काही LC समस्यानिवारण विषय कधीही जुने नसतात, कारण LC प्रॅक्टिसमध्ये समस्या असतात, जरी कालांतराने इन्स्ट्रुमेंट तंत्रज्ञान सुधारत असले तरी. LC सिस्टीममध्ये समस्या उद्भवू शकतात आणि खराब पीक शेपमध्ये संपू शकतात असे अनेक मार्ग आहेत. जेव्हा पीक शेपशी संबंधित समस्या उद्भवतात, तेव्हा या निकालांच्या संभाव्य कारणांची एक छोटी यादी आमचा समस्यानिवारण अनुभव सुलभ करण्यास मदत करते.
हा “LC ट्रबलशूटिंग” कॉलम लिहिणे आणि दर महिन्याला विषयांवर विचार करणे मजेदार आहे, कारण काही विषय कधीही शैलीबाहेर जात नाहीत. क्रोमॅटोग्राफी संशोधनाच्या क्षेत्रात काही विषय किंवा कल्पना कालबाह्य होतात कारण त्या नवीन आणि चांगल्या कल्पनांनी बदलल्या जातात, समस्यानिवारणाच्या क्षेत्रात, १९८३ मध्ये या जर्नलमध्ये (त्या वेळी LC जर्नल) पहिला ट्रबलशूटिंग लेख प्रकाशित झाला होता (कारण काही विषय अजूनही संबंधित आहेत). गेल्या काही वर्षांत, मी लिक्विड क्रोमॅटोग्राफी (LC) वर परिणाम करणाऱ्या समकालीन ट्रेंडवर अनेक LC ट्रबलशूटिंग विभाग केंद्रित केले आहेत (उदाहरणार्थ, धारणावरील दबावाच्या परिणामाबद्दलच्या आमच्या समजुतीची सापेक्ष तुलना [२] नवीन प्रगती) LC निकालांचे आमचे स्पष्टीकरण आणि आधुनिक LC उपकरणांसह समस्यानिवारण कसे करावे. या महिन्याच्या हप्त्यात, मी माझी मालिका (३) सुरू ठेवत आहे, जी डिसेंबर २०२१ मध्ये सुरू झाली होती, जी LC ट्रबलशूटिंगच्या काही “जीवन आणि मृत्यू” विषयांवर केंद्रित होती — कोणत्याही ट्रबलशूटरसाठी उत्तम असलेले घटक आवश्यक आहेत, आम्ही वापरत असलेल्या सिस्टमचे वय काहीही असो. या मालिकेचा मुख्य विषय अनेक प्रयोगशाळांमध्ये लटकलेल्या LCGC च्या प्रसिद्ध “LC ट्रबलशूटिंग गाइड” वॉल चार्ट (4) शी अत्यंत संबंधित आहे. या मालिकेच्या तिसऱ्या भागात, मी शिखर आकार किंवा शिखर वैशिष्ट्यांशी संबंधित मुद्द्यांवर लक्ष केंद्रित करण्याचा निर्णय घेतला. आश्चर्यकारकपणे, वॉल चार्टमध्ये खराब शिखर आकाराची 44 भिन्न संभाव्य कारणे सूचीबद्ध आहेत! आपण या सर्व समस्यांचा एकाच लेखात तपशीलवार विचार करू शकत नाही, म्हणून या विषयावरील पहिल्या भागात, मी बहुतेकदा पाहत असलेल्या काही मुद्द्यांवर लक्ष केंद्रित करेन. मला आशा आहे की तरुण आणि वृद्ध LC वापरकर्त्यांना या महत्त्वाच्या विषयावर काही उपयुक्त टिप्स आणि स्मरणपत्रे सापडतील.
मी स्वतःला "काहीही शक्य आहे" असे प्रश्न सोडवण्याच्या प्रश्नांची उत्तरे अधिकाधिक देताना पाहतो. ज्या निरीक्षणांचा अर्थ लावणे कठीण आहे त्यांचा विचार करताना हे उत्तर सोपे वाटू शकते, परंतु मला ते अनेकदा योग्य वाटते. खराब शिखर आकाराच्या अनेक संभाव्य कारणांमुळे, समस्या काय असू शकते याचा विचार करताना मोकळे मन ठेवणे आणि त्या सर्वात सामान्य शक्यतांवर लक्ष केंद्रित करून आपले समस्यानिवारण प्रयत्न सुरू करण्यासाठी संभाव्य कारणांना प्राधान्य देणे महत्वाचे आहे, हा मुद्दा खूप महत्वाचा आहे. शक्य आहे.
कोणत्याही समस्यानिवारणाच्या व्यायामातील एक महत्त्वाचा टप्पा - परंतु मला वाटते की तो कमी लेखला गेला आहे - म्हणजे एक समस्या आहे जी सोडवणे आवश्यक आहे हे ओळखणे. समस्या आहे हे ओळखणे म्हणजे बहुतेकदा हे ओळखणे की साधनाचे काय होते ते आपल्या अपेक्षांपेक्षा वेगळे आहे, जे सिद्धांत, अनुभवजन्य ज्ञान आणि अनुभवाने आकारले जाते (5). येथे उल्लेख केलेला "पीक आकार" प्रत्यक्षात केवळ पीकच्या आकाराचा (सममितीय, असममित, गुळगुळीत, फ्लफी, अग्रणी धार, शेपटी इ.) संदर्भित नाही तर रुंदीचा देखील संदर्भित करतो. वास्तविक पीक आकारासाठी आमच्या अपेक्षा सोप्या आहेत. सिद्धांत (6) पाठ्यपुस्तकाच्या अपेक्षेला चांगले समर्थन देतो की, बहुतेक प्रकरणांमध्ये, क्रोमॅटोग्राफिक शिखरे सममितीय असावीत आणि गॉसियन वितरणाच्या आकाराशी सुसंगत असावीत, जसे की आकृती 1a मध्ये दर्शविले आहे. पीक रुंदीकडून आपल्याला काय अपेक्षा आहे ही एक अधिक जटिल समस्या आहे आणि आपण भविष्यातील लेखात या विषयावर चर्चा करू. आकृती 1 मधील इतर पीक आकार काही इतर शक्यता दर्शवितात ज्या निरीक्षण केल्या जाऊ शकतात - दुसऱ्या शब्दांत, काही मार्गांनी गोष्टी चुकीच्या होऊ शकतात. या भागाच्या उर्वरित भागात, आपण काही विशिष्ट गोष्टींवर चर्चा करण्यात वेळ घालवू. अशा प्रकारच्या आकारांना कारणीभूत ठरू शकणाऱ्या परिस्थितींची उदाहरणे.
कधीकधी क्रोमॅटोग्राममध्ये शिखर अजिबात दिसून येत नाहीत जिथे ते एल्युट केले जाणे अपेक्षित असते. वरील वॉल चार्ट दर्शवितो की शिखर नसणे (नमुन्यात प्रत्यक्षात लक्ष्य विश्लेषक एकाग्रतेवर आहे असे गृहीत धरून की डिटेक्टर प्रतिसाद आवाजाच्या वर पाहण्यासाठी पुरेसा असावा) हे सहसा काही उपकरणाच्या समस्येशी किंवा चुकीच्या मोबाइल फेज परिस्थितीशी संबंधित असते (जर ते पाहिले गेले असेल तर). शिखर, सहसा खूप "कमकुवत"). या श्रेणीतील संभाव्य समस्या आणि उपायांची एक छोटी यादी तक्ता I मध्ये आढळू शकते.
वर नमूद केल्याप्रमाणे, लक्ष देण्याआधी आणि त्याचे निराकरण करण्याचा प्रयत्न करण्यापूर्वी किती पीक ब्रॉडिंग सहन करावे हा प्रश्न एक गुंतागुंतीचा विषय आहे ज्यावर मी भविष्यातील लेखात चर्चा करेन. माझा अनुभव असा आहे की लक्षणीय पीक ब्रॉडिंग बहुतेकदा पीक आकारात लक्षणीय बदलासह असते आणि पीक टेलिंग प्री-पीक किंवा स्प्लिटिंगपेक्षा अधिक सामान्य आहे. तथापि, नाममात्र सममितीय शिखरे देखील रुंद केली जातात, जी काही वेगवेगळ्या कारणांमुळे होऊ शकतात:
या प्रत्येक मुद्द्यावर ट्रबलशूटिंग एलसीच्या मागील अंकांमध्ये तपशीलवार चर्चा करण्यात आली आहे आणि या विषयांमध्ये रस असलेले वाचक या समस्यांची मूळ कारणे आणि संभाव्य उपायांबद्दल माहितीसाठी या मागील लेखांचा संदर्भ घेऊ शकतात. अधिक तपशील.
पीक टेलिंग, पीक फ्रंटिंग आणि स्प्लिटिंग हे सर्व रासायनिक किंवा भौतिक घटनेमुळे होऊ शकतात आणि या समस्यांवरील संभाव्य उपायांची यादी मोठ्या प्रमाणात बदलते, जी आपण रासायनिक किंवा भौतिक समस्येचा सामना करत आहोत की नाही यावर अवलंबून असते. बऱ्याचदा, क्रोमॅटोग्राममधील वेगवेगळ्या शिखरांची तुलना करून, तुम्हाला दोषी कोण आहे याबद्दल महत्त्वाचे संकेत मिळू शकतात. जर क्रोमॅटोग्राममधील सर्व शिखरे समान आकार दर्शवितात, तर कारण भौतिक नसण्याची शक्यता असते. जर फक्त एक किंवा काही शिखरे प्रभावित झाली असतील, परंतु उर्वरित ठीक दिसत असतील, तर कारण बहुधा रासायनिक असेल.
पीक टेलिंगची रासायनिक कारणे येथे थोडक्यात चर्चा करण्यासाठी खूप गुंतागुंतीची आहेत. अधिक सखोल चर्चेसाठी इच्छुक वाचकाला "एलसी ट्रबलशूटिंग" च्या अलीकडील अंकाचा संदर्भ दिला जातो (१०). तथापि, प्रयत्न करण्यासाठी एक सोपी गोष्ट म्हणजे इंजेक्टेड अॅनालिटचे वस्तुमान कमी करणे आणि पीक आकार सुधारतो का ते पाहणे. जर तसे असेल, तर ही समस्या "मास ओव्हरलोड" आहे याचा एक चांगला संकेत आहे. या प्रकरणात, पद्धत लहान विश्लेषक वस्तुमान इंजेक्ट करण्यापुरती मर्यादित असली पाहिजे, किंवा क्रोमॅटोग्राफिक परिस्थिती बदलली पाहिजे जेणेकरून मोठ्या वस्तुमान इंजेक्ट करूनही चांगले पीक आकार मिळू शकतील.
पीक टेलिंगची अनेक संभाव्य भौतिक कारणे देखील आहेत. शक्यतांच्या सविस्तर चर्चेत रस असलेल्या वाचकांना "एलसी ट्रबलशूटिंग" (११) च्या अलीकडील अंकाचा संदर्भ दिला जातो. पीक टेलिंगच्या सर्वात सामान्य भौतिक कारणांपैकी एक म्हणजे इंजेक्टर आणि डिटेक्टर (१२) मधील एका बिंदूवर खराब कनेक्शन. काही आठवड्यांपूर्वी माझ्या प्रयोगशाळेत मिळालेल्या आकृती १d मध्ये एक अत्यंत उदाहरण दाखवले आहे. या प्रकरणात, आम्ही एक नवीन इंजेक्शन व्हॉल्व्ह असलेली एक प्रणाली तयार केली जी आम्ही आधी वापरली नव्हती आणि स्टेनलेस स्टीलच्या केशिकावर मोल्ड केलेल्या फेरूलसह एक लहान व्हॉल्यूम इंजेक्शन लूप स्थापित केला. काही सुरुवातीच्या समस्यानिवारण प्रयोगांनंतर, आम्हाला लक्षात आले की इंजेक्शन व्हॉल्व्ह स्टेटरमधील पोर्ट डेप्थ आमच्या वापरापेक्षा खूपच खोल होती, परिणामी पोर्टच्या तळाशी एक मोठा डेड व्हॉल्यूम निर्माण झाला. इंजेक्शन लूप दुसऱ्या ट्यूबने बदलून ही समस्या सहजपणे सोडवता येते, आम्ही पोर्टच्या तळाशी डेड व्हॉल्यूम काढून टाकण्यासाठी फेरूलला योग्य स्थितीत समायोजित करू शकतो.
आकृती 1e मध्ये दाखवल्याप्रमाणे पीक फ्रंट्स भौतिक किंवा रासायनिक समस्यांमुळे देखील होऊ शकतात. अग्रणी काठाचे एक सामान्य भौतिक कारण म्हणजे स्तंभाचा कण तळ व्यवस्थित पॅक केलेला नाही किंवा कण कालांतराने पुनर्रचना केलेले आहेत. या भौतिक घटनेमुळे होणाऱ्या पीक टेलिंगप्रमाणे, हे दुरुस्त करण्याचा सर्वोत्तम मार्ग म्हणजे स्तंभ बदलणे आणि चालू ठेवणे. मूलभूतपणे, रासायनिक उत्पत्ती असलेले अग्रणी काठाचे पीक आकार बहुतेकदा आपण ज्याला "नॉन-लिनियर" रिटेन्शन परिस्थिती म्हणतो त्यातून उद्भवतात. आदर्श (रेखीय) परिस्थितीत, स्थिर टप्प्याने (म्हणूनच, रिटेन्शन फॅक्टर) राखून ठेवलेले विश्लेषक स्तंभातील विश्लेषकाच्या एकाग्रतेशी रेषीयपणे संबंधित असते. क्रोमॅटोग्राफिकदृष्ट्या, याचा अर्थ असा की स्तंभात इंजेक्ट केलेल्या विश्लेषकाचे वस्तुमान वाढत असताना, शिखर उंच होते, परंतु रुंद होत नाही. जेव्हा धारणा वर्तन नॉन-लिनियर असते तेव्हा हा संबंध तुटतो आणि अधिक वस्तुमान इंजेक्ट केल्याने शिखर केवळ उंचच होत नाहीत तर रुंद देखील होतात. याव्यतिरिक्त, नॉनलाइनर आकार क्रोमॅटोग्राफिक शिखरांचा आकार निश्चित करतात, परिणामी अग्रणी किंवा मागच्या कडा होतात. वस्तुमान ओव्हरलोड प्रमाणे ज्यामुळे शिखर होतो टेलिंग (१०), नॉनलाइनर रिटेन्शनमुळे होणारे पीक लिडिंग इंजेक्टेड अॅनालाइट मास कमी करून देखील निदान केले जाऊ शकते. जर पीक आकार सुधारला, तर पद्धत सुधारली पाहिजे जेणेकरून लिडिंग एज निर्माण करणाऱ्या इंजेक्शन गुणवत्तेपेक्षा जास्त होणार नाही, किंवा हे वर्तन कमी करण्यासाठी क्रोमॅटोग्राफिक परिस्थिती बदलली पाहिजे.
कधीकधी आपण आकृती 1f मध्ये दाखवल्याप्रमाणे "विभाजित" शिखर असल्याचे पाहतो. या समस्येचे निराकरण करण्याचे पहिले पाऊल म्हणजे शिखर आकार आंशिक सह-उत्खलनामुळे (म्हणजेच, दोन भिन्न परंतु जवळून उत्खनन करणाऱ्या संयुगांच्या उपस्थितीमुळे) आहे की नाही हे निश्चित करणे. जर प्रत्यक्षात दोन भिन्न विश्लेषक एकमेकांच्या जवळून उत्खनन करत असतील, तर त्यांचे रिझोल्यूशन सुधारण्याची बाब आहे (उदाहरणार्थ, निवडकता, धारणा किंवा प्लेट संख्या वाढवून), आणि स्पष्ट "विभाजित" शिखर भौतिक कामगिरीशी संबंधित आहेत याचा स्तंभाशी काहीही संबंध नाही. बऱ्याचदा, या निर्णयाचा सर्वात महत्त्वाचा संकेत म्हणजे क्रोमॅटोग्राममधील सर्व शिखरे विभाजित आकार प्रदर्शित करतात की फक्त एक किंवा दोन. जर ते फक्त एक किंवा दोन असेल तर ती कदाचित सह-उत्खनन समस्या असेल; जर सर्व शिखरे विभाजित असतील तर ती कदाचित एक भौतिक समस्या असेल, बहुधा स्तंभाशी संबंधित असेल.
स्तंभाच्या भौतिक गुणधर्मांशी संबंधित स्प्लिट पीक सहसा अंशतः ब्लॉक केलेल्या इनलेट किंवा आउटलेट फ्रिट्समुळे किंवा स्तंभातील कणांच्या पुनर्रचनामुळे होतात, ज्यामुळे स्तंभ चॅनेल निर्मितीच्या काही भागात मोबाइल फेज मोबाइल फेजपेक्षा वेगाने प्रवाहित होऊ शकतो. इतर क्षेत्रांमध्ये (11). अंशतः अडकलेले फ्रिट्स कधीकधी स्तंभातून प्रवाह उलट करून साफ ​​केले जाऊ शकतात; तथापि, माझ्या अनुभवात, हे सहसा दीर्घकालीन उपायापेक्षा अल्पकालीन असते. जर कण स्तंभात पुन्हा एकत्रित झाले तर आधुनिक स्तंभांमध्ये हे बहुतेकदा घातक ठरते. या टप्प्यावर, स्तंभ बदलणे आणि सुरू ठेवणे चांगले.
आकृती १g मधील शिखर, माझ्या स्वतःच्या प्रयोगशाळेतील अलिकडच्या उदाहरणावरून, सहसा सिग्नल इतका जास्त आहे की तो प्रतिसाद श्रेणीच्या उच्च टोकापर्यंत पोहोचला आहे असे दर्शविते. ऑप्टिकल शोषक डिटेक्टरसाठी (या प्रकरणात UV-vis), जेव्हा विश्लेषणात्मक सांद्रता खूप जास्त असते, तेव्हा विश्लेषक डिटेक्टर फ्लो सेलमधून जाणारा बहुतेक प्रकाश शोषून घेतो, ज्यामुळे शोधण्यासाठी खूप कमी प्रकाश राहतो. या परिस्थितीत, फोटोडिटेक्टरमधील विद्युत सिग्नलवर विविध ध्वनी स्रोतांचा, जसे की भटक्या प्रकाशाचा आणि "गडद प्रवाहाचा" जोरदार प्रभाव पडतो, ज्यामुळे सिग्नल दिसायला खूप "अस्पष्ट" होतो आणि विश्लेषणात्मक सांद्रतेपासून स्वतंत्र होतो. जेव्हा असे होते, तेव्हा विश्लेषकाचे इंजेक्शन व्हॉल्यूम कमी करून - इंजेक्शन व्हॉल्यूम कमी करून, नमुना सौम्य करून किंवा दोन्ही करून समस्या सहजपणे सोडवता येते.
क्रोमॅटोग्राफी स्कूलमध्ये, आपण नमुन्यातील विश्लेषणात्मक एकाग्रतेचे सूचक म्हणून डिटेक्टर सिग्नल (म्हणजेच, क्रोमॅटोग्राममधील y-अक्ष) वापरतो. म्हणून शून्यापेक्षा कमी सिग्नल असलेला क्रोमॅटोग्राम पाहणे विचित्र वाटते, कारण याचा साधा अर्थ असा आहे की हे नकारात्मक विश्लेषणात्मक एकाग्रता दर्शवते - जे अर्थातच भौतिकदृष्ट्या शक्य नाही. माझ्या अनुभवात, ऑप्टिकल शोषक डिटेक्टर (उदा., UV-vis) वापरताना नकारात्मक शिखर बहुतेकदा दिसून येतात.
या प्रकरणात, नकारात्मक शिखराचा अर्थ असा आहे की स्तंभातून बाहेर पडणारे रेणू शिखराच्या आधी आणि नंतर लगेचच मोबाइल फेजपेक्षा कमी प्रकाश शोषून घेतात. उदाहरणार्थ, तुलनेने कमी डिटेक्शन वेव्हलेंथ (<230 nm) आणि या तरंगलांबींवर बहुतेक प्रकाश शोषून घेणारे मोबाइल फेज अॅडिटीव्ह वापरताना हे होऊ शकते. असे अॅडिटीव्ह मिथेनॉलसारखे मोबाइल फेज सॉल्व्हेंट घटक किंवा एसीटेट किंवा फॉर्मेटसारखे बफर घटक असू शकतात. कॅलिब्रेशन वक्र तयार करण्यासाठी आणि अचूक परिमाणात्मक माहिती मिळविण्यासाठी नकारात्मक शिखरांचा वापर केला जाऊ शकतो, म्हणून त्यांना टाळण्याचे कोणतेही मूलभूत कारण नाही (ही पद्धत कधीकधी "अप्रत्यक्ष यूव्ही डिटेक्शन" म्हणून ओळखली जाते) (13). तथापि, जर आपल्याला खरोखरच नकारात्मक शिखर पूर्णपणे टाळायचे असतील तर, शोषक शोधण्याच्या बाबतीत, सर्वोत्तम उपाय म्हणजे वेगळ्या डिटेक्शन वेव्हलेंथचा वापर करणे जेणेकरून विश्लेषक मोबाइल फेजपेक्षा जास्त शोषून घेईल किंवा मोबाइल फेजची रचना बदलेल जेणेकरून ते विश्लेषकांपेक्षा कमी प्रकाश शोषून घेईल.
जेव्हा नमुन्यातील विश्लेषक व्यतिरिक्त इतर घटकांचा अपवर्तक निर्देशांक, जसे की सॉल्व्हेंट मॅट्रिक्स, मोबाइल फेजच्या अपवर्तक निर्देशांकापेक्षा वेगळा असतो तेव्हा अपवर्तक निर्देशांक (RI) शोध वापरताना नकारात्मक शिखरे देखील दिसू शकतात. हे UV-vis शोधण्याच्या बाबतीत देखील घडते, परंतु RI शोधण्याच्या सापेक्ष हा परिणाम कमी केला जातो. दोन्ही प्रकरणांमध्ये, नमुना मॅट्रिक्सची रचना मोबाइल फेजच्या रचनेशी अधिक जवळून जुळवून नकारात्मक शिखरे कमी केली जाऊ शकतात.
एलसी ट्रबलशूटिंगच्या मूलभूत विषयावरील तिसऱ्या भागात, मी अशा परिस्थितींवर चर्चा केली ज्यामध्ये निरीक्षण केलेले पीक आकार अपेक्षित किंवा सामान्य पीक आकारापेक्षा वेगळे असते. अशा समस्यांचे प्रभावी समस्यानिवारण अपेक्षित पीक आकारांच्या ज्ञानाने सुरू होते (सिद्धांतावर किंवा विद्यमान पद्धतींसह पूर्वीच्या अनुभवावर आधारित), म्हणून या अपेक्षांपासून विचलन स्पष्ट आहे. पीक आकाराच्या समस्यांमध्ये अनेक भिन्न संभाव्य कारणे असतात (खूप रुंद, शेपटी, अग्रणी धार इ.). या भागात, मी बहुतेकदा दिसणारी काही कारणे तपशीलवार चर्चा करतो. हे तपशील जाणून घेणे समस्यानिवारण सुरू करण्यासाठी एक चांगली जागा प्रदान करते, परंतु सर्व शक्यता कॅप्चर करत नाही. कारणे आणि उपायांच्या अधिक सखोल यादीमध्ये रस असलेले वाचक LCGC "LC ट्रबलशूटिंग गाइड" वॉल चार्टचा संदर्भ घेऊ शकतात.
(४) एलसीजीसी “एलसी ट्रबलशूटिंग गाइड” वॉल चार्ट. https://www.chromatographyonline.com/view/troubleshooting-wallchart (२०२१).
(६) ए. फेलिंजर, डेटा अॅनालिसिस अँड सिग्नल प्रोसेसिंग इन क्रोमॅटोग्राफी (एल्सेव्हियर, न्यू यॉर्क, एनवाय, १९९८), पृ. ४३-९६.
(८) वहाब एमएफ, दासगुप्ता पीके, काडजो एएफ आणि आर्मस्ट्राँग डीडब्ल्यू, अनल.चिम.जर्नल.रेव्ह. ९०७, ३१–४४ (२०१६).https://doi.org/10.1016/j.aca.2015.11.043.