Nature.com ला भेट दिल्याबद्दल धन्यवाद.तुम्ही वापरत असलेल्या ब्राउझर आवृत्तीमध्ये मर्यादित CSS सपोर्ट आहे.सर्वोत्तम अनुभवासाठी, आम्ही शिफारस करतो की तुम्ही अद्ययावत ब्राउझर वापरा (किंवा इंटरनेट एक्सप्लोररमध्ये सुसंगतता मोड अक्षम करा).दरम्यान, सतत समर्थन सुनिश्चित करण्यासाठी, आम्ही साइटला शैली आणि JavaScript शिवाय रेंडर करू.
औषध चाचणीसाठी हृदयाच्या शारीरिक वातावरणाचे अचूक पुनरुत्पादन करू शकणाऱ्या विश्वासार्ह इन विट्रो प्रणालीची गरज आहे.मानवी हृदयाच्या ऊती संवर्धन प्रणालींच्या मर्यादित उपलब्धतेमुळे ह्रदयावरील औषधांच्या परिणामांची चुकीची व्याख्या झाली आहे.येथे, आम्ही कार्डियाक टिश्यू कल्चर मॉडेल (CTCM) विकसित केले आहे जे इलेक्ट्रोमेकॅनिकली हृदयाचे तुकडे उत्तेजित करते आणि हृदयाच्या चक्राच्या सिस्टोलिक आणि डायस्टोलिक टप्प्यांदरम्यान शारीरिक ताणून जाते.12 दिवसांच्या संस्कृतीनंतर, या दृष्टिकोनाने हृदयाच्या विभागांची व्यवहार्यता अंशतः सुधारली, परंतु त्यांची संरचनात्मक अखंडता पूर्णपणे जतन केली नाही.म्हणून, लहान रेणूंच्या तपासणीनंतर, आम्हाला आढळले की आमच्या माध्यमात 100 nM ट्रायओडोथायरोनिन (T3) आणि 1 μM डेक्सामेथासोन (Dex) जोडल्याने विभागांची सूक्ष्म रचना 12 दिवस टिकून राहिली.T3/Dex उपचारांच्या संयोजनात, CTCM प्रणालीने ट्रान्सक्रिप्शनल प्रोफाइल, व्यवहार्यता, चयापचय क्रिया आणि स्ट्रक्चरल अखंडता 12 दिवसांसाठी ताज्या हृदयाच्या ऊतकांप्रमाणेच राखली.याव्यतिरिक्त, संस्कृतीत हृदयाच्या ऊतींचे जास्त ताणणे हायपरट्रॉफिक कार्डियाक सिग्नलिंगला प्रेरित करते, ज्यामुळे हृदयाच्या ताणामुळे प्रेरित हायपरट्रॉफिक परिस्थितीची नक्कल करण्यासाठी सीटीसीएमच्या क्षमतेचा पुरावा मिळतो.शेवटी, CTCM दीर्घकाळापर्यंत हृदयाच्या शरीरक्रियाविज्ञान आणि पॅथोफिजियोलॉजीचे मॉडेल बनवू शकते, विश्वसनीय औषध तपासणी सक्षम करते.
नैदानिक ​​​​संशोधनापूर्वी, विश्वासार्ह इन विट्रो प्रणाली आवश्यक आहेत जी मानवी हृदयाच्या शारीरिक वातावरणाचे अचूक पुनरुत्पादन करू शकतात.अशा प्रणालींनी बदललेल्या यांत्रिक ताण, हृदय गती आणि इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल गुणधर्मांची नक्कल केली पाहिजे.प्राण्यांच्या मॉडेल्सचा वापर सामान्यतः कार्डियाक फिजियोलॉजीसाठी स्क्रीनिंग प्लॅटफॉर्म म्हणून केला जातो ज्यामध्ये मानवी हृदयावर औषधांचा प्रभाव परावर्तित करण्यासाठी मर्यादित विश्वासार्हता असते1,2.शेवटी, आदर्श कार्डियाक टिश्यू कल्चर प्रायोगिक मॉडेल (CTCM) हे एक मॉडेल आहे जे अत्यंत संवेदनशील आणि विविध उपचारात्मक आणि औषधीय हस्तक्षेपांसाठी विशिष्ट आहे, मानवी हृदयाचे शरीरशास्त्र आणि पॅथोफिजियोलॉजी अचूकपणे पुनरुत्पादित करते3.अशा प्रणालीच्या अनुपस्थितीमुळे हृदयाच्या विफलतेसाठी नवीन उपचारांचा शोध मर्यादित होतो 4,5 आणि औषध कार्डिओटॉक्सिसिटी हे बाजारातून बाहेर पडण्याचे प्रमुख कारण आहे6.
गेल्या दशकात, आठ नॉन-हृदय व रक्तवाहिन्यासंबंधी औषधे नैदानिक ​​​​वापरातून मागे घेण्यात आली आहेत कारण त्यांच्यामुळे क्यूटी मध्यांतर लांबणीवर पडते ज्यामुळे वेंट्रिक्युलर ऍरिथमिया आणि अचानक मृत्यू7.अशा प्रकारे, हृदय व रक्तवाहिन्यासंबंधी परिणामकारकता आणि विषारीपणाचे मूल्यांकन करण्यासाठी विश्वसनीय प्रीक्लिनिकल स्क्रीनिंग धोरणांची वाढती गरज आहे.मानवी-प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न कार्डिओमायोसाइट्स (hiPS-CM) चा ड्रग स्क्रीनिंग आणि टॉक्सिसिटी टेस्टिंगमध्ये अलीकडील वापर या समस्येचे आंशिक समाधान प्रदान करतो.तथापि, hiPS-CM चे अपरिपक्व स्वरूप आणि ह्रदयाच्या ऊतींच्या बहुपेशीय जटिलतेचा अभाव या पद्धतीच्या प्रमुख मर्यादा आहेत.अलीकडील अभ्यासातून असे दिसून आले आहे की उत्स्फूर्त आकुंचन सुरू झाल्यानंतर आणि कालांतराने हळूहळू विद्युत उत्तेजना वाढवल्यानंतर ह्रदयाच्या ऊतींचे हायड्रोजेल तयार करण्यासाठी प्रारंभिक hiPS-CM वापरून ही मर्यादा अंशतः दूर केली जाऊ शकते.तथापि, या hiPS-CM सूक्ष्म ऊतकांमध्ये प्रौढ मायोकार्डियमचे परिपक्व इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल आणि कॉन्ट्रॅक्टाइल गुणधर्म नसतात.याव्यतिरिक्त, मानवी हृदयाच्या ऊतींची रचना अधिक जटिल असते, ज्यामध्ये विविध पेशींचे विषम मिश्रण असते, ज्यामध्ये एंडोथेलियल पेशी, न्यूरॉन्स आणि स्ट्रोमल फायब्रोब्लास्ट्स समाविष्ट असतात, बाह्य पेशी मॅट्रिक्स प्रथिनांच्या विशिष्ट सेटद्वारे एकमेकांशी जोडलेले असतात.प्रौढ सस्तन प्राण्यांच्या हृदयातील नॉन-कार्डिओमायोसाइट लोकसंख्येची ही विषमता 11,12,13 वैयक्तिक पेशी प्रकार वापरून हृदयाच्या ऊतींचे मॉडेलिंग करण्यासाठी एक प्रमुख अडथळा आहे.या प्रमुख मर्यादा शारीरिक आणि पॅथॉलॉजिकल परिस्थितीत अखंड मायोकार्डियल ऊतींचे संवर्धन करण्याच्या पद्धती विकसित करण्याच्या महत्त्वावर जोर देतात.
मानवी हृदयाचे सुसंस्कृत पातळ (300 µm) विभाग अखंड मानवी मायोकार्डियमचे एक आशादायक मॉडेल असल्याचे सिद्ध झाले आहे.ही पद्धत मानवी हृदयाच्या ऊतींप्रमाणेच संपूर्ण 3D मल्टीसेल्युलर प्रणालीमध्ये प्रवेश प्रदान करते.तथापि, 2019 पर्यंत, सुसंस्कृत हृदय विभागांचा वापर लहान (24 तास) संस्कृतीच्या अस्तित्वामुळे मर्यादित होता.हे भौतिक-यांत्रिक स्ट्रेच, एअर-लिक्विड इंटरफेस आणि हृदयाच्या ऊतींच्या गरजा पूर्ण न करणाऱ्या साध्या माध्यमांचा वापर यासह अनेक कारणांमुळे होते.2019 मध्ये, अनेक संशोधन गटांनी दाखवून दिले की कार्डियाक टिश्यू कल्चर सिस्टममध्ये यांत्रिक घटकांचा समावेश केल्याने संस्कृतीचे आयुष्य वाढू शकते, हृदयाची अभिव्यक्ती सुधारू शकते आणि कार्डियाक पॅथॉलॉजीची नक्कल होऊ शकते.दोन मोहक अभ्यास 17 आणि 18 दर्शविते की एकअक्षीय यांत्रिक लोडिंगचा कल्चर दरम्यान कार्डियाक फिनोटाइपवर सकारात्मक प्रभाव पडतो.तथापि, या अभ्यासांमध्ये कार्डियाक सायकलचे डायनॅमिक त्रि-आयामी भौतिक-यांत्रिक लोडिंग वापरले गेले नाही, कारण हृदयाचे विभाग एकतर आयसोमेट्रिक तन्य शक्ती 17 किंवा रेखीय ऑक्सोटोनिक लोडिंग 18 ने लोड केले गेले होते.टिश्यू स्ट्रेचिंगच्या या पद्धतींमुळे अनेक ह्रदयाची जीन्स दडपली गेली किंवा असामान्य स्ट्रेच प्रतिसादांशी संबंधित जनुकांची जास्त एक्सप्रेशन झाली.उल्लेखनीय म्हणजे, पिटौलिस वगैरे.19 ने फोर्स ट्रान्सड्यूसर फीडबॅक आणि टेंशन ड्राईव्हचा वापर करून कार्डियाक सायकल रिकन्स्ट्रक्शनसाठी डायनॅमिक हार्ट स्लाइस कल्चर बाथ विकसित केले.जरी ही प्रणाली विट्रो कार्डियाक सायकल मॉडेलिंगमध्ये अधिक अचूकतेसाठी परवानगी देते, परंतु पद्धतीची जटिलता आणि कमी थ्रूपुट या प्रणालीच्या वापरास मर्यादित करते.आमच्या प्रयोगशाळेने अलीकडेच 6 दिवसांपर्यंत पोर्सिन आणि मानवी हृदयाच्या ऊतींच्या भागांची व्यवहार्यता टिकवून ठेवण्यासाठी विद्युत उत्तेजना आणि ऑप्टिमाइझ्ड माध्यम वापरून एक सरलीकृत संस्कृती प्रणाली विकसित केली आहे.
सध्याच्या हस्तलिखितामध्ये, आम्ही हृदयाच्या चक्रादरम्यान त्रि-आयामी कार्डियाक फिजियोलॉजी आणि पॅथोफिजियोलॉजिकल डिस्टेन्शन पुन्हा सांगण्यासाठी पोर्सिन हृदयाचे विभाग वापरून कार्डियाक टिश्यू कल्चर मॉडेल (CTCM) चे वर्णन करतो.हे CTCM प्री-क्लिनिकल ड्रग चाचणीसाठी सस्तन प्राण्यांच्या हृदयाच्या शरीरविज्ञान/पॅथोफिजियोलॉजीची नक्कल करणारी किफायतशीर, मिड-थ्रूपुट कार्डियाक प्रणाली प्रदान करून प्री-क्लिनिकल ड्रग अंदाजाची अचूकता वाढवू शकते.
विट्रो 22,23,24 मध्ये कार्डिओमायोसाइट फंक्शन राखण्यासाठी हेमोडायनामिक यांत्रिक सिग्नल महत्त्वपूर्ण भूमिका बजावतात.सध्याच्या हस्तलिखितामध्ये, आम्ही एक CTCM (आकृती 1a) विकसित केले आहे जे शारीरिक फ्रिक्वेन्सीवर (1.2 Hz, 72 बीट्स प्रति मिनिट) विद्युत आणि यांत्रिक दोन्ही उत्तेजन देऊन प्रौढ हृदयाच्या वातावरणाची नक्कल करू शकते.डायस्टोल दरम्यान ऊतींचे जास्त ताण टाळण्यासाठी, ऊतींचे आकार 25% वाढवण्यासाठी 3D प्रिंटिंग उपकरण वापरले गेले (चित्र 1b).C-PACE प्रणालीद्वारे प्रेरित इलेक्ट्रिकल पेसिंग कार्डियाक सायकल पूर्णपणे पुनरुत्पादित करण्यासाठी डेटा संपादन प्रणाली वापरून सिस्टोलच्या 100 ms आधी सुरू करण्याची वेळ आली होती.टिश्यू कल्चर सिस्टम प्रोग्रामेबल न्यूमॅटिक अॅक्ट्युएटर (एलबी इंजिनीअरिंग, जर्मनी) चा वापर करून वरच्या चेंबरमध्ये हृदयाच्या तुकड्यांचा विस्तार करण्यासाठी लवचिक सिलिकॉन झिल्ली चक्रीयपणे विस्तारित करते.सिस्टम प्रेशर ट्रान्सड्यूसरद्वारे बाह्य एअर लाइनशी जोडलेली होती, ज्यामुळे दाब (± 1 mmHg) आणि वेळ (± 1 ms) (Fig. 1c) अचूकपणे समायोजित करणे शक्य झाले.
a यंत्राच्या कल्चर चेंबरमध्ये निळ्या रंगात दाखवलेल्या 7 मिमी सपोर्ट रिंगला टिश्यू सेक्शन जोडा.कल्चर चेंबर पातळ लवचिक सिलिकॉन झिल्लीद्वारे एअर चेंबरपासून वेगळे केले जाते.गळती टाळण्यासाठी प्रत्येक चेंबरमध्ये गॅस्केट ठेवा.उपकरणाच्या झाकणामध्ये ग्रेफाइट इलेक्ट्रोड असतात जे विद्युत उत्तेजन देतात.b मोठ्या टिश्यू उपकरण, मार्गदर्शक रिंग आणि सपोर्ट रिंगचे योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व.ऊतींचे विभाग (तपकिरी) उपकरणाच्या बाहेरील काठावर खोबणीत ठेवलेल्या मार्गदर्शक रिंगसह मोठ्या आकाराच्या उपकरणावर ठेवले जातात.मार्गदर्शकाचा वापर करून, कार्डियाक टिश्यूच्या भागावर टिश्यू अॅक्रेलिक अॅडेसिव्हने लेपित सपोर्ट रिंग काळजीपूर्वक ठेवा.c प्रोग्रामेबल वायवीय अॅक्ट्युएटर (PPD) द्वारे नियंत्रित एअर चेंबर प्रेशरचे कार्य म्हणून विद्युत उत्तेजनाची वेळ दर्शविणारा आलेख.प्रेशर सेन्सर्सचा वापर करून इलेक्ट्रिकल स्टिम्युलेशन सिंक्रोनाइझ करण्यासाठी डेटा एक्विझिशन डिव्हाइसचा वापर केला गेला.जेव्हा कल्चर चेंबरमधील दाब सेट थ्रेशोल्डवर पोहोचतो, तेव्हा विद्युत उत्तेजना ट्रिगर करण्यासाठी C-PACE-EM ला एक नाडी सिग्नल पाठविला जातो.d इनक्यूबेटर शेल्फवर ठेवलेल्या चार CTCM ची प्रतिमा.चार उपकरणे एका PPD शी वायवीय सर्किटद्वारे जोडलेली असतात आणि वायवीय सर्किटमधील दाबाचे निरीक्षण करण्यासाठी हेमोस्टॅटिक वाल्वमध्ये प्रेशर सेन्सर घातले जातात.प्रत्येक यंत्रामध्ये सहा ऊतक विभाग असतात.
एकल वायवीय अॅक्ट्युएटर वापरून, आम्ही 4 CTCM उपकरणे नियंत्रित करू शकलो, ज्यापैकी प्रत्येक 6 टिश्यू विभाग (चित्र 1d) ठेवू शकतो.CTCM मध्ये, हवेच्या चेंबरमधील हवेचा दाब फ्लुइड चेंबरमध्ये सिंक्रोनस प्रेशरमध्ये रूपांतरित होतो आणि हृदयाच्या तुकड्याच्या शारीरिक विस्तारास प्रेरित करतो (आकृती 2a आणि पूरक चित्रपट 1).80 मिमी एचजी वर टिश्यू स्ट्रेचचे मूल्यांकन.कला.25% (चित्र 2b) ने ऊतींचे विभाग ताणून दाखवले.ही टक्केवारी खिंचाव सामान्य हृदयविभागाच्या आकुंचनक्षमतेसाठी 2.2-2.3 µm च्या फिजियोलॉजिकल सारकोमेर लांबीशी संबंधित असल्याचे दर्शविले गेले आहे17,19,25.सानुकूल कॅमेरा सेटिंग्ज (पूरक आकृती 1) वापरून टिश्यू हालचालींचे मूल्यांकन केले गेले.ऊतींच्या हालचालींचे मोठेपणा आणि वेग (Fig. 2c, d) ह्रदयाच्या चक्रादरम्यान आणि सिस्टोल आणि डायस्टोल (Fig. 2b) दरम्यानच्या काळात ताणण्याशी संबंधित आहे.आकुंचन आणि विश्रांती दरम्यान हृदयाच्या ऊतींचा ताण आणि वेग संस्कृतीत 12 दिवस स्थिर राहिला (चित्र 2f).संवर्धनादरम्यान आकुंचनशीलतेवर विद्युत उत्तेजनाच्या परिणामाचे मूल्यांकन करण्यासाठी, आम्ही शेडिंग अल्गोरिदम (पूरक चित्र 2a,b) वापरून सक्रिय विकृती निर्धारित करण्यासाठी एक पद्धत विकसित केली आणि विद्युत उत्तेजनासह आणि त्याशिवाय विकृतींमध्ये फरक करण्यास सक्षम झालो.हृदयाचा समान विभाग (Fig. 2f).कट (R6-9) च्या जंगम प्रदेशात, विद्युत उत्तेजना दरम्यान व्होल्टेज विद्युत उत्तेजनाच्या अनुपस्थितीच्या तुलनेत 20% जास्त होते, जे संकुचित कार्यामध्ये विद्युत उत्तेजनाचे योगदान दर्शवते.
एअर चेंबर प्रेशर, फ्लुइड चेंबर प्रेशर आणि टिश्यू हालचाली मोजण्याचे प्रातिनिधिक ट्रेस हे पुष्टी करतात की चेंबर प्रेशर फ्लुइड चेंबर प्रेशर बदलते, ज्यामुळे टिश्यू स्लाइसची संबंधित हालचाल होते.b टक्के स्ट्रेच (नारिंगी) शी संबंधित टिशू विभागांच्या टक्के स्ट्रेच (निळ्या) चे प्रतिनिधी ट्रेस.c कार्डियाक स्लाइसची मोजलेली गती गतीच्या मोजलेल्या गतीशी सुसंगत असते.(d) हृदयाच्या एका तुकड्यात चक्रीय गती (निळी रेषा) आणि वेग (नारिंगी ठिपके असलेली रेषा) यांचे प्रातिनिधिक मार्ग.e सायकल वेळेचे प्रमाण (n = 19 स्लाइस प्रति गट, वेगवेगळ्या डुकरांकडून), आकुंचन वेळ (n = 19 स्लाइस प्रति गट), विश्रांतीची वेळ (n = 19 स्लाइस प्रति गट, वेगवेगळ्या डुकरांकडून), ऊतकांची हालचाल (n = 25 ).वेगवेगळ्या डुकरांचे तुकडे)/गट), पीक सिस्टोलिक वेग (n = 24(D0), 25(D12) स्लाइस/वेगवेगळ्या डुकरांचे गट) आणि पीक विश्रांती दर (n=24(D0), 25(D12) स्लाइस/वेगवेगळ्या डुकरांचे गट).दोन-पुच्छ विद्यार्थ्यांच्या टी-चाचणीने कोणत्याही पॅरामीटरमध्ये लक्षणीय फरक दर्शविला नाही.f (लाल) आणि (निळ्या) विद्युत उत्तेजनाशिवाय टिश्यू विभागांचे प्रातिनिधिक ताण विश्लेषण ट्रेस, त्याच विभागातील ऊतक विभागांचे दहा प्रादेशिक क्षेत्र.खालचे पटल वेगवेगळ्या विभागांमधील दहा भागात विद्युत उत्तेजनासह आणि त्याशिवाय ऊती विभागातील ताणातील टक्केवारीतील फरकाचे प्रमाण दर्शवतात. (n = 8 स्लाइस/गट वेगवेगळ्या डुकरांचे, टू-टेल स्टुडंट टी-टेस्ट केली जाते; ****p < 0.0001, **p < 0.01, *p < 0.05). (n = 8 स्लाइस/गट वेगवेगळ्या डुकरांचे, टू-टेल स्टुडंट टी-टेस्ट केली जाते; ****p < 0.0001, **p < 0.01, *p < 0.05). (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,00, *p<0,001). (n = वेगवेगळ्या डुकरांचे 8 विभाग/गट, दोन-पुच्छ विद्यार्थ्यांची टी-टेस्ट; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05). （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；**p <0.0001，**p < 0.01,*p < 0.05）. （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；**p <0.0001，**p < 0.01,*p < 0.05）. (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = 8 विभाग/गट, वेगवेगळ्या डुकरांकडून, दोन-पुच्छ विद्यार्थ्यांची टी-टेस्ट; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05).त्रुटी पट्ट्या सरासरी ± मानक विचलन दर्शवतात.
आमच्या मागील स्टॅटिक बायोमिमेटिक हार्ट स्लाइस कल्चर सिस्टीममध्ये [२०, २१], आम्ही विद्युत उत्तेजना लागू करून आणि मध्यम रचना ऑप्टिमाइझ करून हृदयाच्या तुकड्यांची व्यवहार्यता, कार्य आणि संरचनात्मक अखंडता 6 दिवसांसाठी राखली.मात्र, 10 दिवसांनंतर ही आकडेवारी झपाट्याने घसरली.आम्ही आमच्या मागील स्टॅटिक बायोमिमेटिक कल्चर सिस्टीम 20, 21 कंट्रोल कंडिशन (Ctrl) मध्ये कल्चर केलेल्या विभागांचा संदर्भ घेऊ आणि आम्ही आमचे पूर्वीचे ऑप्टिमाइझ केलेले माध्यम MC कंडिशन आणि एकाचवेळी मेकॅनिकल आणि इलेक्ट्रिकल स्टिम्युलेशन (CTCM) अंतर्गत कल्चर म्हणून वापरू.म्हणतात.प्रथम, आम्ही निर्धारित केले की विद्युत उत्तेजनाशिवाय यांत्रिक उत्तेजना 6 दिवसांपर्यंत ऊतींची व्यवहार्यता राखण्यासाठी अपुरी होती (पूरक चित्र 3a,b).विशेष म्हणजे, STCM वापरून फिजिओ-मेकॅनिकल आणि इलेक्ट्रिकल स्टिमुलेशनचा परिचय करून दिल्याने, 12-दिवसांच्या हृदयाच्या विभागांची व्यवहार्यता MS परिस्थितीत ताज्या हृदयाच्या विभागांसारखीच राहिली, परंतु Ctrl परिस्थितीत नाही, MTT विश्लेषण (चित्र 1) द्वारे दर्शविल्याप्रमाणे.3a).हे सूचित करते की यांत्रिक उत्तेजित होणे आणि कार्डियाक सायकलचे सिम्युलेशन आमच्या मागील स्टॅटिक कल्चर सिस्टीममध्ये नोंदवल्याप्रमाणे टिश्यू विभागांना दोनदा व्यवहार्य ठेवू शकते.तथापि, कार्डियाक ट्रोपोनिन टी आणि कोनेक्सिन 43 च्या इम्यूनोलालेबलिंगद्वारे ऊतक विभागांच्या संरचनात्मक अखंडतेचे मूल्यांकन दर्शविते की त्याच दिवशी नियंत्रणापेक्षा 12 व्या दिवशी एमसी टिश्यूमध्ये कोनेक्सिन 43 अभिव्यक्ती लक्षणीयरीत्या जास्त होती.तथापि, एकसमान connexin 43 अभिव्यक्ती आणि Z-डिस्क निर्मिती पूर्णपणे राखली गेली नाही (Fig. 3b).टिश्यू स्ट्रक्चरल इंटिग्रिटीचे प्रमाण निश्चित करण्यासाठी आम्ही कृत्रिम बुद्धिमत्ता (AI) फ्रेमवर्क वापरतो, ट्रोपोनिन-टी आणि कोनेक्झिन स्टेनिंग 43 वर आधारित इमेज-आधारित डीप लर्निंग पाइपलाइन स्थानिकीकरणाच्या ताकदीच्या दृष्टीने हृदयाच्या स्लाइसची संरचनात्मक अखंडता आणि फ्लोरोसेन्स स्वयंचलितपणे परिमाण करण्यासाठी.ही पद्धत संदर्भामध्ये वर्णन केल्याप्रमाणे, स्वयंचलित आणि निःपक्षपाती पद्धतीने कार्डियाक टिश्यूच्या स्ट्रक्चरल अखंडतेचे विश्वसनीयरित्या परिमाण करण्यासाठी कॉन्व्होल्युशनल न्यूरल नेटवर्क (CNN) आणि सखोल शिक्षण फ्रेमवर्क वापरते.26. स्टॅटिक कंट्रोल सेक्शनच्या तुलनेत एमसी टिश्यूने दिवस 0 पर्यंत सुधारित संरचनात्मक समानता दर्शविली.याव्यतिरिक्त, मॅसनच्या ट्रायक्रोम स्टेनिंगने संस्कृतीच्या 12 व्या दिवशी (चित्र 3c) नियंत्रण परिस्थितीच्या तुलनेत एमएसच्या परिस्थितीत फायब्रोसिसची लक्षणीय टक्केवारी दिसून आली.CTCM ने 12 व्या दिवशी हृदयाच्या ऊतींच्या विभागांची व्यवहार्यता ताज्या हृदयाच्या ऊतींप्रमाणेच वाढवली, परंतु यामुळे हृदयाच्या विभागांच्या संरचनात्मक अखंडतेत लक्षणीय सुधारणा झाली नाही.
बार आलेख ताज्या हृदयाच्या स्लाइसेस (D0) किंवा हृदयाच्या स्लाइस कल्चरच्या MTT व्यवहार्यतेचे प्रमाण दर्शवितो 12 दिवस एकतर स्टॅटिक कल्चर (D12 Ctrl) किंवा CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 Ctrl), 12 (D12 pigs, 12 व्ही.ए. व्ही.ए. व्ही.ए. व्ही.ए. पेक्षा वेगळ्या पद्धतीने केले जाते; ##p <0.0001 D0 च्या तुलनेत आणि **p <0.01 D12 Ctrl च्या तुलनेत). बार आलेख ताज्या हार्ट स्लाइसेस (D0) किंवा हार्ट स्लाइस कल्चरच्या MTT व्यवहार्यतेचे प्रमाण दर्शवितो 12 दिवस एकतर स्टॅटिक कल्चर (D12 Ctrl) किंवा CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 Ctrl) , 12 (D12, D12, 12) चाचणी वेगळ्या पद्धतीने केले जाते. ###p <0.0001 D0 च्या तुलनेत आणि **p <0.01 D12 Ctrl च्या तुलनेत).हिस्टोग्राम MTT फ्रेश हार्ट सेक्शन्स (D0) किंवा हृदयाच्या विभागांच्या कल्चरच्या व्यवहार्यतेचे प्रमाण 12 दिवसांसाठी स्टॅटिक कल्चर (D12 कंट्रोल) किंवा CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 कंट्रोल) मध्ये दाखवतो.####p < 0,0001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p <0.0001 D0 च्या तुलनेत आणि **p <0.01 D12 Ctrl च्या तुलनेत). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片(或新鲜心脏切片) 12 天的MTT 活力的量化)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA，进行单向ANOVA，CD0p0#1#0p. l 相比,**p < ०.०१). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心的 中新鲜心的 中新鲜心的切片(D12 Ctrl) 12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，####p < 0.0001，与D12 Ctrl 相比，**p.)ताजे हृदय विभाग (D0) किंवा 12 दिवस स्थिर संवर्धन (D12 नियंत्रण) किंवा CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 नियंत्रण)), 12 (D12 MC) विभाग/समूह, ANO डुकरांच्या वेगवेगळ्या चाचणीमध्ये MTT व्यवहार्यतेचे प्रमाण दर्शवणारा हिस्टोग्राम;####p < 0,0001 по сравнению с D0, **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p <0.0001 D0 च्या तुलनेत, **p <0.01 D12 Ctrl च्या तुलनेत).b Troponin-T (हिरवा), connexin 43 (लाल) आणि DAPI (निळा) ताज्या पृथक हृदय विभागांमध्ये (D0) किंवा हृदयाच्या विभागांमध्ये स्थिर स्थिती (Ctrl) किंवा CTCM स्थिती (MC) अंतर्गत 12 दिवसांसाठी) प्रतिनिधी इम्युनोफ्लोरेसेन्स प्रतिमा (रिक्त स्केल = 100 µm). हृदयाच्या ऊतींचे स्ट्रक्चरल इंटिग्रिटी (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) स्लाइस/गट वेगवेगळ्या डुक्करांचे कृत्रिम बुद्धिमत्ता प्रमाणीकरण, एकतर्फी ANOVA चाचणी केली जाते; ####p < 0.0001 D0 आणि C. ***01 च्या तुलनेत D0 आणि C ***01 च्या तुलनेत. हृदयाच्या ऊतींच्या संरचनात्मक अखंडतेचे कृत्रिम बुद्धिमत्ता प्रमाणीकरण (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) तुकडे/गट वेगवेगळ्या डुकरांचे प्रत्येकी, एकतर्फी ANOVA चाचणी केली जाते; ####p < 0.0001 D0 आणि C. ***01 च्या तुलनेत D0 आणि C ***01 च्या तुलनेत. Количественная оценка структурной целостности селостности сердечной ткани искусственным интеллектом (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5/5/15/MC х свиней, проводится однофакторный тест ANOVA; ####p < 0,0001 по сравнению с D0 и ****p < 0,0001 по сравнению Crl D12). आर्टिफिशियल इंटेलिजन्स (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) विभाग/गट वेगवेगळ्या डुकरांकडून ह्रदयाच्या ऊतींच्या स्ट्रक्चरल अखंडतेचे प्रमाणीकरण, एकतर्फी ANOVA चाचणी केली; ####p < 0.0001 vs. D0t0 ची तुलना डी010 आणि ***10.人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) स्लाइस/गट प्रत्येक भिन्न डुक्कर, वन-वे. ##00p0 <#丛D0p. <###0p0p;比,****p <0.0001 与D12 Ctrl 相比）.人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) स्लाइस/गट प्रत्येक वेगवेगळ्या डुकरांना, वन-वे ANOVA 0###0p0;比,****p <0.0001 与D12 Ctrl 相比）. Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной ткани (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl/D05, D12 Ctrl), й из разных свиней, односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001 वि. D0 Для сравнения ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). ह्रदयाच्या ऊतींची संरचनात्मक अखंडता मोजण्यासाठी कृत्रिम बुद्धिमत्ता (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) विभाग/गट प्रत्येक वेगवेगळ्या डुकरांना, एकतर्फी ANOVA चाचणी; ####p<0.0001 vs .D0 .*d0 0 <1 r 0 च्या तुलनेत तुलना करण्यासाठी c प्रातिनिधिक प्रतिमा (डावीकडे) आणि मॅसनच्या ट्रायक्रोम डाग (स्केल बेअर = 500 µm) (स्केल बेअर = 500 µm) सह डागलेल्या हृदयाच्या तुकड्यांसाठी प्रमाणीकरण (उजवीकडे) (n = 10 स्लाइस/गट वेगवेगळ्या डुकराचे, एक-मार्गी ANOVA चाचणी केली जाते; ####p. ***1 ची तुलना D0 0 ची तुलना केली जाते. rl). c प्रातिनिधिक प्रतिमा (डावीकडे) आणि मॅसनच्या ट्रायक्रोम डाग (स्केल बेअर = 500 µm) (स्केल बेअर = 500 µm) सह डागलेल्या हृदयाच्या तुकड्यांसाठी प्रमाणीकरण (उजवीकडे) (n = 10 स्लाइस/गट वेगवेगळ्या डुकरांचे प्रत्येकी एक-मार्गी ANOVA चाचणी केली जाते; #### p. ***1 <0 ची तुलना D0 0 ची तुलना करा. rl). c Репрезентативные изображения (слева) и количественная оценка (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным красибатех трихромным (слева) тия = 500 мкм) (n = 10 срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонний тест ANOVA; #### p < 0,00001 Dp0,00001 равнению с D12 Ctrl). c प्रातिनिधिक प्रतिमा (डावीकडे) आणि मॅसनच्या ट्रायक्रोम डाग (अनकोटेड स्केल = 500 µm) (अनकोटेड स्केल = 500 µm) (n = 10 विभाग/गट) सह डागलेल्या हृदयाच्या विभागांचे प्रमाण (उजवीकडे), एक-मार्गी ANOVA चाचणी केली; #### p < 0 .0001 च्या तुलनेत C. ***1 l. 0001 ची तुलना केली. c 用मेसन 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（裸尺度=0¼n0m0片/组，每组来自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 相比，***p < 0.001 丛1 C.D. सी 用 मासन 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 量化 （右） 裸尺度度度带裸带500 µm） （n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 单向 单向 Anova 测试） 0# 0# 0# 10D. ***p <0.001 与D12 Ctrl 相比）. c Репрезентативные изображения (слева) и количественный анализ (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным (слева) км) (n = 10 срезов/группа, каждый от другой свиньи, протестировано с помощью однофакторного дисперсионного дисперсионного , <#10p00p0p#позов#; нию с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c प्रातिनिधिक प्रतिमा (डावीकडे) आणि मॅसनच्या ट्रायक्रोम डाग (रिक्त = 500 µm) (रिक्त = 500 µm) (n = 10 विभाग/समूह) सह डागलेल्या हृदयाच्या विभागांचे परिमाण (उजवीकडे) (n = 10 विभाग/समूह, प्रत्येक भिन्न डुकराचे, भिन्नतेच्या एकतर्फी विश्लेषणाद्वारे तपासले गेले ;### # p <1 0. ***1 0 ची तुलना डी 0 ची तुलना. rl).त्रुटी पट्ट्या सरासरी ± मानक विचलन दर्शवतात.
आम्ही असे गृहित धरले की संस्कृती माध्यमात लहान रेणू जोडून, ​​कार्डिओमायोसाइट अखंडता सुधारली जाऊ शकते आणि CTCM संस्कृती दरम्यान फायब्रोसिसचा विकास कमी केला जाऊ शकतो.म्हणून आम्ही आमच्या स्थिर नियंत्रण संस्कृती 20,21 वापरून लहान रेणूंची तपासणी केली कारण गोंधळात टाकणारे घटक कमी आहेत.या स्क्रीनसाठी Dexamethasone (Dex), triiodothyronine (T3), आणि SB431542 (SB) निवडले गेले.हे लहान रेणू पूर्वी hiPSC-CM संस्कृतींमध्ये sarcomere लांबी, T-ट्यूब्यूल्स आणि वहन वेग वाढवून कार्डिओमायोसाइट्सची परिपक्वता प्रेरित करण्यासाठी वापरले गेले आहेत.याव्यतिरिक्त, डेक्स (एक ग्लुकोकोर्टिकोइड) आणि एसबी हे दोन्ही सूज दाबण्यासाठी ओळखले जातात 29,30.म्हणून, आम्ही एक किंवा या लहान रेणूंच्या संयोजनाचा समावेश केल्याने हृदयाच्या विभागांची संरचनात्मक अखंडता सुधारेल की नाही याची चाचणी केली.प्रारंभिक स्क्रीनिंगसाठी, सेल कल्चर मॉडेल्समध्ये (1 μM Dex27, 100 nM T327, आणि 2.5 μM SB31) वापरल्या जाणार्‍या एकाग्रतेवर आधारित प्रत्येक कंपाऊंडचा डोस निवडला गेला.12 दिवसांच्या संस्कृतीनंतर, T3 आणि Dex च्या संयोजनाचा परिणाम इष्टतम कार्डिओमायोसाइट स्ट्रक्चरल अखंडता आणि कमीतकमी तंतुमय रीमॉडेलिंग (पूरक आकृती 4 आणि 5) मध्ये झाला.या व्यतिरिक्त, T3 आणि Dex च्या या सांद्रतेच्या दुप्पट किंवा दुप्पट वापराने सामान्य एकाग्रतेच्या तुलनेत हानिकारक प्रभाव निर्माण केले (पूरक चित्र 6a,b).
सुरुवातीच्या स्क्रीनिंगनंतर, आम्ही 4 कल्चर परिस्थितीची (आकृती 4a) तुलना केली: Ctrl: आमच्या ऑप्टिमाइझ्ड माध्यमाचा वापर करून आमच्या पूर्वी वर्णन केलेल्या स्थिर संस्कृतीत सुसंस्कृत हृदय विभाग;20.21 TD: T3 आणि Ctrl s बुधवारी डेक्स जोडले;MC: आमच्या पूर्वीच्या ऑप्टिमाइझ केलेल्या माध्यमाचा वापर करून CTCM मध्‍ये संवर्धन केलेले हृदयाचे विभाग;आणि MT: T3 आणि Dex सह CTCM माध्यमात जोडले.12 दिवसांच्या लागवडीनंतर, MS आणि MT ऊतींची व्यवहार्यता MTT परख (चित्र 4b) द्वारे मूल्यांकन केलेल्या ताज्या ऊतींप्रमाणेच राहिली.विशेष म्हणजे, ट्रान्सवेल कल्चर (TD) मध्ये T3 आणि Dex जोडल्याने Ctrl परिस्थितीच्या तुलनेत व्यवहार्यतेमध्ये लक्षणीय सुधारणा झाली नाही, जे हृदयाच्या विभागांची व्यवहार्यता राखण्यात यांत्रिक उत्तेजनाची महत्त्वपूर्ण भूमिका दर्शवते.
12 दिवसांसाठी यांत्रिक उत्तेजित होणे आणि T3/Dex सप्लिमेंटेशनच्या परिणामांचे मूल्यांकन करण्यासाठी वापरल्या जाणार्‍या चार संस्कृतीच्या परिस्थितीचे चित्रण करणारा प्रायोगिक डिझाइन आकृती. b बार आलेख ताज्या हृदयाच्या तुकड्या (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD आणि D12 MT), 12 (D12 pigs, MC, 12 MC, 12, 12, 12 MT) च्या तुलनेत सर्व 4 कल्चर परिस्थितीत (Ctrl, TD, MC, आणि MT) 12 दिवसांनंतर व्यवहार्यतेचे प्रमाण दर्शवितो. ##p <0.0001, ###p <0.001 D0 च्या तुलनेत आणि **p <0.01 D12 Ctrl च्या तुलनेत). b बार आलेख ताज्या हृदयाच्या तुकड्या (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD आणि D12 MT), 12 (D12 pigs, MC, 12 MC, 12, 12, 12 MT) च्या तुलनेत सर्व 4 कल्चर परिस्थितीत (Ctrl, TD, MC, आणि MT) 12 दिवसांनंतर व्यवहार्यतेचे प्रमाण दर्शवितो. ##p < 0.0001, ###p < 0.001 D0 च्या तुलनेत आणि **p < 0.01 D12 ctrl च्या तुलनेत). b Гистограмма показывает количественную оценку жизнеспособности через 12 дней после культивирования во всех 4 , TD, MC आणि MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD आणि D12 MT), 12 (D12 MC/срезами сердца) й, проводится односторонний тест ANOVA; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению Crl2 с) b बार आलेख ताजे हृदय विभाग (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD, आणि D12 MT), 12 (D12 Ctrl, D12 TD, आणि D12 MT), 12 (D12, 12 (D12 MT), 12 (D12 MT), 12 (D12, 12 दिवसांच्या संवर्धनानंतरच्या सर्व 4 कल्चर परिस्थितींमध्ये (नियंत्रण, TD, MC आणि MT) व्यवहार्यतेचे प्रमाण दर्शवितो. 0.0001, ###p < 0.001 वि. D0 आणि **p < 0.01 D12 Ctrl च्या तुलनेत). b 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片、D0) (n = 18 (D0r18) (D0)和D12 MT)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；####p < 0.0001，###p <0.0D12 <0.0D01，###p <0.0D0** 2控制).b 4 12 (D12 MC) b Гистограмма, показывающая все 4 условия культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими (срезами) (серзами =10Dn) 2 Ctrl, D12 TD и D12 MT), от разных свиней 12 (D12 MC) срезы/группа, односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001, ###p <0,0,0001, ###p <0,0,01** по сравнению с контролем D12). b विविध डुकरांचे 12 (D12 MC) विभाग/समूह, एकमार्गी ANOVA चाचणी, #0p<#0p.<#0p.<#0p.<#0p.<#0p.<#0p.<#0p.<#0p.<#0p.<#0p.<#0p.<##. 0, **p<0.01 वि. नियंत्रण D12). c बार आलेख सर्व 4 कल्चर स्थितींमध्ये (Ctrl, TD, MC, आणि MT) संस्कृतीनंतर 12 दिवसांच्या ग्लुकोज फ्लक्सचे प्रमाण दर्शवितो, ताज्या हृदयाच्या तुकड्यांच्या तुलनेत (D0) (n = 6 स्लाइस/वेगवेगळ्या डुकरांचे गट, एकतर्फी ANOVA चाचणी केली जाते; ###p <0.00 ची तुलना केली जाते. ). c बार आलेख सर्व 4 कल्चर स्थितींमध्ये (Ctrl, TD, MC, आणि MT) संस्कृतीनंतर 12 दिवसांच्या ग्लुकोज फ्लक्सचे प्रमाण दर्शवितो, ताज्या हृदयाच्या तुकड्यांच्या तुलनेत (D0) (n = 6 स्लाइस/वेगवेगळ्या डुकरांचे गट, एकतर्फी ANOVA चाचणी केली जाते; ###p <0.00 ची तुलना केली जाते. ). c Гистограмма показывает количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования во всех 4 усех , усех 4 усенку , MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/груптпу от разных свиней, односторонний свиней, односторонний со свежими срезами сердца (D0) по сравнению с D0 आणि ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c हिस्टोग्राम ताज्या हृदय विभागांच्या (D0) तुलनेत (नियंत्रण, TD, MC आणि MT) सर्व 4 कल्चर परिस्थितींतर्गत 12 दिवसांच्या पोस्ट-कल्चरमध्ये ग्लुकोज फ्लक्सचे प्रमाण दर्शवितो (n = 6 विभाग/गट भिन्न डुकरांचे, एक-मार्गी ANOVA चाचणी केली गेली; ###p < 0.001 D0 आणि C ***1l च्या तुलनेत D0 r <0.001). c 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片的(D0) 复培养所有通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试；###p < 0.001，与D0 相比 <0.001，与D0 相比 <0.10000001,D0* ). C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （（ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 新鲜 心脏 切片 心脏 切片 心脏 切片切片后 后 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 猪 ， ， ， ， ， 猪 猪单 ， ， 猪 猪单向执行 # 0 डी 0 पी 0 # 曎0 相比, ***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）. c Гистограмма, показывающая количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования (для всествирования для всественную 4 TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группа, от разных свиней, одностороных свиней, одностороный свежими срезами сердца (D0) 0,001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 (контроль). c हिस्टोग्राम ताज्या हृदय विभागांच्या तुलनेत (नियंत्रण, TD, MC, आणि MT) सर्व 4 कल्चर स्थितींसाठी 12 दिवसांच्या पोस्ट-कल्चरमध्ये ग्लुकोज फ्लक्सचे प्रमाण दर्शवितो (D0) (n = 6 विभाग/समूह, वेगवेगळ्या डुकरांकडून, एकतर्फी ANOVA चाचण्या केल्या गेल्या होत्या, ###p <0.00, ***1 ची तुलना D00, ***1 p <0.00 च्या तुलनेत).d ताज्या (निळा), दिवस 12 MC (हिरवा), आणि दिवस 12 MT (लाल) ऊतींचे दहा प्रादेशिक टिश्यू सेक्शन पॉइंट्सचे स्ट्रेन विश्लेषण प्लॉट्स (n = 4 स्लाइस/गट, वन-वे ANOVA चाचणी; गटांमध्ये कोणताही महत्त्वपूर्ण फरक नव्हता).e ज्वालामुखी प्लॉट 10-12 दिवसांसाठी स्थिर स्थितीत (Ctrl) किंवा MT परिस्थितीत (MT) संवर्धित हृदय विभागांच्या तुलनेत ताज्या हृदयाच्या विभागांमध्ये (D0) भिन्नपणे व्यक्त जीन्स दर्शवितो.f प्रत्येक संस्कृतीच्या परिस्थितीत संवर्धन केलेल्या हृदयाच्या विभागांसाठी सारकोमेरे जनुकांचा हीटमॅप.त्रुटी पट्ट्या सरासरी ± मानक विचलन दर्शवतात.
फॅटी ऍसिड ऑक्सिडेशनपासून ग्लायकोलिसिसकडे स्विच करण्यावर चयापचय अवलंबित्व हे कार्डिओमायोसाइट विभेदकतेचे वैशिष्ट्य आहे.अपरिपक्व कार्डिओमायोसाइट्स प्रामुख्याने एटीपी उत्पादनासाठी ग्लुकोज वापरतात आणि काही क्रिस्टे 5,32 सह हायपोप्लास्टिक माइटोकॉन्ड्रिया असतात.ग्लुकोजच्या वापराच्या विश्लेषणातून असे दिसून आले आहे की MC आणि MT परिस्थितीनुसार, ग्लुकोजचा वापर दिवसाच्या 0 ऊतींप्रमाणेच होता (आकृती 4c).तथापि, Ctrl नमुन्यांमध्ये ताज्या ऊतींच्या तुलनेत ग्लुकोजच्या वापरामध्ये लक्षणीय वाढ दिसून आली.हे सूचित करते की CTCM आणि T3/Dex चे संयोजन ऊतींची व्यवहार्यता वाढवते आणि 12-दिवसांच्या संवर्धित हृदयाच्या विभागांचे चयापचय फेनोटाइप संरक्षित करते.याव्यतिरिक्त, ताण विश्लेषणाने असे दर्शवले की MT आणि MS स्थितीत (चित्र 4d) 12 दिवस ताज्या हृदयाच्या ऊतींमध्ये ताण पातळी समान राहिली.
हृदयाच्या स्लाइस टिश्यूच्या जागतिक ट्रान्सक्रिप्शनल लँडस्केपवर CTCM आणि T3/Dex च्या एकूण प्रभावाचे विश्लेषण करण्यासाठी, आम्ही सर्व चार भिन्न संस्कृती परिस्थितींमधून (पूरक डेटा 1) कार्डियाक स्लाइसवर RNAseq केले.विशेष म्हणजे, MT विभागांनी 13,642 जनुकांपैकी फक्त 16 भिन्नपणे व्यक्त केलेल्या ताज्या हृदयाच्या ऊतींशी उच्च प्रतिलेखनात्मक समानता दर्शविली.तथापि, आम्ही आधी दाखवल्याप्रमाणे, Ctrl स्लाइसने 10-12 दिवसांनी संस्कृतीत (चित्र 4e) 1229 भिन्न जनुक प्रदर्शित केले.हृदय आणि फायब्रोब्लास्ट जनुकांच्या qRT-PCR द्वारे या डेटाची पुष्टी करण्यात आली (पूरक अंजीर. 7a-c).विशेष म्हणजे, Ctrl विभागांनी ह्रदय आणि पेशी चक्र जनुकांचे नियमन आणि दाहक जनुक कार्यक्रमांचे सक्रियकरण दर्शवले.हे डेटा सूचित करतात की विभेदन, जे सामान्यतः दीर्घकालीन संवर्धनानंतर उद्भवते, पूर्णपणे एमटी परिस्थितीत कमी होते (पूरक चित्र 8a,b).sarcomere जनुकांचा काळजीपूर्वक अभ्यास केल्याने असे दिसून आले आहे की केवळ MT परिस्थितींमध्ये sarcomere (Fig. 4f) आणि आयन चॅनेल (पूरक चित्र 9) एन्कोडिंग जनुके जतन केली जातात, Ctrl, TD, आणि MC परिस्थितींमध्ये दडपशाहीपासून त्यांचे संरक्षण करतात.हे डेटा दाखवतात की यांत्रिक आणि विनोदी उत्तेजना (T3/Dex) च्या संयोगाने, हृदयाचे तुकडे ट्रान्सक्रिप्टोम संस्कृतीत 12 दिवसांनंतर ताज्या हृदयाच्या स्लाइससारखेच राहू शकतात.
हे ट्रान्सक्रिप्शनल निष्कर्ष या वस्तुस्थितीद्वारे समर्थित आहेत की हृदयाच्या विभागातील कार्डिओमायोसाइट्सची संरचनात्मक अखंडता एमटी परिस्थितीत 12 दिवसांसाठी उत्तम प्रकारे जतन केली जाते, अखंड आणि स्थानिकीकरण 43 (चित्र 5a) द्वारे दर्शविल्याप्रमाणे.याव्यतिरिक्त, MT परिस्थितींखालील हृदयाच्या विभागातील फायब्रोसिस Ctrl च्या तुलनेत लक्षणीयरीत्या कमी झाले आणि हृदयाच्या ताज्या विभागांप्रमाणेच (Fig. 5b).हे डेटा दर्शविते की यांत्रिक उत्तेजना आणि T3/Dex उपचार यांचे संयोजन संस्कृतीत हृदयाच्या विभागांमध्ये हृदयाची रचना प्रभावीपणे संरक्षित करते.
ट्रोपोनिन-टी (हिरवा), कोनेक्झिन 43 (लाल), आणि DAPI (निळा) च्या इम्युनोफ्लोरेसेन्स प्रतिमा नव्याने विलग केलेल्या हृदयाच्या विभागात (D0) किंवा चारही हृदय विभागाच्या कल्चर परिस्थितीत 12 दिवसांसाठी संवर्धित (स्केल बार = 100 µm).). हृदयाच्या ऊतींच्या संरचनात्मक अखंडतेचे कृत्रिम बुद्धिमत्ता प्रमाणीकरण (n = 7 (D0 आणि D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC आणि D12 MT) स्लाइस/गट वेगवेगळ्या डुकरांचे, एकतर्फी ANOVA चाचणी केली जाते; ####p < 0.00 आणि ***1 <*0.00 आणि <*0.00 च्या तुलनेत ***1. D12 Ctrl च्या तुलनेत 01). हृदयाच्या ऊती संरचनात्मक अखंडतेचे कृत्रिम बुद्धिमत्ता प्रमाणीकरण (n = 7 (D0 आणि D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC आणि D12 MT) स्लाइस/गट वेगवेगळ्या डुकरांचे, एकतर्फी ANOVA चाचणी केली जाते; #### p < 0.00 आणि ***1 <*0.00 आणि <*0p च्या तुलनेत. D12 Ctrl च्या तुलनेत 01). Количественная оценка структурной целостности ткани сердца с помощью искусственного искусственного интеллекта (n = 7 (D0 आणि D12) DMCTD12 , DMCTD12 , DMC22MT , резов/группу от разных свиней, проведен однофакторный тест ANOVA; #### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 D*015 2 Ctrl). आर्टिफिशियल इंटेलिजन्स (n = 7 (D0 आणि D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC आणि D12 MT) विभाग/गट वेगवेगळ्या डुकरांचा वापर करून हृदयाच्या ऊतींच्या संरचनात्मक अखंडतेचे प्रमाणीकरण, एक-मार्गी ANOVA चाचणी केली; #### p < 0.000 आणि ***0p. <0p. <0.001 आणि <0p. <0p. 0.001 ची तुलना. D12 Ctrl च्या तुलनेत).对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC 和D12 軈牛/MT工智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 和*p < 0.05 相比，或****p < 0.0001 Ct.对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 （n = 7 （d0 和 d12 ctrl） （5 （d12 td 、 d12 mc 12 mc智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ######### p < 0.0001 与D0 和*p < 0.05 相比 0.05相比).वेगवेगळ्या डुकरांमध्ये (n = 7 (D0 आणि D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC आणि D12 MT) विभाग/गट) एकतर्फी ANOVA चाचणीसह कृत्रिम बुद्धिमत्ता वापरून हृदयाच्या ऊतींच्या संरचनात्मक अखंडतेचे प्रमाणीकरण;#### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). #### p < 0.0001 D0 च्या तुलनेत आणि *p < 0.05 किंवा ****p < 0.0001 D12 Ctrl च्या तुलनेत). b मॅसनच्या ट्रायक्रोम डाग (स्केल बार = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, आणि D12 MC), 9 (D12 MT) स्लाइसने डागलेल्या हृदयाच्या स्लाइससाठी प्रातिनिधिक प्रतिमा आणि परिमाण निश्चित करणे, 9 (D12 MT) स्लाइस केले जातात. 0001 D0 च्या तुलनेत आणि ***p < 0.001, किंवा ****p < 0.0001 D12 Ctrl च्या तुलनेत). b मॅसनच्या ट्रायक्रोम डाग (स्केल बार = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, आणि D12 MC), 9 (D12 MT) स्लाइसने डागलेल्या हृदयाच्या स्लाइससाठी प्रातिनिधिक प्रतिमा आणि परिमाण निश्चित करणे, 9 (D12 MT) स्लाइस केले जातात. 0001 D0 च्या तुलनेत आणि ***p < 0.001, किंवा ****p < 0.0001 D12 Ctrl च्या तुलनेत). b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массона (=0масбаня( 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонний тест #0п0сюсю1# тест #0сюсю1; D0 आणि ***p < 0,001 किंवा ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b मॅसनच्या ट्रायक्रोम डाग (स्केल बार = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD आणि D12 MC), 9 (D12 MT) विभाग/गट वेगवेगळ्या डुकरांचे 9 (D12 MT) विभाग/गटाने डागलेल्या हृदयाच्या विभागांची प्रातिनिधिक प्रतिमा आणि प्रमाणीकरण. 0 आणि ***p < 0.001 किंवा ****p < 0.0001 वि. D12 Ctrl). b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺= 500 µm）（n = 10Dtd10D1和D12 MC），来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方差分析；####p <0.00*1** <0.00*或****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）. b 用 मासन 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 （比例 尺 尺 尺 = 500 µm） 尺 20d0d = 500 µm） 、 d12 td 和 d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片/组，进行单因素方差分析； ，. 001,或****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）. b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромом Массона (масштабная =10dn) Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) срезов от разных свиней / группы, один- способ ANOVA; ####p < 0,0001 по < сравней, ***p < сравней, *** 0,0001 0001 по сравнению с D12 Ctrl). b मॅसन ट्रायक्रोम (स्केल बार = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD आणि D12 MC), 9 (D12 MT) विभाग वेगवेगळ्या डुकर/समूहांनी डागलेल्या हृदयाच्या विभागांची प्रातिनिधिक प्रतिमा आणि परिमाण. .001 किंवा ****p < 0.0001 D12 Ctrl च्या तुलनेत).त्रुटी पट्ट्या सरासरी ± मानक विचलन दर्शवतात.
शेवटी, कार्डियाक हायपरट्रॉफीची नक्कल करण्यासाठी सीटीसीएमच्या क्षमतेचे मूल्यांकन कार्डियाक टिश्यू स्ट्रेच वाढवून केले गेले.CTCM मध्ये, सर्वोच्च हवेच्या चेंबरचा दाब 80 mmHg वरून 80 mmHg पर्यंत वाढला.कला.(सामान्य स्ट्रेच) 140 mmHg कला पर्यंत.(Fig. 6a).हे स्ट्रेचमध्ये 32% वाढीशी संबंधित आहे (चित्र 6b), जे पूर्वी हायपरट्रॉफीमध्ये दिसल्याप्रमाणे सारकोमेर लांबी प्राप्त करण्यासाठी हृदयाच्या विभागांना आवश्यक असलेल्या संबंधित टक्केवारी स्ट्रेच म्हणून दर्शविले गेले होते.आकुंचन आणि विश्रांती दरम्यान हृदयाच्या ऊतींचा ताण आणि वेग संस्कृतीच्या सहा दिवसांमध्ये (चित्र 6c) स्थिर राहिला.एमटी स्थितीतील हृदयाच्या ऊतींना सहा दिवस सामान्य ताण (एमटी (नॉर्मल)) किंवा ओव्हरस्ट्रेच कंडिशन (एमटी (ओएस)) च्या अधीन होते.आधीच चार दिवसांच्या संस्कृतीनंतर, हायपरट्रॉफिक बायोमार्कर NT-ProBNP MT (OS) परिस्थितीत MT (सामान्य) परिस्थिती (Fig. 7a) च्या तुलनेत मध्यम मध्ये लक्षणीयरीत्या उंचावला होता.याव्यतिरिक्त, सहा दिवसांच्या संवर्धनानंतर, एमटी हृदयाच्या (सामान्य) विभागांच्या तुलनेत MT (OS) (Fig. 7b) मधील पेशींचा आकार लक्षणीय वाढला.याव्यतिरिक्त, ओव्हरस्ट्रेचड टिश्यूज (Fig. 7c) मध्ये NFATC4 परमाणु लिप्यंतरण लक्षणीयरीत्या वाढले होते.हे परिणाम हायपरडिस्टेंशन नंतर पॅथॉलॉजिकल रीमॉडेलिंगचा प्रगतीशील विकास दर्शवतात आणि CTCM डिव्हाइसचा वापर स्ट्रेच-प्रेरित कार्डियाक हायपरट्रॉफी सिग्नलिंगचा अभ्यास करण्यासाठी व्यासपीठ म्हणून केला जाऊ शकतो या संकल्पनेला समर्थन देतात.
एअर चेंबर प्रेशर, फ्लुइड चेंबर प्रेशर आणि टिश्यू हालचाली मोजण्याचे प्रातिनिधिक ट्रेस हे पुष्टी करतात की चेंबर प्रेशर फ्लुइड चेंबर प्रेशर बदलते, ज्यामुळे टिश्यू स्लाइसची संबंधित हालचाल होते.b सामान्यपणे ताणलेल्या (केशरी) आणि ओव्हरस्ट्रेच केलेल्या (निळ्या) टिश्यू विभागांसाठी प्रतिनिधी स्ट्रेच टक्केवारी आणि स्ट्रेच रेट वक्र.c बार आलेख सायकल वेळ दर्शवितो (n = 19 स्लाइस प्रति गट, वेगवेगळ्या डुकरांकडून), आकुंचन वेळ (n = 18-19 स्लाइस प्रति गट, वेगवेगळ्या डुकरांकडून), विश्रांतीची वेळ (n = 19 स्लाइस प्रति गट, वेगवेगळ्या डुकरांकडून) ), ऊतींच्या हालचालीचे मोठेपणा (n = 14 स्लाइस, वेगवेगळ्या डुकरांकडून) es/समूह, वेगवेगळ्या डुकरांकडून) आणि पीक विश्रांती दर (n = 14 (D0), 15 (D6) ) विभाग/गट) वेगवेगळ्या डुकरांकडून), दोन-पुच्छ विद्यार्थ्यांच्या टी-चाचणीने कोणत्याही पॅरामीटरमध्ये कोणताही महत्त्वपूर्ण फरक दर्शविला नाही, हे दर्शविते की हे पॅरामीटर्स ओव्हरव्होल्टेजसह संस्कृतीच्या 6 दिवसांमध्ये स्थिर राहिले.त्रुटी पट्ट्या सरासरी ± मानक विचलन दर्शवतात.
MT नॉर्मल स्ट्रेच (नॉर्म) किंवा ओव्हरस्ट्रेचिंग (OS) कंडिशन (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, आणि D4 MTOS) स्लाइसमध्ये कल्चर मीडियामधील NT-ProBNP एकाग्रतेचे बार आलेख प्रमाणीकरण. सामान्य ताणण्यासाठी). MT नॉर्मल स्ट्रेच (नॉर्म) किंवा ओव्हरस्ट्रेचिंग (OS) कंडिशन (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, आणि D4 MTOS) स्लाइसमधून कल्चर मीडियामध्ये NT-ProBNP एकाग्रतेचे बार आलेख प्रमाणीकरण; <p0/group. ** 2 pigs/group. सामान्य ताणाच्या तुलनेत).सामान्य MT स्ट्रेच (नॉर्म) किंवा ओव्हरस्ट्रेच (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, आणि D4) च्या परिस्थितीत संवर्धन केलेल्या हृदयाच्या तुकड्यांमधून संस्कृती माध्यमात NT-ProBNP एकाग्रतेचा परिमाणात्मक हिस्टोग्राम.**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p <0.01 सामान्य स्ट्रेचच्या तुलनेत). a 在MT 正常拉伸(नॉर्म) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP 浓度離 坡離MTNorm)、3（D2 MTOS、D4 MTNorm 和D4 MTOS）来自不同猪的切片/组，进行双向方差分析＋p0減減中. ). MT नॉर्मल स्ट्रेच (नॉर्म) किंवा ओव्हरस्ट्रेच (OS) परिस्थितींनुसार (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm和D4 MTOS) वेगवेगळ्या 猪的切片猪的切片猪的切片，湄湄滥人 हृदयाच्या स्लाइसमधील NT-ProBNP एकाग्रतेचे प्रमाण发发动; **सामान्य स्ट्रेचिंगच्या तुलनेत, p < ०.०१).सामान्य MT स्ट्रेच (नॉर्म) किंवा ओव्हरस्ट्रेच (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) आणि D4 MTOS) स्लाइस/गट वेगवेगळ्या डुकरांचे दोन-वेरीएनासिस,**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p <0.01 सामान्य स्ट्रेचच्या तुलनेत). b ट्रोपोनिन-T आणि WGA (डावीकडे) सह डागलेल्या हृदयाच्या स्लाइससाठी प्रातिनिधिक प्रतिमा आणि सेल आकाराचे प्रमाणीकरण (उजवीकडे) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) पेशी/गट वेगवेगळ्या डुकरांच्या 10 वेगवेगळ्या स्लाइसमधून, दोन-पुच्छ विद्यार्थ्याने t-0p ची तुलना केली जाते; ****0 st-0p ची तुलना सामान्य आहे. b ट्रोपोनिन-T आणि WGA (डावीकडे) सह डागलेल्या हृदयाच्या तुकड्यांसाठी प्रातिनिधिक प्रतिमा आणि सेल आकाराचे प्रमाणीकरण (उजवीकडे) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) पेशी/गट वेगवेगळ्या डुकरांच्या 10 वेगवेगळ्या स्लाइसमधून, दोन-पुच्छ असलेल्या विद्यार्थ्याची तुलना t-t-0 सामान्य आहे. b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и количественного определения (3сображения срезов сердца) MTOS), 369 (D6 MTNorm) клеток/группу из 10 разных срезов от разных свиней, два- проводится хвостовой t-критерий, два- проводится хвостовой t-критерий; ***с провостовой t-критерий; ению с нормальным растяжением). b ट्रोपोनिन-T आणि AZP (डावीकडे) आणि पेशींच्या आकाराचे प्रमाणीकरण (उजवीकडे) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) पेशी/गट 10 वेगवेगळ्या डुकरांच्या, दोन-पुच्छ विद्यार्थ्याच्या 10 वेगवेगळ्या विभागांमधील पेशी/गटाने डागलेल्या हृदयाच्या विभागांच्या प्रातिनिधिक प्रतिमा. b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的心脏切片的心脏切片的代表性图 3MT来自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾学生t* 01). b calcarein-T आणि WGA (डावीकडे) आणि पेशींचा आकार (उजवीकडे) (n = 330 (D6 MTOS), 10 वेगवेगळ्या स्लाइसमधून 369 (D6 MTNorm)) पेशी/组，两方法有 चाचण्यांसह डागलेल्या हृदयाच्या तुकड्यांच्या प्रातिनिधिक प्रतिमा* p < 0.0001). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) आणि количественная оценка размева (D0MT) =63MT 369 (D6 MTNorm) из 10 различных срезов от разных свиней Клетки/группа, двусторонние критерий Стьюдента; ****p < 0, 0,0,0,0,00,000 стяжением). b ट्रोपोनिन-T आणि AZP (डावीकडे) सह डागलेल्या हृदयाच्या विभागांच्या प्रातिनिधिक प्रतिमा आणि सेल आकाराचे परिमाण (उजवीकडे) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) वेगवेगळ्या डुकरांच्या 10 वेगवेगळ्या विभागांमधून) पेशी/समूह, दोन-पुच्छ टी निकष;****p <0.0001 सामान्य ताणाच्या तुलनेत). c दिवस 0 आणि दिवस 6 MTOS हृदयाच्या स्लाइससाठी ट्रोपोनिन-T आणि NFATC4 साठी इम्युनोलालेबल केलेले आणि NFATC4 चे CMs (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) स्लाइस/गटाच्या केंद्रकातील स्थानांतराचे प्रमाणीकरण वेगवेगळ्या डुकरांकडून केले जाते. c दिवस 0 आणि दिवस 6 MTOS हृदयाच्या तुकड्यांसाठी ट्रोपोनिन-T आणि NFATC4 साठी इम्युनोलालेबल केलेले आणि NFATC4 चे CMs (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) स्लाइस/गटाच्या केंद्रकातील स्थानांतराचे परिमाण निश्चित करणे. c Репрезентативные изображения для срезов сердца 0 и 6 дней MTOS, иммуномеченых для тропонина-Т и NFATC4, и Nцображения для срезов сердца FATC4 в ядра кавернозных клеток (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срезов/группу от разных свиней , выполняется двусторонный; c 0 आणि 6 दिवसांच्या MTOS वर हृदयाच्या विभागांसाठी प्रातिनिधिक प्रतिमा, ट्रोपोनिन-टी आणि NFATC4 साठी इम्युनोलालेबल केलेले, आणि कॅव्हर्नस पेशींच्या केंद्रकातील NFATC4 लिप्यंतरणाचे प्रमाणीकरण (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) स्लाइस/गट दोन वेगवेगळ्या डुकरांनी केले;*p <0.05). c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS 心脏切片的代表的代表的片的代表性图像代表性图叇的代表性图像茻代表性图像，代表的代表的片的代表性图像，代表思易位至CM 细胞核的量化（n = 4 (D0)、3 (D6 MTOS) 切片/组, 进行双尾学生t 检验；*p <.0. c calcanin-T आणि NFATC4 इम्युनोलालेबलिंग 第0天和第6天MTOS हृदयाच्या तुकड्यांच्या, आणि NFATC4 च्या प्रतिनिधी प्रतिमा वेगवेगळ्या NFATC4 मधून 易位至CM सेल न्यूक्लियस 的 प्रमाण 化 (n = 4 (D0) 化 (n = 4 (D0) 滶MT) , 3.间双尾学生et 电影；*p < ०.०५). c Репрезентативные изображения срезов сердца MTOS на 0 и 6 день для иммуномаркировки тропонином-Т и NFATC4 आणि NFATC4 आणि конличецов сердца MTOS в ядра CM от разных свиней (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срез/группа, два- хвостатый t-критерий Стьюдента; *p < ०,०५). c ट्रोपोनिन-टी आणि NFATC4 इम्युनोलालेबलिंगसाठी 0 आणि 6 व्या दिवशी एमटीओएस हृदयाच्या तुकड्यांच्या प्रातिनिधिक प्रतिमा आणि वेगवेगळ्या डुकरांपासून सीएमच्या केंद्रकातील NFATC4 लिप्यंतरणाचे प्रमाण निश्चित करणे (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) स्लाइस/ग्रुप, टू-पीक्रिट. * विद्यार्थी.एरर बार सरासरी ± मानक विचलन दर्शवतात.
ट्रान्सलेशनल कार्डिओव्हस्कुलर रिसर्चसाठी सेल्युलर मॉडेल्सची आवश्यकता असते जे हृदयाच्या वातावरणाचे अचूक पुनरुत्पादन करतात.या अभ्यासात, एक CTCM उपकरण विकसित केले गेले आणि वैशिष्ट्यीकृत केले गेले जे हृदयाच्या अल्ट्राथिन विभागांना उत्तेजित करू शकते.CTCM प्रणालीमध्ये शारीरिकदृष्ट्या समक्रमित इलेक्ट्रोमेकॅनिकल उत्तेजना आणि T3 आणि Dex द्रव संवर्धन समाविष्ट आहे.जेव्हा डुकराचे हृदय विभाग या घटकांच्या संपर्कात आले, तेव्हा त्यांची व्यवहार्यता, संरचनात्मक अखंडता, चयापचय क्रिया आणि ट्रान्सक्रिप्शनल अभिव्यक्ती 12 दिवसांच्या संस्कृतीनंतर ताज्या हृदयाच्या ऊतकांप्रमाणेच राहिली.याव्यतिरिक्त, हृदयाच्या ऊतींचे जास्त ताणणे हायपरएक्सटेन्शनमुळे हृदयाची हायपरट्रॉफी होऊ शकते.एकंदरीत, हे परिणाम सामान्य कार्डियाक फेनोटाइप राखण्यासाठी शारीरिक संस्कृतीच्या परिस्थितीच्या महत्त्वपूर्ण भूमिकेस समर्थन देतात आणि औषध तपासणीसाठी एक व्यासपीठ प्रदान करतात.
कार्डिओमायोसाइट्सच्या कार्यासाठी आणि जगण्यासाठी इष्टतम वातावरण तयार करण्यात अनेक घटक योगदान देतात.यातील सर्वात स्पष्ट घटक (1) इंटरसेल्युलर परस्परसंवाद, (2) इलेक्ट्रोमेकॅनिकल उत्तेजित होणे, (3) विनोदी घटक आणि (4) चयापचय सब्सट्रेट्सशी संबंधित आहेत.फिजियोलॉजिकल सेल-टू-सेल परस्परसंवादांना एक्स्ट्रासेल्युलर मॅट्रिक्सद्वारे समर्थित एकाधिक सेल प्रकारांचे जटिल त्रि-आयामी नेटवर्क आवश्यक आहे.अशा जटिल सेल्युलर परस्परसंवादांची वैयक्तिक पेशींच्या सह-संस्कृतीद्वारे विट्रोमध्ये पुनर्रचना करणे कठीण आहे, परंतु हृदयाच्या विभागांच्या ऑर्गनोटाइपिक स्वरूपाचा वापर करून ते सहज साध्य केले जाऊ शकते.
कार्डियाक फिनोटाइप 33,34,35 राखण्यासाठी कार्डिओमायोसाइट्सचे यांत्रिक ताण आणि विद्युत उत्तेजना महत्त्वपूर्ण आहेत.हायपीएससी-सीएम कंडिशनिंग आणि मॅच्युरेशनसाठी यांत्रिक उत्तेजना मोठ्या प्रमाणावर वापरली जात असताना, अलीकडेच अनेक मोहक अभ्यासांनी अक्षीय लोडिंगचा वापर करून संस्कृतीत हृदयाच्या तुकड्यांना यांत्रिक उत्तेजन देण्याचा प्रयत्न केला आहे.हे अभ्यास दर्शविते की 2D अक्षीय यांत्रिक लोडिंगचा संस्कृती दरम्यान हृदयाच्या फेनोटाइपवर सकारात्मक प्रभाव पडतो.या अभ्यासांमध्ये, हृदयाचे विभाग एकतर आयसोमेट्रिक टेन्साइल फोर्स१७, रेखीय ऑक्सोटोनिक लोडिंग १८ ने लोड केले गेले किंवा फोर्स ट्रान्सड्यूसर फीडबॅक आणि टेंशन ड्राइव्ह वापरून कार्डियाक सायकल पुन्हा तयार करण्यात आली.तथापि, या पद्धती पर्यावरणीय ऑप्टिमायझेशनशिवाय एकअक्षीय टिश्यू स्ट्रेचचा वापर करतात, परिणामी अनेक ह्रदयाची जीन्स दडपली जातात किंवा असामान्य ताणून प्रतिक्रियांशी संबंधित जनुकांची जास्त एक्सप्रेशन होते.येथे वर्णन केलेले CTCM 3D इलेक्ट्रोमेकॅनिकल उत्तेजन प्रदान करते जे सायकल वेळ आणि शारीरिक ताण (25% स्ट्रेच, 40% सिस्टोल, 60% डायस्टोल आणि 72 बीट्स प्रति मिनिट) च्या दृष्टीने नैसर्गिक हृदय चक्राची नक्कल करते.जरी हे त्रि-आयामी यांत्रिक उत्तेजना केवळ ऊतकांची अखंडता राखण्यासाठी पुरेशी नसली तरी, ऊतींची व्यवहार्यता, कार्य आणि अखंडता पुरेशा प्रमाणात राखण्यासाठी T3/Dex वापरून विनोदी आणि यांत्रिक उत्तेजनांचे संयोजन आवश्यक आहे.
प्रौढ हृदयाच्या फेनोटाइपमध्ये बदल करण्यात विनोदी घटक महत्त्वाची भूमिका बजावतात.हे HiPS-CM अभ्यासामध्ये हायलाइट केले गेले ज्यामध्ये T3 आणि Dex हे सेल मॅच्युरेशनला गती देण्यासाठी कल्चर मीडियामध्ये जोडले गेले.T3 पेशींच्या पडद्यावरील अमीनो ऍसिड, शर्करा आणि कॅल्शियमच्या वाहतुकीवर प्रभाव टाकू शकतो.याव्यतिरिक्त, T3 MHC-α अभिव्यक्ती आणि MHC-β डाउनरेग्युलेशनला प्रोत्साहन देते, गर्भाच्या सीएममधील स्लो ट्विच मायोफिब्रिल्सच्या तुलनेत परिपक्व कार्डिओमायोसाइट्समध्ये जलद ट्विच मायोफिब्रिल्सच्या निर्मितीस प्रोत्साहन देते.हायपोथायरॉईड रूग्णांमध्ये T3 च्या कमतरतेमुळे मायोफिब्रिलर बँड नष्ट होतात आणि टोन विकासाचा दर कमी होतो37.डेक्स ग्लुकोकॉर्टिकोइड रिसेप्टर्सवर कार्य करते आणि पृथक परफ्यूज केलेल्या हृदयांमध्ये मायोकार्डियल आकुंचन वाढवते असे दिसून आले आहे;38 ही सुधारणा कॅल्शियम डिपॉझिट-चालित एंट्री (SOCE) 39,40 वरील परिणामाशी संबंधित असल्याचे मानले जाते.याव्यतिरिक्त, डेक्स त्याच्या रिसेप्टर्सशी बांधला जातो, ज्यामुळे एक व्यापक इंट्रासेल्युलर प्रतिसाद होतो जो रोगप्रतिकारक कार्य आणि जळजळ दाबतो30.
आमचे परिणाम असे सूचित करतात की भौतिक यांत्रिक उत्तेजना (MS) ने Ctrl च्या तुलनेत एकूण संस्कृती कार्यप्रदर्शन सुधारले, परंतु संस्कृतीत 12 दिवसांत व्यवहार्यता, संरचनात्मक अखंडता आणि हृदयाची अभिव्यक्ती राखण्यात अयशस्वी झाले.Ctrl च्या तुलनेत, CTCM (MT) संस्कृतींमध्ये T3 आणि Dex जोडल्याने व्यवहार्यता सुधारली आणि 12 दिवसांसाठी ताज्या हृदयाच्या ऊतीसह समान ट्रान्सक्रिप्शन प्रोफाइल, संरचनात्मक अखंडता आणि चयापचय क्रिया कायम राखली.याव्यतिरिक्त, टिश्यू स्ट्रेचची डिग्री नियंत्रित करून, एसटीसीएम वापरून हायपरएक्सटेन्शन-प्रेरित कार्डियाक हायपरट्रॉफी मॉडेल तयार केले गेले, जे एसटीसीएम प्रणालीची अष्टपैलुत्व दर्शवते.हे लक्षात घेतले पाहिजे की जरी कार्डियाक रीमॉडेलिंग आणि फायब्रोसिसमध्ये सामान्यत: अखंड अवयवांचा समावेश असतो ज्यांच्या रक्ताभिसरण पेशी योग्य साइटोकिन्स तसेच फॅगोसाइटोसिस आणि इतर रीमॉडेलिंग घटक प्रदान करू शकतात, तरीही हृदयाचे विभाग तणाव आणि आघातांच्या प्रतिसादात फायब्रोटिक प्रक्रियेची नक्कल करू शकतात.myofibroblasts मध्ये.या कार्डियाक स्लाइस मॉडेलमध्ये यापूर्वी याचे मूल्यमापन केले गेले आहे.हे लक्षात घ्यावे की टाकीकार्डिया, ब्रॅडीकार्डिया आणि यांत्रिक रक्ताभिसरण समर्थन (यांत्रिक अनलोड केलेले हृदय) यांसारख्या अनेक परिस्थितींचे अनुकरण करण्यासाठी दाब/विद्युत मोठेपणा आणि वारंवारता बदलून CTCM पॅरामीटर्स सुधारित केले जाऊ शकतात.हे प्रणालीला औषध चाचणीसाठी एक माध्यम थ्रूपुट बनवते.अतिश्रम-प्रेरित कार्डियाक हायपरट्रॉफी मॉडेल करण्यासाठी CTCM ची क्षमता वैयक्तिकृत थेरपीसाठी या प्रणालीची चाचणी करण्याचा मार्ग मोकळा करते.शेवटी, सध्याचा अभ्यास दर्शवितो की ह्रदयाच्या ऊती विभागांची संस्कृती राखण्यासाठी यांत्रिक ताण आणि विनोदी उत्तेजना महत्त्वपूर्ण आहेत.
जरी येथे सादर केलेला डेटा सूचित करतो की सीटीसीएम अखंड मायोकार्डियम मॉडेलिंगसाठी एक अतिशय आशादायक व्यासपीठ आहे, या संस्कृती पद्धतीला काही मर्यादा आहेत.सीटीसीएम कल्चरची मुख्य मर्यादा ही आहे की ती स्लाइसवर सतत डायनॅमिक मेकॅनिकल स्ट्रेस लादते, जे प्रत्येक चक्रादरम्यान ह्रदयाच्या स्लाइसच्या आकुंचनांवर सक्रियपणे लक्ष ठेवण्याची क्षमता टाळते.याव्यतिरिक्त, कार्डियाक विभाग (7 मिमी) च्या लहान आकारामुळे, पारंपारिक फोर्स सेन्सर वापरून कल्चर सिस्टमच्या बाहेर सिस्टोलिक फंक्शनचे मूल्यांकन करण्याची क्षमता मर्यादित आहे.सध्याच्या हस्तलिखितामध्ये, कॉन्ट्रॅक्टाइल फंक्शनचे सूचक म्हणून ऑप्टिकल व्होल्टेजचे मूल्यांकन करून आम्ही अंशतः या मर्यादेवर मात करतो.तथापि, या मर्यादेसाठी पुढील कामाची आवश्यकता असेल आणि भविष्यात कॅल्शियम आणि व्होल्टेज-संवेदनशील रंगांचा वापर करून ऑप्टिकल मॅपिंगसारख्या संस्कृतीतील हृदयाच्या तुकड्यांच्या कार्याचे ऑप्टिकल निरीक्षण करण्याच्या पद्धती सादर करून संबोधित केले जाऊ शकते.CTCM ची आणखी एक मर्यादा म्हणजे कार्यरत मॉडेल शारीरिक ताण (प्रीलोड आणि आफ्टरलोड) हाताळत नाही.CTCM मध्ये, डायस्टोल (पूर्ण स्ट्रेच) आणि सिस्टोल (विद्युत उत्तेजना दरम्यान आकुंचनची लांबी) खूप मोठ्या ऊतकांमध्ये 25% शारीरिक ताण पुनरुत्पादित करण्यासाठी विरुद्ध दिशेने दबाव आणला गेला.ही मर्यादा भविष्यातील CTCM रचनांमध्ये दोन्ही बाजूंनी हृदयाच्या ऊतींवर पुरेसा दाब देऊन आणि हृदयाच्या कक्षांमध्ये उद्भवणारे अचूक दाब-खंड संबंध लागू करून काढून टाकली पाहिजे.
या हस्तलिखितात नोंदवलेले ओव्हरस्ट्रेच-प्रेरित रीमॉडेलिंग हायपरट्रॉफिक हायपरस्ट्रेच सिग्नल्सची नक्कल करण्यापुरते मर्यादित आहे.अशाप्रकारे, हे मॉडेल स्ट्रेच-प्रेरित हायपरट्रॉफिक सिग्नलिंगच्या अभ्यासात विनोदी किंवा न्यूरल घटकांची आवश्यकता न ठेवता मदत करू शकते (जे या प्रणालीमध्ये अस्तित्वात नाहीत).CTCM ची बाहुल्यता वाढवण्यासाठी पुढील अभ्यासांची आवश्यकता आहे, उदाहरणार्थ, रोगप्रतिकारक पेशींसह सह-संवर्धन, रक्ताभिसरण प्लाझ्मा ह्युमरल घटक, आणि न्यूरोनल पेशींसह सह-संवर्धन करताना CTCM सह रोग मॉडेलिंगची शक्यता सुधारेल.
या अभ्यासात तेरा डुकरांचा वापर करण्यात आला.सर्व प्राणी प्रक्रिया संस्थात्मक मार्गदर्शक तत्त्वांनुसार केल्या गेल्या आणि लुईव्हिल विद्यापीठाच्या संस्थात्मक प्राणी काळजी आणि वापर समितीने मंजूर केले.महाधमनी कमान बंद करण्यात आली होती आणि हृदयाला 1 L निर्जंतुकीकरण कार्डिओप्लेजिया (110 mM NaCl, 1.2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 U/mL हेपरिन, pH 7 पर्यंत) ने सुगंधित केले होते; बर्फावरील प्रयोगशाळेत नेले जाईपर्यंत ह्रदये बर्फ-थंड कार्डिओप्लेजिक द्रावणात जतन केली जातात जी सामान्यतः <10 मिनिट असते. बर्फावरील प्रयोगशाळेत नेले जाईपर्यंत ह्रदये बर्फ-थंड कार्डिओप्लेजिक द्रावणात जतन केली जातात जी सामान्यतः <10 मिनिट असते. сердца хранили в ледяном кардиоплегическом растворе до транспортировки в лабораторию на льду, что обычно занимает <10 мин. बर्फावरील प्रयोगशाळेत नेले जाईपर्यंत हृदय बर्फ-थंड कार्डिओप्लेजिक द्रावणात साठवले जाते, ज्यास सहसा <10 मिनिटे लागतात.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中,直到冰上运送到实验室,通常<10分钟.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中,直到冰上运送到实验室,通常<10分钟. Держите сердца в ледяной кардиоплегии до транспортировки в лабораторию на льду, обычно <10 min. बर्फावरील प्रयोगशाळेत वाहतूक होईपर्यंत हृदयाला बर्फाच्या कार्डिओप्लेजियावर ठेवा, सामान्यतः <10 मिनिटे.
CTCM उपकरण सॉलिडवर्क्स कॉम्प्युटर-एडेड डिझाइन (CAD) सॉफ्टवेअरमध्ये विकसित केले गेले.कल्चर चेंबर्स, डिव्हायडर आणि एअर चेंबर्स सीएनसी क्लिअर अॅक्रेलिक प्लास्टिकचे बनलेले आहेत.7 मिमी व्यासाची बॅक-अप रिंग मध्यभागी उच्च घनतेच्या पॉलीथिलीन (HDPE) ने बनलेली आहे आणि खाली मीडिया सील करण्यासाठी वापरल्या जाणार्‍या सिलिकॉन ओ-रिंगला सामावून घेण्यासाठी ओ-रिंग ग्रूव्ह आहे.एक पातळ सिलिका झिल्ली कल्चर चेंबरला विभक्त प्लेटपासून वेगळे करते.सिलिकॉन झिल्ली 0.02″ जाडीच्या सिलिकॉन शीटपासून लेसर कापलेली आहे आणि त्याची कडकपणा 35A आहे.खालच्या आणि वरच्या सिलिकॉन गॅस्केट्स 1/16″ जाड सिलिकॉन शीटपासून लेझर कापल्या जातात आणि त्यांची कडकपणा 50A आहे.ब्लॉकला बांधण्यासाठी आणि हवाबंद सील तयार करण्यासाठी 316L स्टेनलेस स्टीलचे स्क्रू आणि विंग नट वापरले जातात.
एक समर्पित मुद्रित सर्किट बोर्ड (PCB) C-PACE-EM प्रणालीसह एकत्रित करण्यासाठी डिझाइन केले आहे.PCB वरील स्विस मशीन कनेक्टर सॉकेट्स ग्रेफाइट इलेक्ट्रोडशी सिल्व्हर-प्लेटेड कॉपर वायर्स आणि ब्राँझ 0-60 स्क्रूने इलेक्ट्रोड्समध्ये जोडलेले असतात.मुद्रित सर्किट बोर्ड 3D प्रिंटरच्या कव्हरमध्ये ठेवलेला आहे.
सीटीसीएम उपकरण प्रोग्रामेबल न्यूमॅटिक अॅक्ट्युएटर (PPD) द्वारे नियंत्रित केले जाते जे हृदय चक्राप्रमाणे नियंत्रित रक्ताभिसरण दाब तयार करते.जसजसे एअर चेंबरच्या आतील दाब वाढतो, लवचिक सिलिकॉन पडदा वरच्या दिशेने विस्तारतो, ज्यामुळे ऊतींच्या जागेखाली मध्यम भाग पडतो.डायस्टोल दरम्यान हृदयाच्या शारीरिक विस्ताराची नक्कल करून द्रवपदार्थाच्या या निष्कासनामुळे ऊतकांचे क्षेत्र ताणले जाईल.विश्रांतीच्या शिखरावर, ग्रेफाइट इलेक्ट्रोड्सद्वारे विद्युत उत्तेजना लागू केली गेली, ज्यामुळे हवेच्या चेंबरमध्ये दबाव कमी झाला आणि ऊतींचे विभाग संकुचित झाले.पाईपच्या आत एक हेमोस्टॅटिक व्हॉल्व्ह आहे ज्यामध्ये हवेच्या यंत्रणेतील दाब शोधण्यासाठी दबाव सेन्सर आहे.प्रेशर सेन्सरद्वारे जाणवलेला दबाव लॅपटॉपशी जोडलेल्या डेटा कलेक्टरवर लागू केला जातो.हे गॅस चेंबरच्या आतील दाबांचे सतत निरीक्षण करण्यास अनुमती देते.जेव्हा कमाल चेंबर प्रेशर गाठले गेले (मानक 80 mmHg, 140 mmHg OS), डेटा संपादन यंत्रास C-PACE-EM सिस्टमला 2 ms साठी biphasic व्होल्टेज सिग्नल तयार करण्यासाठी सिग्नल पाठवण्याचा आदेश देण्यात आला, 4 V वर सेट केला गेला.
हृदयाचे विभाग प्राप्त केले गेले आणि 6 विहिरींमधील संस्कृतीची स्थिती खालीलप्रमाणे केली गेली: कापणी केलेल्या हृदयांना हस्तांतरण पात्रातून थंड (4° से.) कार्डिओप्लेजिया असलेल्या ट्रेमध्ये स्थानांतरित करा.डाव्या वेंट्रिकलला निर्जंतुकीकरण ब्लेडने वेगळे केले आणि 1-2 सेमी 3 चे तुकडे केले.हे टिश्यू ब्लॉक्स टिश्यू अॅडेसिव्हसह टिश्यू सपोर्ट्सला जोडलेले होते आणि टायरोडचे द्रावण असलेल्या कंपनशील मायक्रोटोम टिश्यू बाथमध्ये ठेवलेले होते आणि सतत ऑक्सिजनयुक्त (3 g/L 2,3-butanedione monooxime (BDM), 140 mM NaCl (8.18 g), m10m-4m.4m. ल्युकोज (1.86 ग्रॅम), 10 एमएम एचईपीईएस (2.38 ग्रॅम), 1 एमएम एमजीसीएल2 (1 मिली 1 एम सोल्यूशन), 1.8 एमएम सीएसीएल2 (1.8 मिली 1 एम सोल्यूशन), 1 एल डीडीएच2ओ पर्यंत).कंपन करणारा मायक्रोटोम 80 Hz च्या वारंवारतेवर 300 µm जाडीचे तुकडे कापण्यासाठी, 2 मिमीच्या क्षैतिज कंपनाचे मोठेपणा आणि 0.03 mm/s च्या आगाऊ दराने सेट केले होते.ऊतींचे आंघोळ द्रावण थंड ठेवण्यासाठी बर्फाने वेढलेले होते आणि तापमान 4°C वर राखले होते.मायक्रोटोम बाथमधून ऊतींचे विभाग एका कल्चर प्लेटसाठी पुरेसे विभाग मिळेपर्यंत बर्फावर सतत ऑक्सिजनयुक्त टायरोड द्रावण असलेल्या उष्मायन बाथमध्ये स्थानांतरित करा.ट्रान्सवेल कल्चरसाठी, ऊतींचे विभाग निर्जंतुकीकरण 6 मिमी रुंद पॉलीयुरेथेन सपोर्ट्सशी जोडलेले होते आणि 6 मिली ऑप्टिमाइझ्ड माध्यमात ठेवले होते (199 मध्यम, 1x ITS सप्लीमेंट, 10% FBS, 5 ng/ml VEGF, 10 ng/ml FGF-alkaline antibiotic and 2 ng).C-Pace द्वारे ऊती विभागांवर विद्युत उत्तेजना (10 V, वारंवारता 1.2 Hz) लागू केली गेली.TD स्थितींसाठी, प्रत्येक मध्यम बदलावर ताजे T3 आणि Dex 100 nM आणि 1 μM वर जोडले गेले.दिवसातून 3 वेळा बदलण्यापूर्वी माध्यम ऑक्सिजनसह संतृप्त होते.ऊतींचे विभाग एका इनक्यूबेटरमध्ये 37°C आणि 5% CO2 वर संवर्धन केले गेले.
सीटीसीएम कल्चरसाठी, टिश्यू विभाग सुधारित टायरोडचे द्रावण असलेल्या पेट्री डिशमध्ये सानुकूल-निर्मित 3D प्रिंटरवर ठेवले होते.सपोर्ट रिंगच्या क्षेत्रफळाच्या 25% ने हृदयाच्या स्लाइसचा आकार वाढविण्यासाठी डिव्हाइस डिझाइन केले आहे.हे असे केले जाते की टायरोडच्या द्रावणातून माध्यमात आणि डायस्टोल दरम्यान हस्तांतरित केल्यानंतर हृदयाचे विभाग ताणले जात नाहीत.हिस्टोअॅक्रिलिक गोंद वापरून, 7 मिमी व्यासाच्या सपोर्ट रिंगवर 300 µm जाडीचे विभाग निश्चित केले गेले.सपोर्ट रिंगला टिश्यूचे विभाग जोडल्यानंतर, जास्तीचे टिश्यूचे विभाग कापून टाका आणि जोडलेले टिश्यू सेक्शन परत टायरोड सोल्यूशनच्या बाथमध्ये बर्फावर (4°C) ठेवा जोपर्यंत एका उपकरणासाठी पुरेसे विभाग तयार होत नाहीत.सर्व उपकरणांसाठी एकूण प्रक्रिया वेळ 2 तासांपेक्षा जास्त नसावा.6 टिश्यू विभाग त्यांच्या सपोर्ट रिंगला जोडल्यानंतर, CTCM यंत्र एकत्र केले गेले.CTCM कल्चर चेंबर 21 मिली प्री-ऑक्सिजनयुक्त माध्यमाने पूर्व-भरलेले आहे.टिश्यू विभाग कल्चर चेंबरमध्ये स्थानांतरित करा आणि विंदुकाने कोणतेही हवाई फुगे काळजीपूर्वक काढून टाका.टिश्यू विभाग नंतर भोक मध्ये निर्देशित केला जातो आणि हळूवारपणे त्या जागी दाबला जातो.शेवटी, इलेक्ट्रोड कॅप डिव्हाइसवर ठेवा आणि डिव्हाइस इनक्यूबेटरमध्ये स्थानांतरित करा.नंतर CTCM ला एअर ट्यूब आणि C-PACE-EM प्रणालीशी जोडा.वायवीय अॅक्ट्युएटर उघडतो आणि एअर व्हॉल्व्ह CTCM उघडतो.C-PACE-EM प्रणाली 2 ms साठी biphasic pacing दरम्यान 1.2 Hz वर 4 V वितरीत करण्यासाठी कॉन्फिगर करण्यात आली होती.इलेक्ट्रोड्सवर ग्रेफाइट जमा होऊ नये म्हणून माध्यम दिवसातून दोनदा आणि इलेक्ट्रोड दिवसातून एकदा बदलले गेले.आवश्यक असल्यास, ऊतींचे विभाग त्यांच्या संस्कृतीच्या विहिरीतून काढून टाकले जाऊ शकतात जेणेकरून त्यांच्याखाली पडलेले कोणतेही हवेचे फुगे बाहेर काढले जाऊ शकतात.MT उपचार परिस्थितीसाठी, T3/Dex 100 nM T3 आणि 1 μM Dex सह प्रत्येक मध्यम बदलासह ताजे जोडले गेले.CTCM उपकरणे एका इनक्यूबेटरमध्ये 37°C आणि 5% CO2 वर संवर्धन केली गेली.
हृदयाच्या तुकड्यांचे ताणलेले मार्ग मिळविण्यासाठी, एक विशेष कॅमेरा प्रणाली विकसित केली गेली.एक SLR कॅमेरा (Canon Rebel T7i, Canon, Tokyo, Japan) Navitar Zoom 7000 18-108mm मॅक्रो लेन्स (Navitar, San Francisco, CA) सह वापरला गेला.ताज्या माध्यमाने माध्यम बदलल्यानंतर खोलीच्या तपमानावर व्हिज्युअलायझेशन केले गेले.कॅमेरा 51° कोनात स्थित आहे आणि 30 फ्रेम्स प्रति सेकंदात व्हिडिओ रेकॉर्ड केला जातो.प्रथम, ओपन सोर्स सॉफ्टवेअर (MUSCLEMOTION43) इमेज-J सह हृदयाच्या तुकड्यांची गती मोजण्यासाठी वापरण्यात आले.हा मुखवटा MATLAB (MathWorks, Natick, MA, USA) वापरून आवाज टाळण्यासाठी हृदयाचे तुकडे ठोकण्यासाठी स्वारस्य असलेले क्षेत्र परिभाषित करण्यासाठी तयार केले गेले.मॅन्युअली सेगमेंट केलेले मुखवटे सर्व प्रतिमांवर फ्रेम क्रमाने लागू केले जातात आणि नंतर ते MUSCLEMOTION प्लग-इनमध्ये पास केले जातात.मसल मोशन प्रत्येक फ्रेममधील पिक्सेलच्या सरासरी तीव्रतेचा वापर संदर्भ फ्रेमच्या सापेक्ष त्याची हालचाल मोजण्यासाठी करते.डेटा रेकॉर्ड केला गेला, फिल्टर केला गेला आणि सायकलचा वेळ मोजण्यासाठी आणि कार्डियाक सायकल दरम्यान टिश्यू स्ट्रेचचे मूल्यांकन करण्यासाठी वापरला गेला.रेकॉर्ड केलेला व्हिडिओ फर्स्ट-ऑर्डर शून्य-फेज डिजिटल फिल्टर वापरून पोस्ट-प्रक्रिया करण्यात आला.टिश्यू स्ट्रेच (पीक-टू-पीक) मोजण्यासाठी, रेकॉर्ड केलेल्या सिग्नलमधील शिखर आणि कुंड यांच्यातील फरक ओळखण्यासाठी पीक-टू-पीक विश्लेषण केले गेले.या व्यतिरिक्त, सिग्नल ड्रिफ्ट दूर करण्यासाठी 6व्या क्रमाचा बहुपद वापरून डिट्रेंडिंग केले जाते.ग्लोबल टिश्यू मोशन, सायकल वेळ, विश्रांतीची वेळ आणि आकुंचन वेळ (पूरक प्रोग्राम कोड 44) निर्धारित करण्यासाठी MATLAB मध्ये प्रोग्राम कोड विकसित केला गेला.
ताण विश्लेषणासाठी, यांत्रिक स्ट्रेच असेसमेंटसाठी तयार केलेले समान व्हिडिओ वापरून, आम्ही प्रथम MUSCLEMOTION सॉफ्टवेअरनुसार गती शिखरे (सर्वोच्च (वरच्या) आणि सर्वात कमी (कमी) गतीचे बिंदू दर्शविणाऱ्या दोन प्रतिमा शोधल्या.त्यानंतर आम्ही ऊतींचे क्षेत्र विभाजित केले आणि खंडित ऊतकांवर शेडिंग अल्गोरिदमचा एक प्रकार लागू केला (पूरक चित्र 2a).त्यानंतर खंडित ऊतींचे दहा उपसफेसमध्ये विभाजन केले गेले आणि प्रत्येक पृष्ठभागावरील ताण खालील समीकरण वापरून मोजला गेला: ताण = (Sup-Sdown)/Sdown, जेथे Sup आणि Sdown हे फॅब्रिकच्या वरच्या आणि खालच्या सावल्यांपासून आकाराचे अंतर आहेत (पूरक अंजीर. .2b).
हृदयाचे विभाग 4% पॅराफॉर्मल्डिहाइडमध्ये 48 तासांसाठी निश्चित केले गेले.1 तासासाठी 10% आणि 20% सुक्रोजमध्ये स्थिर ऊतींचे निर्जलीकरण होते, नंतर रात्रभर 30% सुक्रोजमध्ये.नंतर विभाग इष्टतम कटिंग तापमान कंपाऊंड (OCT कंपाऊंड) मध्ये एम्बेड केले गेले आणि हळूहळू आयसोपेंटेन/ड्राय आइस बाथमध्ये गोठवले गेले.OCT एम्बेडिंग ब्लॉक्स वेगळे होईपर्यंत -80 °C वर साठवा.स्लाइड्स 8 μm च्या जाडीसह विभाग म्हणून तयार केल्या गेल्या.
हृदयाच्या विभागांमधून OCT काढून टाकण्यासाठी, 5 मिनिटांसाठी 95 °C तापमानावर स्लाइड्स गरम करा.प्रत्येक स्लाइडमध्ये 1 मिली पीबीएस घाला आणि खोलीच्या तपमानावर 30 मिनिटे उष्मायन करा, नंतर खोलीच्या तपमानावर 15 मिनिटांसाठी पीबीएसमध्ये 0.1% ट्रायटन-एक्स सेट करून विभागांमध्ये झिरपू द्या.विशिष्ट नसलेल्या प्रतिपिंडांना नमुन्याशी जोडण्यापासून रोखण्यासाठी, स्लाइड्समध्ये 1 मिली 3% BSA द्रावण घाला आणि खोलीच्या तपमानावर 1 तास उष्मायन करा.त्यानंतर BSA काढून टाकण्यात आले आणि स्लाइड्स PBS ने धुतल्या गेल्या.प्रत्येक नमुना पेन्सिलने चिन्हांकित करा.प्राथमिक प्रतिपिंड (1% BSA मध्ये 1:200 पातळ केले) (connexin 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) आणि ट्रोपोनिन-T (थर्मो सायंटिफिक; #MA5-12960) 90 मिनिटांत जोडले गेले, नंतर 1% ऍन्टीबॉडीज (बीएसए 200 विरुद्ध 1%) दुय्यम वापरण्यात आले. Fluor 488 (थर्मो सायंटिफिक; #A16079), सशाच्या विरूद्ध Alexa Fluor 594 (थर्मो सायंटिफिक; #T6391) अतिरिक्त 90 मिनिटांसाठी PBS सह 3 वेळा धुतले पार्श्वभूमीपासून लक्ष्याचे डाग वेगळे करण्यासाठी, आम्ही फक्त दुय्यम प्रतिपिंडाचा वापर नियंत्रण म्हणून केला. शेवटी, न्यूक्लियर व्हीडीए (VINDAILD) मध्ये जोडले गेले. प्रयोगशाळा) आणि नेल पॉलिशसह सीलबंद. -x मॅग्निफिकेशन) आणि 40x मॅग्निफिकेशनसह कीन्स मायक्रोस्कोप.
WGA-Alexa Fluor 555 (थर्मो सायंटिफिक; #W32464) PBS मध्ये 5 μg/ml वर WGA स्टेनिंगसाठी वापरला गेला आणि खोलीच्या तपमानावर 30 मिनिटांसाठी निश्चित विभागांवर लागू केला गेला.नंतर स्लाइड्स पीबीएसने धुतल्या गेल्या आणि प्रत्येक स्लाइडमध्ये सुदान ब्लॅक जोडला गेला आणि 30 मिनिटांसाठी उष्मायन केले गेले.स्लाइड्स नंतर पीबीएसने धुतल्या गेल्या आणि व्हेक्टशील्ड एम्बेडिंग माध्यम जोडले गेले.स्लाइड्स 40x मॅग्निफिकेशनवर कीन्स मायक्रोस्कोपवर दृश्यमान केल्या गेल्या.
वर वर्णन केल्याप्रमाणे नमुन्यांमधून OCT काढला गेला.ओसीटी काढून टाकल्यानंतर, स्लाईड्स बौइनच्या द्रावणात रात्रभर बुडवा.स्लाइड्स नंतर 1 तासासाठी डिस्टिल्ड पाण्याने धुवून नंतर 10 मिनिटांसाठी बिब्रिच कोरफड ऍसिड फुचसिनच्या द्रावणात ठेवल्या गेल्या.नंतर स्लाइड्स डिस्टिल्ड पाण्याने धुऊन 5% फॉस्फोमोलिब्डेनम/5% फॉस्फोटंगस्टिक ऍसिडच्या द्रावणात 10 मिनिटे ठेवल्या गेल्या.स्वच्छ धुवल्याशिवाय, स्लाइड्स थेट अॅनिलिन ब्लू सोल्युशनमध्ये 15 मिनिटांसाठी हस्तांतरित करा.नंतर स्लाइड्स डिस्टिल्ड पाण्याने धुऊन 1% ऍसिटिक ऍसिडच्या द्रावणात 2 मिनिटे ठेवल्या गेल्या.स्लाइड्स 200 N इथेनॉलमध्ये वाळल्या आणि xylene मध्ये हस्तांतरित केल्या.10x उद्दिष्टासह कीन्स मायक्रोस्कोप वापरून स्टेन्ड स्लाईड्स व्हिज्युअलाइज केल्या गेल्या.कीन्स विश्लेषक सॉफ्टवेअर वापरून फायब्रोसिस क्षेत्राची टक्केवारी मोजली गेली.
काही बदलांसह निर्मात्याच्या प्रोटोकॉलनुसार CyQUANT™ MTT सेल व्हायबिलिटी परख (Invitrogen, Carlsbad, CA), कॅटलॉग क्रमांक V13154.विशेषतः, एमटीटी विश्लेषणादरम्यान एकसमान ऊतक आकार सुनिश्चित करण्यासाठी 6 मिमी व्यासासह सर्जिकल पंच वापरला गेला.निर्मात्याच्या प्रोटोकॉलनुसार एमटीटी सब्सट्रेट असलेल्या 12-वेल प्लेटच्या विहिरींमध्ये ऊतक वैयक्तिकरित्या प्लेट केले गेले.विभाग 37 डिग्री सेल्सिअस तापमानात 3 तास उबवले जातात आणि जिवंत ऊतक एमटीटी सब्सट्रेटचे चयापचय करून जांभळा फॉर्मझान कंपाऊंड तयार करतात.MTT द्रावण 1 ml DMSO ने बदला आणि 37 °C वर 15 मिनिटांसाठी हृदयाच्या विभागांमधून जांभळा फॉर्मॅझन काढण्यासाठी उबवा.नमुने 1:10 DMSO मध्ये 96-वेल क्लिअर तळाच्या प्लेट्समध्ये पातळ केले गेले आणि जांभळ्या रंगाची तीव्रता सायटेशन प्लेट रीडर (बायोटेक) वापरून 570 nm वर मोजली गेली.हृदयाच्या प्रत्येक तुकड्याच्या वजनानुसार वाचन सामान्य केले गेले.
आधी वर्णन केल्याप्रमाणे ग्लुकोजच्या वापरासाठी 1 μCi/ml [5-3H]-ग्लूकोज (मोरावेक बायोकेमिकल्स, ब्रेआ, सीए, यूएसए) असलेल्या माध्यमाने हृदयाच्या तुकड्यांच्या माध्यमाची जागा बदलण्यात आली.उष्मायनाच्या 4 तासांनंतर, 0.2 N HCl च्या 100 μl असलेल्या खुल्या मायक्रोसेन्ट्रीफ्यूज ट्यूबमध्ये 100 μl मध्यम जोडा.नंतर 37°C तापमानावर 72 तासांसाठी [3H]2O बाष्पीभवन करण्यासाठी 500 μl dH2O असलेली सिंटिलेशन ट्यूबमध्ये ट्यूब ठेवली गेली.नंतर सिंटिलेशन ट्यूबमधून मायक्रोसेन्ट्रीफ्यूज ट्यूब काढून टाका आणि 10 मिली सिंटिलेशन फ्लुइड घाला.ट्राय-कार्ब 2900TR लिक्विड सिंटिलेशन विश्लेषक (पॅकार्ड बायोसायन्स कंपनी, मेरिडेन, सीटी, यूएसए) वापरून सिंटिलेशन मोजणी केली गेली.त्यानंतर ग्लुकोजच्या वापराची गणना [5-3H]-ग्लूकोज विशिष्ट क्रियाकलाप, अपूर्ण समतोल आणि पार्श्वभूमी, [5-3H]-लेबल नसलेल्या ग्लुकोजचे सौम्य करणे, आणि सिंटिलेशन काउंटर कार्यक्षमता लक्षात घेऊन केली गेली.हृदयाच्या विभागांच्या वस्तुमानापर्यंत डेटा सामान्यीकृत केला जातो.
ट्रायझोलमध्ये टिश्यू एकजिनसीकरणानंतर, निर्मात्याच्या प्रोटोकॉलनुसार Qiagen miRNeasy मायक्रो किट #210874 वापरून RNA हृदय विभागांपासून वेगळे केले गेले.RNAsec लायब्ररीची तयारी, अनुक्रम आणि डेटा विश्लेषण खालीलप्रमाणे केले गेले:
आरएनए लायब्ररीच्या तयारीसाठी प्रति नमुना 1 μg आरएनए प्रारंभिक सामग्री म्हणून वापरला गेला.निर्मात्याच्या शिफारशींचे पालन करून NEBNext UltraTM RNA Library Preparation Kit for Illumina (NEB, USA) वापरून सिक्वेन्सिंग लायब्ररी व्युत्पन्न करण्यात आली आणि प्रत्येक नमुन्यासाठी विशेषता अनुक्रमांमध्ये अनुक्रमणिका कोड जोडले गेले.थोडक्यात, पॉली-टी ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्ससह जोडलेले चुंबकीय मणी वापरून एकूण आरएनएमधून mRNA शुद्ध केले गेले.NEBNext First Strand Synthesis Reaction Buffer (5X) मध्ये उच्च तापमानात divalent cations वापरून फ्रॅगमेंटेशन केले जाते.प्रथम स्ट्रँड सीडीएनए यादृच्छिक हेक्सॅमर प्राइमर्स आणि M-MuLV रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्टेस (RNase H-) वापरून संश्लेषित केले गेले.दुसरा स्ट्रँड cDNA नंतर डीएनए पॉलिमरेझ I आणि RNase H वापरून संश्लेषित केला जातो. उर्वरित ओव्हरहॅंग्स एक्सोन्यूक्लीझ/पॉलिमरेझ क्रियाकलापाने ब्लंट टोकांमध्ये रूपांतरित होतात.DNA फ्रॅगमेंटच्या 3′ टोकाच्या अॅडनिलेशननंतर, हायब्रिडायझेशनसाठी तयार करण्यासाठी हेअरपिन लूप स्ट्रक्चरसह NEBNext अडॅप्टर जोडले जाते.पसंतीच्या लांबीच्या cDNA तुकड्यांच्या निवडीसाठी 150-200 bp.AMPure XP प्रणाली (Beckman Coulter, Beverly, USA) वापरून लायब्ररीचे तुकडे शुद्ध केले गेले.त्यानंतर, 3 μl USER एन्झाईम (NEB, USA) आकाराने निवडलेल्या cDNA सह अडॅप्टरने बांधलेले 37°C वर 15 मिनिटे आणि नंतर PCR पूर्वी 95°C वर 5 मिनिटे वापरले गेले.PCR नंतर फ्यूजन हाय-फिडेलिटी डीएनए पॉलिमरेझ, युनिव्हर्सल पीसीआर प्राइमर्स आणि इंडेक्स (X) प्राइमर्स वापरून केले गेले.शेवटी, PCR उत्पादने शुद्ध करण्यात आली (AMPure XP प्रणाली) आणि लायब्ररी गुणवत्तेचे मूल्यांकन Agilent Bioanalyzer 2100 प्रणालीवर केले गेले.सीडीएनए लायब्ररी नंतर नोवासेक सिक्वेन्सर वापरून क्रमबद्ध केली गेली.CASAVA बेस कॉलिंग वापरून Illumina मधील रॉ इमेज फाइल्स रॉ रीडमध्ये रूपांतरित केल्या गेल्या.कच्चा डेटा FASTQ(fq) फॉरमॅट फायलींमध्ये संग्रहित केला जातो ज्यामध्ये वाचन क्रम आणि संबंधित मूलभूत गुण असतात.Sscrofa11.1 संदर्भ जीनोमशी फिल्टर केलेले अनुक्रम वाचण्यासाठी HISAT2 निवडा.सर्वसाधारणपणे, HISAT2 कोणत्याही आकाराच्या जीनोमचे समर्थन करते, ज्यामध्ये 4 अब्ज बेस पेक्षा मोठ्या जीनोमचा समावेश होतो आणि बहुतेक पॅरामीटर्ससाठी डीफॉल्ट मूल्ये सेट केली जातात.RNA Seq डेटाचे स्प्लिसिंग वाचन HISAT2 वापरून कार्यक्षमतेने संरेखित केले जाऊ शकते, सध्या उपलब्ध असलेली सर्वात वेगवान प्रणाली, इतर कोणत्याही पद्धतीपेक्षा समान किंवा अधिक अचूकतेसह.
प्रतिलेखांची विपुलता थेट जनुक अभिव्यक्तीची पातळी दर्शवते.जीन अभिव्यक्ती पातळीचे मुल्यांकन जीनोम किंवा एक्सॉन्सशी संबंधित प्रतिलेखांच्या विपुलतेने केले जाते (क्रमांक संख्या).वाचनाची संख्या जनुक अभिव्यक्ती पातळी, जनुकाची लांबी आणि अनुक्रमिक खोली यांच्या प्रमाणात असते.FPKM (प्रति दशलक्ष बेस जोडी अनुक्रमित प्रति हजार बेस जोड्यांचे तुकडे) मोजले गेले आणि DESeq2 पॅकेज वापरून विभेदक अभिव्यक्तीची P-मूल्ये निर्धारित केली गेली.त्यानंतर आम्ही बिल्ट-इन R-फंक्शन “p.adjust” वर आधारित बेंजामिनी-हॉचबर्ग पद्धत9 वापरून प्रत्येक P मूल्यासाठी खोटे शोध दर (FDR) मोजले.
थर्मो (थर्मो, मांजर क्र. 11756050) मधील सुपरस्क्रिप्ट IV विलो मास्टर मिक्स वापरून हृदयाच्या विभागांपासून वेगळे केलेले RNA 200 ng/μl च्या एकाग्रतेने cDNA मध्ये रूपांतरित केले गेले.परिमाणात्मक RT-PCR अप्लाइड बायोसिस्टम्स एंडुरा प्लेट मायक्रोअँप 384-वेल पारदर्शक प्रतिक्रिया प्लेट (थर्मो, मांजर क्रमांक 4483319) आणि मायक्रोअँप ऑप्टिकल अॅडहेसिव्ह (थर्मो, मांजर क्रमांक 4311971) वापरून केले गेले.प्रतिक्रिया मिश्रणामध्ये 5 µl Taqman Fast Advanced Master Mix (Thermo, cat # 4444557), 0.5 µl Taqman प्राइमर आणि 3.5 µl H2O प्रति विहिरी मिश्रित होते.अप्लाइड बायोसिस्टम्स क्वांटस्टुडिओ 5 रिअल-टाइम पीसीआर इन्स्ट्रुमेंट (384-वेल मॉड्यूल; उत्पादन # A28135) वापरून मानक qPCR चक्र चालवले गेले आणि CT मूल्ये मोजली गेली.Taqman प्राइमर थर्मो (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss081018_m1), RGL1 (Ss086m1), RGL1 (Ss086m1) 8_mH), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss042415) चे नमुने घराचे सामान्य मूल्य होते. e GAPDH.
निर्मात्याच्या प्रोटोकॉलनुसार NT-ProBNP किट (डुक्कर) (Cat. No. MBS2086979, MyBioSource) वापरून NT-ProBNP च्या मीडिया प्रकाशनाचे मूल्यांकन केले गेले.थोडक्यात, प्रत्येक नमुन्याचे 250 μl आणि मानक प्रत्येक विहिरीला डुप्लिकेटमध्ये जोडले गेले.नमुना जोडल्यानंतर लगेच, प्रत्येक विहिरीला 50 μl Assay Reagent A घाला.प्लेट हलक्या हाताने हलवा आणि सीलंटने सील करा.नंतर गोळ्या 1 तासासाठी 37 डिग्री सेल्सिअस तापमानात उबवल्या गेल्या.नंतर द्रावणाला एस्पिरेट करा आणि 350 μl 1X वॉश सोल्यूशनने 4 वेळा विहिरी धुवा, प्रत्येक वेळी 1-2 मिनिटे वॉश सोल्यूशन उबवून ठेवा.नंतर 100 µl Assay Reagent B प्रति विहिरी घाला आणि प्लेट सीलंटने सील करा.टॅब्लेट हलक्या हाताने हलवून 37°C वर 30 मिनिटे उष्मायन केले.द्रावणाला ऍस्पिरेट करा आणि 350 μl 1X वॉश सोल्यूशनने 5 वेळा विहिरी धुवा.प्रत्येक विहिरीला 90 μl सब्सट्रेट द्रावण घाला आणि प्लेट सील करा.10-20 मिनिटे 37 डिग्री सेल्सिअस तपमानावर प्लेट उबवा.प्रत्येक विहिरीला 50 μl स्टॉप सोल्युशन घाला.सायटेशन (बायोटेक) प्लेट रीडर 450 nm वर सेट करून प्लेट लगेच मोजली गेली.
गट आकार निवडण्यासाठी पॉवर विश्लेषणे केली गेली जी 5% प्रकार I त्रुटी दरासह पॅरामीटरमध्ये 10% परिपूर्ण बदल शोधण्यासाठी >80% शक्ती प्रदान करेल. गट आकार निवडण्यासाठी पॉवर विश्लेषणे केली गेली जी 5% प्रकार I त्रुटी दरासह पॅरामीटरमध्ये 10% परिपूर्ण बदल शोधण्यासाठी >80% शक्ती प्रदान करेल. अॅनालिझ мощности был выполнен для выбора размеров групп, которые обеспечат >80% мощности для обнаружемения 10% абнаружемения 10% с 5% частотой ошибок типа I. 5% प्रकार I त्रुटी दरासह 10% परिपूर्ण पॅरामीटर बदल शोधण्यासाठी >80% शक्ती प्रदान करणारे गट आकार निवडण्यासाठी पॉवर विश्लेषण केले गेले.进行功效分析以选择将提供>80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I将揘变化和5％I将提供.进行功效分析以选择将提供>80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I将揘变化和5％I将提供. Был проведен анализ мощности для выбора размера группы, который обеспечил бы > ८०% мощности для обнаружения 10% етров и 5% частоты ошибок типа I. समूह आकार निवडण्यासाठी पॉवर विश्लेषण केले गेले जे 10% परिपूर्ण पॅरामीटर बदल आणि 5% प्रकार I त्रुटी दर शोधण्यासाठी >80% शक्ती प्रदान करेल.प्रयोगापूर्वी ऊतींचे विभाग यादृच्छिकपणे निवडले गेले.सर्व विश्लेषणे अंध होती आणि सर्व डेटाचे विश्लेषण केल्यानंतरच नमुने डीकोड केले गेले.ग्राफपॅड प्रिझम सॉफ्टवेअर (सॅन डिएगो, सीए) सर्व सांख्यिकीय विश्लेषणे करण्यासाठी वापरले गेले. सर्व आकडेवारीसाठी, p-मूल्ये <0.05 मूल्यांवर महत्त्वपूर्ण मानली गेली. सर्व आकडेवारीसाठी, p-मूल्ये <0.05 मूल्यांवर महत्त्वपूर्ण मानली गेली. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. सर्व आकडेवारीसाठी, p-मूल्ये <0.05 मूल्यांवर महत्त्वपूर्ण मानली गेली.对于所有统计数据,p 值在值<0.05 时被认为是显着的.对于所有统计数据,p 值在值<0.05 时被认为是显着的. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. सर्व आकडेवारीसाठी, p-मूल्ये <0.05 मूल्यांवर महत्त्वपूर्ण मानली गेली.दोन-पुच्छ विद्यार्थ्यांची टी-चाचणी डेटावर केवळ 2 तुलनेसह केली गेली.अनेक गटांमधील महत्त्व निश्चित करण्यासाठी एक-मार्ग किंवा द्वि-मार्ग ANOVA वापरला गेला.पोस्ट हॉक चाचण्या करत असताना, तुकीची सुधारणा एकाधिक तुलनांसाठी लागू केली गेली.पद्धती विभागात वर्णन केल्याप्रमाणे FDR आणि p.adjust ची गणना करताना RNAsec डेटामध्ये विशेष सांख्यिकीय विचार आहेत.
अभ्यासाच्या रचनेबद्दल अधिक माहितीसाठी, या लेखाशी जोडलेला निसर्ग संशोधन अहवाल गोषवारा पहा.