर बांधलेल्या पेशींना पुरेशी पोषक आणि सीरम प्रदान करण्यासाठी आणि ल्युमिनल कातरणेचा ताण निर्माण करण्यासाठी, आम्ही सामान्यत: चिपवर आतड्यात दुहेरी प्रवाह लागू करतो. हायब्रिड चिप्समध्ये, ट्रान्सवेल इन्सर्टमध्ये मोचिथ्‍स, प्‍लेब्रिड इन्सर्ट होते. मायक्रोचॅनेलद्वारे छिद्रयुक्त ट्रान्सवेल इन्सर्टच्या बेसोलॅटरल बाजूच्या खाली माध्यम लागू केले गेले. दोन्ही कल्चर प्लॅटफॉर्ममध्ये बेसोलॅटरल प्रवाह सुरू झाल्यानंतर 3-5 दिवसांनी आतड्यांसंबंधी मॉर्फोजेनेसिस उद्भवले.
फेज कॉन्ट्रास्ट मायक्रोस्कोपी, डिफरेंशियल इंटरफेरन्स कॉन्ट्रास्ट (डीआयसी) मायक्रोस्कोपी, एसईएम, किंवा इम्युनोफ्लोरेसेन्स कॉन्फोकल मायक्रोस्कोपी (आकृती 3 आणि 4) सह विविध इमेजिंग पद्धती लागू करून मायक्रोइंजिनियर केलेल्या 3D एपिथेलियल लेयर्सच्या मॉर्फोलॉजिकल वैशिष्ट्यांचे विश्लेषण केले जाऊ शकते. 3D एपिथेलियल लेयर्स. PDMS आणि पॉलिस्टर फिल्म्सच्या ऑप्टिकल पारदर्शकतेमुळे, दोन्ही गट-ऑन-ए-चिप आणि हायब्रीड चिप प्लॅटफॉर्म डिव्हाइसच्या विभागणी किंवा विघटनाशिवाय सिटू इमेजिंगमध्ये रिअल-टाइम प्रदान करू शकतात. इम्युनोफ्लोरेसेन्स इमेजिंग करत असताना, c3, 4, 4, 3, 4, 3, 3, 3, 4, 4, 4, 4, 4, 3, 3, 3, 3, 3, 3, 3, 3, 3, 3, 3, 3, 3, 3, 3, 3, 3, 3, 3, 3, 3, 3, 3, 3, 3, 3, 3, 3, 3, 4, 3, 3, 3, 3, 4, 3, 3, 4, 3, 3, 4, 3, 3, 4, 3, 3, 4, 3, 3, 4, 3, 3, 3 डी. % (wt/vol) paraformaldehyde (PFA), त्यानंतर ट्रायटन X-100 आणि 2% (wt/vol) ) बोवाइन सीरम अल्ब्युमिन (BSA), क्रमाने. सेल प्रकारावर अवलंबून, भिन्न फिक्सेटिव्ह, परमेबिलायझर्स आणि ब्लॉकिंग एजंट वापरले जाऊ शकतात. प्राथमिक अँटीबॉडीज लक्ष्यित पेशींवर अवलंबून असतात किंवा उच्च-मार्क रेखांकनासाठी वापरतात. न्यूक्लियस (उदा., 4′,6-diamidino-2-phenylene) indole, DAPI) किंवा F-actin (उदा., fluorescently labeled phalloidin) ला लक्ष्य करणार्‍या काउंटरस्टेन डाईसह दुय्यम अँटीबॉडीज द्वारे ed. फ्लूरोसेन्स-आधारित लाईव्ह इमेजिंग देखील उत्पादन स्थितीत (mucus Fig शोधण्यासाठी) केले जाऊ शकते.1, “पेशी भिन्नता” आणि “गट फिजियोलॉजी”), सूक्ष्मजीव पेशींचे यादृच्छिक वसाहतीकरण (चित्र 1, “होस्ट-मायक्रोब सह-संस्कृती”), रोगप्रतिकारक पेशींची भरती (चित्र 1, 'डिसीज मॉडेलिंग') किंवा 3D एपिथेलियल आणि मॉडफॉलॉजी, मॉडफॉलॉजी 3 डी ऍपिथेलॉजी आणि मॉडफॉलॉजीचे स्वरूप. खालच्या मायक्रोचॅनेल लेयरपासून वरचा थर विभक्त करण्यासाठी चिपवर आतडे, रेफमध्ये वर्णन केल्याप्रमाणे. आकृती 2 मध्ये दर्शविल्याप्रमाणे, 3D एपिथेलियल मॉर्फोलॉजी तसेच एपिकल ब्रश बॉर्डरवरील मायक्रोव्हिली हे SEM (Fig. 3b) द्वारे दृश्यमान केले जाऊ शकते. डिफरेंशन मार्करची अभिव्यक्ती PCRNA किंवा सिंगल केसिंगद्वारे केली जाऊ शकते. , गट चिप्स किंवा हायब्रिड चिप्समध्ये वाढलेल्या एपिथेलियल पेशींचे 3D थर ट्रायप्सिनायझेशनद्वारे कापले जातात आणि नंतर आण्विक किंवा अनुवांशिक विश्लेषणासाठी वापरले जातात.
a, संकरित चिपमध्ये आतड्यांसंबंधी मॉर्फोजेनेसिसच्या इंडक्शनसाठी कार्यप्रवाह. हायब्रिड चिप प्लॅटफॉर्ममध्ये 3D मॉर्फोजेनेसिस प्रदर्शित करण्यासाठी या प्रोटोकॉलमध्ये Caco-2 आणि आतड्यांसंबंधी ऑर्गनॉइड्सचा वापर केला जातो. डिसॉसिएटेड एपिथेलियल पेशी तयार करण्यात आल्या होत्या. ट्रान्सवेल इन्सर्टमध्ये पॉलिस्टर झिल्ली, सर्व पेशी स्थिर स्थितीत (TW कल्चर) संवर्धित केल्या गेल्या. 7 दिवसांनंतर, एपिथेलियल पेशींचे 2D मोनोलेयर असलेले एकल ट्रान्सवेल इन्सर्ट बेसोलेटरल फ्लो (फ्लो, बीएल) सादर करण्यासाठी हायब्रिड चिपमध्ये एकत्रित केले गेले, ज्यामुळे शेवटी मायक्रोमॉरेस 3 डी पीपी 3 डी तयार केले गेले. प्रत्येक प्रायोगिक पायरी किंवा वेळ बिंदूवर सामान्य दाता (C103 रेषा) चढत्या कोलनपासून प्राप्त झालेल्या मानवी अवयवाच्या उपकला पेशींची आकृतीविषयक वैशिष्ट्ये दर्शविणारे आलेख. वरच्या स्तरांमधील योजना प्रत्येक पायरीसाठी प्रायोगिक कॉन्फिगरेशन स्पष्ट करतात. बी, हायब्रिड चिप्स (डावीकडे योजनाबद्ध) 3D-कॉन्फोलॉइड पेशींसह 3D-कॉन्फोलॉजिकल व्ह्यूज मायक्रोफोलॉइड पेशींकडे जाऊ शकतात. वेगवेगळ्या Z स्थानांवर (वरच्या, मध्यम आणि खालच्या;योग्य योजनाबद्ध आणि संबंधित ठिपके असलेल्या रेषा पहा).स्पष्ट मॉर्फोलॉजिकल वैशिष्ट्ये दर्शविली. एफ-अॅक्टिन (निळसर), न्यूक्लियस (राखाडी) सी, ऑर्गनॉइड-व्युत्पन्न एपिथेलियल पेशींचे फ्लूरोसेन्स कॉन्फोकल मायक्रोग्राफ (3D अँगल व्ह्यू) स्टॅटिक ट्रान्सवेल (TW; पांढर्‍या डॅश बॉक्समध्ये इनसेट) विरुद्ध हायब्रिड कॉम्प्लेसिंग 3D (3D अँगल व्ह्यू) अनुक्रमे. 2D वर्टिकल क्रॉस-कट दृश्यांची जोडी (वरच्या उजव्या कोपर्यात इनसेट; “XZ”) देखील 2D आणि 3D वैशिष्ट्ये दर्शविते. स्केल बार, 100 µm.c संदर्भाच्या परवानगीने पुनर्मुद्रित.4.एल्सव्हियर.
पारंपारिक स्थिर संस्कृतीच्या परिस्थितीत समान पेशी (Caco-2 किंवा आतड्यांसंबंधी ऑर्गनॉइड एपिथेलियल पेशी) द्विमितीय मोनोलेअरमध्ये संवर्धन करून नियंत्रणे तयार केली जाऊ शकतात. विशेष म्हणजे, सूक्ष्म चॅनेलच्या मर्यादित व्हॉल्यूम क्षमतेमुळे (म्हणजे ~4 µL) पोषक तत्वांचा ऱ्हास होऊ शकतो. बेसोलॅटरल फ्लो लागू केल्यानंतर देखील तुलना केली जाऊ शकते.
सॉफ्ट लिथोग्राफी प्रक्रिया स्वच्छ खोलीत केली जावी. चिपवरील प्रत्येक थर (वरचे आणि खालचे स्तर आणि पडदा) आणि हायब्रीड चिप्ससाठी, वेगवेगळे फोटोमास्क वापरले गेले आणि वेगळ्या सिलिकॉन वेफर्सवर बनवले गेले कारण मायक्रोचॅनल्सची उंची भिन्न होती. वरच्या आणि खालच्या मायक्रोचॅनल्सच्या लक्ष्य उंची g5µ0p0µ0p0p0m. m, अनुक्रमे. हायब्रिड चिपची चॅनेल लक्ष्य उंची 200 µm आहे.
एका डिशमध्ये एसीटोनसह 3-इंच सिलिकॉन वेफर ठेवा. प्लेटला 30 सेकंद हळूवारपणे फिरवा, नंतर वेफरला हवेत कोरडे करा. वेफरला IPA असलेल्या प्लेटमध्ये स्थानांतरित करा, नंतर प्लेट स्वच्छ करण्यासाठी 30 सेकंदांपर्यंत फिरवा.
पिरान्हा द्रावण (हायड्रोजन पेरोक्साइड आणि एकाग्र सल्फ्यूरिक ऍसिडचे मिश्रण, 1:3 (व्हॉल/व्हॉल)) वैकल्पिकरित्या सिलिकॉन वेफरच्या पृष्ठभागावरील सेंद्रिय अवशेष काढून टाकण्यासाठी वापरले जाऊ शकते.
पिरान्हा द्रावण अत्यंत संक्षारक आहे आणि उष्णता निर्माण करते. अतिरिक्त सुरक्षा खबरदारी आवश्यक आहे. कचरा विल्हेवाट लावण्यासाठी, द्रावण थंड होऊ द्या आणि स्वच्छ, कोरड्या कचरा कंटेनरमध्ये स्थानांतरित करा. दुय्यम कंटेनर वापरा आणि कचरा कंटेनर योग्यरित्या लेबल करा. अधिक तपशीलवार प्रक्रियेसाठी कृपया सुविधेच्या सुरक्षा मार्गदर्शक तत्त्वांचे अनुसरण करा.
वेफर्स 200 डिग्री सेल्सिअस हॉट प्लेटवर 10 मिनिटांसाठी ठेवून डिहायड्रेट करा. डिहायड्रेशननंतर, वेफर थंड होण्यासाठी हवेत पाच वेळा हलवले गेले.
साफ केलेल्या सिलिकॉन वेफरच्या मध्यभागी ~ 10 ग्रॅम फोटोरेसिस्ट SU-8 2100 घाला. वेफरवर फोटोरेसिस्ट समान रीतीने पसरवण्यासाठी चिमटा वापरा. ​​अधूनमधून वेफरला 65 डिग्री सेल्सिअस हॉट प्लेटवर ठेवा जेणेकरून फोटोरेसिस्ट कमी चिकट होईल आणि ते पसरणे सोपे होईल. हॉटलेटवर थेट ठेवू नका.
स्पिन कोटिंग चालवून वेफरवर SU-8 समान रीतीने वितरीत केले गेले. 5-10 s साठी SU-8 चे इनकमिंग रोटेशन 100 rpm/s च्या प्रवेगवर 500 rpm वर प्रसारित करण्यासाठी प्रोग्राम करा. 200 µm जाडीसाठी मुख्य फिरकी सेट करा चिपवरील आतड्याच्या वरच्या थरासाठी 500 µm उंची; खाली "गंभीर पायऱ्या" पहा) 1,200 rpm वर 300 rpm/s 30 सेकंदांच्या प्रवेगवर सेट करा.
मुख्य फिरकी गती सिलिकॉन वेफरवरील SU-8 पॅटर्नच्या लक्ष्य जाडीनुसार समायोजित केली जाऊ शकते.
चिपवरील आतड्याच्या वरच्या थरासाठी 500 µm उंचीचे SU-8 नमुने तयार करण्यासाठी, या बॉक्सचे स्पिन कोटिंग आणि सॉफ्ट बेक स्टेप्स (पायरे 7 आणि 8) क्रमशः पुनरावृत्ती होते (चरण 9 पहा) 250 µm चे दोन स्तर तयार करण्यासाठी, ज्यामध्ये SU-8 चा जाड थर जोडला जाऊ शकतो आणि SU-8 चा जाड थर या बॉक्समध्ये जोडला जाऊ शकतो. , 500 µm उंच थर बनवणे.
SU-8 लेपित वेफर्स 65 °C वर 5 मिनिटांसाठी काळजीपूर्वक गरम प्लेटवर ठेवून मऊ बेक करा, नंतर सेटिंग 95 °C वर स्विच करा आणि अतिरिक्त 40 मिनिटे उबवा.
वरच्या मायक्रोचॅनेलमध्ये SU-8 पॅटर्नची 500 μm उंची गाठण्यासाठी, दोन 250 μm जाडीचे SU-8 स्तर तयार करण्यासाठी चरण 7 आणि 8 पुन्हा करा.
UV मास्क अलाइनर वापरून, वेफरच्या एक्सपोजर वेळेची गणना करण्यासाठी निर्मात्याच्या सूचनांनुसार दिवा चाचणी करा. (एक्सपोजर वेळ, ms) = (एक्सपोजर डोस, mJ/cm2)/(लॅम्प पॉवर, mW/cm2).
एक्सपोजर वेळ निश्चित केल्यानंतर, यूव्ही मास्क अलाइनरच्या मास्क होल्डरवर फोटोमास्क ठेवा आणि फोटोमास्क SU-8 लेपित वेफरवर ठेवा.
यूव्ही पसरणे कमी करण्यासाठी फोटोमास्कची मुद्रित पृष्ठभाग थेट सिलिकॉन वेफरच्या SU-8 लेपित बाजूवर ठेवा.
पूर्वनिश्चित एक्सपोजर वेळेसाठी SU-8 लेपित वेफर आणि फोटोमास्क 260 mJ/cm2 च्या UV प्रकाशापर्यंत उभ्या उघडा (या बॉक्सची पायरी 10 पहा).
यूव्ही एक्सपोजरनंतर, SU-8-कोटेड सिलिकॉन वेफर्स 200 μm उंचीसह पॅटर्न तयार करण्यासाठी प्रत्येक हॉट प्लेटवर 5 मिनिटांसाठी 65°C आणि 95°C तापमानावर 15 मिनिटांसाठी बेक केले गेले. बेक केल्यानंतरची वेळ 95 °C ते 30 मिनिटे फॅब्रिकेट पॅटर्न 5µ0m पर्यंत वाढवा.
डेव्हलपरला एका काचेच्या डिशमध्ये ओतले जाते, आणि भाजलेले वेफर डिशमध्ये ठेवले जाते. काचेच्या प्लेटच्या आकारानुसार SU-8 डेव्हलपरचे व्हॉल्यूम बदलू शकते. पूर्णपणे न उघडलेले SU-8 काढून टाकण्यासाठी पुरेसा SU-8 विकसक वापरण्याची खात्री करा. उदाहरणार्थ, 150 मिमी व्यासाचा एक ग्लास वापरताना. अधूनमधून हलके फिरवून 25 मिनिटांसाठी साचा.
विकसित साचा ~ 10 mL ताज्या डेव्हलपरने स्वच्छ धुवा आणि त्यानंतर IPA पिपेट वापरून द्रावणाची फवारणी करा.
वेफरला प्लाझ्मा क्लिनरमध्ये ठेवा आणि 1.5 मिनिटांसाठी ऑक्सिजन प्लाझ्मा (वातावरणातील वायू, लक्ष्य दाब 1 × 10−5 टॉर, पॉवर 125 डब्ल्यू) समोर ठेवा.
व्हॅक्यूम डेसिकेटरमध्ये काचेच्या स्लाइडसह वेफर ठेवा. वेफर्स आणि स्लाइड्स शेजारी ठेवल्या जाऊ शकतात. जर व्हॅक्यूम डेसिकेटर प्लेटद्वारे अनेक स्तरांमध्ये विभागले गेले असेल तर, स्लाइड्स खालच्या चेंबरमध्ये आणि वेफर्स वरच्या चेंबरमध्ये ठेवा. fluorooctyl) silane द्रावण काचेच्या स्लाइडवर लावा आणि सिलॅनायझेशनसाठी व्हॅक्यूम लावा.
गोठलेल्या Caco-2 पेशींची एक कुपी 37°C पाण्याच्या आंघोळीमध्ये वितळवा, नंतर वितळलेल्या पेशी T75 फ्लास्कमध्ये हस्तांतरित करा ज्यामध्ये 37°C प्रीवार्म्ड Caco-2 माध्यमाचे 15 मिली.
~90% संगमावर Caco-2 पेशी पास करण्यासाठी, प्रथम उबदार Caco-2 मध्यम, PBS, आणि 0.25% ट्रिप्सिन/1 mM EDTA 37°C पाण्याच्या बाथमध्ये.
व्हॅक्यूम ऍस्पिरेशनद्वारे माध्यमाला ऍस्पिरेट करा. व्हॅक्यूम ऍस्पिरेशनची पुनरावृत्ती करून आणि ताजे पीबीएस जोडून 5 मिली उबदार पीबीएसने पेशी दोनदा धुवा.