Nature.com ला भेट दिल्याबद्दल धन्यवाद. तुम्ही वापरत असलेल्या ब्राउझर आवृत्तीला मर्यादित CSS सपोर्ट आहे. सर्वोत्तम अनुभवासाठी, आम्ही शिफारस करतो की तुम्ही अपडेटेड ब्राउझर वापरा (किंवा इंटरनेट एक्सप्लोररमध्ये कंपॅटिबिलिटी मोड अक्षम करा). दरम्यान, सतत सपोर्ट सुनिश्चित करण्यासाठी, आम्ही साइटला स्टाईल आणि जावास्क्रिप्टशिवाय रेंडर करू.
AFEX सह प्रीट्रीट केलेल्या कॉर्न स्टोव्हरमधील पर्सिस्टंट ऑलिगोसॅकराइड्सच्या जटिल विश्लेषणासाठी नवीन इम्यूनोलॉजिकल आणि मास स्पेक्ट्रोमेट्रिक पद्धती. लिग्नोसेल्युलोसिक बायोमास हा जीवाश्म इंधनाचा एक शाश्वत पर्याय आहे आणि अन्न, खाद्य, इंधन आणि रसायने यासारख्या उत्पादनांच्या उत्पादनासाठी जैवतंत्रज्ञान विकसित करण्यासाठी मोठ्या प्रमाणावर वापरला जातो. या तंत्रज्ञानाची गुरुकिल्ली म्हणजे वनस्पतींच्या पेशींच्या भिंतींमध्ये असलेल्या जटिल कार्बोहायड्रेट्सचे ग्लुकोज, झायलोज आणि अराबिनोज सारख्या साध्या साखरेमध्ये रूपांतर करण्यासाठी किफायतशीर प्रक्रियांचा विकास. लिग्नोसेल्युलोसिक बायोमास खूप हट्टी असल्याने, इच्छित उत्पादन मिळविण्यासाठी त्यावर थर्मोकेमिकल उपचार (उदा. अमोनिया फायबर एक्सफोलिएशन (AFEX), डायल्युट अॅसिड (DA), आयनिक द्रव (IL)) आणि जैविक उपचार (उदा. एंजाइमॅटिक हायड्रोलिसिस आणि मायक्रोबियल किण्वन) एकत्रितपणे करावे लागतात. . तथापि, जेव्हा व्यावसायिक बुरशीजन्य एंजाइम्सचा वापर हायड्रोलिसिस प्रक्रियेत केला जातो तेव्हा तयार होणाऱ्या विरघळणाऱ्या शर्करांपैकी फक्त ७५-८५% मोनोसॅकराइड असतात आणि उर्वरित १५-२५% विरघळणारे, अस्थिर ऑलिगोसॅकराइड असतात, जे नेहमीच सूक्ष्मजीवांसाठी उपलब्ध नसतात. यापूर्वी, आम्ही कार्बन आणि डायटोमेशियस अर्थ सेपरेशन आणि साइज एक्सक्लुजन क्रोमॅटोग्राफीच्या संयोजनाचा वापर करून विरघळणारे हट्टी ऑलिगोसॅकराइड्स यशस्वीरित्या वेगळे आणि शुद्ध केले आहेत आणि त्यांच्या एंजाइम इनहिबिटर गुणधर्मांची देखील तपासणी केली आहे. आम्हाला आढळले आहे की उच्च डिग्री पॉलिमरायझेशन (DP) मिथाइलेटेड युरोनिक अॅसिड सबस्टिट्यूशन असलेले ऑलिगोसॅकराइड्स कमी DP आणि न्यूट्रल ऑलिगोसॅकराइड्सपेक्षा व्यावसायिक एंजाइम मिश्रणांसह प्रक्रिया करणे अधिक कठीण आहे. येथे आम्ही वनस्पती पेशींच्या भिंती आणि एंजाइमॅटिक हायड्रोलिसेट्समध्ये ग्लायकन बंधांचे वैशिष्ट्यीकृत करण्यासाठी वनस्पती बायोमास ग्लायकन्ससाठी विशिष्ट मोनोक्लोनल अँटीबॉडीज (mAbs) वापरून ग्लायकन प्रोफाइलिंग, मॅट्रिक्स-सहाय्यित लेसर डिसॉर्प्शन आयनीकरण, टाइम-ऑफ-फ्लाइट मास-स्पेक्ट्रोमेट्री यासह अनेक अतिरिक्त पद्धतींचा वापर नोंदवतो. MALDI-TOF-MS) मध्ये नकारात्मक आयनांच्या दुय्यम क्षयानंतर स्पेक्ट्रोस्कोपी, गॅस क्रोमॅटोग्राफी आणि मास स्पेक्ट्रोमेट्री (GC-MS) द्वारे मिळवलेल्या स्ट्रक्चर-इन्फॉर्मेटिव्ह डायग्नोस्टिक पीकचा वापर केला जातो ज्यामुळे डेरिव्हेटायझेशनसह आणि त्याशिवाय ऑलिगोसॅकराइड बाँड्सचे वैशिष्ट्यीकृत केले जाते. ऑलिगोसॅकराइड्सच्या लहान आकारामुळे (DP 4-20), हे रेणू mAb बंधन आणि वैशिष्ट्यीकरणासाठी वापरणे कठीण आहे. या समस्येवर मात करण्यासाठी, आम्ही एक नवीन बायोटिन कंज्युगेशन-आधारित ऑलिगोसॅकराइड इमोबिलायझेशन पद्धत लागू केली ज्याने मायक्रोप्लेट पृष्ठभागावर कमी DP विरघळणारे ऑलिगोसॅकराइड्सचे बहुतेक यशस्वीरित्या लेबल केले, जे नंतर विशिष्ट बंधन विश्लेषणासाठी उच्च थ्रूपुट mAb प्रणालीमध्ये वापरले गेले. ही नवीन पद्धत भविष्यात अधिक प्रगत उच्च थ्रूपुट ग्लायकोम अॅसेजच्या विकासास सुलभ करेल ज्याचा वापर निदानात्मक हेतूंसाठी बायोमार्करमध्ये उपस्थित असलेल्या ऑलिगोसॅकराइड्स वेगळे करण्यासाठी आणि वैशिष्ट्यीकृत करण्यासाठी केला जाऊ शकतो.
कृषी, वनीकरण, गवत आणि लाकूड पदार्थांपासून बनलेला लिग्नोसेल्युलोसिक बायोमास हा उच्च मूल्याची उत्पादने तयार करण्यासाठी अन्न, खाद्य, इंधन आणि रासायनिक पूर्वसूचकांसह जैव-आधारित उत्पादनांच्या उत्पादनासाठी एक संभाव्य कच्चा माल आहे. वनस्पती पेशींच्या भिंतींमध्ये असलेले कार्बोहायड्रेट्स (जसे की सेल्युलोज आणि हेमिसेल्युलोज) रासायनिक प्रक्रिया आणि बायोट्रान्सफॉर्मेशन (जसे की एंजाइमॅटिक हायड्रोलिसिस आणि मायक्रोबियल किण्वन) द्वारे मोनोसॅकराइडमध्ये डिपॉलिमराइज केले जातात. सामान्य पूर्व-उपचारांमध्ये अमोनिया फायबर विस्तार (AFEX), पातळ आम्ल (DA), आयनिक द्रव (IL) आणि स्टीम एक्सप्लोजन (SE) यांचा समावेश आहे, जे वनस्पती पेशींच्या भिंती उघडून लिग्नोसेल्युलोज उत्पादन कमी करण्यासाठी रसायने आणि उष्णतेचे संयोजन वापरतात3,4. पदार्थाची हट्टीपणा, 5. एंजाइमॅटिक हायड्रोलिसिस व्यावसायिक सक्रिय कार्बोहायड्रेट-युक्त एन्झाईम्स (CAZymes) वापरून उच्च घन भारावर केले जाते आणि जैव-आधारित इंधन आणि रसायने तयार करण्यासाठी ट्रान्सजेनिक यीस्ट किंवा बॅक्टेरिया वापरून मायक्रोबियल किण्वन केले जाते 6.
व्यावसायिक एन्झाईम्समधील CAZymes हे एन्झाईम्सच्या जटिल मिश्रणाने बनलेले असतात जे जटिल कार्बोहायड्रेट-साखर बंधांना एकत्रितपणे तोडून मोनोसॅकराइड्स 2,7 बनवतात. जसे आपण आधी नोंदवले आहे, लिग्निनच्या कार्बोहायड्रेट्ससह सुगंधी पॉलिमरचे जटिल नेटवर्क त्यांना अत्यंत असह्य बनवते, ज्यामुळे साखरेचे अपूर्ण रूपांतर होते, ज्यामुळे 15-25% सेक्स ऑलिगोसॅकराइड्स जमा होतात जे प्रीट्रीट केलेल्या बायोमासच्या एंजाइमॅटिक हायड्रोलिसिस दरम्यान तयार होत नाहीत. विविध बायोमास प्रीट्रीटमेंट पद्धतींमध्ये ही एक सामान्य समस्या आहे. या अडथळ्याची काही कारणे म्हणजे हायड्रोलिसिस दरम्यान एंजाइम प्रतिबंध, किंवा वनस्पती बायोमासमध्ये साखर बंध तोडण्यासाठी आवश्यक असलेल्या आवश्यक एंजाइमची अनुपस्थिती किंवा कमी पातळी. ऑलिगोसॅकराइड्समधील साखर बंध यासारख्या साखरेची रचना आणि संरचनात्मक वैशिष्ट्ये समजून घेतल्याने आपल्याला हायड्रोलिसिस दरम्यान साखर रूपांतरण सुधारण्यास मदत होईल, ज्यामुळे जैवतंत्रज्ञान प्रक्रिया पेट्रोलियम-व्युत्पन्न उत्पादनांसह किफायतशीर होतील.
कार्बोहायड्रेट्सची रचना निश्चित करणे आव्हानात्मक आहे आणि त्यासाठी लिक्विड क्रोमॅटोग्राफी (LC)11,12, न्यूक्लियर मॅग्नेटिक रेझोनन्स स्पेक्ट्रोस्कोपी (NMR)13, केशिका इलेक्ट्रोफोरेसीस (CE)14,15,16 आणि मास स्पेक्ट्रोमेट्री (MS)17. ,अठरा. मॅट्रिक्स (MALDI-TOF-MS) वापरून लेसर डिसॉर्प्शन आणि आयनीकरणासह टाइम-ऑफ-फ्लाइट मास स्पेक्ट्रोमेट्री सारख्या MS पद्धती कार्बोहायड्रेट संरचना ओळखण्यासाठी एक बहुमुखी पद्धत आहेत. अलिकडे, ऑलिगोसॅकराइड अटॅचमेंट पोझिशन्स, अॅनोमेरिक कॉन्फिगरेशन, सीक्वेन्स आणि ब्रँचिंग पोझिशन्स 20, 21 शी संबंधित फिंगरप्रिंट्स ओळखण्यासाठी कोलिजन-प्रेरित डिसोसिएशन (CID) टँडम MS ऑफ सोडियम आयन अॅडक्ट्सचा सर्वाधिक वापर केला जात आहे.
कार्बोहायड्रेट बंधांची सखोल ओळख पटविण्यासाठी ग्लायकन विश्लेषण हे एक उत्कृष्ट साधन आहे. ही पद्धत जटिल कार्बोहायड्रेट जोडणी समजून घेण्यासाठी वनस्पती पेशी भिंतीच्या ग्लायकनला निर्देशित केलेल्या मोनोक्लोनल अँटीबॉडीज (mAbs) चा वापर करते. जगभरात २५० पेक्षा जास्त mAbs उपलब्ध आहेत, जे विविध सॅकराइड्स वापरून विविध रेषीय आणि ब्रँचेड ऑलिगोसॅकराइड्सच्या विरूद्ध डिझाइन केलेले आहेत. वनस्पती पेशी भिंतीची रचना, रचना आणि बदल दर्शविण्याकरिता अनेक mAbs चा मोठ्या प्रमाणावर वापर केला गेला आहे, कारण वनस्पती पेशी प्रकार, अवयव, वय, विकासाचा टप्पा आणि वाढीचे वातावरण यावर अवलंबून लक्षणीय फरक आहेत २५,२६. अलिकडेच, ही पद्धत वनस्पती आणि प्राण्यांच्या प्रणालींमधील वेसिकल लोकसंख्या आणि सबसेल्युलर मार्कर, विकासाचे टप्पे किंवा पर्यावरणीय उत्तेजनांद्वारे निर्धारित केल्यानुसार ग्लायकन वाहतुकीत त्यांच्या संबंधित भूमिका समजून घेण्यासाठी आणि एंजाइमॅटिक क्रियाकलाप निश्चित करण्यासाठी वापरली गेली आहे. ग्लायकन्स आणि झायलन्सच्या ज्या वेगवेगळ्या रचना ओळखल्या गेल्या आहेत त्यात पेक्टिन (P), झायलॅन (X), मन्नान (M), झायलोग्लुकन्स (XylG), मिश्रित बंध ग्लुकन्स (MLG), अरेबिनॉक्सिलॅन (ArbX), गॅलेक्टोमनान (GalG), ग्लुक्युरोनिक अॅसिड-अरबिनॉक्सिलॅन (GArbX) आणि अरेबिनो-गॅलेक्टन (ArbG)29 यांचा समावेश आहे.
तथापि, या सर्व संशोधन प्रयत्नांना न जुमानता, उच्च घन भार (HSL) हायड्रोलिसिस दरम्यान ऑलिगोसॅकराइड संचयनाच्या स्वरूपावर केवळ काही अभ्यासांनी लक्ष केंद्रित केले आहे, ज्यामध्ये ऑलिगोसॅकराइड सोडणे, हायड्रोलिसिस दरम्यान ऑलिगोमेरिक साखळी लांबी बदलणे, विविध कमी DP पॉलिमर आणि त्यांचे वक्र यांचा समावेश आहे. वितरण 30,31,32. दरम्यान, ग्लायकॅन विश्लेषण ग्लायकॅन संरचनेच्या व्यापक विश्लेषणासाठी एक उपयुक्त साधन असल्याचे सिद्ध झाले असले तरी, अँटीबॉडी पद्धती वापरून पाण्यात विरघळणारे कमी DP ऑलिगोसॅकराइडचे मूल्यांकन करणे कठीण आहे. 5-10 kDa पेक्षा कमी आण्विक वजन असलेले लहान DP ऑलिगोसॅकराइड ELISA प्लेट्स 33, 34 ला बांधत नाहीत आणि अँटीबॉडी जोडण्यापूर्वी ते धुऊन जातात.
येथे, प्रथमच, आम्ही मोनोक्लोनल अँटीबॉडीज वापरून एव्हिडिन-लेपित प्लेट्सवर ELISA परख प्रदर्शित करतो, ज्यामध्ये विरघळणारे रेफ्रेक्ट्री ऑलिगोसॅकराइड्ससाठी एक-चरण बायोटिनिलेशन प्रक्रिया ग्लायकोम विश्लेषणासह एकत्रित केली जाते. ग्लायकोम विश्लेषणासाठी आमचा दृष्टिकोन MALDI-TOF-MS आणि GC-MS आधारित पूरक ऑलिगोसॅकराइड लिंकेजच्या विश्लेषणाद्वारे प्रमाणित करण्यात आला जो हायड्रोलायझ्ड साखर रचनांचे ट्रायमेथिलसिलिल (TMS) व्युत्पन्नीकरण वापरून केला जातो. हा नाविन्यपूर्ण दृष्टिकोन भविष्यात उच्च-थ्रूपुट पद्धत म्हणून विकसित केला जाऊ शकतो आणि बायोमेडिकल संशोधनात व्यापक अनुप्रयोग शोधू शकतो.35.
ग्लायकोसायलेशन सारख्या एन्झाईम्स आणि अँटीबॉडीजमधील भाषांतरोत्तर बदल, 36 त्यांच्या जैविक क्रियाकलापांवर परिणाम करतात. उदाहरणार्थ, सीरम प्रथिनांच्या ग्लायकोसायलेशनमधील बदल दाहक संधिवात महत्वाची भूमिका बजावतात आणि ग्लायकोसायलेशनमधील बदल निदानात्मक चिन्हक म्हणून वापरले जातात37. साहित्यात विविध ग्लायकन्स विविध रोगांमध्ये सहजपणे दिसून येतात असे नोंदवले गेले आहे, ज्यात गॅस्ट्रोइंटेस्टाइनल ट्रॅक्ट आणि यकृताचे जुनाट दाहक रोग, विषाणूजन्य संसर्ग, अंडाशय, स्तन आणि प्रोस्टेट कर्करोग यांचा समावेश आहे38,39,40. अँटीबॉडी-आधारित ग्लायकॅन ELISA पद्धती वापरून ग्लायकन्सची रचना समजून घेतल्याने जटिल MS पद्धतींचा वापर न करता रोग निदानात अतिरिक्त आत्मविश्वास मिळेल.
आमच्या मागील अभ्यासात असे दिसून आले आहे की प्रीट्रीटमेंट आणि एन्झाइमॅटिक हायड्रोलिसिस नंतर हट्टी ऑलिगोसॅकराइड्स हायड्रोलायझ्ड राहिले (आकृती 1). आमच्या पूर्वी प्रकाशित केलेल्या कामात, आम्ही AFEX-प्रीट्रीटेड कॉर्न स्टोव्हर हायड्रोलिझेट (ACSH)8 पासून ऑलिगोसॅकराइड्स वेगळे करण्यासाठी सक्रिय चारकोल सॉलिड-फेज एक्सट्रॅक्शन पद्धत विकसित केली. सुरुवातीच्या निष्कर्षण आणि पृथक्करणानंतर, ऑलिगोसॅकराइड्स आकार बहिष्कार क्रोमॅटोग्राफी (SEC) द्वारे अधिक अंशित केले गेले आणि आण्विक वजनाच्या क्रमाने गोळा केले गेले. विविध प्रीट्रीटमेंटमधून सोडलेल्या साखर मोनोमर आणि ऑलिगोमरचे साखर रचना विश्लेषणाद्वारे विश्लेषण केले गेले. विविध प्रीट्रीटमेंट पद्धतींद्वारे मिळवलेल्या साखर ऑलिगोमरच्या सामग्रीची तुलना करताना, बायोमासचे मोनोसॅकराइड्समध्ये रूपांतर करण्यात हट्टी ऑलिगोसॅकराइड्सची उपस्थिती ही एक सामान्य समस्या आहे आणि त्यामुळे साखर उत्पादनात किमान 10-15% आणि अगदी 18% पर्यंत घट होऊ शकते. यूएस. ही पद्धत ऑलिगोसॅकराइड अपूर्णांकांच्या पुढील मोठ्या प्रमाणात उत्पादनासाठी वापरली जाते. परिणामी ACH आणि त्याचे त्यानंतरचे भिन्न आण्विक वजन असलेले अंश या कामात ऑलिगोसॅकराइड्सच्या वैशिष्ट्यीकरणासाठी प्रायोगिक सामग्री म्हणून वापरले गेले.
प्रीट्रीटमेंट आणि एंजाइमॅटिक हायड्रोलिसिसनंतर, पर्सिस्टंट ऑलिगोसॅकराइड्स हायड्रोलायझ्ड राहिले नाहीत. येथे (A) एक ऑलिगोसॅकराइड पृथक्करण पद्धत आहे ज्यामध्ये ऑलिगोसॅकराइड्स AFEX-प्रीट्रीटेड कॉर्न स्टोव्हर हायड्रोलाइजेट (ACSH) पासून सक्रिय कार्बन आणि डायटोमेशियस अर्थच्या पॅक केलेल्या बेडचा वापर करून वेगळे केले जातात; (B) ऑलिगोसॅकराइड्स वेगळे करण्याची पद्धत. ऑलिगोसॅकराइड्स आकार बहिष्कार क्रोमॅटोग्राफी (SEC) द्वारे वेगळे केले गेले; (C) विविध प्रीट्रीटमेंटमधून सोडलेले सॅकेराइड मोनोमर आणि ऑलिगोमर (डायल्युटेड अॅसिड: DA, आयनिक द्रव: IL आणि AFEX). एंजाइमॅटिक हायड्रोलिसिस परिस्थिती: 25% (w/w) चे उच्च घन लोडिंग (अंदाजे 8% ग्लुकन लोडिंग), 96 तासांचे हायड्रोलिसिस, 20 मिलीग्राम/ग्रॅम व्यावसायिक एंजाइम लोडिंग (Ctec2:Htec2:MP-2:1:1 गुणोत्तर) आणि (D) AFEX प्री-ट्रीटेड कॉर्न स्टोव्हर (ACS) मधून सोडलेले ग्लुकोज, झायलोज आणि अराबिनोजचे साखर मोनोमर आणि ऑलिगोमर.
घन बायोमास अवशेषांपासून वेगळे केलेल्या अर्कांमधील ग्लायकन्सच्या व्यापक संरचनात्मक विश्लेषणासाठी ग्लायकन्स विश्लेषण हे एक उपयुक्त साधन असल्याचे सिद्ध झाले आहे. तथापि, या पारंपारिक पद्धतीचा वापर करून पाण्यात विरघळणारे सॅकराइड्स कमी दर्शविले जातात41 कारण कमी आण्विक वजनाचे ऑलिगोसॅकराइड्स ELISA प्लेट्सवर स्थिर करणे कठीण असते आणि अँटीबॉडी जोडण्यापूर्वी ते धुऊन टाकले जातात. म्हणून, अँटीबॉडी बंधन आणि वैशिष्ट्यीकरणासाठी, एव्हिडिन-लेपित ELISA प्लेट्सवर विरघळणारे, अनुपालन नसलेले ऑलिगोसॅकराइड्स कोट करण्यासाठी एक-चरण बायोटिनिलेशन पद्धत वापरली गेली. ही पद्धत आमच्या पूर्वी उत्पादित ACSH आणि त्याच्या आण्विक वजनावर (किंवा पॉलिमरायझेशनची डिग्री, DP) आधारित अंश वापरून चाचणी केली गेली. कार्बोहायड्रेटच्या रिड्यूसिंग एंडला बायोटिन-एलसी-हायड्रॅझाइड जोडून ऑलिगोसॅकराइड बंधनकारक आत्मीयता वाढवण्यासाठी एक-चरण बायोटिनिलेशन वापरले गेले (आकृती 2). द्रावणात, रिड्यूसिंग एंडवरील हेमियासेटल गट हायड्रॅझोन बॉन्ड तयार करण्यासाठी बायोटिन-एलसी-हायड्रॅझाइडच्या हायड्रॅझाइड गटाशी प्रतिक्रिया देतो. NaCNBH3 या रिड्यूसिंग एजंटच्या उपस्थितीत, हायड्राझोन बाँड एका स्थिर बायोटिनिलेटेड एंड प्रोडक्टमध्ये कमी केला जातो. साखर रिड्यूसिंग एंडमध्ये बदल केल्याने, कमी DP ऑलिगोसॅकराइड्सचे ELISA प्लेट्सशी बंधन शक्य झाले आणि आमच्या अभ्यासात हे ग्लायकॅन-लक्ष्यित mAbs वापरून एव्हिडिन-लेपित प्लेट्सवर केले गेले.
बायोटिनिलेटेड ऑलिगोसॅकराइड्ससाठी ELISA वर आधारित मोनोक्लोनल अँटीबॉडीजची तपासणी. येथे (A) न्यूट्रॅव्हिडिन लेपित प्लेट्सवर ग्लायकन-लक्ष्यित mAbs सह ऑलिगोसॅकराइड्सचे एकत्रित बायोटिनिलेशन आणि त्यानंतरचे ELISA स्क्रीनिंग आणि (B) प्रतिक्रिया उत्पादनांच्या बायोटिनिलेशनसाठी एक-चरण प्रक्रिया दर्शविते.
ऑलिगोसॅकराइड-कंज्युगेटेड अँटीबॉडीज असलेल्या एव्हिडिन-लेपित प्लेट्स नंतर प्राथमिक आणि दुय्यम अँटीबॉडीजमध्ये जोडल्या गेल्या आणि प्रकाश- आणि वेळ-संवेदनशील माध्यमात धुतल्या गेल्या. अँटीबॉडी बंधन पूर्ण झाल्यानंतर, प्लेट उबविण्यासाठी TMB सब्सट्रेट जोडा. शेवटी सल्फ्यूरिक ऍसिडने प्रतिक्रिया थांबवण्यात आली. अँटीबॉडी-विशिष्ट क्रॉस-लिंकिंग शोधण्यासाठी प्रत्येक अँटीबॉडीची बंधन शक्ती निश्चित करण्यासाठी ELISA रीडर वापरून उबलेल्या प्लेट्सचे विश्लेषण केले गेले. प्रयोगाच्या तपशीलांसाठी आणि पॅरामीटर्ससाठी, संबंधित विभाग "सामग्री आणि पद्धती" पहा.
ACSH मध्ये तसेच लिग्नोसेल्युलोसिक हायड्रोलायसेट्सपासून वेगळे केलेल्या क्रूड आणि शुद्ध ऑलिगोसॅकराइड अंशांमध्ये उपस्थित असलेल्या विद्राव्य ऑलिगोसॅकराइड्सचे वैशिष्ट्यीकरण करून आम्ही विशिष्ट अनुप्रयोगांसाठी या नवीन विकसित पद्धतीची उपयुक्तता प्रदर्शित करतो. आकृती 3 मध्ये दर्शविल्याप्रमाणे, बायोएसिलेटेड ग्लायकोम परख पद्धती वापरून ACSH मध्ये ओळखले जाणारे सर्वात सामान्य एपिटोप-प्रतिस्थापन केलेले झायलन्स सामान्यतः युरोनिक (U) किंवा मेथिल्युरोनिक (MeU) आणि पेक्टिक अरेबिनोगॅलेक्टन्स असतात. त्यापैकी बहुतेक नॉन-हायड्रोलायझ्ड सॉलिड्स (UHS)43 च्या ग्लायकन्सच्या विश्लेषणावरील आमच्या मागील अभ्यासात देखील आढळले होते.
पेशी भिंतीच्या ग्लायकनकडे निर्देशित केलेल्या मोनोक्लोनल अँटीबॉडीचा वापर करून रिकॅल्सीट्रंट ऑलिगोसॅकराइड एपिटोप्सचा शोध. "तटस्थ" अंश म्हणजे ACN अंश आणि "अम्लीय" अंश म्हणजे FA अंश. हीटमॅपवरील उजळ लाल रंग उच्च एपिटोप सामग्री दर्शवितात आणि उजळ निळे रंग रिक्त पार्श्वभूमी दर्शवितात. स्केलवरील रंग मूल्ये फॉर्म्युलेशन N=2 साठी कच्च्या OD मूल्यांवर आधारित आहेत. अँटीबॉडीजद्वारे ओळखले जाणारे मुख्य एपिटोप्स उजवीकडे दर्शविले आहेत.
या नॉन-सेल्युलोज स्ट्रक्चर्सना चाचणी केलेल्या व्यावसायिक एन्झाइम मिश्रणातील सर्वात सामान्य सेल्युलेज आणि हेमिसेल्युलेजद्वारे वेगळे करता आले नाही, ज्यामध्ये सर्वात सामान्यतः वापरल्या जाणाऱ्या व्यावसायिक एन्झाइम्सचा समावेश आहे. म्हणून, त्यांच्या हायड्रॉलिसिससाठी नवीन सहाय्यक एन्झाइम्स आवश्यक आहेत. आवश्यक नॉन-सेल्युलोज अॅक्सेसरी एन्झाइम्सशिवाय, हे नॉन-सेल्युलोज बॉन्ड्स मोनोसॅकराइड्समध्ये पूर्ण रूपांतरण रोखतात, जरी त्यांचे मूळ साखर पॉलिमर मोठ्या प्रमाणात लहान तुकड्यांमध्ये हायड्रोलायझ केले गेले आणि व्यावसायिक एन्झाइम मिश्रण वापरून विरघळले गेले तरीही.
सिग्नल वितरण आणि त्याच्या बंधन शक्तीच्या पुढील अभ्यासातून असे दिसून आले की उच्च DP साखर अंशांमध्ये (A, B, C, DP 20+ पर्यंत) बंधनकारक एपिटोप कमी होते (D, E, F, DP) डायमरमध्ये कमी DP अंशांपेक्षा (आकृती 1). आम्ल तुकडे तटस्थ तुकड्यांपेक्षा नॉन-सेल्युलोज एपिटोपमध्ये अधिक सामान्य आहेत. या घटना आमच्या मागील अभ्यासात आढळलेल्या नमुन्याशी सुसंगत आहेत, जिथे उच्च DP आणि आम्ल घटक एंजाइमॅटिक हायड्रोलिसिसला अधिक प्रतिरोधक होते. म्हणून, नॉन-सेल्युलोज ग्लायकन एपिटोप आणि U आणि MeU पर्यायांची उपस्थिती ऑलिगोसॅकराइड्सच्या स्थिरतेमध्ये मोठ्या प्रमाणात योगदान देऊ शकते. हे लक्षात घेतले पाहिजे की कमी DP ऑलिगोसॅकराइड्ससाठी बंधन आणि शोध कार्यक्षमता समस्याप्रधान असू शकते, विशेषतः जर एपिटोप डायमरिक किंवा ट्रायमरिक ऑलिगोसॅकराइड असेल तर. वेगवेगळ्या लांबीच्या व्यावसायिक ऑलिगोसॅकराइड्स वापरून हे तपासले जाऊ शकते, प्रत्येकामध्ये फक्त एक एपिटोप असतो जो विशिष्ट mAb ला बांधतो.
अशाप्रकारे, रचना-विशिष्ट अँटीबॉडीजच्या वापरामुळे विशिष्ट प्रकारचे रिकॅल्सिट्रंट बंध आढळले. वापरलेल्या अँटीबॉडीच्या प्रकारावर, योग्य बंधन पद्धतीवर आणि ते निर्माण करणाऱ्या सिग्नलची ताकद (सर्वात आणि कमीत कमी मुबलक) यावर अवलंबून, नवीन एंजाइम ओळखले जाऊ शकतात आणि अधिक संपूर्ण ग्लायकोकन्व्हर्जनसाठी एंजाइम मिश्रणात अर्ध-परिमाणात्मकपणे जोडले जाऊ शकतात. ACSH ऑलिगोसॅकराइड्सचे विश्लेषण उदाहरण म्हणून घेतल्यास, आपण प्रत्येक बायोमास सामग्रीसाठी ग्लायकन बंधांचा डेटाबेस तयार करू शकतो. येथे हे लक्षात घेतले पाहिजे की अँटीबॉडीजची भिन्न आत्मीयता विचारात घेतली पाहिजे आणि जर त्यांची आत्मीयता अज्ञात असेल, तर वेगवेगळ्या अँटीबॉडीजच्या सिग्नलची तुलना करताना काही अडचणी निर्माण होतील. याव्यतिरिक्त, एकाच अँटीबॉडीसाठी नमुन्यांमध्ये ग्लायकन बंधांची तुलना सर्वोत्तम कार्य करू शकते. हे हट्टी बंध नंतर CAZyme डेटाबेसशी जोडले जाऊ शकतात, ज्यावरून आपण एंजाइम ओळखू शकतो, उमेदवार एंजाइम निवडू शकतो आणि बॉन्ड-ब्रेकिंग एंजाइमची चाचणी करू शकतो किंवा बायोरिफायनरीजमध्ये वापरण्यासाठी या एंजाइम व्यक्त करण्यासाठी सूक्ष्मजीव प्रणाली विकसित करू शकतो44.
लिग्नोसेल्युलोसिक हायड्रोलायसेट्समध्ये असलेल्या कमी आण्विक वजनाच्या ऑलिगोसॅकराइड्सचे वैशिष्ट्यीकरण करण्यासाठी इम्यूनोलॉजिकल पद्धती पर्यायी पद्धतींना कशा पूरक आहेत याचे मूल्यांकन करण्यासाठी, आम्ही त्याच पॅनेलवर (आकृती 5) ऑलिगोसॅकराइड भागावर GC-MS वर आधारित TMS-व्युत्पन्न सॅकराइड्सचे MALDI (आकृती 4, S1-S8) आणि विश्लेषण केले. ऑलिगोसॅकराइड रेणूंचे वस्तुमान वितरण इच्छित संरचनेशी जुळते की नाही याची तुलना करण्यासाठी MALDI चा वापर केला जातो. आकृती 4 मध्ये ACN-A आणि ACN-B चे तटस्थ घटकांचे MS दाखवले आहे. ACN-A विश्लेषणाने DP 4-8 (आकृती 4) ते DP 22 (आकृती S1) पर्यंतच्या पेंटोज शर्कराच्या श्रेणीची पुष्टी केली, ज्यांचे वजन MeU-xylan ऑलिगोसॅकराइड्सशी संबंधित आहे. ACN-B विश्लेषणाने DP 8-15 सह पेंटोज आणि ग्लुकोक्सिलान मालिकेची पुष्टी केली. आकृती S3 सारख्या पूरक सामग्रीमध्ये, FA-C अम्लीय अंश वस्तुमान वितरण नकाशे 8-15 च्या DP सह (Me)U प्रतिस्थापित पेंटोज शर्कराची श्रेणी दर्शवितात जी ELISA-आधारित mAb स्क्रीनिंगमध्ये आढळलेल्या प्रतिस्थापित झायलन्सशी सुसंगत आहेत. एपिटोप सुसंगत आहेत.
ACS मध्ये उपस्थित असलेल्या विद्राव्य नॉन-कम्प्लायंट ऑलिगोसॅकराइड्सचे MALDI-MS स्पेक्ट्रम. येथे, (A) मिथाइलेटेड युरोनिक अॅसिड (DP 4-8) असलेले ACN-A कमी वजन श्रेणीचे अपूर्णांक आणि (B) ग्लुकोरोक्सिलॅन (DP 8-15) ने बदललेले ACN-B झायलन आणि मिथाइलेटेड युरोनिक अॅसिड ऑलिगोसॅकराइड्स.
रेफ्रेक्ट्री ऑलिगोसॅकराइड्सच्या ग्लायकन अवशेषांच्या रचनेचे विश्लेषण. येथे (अ) GC-MS विश्लेषण वापरून मिळवलेल्या विविध ऑलिगोसॅकराइड अंशांची TMS सॅकराइड रचना. (ब) ऑलिगोसॅकराइड्समध्ये असलेल्या विविध TMS-व्युत्पन्न शर्कराची रचना. ACN - तटस्थ ऑलिगोसॅकराइड्स असलेले एसीटोनिट्राइल अंश आणि FA - आम्ल ऑलिगोसॅकराइड्स असलेले फेरुलिक आम्ल अंश.
आकृती S9 मध्ये दाखवल्याप्रमाणे, ऑलिगोसॅकराइड अंशाच्या LC-MS विश्लेषणातून आणखी एक मनोरंजक निष्कर्ष काढण्यात आला (इलेक्ट्रॉनिक पूरक सामग्रीमध्ये पद्धती पाहिल्या जाऊ शकतात). ACN-B अंशाच्या बंधनादरम्यान हेक्सोज आणि -OAc गटांचे तुकडे वारंवार पाहिले गेले. हे निष्कर्ष केवळ ग्लायकोम आणि MALDI-TOF विश्लेषणात आढळलेल्या विखंडनाची पुष्टी करत नाही तर प्रीट्रीटेड लिग्नोसेल्युलोसिक बायोमासमध्ये संभाव्य कार्बोहायड्रेट डेरिव्हेटिव्ह्जबद्दल नवीन माहिती देखील प्रदान करते.
आम्ही TMS ग्लायकॅन डेरिव्हेटायझेशन वापरून ऑलिगोसॅकराइड अंशांचे ग्लायकॅन रचना विश्लेषण देखील केले. GC-MS वापरून, आम्ही ऑलिगोसॅकराइड अंशात न्यूरल (नॉन-डेरिव्हेटिव्ह) आणि आम्लयुक्त साखरेची (GluA आणि GalA) रचना निश्चित केली (आकृती 5). ग्लुकोरोनिक आम्ल आम्लयुक्त घटक C आणि D मध्ये आढळते, तर गॅलेक्च्युरोनिक आम्ल आम्लयुक्त घटक A आणि B मध्ये आढळते, जे दोन्ही आम्लयुक्त साखरेचे उच्च DP घटक आहेत. हे निकाल केवळ आमच्या ELISA आणि MALDI डेटाची पुष्टी करत नाहीत तर ऑलिगोसॅकराइड संचयनाच्या आमच्या मागील अभ्यासांशी देखील सुसंगत आहेत. म्हणून, आमचा असा विश्वास आहे की ऑलिगोसॅकराइड्सचे बायोटिनिलेशन आणि त्यानंतरच्या ELISA स्क्रीनिंग वापरून आधुनिक इम्यूनोलॉजिकल पद्धती विविध जैविक नमुन्यांमध्ये विरघळणारे रिकॅल्सीट्रंट ऑलिगोसॅकराइड्स शोधण्यासाठी पुरेसे आहेत.
ELISA-आधारित mAb स्क्रीनिंग पद्धती अनेक वेगवेगळ्या पद्धतींनी प्रमाणित केल्या गेल्या असल्याने, आम्हाला या नवीन परिमाणात्मक पद्धतीची क्षमता अधिक एक्सप्लोर करायची होती. दोन व्यावसायिक ऑलिगोसॅकराइड्स, xylohexasaccharide oligosaccharides (XHE) आणि 23-α-L-arabinofuranosyl-xylotriose (A2XX), सेल वॉल ग्लायकनला लक्ष्य करून नवीन mAb दृष्टिकोन वापरून खरेदी आणि चाचणी करण्यात आली. आकृती 6 बायोटिनिलेटेड बाइंडिंग सिग्नल आणि ऑलिगोसॅकराइड एकाग्रतेच्या लॉग एकाग्रतेमधील एक रेषीय सहसंबंध दर्शविते, जे संभाव्य लँगमुइर शोषण मॉडेल सूचित करते. mAbs मध्ये, CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148, आणि CCRC-M151 XHE शी सहसंबंधित आहेत, आणि CCRC-M108, CCRC-M109, आणि LM11 1 nm ते 100 नॅनोच्या श्रेणीत A2XX शी सहसंबंधित आहेत. प्रयोगादरम्यान अँटीबॉडीजची उपलब्धता मर्यादित असल्याने, प्रत्येक ऑलिगोसॅकराइड एकाग्रतेसह मर्यादित प्रयोग केले गेले. येथे हे लक्षात घेतले पाहिजे की काही अँटीबॉडीज सब्सट्रेट म्हणून समान ऑलिगोसॅकराइडवर खूप वेगळ्या पद्धतीने प्रतिक्रिया देतात, कदाचित कारण ते थोड्या वेगळ्या एपिटोपशी बांधले जातात आणि त्यांच्या बंधनकारकता खूप वेगळ्या असू शकतात. जेव्हा नवीन mAb दृष्टिकोन वास्तविक नमुन्यांवर लागू केला जातो तेव्हा अचूक एपिटोप ओळखण्याची यंत्रणा आणि परिणाम बरेच जटिल असतील.
विविध ग्लायकॅन-लक्ष्यीकरण mAbs ची शोध श्रेणी निश्चित करण्यासाठी दोन व्यावसायिक ऑलिगोसॅकराइड्स वापरले गेले. येथे, ऑलिगोसॅकराइड एकाग्रतेच्या लॉग एकाग्रतेसह रेषीय सहसंबंध (A) mAb सह XHE आणि (B) mAb सह A2XX साठी लँगमुइर शोषण नमुने दर्शवितात. संबंधित एपिटोप्स परखात सब्सट्रेट्स म्हणून वापरल्या जाणाऱ्या व्यावसायिक ऑलिगोसॅकराइड्सच्या संरचना दर्शवितात.
ग्लायकन-लक्ष्यित मोनोक्लोनल अँटीबॉडीजचा वापर (ग्लायकोकॉमिक विश्लेषण किंवा ELISA-आधारित mAb स्क्रीनिंग) हे वनस्पती बायोमास बनवणाऱ्या बहुतेक प्रमुख पेशी भिंतीच्या ग्लायकन्सचे सखोल वर्णन करण्यासाठी एक शक्तिशाली साधन आहे. तथापि, शास्त्रीय ग्लायकन विश्लेषण फक्त मोठ्या पेशी भिंतीच्या ग्लायकन्सचे वैशिष्ट्य दर्शवते, कारण बहुतेक ऑलिगोसॅकराइड्स ELISA प्लेट्सवर कार्यक्षमतेने स्थिर नसतात. या अभ्यासात, AFEX-प्रीट्रीटेड कॉर्न स्टोव्हरला उच्च घन पदार्थांच्या सामग्रीवर एंजाइमॅटिकली हायड्रोलायझ केले गेले. हायड्रोलायझेटमध्ये रिकॅल्सिट्रंट पेशी भिंतीच्या कार्बोहायड्रेट्सची रचना निश्चित करण्यासाठी साखर विश्लेषणाचा वापर करण्यात आला. तथापि, हायड्रोलायसेट्समधील लहान ऑलिगोसॅकराइड्सचे mAb विश्लेषण कमी लेखले जाते आणि ELISA प्लेट्सवर ऑलिगोसॅकराइड्स प्रभावीपणे स्थिर करण्यासाठी अतिरिक्त साधनांची आवश्यकता असते.
आम्ही येथे न्यूट्रएव्हिडिन™ लेपित प्लेट्सवर ऑलिगोसॅकराइड बायोटिनिलेशन आणि त्यानंतर एलिसा स्क्रीनिंग एकत्रित करून एमएबी स्क्रीनिंगसाठी एक नवीन आणि कार्यक्षम ऑलिगोसॅकराइड इमोबिलायझेशन पद्धत सादर करतो. इम्युबाइझ्ड बायोटिनिलेशन ऑलिगोसॅकराइड्सने अँटीबॉडीसाठी पुरेशी आत्मीयता दर्शविली ज्यामुळे रिकॅल्सिट्रंट ऑलिगोसॅकराइड्सचा जलद आणि कार्यक्षम शोध शक्य झाला. मास स्पेक्ट्रोमेट्रीवर आधारित या हट्टी ऑलिगोसॅकराइड्सच्या रचनेचे विश्लेषण केल्याने इम्युनोस्क्रीनिंगच्या या नवीन दृष्टिकोनाच्या परिणामांची पुष्टी झाली. अशाप्रकारे, या अभ्यासातून असे दिसून येते की ऑलिगोसॅकराइड बायोटिनिलेशन आणि एलिसा स्क्रीनिंगचे ग्लायकन-लक्ष्यित मोनोक्लोनल अँटीबॉडीजसह संयोजन ऑलिगोसॅकराइड्समधील क्रॉसलिंक्स शोधण्यासाठी वापरले जाऊ शकते आणि ऑलिगोसॅकराइड्सच्या संरचनेचे वैशिष्ट्य असलेल्या इतर जैवरासायनिक अभ्यासांमध्ये मोठ्या प्रमाणात वापरले जाऊ शकते.
ही बायोटिन-आधारित ग्लायकन प्रोफाइलिंग पद्धत वनस्पती बायोमासमध्ये विरघळणाऱ्या ऑलिगोसॅकराइड्सच्या रिकॅल्सीट्रंट कार्बोहायड्रेट बंधांची तपासणी करण्यास सक्षम असलेली पहिली अहवाल आहे. जैवइंधन उत्पादनाच्या बाबतीत बायोमासचे काही भाग इतके हट्टी का आहेत हे समजून घेण्यास हे मदत करते. ही पद्धत ग्लायकोम विश्लेषण पद्धतींमधील एक महत्त्वाची पोकळी भरून काढते आणि वनस्पती ऑलिगोसॅकराइड्सच्या पलीकडे असलेल्या सब्सट्रेट्सच्या विस्तृत श्रेणीमध्ये तिचा वापर वाढवते. भविष्यात, आम्ही बायोटिनिलेशनसाठी रोबोटिक्स वापरू शकतो आणि ELISA वापरून नमुन्यांच्या उच्च-थ्रूपुट विश्लेषणासाठी आम्ही विकसित केलेल्या पद्धतीचा वापर करू शकतो.
पायोनियर ३३ए१४ हायब्रिड बियाण्यांपासून उगवलेला कॉर्न स्ट्रॉ (सीएस) २०१० मध्ये रे, कोलोरॅडो येथील क्रॅमर फार्म्समधून काढला गेला. जमीन मालकाच्या परवानगीने, हा बायोमास संशोधनासाठी वापरता येतो. हे नमुने खोलीच्या तापमानात झिप-लॉक बॅगमध्ये ६% पेक्षा कमी आर्द्रतेसह कोरड्या स्थितीत साठवले गेले. हे नमुने खोलीच्या तापमानात झिप-लॉक बॅगमध्ये ६% पेक्षा कमी आर्द्रतेसह कोरड्या स्थितीत साठवले गेले. Образцы хранились сухими при влажности < 6% в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре. नमुने खोलीच्या तपमानावर झिपर असलेल्या पिशव्यांमध्ये <6% आर्द्रतेवर कोरडे साठवले गेले.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中.样品在室温下以干燥< 6% Образцы хранят в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре с влажностью < 6%. नमुने झिपर बॅगमध्ये खोलीच्या तपमानावर साठवले जातात जिथे आर्द्रता 6% पेक्षा कमी असते.अभ्यास स्थानिक आणि राष्ट्रीय मार्गदर्शक तत्त्वांचे पालन करतो. NREL प्रोटोकॉल वापरून रचनात्मक विश्लेषण केले गेले. या रचनामध्ये 31.4% ग्लुकन, 18.7% झायलन, 3.3% अरबीनन, 1.2% गॅलेक्टन, 2.2% एसिटाइल, 14.3% लिग्निन, 1.7% प्रथिने आणि 13.4% राख असल्याचे आढळून आले.
सेलिक® CTec2 (१३८ मिलीग्राम प्रथिने/मिली, लॉट VCNI 0001) हे नोव्होझाइम्स (फ्रँकलिंटन, एनसी, यूएसए) कडून सेल्युलेज, β-ग्लुकोसिडेस आणि सेलिक® HTec2 (१५७ मिलीग्राम प्रथिने/मिली, लॉट VHN00001) यांचे एक जटिल मिश्रण आहे. मल्टीफेक्ट पेक्टिनेज® (७२ मिलीग्राम प्रथिने/मिली), पेक्टिन कमी करणाऱ्या एन्झाईम्सचे एक जटिल मिश्रण, ड्यूपॉन्ट इंडस्ट्रियल बायोसायन्सेस (पालो अल्टो, सीए, यूएसए) द्वारे दान केले गेले. केजेल्डहल नायट्रोजन विश्लेषण (AOAC पद्धत २००१.११, डेअरी वन कोऑपरेटिव्ह इंक., इथाका, NY, यूएसए) वापरून प्रथिने सामग्रीचा अंदाज घेऊन (आणि नॉन-प्रोटीन नायट्रोजनचे योगदान वजा करून) एंजाइम प्रथिनांची सांद्रता निश्चित केली गेली. डायटोमेशियस अर्थ ५४५ हे EMD मिलिपोर (बिलेरिका, एमए) कडून खरेदी केले गेले. सक्रिय कार्बन (DARCO, 100 मेश ग्रॅन्यूल), एव्हिसेल (PH-101), बीच झायलन आणि इतर सर्व रसायने सिग्मा-अल्ड्रिच (सेंट लुईस, MO) येथून खरेदी करण्यात आली.
AFEX प्रीट्रीटमेंट GLBRC (बायोमास कन्व्हर्जन रिसर्च लॅबोरेटरी, MSU, लॅन्सिंग, MI, USA) येथे करण्यात आले. प्री-ट्रीटमेंट १४०° सेल्सिअस तापमानावर १५ मिनिटांसाठी करण्यात आले. स्टेनलेस स्टील बेंचटॉप बॅच रिअॅक्टर (Parr Instruments Company) मध्ये ६०% (w/w) लोडिंगवर निर्जल अमोनिया आणि बायोमासच्या १:१ गुणोत्तरावर ४६ रेसिडेन्स टाइम. यास ३० मिनिटे लागली. रिअॅक्टर १४०° सेल्सिअस तापमानावर आणण्यात आला आणि अमोनिया वेगाने सोडण्यात आला, ज्यामुळे बायोमास खोलीच्या तापमानावर लवकर परत येऊ शकला. AFEX प्री-ट्रीटेड कॉर्न स्टोव्हर (ACS) ची रचना न केलेल्या कॉर्न स्टोव्हर (UT-CS) सारखीच होती.
ऑलिगोसॅकराइड्सच्या मोठ्या प्रमाणात उत्पादनासाठी प्रारंभिक सामग्री म्हणून उच्च घन पदार्थ ACSH 25% (w/w) (अंदाजे 8% डेक्सट्रान लोडिंग) तयार केले गेले. ACS चे एंजाइमॅटिक हायड्रोलिसिस व्यावसायिक एन्झाइम मिश्रण वापरून केले गेले ज्यामध्ये Cellic® Ctec2 10 mg प्रथिने/g ग्लुकन (प्रीट्रीटेड बायोमासमध्ये), Htec2 (नोव्होझाइम्स, फ्रँकलिन्टन, NC), 5 mg प्रथिने/g ग्लुकन आणि मल्टीफेक्ट पेक्टिनेज (जेनेनकोर इंक, यूएसए) यांचा समावेश होता. ). ), 5 mg प्रथिने/g डेक्सट्रान. एंजाइमॅटिक हायड्रोलिसिस 5-लिटर बायोरिअॅक्टरमध्ये 3 लिटर, pH 4.8, 50°C आणि 250 rpm च्या कार्यरत व्हॉल्यूमसह केले गेले. 96 तासांसाठी हायड्रोलिसिस केल्यानंतर, हायड्रोलिझेट 30 मिनिटांसाठी 6000 rpm वर सेंट्रीफ्यूगेशनद्वारे आणि नंतर 30 मिनिटांसाठी 14000 rpm वर अनहायड्रोलायझ्ड घन पदार्थ काढून टाकण्यासाठी गोळा केले गेले. त्यानंतर हायड्रोलायझेटला ०.२२ मिमी फिल्टर बीकरद्वारे निर्जंतुकीकरण केले गेले. फिल्टर केलेले हायड्रोलायझेट ४° सेल्सिअस तापमानात निर्जंतुकीकरण केलेल्या बाटल्यांमध्ये साठवले गेले आणि नंतर कार्बनवर त्याचे अंशीकरण केले गेले.
NREL प्रयोगशाळेतील विश्लेषण प्रक्रियेनुसार अर्क-आधारित बायोमास नमुन्यांच्या रचनेचे विश्लेषण: रचना विश्लेषणासाठी नमुने तयार करणे (NREL/TP-510-42620) आणि बायोमासमधील स्ट्रक्चरल कार्बोहायड्रेट्स आणि लिग्निनचे निर्धारण (NREL/TP-510 – 42618)47.
ऑटोक्लेव्ह-आधारित अ‍ॅसिड हायड्रोलिसिस पद्धतीचा वापर करून हायड्रोलायझेट प्रवाहाचे ऑलिगोसॅकराइड विश्लेषण २ मिली स्केलवर केले गेले. १० मिली स्क्रू कॅप कल्चर ट्यूबमध्ये हायड्रोलायझेट नमुना ६९.७ μl ७२% सल्फ्यूरिक अ‍ॅसिडसह मिसळा आणि १२१ °C वर बेंचटॉपवर १ तासासाठी इनक्यूबेट करा, बर्फावर थंड करा आणि उच्च कार्यक्षमता असलेल्या लिक्विड क्रोमॅटोग्राफी (HPLC) व्हिलमध्ये फिल्टर करा. अ‍ॅसिड-हायड्रोलायझ्ड नमुन्यातील एकूण साखरेच्या एकाग्रतेतून नॉन-हायड्रोलायझ्ड नमुन्यातील मोनोसॅकराइड्सच्या एकाग्रतेला वजा करून ऑलिगोसॅकराइड्सची एकाग्रता निश्चित केली गेली.
बायो-रॅड अमिनेक्स HPX-87H स्तंभावर ऑटोसॅम्पलर, कॉलम हीटर, आयसोक्रॅटिक पंप आणि अपवर्तक निर्देशांक डिटेक्टरने सुसज्ज असलेल्या शिमाडझू HPLC प्रणालीचा वापर करून आम्ल हायड्रोलायझ्ड बायोमासमधील ग्लुकोज, झायलोज आणि अरबिनोज सांद्रतेचे विश्लेषण केले गेले. स्तंभ 50°C वर राखला गेला आणि 0.6 मिली/मिनिट 5 mM H2SO4 पाण्याच्या प्रवाहाने उत्सर्जित केला गेला.
हायड्रोलायझेट सुपरनॅटंट पातळ करून मोनोमर आणि ऑलिगोसॅकराइड सामग्रीसाठी विश्लेषण केले गेले. एन्झाइमॅटिक हायड्रोलायसिसनंतर मिळवलेल्या मोनोमेरिक शर्कराचे विश्लेषण बायो-रॅड (हरक्यूलिस, सीए) अमिनेक्स एचपीएक्स-८७पी कॉलम आणि अॅश गार्ड कॉलमने सुसज्ज एचपीएलसी द्वारे केले गेले. कॉलमचे तापमान ८०°C वर राखले गेले, ०.६ मिली/मिनिट प्रवाह दरासह पाण्याचा वापर मोबाइल फेज म्हणून केला गेला. रेफर्स ४१, ४८, ४९ मध्ये वर्णन केलेल्या पद्धतींनुसार १२१°C वर डायल्युट अ‍ॅसिडमध्ये हायड्रोलायसिसद्वारे ऑलिगोसॅकराइड्स निश्चित केले गेले.
पूर्वी वर्णन केलेल्या प्रक्रिया २७, ४३, ५०, ५१ वापरून कच्च्या, AFEX पूर्व-उपचारित आणि सर्व नॉन-हायड्रोलायझ्ड बायोमास अवशेषांवर (सीरियल सेल वॉल अर्कांचे उत्पादन आणि त्यांच्या mAb स्क्रीनिंगसह) सॅकेराइड विश्लेषण केले गेले. ग्लायकोम विश्लेषणासाठी, वनस्पती पेशी भिंतीच्या साहित्याचे अल्कोहोल-अघुलनशील अवशेष बायोमास अवशेषांपासून तयार केले जातात आणि अमोनियम ऑक्सलेट (५० mM), सोडियम कार्बोनेट (५० mM आणि ०.५% w/v), CON. (१M आणि ४M, दोन्ही १% w/v सोडियम बोरोहायड्राइडसह) आणि पूर्वी वर्णन केल्याप्रमाणे अ‍ॅसिड क्लोराईट सारख्या वाढत्या आक्रमक अभिकर्मकांसह क्रमिक निष्कर्षण केले जातात. त्यानंतर अर्कांना पेशी भिंतीच्या ग्लायकनकडे निर्देशित केलेल्या mAb50s च्या जटिल पॅनेलवर ELISA च्या अधीन केले गेले आणि mAb बंधनकारक प्रतिक्रिया उष्णता नकाशा म्हणून सादर केल्या गेल्या. वनस्पती पेशी भिंतीच्या ग्लायकनला लक्ष्य करणारे mAbs प्रयोगशाळेतील साठ्यांमधून (CCRC, JIM आणि MAC मालिका) खरेदी केले गेले.
ऑलिगोसॅकराइड्सचे एक-चरण बायोटिनिलेशन. कार्बोहायड्रेट्सचे बायोटिन-एलसी-हायड्राझाइडसह संयुग्मन खालील प्रक्रियेचा वापर करून केले गेले. बायोटिन-एलसी-हायड्राझाइड (४.६ मिग्रॅ/१२ माइक्रोमोल) डायमिथाइल सल्फोक्साइड (डीएमएसओ, ७० माइक्रोलोटर) मध्ये ६५° सेल्सिअस तापमानावर १ मिनिटासाठी जोरदार ढवळून आणि गरम करून विरघळवले गेले. ग्लेशियल एसिटिक अॅसिड (३० माइक्रोलोटर) जोडले गेले आणि मिश्रण सोडियम सायनोबोरोहायड्राइड (६.४ मिग्रॅ/१०० माइक्रोमोल) वर ओतले गेले आणि ६५° सेल्सिअस तापमानावर सुमारे १ मिनिट गरम केल्यानंतर पूर्णपणे विरघळले गेले. नंतर, रिड्यूसिंग एंडवर लेबलचा १० पट किंवा त्याहून अधिक मोलर जादा मिळविण्यासाठी ५ ते ८ माइक्रोलोटर प्रतिक्रिया मिश्रण वाळलेल्या ऑलिगोसॅकराइड (१-१०० एनएमओल) मध्ये जोडले गेले. ही प्रतिक्रिया ६५° सेल्सिअस तापमानावर २ तासांसाठी केली गेली, त्यानंतर नमुने लगेच शुद्ध केले गेले. लेबलिंग प्रयोगांमध्ये रिडक्शनशिवाय सोडियम सायनोबोरोहायड्राइड वापरण्यात आले नाही आणि नमुने 65° सेल्सिअस तापमानावर 2.5 तासांसाठी प्रतिक्रिया देण्यात आली.
बायोटिनिलेटेड ऑलिगोसॅकराइड्सच्या नमुन्यांचे एलिसा लेप आणि धुणे. एव्हिडिन-लेपित प्लेटच्या प्रत्येक विहिरीमध्ये २५ μl बायोटिनिलेटेड नमुने (०.१ एम ट्रिस बफर सोल्यूशन (टीबीएस) च्या ५ मिलीमध्ये पातळ केलेल्या प्रत्येक सांद्रित नमुन्याचे १०० μl) जोडले गेले. ०.१ एम टीबीएसमध्ये १० μg/मिलीच्या एकाग्रतेवर नियंत्रण विहिरींवर ५० μl बायोटिनचा लेप लावण्यात आला. रिकाम्या मोजमापांसाठी डिआयोनाइज्ड पाणी कोटिंग म्हणून वापरले गेले. टॅब्लेट अंधारात खोलीच्या तपमानावर २ तास उबवण्यात आले. ग्रेनियर फ्लॅट ३ए साठी प्रोग्राम क्रमांक ११ वापरून प्लेट ३ वेळा ०.१ एम टीबीएसमध्ये ०.१% स्किम्ड दुधाने धुवा.
प्राथमिक अँटीबॉडीज जोडणे आणि धुणे. प्रत्येक विहिरीत ४० μl प्राथमिक अँटीबॉडी घाला. खोलीच्या तपमानावर अंधारात १ तास मायक्रोप्लेट उबवा. नंतर ग्रेनियर फ्लॅट ३ए साठी वॉश प्रोग्राम #११ वापरून प्लेट्स ०.१% दुधासह ०.१ दशलक्ष टीबीएसमध्ये ३ वेळा धुतल्या गेल्या.
दुय्यम अँटीबॉडी घाला आणि धुवा. प्रत्येक विहिरीत ५० μl उंदीर/उंदीर दुय्यम अँटीबॉडी (०.१% दुधात १:५००० ०.१ एम टीबीएसमध्ये पातळ केलेले) घाला. खोलीच्या तपमानावर अंधारात १ तास मायक्रोप्लेट उबवा. त्यानंतर ग्रेनियर फ्लॅट ५ए प्लेट वॉश प्रोग्राम #१२ वापरून मायक्रोप्लेट्स ०.१% दुधात ०.१ एम टीबीएसमध्ये ५ वेळा धुतले गेले.
सब्सट्रेट जोडणे. बेस सब्सट्रेटमध्ये ५० μl ३,३′,५,५′-टेट्रामेथिलबेन्झिडाइन (TMB) घाला (१५ मिली डिआयोनाइज्ड पाण्यात बफरचे २ थेंब, TMBचे ३ थेंब, हायड्रोजन पेरॉक्साइडचे २ थेंब घालून). TMB सब्सट्रेट तयार करा. आणि वापरण्यापूर्वी व्होर्टेक्स). मायक्रोप्लेट खोलीच्या तपमानावर ३० मिनिटे उबवा. अंधारात.
चरण पूर्ण करा आणि टॅब्लेट वाचा. प्रत्येक विहिरीत 50 μl 1 N सल्फ्यूरिक आम्ल घाला आणि ELISA रीडर वापरून 450 ते 655 nm पर्यंत शोषण नोंदवा.
या विश्लेषणांचे १ मिलीग्राम/मिली द्रावण डीआयोनाइज्ड पाण्यात तयार करा: अरेबिनोज, रॅमनोज, फ्यूकोज, झायलोज, गॅलेक्चुरोनिक आम्ल (GalA), ग्लुक्युरोनिक आम्ल (GlcA), मॅनोज, ग्लुकोज, गॅलेक्टोज, लैक्टोज, N-एसिटिलमॅनोसामाइन (manNAc), N-एसिटिलग्लुकोसामाइन. (glcNAc), N-एसिटिलगॅलेक्टोसामाइन (galNAc), इनोसिटॉल (अंतर्गत मानक). तक्ता १ मध्ये दर्शविलेले १ मिलीग्राम/मिली साखर द्रावण जोडून दोन मानके तयार केली गेली. सर्व पाणी काढून टाकेपर्यंत (सामान्यतः सुमारे १२-१८ तास) नमुने गोठवले जातात आणि -८०° सेल्सिअस तापमानावर लायोफिलाइज केले जातात.
विश्लेषणात्मक संतुलनावर स्क्रू कॅप ट्यूबमध्ये १००-५०० µg नमुना घाला. जोडलेल्या प्रमाणाची नोंद करा. नमुना एका विशिष्ट सांद्रता असलेल्या द्रावणात विरघळवणे आणि तो द्रवरूपात ट्यूबमध्ये जोडणे चांगले. प्रत्येक नमुना नळीसाठी अंतर्गत मानक म्हणून २० µl १ mg/ml इनोसिटॉल वापरा. ​​नमुन्यात जोडलेल्या अंतर्गत मानकाचे प्रमाण मानक नळीत जोडलेल्या अंतर्गत मानकाच्या प्रमाणाइतकेच असले पाहिजे.
स्क्रू कॅपच्या बाटलीत ८ मिली निर्जल मिथेनॉल घाला. नंतर ४ मिली ३ नॅनो मेथेनॉलिक एचसीएल द्रावण झाकून आणि हलवून घाला. या प्रक्रियेत पाण्याचा वापर होत नाही.
ऑलिगोसॅकराइड नमुने आणि मानक TMS ट्यूबमध्ये 500 μl 1 M HCl मिथेनॉल द्रावण घाला. नमुने रात्री (168 तास) 80° सेल्सिअस तापमानावर थर्मल ब्लॉकमध्ये उबवले गेले. मेथेनोलिसिस उत्पादन खोलीच्या तपमानावर ड्रायिंग मॅनिफोल्ड वापरून वाळवा. 200 μl MeOH घाला आणि पुन्हा वाळवा. ही प्रक्रिया दोनदा पुनरावृत्ती होते. नमुन्यात 200 μl मिथेनॉल, 100 μl पायरीडिन आणि 100 μl एसिटिक एनहाइड्राइड घाला आणि चांगले मिसळा. नमुने खोलीच्या तपमानावर 30 मिनिटे उबवा. आणि वाळवा. 200 μl मिथेनॉल घाला आणि पुन्हा वाळवा.
२०० μl ट्राय-सिल घाला आणि बंद नळी २० मिनिटे गरम करा. ८०°C, नंतर खोलीच्या तापमानाला थंड करा. नमुना सुमारे ५० μl पर्यंत आणखी सुकविण्यासाठी ड्रायिंग मॅनिफोल्ड वापरा. ​​हे लक्षात ठेवणे महत्त्वाचे आहे की आम्ही नमुने पूर्णपणे सुकू दिले नाहीत.
२ मिली हेक्सेन घाला आणि व्होर्टेक्सिंग करून चांगले मिसळा. ५-३/४ इंच व्यासाच्या पिपेटवर काचेचे लोकर घालून पाश्चर पिपेट्स (५-८ मिमी) च्या टोकांना काचेच्या लोकरचा तुकडा भरा. नमुने ३००० ग्रॅमवर ​​२ मिनिटांसाठी सेंट्रीफ्यूज केले गेले. कोणतेही अघुलनशील अवशेष अवक्षेपित होतात. नमुना १००-१५० µl पर्यंत वाळवा. ८० °C च्या सुरुवातीच्या तापमानात आणि २.० मिनिटांच्या सुरुवातीच्या वेळेत GC-MS मध्ये अंदाजे १ μl चे आकारमान इंजेक्ट केले गेले (तक्ता २).