Nature.com ला भेट दिल्याबद्दल धन्यवाद.तुम्ही वापरत असलेल्या ब्राउझर आवृत्तीमध्ये मर्यादित CSS सपोर्ट आहे.सर्वोत्तम अनुभवासाठी, आम्ही शिफारस करतो की तुम्ही अद्ययावत ब्राउझर वापरा (किंवा इंटरनेट एक्सप्लोररमध्ये सुसंगतता मोड अक्षम करा).दरम्यान, सतत समर्थन सुनिश्चित करण्यासाठी, आम्ही साइटला शैली आणि JavaScript शिवाय रेंडर करू.
लिक्विड बायोप्सी (LB) ही एक संकल्पना आहे जी बायोमेडिकल क्षेत्रात झपाट्याने लोकप्रिय होत आहे.ही संकल्पना मुख्यतः परिसंचारी बाह्य DNA (ccfDNA) च्या तुकड्यांच्या शोधावर आधारित आहे, जे मुख्यत्वे विविध ऊतकांमधील पेशींच्या मृत्यूनंतर लहान तुकड्यांच्या रूपात सोडले जातात.या तुकड्यांचा एक छोटासा भाग परदेशी (विदेशी) ऊती किंवा जीवांपासून उद्भवतो.सध्याच्या कामात, आम्ही ही संकल्पना शिंपल्यांवर लागू केली आहे, ही एक सेंटिनल प्रजाती आहे जी त्यांच्या उच्च समुद्री जल गाळण्याची क्षमता म्हणून ओळखली जाते.सागरी किनारी परिसंस्थांच्या जैवविविधतेबद्दल माहिती देण्यासाठी आम्ही विविध स्त्रोतांकडून पर्यावरणीय DNA तुकडे कॅप्चर करण्यासाठी नैसर्गिक फिल्टर म्हणून काम करण्यासाठी शिंपल्यांची क्षमता वापरतो.आमचे परिणाम असे दर्शवतात की शिंपल्यातील हेमोलिम्फमध्ये डीएनए तुकडे असतात जे 1 ते 5 kb आकारात मोठ्या प्रमाणात बदलतात.शॉटगनच्या अनुक्रमाने असे दिसून आले की मोठ्या संख्येने डीएनए तुकडे परदेशी सूक्ष्मजीव उत्पत्तीचे आहेत.त्यापैकी, आम्हाला बॅक्टेरिया, पुरातत्त्व आणि विषाणूंमधून डीएनएचे तुकडे सापडले, ज्यात सामान्यतः किनारपट्टीच्या सागरी परिसंस्थांमध्ये आढळणाऱ्या विविध यजमानांना संक्रमित करण्यासाठी ज्ञात असलेल्या विषाणूंचा समावेश आहे.शेवटी, आमचा अभ्यास असे दर्शवितो की शिंपल्यांवर लागू केलेली LB ही संकल्पना सागरी किनारी परिसंस्थेतील सूक्ष्मजीव विविधतेबद्दल ज्ञानाचा समृद्ध परंतु अद्याप शोध न झालेला स्रोत आहे.
सागरी परिसंस्थेच्या जैवविविधतेवर हवामान बदलाचा प्रभाव (CC) हे संशोधनाचे झपाट्याने वाढणारे क्षेत्र आहे.ग्लोबल वॉर्मिंगमुळे केवळ महत्त्वपूर्ण शारीरिक ताण पडत नाही, तर सागरी जीवांच्या थर्मल स्थिरतेच्या उत्क्रांती मर्यादा देखील ढकलतात, ज्यामुळे अनेक प्रजातींच्या अधिवासावर परिणाम होतो आणि त्यांना अधिक अनुकूल परिस्थिती शोधण्यास प्रवृत्त करते [१, २].मेटाझोअन्सच्या जैवविविधतेवर परिणाम करण्याव्यतिरिक्त, सीसी यजमान-सूक्ष्मजीव परस्परसंवादाचे नाजूक संतुलन विस्कळीत करते.या सूक्ष्मजंतू डिस्बॅक्टेरिओसिसमुळे सागरी परिसंस्थांना गंभीर धोका निर्माण झाला आहे कारण ते समुद्री जीवांना संसर्गजन्य रोगजनकांना अधिक संवेदनाक्षम बनवते [३, ४].असे मानले जाते की सामूहिक मृत्यूंमध्ये एसएस महत्त्वाची भूमिका बजावते, जी जागतिक सागरी परिसंस्थेच्या व्यवस्थापनासाठी एक गंभीर समस्या आहे [5, 6].अनेक सागरी प्रजातींचे आर्थिक, पर्यावरणीय आणि पौष्टिक परिणाम लक्षात घेता हा एक महत्त्वाचा मुद्दा आहे.हे विशेषतः ध्रुवीय प्रदेशात राहणार्‍या द्विवाल्व्हसाठी खरे आहे, जेथे सीकेचे परिणाम अधिक तत्काळ आणि गंभीर असतात [6, 7].किंबहुना, मायटीलस एसपीपी सारखे बायव्हल्व्ह.सागरी परिसंस्थेवर CC च्या प्रभावांचे निरीक्षण करण्यासाठी मोठ्या प्रमाणावर वापरले जातात.आश्चर्याची गोष्ट नाही की, त्यांच्या आरोग्यावर लक्ष ठेवण्यासाठी तुलनेने मोठ्या संख्येने बायोमार्कर्स विकसित केले गेले आहेत, बहुतेकदा दोन-स्तरीय दृष्टीकोन वापरून कार्यात्मक बायोमार्कर्सचा समावेश आहे ज्यामध्ये एन्झाइमॅटिक क्रियाकलाप किंवा सेल्युलर फंक्शन्स जसे की सेल व्यवहार्यता आणि फागोसाइटिक क्रियाकलाप [8].या पद्धतींमध्ये मोठ्या प्रमाणात समुद्राचे पाणी शोषल्यानंतर मऊ उतींमध्ये जमा होणाऱ्या विशिष्ट दाब निर्देशकांच्या एकाग्रतेचे मोजमाप देखील समाविष्ट आहे.तथापि, उच्च गाळण्याची क्षमता आणि बायव्हल्व्हची अर्ध-खुली रक्ताभिसरण प्रणाली द्रव बायोप्सी (LB) या संकल्पनेचा वापर करून नवीन हेमोलिम्फ बायोमार्कर विकसित करण्याची संधी प्रदान करते, जो रुग्ण व्यवस्थापनासाठी एक सोपा आणि कमीतकमी आक्रमक दृष्टीकोन आहे.रक्ताचे नमुने [९, १०].मानवी LB मध्ये अनेक प्रकारचे परिसंचारी रेणू आढळू शकत असले तरी, ही संकल्पना प्रामुख्याने प्लाझ्मामधील परिसंचरण बाह्य DNA (ccfDNA) तुकड्यांच्या DNA अनुक्रम विश्लेषणावर आधारित आहे.खरं तर, मानवी प्लाझ्मामध्ये प्रसारित DNA ची उपस्थिती 20 व्या शतकाच्या मध्यापासून ज्ञात आहे [11], परंतु अलिकडच्या वर्षांत उच्च-थ्रूपुट सिक्वेन्सिंग पद्धतींच्या आगमनाने ccfDNA वर आधारित क्लिनिकल निदान झाले आहे.पेशींच्या मृत्यूनंतर जीनोमिक डीएनए (न्यूक्लियर आणि माइटोकॉन्ड्रियल) च्या निष्क्रीय प्रकाशनामुळे या प्रसारित डीएनए तुकड्यांची उपस्थिती आहे. निरोगी व्यक्तींमध्ये, ccfDNA ची एकाग्रता सामान्यतः कमी असते (<10 ng/mL) परंतु विविध पॅथॉलॉजीजने ग्रस्त असलेल्या किंवा तणावग्रस्त रुग्णांमध्ये 5-10 पटीने वाढू शकते, परिणामी ऊतींचे नुकसान होते. निरोगी व्यक्तींमध्ये, ccfDNA ची एकाग्रता सामान्यतः कमी असते (<10 ng/mL) परंतु विविध पॅथॉलॉजीजने ग्रस्त असलेल्या किंवा तणावग्रस्त रुग्णांमध्ये 5-10 पटीने वाढू शकते, परिणामी ऊतींचे नुकसान होते. У здоровых людей концентрация вккДНК в норме низкая (<10 ng/мл), но может повышаться в 5–10 раз у больный низкая вккДНК ергающихся стрессу, приводящему к повреждению тканей. निरोगी लोकांमध्ये, cccDNA ची एकाग्रता सामान्यतः कमी असते (<10 ng/mL), परंतु विविध पॅथॉलॉजीज असलेल्या किंवा तणावाखाली असलेल्या रुग्णांमध्ये ते 5-10 पटीने वाढू शकते ज्यामुळे ऊतींचे नुकसान होते.在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/mL），但在患有各种病理或承受压力渂，但在患有各种病理或承受压力渂受从而导致组织损伤.在 健康 个体 中 ， ccfdna 的 浓度 较 低 （（<10 ng/ml） 但 在 各 种 病理 或 承受 卢受 或 承受 厗5-10 倍, 从而 组织.。 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤Концентрации ccfDNA обычно низкие (<10 ng/мл) у здоровых людей, но могут быть увеличены в 5-10 раз у павцентрации нг/мл или стрессом, что приводит к повреждению тканей. निरोगी व्यक्तींमध्ये ccfDNA सांद्रता सामान्यत: कमी असते (<10 ng/ml) परंतु विविध पॅथॉलॉजीज किंवा तणाव असलेल्या रुग्णांमध्ये 5-10 पट वाढू शकते, परिणामी ऊतींचे नुकसान होते.ccfDNA तुकड्यांचा आकार मोठ्या प्रमाणात बदलतो, परंतु सामान्यतः 150 ते 200 bp पर्यंत असतो.[१२].स्वयं-व्युत्पन्न ccfDNA चे विश्लेषण, म्हणजे, सामान्य किंवा बदललेल्या यजमान पेशींमधून ccfDNA, आण्विक आणि/किंवा माइटोकॉन्ड्रियल जीनोममधील अनुवांशिक आणि एपिजेनेटिक बदल शोधण्यासाठी वापरला जाऊ शकतो, ज्यामुळे चिकित्सकांना विशिष्ट आण्विक-लक्षित उपचार निवडण्यात मदत होते [१३].तथापि, गर्भधारणेदरम्यान गर्भाच्या पेशींमधून किंवा प्रत्यारोपित अवयवांमधून ccfDNA सारख्या परदेशी स्त्रोतांकडून ccfDNA मिळवता येते [१४,१५,१६,१७].संसर्गजन्य एजंट (विदेशी) च्या न्यूक्लिक अॅसिडची उपस्थिती शोधण्यासाठी ccfDNA देखील माहितीचा एक महत्त्वाचा स्रोत आहे, जो रक्त संस्कृतींद्वारे ओळखल्या जात नसलेल्या व्यापक संक्रमणांचा गैर-आक्रमक शोध घेण्यास परवानगी देतो, संक्रमित ऊतींची आक्रमक बायोप्सी टाळतो [18].अलीकडील अभ्यासातून असे दिसून आले आहे की मानवी रक्तामध्ये माहितीचा समृद्ध स्रोत आहे ज्याचा वापर व्हायरल आणि बॅक्टेरिया रोगजनक ओळखण्यासाठी केला जाऊ शकतो आणि मानवी प्लाझ्मामध्ये आढळलेल्या ccfDNA पैकी सुमारे 1% परदेशी मूळ आहे [19].या अभ्यासातून असे दिसून आले आहे की ccfDNA विश्लेषण वापरून एखाद्या जीवाच्या प्रसारित मायक्रोबायोमच्या जैवविविधतेचे मूल्यांकन केले जाऊ शकते.तथापि, अलीकडे पर्यंत, ही संकल्पना केवळ मानवांमध्ये आणि काही प्रमाणात, इतर पृष्ठवंशीयांमध्ये वापरली जात होती [20, 21].
वर्तमान पत्रात, आम्ही 35 दशलक्ष वर्षांपूर्वी तयार झालेल्या एका मोठ्या पठारावरील बेटांचा समूह, सबअंटार्क्टिक केरगुलेन बेटांमध्ये सामान्यतः आढळणारी दक्षिणेकडील प्रजाती, ऑलाकोम्या अट्राच्या ccfDNA चे विश्लेषण करण्यासाठी LB क्षमता वापरतो.ज्वालामुखीचा उद्रेक, ज्वालामुखीचे उदभेदन.इन विट्रो प्रायोगिक प्रणाली वापरून, आम्हाला आढळले की समुद्राच्या पाण्यातील डीएनएचे तुकडे शिंपले त्वरीत घेतात आणि हेमोलिम्फ कंपार्टमेंटमध्ये प्रवेश करतात.शॉटगन सिक्वेन्सिंगने दर्शविले आहे की शिंपल्यातील हेमोलिम्फ ccfDNA मध्ये स्वतःचे आणि नॉन-सेल्फ उत्पत्तीचे DNA तुकडे असतात, ज्यात सहजीवन जीवाणू आणि शीत ज्वालामुखीच्या सागरी किनारपट्टीच्या पारिस्थितिक तंत्राच्या वैशिष्ट्यपूर्ण बायोम्समधील DNA तुकडे असतात.हेमोलिम्फ ccfDNA मध्ये वेगवेगळ्या होस्ट श्रेणींसह विषाणूंपासून व्युत्पन्न केलेले विषाणूजन्य अनुक्रम देखील असतात.आम्हाला बहुपेशीय प्राण्यांचे डीएनए तुकडे देखील सापडले आहेत जसे की हाडांचे मासे, समुद्री अॅनिमोन्स, एकपेशीय वनस्पती आणि कीटक.शेवटी, आमचा अभ्यास असे दर्शवितो की सागरी परिसंस्थेमध्ये समृद्ध जीनोमिक भांडार निर्माण करण्यासाठी एलबी संकल्पना सागरी अपृष्ठवंशीयांवर यशस्वीरित्या लागू केली जाऊ शकते.
पोर्ट-ऑ-फ्रान्स (049°21.235 S, 070°13.490 E.) च्या आंतरभरतीच्या खडकाळ किनाऱ्यांवरून प्रौढ (55-70 मिमी लांब) मायटीलस प्लॅटेन्सिस (एम. प्लॅटेन्सिस) आणि औलाकोम्या अट्रा (ए. अट्रा) गोळा केले गेले.डिसेंबर २०१८ मध्ये केरगुलेन बेटे. इतर प्रौढ निळे शिंपले (Mytilus spp.) व्यावसायिक पुरवठादाराकडून (PEI Mussel King Inc., Prince Edward Island, Canada) मिळवले गेले आणि 32‰ कृत्रिम समुद्रातील 10-20 L असलेल्या तापमान नियंत्रित (4°C) वायूयुक्त टाकीमध्ये ठेवले.(कृत्रिम समुद्री मीठ रीफ क्रिस्टल, इन्स्टंट ओशन, व्हर्जिनिया, यूएसए).प्रत्येक प्रयोगासाठी, वैयक्तिक शेलची लांबी आणि वजन मोजले गेले.
या कार्यक्रमासाठी विनामूल्य खुला प्रवेश प्रोटोकॉल ऑनलाइन उपलब्ध आहे (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1).थोडक्यात, वर्णन केल्याप्रमाणे एलबी हेमोलिम्फ अपहरणकर्त्याच्या स्नायूंमधून गोळा केले गेले [२२].हेमोलिम्फ 3 मिनिटांसाठी 1200×g वर सेंट्रीफ्यूगेशनद्वारे स्पष्ट केले गेले, वापर होईपर्यंत सुपरनॅटंट गोठवले गेले (-20°C).cfDNA च्या पृथक्करण आणि शुद्धीकरणासाठी, नमुने (1.5-2.0 ml) निर्मात्याच्या सूचनेनुसार NucleoSnap cfDNA किट (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) वापरून वितळले आणि प्रक्रिया केली गेली.पुढील विश्लेषण होईपर्यंत ccfDNA -80°C वर साठवले गेले.काही प्रयोगांमध्ये, QIAamp DNA इन्व्हेस्टिगेटर किट (QIAGEN, टोरोंटो, ओंटारियो, कॅनडा) वापरून ccfDNA वेगळे आणि शुद्ध केले गेले.मानक पिकोग्रीन परख वापरून शुद्ध केलेल्या डीएनएचे प्रमाण निश्चित केले गेले.पृथक ccfDNA च्या तुकड्यांच्या वितरणाचे विश्लेषण केशिका इलेक्ट्रोफोरेसीसद्वारे उच्च संवेदनशीलता DNA किट वापरून Agilent 2100 bioanalyzer (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) द्वारे केले गेले.निर्मात्याच्या सूचनेनुसार ccfDNA नमुना 1 μl वापरून परख केली गेली.
हेमोलिम्फ ccfDNA तुकड्यांच्या अनुक्रमासाठी, Génome Québec (Montreal, Quebec, Canada) ने Illumina MiSeq PE75 किटच्या Illumina DNA मिक्स किटचा वापर करून शॉटगन लायब्ररी तयार केली.एक मानक अडॅप्टर (BioO) वापरला गेला.NCBI सीक्वेन्स रीड आर्काइव्ह (SRR8924808 आणि SRR8924809) वरून रॉ डेटा फाइल्स उपलब्ध आहेत.FastQC [२३] वापरून मूलभूत वाचन गुणवत्तेचे मूल्यांकन केले गेले.ट्रिमोमॅटिक [२४] क्लिपिंग अडॅप्टर्स आणि खराब गुणवत्तेच्या वाचनासाठी वापरले गेले आहे.पेअर केलेल्या टोकांसह शॉटगन रीड्स फ्लॅश ला लांब सिंगल रीड्समध्ये विलीन करण्यात आले होते ज्यामध्ये विसंगती टाळण्यासाठी किमान 20 bp च्या ओव्हरलॅपसह [25]. विलीन केलेले वाचन BLASTN सह bivalve NCBI वर्गीकरण डेटाबेस (e value < 1e−3 आणि 90% homology) वापरून भाष्य केले गेले आणि DUST [२६] वापरून कमी-जटिलता अनुक्रमांचे मुखवटा तयार केले गेले. विलीन केलेले वाचन BLASTN सह bivalve NCBI वर्गीकरण डेटाबेस (e value < 1e−3 आणि 90% homology) वापरून भाष्य केले गेले आणि DUST [२६] वापरून कमी-जटिलता अनुक्रमांचे मुखवटा तयार केले गेले. Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием базы данных таксономии двустворчатюх двустворчатюх и 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с использованием DUST [२६]. NCBI द्विवाल्व्ह वर्गीकरण डेटाबेस (e मूल्य < 1e-3 आणि 90% homology) वापरून BLASTN सह पूल केलेले वाचन भाष्य केले गेले आणि DUST [26] वापरून कमी जटिलता अनुक्रम मास्किंग केले गेले.使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90% 同源性）用BLASTN 注释合并的读俶释合并的读俶]复杂度序列的掩蔽.使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 90% 同源） 用 用 注释 合并 读湰 茡类 [茡类 茡类 合并 读湰]复杂度 序列 的. . . . 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽掩蔽Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием таксономической базы данных -3 и 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с использованием DUST [२६]. NCBI bivalve taxonomic database (e value <1e-3 आणि 90% homology) वापरून BLASTN सह पूल केलेले रीड्स एनोटेट केले गेले आणि DUST [२६] वापरून कमी जटिलता अनुक्रम मास्किंग केले गेले.वाचन दोन गटांमध्ये विभागले गेले: द्विवाल्व्ह अनुक्रमांशी संबंधित (येथे सेल्फ-रीड्स म्हणतात) आणि असंबंधित (सेल्फ-रिड्स).कॉन्टिग्स [२७] व्युत्पन्न करण्यासाठी मेगाहिट वापरून दोन गट स्वतंत्रपणे एकत्र केले गेले.दरम्यान, एलियन मायक्रोबायोम रीड्सचे वर्गीकरण क्रेकेन२ [२८] वापरून वर्गीकृत केले गेले आणि गॅलेक्सी [२९, ३०] वरील क्रोना पाई चार्टद्वारे ग्राफिकरित्या प्रस्तुत केले गेले.आमच्या प्राथमिक प्रयोगांमधून इष्टतम किमीर्स किमीर्स-59 असल्याचे निश्चित केले होते. नंतर अंतिम भाष्यासाठी BLASTN (bivalve NCBI डेटाबेस, e value < 1e−10 आणि 60% homology) सह संरेखन करून सेल्फ कॉन्टिग्स ओळखले गेले. नंतर अंतिम भाष्यासाठी BLASTN (bivalve NCBI डेटाबेस, e value < 1e−10 आणि 60% homology) सह संरेखन करून सेल्फ कॉन्टिग्स ओळखले गेले. Затем собственные контиги были идентифицированы путем сопоставления с BLASTN омология 60%) для окончательной аннотации. नंतर अंतिम भाष्यासाठी BLASTN (NCBI bivalve डेटाबेस, e value <1e-10 आणि 60% homology) शी जुळवून स्व-कॉन्टीग्स ओळखले गेले.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）毹齐来识囏茻囏圤囏圥臫齐来识壳贝类NCBI终注释.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% Затем были идентифицированы собственные контиги для окончательной аннотации путем сопоставления с BLASTN (bazat моллюсков, значение e <1e-10 и гомология 60%). नंतर BLASTN (NCBI bivalve डेटाबेस, e value <1e-10 आणि 60% homology) विरुद्ध जुळवून अंतिम भाष्यासाठी सेल्फ-कॉन्टीग्स ओळखले गेले. समांतर, नॉनसेल्फ ग्रुप कॉन्टिग्स BLASTN (nt NCBI डेटाबेस, e value < 1e−10 आणि 60% homology) सह भाष्य केले होते. समांतर, नॉनसेल्फ ग्रुप कॉन्टिग्स BLASTN (nt NCBI डेटाबेस, e value < 1e−10 आणि 60% homology) सह भाष्य केले होते. Параллельно чужеродные групповые контиги были аннотированы с помощью BLASTN (база данных nt NCBI, значение e <1e-10%06мои). समांतर, परदेशी गट कॉन्टिग्स BLASTN (NT NCBI डेटाबेस, e value <1e-10 आणि 60% homology) सह भाष्य केले होते.平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群.平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群. Параллельно контиги, не относящиеся к собственной группе, были аннотированы с помощью BLASTN (база даных nt NCBI, база даных nt NCBI, 60%). समांतर, नॉन-सेल्फ ग्रुप कॉन्टिग्स BLASTN (nt NCBI डेटाबेस, e value <1e-10 आणि 60% homology) सह भाष्य केले होते. nr आणि RefSeq प्रोटीन NCBI डेटाबेस (e value < 1e−10 आणि 60% homology) वापरून नॉनसेल्फ कॉन्टिग्सवर BLASTX देखील आयोजित केले गेले. nr आणि RefSeq प्रोटीन NCBI डेटाबेस (e value < 1e−10 आणि 60% homology) वापरून नॉनसेल्फ कॉन्टिग्सवर BLASTX देखील आयोजित केले गेले. BLASTX также был проведен на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr и RefSeq NCBI (<%1-e06могион). nr आणि RefSeq NCBI प्रोटीन डेटाबेस (e value < 1e-10 आणि 60% homology) वापरून नॉन-सेल्फ कॉन्टिग्सवर BLASTX देखील केले गेले.还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60%.还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60%. BLASTX также выполняли на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr и RefSeq NCBI (значение e <10лог10 %0лоим). BLASTX देखील nr ​​आणि RefSeq NCBI प्रथिने डेटाबेस (e मूल्य <1e-10 आणि 60% homology) वापरून नॉन-सेल्फ कॉन्टिग्सवर केले गेले.नॉन-सेल्फ-कॉन्टीगचे BLASTN आणि BLASTX पूल अंतिम कॉन्टिग्सचे प्रतिनिधित्व करतात (पूरक फाइल पहा).
PCR साठी वापरलेले प्राइमर्स टेबल S1 मध्ये सूचीबद्ध आहेत.Taq DNA पॉलिमरेझ (Bio Basic Canada, Markham, ON) चा वापर ccfDNA लक्ष्य जनुकांना वाढवण्यासाठी केला गेला.खालील प्रतिक्रिया अटी वापरल्या गेल्या: 3 मिनिटांसाठी 95°C वर विकृतीकरण, 1 मिनिटासाठी 95°C, 1 मिनिटासाठी ऍनिलिंग तापमान सेट करा, 1 मिनिटासाठी 72°C वर वाढवणे, 35 चक्रे आणि शेवटी 10 मिनिटांत 72°C..Agarose gels (1.5%) मध्ये PCR उत्पादने इलेक्ट्रोफोरेसीस द्वारे 95 V वर SYBRTM Safe DNA Gel Stain (Invitrogen, Burlington, ON, Canada) असलेले वेगळे केले गेले.
शिंपले (Mytilus spp.) 500 मिली ऑक्सिजनयुक्त समुद्राच्या पाण्यात (32 PSU) 24 तास 4°C तापमानात अनुकूल होते.190 μg/μl च्या अंतिम एकाग्रतेवर कुपीमध्ये मानवी गॅलेक्टिन-7 cDNA अनुक्रम (NCBI प्रवेश क्रमांक L07769) एन्कोडिंग इन्सर्ट असलेले प्लाझमिड डीएनए जोडले गेले.डीएनए जोडल्याशिवाय त्याच परिस्थितीत उबवलेले शिंपले नियंत्रण होते.तिसऱ्या कंट्रोल टँकमध्ये शिंपल्याशिवाय डीएनए होता.समुद्राच्या पाण्यातील डीएनएच्या गुणवत्तेचे परीक्षण करण्यासाठी, समुद्राच्या पाण्याचे नमुने (20 μl; तीन पुनरावृत्ती) प्रत्येक टाकीमधून सूचित वेळी घेण्यात आले.प्लाझमिड डीएनए ट्रेसेबिलिटीसाठी, एलबी शिंपल्यांची काढणी सूचित वेळी केली गेली आणि qPCR आणि ddPCR द्वारे विश्लेषण केले गेले.समुद्राच्या पाण्यातील उच्च क्षारयुक्त सामग्रीमुळे, सर्व पीसीआर तपासणीपूर्वी अलिकॉट्स पीसीआर दर्जाच्या पाण्यात (1:10) पातळ केले गेले.
डिजिटल ड्रॉपलेट पीसीआर (ddPCR) BioRad QX200 प्रोटोकॉल (मिसिसॉगा, ओंटारियो, कॅनडा) वापरून केले गेले.इष्टतम तापमान (टेबल S1) निर्धारित करण्यासाठी तापमान प्रोफाइल वापरा.QX200 ड्रॉप जनरेटर (BioRad) वापरून थेंब तयार केले गेले.ddPCR खालीलप्रमाणे केले गेले: 5 मिनिटांसाठी 95°C, 30 s साठी 95°C ची 50 चक्रे आणि 1 मिनिट आणि 30 s साठी 72°C, 5 मिनिटांसाठी 4°C आणि 5 मिनिटांच्या आत 90°C साठी दिलेले ऍनिलिंग तापमान.QX200 ड्रॉप रीडर (BioRad) वापरून थेंब आणि सकारात्मक प्रतिक्रियांची संख्या (प्रत/µl) मोजली गेली.10,000 पेक्षा कमी थेंब असलेले नमुने नाकारण्यात आले.प्रत्येक वेळी ddPCR चालवताना नमुना नियंत्रण केले जात नाही.
qPCR Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Sydney, Australia) आणि LGALS7 विशिष्ट प्राइमर्स वापरून केले गेले.QuantiFast SYBR ग्रीन पीसीआर किट (QIAGEN) वापरून सर्व परिमाणात्मक पीसीआर 20 μl मध्ये केले गेले.qPCR ची सुरुवात 95°C वर 15 मिनिटे उष्मायनासह करण्यात आली होती, त्यानंतर 40 सायकल 95°C वर 10 सेकंदांसाठी आणि 60°C वर 60 सेकंदांसाठी एका डेटा संकलनासह.5 s साठी 95°C, 60 s साठी 65°C आणि qPCR च्या शेवटी 97°C वर सलग मोजमाप वापरून वितळणारे वक्र तयार केले गेले.नियंत्रण नमुने वगळता प्रत्येक क्यूपीसीआर तीन प्रतिलिपीत केले गेले.
शिंपले त्यांच्या उच्च गाळण्याच्या दरासाठी ओळखले जात असल्याने, आम्ही प्रथम तपासले की ते समुद्राच्या पाण्यात असलेले डीएनए तुकडे फिल्टर करू शकतात आणि टिकवून ठेवू शकतात.हे तुकडे त्यांच्या अर्ध-खुल्या लिम्फॅटिक प्रणालीमध्ये जमा होतात की नाही याबद्दल आम्हाला रस होता.निळ्या शिंपल्याच्या टाक्यांमध्ये जोडलेल्या विरघळणाऱ्या डीएनए तुकड्यांच्या भवितव्याचा शोध घेऊन आम्ही या समस्येचे प्रायोगिकपणे निराकरण केले.डीएनए तुकड्यांचा मागोवा घेणे सुलभ करण्यासाठी, आम्ही मानवी गॅलेक्टिन-7 जनुक असलेले परदेशी (स्वतःचे नाही) प्लास्मिड डीएनए वापरले.ddPCR समुद्राच्या पाण्यात आणि शिंपल्यांमध्ये प्लाझमिड डीएनए तुकड्यांचा शोध घेते.आमचे परिणाम असे दर्शवतात की जर समुद्राच्या पाण्यात डीएनए तुकड्यांचे प्रमाण कालांतराने (7 दिवसांपर्यंत) शिंपल्यांच्या अनुपस्थितीत तुलनेने स्थिर राहिले, तर शिंपल्यांच्या उपस्थितीत ही पातळी 8 तासांच्या आत जवळजवळ पूर्णपणे नाहीशी झाली (चित्र 1a,b).एक्सोजेनस डीएनएचे तुकडे 15 मिनिटांच्या आत इंट्राव्हलव्ह्युलर फ्लुइड आणि हेमोलिम्फ (चित्र 1c) मध्ये सहज सापडले.हे तुकडे एक्सपोजरनंतर 4 तासांपर्यंत शोधले जाऊ शकतात.डीएनए तुकड्यांच्या संदर्भात ही फिल्टरिंग क्रियाकलाप बॅक्टेरिया आणि शैवाल [३१] च्या फिल्टरिंग क्रियाकलापाशी तुलना करता येतो.हे परिणाम सूचित करतात की शिंपले त्यांच्या द्रवपदार्थांच्या कंपार्टमेंटमध्ये परदेशी डीएनए फिल्टर आणि जमा करू शकतात.
शिंपल्यांच्या उपस्थितीत (A) किंवा अनुपस्थितीत (B) समुद्राच्या पाण्यात प्लास्मिड डीएनएची सापेक्ष सांद्रता, ddPCR द्वारे मोजली जाते.A मध्ये, बॉक्सच्या सीमा 75 व्या आणि 25 व्या पर्सेंटाइल्स दर्शविणारे परिणाम टक्केवारी म्हणून व्यक्त केले जातात.फिट केलेले लॉगरिदमिक वक्र लाल रंगात दर्शविले आहे आणि राखाडी रंगात छायांकित केलेले क्षेत्र 95% आत्मविश्वास मध्यांतर दर्शवते.B मध्ये, लाल रेषा सरासरी दर्शवते आणि निळी रेषा एकाग्रतेसाठी 95% आत्मविश्वास मध्यांतर दर्शवते.C प्लाझमिड डीएनए जोडल्यानंतर वेगवेगळ्या वेळी हेमोलिम्फ आणि शिंपल्यांमधील वाल्वुलर द्रवपदार्थामध्ये प्लाझमिड डीएनएचे संचय.परिणाम शोधलेल्या परिपूर्ण प्रती/mL (±SE) म्हणून सादर केले जातात.
पुढे, आम्ही केरगुलेन बेटांवर शिंपल्यापासून गोळा केलेल्या शिंपल्यांमधील ccfDNA च्या उत्पत्तीची तपासणी केली, मर्यादित मानववंशीय प्रभाव असलेल्या बेटांचा एक दुर्गम समूह.या उद्देशासाठी, शिंपल्यातील हेमोलिम्फ्समधील सीसीडीएनए वेगळे केले गेले आणि सामान्यतः मानवी सीसीडीएनए [३२, ३३] शुद्ध करण्यासाठी वापरल्या जाणार्‍या पद्धतींद्वारे शुद्ध केले गेले.आम्हाला आढळले की शिंपल्यांमध्ये सरासरी हेमोलिम्फ ccfDNA एकाग्रता कमी मायक्रोग्राम प्रति मिली हेमोलिम्फ श्रेणीमध्ये आहे (टेबल S2, पूरक माहिती पहा).एकाग्रतेची ही श्रेणी निरोगी लोकांपेक्षा खूप मोठी आहे (कमी नॅनोग्राम प्रति मिलीलीटर), परंतु क्वचित प्रसंगी, कर्करोगाच्या रुग्णांमध्ये, ccfDNA ची पातळी प्रति मिलीलीटर अनेक मायक्रोग्रामपर्यंत पोहोचू शकते [34, 35].हेमोलिम्फ ccfDNA च्या आकारमानाच्या वितरणाच्या विश्लेषणात असे दिसून आले आहे की हे तुकडे 1000 bp ते 1000 bp पर्यंत आकारात मोठ्या प्रमाणात बदलतात.5000 bp पर्यंत (चित्र 2).सिलिका-आधारित QIAamp इन्व्हेस्टिगेटर किटचा वापर करून तत्सम परिणाम प्राप्त झाले, सामान्यतः फॉरेन्सिक सायन्समध्ये ccfDNA [३६] सह कमी एकाग्रतेच्या DNA नमुन्यांमधून जीनोमिक डीएनए वेगाने वेगळे आणि शुद्ध करण्यासाठी वापरली जाणारी पद्धत.
शिंपल्याच्या हेमोलिम्फचा प्रतिनिधी ccfDNA इलेक्ट्रोफोरेग्राम.न्यूक्लिओस्नॅप प्लाझ्मा किट (टॉप) आणि क्यूआयएएमपी डीएनए इन्व्हेस्टिगेटर किटसह काढले.B व्हायोलिन प्लॉट शिंपल्यांमध्ये हेमोलिम्फ ccfDNA सांद्रता (±SE) चे वितरण दर्शविते.काळ्या आणि लाल रेषा अनुक्रमे मध्यक आणि प्रथम आणि तृतीय चतुर्थांश दर्शवतात.
मानव आणि प्राइमेट्समधील अंदाजे 1% ccfDNA मध्ये परदेशी स्त्रोत आहे [21, 37].द्विवाल्व्हची अर्ध-खुली रक्ताभिसरण प्रणाली, मायक्रोबियल-समृद्ध समुद्राचे पाणी आणि शिंपले ccfDNA चे आकारमान वितरण लक्षात घेता, आम्ही असे गृहित धरले की शिंपले हेमोलिम्फ ccfDNA मध्ये मायक्रोबियल डीएनएचा समृद्ध आणि वैविध्यपूर्ण पूल असू शकतो.या गृहीतकाची चाचणी करण्यासाठी, आम्ही केरगुलेन बेटांवरून गोळा केलेल्या ऑलाकोमिया अट्रा नमुन्यांमधून हेमोलिम्फ ccfDNA अनुक्रमित केले, 10 दशलक्ष रीड्स मिळाले, त्यापैकी 97.6% गुणवत्ता नियंत्रण उत्तीर्ण झाले.नंतर BLASTN आणि NCBI द्विवाल्व्ह डेटाबेसेस (चित्र S1, पूरक माहिती) वापरून वाचनांचे वर्गीकरण स्वयं आणि स्वयं नसलेल्या स्त्रोतांनुसार केले गेले.
मानवांमध्ये, परमाणु आणि माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए दोन्ही रक्तप्रवाहात सोडले जाऊ शकतात [38].तथापि, सध्याच्या अभ्यासात, शिंपल्यांच्या आण्विक जीनोमिक डीएनएचे तपशीलवार वर्णन करणे शक्य नव्हते, कारण A. अट्रा जीनोम अनुक्रमित किंवा वर्णन केलेले नाही.तथापि, आम्ही बायव्हल्व्ह लायब्ररी (चित्र S2, पूरक माहिती) वापरून आमच्या स्वतःच्या उत्पत्तीचे अनेक ccfDNA तुकडे ओळखण्यात सक्षम होतो.आम्ही आमच्या स्वतःच्या उत्पत्तीच्या डीएनए तुकड्यांच्या उपस्थितीची पुष्टी देखील त्या A. अट्रा जीन्सच्या निर्देशित पीसीआर प्रवर्धनाद्वारे केली (चित्र 3).त्याचप्रमाणे, ए. अट्राचा माइटोकॉन्ड्रियल जीनोम सार्वजनिक डेटाबेसमध्ये उपलब्ध आहे, ए. अट्राच्या हेमोलिम्फमध्ये माइटोकॉन्ड्रियल ccfDNA तुकड्यांच्या उपस्थितीचा पुरावा मिळू शकतो.पीसीआर प्रवर्धन (चित्र 3) द्वारे माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए तुकड्यांच्या उपस्थितीची पुष्टी केली गेली.
A. atra (लाल ठिपके - स्टॉक क्रमांक: SRX5705969) आणि M. प्लॅटेन्सिस (निळे ठिपके - स्टॉक क्रमांक: SRX5705968) च्या हेमोलिम्फमध्ये विविध माइटोकॉन्ड्रियल जीन्स उपस्थित होते.ब्रेटन एट अल., 2011 B पासून रूपांतरित केलेली आकृती ए. एट्रा पासून हेमोलिम्फ सुपरनॅटंटचे एफटीए पेपरवर संग्रहित.पीसीआर मिक्स असलेल्या पीसीआर ट्यूबमध्ये थेट जोडण्यासाठी 3 मिमी पंच वापरा.
समुद्राच्या पाण्यातील मुबलक सूक्ष्मजीव सामग्री लक्षात घेता, आम्ही सुरुवातीला हेमोलिम्फमधील सूक्ष्मजीव डीएनए अनुक्रमांच्या वैशिष्ट्यांवर लक्ष केंद्रित केले.हे करण्यासाठी, आम्ही दोन भिन्न धोरणे वापरतो.प्रथम रणनीती Kraken2 वापरली, अल्गोरिदम-आधारित अनुक्रम वर्गीकरण कार्यक्रम जो BLAST आणि इतर साधनांशी तुलना करता येणार्‍या अचूकतेसह सूक्ष्मजीव अनुक्रम ओळखू शकतो [28].6719 पेक्षा जास्त रीड्स बॅक्टेरियाच्या उत्पत्तीचे असल्याचे निश्चित केले गेले, तर 124 आणि 64 अनुक्रमे आर्किया आणि व्हायरसचे होते (चित्र 4).Firmicutes (46%), प्रोटीओबॅक्टेरिया (27%), आणि बॅक्टेरॉइडेट्स (17%) (Fig. 4a) हे सर्वात मुबलक जिवाणू डीएनए तुकडे होते.हे वितरण सागरी निळ्या शिंपल्याच्या मायक्रोबायोमच्या मागील अभ्यासांशी सुसंगत आहे [39, 40].गॅमाप्रोटीओबॅक्टेरिया प्रोटीओबॅक्टेरियाचा मुख्य वर्ग (44%) होता, ज्यात अनेक व्हायब्रोनेल (चित्र 4b) समाविष्ट होते.ddPCR पद्धतीने A. atra hemolymph (Fig. 4c) [41] च्या ccfDNA मध्ये Vibrio DNA तुकड्यांच्या उपस्थितीची पुष्टी केली.ccfDNA च्या जिवाणू उत्पत्तीबद्दल अधिक माहिती मिळविण्यासाठी, एक अतिरिक्त दृष्टीकोन घेतला गेला (चित्र S2, पूरक माहिती). या प्रकरणात, ओव्हरलॅप केलेले वाचन पेअर-एंड रीड्स म्हणून एकत्र केले गेले आणि BLASTN आणि 1e−3 चे e मूल्य आणि >90% समरूपता असलेले कटऑफ वापरून स्वत: (बायव्हल्व्ह) किंवा नॉनसेल्फ मूळ म्हणून वर्गीकृत केले गेले. या प्रकरणात, ओव्हरलॅप केलेले वाचन पेअर-एंड रीड्स म्हणून एकत्र केले गेले आणि BLASTN आणि 1e−3 चे e मूल्य आणि >90% समरूपता असलेले कटऑफ वापरून स्वत: (बायव्हल्व्ह) किंवा नॉनसेल्फ मूळ म्हणून वर्गीकृत केले गेले. В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и были классифицированы как собраны как собраны ски) или чужие по происхождению с использованием BLASTN и значения e 1e-3 и отсечения с гомологией> 90%. या प्रकरणात, ओव्हरलॅपिंग रीड्स पेअर-एंडेड रीड्स म्हणून संकलित केले गेले आणि BLASTN आणि 1e-3 चे e मूल्य वापरून नेटिव्ह (बायव्हल्व्ह) किंवा गैर-मूळ म्हणून वर्गीकृत केले गेले आणि > 90% होमोलॉजीसह कटऑफ.在这种情况下,重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN 和1e-3 的e 值和>90% 值和>90%为自身（双壳类）或非自身来源.在 这 种 情况 下 ， 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 ， 使用 的 使用 的 %0 匐 使用 ब्लास्टन 和1 和1>源性 的 分类 自身 （双 壳类） 非 自身。 .. . . . . В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и классифицированы как собствения были собраны как или несобственные по происхождению с использованием значений e BLASTN и 1e-3 и порога гомологии> 90%. या प्रकरणात, ओव्हरलॅपिंग रीड्स पेअर-एंडेड रीड्स म्हणून संकलित केले गेले आणि e BLASTN आणि 1e-3 व्हॅल्यूज आणि 90% > थ्रेशोल्ड वापरून स्वतःचे (बायव्हल्व्ह) किंवा गैर-मूळ म्हणून वर्गीकृत केले गेले.A. अट्रा जीनोम अद्याप अनुक्रमित केलेला नसल्यामुळे, आम्ही मेगाहिट नेक्स्ट जनरेशन सिक्वेन्सिंग (NGS) असेंबलरची डी नोव्हो असेंब्ली स्ट्रॅटेजी वापरली.एकूण 147,188 कंटीग्स मूळचे आश्रित (बायव्हल्व्ह) म्हणून ओळखले गेले आहेत.नंतर BLASTN आणि BLASTX वापरून 1e-10 च्या ई-व्हॅल्यूसह या कॉन्टिग्जचा स्फोट झाला.या धोरणामुळे A. atra ccfDNA मध्ये उपस्थित असलेले ४८२ नॉन-बायव्हल्व्ह तुकडे ओळखता आले.या DNA तुकड्यांपैकी अर्ध्याहून अधिक (57%) बॅक्टेरिया, मुख्यत्वे सल्फोट्रॉफिक सिम्बियंट्ससह गिल सिम्बियंट्स आणि गिल सिम्बियंट्स सोलेमिया व्हेलम (चित्र 5) पासून प्राप्त झाले.
प्रकार स्तरावर सापेक्ष विपुलता.B दोन मुख्य फायला (फर्मिक्युट्स आणि प्रोटीओबॅक्टेरिया) ची सूक्ष्मजीव विविधता.ddPCR C Vibrio spp चे प्रतिनिधी प्रवर्धन.A. तीन अट्रा हेमोलिम्फमध्ये 16S rRNA जनुकाचे (निळे) तुकडे.
एकूण 482 संकलित कॉन्टिग्जचे विश्लेषण करण्यात आले.मेटाजेनोमिक कॉन्टिग एनोटेशन्स (प्रोकेरियोट्स आणि युकेरियोट्स) च्या वर्गीकरण वितरणाचे सामान्य प्रोफाइल.B BLASTN आणि BLASTX द्वारे ओळखले जाणारे जिवाणू DNA तुकड्यांचे तपशीलवार वितरण.
Kraken2 विश्लेषणाने असेही दाखवले की शिंपल्याच्या ccfDNA मध्ये पुरातन डीएनए तुकड्यांचा समावेश आहे, ज्यात Euryarchaeota (65%), Crenarchaeota (24%), आणि Thaurmarcheota (11%) (Fig. 6a) यांचा समावेश आहे.कॅलिफोर्नियातील शिंपल्यांच्या सूक्ष्मजंतू समुदायात पूर्वी आढळलेल्या युरीयार्चाओटा आणि क्रेनार्चाओटापासून प्राप्त झालेल्या डीएनए तुकड्यांची उपस्थिती आश्चर्यकारक वाटू नये [४२].जरी Euryarchaeota बर्‍याचदा अत्यंत परिस्थितीशी संबंधित असले तरी, आता हे ओळखले जाते की Euryarchaeota आणि Crenarcheota दोन्ही सागरी क्रायोजेनिक वातावरणातील सर्वात सामान्य प्रोकेरियोट्स आहेत [43, 44].केरगुलेन पठारावरील तळापासून मोठ्या प्रमाणात मिथेन गळतीचे अलीकडील अहवाल आणि केरगुलेन बेटांच्या [४६] किनार्‍यावर संभाव्य सूक्ष्मजीव मिथेन उत्पादनामुळे शिंपल्यांमध्ये मिथेनोजेनिक सूक्ष्मजीवांची उपस्थिती आश्चर्यकारक नाही.
त्यानंतर आमचे लक्ष डीएनए व्हायरसच्या वाचनाकडे वळले.आमच्या माहितीनुसार, शिंपल्यांमधील विषाणू सामग्रीचा हा पहिला ऑफ-लक्ष्य अभ्यास आहे.अपेक्षेप्रमाणे, आम्हाला बॅक्टेरियोफेजेसचे डीएनए तुकडे सापडले (कॅडोवायरेल्स) (चित्र 6b).तथापि, सर्वात सामान्य व्हायरल डीएनए न्यूक्लियोसाइटोव्हायरसच्या फाइलममधून येतो, ज्याला न्यूक्लियर सायटोप्लाज्मिक लार्ज डीएनए व्हायरस (NCLDV) देखील म्हणतात, ज्यामध्ये कोणत्याही विषाणूचा सर्वात मोठा जीनोम असतो.या फाइलममध्ये, बहुतेक डीएनए अनुक्रम मिमिमिडोविरिडे (58%) आणि पॉक्सविरिडे (21%) या कुटुंबांचे आहेत, ज्यांच्या नैसर्गिक यजमानांमध्ये पृष्ठवंशी आणि आर्थ्रोपॉड्सचा समावेश आहे, तर या डीएनए अनुक्रमांचा एक छोटासा भाग ज्ञात व्हायरोलॉजिकल शैवालचा आहे.समुद्री युकेरियोटिक शैवाल संक्रमित करते.कोणत्याही ज्ञात व्हायरल वंशाच्या सर्वात मोठ्या जीनोम आकारासह, Pandora विषाणूपासून देखील अनुक्रम प्राप्त केले गेले.विशेष म्हणजे, हेमोलिम्फ ccfDNA अनुक्रमाने निर्धारित केल्यानुसार, विषाणूचा संसर्ग झालेल्या यजमानांची श्रेणी तुलनेने मोठी होती (आकृती S3, पूरक माहिती).यामध्ये बॅक्युलोव्हिरिडे आणि इरिडोविरिडे सारख्या कीटकांना संक्रमित करणारे विषाणू तसेच अमिबा, शैवाल आणि पृष्ठवंशी प्राण्यांना संक्रमित करणारे विषाणू समाविष्ट आहेत.आम्हाला पिथोव्हायरस सायबेरिकम जीनोमशी जुळणारे अनुक्रम देखील आढळले.Pitoviruses (ज्याला "झोम्बी व्हायरस" असेही म्हणतात) प्रथम सायबेरियातील 30,000 वर्ष जुन्या पर्माफ्रॉस्टपासून वेगळे केले गेले [47].अशाप्रकारे, आमचे परिणाम मागील अहवालांशी सुसंगत आहेत हे दर्शविते की या विषाणूंच्या सर्व आधुनिक प्रजाती नामशेष झालेल्या नाहीत [४८] आणि हे विषाणू दुर्गम सबार्क्टिक सागरी परिसंस्थांमध्ये उपस्थित असू शकतात.
शेवटी, आम्ही इतर बहुपेशीय प्राण्यांमधून डीएनएचे तुकडे शोधू शकतो का हे पाहण्यासाठी आम्ही चाचणी केली.BLASTN आणि BLASTX द्वारे nt, nr आणि RefSeq लायब्ररी (जीनोमिक आणि प्रोटीन) सह एकूण 482 परदेशी कॉन्टिग्ज ओळखले गेले.आमचे परिणाम असे दर्शवतात की बहुपेशीय प्राण्यांच्या ccfDNA च्या परदेशी तुकड्यांमध्ये हाडांच्या हाडांचा DNA वरचढ आहे (चित्र 5).कीटक आणि इतर प्रजातींमधून डीएनएचे तुकडेही सापडले आहेत.डीएनए तुकड्यांचा तुलनेने मोठा भाग ओळखला गेला नाही, शक्यतो स्थलीय प्रजातींच्या तुलनेत जीनोमिक डेटाबेसमध्ये मोठ्या संख्येने सागरी प्रजातींच्या कमी प्रतिनिधित्वामुळे [४९].
सध्याच्या पेपरमध्ये, आम्ही शिंपल्यांवर एलबी संकल्पना लागू करतो, असा युक्तिवाद करत की हेमोलिम्फ ccfDNA शॉट सीक्वेन्सिंग सागरी किनारपट्टीच्या परिसंस्थेच्या रचनेची अंतर्दृष्टी प्रदान करू शकते.विशेषतः, आम्हाला आढळले की 1) शिंपल्यातील हेमोलिम्फमध्ये तुलनेने मोठ्या (~1-5 kb) प्रसारित DNA तुकड्यांची तुलनेने उच्च सांद्रता (मायक्रोग्राम पातळी) असते;2) हे डीएनए तुकडे स्वतंत्र आणि स्वतंत्र नसलेले दोन्ही आहेत 3) या डीएनए तुकड्यांच्या परदेशी स्त्रोतांपैकी, आम्हाला बॅक्टेरिया, पुरातन आणि विषाणूजन्य डीएनए, तसेच इतर बहुपेशीय प्राण्यांचे डीएनए आढळले;4) हेमोलिम्फमध्ये या परदेशी ccfDNA तुकड्यांचा संचय वेगाने होतो आणि शिंपल्यांच्या अंतर्गत फिल्टरिंग क्रियाकलापांना हातभार लावतो.शेवटी, आमचा अभ्यास दर्शवितो की LB ची संकल्पना, जी आत्तापर्यंत मुख्यतः बायोमेडिसिनच्या क्षेत्रात लागू केली गेली आहे, ज्ञानाचा एक समृद्ध परंतु शोध न केलेला स्त्रोत एन्कोड करते ज्याचा उपयोग सेंटिनल प्रजाती आणि त्यांचे वातावरण यांच्यातील परस्परसंवाद अधिक चांगल्या प्रकारे समजून घेण्यासाठी केला जाऊ शकतो.
प्राइमेट्स व्यतिरिक्त, उंदीर, कुत्री, मांजर आणि घोडे [50, 51, 52] यासह सस्तन प्राण्यांमध्ये ccfDNA अलगाव नोंदवला गेला आहे.तथापि, आमच्या माहितीनुसार, आमचा अभ्यास हा खुल्या परिसंचरण प्रणालीसह सागरी प्रजातींमध्ये ccfDNA शोधणे आणि अनुक्रमित करण्याचा अहवाल देणारा पहिला आहे.हे शारीरिक वैशिष्ट्य आणि शिंपल्यांची फिल्टरिंग क्षमता, कमीत कमी अंशतः, इतर प्रजातींच्या तुलनेत डीएनए तुकड्यांच्या प्रसाराच्या वेगवेगळ्या आकाराची वैशिष्ट्ये स्पष्ट करू शकतात.मानवांमध्ये, रक्तामध्ये फिरणारे बहुतेक डीएनए तुकडे 150 ते 200 bp आकाराचे लहान तुकडे असतात.167 bp च्या कमाल शिखरासह [34, 53].DNA तुकड्यांचा एक छोटा पण महत्त्वाचा भाग 300 आणि 500 ​​bp च्या दरम्यान असतो आणि सुमारे 5% 900 bp पेक्षा मोठा असतो.[५४].या आकाराच्या वितरणाचे कारण असे आहे की प्लाझ्मामधील ccfDNA चा मुख्य स्त्रोत सेल मृत्यूच्या परिणामी उद्भवतो, एकतर सेल मृत्यूमुळे किंवा निरोगी व्यक्तींमध्ये रक्ताभिसरण करणाऱ्या हेमॅटोपोएटिक पेशींच्या नेक्रोसिसमुळे किंवा कर्करोगाच्या रुग्णांमध्ये ट्यूमर पेशींच्या अपोप्टोसिसमुळे (ज्याला ट्यूमर डीएनए म्हणून ओळखले जाते)., ctDNA).हेमोलिम्फ ccfDNA चे आकारमान वितरण जे आम्हाला शिंपल्यांमध्ये आढळले ते 1000 ते 5000 bp पर्यंत होते, हे सूचित करते की शिंपल्याच्या ccfDNA ची उत्पत्ती वेगळी आहे.हे तार्किक गृहीतक आहे, कारण शिंपल्यांमध्ये अर्ध-खुली संवहनी प्रणाली असते आणि ते सूक्ष्मजीव जीनोमिक डीएनएची उच्च सांद्रता असलेल्या सागरी जलीय वातावरणात राहतात.खरं तर, एक्सोजेनस डीएनए वापरून आमच्या प्रयोगशाळेतील प्रयोगांनी हे सिद्ध केले आहे की शिंपले डीएनएचे तुकडे समुद्राच्या पाण्यात जमा करतात, कमीतकमी काही तासांनंतर ते सेल्युलर शोषल्यानंतर आणि/किंवा सोडले जातात आणि/किंवा विविध संस्थांमध्ये साठवले जातात.पेशींची दुर्मिळता (प्रोकेरियोटिक आणि युकेरियोटिक दोन्ही) लक्षात घेता, इंट्राव्हलव्ह्युलर कंपार्टमेंट्सचा वापर स्व-स्रोत तसेच परदेशी स्त्रोतांकडून ccfDNA चे प्रमाण कमी करेल.द्विवाल्व्ह जन्मजात प्रतिकारशक्तीचे महत्त्व आणि परिसंचरण फॅगोसाइट्सची मोठी संख्या लक्षात घेऊन, आम्ही पुढे असे गृहित धरले की परकीय ccfDNA देखील प्रसारित फॅगोसाइट्समध्ये समृद्ध आहे जे सूक्ष्मजीव आणि/किंवा सेल्युलर मोडतोड घेतल्यानंतर परदेशी DNA जमा करतात.एकत्रितपणे, आमचे परिणाम दर्शवितात की bivalve hemolymph ccfDNA हे आण्विक माहितीचे अनन्य भांडार आहे आणि सेंटिनल प्रजाती म्हणून त्यांची स्थिती मजबूत करते.
आमचा डेटा सूचित करतो की जिवाणू-व्युत्पन्न हेमोलिम्फ ccfDNA तुकड्यांचे अनुक्रम आणि विश्लेषण यजमान बॅक्टेरियल फ्लोरा आणि आसपासच्या सागरी परिसंस्थेमध्ये उपस्थित असलेल्या जीवाणूंबद्दल मुख्य माहिती प्रदान करू शकतात.शॉट सिक्वेन्सिंग तंत्राने कॉमेन्सल बॅक्टेरिया ए. एट्रा गिलचे अनुक्रम उघड केले आहेत जे संदर्भ ग्रंथालयाच्या पूर्वाग्रहामुळे, पारंपारिक 16S rRNA ओळख पद्धती वापरल्या गेल्या असत्या तर ते चुकले असते.खरेतर, केरगुलेन येथील त्याच शिंपल्याच्या थरातील एम. प्लॅटेन्सिस वरून गोळा केलेल्या एलबी डेटाच्या आमच्या वापरावरून असे दिसून आले की गिल-संबंधित जिवाणू सिम्बिओंट्सची रचना दोन्ही शिंपल्यांच्या प्रजातींसाठी समान होती (चित्र S4, पूरक माहिती).दोन अनुवांशिकदृष्ट्या भिन्न शिंपल्यांची ही समानता केरगुलेन [५५, ५६, ५७, ५८] च्या थंड, गंधकयुक्त आणि ज्वालामुखीच्या ठेवींमध्ये बॅक्टेरियाच्या समुदायाची रचना प्रतिबिंबित करू शकते.पोर्ट-ऑ-फ्रान्सच्या किनार्‍यासारख्या बायोटर्बेटेड किनारी भाग [५९] पासून शिंपले काढताना सल्फर-कमी करणार्‍या सूक्ष्मजीवांच्या उच्च पातळीचे वर्णन केले गेले आहे.दुसरी शक्यता अशी आहे की क्षैतिज प्रक्षेपण [60, 61] द्वारे कॉमन्सल शिंपल्याचा फ्लोरा प्रभावित होऊ शकतो.सागरी वातावरण, समुद्रातील पृष्ठभाग आणि शिंपल्यांमधील सहजीवन जीवाणूंची रचना यांच्यातील परस्परसंबंध निश्चित करण्यासाठी अधिक संशोधन आवश्यक आहे.हे अभ्यास सध्या चालू आहेत.
हेमोलिम्फ ccfDNA ची लांबी आणि एकाग्रता, त्याची शुद्धीकरणाची सुलभता आणि जलद शॉटगन सिक्वेन्सिंगला अनुमती देण्यासाठी उच्च दर्जा हे सागरी किनारी परिसंस्थेतील जैवविविधतेचे मूल्यांकन करण्यासाठी शिंपले ccfDNA वापरण्याचे अनेक फायदे आहेत.दिलेल्या इकोसिस्टममध्ये व्हायरल कम्युनिटीज (व्हायरोम्स) चे वैशिष्ट्य देण्यासाठी हा दृष्टीकोन विशेषतः प्रभावी आहे [६२, ६३].बॅक्टेरिया, आर्किया आणि युकेरियोट्सच्या विपरीत, विषाणूजन्य जीनोममध्ये 16S अनुक्रमांसारखे फायलोजेनेटिकरित्या संरक्षित जीन्स नसतात.आमचे परिणाम सूचित करतात की शिंपल्यासारख्या निर्देशक प्रजातींमधून द्रव बायोप्सीचा वापर तुलनेने मोठ्या संख्येने ccfDNA विषाणूच्या तुकड्यांना ओळखण्यासाठी केला जाऊ शकतो जे सामान्यत: किनारपट्टीच्या सागरी परिसंस्थांमध्ये वास्तव्य करणाऱ्या यजमानांना संक्रमित करण्यासाठी ओळखले जातात.यामध्ये प्रोटोझोआ, आर्थ्रोपॉड्स, कीटक, वनस्पती आणि जिवाणू विषाणू (उदा., बॅक्टेरियोफेजेस) संक्रमित करण्यासाठी ओळखले जाणारे व्हायरस समाविष्ट आहेत.केरगुलेन (टेबल S2, पूरक माहिती) येथे त्याच शिंपल्याच्या थरात गोळा केलेल्या निळ्या शिंपल्यांचे (एम. प्लॅटेन्सिस) हेमोलिम्फ ccfDNA व्हायरोमचे परीक्षण केले तेव्हा असेच वितरण आढळून आले.ccfDNA चे शॉटगन सिक्वेन्सिंग हा मानवाच्या किंवा इतर प्रजातींच्या व्हायरोमच्या अभ्यासात गती मिळवणारा एक नवीन दृष्टीकोन आहे [21, 37, 64].हा दृष्टीकोन विशेषतः दुहेरी अडकलेल्या DNA विषाणूंचा अभ्यास करण्यासाठी उपयुक्त आहे, कारण सर्व दुहेरी-असरलेल्या DNA विषाणूंमध्ये कोणतेही एक जनुक संरक्षित केलेले नाही, जे बाल्टिमोर [६५] मधील सर्वात वैविध्यपूर्ण आणि व्यापक वर्गाचे व्हायरसचे प्रतिनिधित्व करते.जरी यापैकी बहुतेक विषाणू अवर्गीकृत राहतात आणि त्यामध्ये विषाणू जगाच्या पूर्णपणे अज्ञात भागातील विषाणूंचा समावेश असू शकतो [६६], आम्हाला आढळले की ए. अट्रा आणि एम. प्लॅटेन्सिस या शिंपल्यांचे विषाणू आणि यजमान श्रेणी दोन प्रजातींमध्ये येतात.त्याचप्रमाणे (आकृती S3, अतिरिक्त माहिती पहा).ही समानता आश्चर्यकारक नाही, कारण ती वातावरणात उपस्थित असलेल्या डीएनएच्या शोषणात निवडकतेचा अभाव दर्शवू शकते.शुद्ध RNA वापरून भविष्यातील अभ्यास सध्या RNA virome चे वर्णन करण्यासाठी आवश्यक आहेत.
आमच्या अभ्यासात, आम्ही कोवार्स्की आणि सहकाऱ्यांच्या [३७] कामातून रुपांतरित केलेली अतिशय कठोर पाइपलाइन वापरली, ज्यांनी मूळ ccfDNA च्या असेंब्लीपूर्वी आणि नंतर पूल केलेले रीड्स आणि कॉन्टिग्सचे द्वि-चरण हटवण्याचा वापर केला, परिणामी मॅप न केलेल्या वाचनाचे उच्च प्रमाण होते.म्हणूनच, यापैकी काही न मॅप केलेल्या वाचनांचे अजूनही स्वतःचे मूळ असू शकते हे आम्ही नाकारू शकत नाही, मुख्यतः कारण आमच्याकडे या शिंपल्याच्या प्रजातींसाठी संदर्भ जीनोम नाही.आम्ही ही पाइपलाइन देखील वापरली कारण आम्हाला सेल्फ आणि नॉन-सेल्फ रीडमधील काइमरा आणि Illumina MiSeq PE75 द्वारे व्युत्पन्न केलेल्या रीड लांबीबद्दल चिंता होती.बहुसंख्य अपरिचित वाचनांचे आणखी एक कारण हे आहे की बहुतेक सागरी सूक्ष्मजंतू, विशेषत: केरगुलेनसारख्या दुर्गम भागात, भाष्य केलेले नाही.आम्ही मानवी ccfDNA प्रमाणेच ccfDNA खंडाची लांबी गृहीत धरून Illumina MiSeq PE75 वापरला.भविष्यातील अभ्यासांसाठी, हेमोलिम्फ ccfDNA ने मानव आणि/किंवा सस्तन प्राण्यांपेक्षा जास्त वाचन केले आहे हे दर्शविणारे आमचे परिणाम पाहता, आम्ही ccfDNA च्या लांब तुकड्यांसाठी अधिक योग्य अनुक्रमिक प्लॅटफॉर्म वापरण्याची शिफारस करतो.या सरावामुळे सखोल विश्लेषणासाठी अधिक संकेत ओळखणे अधिक सोपे होईल.सध्या अनुपलब्ध पूर्ण A. अट्रा न्यूक्लियर जीनोम सीक्वेन्स प्राप्त केल्याने ccfDNA मधील भेदभाव स्वयं आणि गैर-स्वयं स्रोतांपासून देखील मोठ्या प्रमाणात सुलभ होईल.आमच्या संशोधनात द्रव बायोप्सीची संकल्पना शिंपल्यांवर लागू करण्याच्या शक्यतेवर लक्ष केंद्रित केले आहे, आम्हाला आशा आहे की ही संकल्पना भविष्यातील संशोधनात वापरली जात असल्याने, शिंपल्यांच्या सूक्ष्मजीव विविधतेचा अभ्यास करण्यासाठी या पद्धतीची क्षमता वाढवण्यासाठी नवीन साधने आणि पाइपलाइन विकसित केली जातील.सागरी परिसंस्था.
नॉन-इनवेसिव्ह क्लिनिकल बायोमार्कर म्हणून, ccfDNA ची वाढलेली मानवी प्लाझ्मा पातळी विविध रोग, ऊतींचे नुकसान आणि तणाव परिस्थितीशी संबंधित आहे [67,68,69].ही वाढ ऊतींचे नुकसान झाल्यानंतर स्वतःच्या उत्पत्तीचे डीएनए तुकडे सोडण्याशी संबंधित आहे.आम्ही तीव्र उष्णतेचा ताण वापरून या समस्येचे निराकरण केले, ज्यामध्ये शिंपले 30 डिग्री सेल्सिअस तापमानात थोडक्यात उघड होते.आम्ही हे विश्लेषण तीन वेगवेगळ्या प्रकारच्या शिंपल्यांवर तीन स्वतंत्र प्रयोगांमध्ये केले.तथापि, तीव्र उष्णतेच्या ताणानंतर आम्हाला ccfDNA पातळीमध्ये कोणताही बदल आढळला नाही (आकृती S5, अतिरिक्त माहिती पहा).हा शोध, कमीत कमी अंशतः, हे स्पष्ट करू शकतो की शिंपल्यांमध्ये अर्ध-खुली रक्ताभिसरण प्रणाली असते आणि त्यांच्या उच्च फिल्टरिंग क्रियाकलापांमुळे मोठ्या प्रमाणात परदेशी डीएनए जमा होतो.दुसरीकडे, शिंपले, अनेक इनव्हर्टेब्रेट्सप्रमाणे, तणाव-प्रेरित ऊतींच्या नुकसानास अधिक प्रतिरोधक असू शकतात, ज्यामुळे त्यांच्या हेमोलिम्फ [70, 71] मध्ये ccfDNA च्या प्रकाशनास मर्यादित करते.
आजपर्यंत, जलीय परिसंस्थेतील जैवविविधतेचे DNA विश्लेषण प्रामुख्याने पर्यावरणीय DNA (eDNA) मेटाबारकोडिंगवर केंद्रित आहे.तथापि, जेव्हा प्राइमर्स वापरले जातात तेव्हा ही पद्धत सामान्यतः जैवविविधता विश्लेषणामध्ये मर्यादित असते.शॉटगन सिक्वेन्सिंगचा वापर पीसीआरच्या मर्यादा आणि प्राइमर सेट्सच्या पक्षपाती निवडीपासून बचाव करतो.अशाप्रकारे, एका अर्थाने, आमची पद्धत अलीकडे वापरलेल्या उच्च-थ्रूपुट ईडीएनए शॉटगन सिक्वेन्सिंग पद्धतीच्या जवळ आहे, जी थेट खंडित डीएनए अनुक्रमित करण्यास आणि जवळजवळ सर्व जीवांचे विश्लेषण करण्यास सक्षम आहे [७२, ७३].तथापि, LB ला मानक eDNA पद्धतींपासून वेगळे करणारे अनेक मूलभूत मुद्दे आहेत.अर्थात, eDNA आणि LB मधील मुख्य फरक म्हणजे नैसर्गिक फिल्टर होस्टचा वापर.eDNA चा अभ्यास करण्यासाठी नैसर्गिक फिल्टर म्हणून स्पंज आणि बिव्हॅल्व्ह (ड्रेसीना एसपीपी.) सारख्या समुद्री प्रजातींचा वापर नोंदवला गेला आहे [७४, ७५].तथापि, ड्रेसेनाच्या अभ्यासात टिश्यू बायोप्सीचा वापर केला गेला ज्यातून डीएनए काढला गेला.LB पासून ccfDNA चे विश्लेषण करण्यासाठी टिश्यू बायोप्सी, ईडीएनए किंवा टिश्यू बायोप्सीशी संबंधित विशेष आणि कधीकधी महाग उपकरणे आणि लॉजिस्टिक्सची आवश्यकता नसते.खरं तर, आम्ही अलीकडेच नोंदवले आहे की LB मधील ccfDNA कोल्ड चेन राखल्याशिवाय FTA समर्थनासह संग्रहित आणि विश्लेषण केले जाऊ शकते, जे दुर्गम भागातील संशोधनासाठी एक मोठे आव्हान आहे [76].द्रव बायोप्सीमधून ccfDNA काढणे देखील सोपे आहे आणि शॉटगन अनुक्रम आणि PCR विश्लेषणासाठी उच्च दर्जाचे DNA प्रदान करते.ईडीएनए विश्लेषण [७७] शी संबंधित काही तांत्रिक मर्यादा दिल्यास हा एक मोठा फायदा आहे.सॅम्पलिंग पद्धतीची साधेपणा आणि कमी किंमत देखील दीर्घकालीन देखरेख कार्यक्रमांसाठी विशेषतः योग्य आहे.त्यांच्या उच्च फिल्टरिंग क्षमतेव्यतिरिक्त, बायव्हल्व्हचे आणखी एक सुप्रसिद्ध वैशिष्ट्य म्हणजे त्यांच्या श्लेष्माची रासायनिक म्यूकोपोलिसेकेराइड रचना, जी विषाणूंचे शोषण करण्यास प्रोत्साहन देते [७८, ७९].हे bivalves जैवविविधता आणि दिलेल्या जलीय परिसंस्थेतील हवामान बदलाचा प्रभाव दर्शवण्यासाठी एक आदर्श नैसर्गिक फिल्टर बनवते.यजमान-व्युत्पन्न DNA तुकड्यांची उपस्थिती eDNA च्या तुलनेत पद्धतीची मर्यादा म्हणून पाहिली जात असली तरी, eDNA च्या तुलनेत असे मूळ ccfDNA असण्याशी संबंधित खर्च आरोग्य अभ्यासासाठी उपलब्ध असलेल्या मोठ्या प्रमाणात माहितीसाठी एकाच वेळी समजण्यासारखा आहे.ऑफसेट होस्ट.यामध्ये होस्ट होस्टच्या जीनोममध्ये एकत्रित केलेल्या व्हायरल अनुक्रमांची उपस्थिती समाविष्ट आहे.शिंपल्यांसाठी हे विशेषतः महत्वाचे आहे, बायव्हल्व्ह [80, 81] मध्ये क्षैतिजरित्या प्रसारित ल्यूकेमिक रेट्रोव्हायरसची उपस्थिती लक्षात घेता.ईडीएनएपेक्षा एलबीचा आणखी एक फायदा म्हणजे हेमोलिम्फमधील रक्तपेशींचे परिसंचरण करणार्‍या फॅगोसाइटिक क्रियाकलापांचे ते शोषण करते, जे सूक्ष्मजीव (आणि त्यांचे जीनोम) व्यापतात.फागोसाइटोसिस हे बायव्हल्व्ह [८२] मधील रक्त पेशींचे मुख्य कार्य आहे.शेवटी, ही पद्धत शिंपल्यांच्या उच्च फिल्टरिंग क्षमतेचा (सरासरी 1.5 l/h समुद्राचे पाणी) आणि दोन दिवसांच्या अभिसरणाचा फायदा घेते, ज्यामुळे समुद्राच्या पाण्याच्या विविध स्तरांचे मिश्रण वाढते, ज्यामुळे विषम ईडीएनए कॅप्चर करता येतो.[८३, ८४].अशाप्रकारे, शिंपल्यांचे पोषण, आर्थिक आणि पर्यावरणीय परिणाम लक्षात घेता शिंपले ccfDNA विश्लेषण हा एक मनोरंजक मार्ग आहे.मानवाकडून गोळा केलेल्या एलबीच्या विश्लेषणाप्रमाणेच, ही पद्धत बाह्य पदार्थांच्या प्रतिसादात होस्ट डीएनएमध्ये अनुवांशिक आणि एपिजेनेटिक बदल मोजण्याची शक्यता देखील उघडते.उदाहरणार्थ, नॅनोपोर सिक्वेन्सिंगचा वापर करून नेटिव्ह ccfDNA मध्ये जीनोम-व्यापी मेथिलेशन विश्लेषण करण्यासाठी थर्ड-जनरेशन सिक्वेन्सिंग तंत्रज्ञानाची कल्पना केली जाऊ शकते.या प्रक्रियेस या प्रक्रियेस सुलभ केले पाहिजे की शिंपल सीसीएफडीएनए तुकड्यांची लांबी दीर्घ-वाचन अनुक्रमित प्लॅटफॉर्मशी आदर्शपणे सुसंगत आहे जी जीनोम-वाइड डीएनए मेथिलेशन विश्लेषणास एकाच अनुक्रमांमधून रासायनिक परिवर्तनाची आवश्यकता न घेता चालते.म्हणूनच, हवामान बदल किंवा प्रदूषकांच्या संपर्कात आल्यानंतर प्रतिसाद नियंत्रित करणार्‍या अंतर्निहित यंत्रणेची मौल्यवान अंतर्दृष्टी प्रदान करू शकते [८७].तथापि, एलबीचा वापर मर्यादांशिवाय नाही.हे सांगण्याची गरज नाही, यासाठी परिसंस्थेमध्ये सूचक प्रजातींची उपस्थिती आवश्यक आहे.वर नमूद केल्याप्रमाणे, दिलेल्या इकोसिस्टमच्या जैवविविधतेचे मूल्यांकन करण्यासाठी LB वापरण्यासाठी देखील एक कठोर बायोइन्फॉरमॅटिक्स पाइपलाइन आवश्यक आहे जी स्त्रोतापासून DNA तुकड्यांची उपस्थिती लक्षात घेते.दुसरी मोठी समस्या म्हणजे सागरी प्रजातींसाठी संदर्भ जीनोमची उपलब्धता.अशी आशा आहे की सागरी सस्तन जीनोम प्रकल्प आणि अलीकडेच स्थापित केलेला Fish10k प्रकल्प [८८] यांसारखे उपक्रम भविष्यात असे विश्लेषण सुलभ करतील.सागरी फिल्टर-फीडिंग जीवांवर LB संकल्पना लागू करणे देखील अनुक्रम तंत्रज्ञानातील नवीनतम प्रगतीशी सुसंगत आहे, ज्यामुळे पर्यावरणीय तणावाच्या प्रतिसादात सागरी अधिवासांच्या आरोग्याविषयी महत्त्वपूर्ण माहिती प्रदान करण्यासाठी मल्टी-ओम बायोमार्कर्सच्या विकासासाठी ते योग्य आहे.
बायोप्रोजेक्ट्स SRR8924808 अंतर्गत NCBI अनुक्रम रीड आर्काइव्ह https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 मध्ये जीनोम सिक्वेन्सिंग डेटा जमा केला गेला आहे.
ब्रियरले एएस, किंग्सफोर्ड एमजे इम्पॅक्ट ऑफ क्लायमेट चेंज ऑन मरीन लाईफ अँड इकोसिस्टम्स.कोल जीवशास्त्र.2009;१९: P602–P614.
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Almpanidou V, Bevilacqua S, et al.हवामान बदल आणि सागरी पर्यावरणावरील इतर स्थानिक ताणतणावांचे एकत्रित परिणाम विचारात घ्या.सामान्य वैज्ञानिक वातावरण.2021;755:142564.
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P, et al.).पहिल्या मार्चचे विज्ञान.2020; 7:48.
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. पुनरावृत्ती होणाऱ्या उष्णतेच्या तणावाच्या परिस्थितीत कमी झालेली उष्णता सहनशीलता निळ्या शिंपल्यांच्या उच्च उन्हाळ्यातील मृत्यूचे स्पष्टीकरण देते.वैज्ञानिक अहवाल 2019;९:१७४९८.
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER, et al.प्राण्यांच्या मृत्यूची वारंवारता, कारणे आणि प्रमाणात अलीकडील बदल.Proc Natl Acad Sci USA.2015;112:1083-8.
स्कार्पा एफ, सन्ना डी, अझेना I, मुगेट्टी डी, सेरुती एफ, होसेनी एस, एट अल.बहुविध गैर-प्रजाती-विशिष्ट रोगजनकांमुळे पिना नोबिलिसचा सामूहिक मृत्यू झाला असावा.जीवन.2020; 10:238.
ब्रॅडली एम, कौट्स एसजे, जेनकिन्स ई, ओ'हारा टीएम.आर्क्टिक झुनोटिक रोगांवर हवामान बदलाचा संभाव्य प्रभाव.इंट जे सर्कम्पोलर हेल्थ.2005;६४:४६८–७७.
Beyer J., Greene NW, Brooks S., Allan IJ, Ruus A., Gomez T. et al.कोस्टल पोल्युशन मॉनिटरिंगमध्ये सिग्नल ऑर्गेनिझम म्हणून ब्लू शिंपले (मायटीलस एड्युलिस एसपीपी.: एक पुनरावलोकन.Mar Environ Res 2017;130:338-65.
सिरवेग्ना जी, मार्सोनी एस, सिएना एस, बार्डेली ए. कॅन्सर उपचारात लिक्विड बायोप्सीचे एकत्रीकरण.नॅट रेव्ह क्लीन ऑन्कोल.2017;१४:५३१–४८.
वॅन जेसीएम, मॅसी सी, गार्सिया-कोर्बचो जे, मौलीरे एफ, ब्रेंटन जेडी, कॅल्डास सी, इ.लिक्विड बायोप्सी परिपक्वता: ट्यूमर डीएनए प्रसारित करण्यास अनुमती देते.नॅट रेव कर्करोग.2017;17:223–38.
मँडल पी., मेटाइस पी. मानवी प्लाझ्मामधील न्यूक्लिक अॅसिड.Soc Biol उपकंपन्यांचे मीटिंग मिनिटे.1948;१४२:२४१-३.
ब्रॉन्कोर्स्ट एजे, उंगेरर डब्ल्यू, होल्डनरीडर एस. कर्करोगाच्या उपचारासाठी आण्विक मार्कर म्हणून सेल-फ्री डीएनएसाठी एक नवीन भूमिका.बायोमोलर विश्लेषणाचे प्रमाणीकरण.2019;17:100087.
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS लिक्विड बायोप्सी क्लिनिकमध्ये प्रवेश करते - अंमलबजावणी समस्या आणि भविष्यातील आव्हाने.नॅट रेव्ह क्लिन ऑन्कोल.2021;१८:२९७–३१२.
Lo YM, Corbetta N., Chamberlain PF, Rai W., Sargent IL, Redman CW आणि इतर.गर्भाचा डीएनए मातृ प्लाझ्मा आणि सीरममध्ये असतो.लॅन्सेट.1997;३५०:४८५-७.
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR गर्भधारणेदरम्यान स्त्रियांच्या रक्तातील रक्ताभिसरण बाह्य RNA वापरून गर्भधारणेचा अभ्यासक्रम आणि त्याच्या गुंतागुंतीचा अभ्यास.डोपेडियाट्रिक्स.2020;8:605219.
ओलेरिच एम, शेरवुड के, केओन पी, शुट्झ ई, बेक जे, स्टेगबॉअर जे, एट अल.लिक्विड बायोप्सी: दाता सेल-फ्री डीएनएचा वापर किडनी ग्राफ्टमध्ये अॅलोजेनिक जखम शोधण्यासाठी केला जातो.नॅट रेव्ह नेफ्रोल.2021;१७:५९१–६०३.
जुआन एफसी, लो वायएम इनोव्हेशन्स इन प्रीनेटल डायग्नोस्टिक्स: मॅटरनल प्लाझ्मा जीनोम सिक्वेन्सिंग.अण्णा एमडी.2016;67:419-32.
Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D, et al.संक्रमित शारीरिक द्रव्यांच्या पुढील पिढीच्या मेटाजेनोमिक अनुक्रमासह जलद रोगजनक शोध.नॅट औषध.2021;27:115-24.