Nature.com ला भेट दिल्याबद्दल धन्यवाद.तुम्ही मर्यादित CSS समर्थनासह ब्राउझर आवृत्ती वापरत आहात.सर्वोत्तम अनुभवासाठी, आम्ही शिफारस करतो की तुम्ही अद्ययावत ब्राउझर वापरा (किंवा इंटरनेट एक्सप्लोररमध्ये सुसंगतता मोड अक्षम करा).याव्यतिरिक्त, सतत समर्थन सुनिश्चित करण्यासाठी, आम्ही शैली आणि JavaScript शिवाय साइट दर्शवतो.
एकाच वेळी तीन स्लाइड्सचे कॅरोसेल प्रदर्शित करते.एका वेळी तीन स्लाइड्समधून जाण्यासाठी मागील आणि पुढील बटणे वापरा किंवा एका वेळी तीन स्लाइड्समधून जाण्यासाठी शेवटी स्लाइडर बटणे वापरा.
रक्त-मेंदूचा अडथळा आणि रक्त-मेंदूचा अडथळा बायोथेरप्यूटिक एजंट्सना मध्यवर्ती मज्जासंस्थेमध्ये त्यांच्या लक्ष्यापर्यंत पोहोचण्यापासून रोखतात, ज्यामुळे न्यूरोलॉजिकल रोगांच्या प्रभावी उपचारांमध्ये अडथळा येतो.विवोमध्ये नवीन मेंदू वाहतूक करणारे शोधण्यासाठी, आम्ही T7 फेज पेप्टाइड लायब्ररी आणली आणि उंदीरांच्या कॅन्युलेटेड कॉन्शस लार्ज पूल मॉडेलचा वापर करून रक्त आणि सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड (CSF) अनुक्रमे गोळा केले.निवडीच्या चार फेऱ्यांनंतर CSF मध्ये विशिष्ट फेज क्लोन अत्यंत समृद्ध झाले.वैयक्तिक उमेदवार पेप्टाइड्सच्या चाचणीने CSF मध्ये 1000-पटीहून अधिक संवर्धन दिसून आले.ओळखलेल्या कादंबरी ट्रान्झिट पेप्टाइडशी जोडलेल्या BACE1 पेप्टाइड इनहिबिटरचा वापर करून मेंदूला पेप्टाइड-मध्यस्थ डिलिव्हरीची बायोएक्टिव्हिटी सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइडमधील अमायलोइड-β च्या पातळीत 40% घट झाल्यामुळे पुष्टी झाली.हे परिणाम सूचित करतात की विवो फेज निवड पद्धतींद्वारे ओळखले जाणारे पेप्टाइड्स उपचारात्मक प्रभावासह मेंदूमध्ये मॅक्रोमोलेक्यूल्सच्या प्रणालीगत वितरणासाठी उपयुक्त वाहने असू शकतात.
सेंट्रल नर्वस सिस्टम (CNS) लक्ष्यित थेरपी संशोधनाने मुख्यत्वे ऑप्टिमाइझ केलेली औषधे आणि सीएनएस-लक्ष्यीकरण गुणधर्म प्रदर्शित करणारी एजंट ओळखण्यावर लक्ष केंद्रित केले आहे, ज्यामध्ये मेंदूला सक्रिय औषध डिलिव्हरी चालविणारी यंत्रणा शोधण्यासाठी कमी प्रयत्न केले जातात.हे आता बदलू लागले आहे कारण औषध वितरण, विशेषतः मोठे रेणू, आधुनिक न्यूरोसायन्स औषध विकासाचा अविभाज्य भाग आहे.मध्यवर्ती मज्जासंस्थेचे वातावरण सेरेब्रोव्हस्कुलर बॅरियर सिस्टमद्वारे चांगले संरक्षित आहे, ज्यामध्ये ब्लड-ब्रेन बॅरियर (BBB) ​​आणि ब्लड-ब्रेन बॅरियर (BCBB) 1 यांचा समावेश आहे, ज्यामुळे मेंदूपर्यंत औषधे पोहोचवणे आव्हानात्मक होते.असा अंदाज आहे की जवळजवळ सर्व मोठ्या रेणू औषधे आणि 98% पेक्षा जास्त लहान रेणू औषधे मेंदूमधून काढून टाकली जातात3.म्हणूनच नवीन मेंदू वाहतूक प्रणाली ओळखणे खूप महत्वाचे आहे जे CNS 4,5 ला उपचारात्मक औषधे कार्यक्षम आणि विशिष्ट वितरण प्रदान करतात.तथापि, BBB आणि BCSFB देखील औषध वितरणासाठी उत्कृष्ट संधी सादर करतात कारण ते मेंदूच्या सर्व संरचनेत प्रवेश करतात आणि त्यांच्या विस्तृत संवहनीद्वारे प्रवेश करतात.अशाप्रकारे, मेंदूला प्रसूतीसाठी गैर-आक्रमक पद्धती वापरण्याचे सध्याचे प्रयत्न मुख्यत्वे अंतर्जात BBB6 रिसेप्टर वापरून रिसेप्टर-मध्यस्थ वाहतूक (PMT) च्या यंत्रणेवर आधारित आहेत.ट्रान्सफरिन रिसेप्टर मार्ग7,8 वापरून अलीकडील महत्त्वाच्या प्रगती असूनही, सुधारित गुणधर्मांसह नवीन वितरण प्रणालींचा पुढील विकास आवश्यक आहे.यासाठी, आमचे ध्येय CSF वाहतूक मध्यस्थी करण्यास सक्षम पेप्टाइड्स ओळखणे हे होते, कारण ते तत्त्वतः CNS मध्ये मॅक्रोमोलेक्यूल्स वितरीत करण्यासाठी किंवा नवीन रिसेप्टर मार्ग उघडण्यासाठी वापरले जाऊ शकतात.विशेषतः, सेरेब्रोव्हस्कुलर प्रणालीचे विशिष्ट रिसेप्टर्स आणि ट्रान्सपोर्टर्स (BBB आणि BSCFB) बायोथेरेप्यूटिक औषधांच्या सक्रिय आणि विशिष्ट वितरणासाठी संभाव्य लक्ष्य म्हणून काम करू शकतात.सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड (CSF) हे कोरोइड प्लेक्सस (CS) चे एक स्रावी उत्पादन आहे आणि सबराक्नोइड स्पेस आणि वेंट्रिक्युलर स्पेस 4 द्वारे मेंदूच्या इंटरस्टिशियल फ्लुइडच्या थेट संपर्कात आहे.अलीकडे असे दिसून आले आहे की मेंदूच्या इंटरस्टिटियममध्ये subarachnoid सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड जास्त प्रमाणात पसरतो.आम्हाला आशा आहे की या सबराक्नोइड इनफ्लो ट्रॅक्टचा वापर करून किंवा थेट BBB द्वारे पॅरेन्कायमल स्पेसमध्ये प्रवेश करू.हे साध्य करण्यासाठी, आम्ही एक मजबूत इन विवो फेज निवड धोरण अंमलात आणले जे आदर्शपणे या दोन भिन्न मार्गांपैकी कोणत्याही एका मार्गाने वाहतूक केलेले पेप्टाइड्स ओळखते.
आम्ही आता उच्च लायब्ररी विविधतेसह प्रारंभिक निवड फेरीचे निरीक्षण करण्यासाठी उच्च थ्रुपुट सिक्वेन्सिंग (HTS) सह CSF सॅम्पलिंगसह विवो फेज डिस्प्ले स्क्रीनिंग पद्धतीचे अनुक्रमिक वर्णन करतो.रक्त दूषित टाळण्यासाठी कायमस्वरूपी प्रत्यारोपित लार्ज सिस्टर्ना (CM) कॅन्युलासह जागरूक उंदरांवर स्क्रीनिंग केले गेले.महत्त्वाचे म्हणजे, हा दृष्टीकोन सेरेब्रोव्हस्कुलर अडथळा ओलांडून वाहतूक क्रियाकलापांसह मेंदू-लक्ष्यीकरण आणि पेप्टाइड्स दोन्ही निवडतो.आम्ही T7 फेज त्यांच्या लहान आकारामुळे (~60 nm)10 वापरले आणि सुचवले की ते वेसिकल्सच्या वाहतुकीसाठी योग्य आहेत जे एंडोथेलियल आणि/किंवा एपिथेलियल-मेड्युला बॅरियरच्या ट्रान्ससेल्युलर क्रॉसिंगला परवानगी देतात.पॅनिंगच्या चार फेऱ्यांनंतर, विवो सीएसएफ संवर्धन आणि सेरेब्रल मायक्रोवेसेल असोसिएशनमध्ये मजबूत दर्शविणारी फेज लोकसंख्या वेगळी करण्यात आली.महत्त्वाचे म्हणजे, प्राधान्यकृत आणि रासायनिक संश्लेषित सर्वोत्तम उमेदवार पेप्टाइड्स सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइडमध्ये प्रोटीन कार्गो वाहतूक करण्यास सक्षम आहेत हे दाखवून आम्ही आमच्या निष्कर्षांची पुष्टी करू शकलो.प्रथम, CNS चे फार्माकोडायनामिक प्रभाव BACE1 पेप्टाइडच्या इनहिबिटरसह अग्रगण्य ट्रान्झिट पेप्टाइड एकत्र करून स्थापित केले गेले.व्हिव्हो फंक्शनल स्क्रिनिंग स्ट्रॅटेजीमध्ये नवीन ब्रेन ट्रान्सपोर्ट पेप्टाइड्स प्रभावी प्रोटीन कार्गो वाहक म्हणून ओळखू शकतात हे दाखवून देण्याव्यतिरिक्त, नवीन मेंदू वाहतूक मार्ग ओळखण्यासाठी समान कार्यात्मक निवड पद्धती देखील महत्त्वपूर्ण बनतील अशी आम्ही अपेक्षा करतो.
प्लेक-फॉर्मिंग युनिट्स (PFU) वर आधारित, फेज पॅकेजिंग चरणानंतर, यादृच्छिक 12-मेर रेखीय T7 फेज पेप्टाइड्सची लायब्ररी सुमारे 109 च्या विविधतेसह डिझाइन आणि तयार केली गेली (सामग्री आणि पद्धती पहा).हे लक्षात घेणे महत्त्वाचे आहे की विवो पॅनिंगमध्ये आधी आम्ही या लायब्ररीचे काळजीपूर्वक विश्लेषण केले.सुधारित प्राइमर्सचा वापर करून फेज लायब्ररी नमुन्यांचे पीसीआर प्रवर्धन करून एचटीएस (पूरक अंजीर 1a) वर थेट लागू होणारे अँप्लिकॉन तयार केले.अ) HTS11 अनुक्रम त्रुटी, ब) प्राइमर्सच्या गुणवत्तेवर परिणाम (NNK)1-12, आणि c) स्टँडबाय लायब्ररीमध्ये वाइल्ड-टाइप (wt) फेज (स्केलेटन इन्सर्ट) च्या उपस्थितीमुळे, केवळ सत्यापित pleleup sequence FigSb माहिती काढण्यासाठी अनुक्रम फिल्टरिंग प्रक्रिया लागू करण्यात आली.या फिल्टर पायऱ्या सर्व HTS सिक्वेन्सिंग लायब्ररींना लागू होतात.मानक लायब्ररीसाठी, एकूण 233,868 वाचन मिळाले, त्यापैकी 39% फिल्टर निकषांमध्ये उत्तीर्ण झाले आणि लायब्ररी विश्लेषण आणि त्यानंतरच्या फेऱ्यांसाठी निवड करण्यासाठी वापरले गेले (पूरक आकृती 1c–e).वाचन प्रामुख्याने 36 न्यूक्लियोटाइड्स (पूरक अंजीर 1c) वर शिखर असलेल्या लांबीच्या 3 बेस जोड्यांचे गुणाकार होते, लायब्ररी डिझाइन (NNK) 1-12 ची पुष्टी करते.उल्लेखनीय म्हणजे, सुमारे 11% लायब्ररी सदस्यांमध्ये 12-आयामी वाइल्ड-टाइप (wt) बॅकबोन PAGISRELVDKL इन्सर्ट होते आणि जवळपास निम्म्या सिक्वन्स (49%) मध्ये इन्सर्टेशन किंवा डिलीट होते.लायब्ररी लायब्ररीच्या HTS ने ग्रंथालयातील पेप्टाइड्सच्या उच्च विविधतेची पुष्टी केली: 81% पेक्षा जास्त पेप्टाइड अनुक्रम फक्त एकदाच आढळले आणि केवळ 1.5% ≥4 प्रतींमध्ये आढळले (पूरक चित्र 2a).अमीनो अ‍ॅसिड्स (एए) ची फ्रिक्वेन्सी रेपरटोअरमधील सर्व 12 पोझिशन्सवर डीजेनेरेट एनकेके रिपर्टोअर (पूरक अंजीर 2b) द्वारे व्युत्पन्न केलेल्या कोडनच्या संख्येसाठी अपेक्षित असलेल्या फ्रिक्वेन्सीशी उत्तम प्रकारे संबंधित आहेत.या इन्सर्ट्सद्वारे एन्कोड केलेल्या aa अवशेषांची निरीक्षण केलेली वारंवारता गणना केलेल्या वारंवारता (r = 0.893) (पूरक अंजीर 2c) शी चांगल्या प्रकारे संबंधित आहे.इंजेक्शनसाठी फेज लायब्ररीच्या तयारीमध्ये एन्डोटॉक्सिनचे प्रवर्धन आणि काढून टाकण्याच्या चरणांचा समावेश आहे.हे याआधी 12,13 फेज लायब्ररींची विविधता कमी करण्यासाठी दर्शविले गेले आहे.म्हणून, आम्ही एक प्लेट-एम्प्लीफाइड फेज लायब्ररी अनुक्रमित केली ज्यामध्ये एंडोटॉक्सिन काढून टाकण्यात आले आणि AA च्या वारंवारतेचा अंदाज घेण्यासाठी मूळ लायब्ररीशी तुलना केली.मूळ पूल आणि प्रवर्धित आणि शुद्धीकरण पूल (पूरक अंजीर 2d) यांच्यात एक मजबूत सहसंबंध (r = 0.995) आढळून आला, जे दर्शविते की T7 फेज वापरून प्लेट्सवर वाढवलेले क्लोन यांच्यातील स्पर्धेमुळे मोठा पूर्वाग्रह झाला नाही.ही तुलना प्रत्येक लायब्ररीतील ट्रिपेप्टाइड आकृतिबंधांच्या वारंवारतेवर आधारित आहे, कारण लायब्ररींची विविधता (~109) HTS सह देखील पूर्णपणे कॅप्चर केली जाऊ शकत नाही.प्रत्येक स्थानावरील aa च्या फ्रिक्वेन्सी विश्लेषणाने प्रविष्ट केलेल्या प्रदर्शनाच्या शेवटच्या तीन स्थानांमध्ये एक लहान स्थिती-आश्रित पूर्वाग्रह दिसून आला (पूरक चित्र 2e).शेवटी, आम्ही असा निष्कर्ष काढला की लायब्ररीची गुणवत्ता आणि विविधता स्वीकार्य होती आणि निवडीच्या अनेक फेऱ्यांमधील फेज लायब्ररींचे विस्तारीकरण आणि तयारी यामुळे विविधतेमध्ये केवळ किरकोळ बदल दिसून आले.
BBB आणि/किंवा BCSFB (Fig. 1a-b) द्वारे इंट्राव्हेन्सली (iv) इंजेक्ट केलेल्या T7 फेजची ओळख सुलभ करण्यासाठी सजग उंदरांच्या सीएममध्ये कॅन्युलाचे शस्त्रक्रियेने रोपण करून सिरीयल सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड सॅम्पलिंग केले जाऊ शकते.इन विवो सिलेक्शनच्या पहिल्या तीन फेऱ्यांमध्ये आम्ही दोन स्वतंत्र निवड आर्म्स (आर्म्स A आणि B) वापरले (चित्र 1c).निवडीच्या पहिल्या तीन फेऱ्यांमध्ये फेजची एकूण संख्या कमी करून आम्ही हळूहळू निवडीची कठोरता वाढवली.पॅनिंगच्या चौथ्या फेरीसाठी, आम्ही शाखा A आणि B चे नमुने एकत्र केले आणि तीन अतिरिक्त स्वतंत्र निवडी केल्या.या मॉडेलमधील T7 फेज कणांच्या विवो गुणधर्मांचा अभ्यास करण्यासाठी, वाइल्ड-टाइप फेज (PAGISRELVDKL मास्टर इन्सर्ट) शेपटीच्या रक्तवाहिनीद्वारे उंदरांमध्ये टोचले गेले.सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड आणि रक्तातून वेगवेगळ्या वेळेच्या बिंदूंवर फेजच्या पुनर्प्राप्तीवरून असे दिसून आले की तुलनेने लहान T7 आयकोसाहेड्रल फेजेसमध्ये रक्ताच्या डब्यातून जलद प्रारंभिक क्लिअरन्स टप्पा होता (पूरक चित्र 3).प्रशासित टायटर्स आणि उंदरांच्या रक्ताच्या प्रमाणाच्या आधारावर, आम्ही मोजले की फक्त अंदाजे 1% wt.इंट्राव्हेनस इंजेक्शनच्या 10 मिनिटांनंतर प्रशासित डोसमधील फेज रक्तामध्ये आढळून आला.या सुरुवातीच्या जलद घसरणीनंतर, 27.7 मिनिटांच्या अर्ध्या आयुष्यासह धीमे प्राथमिक मंजुरी मोजली गेली.महत्त्वाचे म्हणजे, CSF कंपार्टमेंटमधून फक्त फारच कमी फेज काढले गेले, जे CSF कंपार्टमेंटमध्ये जंगली-प्रकारचे फेज स्थलांतरणासाठी कमी पार्श्वभूमी दर्शविते (पूरक चित्र 3).सरासरी, संपूर्ण सॅम्पलिंग कालावधीत (0-250 मिनिट) सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइडमध्ये रक्तातील T7 फेजचे फक्त 1 x 10-3% टायटर्स आणि सुरुवातीला 4 x 10-8% फेज आढळले.विशेष म्हणजे, सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइडमधील वन्य-प्रकारच्या फेजचे अर्ध-जीवन (25.7 मिनिटे) रक्तामध्ये आढळलेल्या सारखेच होते.हे डेटा दाखवतात की CSF कंपार्टमेंटला रक्तापासून वेगळे करणारा अडथळा CM-कॅन्युलेटेड उंदरांमध्ये अबाधित आहे, ज्यामुळे फेज लायब्ररीच्या व्हिव्हो सिलेक्शनमध्ये रक्तातून CSF कंपार्टमेंटमध्ये सहजपणे वाहून जाणारे क्लोन ओळखता येतात.
(a) मोठ्या तलावातून सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड (CSF) पुन्हा नमुने घेण्यासाठी पद्धत सेट करणे.(b) मध्यवर्ती मज्जासंस्था (CNS) अडथळाचे सेल्युलर स्थान आणि रक्त-मेंदू अडथळा (BBB) ​​आणि रक्त-मेंदू अडथळा ओलांडणारे पेप्टाइड्स ओळखण्यासाठी वापरलेली निवड धोरण दर्शविणारा आकृती.(c) विवो फेज डिस्प्ले स्क्रीनिंग फ्लोचार्टमध्ये.निवडीच्या प्रत्येक फेरीत, फेजेस (बाणांच्या आत प्राणी ओळखणारे) अंतस्नायुद्वारे इंजेक्ट केले गेले.निवडीच्या चौथ्या फेरीपर्यंत दोन स्वतंत्र पर्यायी शाखा (A, B) स्वतंत्रपणे ठेवल्या जातात.निवड फेरी 3 आणि 4 साठी, CSF मधून काढलेले प्रत्येक फेज क्लोन मॅन्युअली अनुक्रमित केले गेले.(d) T7 पेप्टाइड लायब्ररी (2 x 1012 फेज/प्राणी) च्या इंट्राव्हेनस इंजेक्शननंतर दोन कॅन्युलेटेड उंदीरांमध्ये निवडीच्या पहिल्या फेरीत रक्त (लाल वर्तुळे) आणि सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड (हिरव्या त्रिकोण) पासून वेगळे केलेले फेजचे गतिशास्त्र.निळे चौरस रक्तातील फेजची सरासरी प्रारंभिक एकाग्रता दर्शवतात, एकूण रक्ताचे प्रमाण लक्षात घेऊन, इंजेक्शन केलेल्या फेजच्या प्रमाणात मोजले जाते.ब्लड फेज सांद्रता पासून एक्सट्रापोलेट केलेल्या y रेषेच्या छेदनबिंदूचे काळे चौकोन सूचित करतात.(e,f) पेप्टाइडमध्ये आढळलेल्या सर्व संभाव्य ओव्हरलॅपिंग ट्रिपेप्टाइड आकृतिबंधांची सापेक्ष वारंवारता आणि वितरण सादर करा.1000 वाचनांमध्ये आढळलेल्या आकृतिबंधांची संख्या दर्शविली आहे.लक्षणीयरीत्या (p <0.001) समृद्ध आकृतिबंध लाल ठिपक्यांनी चिन्हांकित केले आहेत.(e) सहसंबंध स्कॅटरप्लॉट इंजेक्टेड लायब्ररीच्या ट्रिपेप्टाइड मोटिफच्या सापेक्ष वारंवारतेची तुलना प्राण्यांकडून रक्त-व्युत्पन्न फेज #1.1 आणि #1.2.(f) रक्त आणि सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइडमध्ये विलग असलेल्या प्राण्यांच्या फेज ट्रायपेप्टाइड मोटिफ्स #1.1 आणि #1.2 च्या सापेक्ष फ्रिक्वेन्सीची तुलना करणारा सहसंबंध स्कॅटरप्लॉट.(g, h) दोन्ही प्राण्यांमध्ये विवो निवडीच्या फेरीनंतर रक्त (g) विरुद्ध इंजेक्टेड लायब्ररी आणि CSF (h) विरुद्ध रक्तामध्ये समृद्ध झालेले फेजचे अनुक्रम आयडी प्रतिनिधित्व.एक-अक्षर कोडचा आकार दर्शवतो की त्या स्थितीत ते अमिनो आम्ल किती वेळा येते.हिरवा = ध्रुवीय, जांभळा = तटस्थ, निळा = मूलभूत, लाल = अम्लीय आणि काळा = हायड्रोफोबिक अमीनो आम्ल.आकृती 1a, b ची रचना आणि निर्मिती एडवर्ड उरिच यांनी केली होती.
आम्ही दोन सीएम इन्स्ट्रुमेंट उंदीर (क्लेड ए आणि बी) मध्ये फेज पेप्टाइड लायब्ररी इंजेक्शन दिली आणि सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड आणि रक्त (आकृती 1d) पासून वेगळे फेज केले.लायब्ररीचे प्रारंभिक जलद क्लिअरन्स जंगली-प्रकारच्या फेजच्या तुलनेत कमी उच्चारले गेले.दोन्ही प्राण्यांमध्ये इंजेक्ट केलेल्या लायब्ररीचे सरासरी अर्धे आयुष्य 24.8 मिनिटे रक्तामध्ये होते, जे जंगली-प्रकारच्या फेजसारखे होते आणि CSF मध्ये 38.5 मिनिटे होते.प्रत्येक प्राण्याचे रक्त आणि सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड फेज नमुने एचटीएसच्या अधीन होते आणि सर्व ओळखल्या गेलेल्या पेप्टाइड्सचे विश्लेषण लहान ट्रिपेप्टाइड मोटिफच्या उपस्थितीसाठी केले गेले.ट्रिपप्टाइड आकृतिबंध निवडले गेले कारण ते रचना निर्मिती आणि पेप्टाइड-प्रोटीन परस्परसंवादासाठी किमान आधार प्रदान करतात 14,15.इंजेक्टेड फेज लायब्ररी आणि दोन्ही प्राण्यांच्या रक्तातून काढलेले क्लोन (Fig. 1e) यांच्यातील आकृतिबंधांच्या वितरणामध्ये आम्हाला चांगला संबंध आढळला.डेटा सूचित करतो की लायब्ररीची रचना रक्ताच्या कप्प्यात किरकोळ प्रमाणात समृद्ध आहे.Weblogo16 सॉफ्टवेअरचे रुपांतर वापरून प्रत्येक स्थानावर अमीनो ऍसिड फ्रिक्वेन्सी आणि एकमत अनुक्रमांचे विश्लेषण केले गेले.विशेष म्हणजे, आम्हाला रक्तातील ग्लाइसिन अवशेषांमध्ये एक मजबूत संवर्धन आढळले (चित्र 1 ग्रॅम).जेव्हा रक्ताची तुलना CSF मधून निवडलेल्या क्लोनशी केली गेली तेव्हा मजबूत निवड आणि काही आकृतिबंधांची निवड रद्द केली गेली (Fig. 1f), आणि 12-सदस्यांमध्ये (Fig. 1h) पूर्वनिर्धारित स्थानांवर विशिष्ट अमीनो ऍसिड प्राधान्याने उपस्थित होते.विशेष म्हणजे, वैयक्तिक प्राण्यांमध्ये सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइडमध्ये लक्षणीय फरक होता, तर दोन्ही प्राण्यांमध्ये रक्त ग्लाइसिन संवर्धन दिसून आले (पूरक चित्र 4a–j).प्राण्यांच्या सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड #1.1 आणि #1.2 मध्ये अनुक्रम डेटाचे कठोर फिल्टरिंग केल्यानंतर, एकूण 964 आणि 420 अद्वितीय 12-मेर पेप्टाइड्स प्राप्त झाले (पूरक चित्र 1d–e).पृथक फेज क्लोन वाढवले ​​गेले आणि विवो निवडीच्या दुसर्‍या फेरीच्या अधीन केले गेले.निवडीच्या दुसऱ्या फेरीतून काढलेले फेज प्रत्येक प्राण्यामध्ये एचटीएसच्या अधीन होते आणि सर्व ओळखल्या गेलेल्या पेप्टाइड्सचा वापर ट्रिपेप्टाइड मोटिफ्स (चित्र 2a, b, ef) च्या घटनेचे विश्लेषण करण्यासाठी मोटिफ ओळख कार्यक्रमासाठी इनपुट म्हणून केला गेला.CSF मधून पुनर्प्राप्त झालेल्या फेजच्या पहिल्या चक्राच्या तुलनेत, आम्ही शाखा A आणि B (Fig. 2) मध्ये CSF मधील अनेक आकृतिबंधांची पुढील निवड आणि निवड रद्द केल्याचे निरीक्षण केले.एक नेटवर्क आयडेंटिफिकेशन अल्गोरिदम हे निर्धारित करण्यासाठी लागू केले होते की ते सुसंगत अनुक्रमाचे भिन्न नमुने दर्शवतात.वैकल्पिक क्लेड A (Fig. 2c, d) आणि clade B (Fig. 2g, h) मध्ये CSF द्वारे पुनर्प्राप्त केलेल्या 12-आयामी अनुक्रमांमध्ये स्पष्ट समानता दिसून आली.प्रत्येक शाखेतील एकत्रित विश्लेषणाने 12-मेर पेप्टाइड्स (पूरक अंजीर 5c,d) साठी भिन्न निवड प्रोफाइल आणि निवडीच्या पहिल्या फेरीच्या तुलनेत निवडीच्या दुसर्‍या फेरीनंतर पूल केलेल्या क्लोनसाठी कालांतराने CSF/ब्लड टायटर गुणोत्तरामध्ये वाढ दिसून आली (पूरक चित्र 5e).).
इन व्हिव्हो फंक्शनल फेज डिस्प्ले सिलेक्शनच्या सलग दोन फेऱ्यांद्वारे सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइडमधील आकृतिबंध आणि पेप्टाइड्सचे संवर्धन.
प्रत्येक प्राण्याच्या पहिल्या फेरीतून बरे झालेले सर्व सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड फेज (प्राणी #1.1 आणि #1.2) एकत्र केले गेले, वाढवले ​​गेले, HT-क्रम केले गेले आणि एकत्र केले गेले (2 x 1010 फेजेस/प्राणी) 2 SM कॅन्युलेटेड उंदीर (#1.1 → #).2.1 आणि 2.2, 1.2 → 2.3 आणि 2.4).(a,b,e,f) सहसंबंध स्कॅटरप्लॉट्स पहिल्या आणि दुसऱ्या निवड फेरीतील सर्व CSF-व्युत्पन्न फेजच्या ट्रिपेप्टाइड मोटिफ्सच्या सापेक्ष वारंवारतेची तुलना करतात.सापेक्ष वारंवारता आणि आकृतिबंधांचे वितरण सर्व संभाव्य ओव्हरलॅपिंग ट्रिपेप्टाइड्सचे प्रतिनिधित्व करतात जे पेप्टाइड्समध्ये दोन्ही दिशानिर्देशांमध्ये आढळतात.1000 वाचनांमध्ये आढळलेल्या आकृतिबंधांची संख्या दर्शविली आहे.तुलना केलेल्या लायब्ररींपैकी एकामध्ये लक्षणीयरीत्या (p <0.001) निवडलेले किंवा वगळलेले आकृतिबंध लाल ठिपक्यांसह हायलाइट केले जातात.(c, d, g, h) व्हिव्हो सिलेक्शनमधील राऊंड 2 आणि 1 वर आधारित सर्व CSF-समृद्ध 12 अमीनो ऍसिड लांब अनुक्रमांचे अनुक्रम लोगोचे प्रतिनिधित्व.एक-अक्षर कोडचा आकार दर्शवतो की त्या स्थितीत ते अमिनो आम्ल किती वेळा येते.लोगोचे प्रतिनिधित्व करण्यासाठी, दोन निवड फेरींमधील वैयक्तिक प्राण्यांमधून काढलेल्या CSF अनुक्रमांच्या वारंवारतेची तुलना केली जाते आणि दुसर्‍या फेरीतील समृद्ध अनुक्रम दर्शविले जातात: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 आणि (h) #1.2–#2.(c, d) प्राण्यांमध्ये दिलेल्या स्थानावर सर्वाधिक समृद्ध केलेले अमिनो आम्ल क्र.2.1 आणि क्र.2.2 किंवा (g, h) प्राण्यांमध्ये क्र.2.3 आणि क्र.2.4 रंगात दर्शविले आहेत.हिरवा = ध्रुवीय, जांभळा = तटस्थ, निळा = मूलभूत, लाल = अम्लीय आणि काळा = हायड्रोफोबिक अमीनो आम्ल.
निवडीच्या तिसर्‍या फेरीनंतर, आम्ही दोन प्राण्यांपासून वेगळे केलेल्या 332 CSF-पुनर्रचित फेज क्लोनमधून 124 अद्वितीय पेप्टाइड अनुक्रम (#3.1 आणि #3.2) ओळखले (पूरक चित्र 6a).अनुक्रम LGSVS (18.7%) मध्ये सर्वात जास्त सापेक्ष प्रमाण होते, त्यानंतर जंगली-प्रकारचे इन्सर्ट PAGISRELVDKL (8.2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2.2%), आणि SARGSWREIVSLS (2.2%) होते.अंतिम चौथ्या फेरीत, आम्ही तीन स्वतंत्र प्राण्यांच्या दोन स्वतंत्रपणे निवडलेल्या शाखा एकत्र केल्या (चित्र 1c).CSF कडून पुनर्प्राप्त केलेल्या 925 अनुक्रमित फेज क्लोनपैकी, चौथ्या फेरीत आम्हाला 64 अद्वितीय पेप्टाइड अनुक्रम आढळले (पूरक आकृती 6b), त्यापैकी जंगली-प्रकार फेजचे सापेक्ष प्रमाण 0.8% पर्यंत घसरले.चौथ्या फेरीत सर्वात सामान्य CSF क्लोन होते LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3.6%), GRPQKINGARVC (3.6%), %SSDRL (3.6%).%)).NNK लायब्ररी डिझाइनसाठी डिजनरेट कोडन वापरताना निवडलेल्या पेप्टाइड्सची लांबीची श्रेणी लायब्ररी प्राइमर्समध्ये न्यूक्लियोटाइड इन्सर्टेशन/हटवणे किंवा अकाली स्टॉप कोडनमुळे आहे.अकाली स्टॉप कोडन लहान पेप्टाइड्स तयार करतात आणि ते निवडले जातात कारण त्यात अनुकूल aa आकृतिबंध असतात.सिंथेटिक लायब्ररीच्या प्राइमर्समध्ये अंतर्भूत/हटवल्यामुळे लांब पेप्टाइड्स येऊ शकतात.हे डिझाइन केलेले स्टॉप कोडन फ्रेमच्या बाहेर ठेवते आणि नवीन स्टॉप कोडॉन डाउनस्ट्रीम दिसेपर्यंत ते वाचते.सर्वसाधारणपणे, आम्ही नमुना आउटपुट डेटासह इनपुट डेटाची तुलना करून सर्व चार निवड फेरीसाठी संवर्धन घटकांची गणना केली.स्क्रीनिंगच्या पहिल्या फेरीसाठी, आम्ही विशिष्ट पार्श्वभूमी संदर्भ म्हणून वाइल्ड-प्रकार फेज टायटर्स वापरले.विशेष म्हणजे, पहिल्या CSF सायकलमध्ये नकारात्मक फेजची निवड खूप मजबूत होती, परंतु रक्तामध्ये नाही (चित्र 3a), जे पेप्टाइड लायब्ररीच्या बहुतेक सदस्यांच्या CSF कंपार्टमेंटमध्ये निष्क्रिय प्रसाराच्या कमी संभाव्यतेमुळे असू शकते किंवा संबंधित फेज बॅक्टेरिओपेक्षा रक्तप्रवाहातून अधिक कार्यक्षमतेने टिकवून ठेवतात किंवा काढून टाकतात.तथापि, पॅनिंगच्या दुस-या फेरीत, दोन्ही क्लेड्समध्ये CSF मधील फेजची मजबूत निवड दिसून आली, जे सुचविते की मागील फेरी CSF शोषणास प्रोत्साहन देणारे पेप्टाइड्स प्रदर्शित करणारे फेजमध्ये समृद्ध होते (चित्र 3a).पुन्हा, लक्षणीय रक्त संवर्धनाशिवाय.तसेच तिसऱ्या आणि चौथ्या फेरीत, CSF मध्ये फेज क्लोन लक्षणीयरीत्या समृद्ध झाले.निवडीच्या शेवटच्या दोन फेऱ्यांमधील प्रत्येक अनन्य पेप्टाइड क्रमाच्या सापेक्ष वारंवारतेची तुलना करताना, आम्हाला असे आढळले की निवडीच्या चौथ्या फेरीत (चित्र 3b) अनुक्रम आणखी समृद्ध झाले आहेत.दोन्ही पेप्टाइड अभिमुखता वापरून सर्व 64 अद्वितीय पेप्टाइड अनुक्रमांमधून एकूण 931 ट्रायपेप्टाइड आकृतिबंध काढले गेले.इंजेक्टेड लायब्ररी (कट-ऑफ: 10% संवर्धन) (पूरक चित्र 6c) च्या तुलनेत चौथ्या फेरीतील सर्वात समृद्ध आकृतिबंधांचे त्यांच्या संवर्धन प्रोफाइलसाठी सर्व राऊंडमध्ये अधिक बारकाईने परीक्षण केले गेले.निवडीच्या सामान्य नमुन्यांवरून असे दिसून आले की बहुतेक अभ्यास केलेले हेतू दोन्ही निवड शाखांच्या मागील सर्व फेऱ्यांमध्ये समृद्ध होते.तथापि, काही आकृतिबंध (उदा. SGL, VSG, LGS GSV) प्रामुख्याने पर्यायी क्लेड A पासून होते, तर इतर (उदा. FGW, RTN, WGF, NTR) पर्यायी क्लेड B मध्ये समृद्ध होते.
CSF-समृद्ध फेज-प्रदर्शित पेप्टाइड्स आणि स्ट्रेप्टाव्हिडिन पेलोड्सशी संयुग्मित बायोटिनिलेटेड लीडर पेप्टाइड्सच्या CSF वाहतुकीचे प्रमाणीकरण.
(a) इंजेक्टेड (इनपुट = I) फेज (PFU) टायटर्स आणि निर्धारित CSF फेज टायटर्स (आउटपुट = O) वर आधारित सर्व चार फेऱ्यांमध्ये (R1-R4) गणना केलेले समृद्धी गुणोत्तर.शेवटच्या तीन फेऱ्यांसाठी (R2-R4) समृद्धी घटकांची गणना मागील फेरी आणि पहिल्या फेरीच्या (R1) वजन डेटासह तुलना करून केली गेली.ओपन बार सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड असतात, छायांकित बार प्लाझ्मा असतात.(***p<0.001, विद्यार्थ्याच्या टी-चाचणीवर आधारित).(b) सर्वात मुबलक फेज पेप्टाइड्सची यादी, निवडीच्या चौथ्या फेरीनंतर CSF मध्ये गोळा केलेल्या सर्व फेजच्या सापेक्ष प्रमाणानुसार रँक केली जाते.सहा सर्वात सामान्य फेज क्लोन रंग, क्रमांकित आणि निवडीच्या (इनसेट) फेरी 3 आणि 4 मधील त्यांच्या संवर्धन घटकांमध्ये हायलाइट केले जातात.(c,d) राउंड 4 मधील सहा सर्वात समृद्ध फेज क्लोन, रिक्त फेज आणि पॅरेंटल फेज पेप्टाइड लायब्ररींचे CSF सॅम्पलिंग मॉडेलमध्ये वैयक्तिकरित्या विश्लेषण केले गेले.CSF आणि रक्ताचे नमुने सूचित वेळेवर गोळा केले गेले.(c) समान प्रमाणात 6 उमेदवार फेज क्लोन (2 x 1010 फेजेस/प्राणी), रिक्त फेज (#1779) (2 x 1010 फेजेस/प्राणी) आणि स्टॉक फेज पेप्टाइड लायब्ररी (2 x 1012 फेजेस/प्राणी) कमीतकमी 3 सीएमच्या शेपटीत इंजेक्ट करा.प्रत्येक इंजेक्शन केलेल्या फेज क्लोन आणि फेज पेप्टाइड लायब्ररीचे CSF फार्माकोकाइनेटिक्स कालांतराने दर्शविले आहे.(d) सॅम्पलिंग वेळेत सर्व पुनर्प्राप्त झालेल्या फेज/एमएलसाठी सरासरी CSF/रक्त गुणोत्तर दर्शविते.(ई) चार सिंथेटिक लीडर पेप्टाइड्स आणि एक स्क्रॅम्बल्ड कंट्रोल बायोटिनशी त्यांच्या एन-टर्मिनस (टेट्रामर डिस्प्ले) द्वारे स्ट्रेप्टाव्हिडिनशी जोडले गेले आणि त्यानंतर इंजेक्शन (टेल व्हेन iv, 10 मिलीग्राम स्ट्रेप्टाव्हिडिन/किलो).किमान तीन इंट्यूबेटेड उंदीर (N = 3).).CSF नमुने सूचित वेळेत गोळा केले गेले आणि स्ट्रेप्टाव्हिडिन एकाग्रता CSF अँटी-स्ट्रेप्टाव्हिडिन ELISA (nd = आढळले नाही) द्वारे मोजली गेली.(*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ANOVA चाचणीवर आधारित).(f) निवडीच्या चौथ्या फेरीतील सर्वात समृद्ध फेज पेप्टाइड क्लोन #2002 (जांभळा) च्या इतर निवडलेल्या फेज पेप्टाइड क्लोनसह अमीनो ऍसिड अनुक्रमाची तुलना.एकसारखे आणि समान अमीनो आम्लाचे तुकडे रंग-कोड केलेले असतात.
चौथ्या फेरीतील सर्व समृद्ध फेजांपैकी (चित्र 3b), CSF सॅम्पलिंग मॉडेलमध्ये पुढील वैयक्तिक विश्लेषणासाठी सहा उमेदवार क्लोन निवडले गेले.समान प्रमाणात सहा उमेदवार फेज, रिक्त फेज (इन्सर्ट नाही) आणि प्रोफेज पेप्टाइड लायब्ररी तीन कॅन्युलेटेड सीएम प्राण्यांमध्ये इंजेक्ट केले गेले आणि फार्माकोकाइनेटिक्स CSF (Fig. 3c) आणि रक्त (पूरक अंजीर 7) परीक्षणांमध्ये निर्धारित केले गेले.चाचणी केलेल्या सर्व फेज क्लोनने रिक्त नियंत्रण फेज (#1779) पेक्षा 10-1000 पट जास्त स्तरावर CSF कंपार्टमेंटला लक्ष्य केले.उदाहरणार्थ, क्लोन #2020 आणि #2077 मध्ये कंट्रोल फेजपेक्षा सुमारे 1000 पट जास्त CSF टायटर्स होते.प्रत्येक निवडलेल्या पेप्टाइडचे फार्माकोकिनेटिक प्रोफाइल वेगळे असते, परंतु त्या सर्वांमध्ये उच्च CSF होमिंग क्षमता असते.आम्ही क्लोन्स #1903 आणि #2011 साठी कालांतराने सतत घट पाहिली, तर क्लोन #2077, #2002 आणि #2009 साठी पहिल्या 10 मिनिटांमध्ये वाढ सक्रिय वाहतूक दर्शवू शकते परंतु सत्यापित करणे आवश्यक आहे.क्लोन #2020, #2002, आणि #2077 उच्च पातळीवर स्थिर झाले, तर क्लोन #2009 ची CSF एकाग्रता सुरुवातीच्या वाढीनंतर हळूहळू कमी झाली.त्यानंतर आम्ही प्रत्येक CSF उमेदवाराच्या रक्तातील एकाग्रतेशी (Fig. 3d) तुलना केली.प्रत्येक CSF उमेदवाराच्या सरासरी टायटरचा त्याच्या रक्ताच्या टायटरशी सर्व सॅम्पलिंगच्या वेळी सहसंबंध दिसून आला की सहा उमेदवारांपैकी तीन उमेदवारांचे रक्त CSF मध्ये लक्षणीयरित्या समृद्ध होते.विशेष म्हणजे, क्लोन #2077 ने उच्च रक्त स्थिरता दर्शविली (पूरक आकृती 7).CSF कंपार्टमेंटमध्ये फेज कणांव्यतिरिक्त इतर मालवाहतूक करण्यासाठी पेप्टाइड्स स्वतः सक्षम आहेत याची पुष्टी करण्यासाठी, आम्ही एन-टर्मिनसमध्ये बायोटिनसह व्युत्पन्न केलेल्या चार लीडर पेप्टाइड्सचे संश्लेषण केले जेथे पेप्टाइड्स फेज कणांना जोडतात.बायोटिनिलेटेड पेप्टाइड्स (संख्या. 2002, 2009, 2020 आणि 2077) स्ट्रेप्टाव्हिडिन (SA) सह संयुग्मित केले गेले ज्यामुळे काही प्रमाणात फेज भूमितीची नक्कल करणारे मल्टीमेरिक फॉर्म प्राप्त झाले.या स्वरूपामुळे आम्हाला रक्त आणि सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइडमध्ये कार्गो-वाहतूक प्रोटीन पेप्टाइड्स म्हणून SA एक्सपोजर मोजण्याची परवानगी मिळाली.महत्त्वाचे म्हणजे, या SA-संयुग्मित स्वरूपात (चित्र 3e) सिंथेटिक पेप्टाइड्स प्रशासित केल्यावर फेज डेटा अनेकदा पुनरुत्पादित केला जाऊ शकतो.स्क्रॅम्बल्ड पेप्टाइड्सचे प्रारंभिक एक्सपोजर कमी होते आणि 48 तासांच्या आत न ओळखता येण्याजोग्या पातळीसह जलद CSF क्लिअरन्स होते.CSF स्पेसमध्ये या पेप्टाइड फेज क्लोनच्या डिलिव्हरी मार्गांबद्दल अंतर्दृष्टी मिळविण्यासाठी, आम्ही इम्युनोहिस्टोकेमिस्ट्री (IHC) वापरून वैयक्तिक फेज पेप्टाइड हिट्सचे स्थानिकीकरण विश्लेषित केले आणि विवोमध्ये इंट्राव्हेनस इंजेक्शनच्या 1 तासानंतर फेज कण थेट शोधले.विशेष म्हणजे, क्लोन #2002, #2077, आणि #2009 मेंदूच्या केशिकांमधील मजबूत डागांमुळे शोधले जाऊ शकतात, तर कंट्रोल फेज (#1779) आणि क्लोन #2020 आढळले नाहीत (पूरक आकृती 8).हे सूचित करते की हे पेप्टाइड्स BBB ओलांडून अचूकपणे मेंदूवर परिणाम करण्यास योगदान देतात.या गृहीतकाची चाचणी घेण्यासाठी पुढील तपशीलवार विश्लेषण आवश्यक आहे, कारण BSCFB मार्ग देखील गुंतलेला असू शकतो.इतर निवडलेल्या पेप्टाइड्ससह सर्वात समृद्ध क्लोन (#2002) च्या अमीनो ऍसिड अनुक्रमाची तुलना करताना, हे लक्षात आले की त्यांच्यापैकी काहींमध्ये समान अमीनो ऍसिड विस्तार आहेत, जे समान वाहतूक यंत्रणा (चित्र 3f) दर्शवू शकतात.
त्याच्या अद्वितीय प्लाझ्मा प्रोफाइलमुळे आणि कालांतराने CSF मध्ये लक्षणीय वाढ झाल्यामुळे, फेज डिस्प्ले क्लोन #2077 चा अधिक 48-तासांच्या कालावधीत शोध घेण्यात आला आणि सतत SA पातळीच्या (Fig. 4a) सह संबंधात CSF मधील जलद वाढ पुनरुत्पादित करण्यात सक्षम झाला.इतर ओळखल्या गेलेल्या फेज क्लोनच्या संदर्भात, #2077 ने मेंदूच्या केशिकांसाठी जोरदार डाग लावला आणि उच्च रिझोल्यूशनवर पाहिल्यावर केशिका मार्कर लेक्टिनसह लक्षणीय कोलोकलायझेशन दर्शविले आणि शक्यतो पॅरेन्कायमल स्पेसमध्ये काही डाग दिसून आले (आकृती 4b).पेप्टाइड-मध्यस्थ औषधीय प्रभाव CNS मध्ये मिळू शकतात की नाही हे तपासण्यासाठी, आम्ही एक प्रयोग केला ज्यामध्ये i) #2077 ट्रान्झिट पेप्टाइड आणि ii) BACE1 इनहिबिटर पेप्टाइडचे बायोटिनिलेटेड आवृत्त्या SA मध्ये दोन भिन्न गुणोत्तरांमध्ये मिसळले गेले.एका संयोजनासाठी आम्ही फक्त BACE1 पेप्टाइड इनहिबिटर वापरले आणि दुसऱ्यासाठी आम्ही #2077 पेप्टाइड BACE1 पेप्टाइड इनहिबिटरचे 1:3 गुणोत्तर वापरले.दोन्ही नमुने इंट्राव्हेनस प्रशासित केले गेले आणि बीटा-अमायलोइड पेप्टाइड 40 (अबेटा 40) चे रक्त आणि सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइडचे प्रमाण कालांतराने मोजले गेले.Abeta40 चे मोजमाप CSF मध्ये केले गेले कारण ते मेंदू पॅरेन्काइमामध्ये BACE1 प्रतिबंध दर्शवते.अपेक्षेप्रमाणे, दोन्ही कॉम्प्लेक्सने Abeta40 (Fig. 4c, d) च्या रक्त पातळीत लक्षणीय घट केली.तथापि, केवळ पेप्टाइडचे मिश्रण असलेले नमुने क्र.2077 आणि SA मध्ये संयुग्मित BACE1 पेप्टाइडच्या अवरोधामुळे सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड (Fig. 4c) मध्ये Abeta40 मध्ये लक्षणीय घट झाली.डेटा दर्शविते की पेप्टाइड क्र.2077 60 kDa SA प्रथिने CNS मध्ये वाहून नेण्यास सक्षम आहे आणि BACE1 पेप्टाइडच्या SA-संयुग्मित इनहिबिटरसह फार्माकोलॉजिकल प्रभाव देखील प्रेरित करते.
(a) T7 फेजचे क्लोनल इंजेक्शन (2 × 10 फेजेस/प्राणी) CSF पेप्टाइड #2077 (RLSSVDSDLSGC) चे दीर्घकालीन फार्माकोकाइनेटिक प्रोफाइल आणि कमीतकमी तीन CM-इंटुबेटेड उंदरांमध्ये अनइंजेक्टेड कंट्रोल फेज (#1779) दर्शविते.(b) फेज-इंजेक्टेड उंदीर (2 × 10 10 फेजेस/प्राणी) मधील प्रतिनिधी कॉर्टिकल मायक्रोव्हेसल्सची कॉन्फोकल मायक्रोस्कोपिक प्रतिमा पेप्टाइड #2077 आणि वाहिन्या (लेक्टिन) चे काउंटरस्टेनिंग दर्शवते.हे फेज क्लोन 3 उंदरांना दिले गेले आणि परफ्यूजन करण्यापूर्वी 1 तास प्रसारित होऊ दिले.T7 फेज कॅप्सिड विरुद्ध पॉलीक्लोनल FITC-लेबल केलेल्या अँटीबॉडीजसह मेंदू विभागलेले आणि डागलेले होते.परफ्युजन आणि त्यानंतरच्या फिक्सेशनच्या दहा मिनिटांपूर्वी, DyLight594-लेबल केलेले लेक्टिन अंतस्नायुद्वारे प्रशासित केले गेले.केशिका आणि पेरिव्हस्कुलर ब्रेन टिश्यूच्या लुमेनमध्ये मायक्रोवेसेल्स आणि फेजेस (हिरव्या) च्या ल्युमिनल बाजूचे लेक्टिन डाग (लाल) दर्शविणारी फ्लोरोसेंट प्रतिमा.स्केल बार 10 µm शी संबंधित आहे.(c, d) बायोटिनिलेटेड BACE1 इनहिबिटरी पेप्टाइड एकट्याने किंवा बायोटिनिलेटेड ट्रान्झिट पेप्टाइड #2077 च्या संयोगाने स्ट्रेप्टाव्हिडिनशी जोडले गेले आणि त्यानंतर कमीतकमी तीन कॅन्युलेटेड सीएम उंदीर (10 मिग्रॅ स्ट्रेप्टाव्हिडिन/किलो) च्या अंतस्नायु इंजेक्शनने.Aβ40 मधील BACE1 पेप्टाइड इनहिबिटर-मध्यस्थ घट हे रक्त (लाल) आणि सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड (नारिंगी) मध्ये Aβ1-40 ELISA द्वारे सूचित वेळेच्या बिंदूंवर मोजले गेले.चांगल्या स्पष्टतेसाठी, 100% च्या स्केलवर एक ठिपकेदार रेषा काढली आहे.(c) रक्तातील Aβ40 (लाल त्रिकोण) आणि सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड (नारिंगी त्रिकोण) मध्ये स्ट्रेप्टाव्हिडिन संयुग्मित पेप्टाइड #2077 आणि 3:1 च्या प्रमाणात BACE1 प्रतिबंधक पेप्टाइडसह उपचार केलेल्या उंदरांमध्ये टक्केवारी कमी होते.(d) रक्त Aβ40 (लाल वर्तुळे) आणि सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड (नारिंगी वर्तुळे) स्ट्रेप्टाव्हिडिन आणि फक्त BACE1 प्रतिबंधक पेप्टाइडसह उपचार केलेल्या उंदरांच्या टक्केवारीत घट.नियंत्रणातील Aβ एकाग्रता 420 pg/ml (मानक विचलन = 101 pg/ml) होती.
फेज डिस्प्ले बायोमेडिकल संशोधनाच्या अनेक क्षेत्रांमध्ये यशस्वीरित्या लागू केले गेले आहे.ही पद्धत विवो संवहनी विविधता अभ्यास18,19 तसेच सेरेब्रल वेसल्स 20,21,22,23,24,25,26 लक्ष्यित अभ्यासासाठी वापरली गेली आहे.या अभ्यासात, आम्ही या निवड पद्धतीचा वापर केवळ सेरेब्रल वाहिन्यांना लक्ष्य करणार्‍या पेप्टाइड्सच्या थेट ओळखीसाठीच नाही तर रक्त-मेंदूचा अडथळा पार करण्यासाठी सक्रिय वाहतूक गुणधर्म असलेल्या उमेदवारांच्या शोधासाठी देखील विस्तारित केले.आम्ही आता सीएम इंट्यूबेटेड उंदीरांमध्ये इन व्हिव्हो निवड प्रक्रियेच्या विकासाचे वर्णन करतो आणि CSF होमिंग गुणधर्मांसह पेप्टाइड्स ओळखण्याची क्षमता प्रदर्शित करतो.12-मेर यादृच्छिक पेप्टाइड्सची लायब्ररी प्रदर्शित करणार्‍या T7 फेजचा वापर करून, आम्ही हे दाखवून देऊ शकलो की T7 फेज पुरेसा लहान आहे (अंदाजे 60 एनएम व्यासाचा) 10 रक्त-मेंदूच्या अडथळ्याशी जुळवून घेता येईल, ज्यामुळे थेट रक्त-मेंदू अडथळा किंवा चोरोस ओलांडला जाईल.आम्ही निरीक्षण केले की कॅन्युलेटेड सीएम उंदरांपासून CSF काढणी ही व्हिव्हो फंक्शनल स्क्रीनिंग पद्धतीमध्ये चांगली नियंत्रित होती आणि काढलेला फेज केवळ रक्तवहिन्याशीच बांधला जात नाही तर रक्त-मेंदूच्या अडथळा ओलांडून ट्रान्सपोर्टर म्हणून देखील कार्य करतो.शिवाय, एकाच वेळी रक्त गोळा करून आणि CSF आणि रक्त-व्युत्पन्न फेजवर HTS लागू करून, आम्ही पुष्टी केली की CSF ची आमची निवड रक्त संवर्धन किंवा निवडीच्या फेऱ्यांमधील विस्तारासाठी तंदुरुस्तीने प्रभावित झालेली नाही.तथापि, रक्ताचा डबा हा निवड प्रक्रियेचा एक भाग आहे, कारण CSF कंपार्टमेंटपर्यंत पोहोचण्यास सक्षम असलेले फेजेस मेंदूमध्ये स्वतःला समृद्ध करण्यासाठी रक्तप्रवाहात दीर्घकाळ टिकून राहणे आवश्यक आहे.कच्च्या HTS डेटामधून विश्वसनीय अनुक्रम माहिती काढण्यासाठी, आम्ही विश्लेषण वर्कफ्लोमध्ये प्लॅटफॉर्म-विशिष्ट अनुक्रम त्रुटींसाठी अनुकूल फिल्टर लागू केले.स्क्रिनिंग पद्धतीमध्ये गतिज मापदंडांचा समावेश करून, आम्ही रक्त24, 27, 28 मध्ये जंगली-प्रकारचे T7 फेजेस (t½ ~ 28 मिनिट) च्या जलद फार्माकोकाइनेटिक्सची पुष्टी केली आणि सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड (t½ ~ 26 मिनिट) प्रति मिनिट) मध्ये त्यांचे अर्धे आयुष्य देखील निर्धारित केले.रक्त आणि CSF मध्ये समान फार्माकोकिनेटिक प्रोफाइल असूनही, CSF मध्ये फेजच्या रक्तातील एकाग्रतेपैकी फक्त 0.001% शोधले जाऊ शकते, जे रक्त-मेंदूच्या अडथळा ओलांडून जंगली-प्रकार T7 फेजची कमी पार्श्वभूमी गतिशीलता दर्शवते.हे काम विवो पॅनिंग रणनीती वापरताना निवडीच्या पहिल्या फेरीचे महत्त्व अधोरेखित करते, विशेषत: फेज सिस्टीमसाठी जे रक्ताभिसरणातून वेगाने साफ केले जातात, कारण काही क्लोन CNS कंपार्टमेंटमध्ये पोहोचू शकतात.अशा प्रकारे, पहिल्या फेरीत, लायब्ररीच्या विविधतेतील घट खूप मोठी होती, कारण या अत्यंत कठोर CSF मॉडेलमध्ये केवळ मर्यादित संख्येने क्लोन गोळा केले गेले.विवो पॅनिंग रणनीतीमध्ये अनेक निवड चरणांचा समावेश आहे जसे की CSF कंपार्टमेंटमध्ये सक्रिय संचय, रक्ताच्या डब्यात क्लोन जगणे आणि पहिल्या 10 मिनिटांत रक्तातून T7 फेज क्लोन जलद काढणे (चित्र 1d आणि पूरक आकृती 4M).).अशा प्रकारे, पहिल्या फेरीनंतर, सीएसएफमध्ये भिन्न फेज क्लोन ओळखले गेले, जरी समान प्रारंभिक पूल वैयक्तिक प्राण्यांसाठी वापरला गेला.हे सूचित करते की मोठ्या संख्येने लायब्ररी सदस्यांसह स्त्रोत लायब्ररींसाठी अनेक कठोर निवड चरणांमुळे विविधतेत लक्षणीय घट होते.त्यामुळे, यादृच्छिक घटना प्रारंभिक निवड प्रक्रियेचा अविभाज्य भाग बनतील, परिणामांवर मोठ्या प्रमाणावर प्रभाव टाकतील.मूळ लायब्ररीतील अनेक क्लोनमध्ये CSF संवर्धन प्रवृत्ती सारखीच असण्याची शक्यता आहे.तथापि, समान प्रायोगिक परिस्थितीत देखील, प्रारंभिक पूलमधील प्रत्येक विशिष्ट क्लोनच्या लहान संख्येमुळे निवड परिणाम भिन्न असू शकतात.
CSF मध्ये समृद्ध केलेले आकृतिबंध रक्तातील पेक्षा वेगळे असतात.विशेष म्हणजे, आम्ही वैयक्तिक प्राण्यांच्या रक्तातील ग्लाइसिन-समृद्ध पेप्टाइड्सकडे पहिले शिफ्ट पाहिले.(Fig. 1g, Supplementary Figs. 4e, 4f).ग्लायसिन पेप्टाइड्स असलेले फेज अधिक स्थिर असू शकतात आणि रक्ताभिसरणातून बाहेर काढण्याची शक्यता कमी असते.तथापि, सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइडच्या नमुन्यांमध्ये हे ग्लाइसिन-समृद्ध पेप्टाइड्स आढळले नाहीत, हे सूचित करते की क्युरेट केलेल्या लायब्ररी दोन वेगवेगळ्या निवड चरणांमधून जातात: एक रक्तात आणि दुसरा सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइडमध्ये जमा होऊ दिला.निवडीच्या चौथ्या फेरीच्या परिणामी CSF- समृद्ध क्लोनची विस्तृतपणे चाचणी केली गेली आहे.जवळजवळ सर्व वैयक्तिकरित्या चाचणी केलेले क्लोन रिक्त नियंत्रण फेजच्या तुलनेत CSF मध्ये समृद्ध असल्याची पुष्टी केली गेली.एक पेप्टाइड हिट (#2077) अधिक तपशीलवार तपासले गेले.इतर हिट्स (आकृती 3d आणि पूरक आकृती 7) च्या तुलनेत याने दीर्घ प्लाझ्मा अर्ध-जीवन दर्शविले आणि मनोरंजकपणे, या पेप्टाइडमध्ये सी-टर्मिनसमध्ये सिस्टीन अवशेष होते.हे अलीकडेच दर्शविले गेले आहे की पेप्टाइड्समध्ये सिस्टीन जोडल्याने अल्ब्युमिन 29 ला बांधून त्यांचे फार्माकोकिनेटिक गुणधर्म सुधारू शकतात.हे सध्या पेप्टाइड #2077 साठी अज्ञात आहे आणि पुढील अभ्यासाची आवश्यकता आहे.काही पेप्टाइड्सने CSF संवर्धन (डेटा दर्शविला नाही) मध्ये व्हॅलेन्स-अवलंबन दर्शवले, जे T7 कॅप्सिडच्या प्रदर्शित पृष्ठभाग भूमितीशी संबंधित असू शकते.आम्ही वापरलेल्या T7 प्रणालीमध्ये प्रत्येक पेप्टाइडच्या प्रति फेज कणाच्या 5-15 प्रती दिसल्या.IHC हे उंदरांच्या सेरेब्रल कॉर्टेक्समध्ये इंट्राव्हेनस इंजेक्ट केलेल्या उमेदवार लीड फेज क्लोनवर केले गेले (पूरक चित्र 8).डेटावरून असे दिसून आले की किमान तीन क्लोन (क्रमांक 2002, क्रमांक 2009 आणि क्रमांक 2077) बीबीबीशी संवाद साधतात.या BBB परस्परसंवादाचा परिणाम CSF जमा होतो की या क्लोनची हालचाल थेट BCSFB कडे होते हे निश्चित करणे बाकी आहे.महत्त्वाचे म्हणजे, आम्ही दाखवतो की निवडलेले पेप्टाइड्स संश्लेषित केल्यावर आणि प्रथिने कार्गोला बांधलेले असताना त्यांची CSF वाहतूक क्षमता टिकवून ठेवतात.एन-टर्मिनल बायोटिनिलेटेड पेप्टाइड्सचे SA ला बंधन अनिवार्यपणे रक्त आणि सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड (चित्र 3e) मध्ये त्यांच्या संबंधित फेज क्लोनसह प्राप्त झालेल्या परिणामांची पुनरावृत्ती करते.शेवटी, आम्ही दाखवतो की लीड पेप्टाइड #2077 SA मध्ये संयुग्मित BACE1 च्या बायोटिनिलेटेड पेप्टाइड इनहिबिटरच्या मेंदूच्या क्रियेला प्रोत्साहन देण्यास सक्षम आहे, ज्यामुळे CSF मधील Abeta40 पातळी लक्षणीयरीत्या कमी करून CNS मध्ये स्पष्ट फार्माकोडायनामिक प्रभाव निर्माण होतो (चित्र 4).आम्ही सर्व हिट्सचा पेप्टाइड सीक्वेन्स होमोलॉजी शोध करून डेटाबेसमधील कोणतेही समरूप ओळखण्यात अक्षम होतो.हे लक्षात घेणे महत्वाचे आहे की T7 लायब्ररीचा आकार अंदाजे 109 आहे, तर 12-mers साठी सैद्धांतिक लायब्ररीचा आकार 4 x 1015 आहे. म्हणून, आम्ही 12-mer पेप्टाइड लायब्ररीच्या विविधतेच्या जागेचा फक्त एक छोटासा भाग निवडला आहे, याचा अर्थ असा होऊ शकतो की या पेप्टाइड्सच्या जाहिरातीद्वारे ओळखल्या जाणार्‍या अधिक ऑप्टिमाइझ केलेल्या जागा ओळखल्या जाऊ शकतात.काल्पनिकदृष्ट्या, आम्हाला या पेप्टाइड्सचे कोणतेही नैसर्गिक समरूप सापडले नाहीत याचे एक कारण म्हणजे उत्क्रांतीदरम्यान विशिष्ट पेप्टाइड हेतूंचा मेंदूमध्ये अनियंत्रित प्रवेश रोखण्यासाठी निवड रद्द करणे.
एकत्रितपणे, आमचे परिणाम अधिक तपशीलवार विवोमधील सेरेब्रोव्हस्कुलर अडथळ्याची वाहतूक प्रणाली ओळखण्यासाठी आणि वैशिष्ट्यीकृत करण्यासाठी भविष्यातील कार्यासाठी आधार प्रदान करतात.या पद्धतीचा मूलभूत सेटअप फंक्शनल निवड धोरणावर आधारित आहे जो केवळ सेरेब्रल व्हॅस्कुलर बंधनकारक गुणधर्मांसह क्लोन ओळखत नाही तर एक गंभीर पायरी देखील समाविष्ट करते ज्यामध्ये यशस्वी क्लोनमध्ये सीएनएस कंपार्टमेंटमध्ये व्हिव्होमध्ये जैविक अडथळे पार करण्यासाठी आंतरिक क्रिया असते.या पेप्टाइड्सच्या वाहतुकीची यंत्रणा आणि मेंदूच्या क्षेत्राशी संबंधित मायक्रोव्हॅस्क्युलेचरशी जोडण्याची त्यांची प्राधान्ये स्पष्ट करणे आहे.यामुळे BBB आणि रिसेप्टर्सच्या वाहतुकीसाठी नवीन मार्गांचा शोध होऊ शकतो.आम्ही अपेक्षा करतो की ओळखले जाणारे पेप्टाइड्स थेट सेरेब्रोव्हस्कुलर रिसेप्टर्सशी किंवा BBB किंवा BCSFB द्वारे वाहून नेल्या जाणार्‍या प्रसारित लिगँड्सशी बांधले जाऊ शकतात.या कामात सापडलेल्या CSF वाहतूक क्रियाकलापांसह पेप्टाइड वेक्टर्सची पुढील तपासणी केली जाईल.आम्ही सध्या BBB आणि/किंवा BCSFB ओलांडण्याच्या क्षमतेसाठी या पेप्टाइड्सच्या मेंदूच्या विशिष्टतेची तपासणी करत आहोत.हे नवीन पेप्टाइड्स नवीन रिसेप्टर्स किंवा मार्गांच्या संभाव्य शोधासाठी आणि मेंदूला जीवशास्त्रासारख्या मॅक्रोमोलेक्यूल्सच्या वितरणासाठी नवीन अत्यंत कार्यक्षम प्लॅटफॉर्मच्या विकासासाठी अत्यंत मौल्यवान साधने असतील.
पूर्वी वर्णन केलेल्या पद्धतीत बदल करून लार्ज सिस्टरना (CM) कॅन्युलेट करा.ऍनेस्थेटाइज्ड विस्टार उंदीर (200-350 ग्रॅम) एका स्टिरिओटॅक्सिक उपकरणावर बसवले गेले आणि कवटीला उघड करण्यासाठी मुंडण केलेल्या आणि अ‍ॅसेप्टली तयार केलेल्या टाळूवर एक मध्यम चीरा बनविला गेला.वरच्या सॅशच्या क्षेत्रामध्ये दोन छिद्रे ड्रिल करा आणि छिद्रांमध्ये फिक्सिंग स्क्रू बांधा.सीएममध्ये स्टेनलेस स्टील कॅन्युलाच्या स्टिरिओटॅक्टिक मार्गदर्शनासाठी लॅटरल ओसीपीटल क्रेस्टमध्ये अतिरिक्त छिद्र पाडण्यात आले.कॅन्युलाभोवती डेंटल सिमेंट लावा आणि स्क्रूने सुरक्षित करा.फोटो-क्युरिंग आणि सिमेंट कडक झाल्यानंतर, त्वचेची जखम 4/0 सुप्रॅमिड सिवनीने बंद केली गेली.सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड (CSF) च्या उत्स्फूर्त गळतीमुळे कॅन्युलाची योग्य जागा निश्चित केली जाते.स्टिरिओटॅक्सिक उपकरणातून उंदीर काढून टाका, योग्य पोस्टऑपरेटिव्ह काळजी आणि वेदना व्यवस्थापन मिळवा आणि सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइडमध्ये रक्ताची चिन्हे दिसेपर्यंत त्याला किमान एक आठवडा बरा होऊ द्या.विस्टार उंदीर (Crl:WI/Han) चार्ल्स नदी (फ्रान्स) येथून मिळवले गेले.सर्व उंदीर विशिष्ट रोगजनक-मुक्त परिस्थितीत ठेवण्यात आले होते.सर्व प्राण्यांचे प्रयोग स्वित्झर्लंडच्या बासेल शहराच्या पशुवैद्यकीय कार्यालयाने मंजूर केले होते आणि ते प्राणी परवाना क्रमांक 2474 (सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड आणि उंदराच्या मेंदूतील उपचारात्मक उमेदवारांच्या पातळीचे मोजमाप करून सक्रिय मेंदूच्या वाहतुकीचे मूल्यांकन) नुसार केले गेले होते.
सीएम कॅन्युला हातात घेऊन उंदराला हळूवारपणे जागृत ठेवा.दातुरा कॅन्युलामधून काढा आणि 10 μl उत्स्फूर्तपणे वाहणारे सेरेब्रोस्पाइनल द्रव गोळा करा.कॅन्युलाच्या पेटन्सीशी शेवटी तडजोड करण्यात आली असल्याने, या अभ्यासात केवळ स्पष्ट सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइडचे नमुने समाविष्ट केले गेले ज्यामध्ये रक्त दूषित किंवा विकृतीकरणाचा कोणताही पुरावा नाही.समांतर, शेपटीच्या टोकाला असलेल्या एका लहान चीरामधून अंदाजे 10-20 μl रक्त हेपरिन (सिग्मा-अल्ड्रिच) असलेल्या नळ्यांमध्ये घेण्यात आले.T7 फेजच्या इंट्राव्हेनस इंजेक्शननंतर वेगवेगळ्या वेळी CSF आणि रक्त गोळा केले गेले.प्रत्येक CSF नमुना गोळा करण्यापूर्वी अंदाजे 5-10 μl द्रव टाकून देण्यात आला, जो कॅथेटरच्या मृत व्हॉल्यूमशी संबंधित आहे.
T7Select 10-3b व्हेक्टर वापरून T7Select सिस्टीम मॅन्युअल (Novagen, Rosenberg et al., Innovations 6, 1-6, 1996) मध्ये वर्णन केल्याप्रमाणे लायब्ररी तयार केल्या गेल्या.थोडक्यात, यादृच्छिक 12-मेर डीएनए इन्सर्ट खालील स्वरूपात संश्लेषित केले गेले:
NNK कोडॉनचा वापर इन्सर्टमध्ये डबल स्टॉप कोडन आणि एमिनो अॅसिड ओव्हरएक्सप्रेशन टाळण्यासाठी केला गेला.N हे प्रत्येक न्यूक्लियोटाइडचे स्वहस्ते मिश्रित समतुल्य गुणोत्तर आहे आणि K हे अॅडेनाइन आणि सायटोसिन न्यूक्लियोटाइड्सचे स्वहस्ते मिश्रित समतुल्य गुणोत्तर आहे.37°C तापमानावर 3 तासांसाठी Klenow बफर (न्यू इंग्लंड बायोलॅब्स) मध्ये dNTP (Novagen) आणि Klenow enzyme (New England Biolabs) सह पुढील उष्मायनाद्वारे सिंगल स्ट्रँडेड प्रदेश दुहेरी अडकलेल्या DNA मध्ये रूपांतरित झाले.प्रतिक्रियेनंतर, EtOH पर्जन्याद्वारे डबल-स्ट्रॅन्ड डीएनए पुनर्प्राप्त करण्यात आला.परिणामी डीएनए प्रतिबंधित एन्झाइम्स इकोआरआय आणि हिंदIII (दोन्ही रोचेपासून) सह पचले गेले.क्लीव्ह्ड आणि प्युरिफाईड (QIAquick, Qiagen) इन्सर्ट (T4 ligase, New England Biolabs) नंतर 10B कॅप्सिड जनुकाच्या अमिनो ऍसिड 348 नंतर प्री-क्लीव्हड T7 वेक्टरमध्ये फ्रेममध्ये बांधले गेले.इन विट्रो पॅकेजिंगच्या 18 तास आधी लिगेशन रिअॅक्शन 16° से. तापमानात उष्मायन केले गेले.T7Select 10-3b क्लोनिंग किट (Novagen) सह पुरवलेल्या सूचनांनुसार विट्रोमध्ये फेज पॅकेजिंग केले गेले आणि एस्चेरिचिया कोली (BLT5615, नोवाजेन) वापरून पॅकेजिंग सोल्यूशन एकदा लिसिसपर्यंत वाढवले ​​गेले.ग्लिसरॉलचे स्टॉक सोल्यूशन म्हणून लाइसेट्स सेंट्रीफ्यूज, टायट्रेट आणि -80 डिग्री सेल्सिअस तापमानात गोठवले गेले.
प्रोप्रायटरी 454/Roche-amplicon फ्यूजन प्राइमर्स वापरून मटनाचा रस्सा किंवा प्लेटमध्ये वाढवलेला फेज व्हेरिएबल क्षेत्रांचे थेट पीसीआर प्रवर्धन.फॉरवर्ड फ्यूजन प्राइमरमध्ये व्हेरिएबल रिजन (NNK) 12 (टेम्पलेट-विशिष्ट), GS FLX टायटॅनियम अॅडॉप्टर A, आणि फोर-बेस लायब्ररी की सिक्वेन्स (TCAG) (पूरक आकृती 1a):
रिव्हर्स फ्यूजन प्राइमरमध्ये कॅप्चर बीड्सला जोडलेले बायोटिन आणि इमल्शन पीसीआर दरम्यान क्लोनल अॅम्प्लिफिकेशनसाठी आवश्यक GS FLX टायटॅनियम अॅडॉप्टर बी देखील समाविष्ट आहे:
त्यानंतर 454 GS-FLX टायटॅनियम प्रोटोकॉलनुसार amplicons 454/Roche pyrosequencing च्या अधीन होते.मॅन्युअल सेंगर सिक्वेन्सिंगसाठी (अप्लाईड बायोसिस्टम हिटाची 3730 xl DNA विश्लेषक), T7 फेज DNA PCR द्वारे वाढवले ​​गेले आणि खालील प्राइमर जोड्यांसह अनुक्रम केले गेले:
रोश फास्ट स्टार्ट डीएनए पॉलिमरेझ किट (निर्मात्याच्या सूचनांनुसार) वापरून वैयक्तिक फलकांच्या इन्सर्टवर पीसीआर प्रवर्धन केले गेले.हॉट स्टार्ट (95 °C वर 10 मिनिटे) आणि 35 बूस्ट सायकल (95 °C वर 50 s, 50 °C वर 1 मिनिट आणि 72 °C वर 1 मिनिट) करा.
लायब्ररीतील फेज, वाइल्ड-टाइप फेज, CSF आणि रक्तातून सुटलेले फेज किंवा वैयक्तिक क्लोन Escherichia coli BL5615 मध्ये TB मटनाचा रस्सा (Sigma Aldrich) किंवा 500 cm2 डिशेस (थर्मो सायंटिफिक) मध्ये 4 तास 37°C तापमानात वाढवले ​​गेले.ट्रिस-ईडीटीए बफर (फ्लुका अॅनालिटिकल) सह प्लेट्स स्वच्छ धुवून किंवा निर्जंतुक विंदुक टिपांसह प्लेक्स गोळा करून प्लेट्समधून फेज काढले गेले.पॉलीथिलीन ग्लायकॉल (पीईजी 8000) पर्जन्य (प्रोमेगा) च्या एका राउंडसह कल्चर सुपरनॅटंट किंवा एक्स्ट्रक्शन बफरपासून फेज वेगळे केले गेले आणि ट्रिस-ईडीटीए बफरमध्ये पुन्हा निलंबित केले गेले.
इंट्राव्हेनस (IV) इंजेक्शन (500 μl/प्राणी) आधी एन्डोटॉक्सिन रिमूव्हल बीड्स (मिलटेनी बायोटेक) वापरून अॅम्प्लीफाइड फेजला एंडोटॉक्सिन काढण्याच्या 2-3 फेऱ्या केल्या गेल्या.पहिल्या फेरीत, 2×1012 फेज सादर केले गेले;दुसऱ्यामध्ये, 2×1010 फेज;तिसऱ्या आणि चौथ्या निवड फेरीत, प्रति प्राणी 2×109 फेज.CSF मधील फेज सामग्री आणि सूचित वेळेवर गोळा केलेले रक्त नमुने निर्मात्याच्या सूचनांनुसार फलक मोजणीद्वारे निर्धारित केले गेले (T7 सिलेक्ट सिस्टम मॅन्युअल).शेपटीच्या शिरामध्ये शुद्ध लायब्ररीच्या इंट्राव्हेनस इंजेक्शनद्वारे किंवा मागील निवड फेरीमधून सीएसएफमधून काढलेल्या फेजच्या री-इंजेक्शनद्वारे फेज निवड केली गेली आणि त्यानंतरची कापणी 10 मिनिट, 30 मिनिट, 60 मिनिट, 90 मि, 120 मिनिट, 180 मिनिट आणि 240 मि.इन व्हिव्हो पॅनिंगच्या एकूण चार फेऱ्या घेण्यात आल्या ज्यामध्ये निवडलेल्या पहिल्या तीन फेऱ्यांमध्ये दोन निवडलेल्या शाखांचे स्वतंत्रपणे संग्रहित आणि विश्लेषण करण्यात आले.निवडीच्या पहिल्या दोन फेऱ्यांमधून CSF मधून काढलेले सर्व फेज इन्सर्ट 454/Roche pyrosequencing च्या अधीन होते, तर निवडीच्या शेवटच्या दोन फेऱ्यांमधून CSF मधून काढलेले सर्व क्लोन मॅन्युअली अनुक्रमित होते.निवडीच्या पहिल्या फेरीतील सर्व रक्त फेज देखील 454/Roche pyrosequencing च्या अधीन होते.फेज क्लोनच्या इंजेक्शनसाठी, निवडलेले फेजेस 4 तासांसाठी 37°C तापमानावर 500 सेमी 2 प्लेट्सवर E. coli (BL5615) मध्ये वाढवले ​​गेले.वैयक्तिकरित्या निवडलेले आणि स्वहस्ते अनुक्रमित क्लोन टीबी माध्यमात प्रसारित केले गेले.फेज काढल्यानंतर, एंडोटॉक्सिनचे शुद्धीकरण आणि काढून टाकल्यानंतर (वर वर्णन केल्याप्रमाणे), 300 μl मध्ये 2×1010 फेजेस/प्राणी एका शेपटीच्या शिरामध्ये इंट्राव्हेनस इंजेक्ट केले गेले.
अनुक्रम डेटाचे प्रीप्रोसेसिंग आणि गुणात्मक फिल्टरिंग.Raw 454/Roche डेटा बायनरी स्टँडर्ड स्ट्रीम मॅप फॉरमॅट (sff) मधून वेंडर सॉफ्टवेअर वापरून Pearson ह्युमन रीडेबल फॉरमॅट (fasta) मध्ये रूपांतरित करण्यात आला.न्यूक्लियोटाइड अनुक्रमाची पुढील प्रक्रिया खाली वर्णन केल्याप्रमाणे प्रोप्रायटरी सी प्रोग्राम्स आणि स्क्रिप्ट्स (अप्रकाशित सॉफ्टवेअर पॅकेज) वापरून केली गेली.प्राथमिक डेटाच्या विश्लेषणामध्ये कठोर मल्टी-स्टेज फिल्टरिंग प्रक्रियांचा समावेश आहे.फिल्टर आउट वाचण्यासाठी ज्यामध्ये वैध 12 एमआर घाला डीएनए अनुक्रम आहे, वाचन अनुक्रमे लेबल (जीटीजीएटीजीटीसीजीजीजीजीटीसीजीएटीटीसीटी), स्टॉप लेबल (टॅगटीटीजीसीजीजीसीजीसीसीसीसीसीजीएजीटीए) आणि पार्श्वभूमी इन्सर्ट (सीसीसीटीजीसीजीएटीसीसीजीजीटीसीजीटीसीजीटीसीजीसीजीटीसीजीटीसीजीटीसीजीटीसीजीसीटीसीजीटीसीजीटीसीजीटीसीजीटीसीजीटीसीजीसीटीसीजीटीसीजीटीसीजीटीसीजीटीसीजीजीटीसीजीटीसीजीटीसीजीटीसीजीटीसीजीटीसीजीटीसी)संरेखन प्रति संरेखन 31 पर्यंत 2 विसंगतींना अनुमती देते.म्हणून, स्टार्ट आणि स्टॉप टॅगशिवाय वाचलेले वाचन आणि पार्श्वभूमी समाविष्ट असलेले वाचन, म्हणजे, अनुमत जुळण्यांच्या संख्येपेक्षा जास्त संरेखन, लायब्ररीमधून काढले गेले.उर्वरित वाचनांसाठी, N-mer DNA क्रम प्रारंभ चिन्हापासून विस्तारित आणि स्टॉप चिन्हापूर्वी समाप्त होण्याआधी मूळ वाचन क्रमातून काढून टाकण्यात आला आणि पुढील प्रक्रिया केली गेली (यापुढे "इन्सर्ट" म्हणून संदर्भित).इन्सर्टचे भाषांतर केल्यानंतर, प्राइमरच्या 5′ शेवटी असलेल्या पहिल्या स्टॉप कोडन नंतरचा भाग इन्सर्टमधून काढून टाकला जातो.याव्यतिरिक्त, प्राइमरच्या 3′ शेवटी अपूर्ण कोडन बनवणारे न्यूक्लियोटाइड्स देखील काढले गेले.फक्त पार्श्वभूमी अनुक्रम असलेले इन्सर्ट वगळण्यासाठी, एमिनो अॅसिड पॅटर्न "PAG" ने सुरू होणारे भाषांतरित इन्सर्ट देखील काढले गेले.लायब्ररीतून 3 पेक्षा कमी अमीनो ऍसिडची पोस्ट-अनुवादित लांबी असलेले पेप्टाइड्स काढून टाकण्यात आले.शेवटी, इन्सर्ट पूलमधील रिडंडंसी काढून टाका आणि प्रत्येक अनन्य इन्सर्टची वारंवारता निश्चित करा.या विश्लेषणाच्या परिणामांमध्ये न्यूक्लियोटाइड अनुक्रमांची सूची (इन्सर्ट) आणि त्यांची (वाचलेली) वारंवारता (पूरक आकृती 1c आणि 2) समाविष्ट आहे.
अनुक्रम समानतेनुसार गट N-mer DNA घालणे: 454/Roche-विशिष्ट अनुक्रम त्रुटी दूर करण्यासाठी (जसे की homopolymer एक्स्टेंशन अनुक्रमित करण्यात समस्या) आणि कमी महत्त्वाच्या रिडंडंसी काढून टाकण्यासाठी, पूर्वी फिल्टर केलेले N-mer DNA अनुक्रम घालणे (इन्सर्ट) समानतेनुसार क्रमवारी लावले जातात.खालीलप्रमाणे परिभाषित केलेल्या पुनरावृत्ती अल्गोरिदमचा वापर करून इन्सर्शन (2 न जुळणार्‍या बेसेसला अनुमती आहे): इनसर्शन प्रथम त्यांच्या वारंवारतेनुसार (सर्वोच्च ते सर्वात कमी) क्रमवारी लावले जातात आणि जर ते समान असतील तर त्यांच्या दुय्यम क्रमवारीनुसार लांबीनुसार (सर्वात लांब ते सर्वात लहान) ).अशाप्रकारे, सर्वात वारंवार आणि प्रदीर्घ प्रवेश प्रथम "गट" परिभाषित करतात.समूह वारंवारता की वारंवारता सेट केली आहे.त्यानंतर, क्रमवारी लावलेल्या सूचीमध्ये उरलेल्या प्रत्येक निविष्टाला पेअरवाइज नीडलमन-वुन्श अलाइनमेंटद्वारे गटामध्ये जोडण्याचा प्रयत्न केला गेला.जर संरेखनमधील विसंगती, अंतर्भूत किंवा हटवण्याची संख्या 2 च्या थ्रेशोल्डपेक्षा जास्त नसेल, तर ग्रुपमध्ये एक इन्सर्टेशन जोडले जाते आणि एकूण ग्रुप फ्रिक्वेन्सी किती वेळा समाविष्ट केली गेली याने वाढवली जाते.समुहामध्ये जोडलेले इन्सर्ट वापरलेले म्हणून चिन्हांकित केले जातात आणि पुढील प्रक्रियेतून वगळले जातात.जर आधीपासून अस्तित्वात असलेल्या गटामध्ये घाला क्रम जोडला जाऊ शकत नसेल, तर घाला क्रम योग्य इन्सर्ट फ्रिक्वेंसीसह नवीन गट तयार करण्यासाठी वापरला जातो आणि वापरल्याप्रमाणे चिन्हांकित केला जातो.पुनरावृत्ती समाप्त होते जेव्हा प्रत्येक अंतर्भूत क्रम नवीन गट तयार करण्यासाठी वापरला जातो किंवा आधीपासून अस्तित्वात असलेल्या गटामध्ये समाविष्ट केला जाऊ शकतो.अखेरीस, न्यूक्लियोटाइड्सचा समावेश असलेल्या गटबद्ध इन्सर्टचे अखेरीस पेप्टाइड अनुक्रमांमध्ये (पेप्टाइड लायब्ररी) भाषांतर केले जाते.या विश्लेषणाचा परिणाम म्हणजे इन्सर्शन आणि त्यांच्या संबंधित फ्रिक्वेन्सीचा एक संच जो सलग वाचनांची संख्या बनवतो (पूरक चित्र 2).
मोटिफ जनरेशन: अद्वितीय पेप्टाइड्सच्या सूचीवर आधारित, खाली दर्शविल्याप्रमाणे सर्व संभाव्य अमीनो ऍसिड पॅटर्न (एए) असलेली लायब्ररी तयार केली गेली.पेप्टाइडमधून लांबी 3 चा प्रत्येक संभाव्य पॅटर्न काढला गेला आणि सर्व पॅटर्न (ट्रिपेप्टाइड्स) असलेल्या कॉमन मोटिफ लायब्ररीसह त्याचा व्यस्त पॅटर्न जोडला गेला.अत्यंत पुनरावृत्ती होणाऱ्या आकृतिबंधांची लायब्ररी अनुक्रमित करण्यात आली आणि रिडंडंसी काढून टाकण्यात आली.नंतर, मोटिफ लायब्ररीतील प्रत्येक ट्रिपप्टाइडसाठी, आम्ही संगणकीय साधनांचा वापर करून लायब्ररीमध्ये त्याची उपस्थिती तपासली.या प्रकरणात, आढळलेल्या मोटिफ ट्रायपेप्टाइड असलेल्या पेप्टाइडची वारंवारता जोडली जाते आणि मोटिफ लायब्ररीमध्ये ("मोटिफची संख्या") मोटिफला नियुक्त केली जाते.आकृतिबंध निर्मितीचा परिणाम म्हणजे त्रिपेप्टाइड्स (मोटिफ्स) आणि त्यांच्या संबंधित मूल्यांच्या सर्व घटनांचा समावेश असलेला द्वि-आयामी अ‍ॅरे आहे, जे अनुक्रम वाचनाची संख्या आहे ज्यामुळे रीड फिल्टर, गटबद्ध आणि अनुवादित केले जातात तेव्हा संबंधित आकृतिबंधात परिणाम होतो.वर वर्णन केल्याप्रमाणे मेट्रिक्स.
मोटिफ्स आणि संबंधित स्कॅटरप्लॉट्सच्या संख्येचे सामान्यीकरण: प्रत्येक नमुन्यासाठी मोटिफ्सची संख्या वापरून सामान्यीकृत केली गेली.
जेथे ni हा विषय i समाविष्ट असलेल्या वाचनाची संख्या आहे.अशाप्रकारे, vi नमुन्यातील motif i असलेल्या वाचनाची (किंवा पेप्टाइड्स) वारंवारता दर्शवते.फिशरच्या अचूक चाचणीचा वापर करून नॉन-सामान्यीकृत नॉन-सामान्यीकृत संख्येसाठी पी-मूल्यांची गणना केली गेली.हेतूंच्या संख्‍येच्‍या सहसंबंधांबाबत, स्‍पिअरमॅनच्‍या सहसंबंधांची गणना आर सह हेतूच्‍या सामान्यीकृत संख्‍येचा वापर करून केली गेली.
पेप्टाइड लायब्ररीतील प्रत्येक स्थानावर अमीनो ऍसिडची सामग्री दृश्यमान करण्यासाठी, वेब लोगोग्राम 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com) तयार केले गेले.प्रथम, 12-मेर पेप्टाइडच्या प्रत्येक स्थानावरील अमीनो ऍसिडची सामग्री 20×12 मॅट्रिक्समध्ये संग्रहित केली जाते.त्यानंतर, प्रत्येक स्थानावर समान सापेक्ष अमीनो आम्ल सामग्री असलेल्या 1000 पेप्टाइड्सचा संच फास्टा-सिक्वेंस फॉरमॅटमध्ये तयार केला जातो आणि वेब-लोगो 3 मध्ये इनपुट म्हणून प्रदान केला जातो, जो प्रत्येक स्थानावर संबंधित अमीनो ऍसिड सामग्रीचे ग्राफिकल प्रतिनिधित्व तयार करतो.दिलेल्या पेप्टाइड लायब्ररीसाठी.बहुआयामी डेटासेट व्हिज्युअलायझ करण्यासाठी, उष्णता नकाशे R मधील अंतर्गत विकसित साधन वापरून तयार केले गेले (बायोसहीटमॅप, अजून-रिलीज केलेले R पॅकेज).उष्मा नकाशांमध्ये सादर केलेल्या डेंड्रोग्रामची गणना युक्लिडियन अंतर मेट्रिकसह वॉर्डच्या श्रेणीबद्ध क्लस्टरिंग पद्धतीचा वापर करून केली गेली.मोटिफ स्कोअरिंग डेटाच्या सांख्यिकीय विश्लेषणासाठी, फिशरच्या अचूक चाचणीचा वापर करून असामान्य स्कोअरिंगसाठी पी मूल्यांची गणना केली गेली.विद्यार्थ्यांची टी-टेस्ट किंवा ANOVA वापरून इतर डेटासेटसाठी P-मूल्यांची गणना R मध्ये केली गेली.
निवडलेले फेज क्लोन आणि इन्सर्ट्सशिवाय फेजेस शेपटीच्या शिराद्वारे (2×1010 फेजेस/प्राणी 300 μl PBS मध्ये) इंट्राव्हेनस इंजेक्ट केले गेले.परफ्यूजन आणि त्यानंतरच्या फिक्सेशनच्या दहा मिनिटांपूर्वी, त्याच प्राण्यांना 100 μl DyLight594-लेबलयुक्त लेक्टिन (वेक्टर लॅबोरेटरीज इंक., DL-1177) सह इंट्राव्हेनस इंजेक्ट केले गेले.फेज इंजेक्शननंतर 60 मिनिटांनंतर, उंदरांना 50 मिली पीबीएस आणि त्यानंतर 50 मिली 4% पीएफए/पीबीएससह हृदयाद्वारे परफ्यूज केले गेले.मेंदूचे नमुने रात्रभर 4% PFA/PBS मध्ये निश्चित केले गेले आणि 4°C वर रात्रभर 30% सुक्रोजमध्ये भिजवले गेले.ओसीटी मिश्रणात नमुने फ्लॅश गोठवले जातात.1% BSA सह अवरोधित केलेल्या 30 µm क्रायसेक्शनवर आणि T7 फेज (Novus NB 600-376A) विरुद्ध पॉलीक्लोनल FITC-लेबल केलेल्या प्रतिपिंडांसह 4 °C तापमानावर खोलीच्या तपमानावर गोठलेल्या नमुन्यांचे इम्युनोहिस्टोकेमिकल विश्लेषण केले गेले.रात्रभर उष्मायन करा.शेवटी, विभाग PBS सह 3 वेळा धुतले गेले आणि कॉन्फोकल लेसर मायक्रोस्कोप (Leica TCS SP5) ने तपासले.
98% च्या किमान शुद्धतेसह सर्व पेप्टाइड्स जेनस्क्रिप्ट यूएसए द्वारे संश्लेषित केले गेले, बायोटिनिलेटेड आणि लायफिलाइज्ड.एन-टर्मिनसवर बायोटिन अतिरिक्त ट्रिपल ग्लाइसिन स्पेसरद्वारे बांधले जाते.मास स्पेक्ट्रोमेट्री वापरून सर्व पेप्टाइड्स तपासा.
स्ट्रेप्टाव्हिडिन (सिग्मा S0677) हे बायोटिनिलेटेड पेप्टाइड, बायोटिनिलेटेड BACE1 इनहिबिटरी पेप्टाइड, किंवा बायोटिनिलेटेड BACE1 इनहिबिटरी पेप्टाइड आणि BACE1 इनहिबिटरी पेप्टाइड- PSO5DM01% SOubincated मध्ये (3:1 गुणोत्तर) च्या 5-पट समतुल्य प्रमाणात मिसळले होते.इंजेक्शन करण्यापूर्वी खोलीच्या तपमानावर 1 तास.स्ट्रेप्टाव्हिडिन-संयुग्मित पेप्टाइड्स सेरेब्रल पोकळी असलेल्या उंदरांच्या शेपटीच्या शिरामध्ये 10 मिग्रॅ/किलोच्या डोसमध्ये इंट्राव्हेनस इंजेक्ट केले गेले.
स्ट्रेप्टाव्हिडिन-पेप्टाइड कॉम्प्लेक्सच्या एकाग्रतेचे मूल्यांकन एलिसा द्वारे केले गेले.Nunc Maxisorp microtiter plates (Sigma) वर रात्रभर 4°C वर 1.5 μg/ml माऊस अँटी-स्ट्रेप्टाव्हिडिन प्रतिपिंड (थर्मो, MA1-20011) सह लेपित केले गेले.ब्लॉक केल्यानंतर (ब्लॉकिंग बफर: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0.05% NP40, 0.25% जिलेटिन, 1% BSA) खोलीच्या तपमानावर 2 तासांसाठी, प्लेट 0.05% Tween-20/PBS (वॉश बफर) ने धुवा आणि 3 प्लॅक्‍स नमुने त्‍यासाठी प्‍लॉफ स्‍पॅलमध्‍ये जोडले गेले. लस्मा 1:10,000, CSF 1:115).त्यानंतर डिटेक्शन अँटीबॉडी (1 μg/ml, anti-streptavidin-HRP, Novus NB120-7239) सह प्लेट 4°C वर रात्रभर उष्मायन करण्यात आली.वॉशिंगच्या तीन पायऱ्यांनंतर, TMB सब्सट्रेट सोल्यूशन (रोचे) मध्ये 20 मिनिटांपर्यंत उष्मायनाद्वारे स्ट्रेप्टाव्हिडिन आढळले.1M H2SO4 सह रंग विकास थांबविल्यानंतर, शोषकता 450 nm वर मोजा.
स्ट्रेप्टाव्हिडिन-पेप्टाइड-BACE1 इनहिबिटर कॉम्प्लेक्सचे कार्य उत्पादकाच्या प्रोटोकॉल (वाको, 294-64701) नुसार Aβ(1-40) ELISA द्वारे मूल्यांकन केले गेले.थोडक्यात, CSF नमुने मानक diluent (1:23) मध्ये पातळ केले गेले आणि BNT77 कॅप्चर अँटीबॉडीसह लेपित 96-वेल प्लेट्समध्ये 4°C वर रात्रभर उष्मायन केले गेले.वॉशिंगच्या पाच पायऱ्यांनंतर, एचआरपी-संयुग्मित BA27 अँटीबॉडी जोडण्यात आली आणि 4° से. तापमानात 2 तास उष्मायन केले गेले, त्यानंतर पाच वॉशिंग पायऱ्या केल्या गेल्या.Aβ(1–40) खोलीच्या तपमानावर 30 मिनिटे TMB द्रावणात उष्मायनाद्वारे आढळून आले.स्टॉप सोल्यूशनसह रंग विकास थांबविल्यानंतर, शोषकता 450 एनएम वर मोजा.Aβ(1–40) ELISA च्या आधी प्लाझ्मा नमुने घन फेज एक्सट्रॅक्शनच्या अधीन होते.96-वेल प्लेट्समध्ये 0.2% DEA (सिग्मा) मध्ये प्लाझ्मा जोडला गेला आणि 30 मिनिटांसाठी खोलीच्या तपमानावर उष्मायन केले गेले.एसपीई प्लेट्स (ओएसिस, 186000679) पाण्याने आणि 100% मिथेनॉलने सलग धुतल्यानंतर, एसपीई प्लेट्समध्ये प्लाझ्मा नमुने जोडले गेले आणि सर्व द्रव काढून टाकण्यात आले.नमुने धुतले गेले (प्रथम 5% मिथेनॉल नंतर 30% मिथेनॉल) आणि 2% NH4OH/90% मिथेनॉलने काढले.स्थिर N2 प्रवाहावर 99 मिनिटांसाठी 55°C वर एल्युएट कोरडे केल्यावर, नमुने मानक diluents मध्ये कमी केले गेले आणि वर वर्णन केल्याप्रमाणे Aβ(1–40) मोजले गेले.
हा लेख कसा उद्धृत करायचा: Urich, E. et al.व्हिव्होमध्ये ओळखल्या गेलेल्या ट्रान्झिट पेप्टाइड्सचा वापर करून मेंदूला कार्गो डिलिव्हरी.विज्ञान5, 14104;doi:10.1038/srep14104 (2015).
Likhota J., Skjorringe T., Thomsen LB आणि Moos T. लक्ष्यित थेरपी वापरून मेंदूला मॅक्रोमोलेक्युलर औषधांचे वितरण.जर्नल ऑफ न्यूरोकेमिस्ट्री 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C., आणि Martinez-Martinez, P. रक्त-मेंदूच्या अडथळा ओलांडून पेप्टाइड आणि प्रथिने औषधांचे वितरण.Prog Neurobiol 87, 212–251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
परड्रिज, डब्ल्यूएम रक्त-मेंदू अडथळा: मेंदूच्या औषधांच्या विकासात अडथळा.NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
Johanson, KE, Duncan, JA, Stopa, EG, आणि Byrd, A. सुधारित औषध वितरण आणि कोरोइड प्लेक्सस-CSF मार्गाद्वारे मेंदूला लक्ष्य करण्यासाठी संभाव्यता.फार्मास्युटिकल रिसर्च 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
परड्रिज, डब्ल्यूएम मेंदूच्या प्रसूतीसाठी आण्विक ट्रोजन हॉर्ससह बायोफार्मास्युटिकल्सचे आधुनिकीकरण.बायोकॉनजग केम 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008).
परड्रिज, डब्ल्यूएम रिसेप्टर-मध्यस्थ पेप्टाइड रक्त-मेंदू अडथळा ओलांडून वाहतूक.एंडोक्र रेव्ह. 7, 314–330 (1986).
Niewoehner, J. et al.मोनोव्हॅलेंट आण्विक शटल वापरून मेंदूचा प्रवेश आणि उपचारात्मक प्रतिपिंडांची कार्यक्षमता वाढवा.न्यूरॉन 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
बिएन-ली, एन. आणि इतर.ट्रान्सफरिन रिसेप्टर (TfR) वाहतूक TfR ऍन्टीबॉडीजच्या ऍफिनिटी वेरिएंटचे मेंदूचे सेवन निर्धारित करते.J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).