Nature.com ला भेट दिल्याबद्दल धन्यवाद. तुम्ही वापरत असलेल्या ब्राउझर आवृत्तीला मर्यादित CSS सपोर्ट आहे. सर्वोत्तम अनुभवासाठी, आम्ही शिफारस करतो की तुम्ही अपडेटेड ब्राउझर वापरा (किंवा इंटरनेट एक्सप्लोररमध्ये कंपॅटिबिलिटी मोड अक्षम करा). दरम्यान, सतत सपोर्ट सुनिश्चित करण्यासाठी, आम्ही साइटला स्टाईल आणि जावास्क्रिप्टशिवाय रेंडर करू.
लिक्विड बायोप्सी (LB) ही संकल्पना बायोमेडिकल क्षेत्रात वेगाने लोकप्रिय होत आहे. ही संकल्पना प्रामुख्याने पेशींच्या मृत्यूनंतर विविध ऊतींमध्ये लहान तुकड्यांमध्ये सोडल्या जाणाऱ्या रक्तवाहिन्यांच्या बाह्य पेशीय DNA (ccfDNA) च्या तुकड्यांच्या शोधावर आधारित आहे. या तुकड्यांचा एक छोटासा भाग परदेशी (विदेशी) ऊती किंवा जीवांपासून उद्भवतो. सध्याच्या कामात, आम्ही ही संकल्पना शिंपल्यांवर लागू केली आहे, ही एक सेन्टिनेल प्रजाती आहे जी त्यांच्या उच्च समुद्राच्या पाण्यातील गाळण्याची क्षमता म्हणून ओळखली जाते. आम्ही शिंपल्यांच्या क्षमतेचा वापर विविध स्त्रोतांमधून पर्यावरणीय DNA तुकड्या कॅप्चर करण्यासाठी नैसर्गिक फिल्टर म्हणून करतो जेणेकरून सागरी किनारी परिसंस्थांच्या जैवविविधतेबद्दल माहिती मिळेल. आमचे निकाल दर्शवितात की शिंपल्याच्या हेमोलिम्फमध्ये 1 ते 5 kb पर्यंत आकारात मोठ्या प्रमाणात बदलणारे DNA तुकडे असतात. शॉटगन सिक्वेन्सिंगमध्ये असे दिसून आले की मोठ्या संख्येने DNA तुकडे परदेशी सूक्ष्मजीव उत्पत्तीचे आहेत. त्यापैकी, आम्हाला बॅक्टेरिया, आर्किया आणि विषाणूंमधील DNA तुकडे आढळले, ज्यामध्ये किनारी सागरी परिसंस्थांमध्ये सामान्यतः आढळणाऱ्या विविध यजमानांना संक्रमित करण्यासाठी ओळखले जाणारे विषाणू समाविष्ट आहेत. शेवटी, आमच्या अभ्यासातून असे दिसून येते की शिंपल्यांना लागू केलेली LB ही संकल्पना सागरी किनारी परिसंस्थांमधील सूक्ष्मजीव विविधतेबद्दल ज्ञानाचा एक समृद्ध परंतु अद्याप शोध न लागलेला स्रोत दर्शवते.
सागरी परिसंस्थांच्या जैवविविधतेवर हवामान बदलाचा (CC) परिणाम हा संशोधनाचा झपाट्याने वाढणारा क्षेत्र आहे. जागतिक तापमानवाढ केवळ महत्त्वाचे शारीरिक ताण निर्माण करत नाही तर सागरी जीवांच्या थर्मल स्थिरतेच्या उत्क्रांती मर्यादा देखील ढकलते, ज्यामुळे अनेक प्रजातींच्या अधिवासावर परिणाम होतो, ज्यामुळे त्यांना अधिक अनुकूल परिस्थिती शोधण्यास प्रवृत्त होते [1, 2]. मेटाझोअन्सच्या जैवविविधतेवर परिणाम करण्याव्यतिरिक्त, CC यजमान-सूक्ष्मजीव परस्परसंवादाचे नाजूक संतुलन बिघडवते. हे सूक्ष्मजीव डिस्बॅक्टेरियोसिस सागरी परिसंस्थांना गंभीर धोका निर्माण करते कारण ते सागरी जीवांना संसर्गजन्य रोगजनकांना अधिक संवेदनशील बनवते [3, 4]. असे मानले जाते की SS मोठ्या प्रमाणात मृत्यूंमध्ये महत्त्वाची भूमिका बजावते, जी जागतिक सागरी परिसंस्थांच्या व्यवस्थापनासाठी एक गंभीर समस्या आहे [5, 6]. अनेक सागरी प्रजातींचे आर्थिक, पर्यावरणीय आणि पौष्टिक परिणाम पाहता ही एक महत्त्वाची समस्या आहे. हे विशेषतः ध्रुवीय प्रदेशात राहणाऱ्या बायव्हल्व्हसाठी खरे आहे, जिथे CK चे परिणाम अधिक तात्काळ आणि गंभीर असतात [6, 7]. खरं तर, मायटिलस एसपीपी सारखे बायव्हल्व्ह. सागरी परिसंस्थांवर CC च्या परिणामांचे निरीक्षण करण्यासाठी मोठ्या प्रमाणात वापरले जातात. आश्चर्याची गोष्ट नाही की, त्यांच्या आरोग्याचे निरीक्षण करण्यासाठी तुलनेने मोठ्या संख्येने बायोमार्कर विकसित केले गेले आहेत, बहुतेकदा एंजाइमॅटिक क्रियाकलाप किंवा पेशी व्यवहार्यता आणि फॅगोसाइटिक क्रियाकलाप [8] सारख्या सेल्युलर फंक्शन्सवर आधारित कार्यात्मक बायोमार्करचा समावेश असलेल्या द्वि-स्तरीय दृष्टिकोनाचा वापर केला जातो. या पद्धतींमध्ये मोठ्या प्रमाणात समुद्राचे पाणी शोषल्यानंतर मऊ ऊतींमध्ये जमा होणाऱ्या विशिष्ट दाब निर्देशकांच्या एकाग्रतेचे मोजमाप देखील समाविष्ट आहे. तथापि, उच्च गाळण्याची क्षमता आणि बायव्हल्व्हची अर्ध-खुली रक्ताभिसरण प्रणाली द्रव बायोप्सी (LB) च्या संकल्पनेचा वापर करून नवीन हेमोलिम्फ बायोमार्कर विकसित करण्याची संधी प्रदान करते, रुग्ण व्यवस्थापनासाठी एक साधी आणि किमान आक्रमक पद्धत. रक्त नमुने [9, 10]. जरी मानवी LB मध्ये अनेक प्रकारचे परिसंचरण रेणू आढळू शकतात, तरी ही संकल्पना प्रामुख्याने प्लाझ्मामधील परिसंचरण बाह्य पेशीय DNA (ccfDNA) तुकड्यांच्या DNA अनुक्रम विश्लेषणावर आधारित आहे. खरं तर, मानवी प्लाझ्मामध्ये फिरणाऱ्या डीएनएची उपस्थिती २० व्या शतकाच्या मध्यापासून ज्ञात आहे [11], परंतु अलिकडच्या काळातच उच्च-थ्रूपुट सिक्वेन्सिंग पद्धतींच्या आगमनामुळे ccfDNA वर आधारित क्लिनिकल निदान झाले आहे. या फिरणाऱ्या डीएनए तुकड्यांची उपस्थिती अंशतः पेशींच्या मृत्यूनंतर जीनोमिक डीएनए (न्यूक्लियर आणि माइटोकॉन्ड्रियल) च्या निष्क्रिय प्रकाशनामुळे आहे. निरोगी व्यक्तींमध्ये, ccfDNA चे प्रमाण सामान्यतः कमी असते (<१० ng/mL) परंतु विविध पॅथॉलॉजीजने ग्रस्त असलेल्या किंवा तणावाखाली असलेल्या रुग्णांमध्ये ते ५-१० पट वाढू शकते, ज्यामुळे ऊतींचे नुकसान होते. निरोगी व्यक्तींमध्ये, ccfDNA चे प्रमाण सामान्यतः कमी असते (<१० ng/mL) परंतु विविध पॅथॉलॉजीजने ग्रस्त असलेल्या किंवा तणावाखाली असलेल्या रुग्णांमध्ये ते ५-१० पट वाढू शकते, ज्यामुळे ऊतींचे नुकसान होते. У здоровых людей концентрация вккДНК в норме низкая (<10 нг/мл), но может повышаться в 5–10 раз у больный низкая подвергающихся стрессу, приводящему к повреждению тканей. निरोगी लोकांमध्ये, cccDNA चे प्रमाण सामान्यतः कमी असते (<१० ng/mL), परंतु विविध पॅथॉलॉजीज असलेल्या किंवा तणावाखाली असलेल्या रुग्णांमध्ये ते ५-१० पटीने वाढू शकते ज्यामुळे ऊतींचे नुकसान होते.在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/mL），但在患有各种病理或承受压力渞0-5受压力渞倍, 从而导致组织损伤.在 健康 个体 中 ， ccfdna 的 浓度 较 低 （（<10 ng/ml） 但 在 各 种 病理 或 承受 曭叀 或 承受 厗增加 5-10 倍, 从而 组织。 . 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤Концентрации ccfDNA обычно низкие (<10 нг/мл) у здоровых людей, но могут быть увеличены в 5-10 раз у павцымистом. патологиями или стрессом, что приводит к повреждению тканей. निरोगी व्यक्तींमध्ये ccfDNA चे प्रमाण सामान्यतः कमी असते (<१० ng/ml), परंतु विविध पॅथॉलॉजीज किंवा तणाव असलेल्या रुग्णांमध्ये ते ५-१० पट वाढू शकते, ज्यामुळे ऊतींचे नुकसान होते.ccfDNA तुकड्यांचा आकार मोठ्या प्रमाणात बदलतो, परंतु सामान्यतः 150 ते 200 bp पर्यंत असतो. [12]. सामान्य किंवा रूपांतरित होस्ट पेशींमधून स्वयं-व्युत्पन्न ccfDNA चे विश्लेषण, म्हणजेच सामान्य किंवा रूपांतरित यजमान पेशींमधून ccfDNA, न्यूक्लियर आणि/किंवा माइटोकॉन्ड्रियल जीनोममध्ये उपस्थित असलेल्या अनुवांशिक आणि एपिजेनेटिक बदलांचा शोध घेण्यासाठी वापरले जाऊ शकते, ज्यामुळे क्लिनिशियनना विशिष्ट आण्विक-लक्ष्यित उपचार निवडण्यास मदत होते [13]. तथापि, ccfDNA गर्भधारणेदरम्यान गर्भाच्या पेशींमधून किंवा प्रत्यारोपित अवयवांमधून ccfDNA सारख्या परदेशी स्त्रोतांकडून मिळवता येते [14,15,16,17]. ccfDNA हा संसर्गजन्य एजंट (विदेशी) च्या न्यूक्लिक अॅसिडची उपस्थिती शोधण्यासाठी माहितीचा एक महत्त्वाचा स्रोत देखील आहे, जो रक्त संस्कृतींद्वारे ओळखल्या न जाणाऱ्या व्यापक संसर्गांचा गैर-आक्रमक शोध घेण्यास अनुमती देतो, संक्रमित ऊतींचे आक्रमक बायोप्सी टाळतो [18]. अलीकडील अभ्यासातून खरोखरच असे दिसून आले आहे की मानवी रक्तात माहितीचा एक समृद्ध स्रोत आहे जो विषाणू आणि बॅक्टेरियाच्या रोगजनकांना ओळखण्यासाठी वापरला जाऊ शकतो आणि मानवी प्लाझ्मामध्ये आढळणाऱ्या ccfDNA पैकी सुमारे 1% परदेशी मूळ आहे [19]. या अभ्यासांवरून असे दिसून येते की जीवाच्या फिरणाऱ्या सूक्ष्मजीवांच्या जैवविविधतेचे मूल्यांकन ccfDNA विश्लेषण वापरून केले जाऊ शकते. तथापि, अलिकडेपर्यंत, ही संकल्पना केवळ मानवांमध्ये आणि काही प्रमाणात इतर पृष्ठवंशी प्राण्यांमध्ये वापरली जात होती [20, 21].
या पेपरमध्ये, आम्ही औलाकोम्या अट्राच्या ccfDNA चे विश्लेषण करण्यासाठी LB क्षमता वापरतो, ही दक्षिणेकडील प्रजाती सामान्यतः उपअंटार्क्टिक केर्गुलेन बेटांवर आढळते, जी 35 दशलक्ष वर्षांपूर्वी तयार झालेल्या मोठ्या पठाराच्या वर बेटांचा समूह आहे. ज्वालामुखीचा उद्रेक. इन विट्रो प्रायोगिक प्रणाली वापरून, आम्हाला आढळले की समुद्राच्या पाण्यातील DNA तुकडे शिंपल्यांद्वारे त्वरीत शोषले जातात आणि हेमोलिम्फ कंपार्टमेंटमध्ये प्रवेश करतात. शॉटगन सिक्वेन्सिंगने दर्शविले आहे की शिंपल्याच्या हेमोलिम्फ ccfDNA मध्ये स्वतःचे आणि स्वतःचे नसलेले DNA तुकडे असतात, ज्यामध्ये सहजीवन जीवाणू आणि थंड ज्वालामुखी सागरी किनारी परिसंस्थांच्या वैशिष्ट्यपूर्ण बायोम्समधील DNA तुकडे समाविष्ट आहेत. हेमोलिम्फ ccfDNA मध्ये वेगवेगळ्या यजमान श्रेणी असलेल्या विषाणूंपासून मिळवलेले विषाणू अनुक्रम देखील आहेत. आम्हाला हाडांचे मासे, समुद्री अॅनिमोन्स, शैवाल आणि कीटक यांसारख्या बहुपेशीय प्राण्यांचे DNA तुकडे देखील आढळले. शेवटी, आमचा अभ्यास असे दर्शवितो की LB संकल्पना सागरी अपृष्ठवंशी प्राण्यांवर यशस्वीरित्या लागू केली जाऊ शकते जेणेकरून सागरी परिसंस्थांमध्ये समृद्ध जीनोमिक संग्रह निर्माण होईल.
डिसेंबर २०१८ मध्ये पोर्ट-औ-फ्रान्सच्या (०४९°२१.२३५ एस, ०७०°१३.४९० ई.) आंतरभरतीच्या खडकाळ किनाऱ्यावरून प्रौढ (५५-७० मिमी लांब) मायटिलस प्लॅटेन्सिस (एम. प्लॅटेन्सिस) आणि ऑलाकोम्या अट्रा (ए. अट्रा) हे शिंपले गोळा करण्यात आले. इतर प्रौढ निळे शिंपले (मायटिलस एसपीपी.) एका व्यावसायिक पुरवठादाराकडून (पीईआय मसेल किंग इंक., प्रिन्स एडवर्ड आयलंड, कॅनडा) मिळवण्यात आले आणि त्यांना १०-२० लिटर ३२‰ कृत्रिम समुद्र असलेल्या तापमान नियंत्रित (४° सेल्सिअस) वायूयुक्त टाकीमध्ये ठेवण्यात आले. (कृत्रिम समुद्री मीठ रीफ क्रिस्टल, इन्स्टंट ओशन, व्हर्जिनिया, यूएसए). प्रत्येक प्रयोगासाठी, वैयक्तिक कवचांची लांबी आणि वजन मोजण्यात आले.
या कार्यक्रमासाठी एक मोफत ओपन अॅक्सेस प्रोटोकॉल ऑनलाइन उपलब्ध आहे (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1). थोडक्यात, वर्णन केल्याप्रमाणे [22] अपहरणकर्त्यांच्या स्नायूंमधून LB हेमोलिम्फ गोळा केले गेले. हेमोलिम्फ 1200×g वर 3 मिनिटांसाठी सेंट्रीफ्यूगेशनद्वारे स्पष्ट केले गेले, सुपरनॅटंट वापरेपर्यंत (-20°C) गोठवले गेले. cfDNA वेगळे करण्यासाठी आणि शुद्ध करण्यासाठी, उत्पादकाच्या सूचनांनुसार नमुने (1.5-2.0 मिली) वितळवले गेले आणि NucleoSnap cfDNA किट (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) वापरून प्रक्रिया केली गेली. पुढील विश्लेषण होईपर्यंत ccfDNA -80°C वर साठवले गेले. काही प्रयोगांमध्ये, QIAamp DNA इन्व्हेस्टिगेटर किट (QIAGEN, टोरंटो, ओंटारियो, कॅनडा) वापरून ccfDNA वेगळे केले गेले आणि शुद्ध केले गेले. मानक पिकोग्रीन परख वापरून शुद्ध केलेले DNA प्रमाणित केले गेले. वेगळ्या ccfDNA च्या तुकड्यांचे वितरण केशिका इलेक्ट्रोफोरेसीसद्वारे Agilent 2100 बायोअनालायझर (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) वापरून उच्च संवेदनशीलता DNA किट वापरून विश्लेषण केले गेले. उत्पादकाच्या सूचनांनुसार ccfDNA नमुन्याच्या 1 µl वापरून हे परीक्षण करण्यात आले.
हेमोलिम्फ ccfDNA तुकड्यांच्या अनुक्रमणासाठी, Génome Québec (Montreal, Quebec, Canada) ने Illumina MiSeq PE75 किटच्या Illumina DNA मिक्स किटचा वापर करून शॉटगन लायब्ररी तयार केल्या. एक मानक अडॅप्टर (BioO) वापरण्यात आला. NCBI सिक्वेन्स रीड आर्काइव्ह (SRR8924808 आणि SRR8924809) मधून कच्च्या डेटा फाइल्स उपलब्ध आहेत. FastQC [23] वापरून मूलभूत वाचन गुणवत्तेचे मूल्यांकन केले गेले. क्लिपिंग अॅडॉप्टर आणि खराब दर्जाच्या वाचनांसाठी ट्रिमोमॅटिक [24] वापरले गेले आहे. जुळणारे टोक असलेले शॉटगन वाचन FLASH ला 20 bp च्या किमान ओव्हरलॅपसह लांब सिंगल वाचनांमध्ये विलीन केले गेले जेणेकरून जुळत नाही [25]. बायव्हल्व्ह NCBI टॅक्सोनॉमी डेटाबेस (e व्हॅल्यू < 1e−3 आणि 90% होमोलॉजी) वापरून BLASTN सह मर्ज केलेले रीड एनोटेट केले गेले आणि DUST [26] वापरून कमी-जटिलता अनुक्रमांचे मास्किंग केले गेले. बायव्हल्व्ह NCBI टॅक्सोनॉमी डेटाबेस (e व्हॅल्यू < 1e−3 आणि 90% होमोलॉजी) वापरून BLASTN सह मर्ज केलेले रीड एनोटेट केले गेले आणि DUST [26] वापरून कमी-जटिलता अनुक्रमांचे मास्किंग केले गेले. Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием базы данных таксономии двустворчатюх двустворчатюх 1e-3 आणि 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с использованием DUST [२६]. NCBI बायव्हल्व्ह टॅक्सोनॉमी डेटाबेस (e व्हॅल्यू < 1e-3 आणि 90% होमोलॉजी) वापरून BLASTN सह पूल्ड रीड्सवर भाष्य केले गेले आणि DUST [26] वापरून कमी जटिलता अनुक्रम मास्किंग केले गेले.使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90% 同源性）用BLASTN 注释合并的读买数据库（e 值< 1e-3进行低复杂度序列的掩蔽.使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 90% 同源） 用 用 注释 合幨 分类 读湰]进行 复杂度 序列 的.。 . 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽掩蔽 掩蔽 掩蔽Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием таксономической базы данных двустворчать данных (значение e <1e-3 и 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с использовательности NCBI बायव्हल्व्ह टॅक्सोनॉमिक डेटाबेस (e व्हॅल्यू <1e-3 आणि 90% होमोलॉजी) वापरून BLASTN सह पूल्ड रीड्सवर भाष्य केले गेले आणि DUST [26] वापरून कमी जटिलता अनुक्रम मास्किंग केले गेले.वाचनांना दोन गटांमध्ये विभागले गेले: बायव्हल्व्ह अनुक्रमांशी संबंधित (येथे स्वयं-वाचन म्हटले जाते) आणि असंबंधित (नॉन-स्व-वाचन). कॉन्टिग्स निर्माण करण्यासाठी MEGAHIT वापरून दोन गट स्वतंत्रपणे एकत्र केले गेले [27]. दरम्यान, एलियन मायक्रोबायोम वाचनांचे वर्गीकरण वितरण क्रॅकेन2 [28] वापरून वर्गीकृत केले गेले आणि गॅलेक्सी [29, 30] वरील क्रोना पाय चार्टद्वारे ग्राफिकली दर्शविले गेले. आमच्या प्राथमिक प्रयोगांमधून इष्टतम किमीर्स kmers-59 असल्याचे निश्चित केले गेले. नंतर अंतिम भाष्यासाठी BLASTN (bivalve NCBI डेटाबेस, e मूल्य < 1e−10 आणि 60% समरूपता) सह संरेखन करून सेल्फ कॉन्टिग्स ओळखले गेले. नंतर अंतिम भाष्यासाठी BLASTN (bivalve NCBI डेटाबेस, e मूल्य < 1e−10 आणि 60% समरूपता) सह संरेखन करून सेल्फ कॉन्टिग्स ओळखले गेले. Затем собственные контиги были идентифицированы путем сопоставления с BLASTN <1e-10 и гомология 60%) для окончательной аннотации. नंतर अंतिम भाष्यासाठी BLASTN (NCBI बायव्हल्व्ह डेटाबेस, e व्हॅल्यू <1e-10 आणि 60% होमोलॉजी) शी जुळवून सेल्फ-कॉन्टिग्स ओळखले गेले.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60%同源性）对齐来识别自身重叠群以进行最终注释.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% Затем были идентифицированы собственные контиги для окончательной аннотации путем сопоставления с BLASTN двустворчатых моллюсков, значение e <1e-10 и гомология 60%). नंतर BLASTN (NCBI बायव्हल्व्ह डेटाबेस, e व्हॅल्यू <1e-10 आणि 60% होमोलॉजी) शी जुळवून अंतिम भाष्यासाठी सेल्फ-कॉन्टिग्स ओळखले गेले. समांतरपणे, नॉनसेल्फ ग्रुप कॉन्टिग्सना BLASTN (nt NCBI डेटाबेस, e व्हॅल्यू < 1e−10 आणि 60% होमोलॉजी) सह भाष्य केले गेले. समांतरपणे, नॉनसेल्फ ग्रुप कॉन्टिग्सना BLASTN (nt NCBI डेटाबेस, e व्हॅल्यू < 1e−10 आणि 60% होमोलॉजी) सह भाष्य केले गेले. Параллельно чужеродные групповые контиги были аннотированы с помощью BLASTN (база данных nt NCBI, значение e <1e-10%06мои). समांतरपणे, परदेशी गटांच्या समूहांना BLASTN (NT NCBI डेटाबेस, e मूल्य <1e-10 आणि 60% समरूपता) सह भाष्य केले गेले.平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群.平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群. Параллельно контиги, не относящиеся к собственной группе, были аннотированы с помощью BLASTN (база даных nt < NCBI, гомология 60%). समांतरपणे, नॉन-सेल्फ ग्रुप कॉन्टिग्सना BLASTN (nt NCBI डेटाबेस, e व्हॅल्यू <1e-10 आणि 60% होमोलॉजी) सह भाष्य केले गेले. nr आणि RefSeq प्रोटीन NCBI डेटाबेस (e व्हॅल्यू < 1e−10 आणि 60% होमोलॉजी) वापरून नॉनसेल्फ कॉन्टिग्सवर देखील BLASTX घेण्यात आले. nr आणि RefSeq प्रोटीन NCBI डेटाबेस (e व्हॅल्यू < 1e−10 आणि 60% होमोलॉजी) वापरून नॉनसेल्फ कॉन्टिग्सवर देखील BLASTX घेण्यात आले. BLASTX также был проведен на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr и RefSeq NCBI 60%). nr आणि RefSeq NCBI प्रोटीन डेटाबेस (e व्हॅल्यू < 1e-10 आणि 60% होमोलॉजी) वापरून नॉन-सेल्फ कॉन्टिग्सवर देखील BLASTX केले गेले.还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60%.还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60%. BLASTX также выполняли на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr и RefSeq NCBI 60%). nr आणि RefSeq NCBI प्रोटीन डेटाबेस (e व्हॅल्यू <1e-10 आणि 60% होमोलॉजी) वापरून नॉन-सेल्फ कॉन्टिग्सवर देखील BLASTX केले गेले.नॉन-सेल्फ-कॉन्टिग्सचे BLASTN आणि BLASTX पूल अंतिम कॉन्टिग्सचे प्रतिनिधित्व करतात (पूरक फाइल पहा).
पीसीआरसाठी वापरलेले प्रायमर टेबल एस१ मध्ये सूचीबद्ध आहेत. टॅक डीएनए पॉलिमरेज (बायो बेसिक कॅनडा, मार्कहॅम, ओएन) चा वापर सीसीएफडीएनए लक्ष्य जनुकांना वाढविण्यासाठी केला गेला. खालील प्रतिक्रिया अटी वापरल्या गेल्या: ९५°सेल्सिअस तापमानावर ३ मिनिटांसाठी विकृतीकरण, ९५°सेल्सिअस तापमान १ मिनिटासाठी, १ मिनिटासाठी अ‍ॅनिलिंग तापमान सेट करा, ७२°सेल्सिअस तापमानावर १ मिनिटासाठी वाढवा, ३५ चक्रे आणि शेवटी १० मिनिटांत ७२°सेल्सिअस तापमान. . एसवायबीआरटीएम सेफ डीएनए जेल स्टेन (इन्व्हिट्रोजन, बर्लिंग्टन, ओएन, कॅनडा) असलेल्या ९५ व्ही तापमानावर अ‍ॅगारोज जेलमध्ये (१.५%) इलेक्ट्रोफोरेसीसद्वारे पीसीआर उत्पादने वेगळी केली गेली.
शिंपल्यांना (मायटिलस एसपीपी.) ५०० मिली ऑक्सिजनयुक्त समुद्री पाण्यात (३२ पीएसयू) २४ तासांसाठी ४°C तापमानावर अनुकूल केले गेले. मानवी गॅलेक्टिन-७ सीडीएनए अनुक्रम (NCBI अ‍ॅक्सेसन क्रमांक L07769) एन्कोडिंग इन्सर्ट असलेले प्लाझ्मिड डीएनए १९० μg/μl च्या अंतिम सांद्रतेवर कुपीमध्ये जोडले गेले. डीएनए जोडल्याशिवाय त्याच परिस्थितीत उबवलेल्या शिंपल्यांना नियंत्रण देण्यात आले. तिसऱ्या नियंत्रण टाकीत शिंपल्याशिवाय डीएनए होते. समुद्राच्या पाण्यात डीएनएच्या गुणवत्तेचे निरीक्षण करण्यासाठी, दर्शविलेल्या वेळी प्रत्येक टाकीमधून समुद्राच्या पाण्याचे नमुने (२० μl; तीन पुनरावृत्ती) घेण्यात आले. प्लाझ्मिड डीएनए ट्रेसेबिलिटीसाठी, एलबी शिंपल्यांना सूचित वेळेत कापण्यात आले आणि qPCR आणि ddPCR द्वारे विश्लेषण करण्यात आले. समुद्राच्या पाण्यात जास्त मीठ असल्याने, सर्व पीसीआर चाचण्यांपूर्वी एलिकॉट्स पीसीआर गुणवत्तेच्या पाण्यात (१:१०) पातळ केले गेले.
डिजिटल ड्रॉपलेट पीसीआर (ddPCR) हे बायोराड QX200 प्रोटोकॉल (मिसिसॉगा, ओंटारियो, कॅनडा) वापरून केले गेले. इष्टतम तापमान निश्चित करण्यासाठी तापमान प्रोफाइल वापरा (टेबल S1). QX200 ड्रॉप जनरेटर (बायोराड) वापरून थेंब तयार केले गेले. ddPCR खालीलप्रमाणे केले गेले: 5 मिनिटांसाठी 95°C, 30 सेकंदांसाठी 95°C चे 50 चक्र आणि 1 मिनिटांसाठी दिलेले अॅनिलिंग तापमान आणि 30 सेकंदांसाठी 72°C, 5 मिनिटांसाठी 4°C आणि 5 मिनिटांत 90°C. QX200 ड्रॉप रीडर (बायोराड) वापरून थेंबांची संख्या आणि सकारात्मक प्रतिक्रिया (प्रतींची संख्या/µl) मोजण्यात आल्या. 10,000 पेक्षा कमी थेंब असलेले नमुने नाकारण्यात आले. ddPCR चालवताना प्रत्येक वेळी पॅटर्न नियंत्रण केले गेले नाही.
रोटर-जीन® ३००० (कॉर्बेट रिसर्च, सिडनी, ऑस्ट्रेलिया) आणि LGALS7 विशिष्ट प्रायमर वापरून qPCR करण्यात आले. सर्व परिमाणात्मक PCR २० μl मध्ये QuantiFast SYBR ग्रीन PCR किट (QIAGEN) वापरून करण्यात आले. qPCR ची सुरुवात ९५°C वर १५ मिनिटांच्या उष्मायनाने करण्यात आली, त्यानंतर ९५°C वर १० सेकंदांसाठी ४० चक्रे आणि ६०°C वर ६० सेकंदांसाठी एका डेटा संकलनासह करण्यात आली. ९५°C वर ५ सेकंदांसाठी, ६५°C वर ६० सेकंदांसाठी आणि ९७°C वर qPCR च्या शेवटी सलग मोजमाप वापरून वितळण्याचे वक्र तयार करण्यात आले. नियंत्रण नमुने वगळता प्रत्येक qPCR तीन प्रतींमध्ये करण्यात आला.
शिंपले त्यांच्या उच्च गाळण्याच्या दरासाठी ओळखले जातात, म्हणून आम्ही प्रथम समुद्राच्या पाण्यात असलेले डीएनए तुकडे फिल्टर करून टिकवून ठेवू शकतात का याचा तपास केला. हे तुकडे त्यांच्या अर्ध-खुल्या लसीका प्रणालीमध्ये जमा होतात का याबद्दल आम्हाला देखील रस होता. निळ्या शिंपल्याच्या टाक्यांमध्ये जोडलेल्या विरघळणाऱ्या डीएनए तुकड्यांचे भवितव्य शोधून आम्ही प्रायोगिकरित्या ही समस्या सोडवली. डीएनए तुकड्यांचा मागोवा घेणे सोपे करण्यासाठी, आम्ही मानवी गॅलेक्टिन-७ जनुक असलेल्या परदेशी (स्वतः नव्हे) प्लाझमिड डीएनएचा वापर केला. ddPCR समुद्राच्या पाण्यात आणि शिंपल्यांमध्ये प्लाझमिड डीएनए तुकड्यांचा मागोवा घेते. आमचे निकाल दर्शवितात की जर शिंपल्यांच्या अनुपस्थितीत समुद्राच्या पाण्यात डीएनए तुकड्यांचे प्रमाण कालांतराने (७ दिवसांपर्यंत) तुलनेने स्थिर राहिले, तर शिंपल्यांच्या उपस्थितीत ही पातळी जवळजवळ ८ तासांच्या आत पूर्णपणे नाहीशी झाली (आकृती १अ,ब). इंट्राव्हल्व्ह्युलर फ्लुइड आणि हेमोलिम्फमध्ये १५ मिनिटांच्या आत बाह्य डीएनएचे तुकडे सहजपणे शोधले गेले (आकृती १क). हे तुकडे संपर्कात आल्यानंतर ४ तासांपर्यंत शोधले जाऊ शकतात. डीएनए तुकड्यांच्या संदर्भात ही फिल्टरिंग क्रिया बॅक्टेरिया आणि शैवालच्या फिल्टरिंग क्रियांसारखी आहे [31]. हे निकाल सूचित करतात की शिंपले त्यांच्या द्रवपदार्थांच्या कप्प्यांमध्ये परदेशी डीएनए फिल्टर करू शकतात आणि जमा करू शकतात.
शिंपल्यांच्या उपस्थितीत (A) किंवा अनुपस्थितीत (B) समुद्राच्या पाण्यात प्लाझमिड डीएनएची सापेक्ष सांद्रता, ddPCR द्वारे मोजली जाते. A मध्ये, निकाल टक्केवारी म्हणून व्यक्त केले जातात, बॉक्सच्या सीमा 75 व्या आणि 25 व्या पर्सेंटाइल दर्शवितात. फिट केलेले लॉगरिथमिक वक्र लाल रंगात दर्शविले आहे आणि राखाडी रंगात छायांकित क्षेत्र 95% आत्मविश्वास मध्यांतर दर्शविते. B मध्ये, लाल रेषा सरासरी दर्शवते आणि निळी रेषा एकाग्रतेसाठी 95% आत्मविश्वास मध्यांतर दर्शवते. C प्लाझमिड डीएनए जोडल्यानंतर वेगवेगळ्या वेळी शिंपल्यांच्या हेमोलिम्फ आणि व्हॉल्व्हुलर द्रवपदार्थात प्लाझमिड डीएनएचे संचय. निकाल शोधलेल्या परिपूर्ण प्रती/mL (±SE) म्हणून सादर केले जातात.
पुढे, आम्ही केर्गुलेन बेटांवरील शिंपल्यांच्या बेडमधून गोळा केलेल्या शिंपल्यांमध्ये ccfDNA च्या उत्पत्तीचा शोध घेतला, जो मर्यादित मानववंशीय प्रभाव असलेल्या बेटांचा एक दुर्गम गट आहे. या उद्देशासाठी, शिंपल्यांच्या हेमोलिम्फमधून cccDNA वेगळे केले गेले आणि मानवी cccDNA शुद्ध करण्यासाठी सामान्यतः वापरल्या जाणाऱ्या पद्धतींनी शुद्ध केले गेले [32, 33]. आम्हाला आढळले की शिंपल्यांमध्ये सरासरी हेमोलिम्फ ccfDNA सांद्रता कमी मायक्रोग्राम प्रति मिली हेमोलिम्फ श्रेणीत असते (टेबल S2, पूरक माहिती पहा). ही सांद्रता निरोगी लोकांपेक्षा खूप मोठी आहे (प्रति मिलीलीटर कमी नॅनोग्राम), परंतु क्वचित प्रसंगी, कर्करोगाच्या रुग्णांमध्ये, ccfDNA ची पातळी अनेक मायक्रोग्राम प्रति मिलीलीटरपर्यंत पोहोचू शकते [34, 35]. हेमोलिम्फ ccfDNA च्या आकार वितरणाच्या विश्लेषणातून असे दिसून आले की हे तुकडे आकारात मोठ्या प्रमाणात बदलतात, 1000 bp ते 1000 bp पर्यंत. ते 5000 bp पर्यंत (आकृती 2). सिलिका-आधारित QIAamp इन्व्हेस्टिगेटर किट वापरून असेच परिणाम प्राप्त झाले, ही पद्धत सामान्यतः फॉरेन्सिक सायन्समध्ये ccfDNA [36] सह कमी सांद्रता असलेल्या DNA नमुन्यांमधून जीनोमिक DNA जलद वेगळे करण्यासाठी आणि शुद्ध करण्यासाठी वापरली जाते.
शिंपल्यातील हेमोलिम्फचा प्रतिनिधी ccfDNA इलेक्ट्रोफोरेग्राम. न्यूक्लियोस्नॅप प्लाझ्मा किट (वर) आणि QIAamp DNA इन्व्हेस्टिगेटर किट वापरून काढलेला. B व्हायोलिन प्लॉट शिंपल्यांमध्ये हेमोलिम्फ ccfDNA सांद्रता (±SE) चे वितरण दर्शवितो. काळ्या आणि लाल रेषा अनुक्रमे मध्यक आणि पहिल्या आणि तिसऱ्या चतुर्थांशाचे प्रतिनिधित्व करतात.
मानव आणि प्राइमेट्समधील अंदाजे १% ccfDNA हा परदेशी स्रोत आहे [21, 37]. बायव्हल्व्हची अर्ध-खुली रक्ताभिसरण प्रणाली, सूक्ष्मजीवांनी समृद्ध समुद्राचे पाणी आणि शिंपल्याच्या ccfDNA च्या आकाराचे वितरण लक्षात घेता, आम्ही असे गृहीत धरले की शिंपल्याच्या हेमोलिम्फ ccfDNA मध्ये मायक्रोबियल डीएनएचा समृद्ध आणि वैविध्यपूर्ण पूल असू शकतो. या गृहीतकाची चाचणी घेण्यासाठी, आम्ही केर्गुलेन बेटांमधून गोळा केलेल्या औलाकोम्या अट्रा नमुन्यांमधून हेमोलिम्फ ccfDNA अनुक्रमित केले, ज्यातून १ कोटींहून अधिक वाचन मिळाले, ज्यापैकी ९७.६% गुणवत्ता नियंत्रण उत्तीर्ण झाले. नंतर BLASTN आणि NCBI बायव्हल्व्ह डेटाबेस वापरून वाचनांचे वर्गीकरण स्व आणि स्व-नसलेल्या स्त्रोतांनुसार केले गेले (आकृती S1, पूरक माहिती).
मानवांमध्ये, न्यूक्लियर आणि माइटोकॉन्ड्रियल दोन्ही डीएनए रक्तप्रवाहात सोडले जाऊ शकतात [38]. तथापि, सध्याच्या अभ्यासात, शिंपल्यांच्या न्यूक्लियर जीनोमिक डीएनएचे तपशीलवार वर्णन करणे शक्य नव्हते, कारण ए. अट्रा जीनोम अनुक्रमित किंवा वर्णन केलेले नाही. तथापि, आम्ही बायव्हल्व्ह लायब्ररी (आकृती S2, पूरक माहिती) वापरून आमच्या स्वतःच्या उत्पत्तीच्या अनेक ccfDNA तुकड्यांना ओळखू शकलो. आम्ही अनुक्रमित केलेल्या त्या ए. अट्रा जीन्सच्या निर्देशित पीसीआर प्रवर्धनाद्वारे आमच्या स्वतःच्या उत्पत्तीच्या डीएनए तुकड्यांच्या उपस्थितीची पुष्टी देखील केली (आकृती 3). त्याचप्रमाणे, ए. अट्राचा माइटोकॉन्ड्रियल जीनोम सार्वजनिक डेटाबेसमध्ये उपलब्ध असल्याने, ए. अट्राच्या हेमोलिम्फमध्ये माइटोकॉन्ड्रियल ccfDNA तुकड्यांच्या उपस्थितीचे पुरावे मिळू शकतात. पीसीआर प्रवर्धनाद्वारे माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए तुकड्यांच्या उपस्थितीची पुष्टी केली गेली (आकृती 3).
A. atra (लाल ठिपके - स्टॉक क्रमांक: SRX5705969) आणि M. platensis (निळे ठिपके - स्टॉक क्रमांक: SRX5705968) यांच्या हेमोलिम्फमध्ये विविध माइटोकॉन्ड्रियल जीन्स PCR द्वारे प्रवर्धित होते. ब्रेटन एट अल., २०११ B मधून रूपांतरित केलेले आकृती A. atra कडून हेमोलिम्फ सुपरनॅटंटचे प्रवर्धक FTA कागदावर संग्रहित. PCR मिश्रण असलेल्या PCR ट्यूबमध्ये थेट जोडण्यासाठी 3 मिमी पंच वापरा.
समुद्राच्या पाण्यात मुबलक प्रमाणात सूक्ष्मजीवांचे प्रमाण पाहता, आम्ही सुरुवातीला हेमोलिम्फमधील सूक्ष्मजीव डीएनए अनुक्रमांच्या वैशिष्ट्यीकरणावर लक्ष केंद्रित केले. हे करण्यासाठी, आम्ही दोन वेगवेगळ्या रणनीती वापरतो. पहिल्या रणनीतीमध्ये क्रॅकेन२ वापरण्यात आला, जो अल्गोरिथम-आधारित अनुक्रम वर्गीकरण कार्यक्रम आहे जो BLAST आणि इतर साधनांच्या तुलनेत अचूकतेने सूक्ष्मजीव अनुक्रम ओळखू शकतो [28]. 6719 पेक्षा जास्त वाचन बॅक्टेरियाच्या उत्पत्तीचे असल्याचे निश्चित करण्यात आले, तर 124 आणि 64 अनुक्रमे आर्किया आणि विषाणूंपासून होते (आकृती 4). सर्वात मुबलक बॅक्टेरिया डीएनए तुकडे फर्मिक्युट्स (46%), प्रोटीओबॅक्टेरिया (27%) आणि बॅक्टेरॉइडेट्स (17%) (आकृती 4a) होते. हे वितरण सागरी निळ्या शिंपल्याच्या मायक्रोबायोमच्या मागील अभ्यासांशी सुसंगत आहे [39, 40]. गॅमाप्रोटिओबॅक्टेरिया हे प्रोटीओबॅक्टेरिया (44%) चे मुख्य वर्ग होते, ज्यामध्ये अनेक व्हिब्रिओनालेस (आकृती 4b) समाविष्ट आहेत. ddPCR पद्धतीमुळे A. atra hemolymph (आकृती 4c) [41] च्या ccfDNA मध्ये Vibrio DNA तुकड्यांची उपस्थिती पुष्टी झाली. ccfDNA च्या जिवाणू उत्पत्तीबद्दल अधिक माहिती मिळविण्यासाठी, एक अतिरिक्त दृष्टिकोन स्वीकारण्यात आला (आकृती S2, पूरक माहिती). या प्रकरणात, ओव्हरलॅप केलेले वाचन पेअर-एंड वाचन म्हणून एकत्र केले गेले होते आणि BLASTN आणि 1e−3 चे e मूल्य आणि >90% समरूपतेसह कटऑफ वापरून स्वयं (द्विभाज्य) किंवा स्वयं-उत्पत्ती नसलेले म्हणून वर्गीकृत केले गेले होते. या प्रकरणात, ओव्हरलॅप केलेले वाचन पेअर-एंड वाचन म्हणून एकत्र केले गेले होते आणि BLASTN आणि 1e−3 चे e मूल्य आणि >90% समरूपतेसह कटऑफ वापरून स्वयं (द्विभाज्य) किंवा स्वयं-उत्पत्ती नसलेले म्हणून वर्गीकृत केले गेले होते. В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и были классифицированы как собраны как собраны моллюски) или чужие по происхождению с использованием BLASTN и значения e 1e-3 и отсечения с гомологией> 90%. या प्रकरणात, ओव्हरलॅपिंग रीड्स पेअर-एंडेड रीड्स म्हणून गोळा केले गेले आणि BLASTN आणि 1e-3 चे e मूल्य आणि >90% समरूपतेसह कटऑफ वापरून मूळ (द्विवार्षिक) किंवा मूळ नसलेले म्हणून वर्गीकृत केले गेले.在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN 和1e-3 的e 值和>90%同源性的截止值分类为自身（双壳类）或非自身来源.在 这 种 情况 下 ， 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 ， 使用 的 使用 使用 ब्लास्टन 和 和1> 90% 同源性 的 分类 自身 （双 壳类） 非 自身。 .. . . . . В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и классифицированы как собственчевыстированы моллюски) или несобственные по происхождению с использованием значений e BLASTN и 1e-3 и порога гомологии> 90%. या प्रकरणात, ओव्हरलॅपिंग रीड्स पेअर-एंडेड रीड्स म्हणून गोळा केले गेले आणि e BLASTN आणि 1e-3 मूल्ये आणि समरूपता थ्रेशोल्ड >90% वापरून स्वतःचे (द्विभाज्य) किंवा मूळ नसलेले म्हणून वर्गीकृत केले गेले.A. atra जीनोम अद्याप अनुक्रमित न झाल्यामुळे, आम्ही MEGAHIT नेक्स्ट जनरेशन सिक्वेन्सिंग (NGS) असेंबलरच्या डी नोव्हो असेंबली स्ट्रॅटेजीचा वापर केला. एकूण १४७,१८८ कॉन्टिग्स मूळचे अवलंबित (द्विभाज्य) म्हणून ओळखले गेले आहेत. त्यानंतर BLASTN आणि BLASTX वापरून 1e-10 च्या ई-व्हॅल्यूजसह या कॉन्टिग्सचा स्फोट करण्यात आला. या स्ट्रॅटेजीमुळे आम्हाला A. atra ccfDNA मध्ये उपस्थित असलेले ४८२ नॉन-द्विभाज्य तुकडे ओळखता आले. या DNA तुकड्यांपैकी अर्ध्याहून अधिक (५७%) बॅक्टेरियापासून मिळवले गेले होते, प्रामुख्याने गिल सिम्बिओंट्सपासून, ज्यामध्ये सल्फोट्रॉफिक सिम्बिओंट्सचा समावेश आहे आणि गिल सिम्बिओंट्स सोलेम्या वेलम (आकृती ५) पासून.
प्रकार पातळीवर सापेक्ष विपुलता. B दोन मुख्य फायला (फर्मिक्युट्स आणि प्रोटीओबॅक्टेरिया) ची सूक्ष्मजीव विविधता. ddPCR चे प्रतिनिधी प्रवर्धन C व्हिब्रिओ spp. A. तीन अट्रा हेमोलिम्फमध्ये 16S rRNA जनुकाचे (निळे) तुकडे.
एकूण ४८२ गोळा केलेल्या काँटिगचे विश्लेषण करण्यात आले. मेटाजेनोमिक काँटिग अ‍ॅनोटेशन्स (प्रोकॅरियोट्स आणि युकेरियोट्स) च्या वर्गीकरण वितरणाचे सामान्य प्रोफाइल. B BLASTN आणि BLASTX द्वारे ओळखल्या जाणाऱ्या बॅक्टेरियाच्या DNA तुकड्यांचे तपशीलवार वितरण.
क्रॅकेन२ च्या विश्लेषणातून असेही दिसून आले की शिंपल्यांच्या ccfDNA मध्ये आर्किअल डीएनए तुकडे आहेत, ज्यात युरीआर्चिओटा (६५%), क्रेनारचिओटा (२४%) आणि थॉरमार्चिओटा (११%) चे डीएनए तुकडे समाविष्ट आहेत (आकृती ६अ). कॅलिफोर्नियातील शिंपल्यांच्या सूक्ष्मजीव समुदायात पूर्वी आढळणाऱ्या युरीआर्चिओटा आणि क्रेनारचिओटा पासून मिळवलेल्या डीएनए तुकड्यांची उपस्थिती आश्चर्यकारक नसावी [४२]. जरी युरीआर्चिओटा बहुतेकदा अत्यंत परिस्थितीशी संबंधित असला तरी, आता हे ओळखले गेले आहे की युरीआर्चिओटा आणि क्रेनारचिओटा हे दोन्ही सागरी क्रायोजेनिक वातावरणातील सर्वात सामान्य प्रोकॅरिओट्सपैकी आहेत [४३, ४४]. केर्गुलेन पठारावरील तळाच्या गळतीतून मोठ्या प्रमाणात मिथेन गळती झाल्याच्या आणि केर्गुलेन बेटांच्या किनाऱ्यावर आढळलेल्या संभाव्य सूक्ष्मजीव मिथेन उत्पादनाच्या अलिकडच्या अहवालांमुळे शिंपल्यांमध्ये मिथेनोजेनिक सूक्ष्मजीवांची उपस्थिती आश्चर्यकारक नाही [४५].
त्यानंतर आमचे लक्ष डीएनए विषाणूंकडून मिळालेल्या वाचनांकडे गेले. आमच्या माहितीनुसार, शिंपल्यांच्या विषाणूंच्या सामग्रीचा हा पहिलाच लक्ष्याबाहेरचा अभ्यास आहे. अपेक्षेप्रमाणे, आम्हाला बॅक्टेरियोफेजेस (कॅडोव्हायरल्स) चे डीएनए तुकडे आढळले (आकृती 6b). तथापि, सर्वात सामान्य विषाणू डीएनए न्यूक्लियोसाइटोव्हायरसच्या एका फिलममधून येतो, ज्याला न्यूक्लियर सायटोप्लाज्मिक लार्ज डीएनए व्हायरस (NCLDV) असेही म्हणतात, ज्यामध्ये कोणत्याही विषाणूचा सर्वात मोठा जीनोम असतो. या फिलममध्ये, बहुतेक डीएनए अनुक्रम मिमिमिडोव्हिरिडे (58%) आणि पोक्सव्हिरिडे (21%) कुटुंबांचे आहेत, ज्यांच्या नैसर्गिक यजमानांमध्ये पृष्ठवंशी आणि आर्थ्रोपॉड्स समाविष्ट आहेत, तर या डीएनए अनुक्रमांचा एक छोटासा भाग ज्ञात व्हायरोलॉजिकल शैवालचा आहे. सागरी युकेरियोटिक शैवाल संक्रमित करते. हे अनुक्रम पॅन्डोरा विषाणूपासून देखील प्राप्त केले गेले होते, जो कोणत्याही ज्ञात विषाणू प्रजातीच्या सर्वात मोठ्या जीनोम आकाराचा महाकाय विषाणू आहे. मनोरंजक म्हणजे, हेमोलिम्फ ccfDNA अनुक्रमाद्वारे निर्धारित केल्यानुसार विषाणूने संक्रमित होण्यासाठी ज्ञात होस्टची श्रेणी तुलनेने मोठी होती (आकृती S3, पूरक माहिती). त्यामध्ये बॅक्युलोविरिडे आणि इरिडोविरिडे सारख्या कीटकांना संक्रमित करणारे विषाणू तसेच अमीबा, शैवाल आणि पृष्ठवंशी प्राण्यांना संक्रमित करणारे विषाणू समाविष्ट आहेत. आम्हाला पिथोव्हायरस सायबेरिकम जीनोमशी जुळणारे अनुक्रम देखील आढळले. पिटोव्हायरस ("झोम्बी व्हायरस" म्हणूनही ओळखले जाते) प्रथम सायबेरियातील 30,000 वर्षे जुन्या पर्माफ्रॉस्टमधून वेगळे केले गेले होते [47]. अशाप्रकारे, आमचे निकाल मागील अहवालांशी सुसंगत आहेत जे दर्शवितात की या विषाणूंच्या सर्व आधुनिक प्रजाती नामशेष झालेल्या नाहीत [48] आणि हे विषाणू दुर्गम उपआर्क्टिक सागरी परिसंस्थांमध्ये उपस्थित असू शकतात.
शेवटी, आम्ही इतर बहुपेशीय प्राण्यांमधील डीएनए तुकडे शोधू शकतो का हे पाहण्यासाठी चाचणी केली. BLASTN आणि BLASTX द्वारे nt, nr आणि RefSeq लायब्ररी (जीनोमिक आणि प्रथिने) सह एकूण 482 परदेशी कॉन्टिग ओळखले गेले. आमचे निकाल दर्शवितात की बहुपेशीय प्राण्यांच्या ccfDNA च्या परदेशी तुकड्यांमध्ये हाडांच्या हाडांचा डीएनए प्रामुख्याने आढळतो (आकृती 5). कीटक आणि इतर प्रजातींमधील डीएनए तुकडे देखील आढळले आहेत. डीएनए तुकड्यांचा तुलनेने मोठा भाग ओळखला गेला नाही, कदाचित स्थलीय प्रजातींच्या तुलनेत जीनोमिक डेटाबेसमध्ये मोठ्या संख्येने सागरी प्रजातींचे कमी प्रतिनिधित्व असल्यामुळे [49].
या पेपरमध्ये, आम्ही शिंपल्यांवर LB संकल्पना लागू करतो, असा युक्तिवाद करतो की हेमोलिम्फ ccfDNA शॉट सिक्वेन्सिंग सागरी किनारी परिसंस्थांच्या रचनेबद्दल अंतर्दृष्टी प्रदान करू शकते. विशेषतः, आम्हाला आढळले की १) शिंपल्याच्या हेमोलिम्फमध्ये तुलनेने जास्त प्रमाणात (~१-५ kb) फिरणारे DNA तुकडे असतात; २) हे DNA तुकडे स्वतंत्र आणि स्वतंत्र नसलेले दोन्ही आहेत ३) या DNA तुकड्यांच्या परदेशी स्रोतांमध्ये, आम्हाला जिवाणू, आर्किअल आणि विषाणूजन्य DNA तसेच इतर बहुपेशीय प्राण्यांचे DNA आढळले; ४) हेमोलिम्फमध्ये या परदेशी ccfDNA तुकड्यांचे संचय वेगाने होते आणि शिंपल्यांच्या अंतर्गत फिल्टरिंग क्रियाकलापात योगदान देते. शेवटी, आमचा अभ्यास दर्शवितो की LB ची संकल्पना, जी आतापर्यंत प्रामुख्याने बायोमेडिसिनच्या क्षेत्रात लागू केली गेली आहे, ती ज्ञानाचा एक समृद्ध परंतु अनपेक्षित स्रोत एन्कोड करते ज्याचा वापर सेंटिनेल प्रजाती आणि त्यांच्या वातावरणातील परस्परसंवाद चांगल्या प्रकारे समजून घेण्यासाठी केला जाऊ शकतो.
प्राइमेट्स व्यतिरिक्त, उंदीर, कुत्रे, मांजरी आणि घोडे यासारख्या सस्तन प्राण्यांमध्ये ccfDNA अलगावची नोंद झाली आहे [50, 51, 52]. तथापि, आमच्या माहितीनुसार, आमचा अभ्यास हा खुल्या रक्ताभिसरण प्रणाली असलेल्या सागरी प्रजातींमध्ये ccfDNA शोधणे आणि अनुक्रमित करण्याचा अहवाल देणारा पहिला अभ्यास आहे. शिंपल्यांची ही शारीरिक वैशिष्ट्य आणि फिल्टरिंग क्षमता, कमीत कमी अंशतः, इतर प्रजातींच्या तुलनेत रक्ताभिसरण करणाऱ्या DNA तुकड्यांच्या वेगवेगळ्या आकाराच्या वैशिष्ट्यांचे स्पष्टीकरण देऊ शकते. मानवांमध्ये, रक्तात फिरणारे बहुतेक DNA तुकडे 150 ते 200 bp आकाराचे लहान तुकडे असतात. ज्याची कमाल शिखर 167 bp [34, 53] असते. DNA तुकड्यांचा एक छोटा पण महत्त्वाचा भाग 300 ते 500 bp आकाराचा असतो आणि सुमारे 5% 900 bp पेक्षा जास्त लांब असतात. [54]. या आकाराच्या वितरणाचे कारण असे आहे की प्लाझ्मामध्ये ccfDNA चा मुख्य स्रोत पेशी मृत्युमुळे होतो, एकतर पेशी मृत्युमुळे किंवा निरोगी व्यक्तींमध्ये रक्ताभिसरण करणाऱ्या हेमॅटोपोएटिक पेशींच्या नेक्रोसिसमुळे किंवा कर्करोगाच्या रुग्णांमध्ये ट्यूमर पेशींच्या अपोप्टोसिसमुळे (ज्याला रक्ताभिसरण करणाऱ्या ट्यूमर DNA म्हणून ओळखले जाते). , ctDNA). शिंपल्यांमध्ये आढळलेले हेमोलिम्फ ccfDNA चे आकार वितरण 1000 ते 5000 bp पर्यंत होते, जे सूचित करते की शिंपल्यांमध्ये ccfDNA चे मूळ वेगळे आहे. हे एक तार्किक गृहीतक आहे, कारण शिंपल्यांमध्ये अर्ध-खुली रक्तवहिन्यासंबंधी प्रणाली असते आणि ते सूक्ष्मजीव जीनोमिक DNA चे उच्च सांद्रता असलेल्या सागरी जलीय वातावरणात राहतात. खरं तर, बाह्य DNA वापरून केलेल्या आमच्या प्रयोगशाळेतील प्रयोगांनी असे दर्शविले आहे की शिंपले समुद्राच्या पाण्यात DNA तुकडे जमा करतात, किमान काही तासांनंतर ते पेशींच्या शोषणानंतर खराब होतात आणि/किंवा विविध संस्थांमध्ये सोडले जातात आणि/किंवा साठवले जातात. पेशींची दुर्मिळता लक्षात घेता (प्रोकॅरियोटिक आणि युकेरियोटिक दोन्ही), इंट्राव्हॅल्व्हुलर कंपार्टमेंटचा वापर स्व-स्त्रोत तसेच परदेशी स्रोतांमधून ccfDNA चे प्रमाण कमी करेल. बायव्हल्व्ह इनेट इम्युनिटीचे महत्त्व आणि मोठ्या संख्येने फिरणाऱ्या फॅगोसाइट्सचा विचार करून, आम्ही पुढे असे गृहीत धरले की सूक्ष्मजीव आणि/किंवा सेल्युलर कचरा खाल्ल्यानंतर परदेशी डीएनए जमा करणाऱ्या फिरणाऱ्या फॅगोसाइट्समध्ये परदेशी ccfDNA देखील समृद्ध होते. एकत्रितपणे, आमचे निकाल दर्शवितात की बायव्हल्व्ह हेमोलिम्फ ccfDNA हे आण्विक माहितीचे एक अद्वितीय भांडार आहे आणि एक सेन्टिनेल प्रजाती म्हणून त्यांची स्थिती मजबूत करते.
आमच्या डेटावरून असे दिसून येते की बॅक्टेरियापासून मिळवलेल्या हेमोलिम्फ ccfDNA तुकड्यांचे अनुक्रमण आणि विश्लेषण यजमान बॅक्टेरियाच्या वनस्पती आणि आसपासच्या सागरी परिसंस्थेत उपस्थित असलेल्या बॅक्टेरियांबद्दल महत्त्वाची माहिती प्रदान करू शकते. शॉट सिक्वेन्सिंग तंत्रांनी कॉमेन्सल बॅक्टेरिया A. atra gill चे अनुक्रम उघड केले आहेत जे पारंपारिक 16S rRNA ओळख पद्धती वापरल्या असत्या तर चुकले असते, कारण काही प्रमाणात संदर्भ ग्रंथालय पूर्वाग्रह होता. खरं तर, केर्गुएलेन येथील त्याच शिंपल्याच्या थरात M. platensis कडून गोळा केलेल्या LB डेटाच्या आमच्या वापरातून असे दिसून आले की गिल-संबंधित बॅक्टेरियाच्या प्रतीकांची रचना दोन्ही शिंपल्यांच्या प्रजातींसाठी समान होती (आकृती S4, पूरक माहिती). दोन अनुवांशिकदृष्ट्या भिन्न शिंपल्यांची ही समानता केर्गुएलेनच्या थंड, सल्फरयुक्त आणि ज्वालामुखीय साठ्यांमध्ये बॅक्टेरिया समुदायांची रचना प्रतिबिंबित करू शकते [55, 56, 57, 58]. पोर्ट-औ-फ्रान्सच्या किनाऱ्यासारख्या बायोटर्बेटेड किनारी भागातून [59] शिंपल्यांची कापणी करताना सल्फर-कमी करणारे सूक्ष्मजीवांचे उच्च स्तर चांगले वर्णन केले गेले आहेत. दुसरी शक्यता अशी आहे की कोमेन्सल शिंपल्यांच्या वनस्पती क्षैतिज संक्रमणामुळे प्रभावित होऊ शकतात [60, 61]. सागरी वातावरण, समुद्राच्या तळाचा पृष्ठभाग आणि शिंपल्यांमध्ये सहजीवन जीवाणूंची रचना यांच्यातील सहसंबंध निश्चित करण्यासाठी अधिक संशोधन आवश्यक आहे. हे अभ्यास सध्या चालू आहेत.
हेमोलिम्फ ccfDNA ची लांबी आणि एकाग्रता, त्याचे शुद्धीकरण सुलभता आणि जलद शॉटगन सिक्वेन्सिंगला अनुमती देण्यासाठी उच्च गुणवत्ता हे सागरी किनारी परिसंस्थांमध्ये जैवविविधतेचे मूल्यांकन करण्यासाठी शिंपल्या ccfDNA वापरण्याचे अनेक फायदे आहेत. दिलेल्या परिसंस्थेमध्ये विषाणू समुदाय (विषाणू) वैशिष्ट्यीकृत करण्यासाठी हा दृष्टिकोन विशेषतः प्रभावी आहे [62, 63]. बॅक्टेरिया, आर्किया आणि युकेरियोट्सच्या विपरीत, विषाणू जीनोममध्ये 16S अनुक्रमांसारखे फायलोजेनेटिकली संरक्षित जीन्स नसतात. आमचे निकाल असे दर्शवितात की शिंपल्यासारख्या सूचक प्रजातींमधील द्रव बायोप्सी सामान्यतः किनारी सागरी परिसंस्थांमध्ये राहणाऱ्या यजमानांना संक्रमित करण्यासाठी ज्ञात असलेल्या ccfDNA विषाणू तुकड्यांची तुलनेने मोठ्या संख्येने ओळखण्यासाठी वापरली जाऊ शकतात. यामध्ये प्रोटोझोआ, आर्थ्रोपॉड्स, कीटक, वनस्पती आणि बॅक्टेरिया विषाणू (उदा. बॅक्टेरियोफेजेस) संक्रमित करण्यासाठी ज्ञात असलेल्या विषाणूंचा समावेश आहे. केर्गुएलेन येथे त्याच शिंपल्याच्या थरात गोळा केलेल्या निळ्या शिंपल्यांच्या (एम. प्लेटेन्सिस) हेमोलिम्फ ccfDNA विषाणूंचे परीक्षण केले तेव्हा समान वितरण आढळले (टेबल S2, पूरक माहिती). ccfDNA चा शॉटगन सिक्वेन्सिंग हा खरोखरच मानवांच्या किंवा इतर प्रजातींच्या विषाणूंच्या अभ्यासात गती मिळवणारा एक नवीन दृष्टिकोन आहे [21, 37, 64]. हा दृष्टिकोन विशेषतः डबल-स्ट्रँडेड डीएनए विषाणूंचा अभ्यास करण्यासाठी उपयुक्त आहे, कारण बाल्टिमोरमधील विषाणूंच्या सर्वात वैविध्यपूर्ण आणि विस्तृत वर्गाचे प्रतिनिधित्व करणाऱ्या सर्व डबल-स्ट्रँडेड डीएनए विषाणूंमध्ये कोणताही एक जनुक संरक्षित नाही [65]. जरी यापैकी बहुतेक विषाणू अवर्गीकृत राहिले आहेत आणि त्यात विषाणू जगाच्या पूर्णपणे अज्ञात भागातील विषाणूंचा समावेश असू शकतो [66], आम्हाला आढळले की शिंपल्यांचे विषाणू आणि होस्ट श्रेणी A. atra आणि M. platensis दोन्ही प्रजातींमध्ये येतात. त्याचप्रमाणे (आकृती S3 पहा, अतिरिक्त माहिती). ही समानता आश्चर्यकारक नाही, कारण ती वातावरणात उपस्थित असलेल्या डीएनएच्या शोषणात निवडकतेचा अभाव दर्शवू शकते. आरएनए विषाणूचे वैशिष्ट्यीकरण करण्यासाठी सध्या शुद्ध आरएनए वापरून भविष्यातील अभ्यास आवश्यक आहेत.
आमच्या अभ्यासात, आम्ही कोवार्स्की आणि त्यांच्या सहकाऱ्यांच्या कामातून स्वीकारलेली एक अतिशय कठोर पाइपलाइन वापरली [37], ज्यांनी मूळ ccfDNA असेंब्लीपूर्वी आणि नंतर पूल्ड रीड्स आणि कॉन्टिग्सचे दोन-चरण हटवण्याचा वापर केला, ज्यामुळे मॅप न केलेल्या रीड्सचे प्रमाण जास्त होते. म्हणून, आम्ही हे नाकारू शकत नाही की या अनमॅप न केलेल्या रीड्सपैकी काहींचे स्वतःचे मूळ असू शकते, प्रामुख्याने कारण आमच्याकडे या शिंपल्याच्या प्रजातीसाठी संदर्भ जीनोम नाही. आम्ही ही पाइपलाइन देखील वापरली कारण आम्हाला सेल्फ आणि नॉन-सेल्फ रीड्समधील काइमेरा आणि इल्युमिना MiSeq PE75 द्वारे निर्माण होणाऱ्या रीड लांबीबद्दल काळजी होती. बहुतेक अनचार्टेड रीडिंगचे आणखी एक कारण म्हणजे बहुतेक सागरी सूक्ष्मजंतू, विशेषतः केर्गुएलेन सारख्या दुर्गम भागात, भाष्य केलेले नाही. आम्ही इल्युमिना MiSeq PE75 वापरले, असे गृहीत धरले की ccfDNA तुकड्यांची लांबी मानवी ccfDNA सारखीच आहे. भविष्यातील अभ्यासांसाठी, हेमोलिम्फ ccfDNA चे वाचन मानव आणि/किंवा सस्तन प्राण्यांपेक्षा जास्त आहे हे दर्शविणारे आमचे निकाल पाहता, आम्ही ccfDNA च्या लांब तुकड्यांसाठी अधिक योग्य असा सिक्वेन्सिंग प्लॅटफॉर्म वापरण्याची शिफारस करतो. या पद्धतीमुळे सखोल विश्लेषणासाठी अधिक संकेत ओळखणे खूप सोपे होईल. सध्या उपलब्ध नसलेला पूर्ण A. atra न्यूक्लियर जीनोम अनुक्रम मिळवल्याने ccfDNA चे स्वतःचे आणि स्वतःचे नसलेले स्रोत वेगळे करणे देखील मोठ्या प्रमाणात सुलभ होईल. आमच्या संशोधनाने शिंपल्यांना द्रव बायोप्सीची संकल्पना लागू करण्याच्या शक्यतेवर लक्ष केंद्रित केले आहे हे लक्षात घेता, आम्हाला आशा आहे की भविष्यातील संशोधनात ही संकल्पना वापरली जात असल्याने, शिंपल्यांच्या सूक्ष्मजीव विविधतेचा अभ्यास करण्यासाठी या पद्धतीची क्षमता वाढवण्यासाठी नवीन साधने आणि पाइपलाइन विकसित केल्या जातील. सागरी परिसंस्था.
नॉन-इनवेसिव्ह क्लिनिकल बायोमार्कर म्हणून, ccfDNA चे वाढलेले मानवी प्लाझ्मा पातळी विविध रोग, ऊतींचे नुकसान आणि ताण परिस्थितीशी संबंधित आहे [67,68,69]. ही वाढ ऊतींचे नुकसान झाल्यानंतर त्यांच्या स्वतःच्या मूळ डीएनए तुकड्यांच्या प्रकाशनाशी संबंधित आहे. आम्ही तीव्र उष्णतेच्या ताणाचा वापर करून या समस्येचे निराकरण केले, ज्यामध्ये शिंपल्यांना 30 °C तापमानात थोडक्यात संपर्क साधण्यात आला. आम्ही तीन स्वतंत्र प्रयोगांमध्ये तीन वेगवेगळ्या प्रकारच्या शिंपल्यांवर हे विश्लेषण केले. तथापि, तीव्र उष्णतेच्या ताणानंतर आम्हाला ccfDNA पातळीत कोणताही बदल आढळला नाही (आकृती S5, अतिरिक्त माहिती पहा). हा शोध किमान अंशतः, शिंपल्यांमध्ये अर्ध-खुली रक्ताभिसरण प्रणाली असते आणि त्यांच्या उच्च फिल्टरिंग क्रियाकलापामुळे मोठ्या प्रमाणात परदेशी डीएनए जमा होतात हे स्पष्ट करू शकतो. दुसरीकडे, अनेक अपृष्ठवंशी प्राण्यांप्रमाणे, शिंपले ताण-प्रेरित ऊतींच्या नुकसानास अधिक प्रतिरोधक असू शकतात, ज्यामुळे त्यांच्या हेमोलिम्फमध्ये ccfDNA चे प्रकाशन मर्यादित होते [70, 71].
आजपर्यंत, जलीय परिसंस्थांमधील जैवविविधतेचे डीएनए विश्लेषण प्रामुख्याने पर्यावरणीय डीएनए (ईडीएनए) मेटाबारकोडिंगवर केंद्रित आहे. तथापि, जेव्हा प्राइमर्स वापरले जातात तेव्हा जैवविविधता विश्लेषणात ही पद्धत सहसा मर्यादित असते. शॉटगन सिक्वेन्सिंगचा वापर पीसीआरच्या मर्यादा आणि प्राइमर सेटच्या पक्षपाती निवडीला बगल देतो. अशा प्रकारे, एका अर्थाने, आमची पद्धत अलीकडे वापरल्या जाणाऱ्या हाय-थ्रूपुट ईडीएनए शॉटगन सिक्वेन्सिंग पद्धतीच्या जवळ आहे, जी थेट खंडित डीएनए अनुक्रमित करण्यास आणि जवळजवळ सर्व जीवांचे विश्लेषण करण्यास सक्षम आहे [72, 73]. तथापि, मानक ईडीएनए पद्धतींपासून एलबी वेगळे करणारे अनेक मूलभूत मुद्दे आहेत. अर्थात, ईडीएनए आणि एलबीमधील मुख्य फरक म्हणजे नैसर्गिक फिल्टर होस्टचा वापर. ईडीएनएचा अभ्यास करण्यासाठी नैसर्गिक फिल्टर म्हणून स्पंज आणि बायव्हल्व्ह (ड्रेसिना एसपीपी.) सारख्या सागरी प्रजातींचा वापर नोंदवला गेला आहे [74, 75]. तथापि, ड्रेसेनाच्या अभ्यासात ज्या ऊतींचे बायोप्सी वापरल्या गेल्या ज्यातून डीएनए काढले गेले होते. LB मधून ccfDNA चे विश्लेषण करण्यासाठी टिश्यू बायोप्सी, विशेष आणि कधीकधी महागड्या उपकरणे आणि eDNA किंवा टिश्यू बायोप्सीशी संबंधित लॉजिस्टिक्सची आवश्यकता नसते. खरं तर, आम्ही अलीकडेच अहवाल दिला आहे की LB मधून ccfDNA कोल्ड चेन न ठेवता FTA सपोर्टसह संग्रहित आणि विश्लेषण केले जाऊ शकते, जे दुर्गम भागात संशोधनासाठी एक मोठे आव्हान आहे [76]. द्रव बायोप्सीमधून ccfDNA काढणे देखील सोपे आहे आणि शॉटगन सिक्वेन्सिंग आणि PCR विश्लेषणासाठी उच्च दर्जाचे DNA प्रदान करते. eDNA विश्लेषणाशी संबंधित काही तांत्रिक मर्यादांमुळे हा एक मोठा फायदा आहे [77]. सॅम्पलिंग पद्धतीची साधेपणा आणि कमी किंमत दीर्घकालीन देखरेख कार्यक्रमांसाठी देखील विशेषतः योग्य आहे. त्यांच्या उच्च फिल्टरिंग क्षमतेव्यतिरिक्त, बायव्हल्व्हचे आणखी एक सुप्रसिद्ध वैशिष्ट्य म्हणजे त्यांच्या श्लेष्माची रासायनिक म्यूकोपोलिसेकेराइड रचना, जी विषाणूंचे शोषण करण्यास प्रोत्साहन देते [78, 79]. हे दिलेल्या जलीय परिसंस्थेमध्ये जैवविविधता आणि हवामान बदलाच्या प्रभावाचे वर्णन करण्यासाठी बायव्हल्व्हला एक आदर्श नैसर्गिक फिल्टर बनवते. जरी eDNA च्या तुलनेत यजमान-व्युत्पन्न DNA तुकड्यांची उपस्थिती ही पद्धतीची मर्यादा म्हणून पाहिली जाऊ शकते, तरी आरोग्य अभ्यासासाठी उपलब्ध असलेल्या प्रचंड माहितीमुळे eDNA च्या तुलनेत अशा मूळ ccfDNA असण्याशी संबंधित खर्च एकाच वेळी समजण्यासारखा आहे. ऑफसेट होस्ट. यामध्ये यजमान होस्टच्या जीनोममध्ये एकत्रित केलेल्या विषाणू अनुक्रमांची उपस्थिती समाविष्ट आहे. बायव्हल्व्हमध्ये क्षैतिजरित्या प्रसारित ल्युकेमिक रेट्रोव्हायरसची उपस्थिती लक्षात घेता, शिंपल्यांसाठी हे विशेषतः महत्वाचे आहे [80, 81]. eDNA पेक्षा LB चा आणखी एक फायदा म्हणजे ते हेमोलिम्फमध्ये रक्ताभिसरण करणाऱ्या रक्त पेशींच्या फॅगोसाइटिक क्रियाकलापांचे शोषण करते, जे सूक्ष्मजीवांना (आणि त्यांच्या जीनोमला) वेढते. बायव्हल्व्हमध्ये रक्त पेशींचे मुख्य कार्य फॅगोसाइटोसिस आहे [82]. शेवटी, ही पद्धत शिंपल्यांच्या उच्च फिल्टरिंग क्षमतेचा (सरासरी 1.5 l/h समुद्राच्या पाण्याचे) आणि दोन-दिवसांच्या अभिसरणाचा फायदा घेते, ज्यामुळे समुद्राच्या पाण्याच्या वेगवेगळ्या थरांचे मिश्रण वाढते, ज्यामुळे विषम eDNA कॅप्चर होते. [83, 84]. अशाप्रकारे, शिंपल्यांचे पौष्टिक, आर्थिक आणि पर्यावरणीय परिणाम पाहता, शिंपल्यांचे ccfDNA विश्लेषण हा एक मनोरंजक मार्ग आहे. मानवांकडून गोळा केलेल्या LB च्या विश्लेषणाप्रमाणेच, ही पद्धत बाह्य पदार्थांच्या प्रतिसादात यजमान DNA मध्ये अनुवांशिक आणि एपिजेनेटिक बदल मोजण्याची शक्यता देखील उघडते. उदाहरणार्थ, नॅनोपोर सिक्वेन्सिंग वापरून मूळ ccfDNA मध्ये जीनोम-वाइड मिथाइलेशन विश्लेषण करण्यासाठी तिसऱ्या पिढीतील सिक्वेन्सिंग तंत्रज्ञानाची कल्पना केली जाऊ शकते. ही प्रक्रिया या वस्तुस्थितीद्वारे सुलभ केली पाहिजे की शिंपल्याच्या ccfDNA तुकड्यांची लांबी दीर्घकालीन वाचनीय अनुक्रमण प्लॅटफॉर्मशी आदर्शपणे सुसंगत आहे जी रासायनिक परिवर्तनांची आवश्यकता न ठेवता एकाच अनुक्रमणातून जीनोम-वाइड डीएनए मिथाइलेशन विश्लेषण चालविण्यास अनुमती देते.85,86] ही एक मनोरंजक शक्यता आहे, कारण असे दर्शविले गेले आहे की DNA मिथाइलेशन नमुने पर्यावरणीय ताणाला प्रतिसाद प्रतिबिंबित करतात आणि अनेक पिढ्यांपर्यंत टिकून राहतात. म्हणूनच, हवामान बदल किंवा प्रदूषकांच्या संपर्कात आल्यानंतर प्रतिसाद नियंत्रित करणाऱ्या अंतर्निहित यंत्रणांमध्ये ते मौल्यवान अंतर्दृष्टी प्रदान करू शकते [87]. तथापि, LB चा वापर मर्यादांशिवाय नाही. हे सांगण्याची गरज नाही की यासाठी परिसंस्थेत निर्देशक प्रजातींची उपस्थिती आवश्यक आहे. वर नमूद केल्याप्रमाणे, दिलेल्या परिसंस्थेच्या जैवविविधतेचे मूल्यांकन करण्यासाठी LB चा वापर करण्यासाठी एक कठोर बायोइन्फॉरमॅटिक्स पाइपलाइन देखील आवश्यक आहे जी स्त्रोतापासून DNA तुकड्यांची उपस्थिती विचारात घेते. आणखी एक मोठी समस्या म्हणजे सागरी प्रजातींसाठी संदर्भ जीनोमची उपलब्धता. अशी आशा आहे की मरीन मॅमल जीनोम्स प्रकल्प आणि अलीकडेच स्थापित झालेल्या Fish10k प्रकल्प [88] सारख्या उपक्रमांमुळे भविष्यात असे विश्लेषण सुलभ होईल. सागरी फिल्टर-फीडिंग जीवांवर LB संकल्पनेचा वापर अनुक्रम तंत्रज्ञानातील नवीनतम प्रगतीशी देखील सुसंगत आहे, ज्यामुळे पर्यावरणीय ताणाच्या प्रतिसादात सागरी अधिवासांच्या आरोग्याबद्दल महत्त्वाची माहिती प्रदान करण्यासाठी मल्टी-ओम बायोमार्करच्या विकासासाठी ते योग्य बनते.
जीनोम सिक्वेन्सिंग डेटा बायोप्रोजेक्ट्स SRR8924808 अंतर्गत NCBI सिक्वेन्स रीड आर्काइव्ह https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 मध्ये जमा करण्यात आला आहे.
ब्रियरली एएस, किंग्सफोर्ड एमजे, सागरी जीव आणि परिसंस्थांवर हवामान बदलाचा प्रभाव. कोल बायोलॉजी. २००९; १९: पी६०२–पी६१४.
गिसी ई, मानिया ई, मजारिस एडी, फ्रॅशेट्टी एस, आल्म्पानिडो व्ही, बेव्हिलाक्वा एस, इत्यादी. हवामान बदल आणि इतर स्थानिक ताणतणावांचे सागरी पर्यावरणावर होणारे एकत्रित परिणाम विचारात घ्या. सामान्य वैज्ञानिक पर्यावरण. २०२१;७५५:१४२५६४.
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P, et al. ). पहिल्या मार्चचे विज्ञान. 2020; 7:48.
सेरोंट एल, निकास्ट्रो सीआर, जरदी जीआय, गोबरविले ई. पुनरावृत्ती होणाऱ्या उष्णतेच्या ताणाच्या परिस्थितीत कमी झालेली उष्णता सहनशीलता निळ्या शिंपल्यांच्या उन्हाळ्यातील उच्च मृत्युदराचे स्पष्टीकरण देते. वैज्ञानिक अहवाल २०१९; ९:१७४९८.
फे एसबी, सिपिएलस्की एएम, नस्ले एस, सर्व्हेंटेस-योशिदा के, ह्वान जेएल, ह्युबर ईआर, इत्यादी. प्राण्यांच्या मृत्यूची वारंवारता, कारणे आणि व्याप्तीमध्ये अलिकडच्या काळात झालेले बदल. प्रोक नॅशनल अ‍ॅकॅड सायन्स यूएसए. २०१५;११२:१०८३-८.
स्कार्पा एफ, सन्ना डी, अझेना I, मुगेट्टी डी, सेरुती एफ, होसेनी एस, एट अल. बहुविध गैर-प्रजाती-विशिष्ट रोगजनकांमुळे पिना नोबिलिसचा सामूहिक मृत्यू झाला असावा. जीवन. 2020; 10:238.
ब्रॅडली एम, कौट्स एसजे, जेनकिन्स ई, ओ'हारा टीएम. आर्क्टिक झुनोटिक रोगांवर हवामान बदलाचा संभाव्य परिणाम. इंट जे सर्कम्पोलर हेल्थ. २००५; ६४:४६८–७७.
बेयर जे., ग्रीन एनडब्ल्यू, ब्रूक्स एस., अॅलन आयजे, रुस ए., गोमेझ टी. इत्यादी. किनारी प्रदूषण देखरेखीमध्ये सिग्नल जीव म्हणून निळे शिंपले (मायटिलस एड्युलिस एसपीपी.): एक पुनरावलोकन. मार्च एनव्हायरन रेस २०१७; १३०:३३८-६५.
सिरावेग्ना जी, मार्सोनी एस, सिएना एस, बार्डेली ए. कर्करोगाच्या उपचारात द्रव बायोप्सीचे एकत्रीकरण. नॅट रेव्ह क्लीन ऑन्कोल. २०१७; १४:५३१–४८.
वॅन जेसीएम, मॅसी सी, गार्सिया-कोर्बाचो जे, मौलिएर एफ, ब्रेंटन जेडी, कॅल्डास सी, इत्यादी. लिक्विड बायोप्सी मॅच्युरेशन: ट्यूमर डीएनएला रक्ताभिसरण करण्यास अनुमती देते. नॅट रेव्ह कॅन्सर. २०१७;१७:२२३–३८.
मँडेल पी., मेटाईस पी. मानवी प्लाझ्मामधील न्यूक्लिक अॅसिड्स. सोस बायोल उपकंपन्यांचे बैठकीचे इतिवृत्त. १९४८; १४२:२४१-३.
ब्रोंखोर्स्ट एजे, उंगेरर डब्ल्यू, होल्डनरीडर एस. कर्करोगाच्या उपचारांसाठी आण्विक मार्कर म्हणून पेशीमुक्त डीएनएची एक नवीन भूमिका. बायोमोलर विश्लेषणाचे परिमाणीकरण. २०१९;१७:१०००८७.
इग्नाटियाडिस एम., स्लेज जीडब्ल्यू, जेफ्री एसएस लिक्विड बायोप्सी क्लिनिकमध्ये प्रवेश करते - अंमलबजावणीचे मुद्दे आणि भविष्यातील आव्हाने. नॅट रेव्हर्न क्लिन ऑन्कोल. २०२१; १८:२९७–३१२.
लो वायएम, कॉर्बेटा एन., चेंबरलेन पीएफ, राय डब्ल्यू., सार्जेंट आयएल, रेडमन सीडब्ल्यू आणि इतर. गर्भाचा डीएनए मातृ प्लाझ्मा आणि सीरममध्ये असतो. लॅन्सेट. १९९७; ३५०:४८५-७.
मुफरे एमएन, वोंग आरजे, शॉ जीएम, स्टीव्हनसन डीके, क्वेक एसआर गर्भधारणेदरम्यान महिलांच्या रक्तात फिरणाऱ्या बाह्य पेशीय आरएनएचा वापर करून गर्भधारणेचा आणि त्याच्या गुंतागुंतीचा अभ्यास. डोपेडियाट्रिक्स. २०२०;८:६०५२१९.
ऑलेरिच एम, शेरवुड के, केवन पी, शुट्झ ई, बेक जे, स्टेगबॉअर जे, इत्यादी. लिक्विड बायोप्सी: मूत्रपिंडाच्या ग्राफ्टमध्ये अ‍ॅलोजेनिक जखम शोधण्यासाठी दाता पेशी-मुक्त डीएनए वापरला जातो. नॅट रेव्ह नेफ्रोल. २०२१; १७:५९१–६०३.
जुआन एफसी, लो वायएम प्रसूतीपूर्व निदानातील नवोपक्रम: मातृ प्लाझ्मा जीनोम सिक्वेन्सिंग. अण्णा एमडी. २०१६;६७:४१९-३२.
गु डब्ल्यू, डेंग एक्स, ली एम, सुकु वायडी, अरेव्हालो एस, स्ट्रायक डी, इत्यादी. संक्रमित शारीरिक द्रव्यांच्या पुढील पिढीच्या मेटाजेनोमिक अनुक्रमांसह जलद रोगजनक शोध. नॅट मेडिसिन. २०२१;२७:११५-२४.