Nature.com ला भेट दिल्याबद्दल धन्यवाद. तुम्ही वापरत असलेल्या ब्राउझर आवृत्तीला CSS साठी मर्यादित समर्थन आहे. सर्वोत्तम अनुभवासाठी, आम्ही शिफारस करतो की तुम्ही अपडेटेड ब्राउझर वापरा (किंवा Internet Explorer मधील सुसंगतता मोड बंद करा). दरम्यान, सतत समर्थन सुनिश्चित करण्यासाठी, आम्ही शैली आणि JavaScript शिवाय साइट प्रदर्शित करू.
सच्छिद्र सिलिका कण मॅक्रोपोरस कण मिळविण्यासाठी काही बदलांसह सोल-जेल पद्धतीने तयार केले गेले. हे कण एन-फेनिलमॅलेइमाइड-मेथिलविनाइलिसोसायनेट (पीएमआय) आणि एन-फेनिलमॅलीमाइड-फेज एन-एमपी-एन-एमपी-एन-एमपी-एन-फेज-स्टेशन तयार करण्यासाठी स्टायरीनसह रिव्हर्सिबल अॅडिशन फ्रॅगमेंटेशन चेन ट्रान्सफर (RAFT) पॉलिमरायझेशनद्वारे व्युत्पन्न केले गेले. पुन्हा स्टेनलेस स्टीलचे स्तंभ (100 × 1.8 मिमी id) स्लरी पॅकिंगद्वारे पॅक केले गेले. पाच पेप्टाइड्स (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, en-Gly-Gly-Tyr-Arg, en-Gly-Gly-Tyr-Arg, en-Gly-Gly-Tyr-Arg) पेप्टाइड मिश्रणाचे मूल्यमापन केलेले PMP स्तंभ वेगळे करणे. ic कार्यप्रदर्शन) आणि मानवी सीरम अल्ब्युमिन (HAS) चे ट्रिप्सिन पचन. इष्टतम उत्सर्जन परिस्थितीत, पेप्टाइड मिश्रणाची सैद्धांतिक प्लेट संख्या 280,000 प्लेट्स/m² इतकी आहे. विकसित स्तंभाच्या पृथक्करण कामगिरीची व्यावसायिक Ascentis Express RP-Amide स्तंभाशी तुलना करताना, PMP-अमाइड कॉलमच्या व्यावसायिक स्तंभातील कामगिरीचे निरीक्षण केले गेले. पृथक्करण कार्यक्षमता आणि निराकरणाच्या अटी.
अलिकडच्या वर्षांत, बायोफार्मास्युटिकल उद्योग बाजारपेठेत भरीव वाढीसह एक विस्तारणारी जागतिक बाजारपेठ बनली आहे. बायोफार्मास्युटिकल उद्योगाच्या 1,2,3 च्या स्फोटक वाढीसह, पेप्टाइड्स आणि प्रथिनांचे विश्लेषण करणे अत्यंत आवश्यक आहे. लक्ष्य पेप्टाइड व्यतिरिक्त, पेप्टाइड्सच्या संश्लेषणाच्या दरम्यान अनेक अशुद्धता निर्माण होतात. इच्छित शुद्धतेचे. शरीरातील द्रव, उती आणि पेशींमधील प्रथिनांचे विश्लेषण आणि वैशिष्ट्यीकरण हे एक अत्यंत आव्हानात्मक काम आहे कारण एकाच नमुन्यात मोठ्या संख्येने संभाव्य शोधण्यायोग्य प्रजाती आहेत. जरी मास स्पेक्ट्रोमेट्री हे पेप्टाइड आणि प्रोटीन सिक्वेन्सिंगसाठी एक प्रभावी साधन आहे, जर असे नमुने एका मासमीटरमध्ये इंजेक्ट केले गेले तर ही वस्तुमान तपासणी लागू केली जाऊ शकत नाही. एमएस विश्लेषणापूर्वी लिक्विड क्रोमॅटोग्राफी (एलसी) पृथक्करण करणे, जे दिलेल्या वेळी मास स्पेक्ट्रोमीटरमध्ये प्रवेश करणार्‍या विश्लेषकांची संख्या कमी करेल 4,5,6. शिवाय, लिक्विड फेज पृथक्करणादरम्यान, विश्लेषक अरुंद प्रदेशात केंद्रित केले जाऊ शकतात, ज्यामुळे या विश्लेषकांवर लक्ष केंद्रित केले जाऊ शकते आणि एलसीएमएस तपासण्यामध्ये लक्षणीय सुधारणा होते. गेल्या दशकात आणि प्रोटीओमिक विश्लेषण7,8,9,10 मध्ये एक लोकप्रिय तंत्र बनले आहे.
रिव्हर्स्ड-फेज लिक्विड क्रोमॅटोग्राफी (RP-LC) चा वापर ऑक्टाडेसिल-मॉडिफाइड सिलिका (ODS) चा वापर करून पेप्टाइड मिश्रणांचे शुद्धीकरण आणि पृथक्करण करण्यासाठी स्थिर फेज 11,12,13 म्हणून मोठ्या प्रमाणावर केला जातो. तथापि, RP स्थिर टप्पे समाधानकारक पृथक्करण प्रदान करत नाहीत. या विश्लेषकांशी संवाद साधण्यासाठी आणि टिकवून ठेवण्यासाठी ध्रुवीय आणि नॉन-ध्रुवीय भागांसह पेप्टाइड्स आणि प्रथिनांचे विश्लेषण करण्यासाठी विशेष डिझाइन केलेले स्थिर टप्पे आवश्यक आहेत16. मिक्स्ड-मोड क्रोमॅटोग्राफी, जी मल्टीमोडल परस्परसंवाद प्रदान करते, पेप्टाइड्स, प्रथिने, आणि इतर मिश्रित फेज, आणि इतर मिश्रित फेज तयार केले गेले आहेत. या टप्प्यांसह पॅक केलेले पेप्टाइड आणि प्रथिने पृथक्करणासाठी वापरले गेले आहेत17,18,19,20,21. मिश्रित-मोड स्थिर टप्पे (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, ध्रुवीय इंटरकॅलेशन/RPLC) दोन्ही ध्रुवीय आणि नॉन-ध्रुवीय गटांच्या उपस्थितीमुळे पेप्टाइड आणि प्रथिने वेगळे करण्यासाठी योग्य आहेत. सहसंयोजक बंधित ध्रुवीय गटांसह स्थिर टप्पे कॅलेटिंग ध्रुवीय आणि नॉन-ध्रुवीय विश्लेषकांसाठी चांगली पृथक्करण शक्ती आणि अद्वितीय निवडकता दर्शवतात, कारण विभक्त होणे विश्लेषक आणि स्थिर टप्प्यातील परस्परसंवादावर अवलंबून असते.मल्टिमोडल परस्परसंवाद 29, 30, 31, 32. अलीकडे, झांग आणि इतर.30 ने डोडेसिल-टर्मिनेटेड पॉलीमाइन स्थिर टप्पा तयार केला आणि हायड्रोकार्बन्स, एन्टीडिप्रेसस, फ्लेव्होनॉइड्स, न्यूक्लियोसाइड्स, एस्ट्रोजेन्स आणि इतर अनेक विश्लेषक यशस्वीरित्या वेगळे केले. ध्रुवीय इंटरकॅलेटरमध्ये ध्रुवीय आणि नॉन-ध्रुवीय दोन्ही गट आहेत, म्हणून ते पेप्टाइड्स आणि प्रोटीन वेगळे करण्यासाठी वापरले जाऊ शकतात ज्यात mohydrocarbons, hydrocarbons, hydrocarbons, cohydrophis, आणि इतर दोन्ही गट आहेत. उदा., amide-एम्बेडेड C18 स्तंभ) व्यावसायिकरित्या Ascentis Express RP-Amide स्तंभ या व्यापारिक नावाखाली उपलब्ध आहेत, परंतु हे स्तंभ फक्त amine 33 च्या विश्लेषणासाठी वापरले जातात.
सध्याच्या अभ्यासात, HSA च्या पेप्टाइड्स आणि ट्रिप्सिन डायजेस्टच्या पृथक्करणासाठी एक ध्रुवीय-एम्बेडेड स्थिर टप्पा (N-phenylmaleimide-एम्बेडेड पॉलिस्टीरिन) तयार केला गेला आणि त्याचे मूल्यांकन केले गेले. स्थिर टप्पा खालील रणनीती वापरून तयार केला गेला. सच्छिद्र सिलिका कण आमच्या मागील प्रकाशनात दिलेल्या प्रक्रियेनुसार तयार केले गेले. (PEG), TMOS, पाण्यातील ऍसिटिक ऍसिड मोठ्या छिद्राच्या आकारासह सिलिका कण तयार करण्यासाठी समायोजित केले गेले. दुसरे, नवीन लिगँड, फिनाइलमॅलेइमाइड-मिथाइल विनाइल आयसोसायनेट, संश्लेषित केले गेले आणि ध्रुवीय एम्बेडेड स्थिर फेज तयार करण्यासाठी सिलिका कणांचे व्युत्पन्न करण्यासाठी वापरले गेले. परिणामी स्थिर फेज 1 मिमी 0 × 1 मिमी 0 पॅक रहित केले गेले. ऑप्टिमाइझ पॅकिंग योजना. स्तंभाच्या आत एकसंध पलंग तयार झाला आहे याची खात्री करण्यासाठी स्तंभ पॅकिंगला यांत्रिक कंपनाने मदत केली जाते. पाच पेप्टाइड्स असलेल्या पेप्टाइड मिश्रणाच्या पॅक केलेल्या स्तंभाच्या पृथक्करणाचे मूल्यांकन करा;(Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) आणि ट्रिप्सिन डायजेस्ट ऑफ ह्युमन सीरम अल्ब्युमिन (HAS). पेप्टाइड मिश्रण आणि HSA चे ट्रिप्सिन डायजेस्ट चांगले रिझोल्यूशनसह वेगळे असल्याचे आढळून आले. पीआरपीसेंटच्या कार्यक्षमतेच्या तुलनेत सह-एमपीच्या कार्यक्षमतेची तुलना केली गेली. -अमाइड स्तंभ. दोन्ही पेप्टाइड्स आणि प्रथिने पीएमपी स्तंभावर चांगले निराकरण आणि कार्यक्षम असल्याचे दिसून आले, जे एसेंटिस एक्सप्रेस RP-अमाइड स्तंभापेक्षा अधिक कार्यक्षम होते.
पीईजी (पॉलिथिलीन ग्लायकॉल), यूरिया, एसिटिक ऍसिड, ट्रायमेथॉक्सी ऑर्थोसिलिकेट (टीएमओएस), ट्रायमिथाइल क्लोरोसिलेन (टीएमसीएस), ट्रायप्सिन, ह्यूमन सीरम अल्ब्युमिन (एचएसए), अमोनियम क्लोराईड, यूरिया, हेक्सेन मेथाइलडिसिलाझेन (एचएमडीएस), मेथॅक्रिलॉयल क्लोराईड, बेनएक्रॉयल क्लोराईड, पेरीओक्लॉइड, एमसीपीओ-एमसीओ-एमपीओ-एमसीओसी (BPO), HPLC ग्रेड एसीटोनिट्रिल (ACN), मिथेनॉल, 2-प्रोपॅनॉल आणि एसीटोन सिग्मा-अल्ड्रिच (सेंट लुईस, एमओ, यूएसए) कडून खरेदी केले गेले.
युरिया (8 ग्रॅम), पॉलीथिलीन ग्लायकोल (8 ग्रॅम), आणि 0.01 एन एसिटिक ऍसिडचे 8 एमएल मिश्रण 10 मिनिटे ढवळण्यात आले आणि नंतर बर्फ-थंड परिस्थितीत त्यात 24 मिली टीएमओएस जोडले गेले. प्रतिक्रिया मिश्रण 40 डिग्री सेल्सिअस तापमानात 6 तासांसाठी गरम केले गेले आणि नंतर 120 डिग्री सेल्सिअस पाण्यात 120 डिग्री सेल्सिअस पाण्यात 120 डिग्री सेल्सिअस बंद केले गेले. अवशिष्ट सामग्री 70°C वर 12 तासांसाठी वाळवली गेली. वाळलेल्या मऊ वस्तुमान ओव्हनमध्ये गुळगुळीत जमिनीवर होते आणि 12 तासांसाठी 550°C वर कॅलक्लाइंड केले होते. कण आकार, छिद्र आकार आणि पृष्ठभागाच्या क्षेत्रामध्ये पुनरुत्पादनक्षमता तपासण्यासाठी तीन बॅच तयार आणि वैशिष्ट्यीकृत केले गेले.
सिलिका कणांच्या पृष्ठभागावर पूर्व-संश्लेषित लिगँड फेनिलमॅलेइमाइड-मेथिलव्हिनिलिसोसायनेट (पीसीएमपी) आणि स्टायरीनसह रेडियल पॉलिमरायझेशन करून, एक ध्रुवीय समूह-युक्त कंपाऊंड तयार केले गेले.एकूण आणि पॉलीस्टीरिन चेनसाठी स्थिर टप्पा. तयारी प्रक्रियेचे खाली वर्णन केले आहे.
N-phenylmaleimide (200 mg) आणि मिथाइल विनाइल आयसोसायनेट (100 mg) कोरड्या टोल्यूनिमध्ये विरघळले गेले आणि 2,2′-azoisobutyronitrile (AIBN) चे 0.1 mL फेनिलमॅलेइमाइड-मिथाइल एमआयसीपीएट-मिथाइल एमआयसीपीव्हीन हीटमॅलेमाइड तयार करण्यासाठी प्रतिक्रिया फ्लास्कमध्ये जोडले गेले. 0°C 3 तासांसाठी, फिल्टर करून 40°C वर ओव्हनमध्ये 3 तासांसाठी वाळवा.
वाळलेले सिलिका कण (2 ग्रॅम) कोरड्या टोल्यूनि (100 एमएल) मध्ये विखुरले गेले, 10 मिनिटांसाठी 500 एमएल गोल तळाच्या फ्लास्कमध्ये ढवळले आणि सॉनिक केले गेले. पीएमसीपी (10 मिग्रॅ) टोल्यूइनमध्ये विरघळले गेले आणि ड्रॉपिंग फनेलद्वारे प्रतिक्रिया फ्लास्कमध्ये ड्रॉपवाइज जोडले गेले. मिश्रण 80 डिग्री सेल्सिअस तापमानात 80 डिग्री सेल्सिअस तापमानात मिसळले गेले. एसीटोन आणि 60°C वर 3 तास वाळवले. त्यानंतर, PMCP-बंधित सिलिका कण (100 ग्रॅम) टोल्युइन (200 ml) मध्ये विरघळले गेले आणि 4-hydroxy-TEMPO (2 mL) 100 µL dibutyltin dilaurate च्या उपस्थितीत जोडले गेले, 5 °C 5 °C तापमानात कॅटरल फिल केले गेले. 50 डिग्री सेल्सिअस तापमानात 3 तास वाळवा.
स्टायरीन (1 एमएल), बेंझॉयल पेरोक्साईड बीपीओ (0.5 एमएल), आणि टेम्पो-पीएमसीपी-संलग्न सिलिका कण (1.5 ग्रॅम) टोल्युइनमध्ये विखुरले गेले आणि नायट्रोजनने शुद्ध केले गेले. स्टायरीनचे पॉलिमरायझेशन 100 डिग्री सेल्सिअस तापमानात 12 तासांसाठी केले गेले. परिणामी रात्रीच्या वेळी 6 डिग्री सेल्सिअस पेक्षा जास्त उत्पादनाची प्रतिक्रिया झाली. आकृती 1 मध्ये दाखवले आहे.
10-3 Torr पेक्षा कमी अवशिष्ट दाब मिळविण्यासाठी नमुने 1 तासासाठी 393 K वर डिगॅस केले गेले. P/P0 = 0.99 च्या सापेक्ष दाबाने शोषलेल्या N2 चे प्रमाण एकूण छिद्रांचे प्रमाण निश्चित करण्यासाठी वापरले गेले. बेअर आणि लिगॅंड-बॉन्डेड सिलिका कणांचे आकारविज्ञान, इलेक्ट्रोकोपी, हायस्कूल, इलेक्ट्रोचिकित्सा, हायस्कूल, टॅब्लेटसह तपासले गेले. जपान). सुके नमुने (बेअर सिलिका आणि लिगँड-बॉन्डेड सिलिका कण) अॅल्युमिनियमच्या स्तंभावर चिकट कार्बन टेप वापरून ठेवले होते. Q150T स्पटर कोटर वापरून नमुन्यांवर सोन्याचा मुलामा देण्यात आला होता आणि नमुन्यांवर 5 nm Au लेयर जमा करण्यात आला होता. यामुळे प्रक्रिया सुधारते, थंड व्होल्टेग्राफिकता कमी होते आणि प्रक्रिया सुधारते. ron (Waltham, MA, USA) Flash EA1112 एलिमेंटल अॅनालायझरचा वापर एलिमेंटल अॅनालिसिससाठी करण्यात आला. ए माल्व्हर्न (वोर्सेस्टरशायर, यूके) मास्टरसायझर 2000 पार्टिकल साइज अॅनालायझरचा वापर कणांच्या आकाराचे वितरण मिळवण्यासाठी करण्यात आला. नग्न सिलिका कण आणि m5 सिलिका कणांचे (m5) भाग होते. isopropanol, 10 मिनिटांसाठी sonicated, 5 मिनिटांसाठी vortexed, आणि Mastersizer च्या ऑप्टिकल बेंचवर ठेवले. थर्मोग्राव्हिमेट्रिक विश्लेषण 30 ते 800 °C तापमान श्रेणीवर 5 °C प्रति मिनिट दराने केले गेले.
रेफमध्ये वापरलेली समान प्रक्रिया लागू करून, स्लरी पॅकिंग पद्धतीचा वापर करून काचेच्या रेषेतील स्टेनलेस स्टीलचे अरुंद-बोअर स्तंभ (100 × 1.8 मिमी आयडी) पॅक केले गेले.1 µm फ्रिट असलेल्या आउटलेट फिटिंगसह 31.एक स्टेनलेस स्टीलचा स्तंभ (ग्लास-लाइन केलेला, 100 × 1.8 मिमी आयडी) स्लरी पॅकरशी जोडलेला होता (ऑलटेक डीअरफील्ड, IL, USA). एक स्थिर फेज स्लरी तयार करा आणि स्टेशनरी फेज स्लरी 150 मीटर पेक्षा 150 मीटर फेज स्टोरेजमध्ये पाठवा. .मिथेनॉलचा वापर स्लरी सॉल्व्हेंट तसेच प्रोपेलिंग सॉल्व्हेंट म्हणून केला गेला. 10 मिनिटांसाठी 100 MP, 15 मिनिटांसाठी 80 MP आणि 30 मिनिटांसाठी 60 MP चा दाब देऊन क्रमाने स्तंभ भरा. पॅकिंग दरम्यान, यांत्रिक कंपन दोन GC फील्ड कॉलम, यूएसएआयएल कॉलम, डॅकर, ड्युके, ड्युटी, ड्युटी, ड्युटी, ड्युटी, वॉल्यूम, ड्युटी, वॉशिंग, वॉशिंग, वॉल्यूम, यूएसएआयएल, शेल्फ, हे सुनिश्चित करण्यासाठी वापरण्यात आले. स्तंभ. स्लरी पॅकर बंद करा आणि स्तंभातील कोणतेही नुकसान टाळण्यासाठी हळू हळू दाब सोडा. स्लरी पॅकिंग युनिटमधून स्तंभ डिस्कनेक्ट करा आणि त्याची कार्यक्षमता तपासण्यासाठी इनलेट आणि एलसी सिस्टमशी दुसरे फिटिंग कनेक्ट करा.
50nL इंजेक्शन लूपसह LC पंप (10AD Shimadzu, जपान), इंजेक्टर (Valco (USA) C14 W.05), झिल्ली डिगासर (Shimadzu DGU-14A), UV-VIS केशिका खिडकी तयार करण्यात आली आहे विशेष µLC उपकरण शोधक (UV-2075 मायक्रोकॉल्स आणि मायक्रोकॉल्सना जोडणारा) अतिरिक्त कॉलम बँड ब्रॉडनिंगचा प्रभाव कमी करा. पॅकेजिंगनंतर, केशिका (50 μm आयडी 365 आणि रिड्यूसिंग युनियन केशिका (50 μm) रिड्यूसिंग युनियनच्या 1/16″ आउटलेटवर स्थापित केल्या गेल्या. डेटा संकलन आणि क्रोमॅटोग्राफिक प्रक्रिया Multichro 200m 200 200 एबी 204 सॉफ्टवेअर वापरून केली गेली. bance. क्रोमॅटोग्राफिक डेटाचे OriginPro8 (Northampton, MA) द्वारे विश्लेषण केले गेले.
मानवी रक्तातील अल्ब्युमिन, लिओफिलाइज्ड पावडर, ≥ 96% (अॅगरोज जेल इलेक्ट्रोफोरेसीस) 3 मिलीग्राम ट्रिप्सिन (1.5 मिलीग्राम), 4.0 एम युरिया (1 एमएल), आणि 0.2 एम अमोनियम बायकार्बोनेट (1 एमएल) मिसळून. हे द्रावण 10 मिनिटे ढवळले गेले आणि नंतर 3 मीटर 1 लिटर पाण्यात 3 डिग्री सेल्सिअस तापमानात ठेवा. 0.1% TFA. द्रावण फिल्टर करा आणि 4 °C खाली साठवा.
पेप्टाइड मिश्रण आणि HSA ट्रिप्सिन डायजेस्टचे पृथक्करण PMP स्तंभांवर स्वतंत्रपणे मूल्यमापन केले गेले. PMP स्तंभाद्वारे HSA चे पेप्टाइड मिश्रण आणि ट्रिप्सिन डायजेस्टचे पृथक्करण तपासा आणि परिणामांची तुलना Ascentis Express RP-Amide स्तंभाशी करा. सैद्धांतिक प्लेट क्रमांक खालीलप्रमाणे आहे:
बेअर सिलिका कण आणि लिगँड-बॉन्डेड सिलिका कणांच्या SEM प्रतिमा अंजीर मध्ये दर्शविल्या आहेत.2 .बेअर सिलिका कणांच्या SEM प्रतिमा (A, B) दाखवतात की, आमच्या मागील अभ्यासाच्या विरूद्ध, हे कण गोलाकार आहेत ज्यामध्ये कण लांबलचक आहेत किंवा अनियमित सममिती आहेत. लिगँड-बॉन्डेड सिलिका कणांची पृष्ठभाग (C, D) सिलिका कणांपेक्षा गुळगुळीत आहे, ज्याच्या पृष्ठभागावर बेअर सिलिकाच्या पॉलिस्टीकच्या सिलिका कणांमुळे सिलिकाच्या पृष्ठभागावर सिलिका निर्माण होऊ शकते. ica कण.
बेअर सिलिका कण (A, B) आणि ligand-bonded सिलिका कण (C, D) च्या इलेक्ट्रॉन मायक्रोस्कोप प्रतिमा स्कॅन करणे.
बेअर सिलिका कण आणि लिगॅंड-बॉन्डेड सिलिका कणांचे कण आकाराचे वितरण आकृती 3(A) मध्ये दर्शविले आहे. खंड-आधारित कण आकार वितरण वक्र असे दर्शविते की रासायनिक बदलानंतर सिलिका कणांचा आकार वाढला आहे (चित्र 3A). कण आकार वितरण डेटा सिलिका कण (आगीच्या अभ्यासातील सिलिका कण आणि T1 कणांमधील वर्तमान अभ्यासाच्या आकारमान वितरण डेटा) आहेत. पीएमपीचा le आकार, d(0.5), 3.05 μm (पॉलीस्टीरिन-बाउंड सिलिका कण) च्या जाहिरात(0.5) मूल्यासह आमच्या मागील अभ्यासाच्या तुलनेत 3.36 μm आहे. 34. या बॅचमध्ये आमच्या मागील अभ्यासाच्या तुलनेत कणांच्या आकाराचे वितरण कमी होते कारण PEG आणि miure ऍसिडचे PEG आणि ऍसिडचे अंश, ऍसिडचे प्रमाण भिन्न होते. MP फेज हा आम्ही पूर्वी अभ्यास केलेल्या पॉलिस्टीरिन-बाउंड सिलिका कण टप्प्यापेक्षा थोडा मोठा आहे. याचा अर्थ स्टायरीनसह सिलिका कणांच्या पृष्ठभागाच्या कार्यक्षमतेमुळे सिलिका पृष्ठभागावर फक्त पॉलिस्टीरिन थर (0.97 µm) जमा झाला, तर PMP टप्प्यात थराची जाडी 1.38 µm होती.
बेअर सिलिका कण आणि लिगँड-बाउंड सिलिका कणांचे कण आकार वितरण (A) आणि छिद्र आकार वितरण (B).
सध्याच्या अभ्यासातील सिलिका कणांचे छिद्र आकार, छिद्राचे प्रमाण आणि पृष्ठभागाचे क्षेत्रफळ तक्ता 1(B) मध्ये दिले आहे. बेअर सिलिका कण आणि लिगॅंड-बॉन्डेड सिलिका कणांचे PSD प्रोफाइल आकृती 3(B) मध्ये दर्शविले आहेत. परिणाम आमच्या मागील अभ्यासाशी तुलना करता येतील. बेअर आणि लिगँड-बाउंडेड सिलिका कणांचे छिद्र आकार दर्शवतात, जे सिलिका आणि सिलिका बंधित आहेत, 410, 340 अंश आहेत. तक्ता 1(B) मध्ये दाखवल्याप्रमाणे रासायनिक फेरफार केल्यानंतर re आकार 69 ने कमी होतो आणि वक्र बदल अंजीर 3(B) मध्ये दर्शविला आहे.तसेच, रासायनिक बदलानंतर सिलिका कणांचे छिद्राचे प्रमाण 0.67 वरून 0.58 cm3/g पर्यंत कमी झाले आहे. सिलिकाचे विशिष्ट पृष्ठभागाचे क्षेत्रफळ जे सध्या अभ्यास करण्यायोग्य आहे (1 m1/g 1 m1/g) पूर्वीचे अभ्यासले आहे. 24 m2/g). तक्ता 1(B) मध्ये दाखवल्याप्रमाणे, सिलिका कणांचे पृष्ठभागाचे क्षेत्रफळ (m2/g) रासायनिक बदलानंतर 116 m2/g वरून 105 m2/g पर्यंत कमी झाले.
स्थिर टप्प्याच्या मूलभूत विश्लेषणाचे परिणाम तक्ता 2 मध्ये दर्शविले आहेत. वर्तमान स्थिर टप्प्याचे कार्बन लोडिंग 6.35% आहे, जे आमच्या मागील अभ्यासाच्या कार्बन लोडिंगपेक्षा कमी आहे (पॉलीस्टीरिन बॉन्डेड सिलिका कण, 7.93%35 आणि 10.21%, अनुक्रमे) 42 सध्याच्या स्टेशनच्या तयारीमध्ये कार्बन लोडिंग कमी आहे. स्टायरीन व्यतिरिक्त, काही ध्रुवीय लिगँड्स जसे की phenylmaleimide-methylvinylisocyanate (PCMP) आणि 4-hydroxy-TEMPO वापरण्यात आले. सध्याच्या स्थिर अवस्थेतील नायट्रोजन वजन टक्केवारी 2.21% आहे, 0.1735 आणि 0.85% च्या तुलनेत, पूर्वीच्या अभ्यासात अनुक्रमे नायट्रोजनचे वजन जास्त आहे. phenylmaleimide मुळे फेज. त्याचप्रमाणे, उत्पादनांचे कार्बन लोडिंग (4) आणि (5) अनुक्रमे 2.7% आणि 2.9% होते, तर अंतिम उत्पादनाचे कार्बन लोडिंग (6) 6.35% होते, जसे तक्ता 2 मध्ये दर्शविल्याप्रमाणे. वजन कमी होणे PMP स्थिर टप्प्यासह तपासले गेले आणि TGA curve 4% वजन कमी दाखवले. , जे कार्बन लोडिंगशी (6.35%) चांगले सहमत आहे कारण लिगँड्समध्ये केवळ C नाही तर N, O आणि H देखील असतात.
फिनाइलमॅलेइमाइड-मेथिलविनाइलिसोसायनेट लिगँड सिलिका कणांच्या पृष्ठभागाच्या सुधारणेसाठी निवडले गेले कारण त्यात ध्रुवीय फिनाइलमॅलेइमाइड गट आणि विनाइलिसोसायनेट गट आहेत. विनाइल आयसोसायनेट गट जिवंत मूलगामी पॉलिमरायझेशनद्वारे स्टायरीनवर पुढील प्रतिक्रिया करू शकतात. दुसरे कारण म्हणजे एक गट समाविष्ट करणे ज्यामध्ये मॉडरेटीस्टॅना आणि मजबूत इंटरॅक्शन आणि इलेक्ट्रोस्टॅना स्टेशन यांच्यातील परस्परसंवाद नाही. ary फेज, phenylmaleimide moiety वर सामान्य pH वर कोणतेही आभासी शुल्क नसल्यामुळे. स्थिर टप्प्याची ध्रुवीयता स्टायरीनच्या इष्टतम प्रमाणाद्वारे आणि फ्री रॅडिकल पॉलिमरायझेशनच्या प्रतिक्रिया वेळेद्वारे नियंत्रित केली जाऊ शकते. प्रतिक्रियेची शेवटची पायरी (फ्री-रॅडिकल पॉलिमरायझेशन) गंभीर आहे आणि या ध्रुवीयता बदलू शकते. टी असे आढळून आले की स्टायरीनचे प्रमाण आणि प्रतिक्रिया वेळ वाढल्याने स्थिर टप्प्याचे कार्बन लोडिंग वाढले आणि त्याउलट. स्टायरीनच्या वेगवेगळ्या एकाग्रतेसह तयार केलेल्या एसपीमध्ये भिन्न कार्बन लोडिंग आहेत. पुन्हा, हे स्थिर टप्पे स्टेनलेस स्टीलच्या स्तंभांमध्ये लोड करा आणि त्यांचे क्रोमॅटोग्राफिक कार्यप्रदर्शन तपासा (निवडकता, रिझोल्यूशन तयार करण्यासाठी, एन फॉर्म तयार करणे, इ. मूल्ये तयार करणे). नियंत्रित ध्रुवीयता आणि चांगले विश्लेषक धारणा सुनिश्चित करण्यासाठी पीएमपी स्थिर टप्पा.
पाच पेप्टाइड मिश्रण (ग्लाय-टायर, ग्लाय-ल्यू-टायर, ग्लाय-ग्लाय-टायर-आर्ग, टायर-इले-ग्लाय-सेर-आर्ग, ल्यूसीन एनकेफेलिन) देखील मोबाइल फेज वापरून पीएमपी कॉलम वापरून मूल्यांकन केले गेले;60/40 (v/v) acetonitrile/पाणी (0.1% TFA) 80 μL/min च्या प्रवाह दराने. इष्टतम उत्सर्जन परिस्थितीत, सैद्धांतिक प्लेट क्रमांक (N) प्रति स्तंभ (100 × 1.8 mm id) 20,000 ± 0,00m/100 203 s 20,000 ± 1002 टीएफए आहे. PMP स्तंभ आणि क्रोमॅटोग्राम आकृती 5A मध्ये दर्शविले आहेत. उच्च प्रवाह दराने (700 μL/min) PMP स्तंभावर जलद विश्लेषण, एका मिनिटात पाच पेप्टाइड्स काढले गेले, N मूल्ये खूप चांगली होती, 13,500 ± 330 प्रति स्तंभ), 10.130 × 180 मिमी, कॉर्पोनड्स ते 100 मिमी m (आकृती 5B). पुनरुत्पादनक्षमता तपासण्यासाठी तीन समान आकाराचे स्तंभ (100 × 1.8 mm id) PMP स्थिर टप्प्याच्या तीन वेगवेगळ्या लॉटने पॅक केले गेले होते. प्रत्येक स्तंभासाठी विश्लेषक एकाग्रता इष्टतम उत्सर्जन परिस्थिती आणि सैद्धांतिक प्लेट्सची संख्या वापरून रेकॉर्ड केली गेली. lumns तक्ता 4 मध्ये दर्शविले आहेत. PMP स्तंभाची पुनरुत्पादकता टेबल 3 मध्ये दर्शविल्याप्रमाणे, अत्यंत कमी %RSD मूल्यांशी उत्तम प्रकारे संबंधित आहे.
PMP स्तंभ (B) आणि Ascentis Express RP-Amide स्तंभ (A) वर पेप्टाइड मिश्रणाचे पृथक्करण;मोबाइल फेज 60/40 ACN/H2O (TFA 0.1%), PMP स्तंभ परिमाणे (100 × 1.8 mm id);विश्लेषणात्मक संयुगांचा उत्सर्जन क्रम: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) आणि 5 (leucine) ऍसिड एन्केफेलिन)).
उच्च कार्यक्षमता लिक्विड क्रोमॅटोग्राफीमध्ये मानवी सीरम अल्ब्युमिनच्या ट्रायप्टिक डायजेस्टच्या पृथक्करणासाठी PMP स्तंभाचे (100 × 1.8 मिमी id) मूल्यमापन केले गेले. आकृती 6 मधील क्रोमॅटोग्राम दर्शवितो की नमुना चांगला विभक्त झाला आहे आणि रिझोल्यूशन खूप चांगले आहे. HSA डायजेस्टचे विश्लेषण केले गेले आहे. rile/water आणि 0.1% TFA. क्रोमॅटोग्राम (आकृती 6) मध्ये दर्शविल्याप्रमाणे, HSA पाचन 17 पेप्टाइड्सशी संबंधित 17 शिखरांमध्ये विभागले गेले आहे. HSA डायजेस्टमधील प्रत्येक शिखराची पृथक्करण कार्यक्षमता मोजली गेली आणि मूल्ये टी 5 मध्ये दिली आहेत.
PMP स्तंभावर HSA (100 × 1.8 mm id) चे ट्रिप्टिक डायजेस्ट वेगळे केले गेले;प्रवाह दर (100 μL/मिनिट), मोबाईल फेज 60/40 एसीटोनिट्रिल/पाणी 0.1% TFA सह.
जेथे L ही स्तंभाची लांबी आहे, η ही मोबाइल टप्प्याची चिकटपणा आहे, ΔP हा स्तंभाचा मागील दाब आहे, आणि u हा मोबाइल टप्प्याचा रेषीय वेग आहे. PMP स्तंभाची पारगम्यता 2.5 × 10-14 m2 होती, प्रवाह दर 25 μL/min होता, आणि 60/40MP AC/40MP AC/40m ची पारगम्यता होती. 0 × 1.8 mm id) आमच्या मागील अभ्यासाप्रमाणेच होते Ref.34. वरवरच्या सच्छिद्र कणांनी भरलेल्या स्तंभाची पारगम्यता आहे: 1.3 μm कणांसाठी 1.7 × 10-15, 1.7 μm कणांसाठी 3.1 × 10-15, 1.7 μm कणांसाठी 3.1 × 10-15 × 251 × 2-51,. .6 μm कण 5 μm कणांसाठी 43. त्यामुळे, PMP टप्प्याची पारगम्यता 5 μm कोर-शेल कणांसारखीच असते.
जेथे Wx हे क्लोरोफॉर्मने पॅक केलेल्या स्तंभाचे वजन आहे, Wy हे मिथेनॉलने पॅक केलेल्या स्तंभाचे वजन आहे, आणि ρ हे सॉल्व्हेंटची घनता आहे. मिथेनॉल (ρ = 0.7866) आणि क्लोरोफॉर्म (ρ = 1.484) ची घनता आहे. SIIClum 18mm PARTC18 ची एकूण सच्छिद्रता. ) 34 आणि C18-युरिया स्तंभ 31 ज्यांचा आम्ही यापूर्वी अभ्यास केला होता ते अनुक्रमे 0.63 आणि 0.55 होते. याचा अर्थ असा होतो की युरिया लिगॅंड्सच्या उपस्थितीमुळे स्थिर टप्प्याची पारगम्यता कमी होते. दुसरीकडे, PMP स्तंभाची एकूण सच्छिद्रता (100 × 1.8 mm. idmns पेक्षा कमी आहे). C18-बंधित सिलिका कणांनी भरलेले आहे कारण C18-प्रकारच्या स्थिर टप्प्यांमध्ये C18 ligands सिलिका कणांना रेखीय साखळ्यांप्रमाणे जोडलेले असतात, तर पॉलिस्टीरिन-प्रकारच्या स्थिर टप्प्यांमध्ये, त्याभोवती तुलनेने जाड पॉलिमर थर तयार होतो. एका सामान्य प्रयोगात, स्तंभाची सच्छिद्रता अशी असते:
आकृती 7A,B PMP स्तंभ (100 × 1.8 mm id) आणि Ascentis Express RP-Amide स्तंभ (100 × 1.8 mm id) समान उत्सर्जन स्थिती वापरून दाखवते (म्हणजे, 60/40 ACN/H2O आणि 0.1% TFA).) व्हॅन डीमटर प्लॉटचा.निवडलेले पेप्टाइड मिश्रण (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) 20 µL/ मध्ये तयार केले गेले होते/ दोन्ही स्तंभांसाठी किमान प्रवाह दर 800 µminL/min the ummHe मूल्य 800 µminL/min आहे. L/min) PMP स्तंभ आणि Ascentis Express RP-Amide स्तंभासाठी अनुक्रमे 2.6 µm आणि 3.9 µm होते. HETP मूल्ये दर्शवितात की PMP स्तंभाची पृथक्करण कार्यक्षमता (100 × 1.8 mm id) पेक्षा जास्त चांगली आहे. .चित्र 7(A) मधील व्हॅन डीमटर प्लॉट दर्शविते की वाढत्या प्रवाहासह N मूल्यातील घट आमच्या मागील अभ्यासाच्या तुलनेत लक्षणीय नाही. Ascentis Express RP-Amide स्तंभाच्या तुलनेत PMP स्तंभाची उच्च पृथक्करण कार्यक्षमता (100 × 1.8 mm id) ही सुधारणेवर आधारित आहे.
(A) व्हॅन डीमटर प्लॉट (HETP विरुद्ध मोबाइल फेज रेखीय वेग) 60/40 ACN/H2O मध्ये 0.1% TFA सह PMP स्तंभ (100 × 1.8 मिमी id) वापरून मिळवला. (B) व्हॅन डीमटर प्लॉट (HETP विरुद्ध मोबाइल फेज रेखीय वेग) RP0 मीटर एक्सप्रेस co-1 मीटर एक्सप्रेस co-1 मीटर वापरून 60/40 ACN/H2O. .8 मिमी आयडी) 60/40 ACN/H2O मध्ये 0.1% TFA सह.
हाय परफॉर्मन्स लिक्विड क्रोमॅटोग्राफीमध्ये सिंथेटिक पेप्टाइड मिश्रण आणि मानवी सीरम अल्ब्युमिन (HAS) चे ट्रिप्सिन डायजेस्ट वेगळे करण्यासाठी ध्रुवीय-एम्बेडेड पॉलीस्टीरिन स्थिर टप्पा तयार केला गेला आणि त्याचे मूल्यमापन केले गेले. पेप्टाइड मिश्रणासाठी पीएमपी स्तंभांची क्रोमॅटोग्राफिक कामगिरी पीएमपी विविधतेच्या पृथक्करण आणि सह-रिझोल्यूशनच्या सह-रिझोल्यूशनच्या कारणामुळे उत्कृष्ट आहे. s, जसे की सिलिका कणांचे कण आकार आणि छिद्र आकार, स्थिर टप्प्याचे नियंत्रित संश्लेषण आणि जटिल स्तंभ पॅकिंग. उच्च पृथक्करण कार्यक्षमतेच्या व्यतिरिक्त, उच्च प्रवाह दरांवर कमी स्तंभाचा दाब हा या स्थिर टप्प्याचा आणखी एक फायदा आहे. पीएमपी स्तंभ चांगले पुनरुत्पादकता प्रदर्शित करतात आणि विविध प्रथिने आणि पेप्टीडिअनच्या विविध प्रथिनांसाठी वापरले जाऊ शकतात. या स्तंभाचा वापर नैसर्गिक उत्पादने, औषधी वनस्पतींतील बायोएक्टिव्ह संयुगे आणि द्रव क्रोमॅटोग्राफीमध्ये बुरशीजन्य अर्क वेगळे करण्यासाठी करा. भविष्यात, प्रथिने आणि मोनोक्लोनल ऍन्टीबॉडीजच्या पृथक्करणासाठी PMP स्तंभांचे मूल्यमापन देखील केले जाईल.
फील्ड, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. रिव्हर्स्ड फेज क्रोमॅटोग्राफी द्वारे पेप्टाइड सेपरेशन सिस्टम्सवर संशोधन भाग I: कॉलम कॅरेक्टरायझेशन प्रोटोकॉलचा विकास.जे.क्रोमॅटोग्राफी.१६०३, ११३–१२९.https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038 (2019).
Gomez, B. et al.संक्रामक रोगांच्या उपचारांसाठी डिझाइन केलेले सक्रिय पेप्टाइड सुधारित केले. Biotechnology.Advanced.36(2), 415-429.https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. सिंथेटिक थेरप्यूटिक पेप्टाइड्स: सायन्स अँड द मार्केट.ड्रग डिस्कवरी.15 (1-2) आज, 40-56.https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009 (0.2009).
Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Advanced Proteomic Liquid Chromatography.J.क्रोमॅटोग्राफी.ए 1261, 78-90 (2012).
Liu, W. et al. Advanced Liquid Chromatography-mass spectrometry व्यापकपणे लक्ष्यित मेटाबोलॉमिक्स आणि proteomics.anus.Chim.Acta 1069, 89–97 (2019) यांचा समावेश करण्यास सक्षम करते.
Chesnut, SM आणि Salisbury, JJ औषध विकासात UHPLC ची भूमिका.जे.Sci.30(8), 1183-1190 (2007).
वू, एन. आणि क्लॉसेन, एएम जलद पृथक्करणासाठी अल्ट्राहाय प्रेशर लिक्विड क्रोमॅटोग्राफीचे मूलभूत आणि व्यावहारिक पैलू.जे.Sci.30(8), 1167-1182.https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA आणि Tchelitcheff, P. अॅप्लिकेशन ऑफ अल्ट्रा-हाय परफॉर्मन्स लिक्विड क्रोमॅटोग्राफी इन ड्रग डेव्हलपमेंट.जे.क्रोमॅटोग्राफी.1119(1-2), 140-146.https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
गु, एच. एट अल. मोनोलिथिक मॅक्रोपोरस हायड्रोजेल्स एंटरोव्हायरसेसच्या कार्यक्षम शुध्दीकरणासाठी तेल-इन-वॉटर हाय इंटरनल फेज इमल्शनपासून तयार केलेले. केमिकल.ब्रिटन.जे.401, 126051 (2020).
शि, वाई., झियांग, आर., होर्व्हथ, सी. आणि विल्किन्स, जेए प्रोटिओमिक्समध्ये द्रव क्रोमॅटोग्राफीची भूमिका.जे.क्रोमॅटोग्राफी.ए 1053(1-2), 27-36 (2004).
फेकेटे, एस., व्हेउथे, जे.-एल. आणि गिलार्मे, डी. उपचारात्मक पेप्टाइड्स आणि प्रथिनांचे रिव्हर्स्ड-फेज लिक्विड क्रोमॅटोग्राफी पृथक्करणातील उदयोन्मुख ट्रेंड: सिद्धांत आणि अनुप्रयोग.जे.फार्मसी.बायोमेडिकल सायन्स.अॅनस.69, 9-27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC RP-RP-HPLC प्रणाली वापरून पेप्टाइड्सचे द्विमितीय पृथक्करण पहिल्या आणि दुसऱ्या पृथक्करण परिमाणांमध्ये भिन्न pH मूल्ये वापरून.जे.Sci.28(14), 1694-1703 (2005).
Feletti, S. et al. C18 sub-2 μm पूर्ण आणि वरवरच्या सच्छिद्र कणांनी भरलेल्या उच्च-कार्यक्षमतेच्या क्रोमॅटोग्राफिक स्तंभांची वस्तुमान हस्तांतरण वैशिष्ट्ये आणि गतिज कामगिरीची तपासणी करण्यात आली.जे.Sci.43 (9-10), 1737-1745 (2020).
Piovesana, S. et al. वनस्पती bioactive peptides.anus.biological anus.Chemical.410(15), 3425–3444.https://doi.org/10.1007/s0182610.1007/s018-2018 पृथक्करण, ओळख आणि प्रमाणीकरणातील अलीकडील ट्रेंड आणि विश्लेषणात्मक आव्हाने.
Mueller, JB et al.The proteomic landscape of the kingdom of life.Nature 582(7813), 592-596.https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
DeLuca, C. et al. प्रीपेरेटिव्ह लिक्विड क्रोमॅटोग्राफीद्वारे उपचारात्मक पेप्टाइड्सची डाउनस्ट्रीम प्रक्रिया. रेणू (बासेल, स्वित्झर्लंड) 26(15), 4688(2021).
यांग, वाय. आणि गेंग, एक्स. मिश्रित-मोड क्रोमॅटोग्राफी आणि बायोपॉलिमर्सवर त्याचा अनुप्रयोग.जे.क्रोमॅटोग्राफी.A 1218(49), 8813–8825 (2011).
झाओ, जी., डोंग, एक्स.-वाय. आणि सन, वाई. लिगंड्स फॉर मिक्स्ड-मोड प्रोटीन क्रोमॅटोग्राफी: तत्त्व, व्यक्तिचित्रण आणि डिझाइन.जे.जैवतंत्रज्ञान.144(1), 3-11 (2009).