Terima kasih kerana melawati Nature.com.Versi penyemak imbas yang anda gunakan mempunyai sokongan terhad untuk CSS. Untuk pengalaman terbaik, kami mengesyorkan agar anda menggunakan penyemak imbas yang dikemas kini (atau matikan mod keserasian dalam Internet Explorer). Sementara itu, untuk memastikan sokongan berterusan, kami akan memaparkan tapak tanpa gaya dan JavaScript.
Morfogenesis usus manusia mewujudkan ciri-ciri crypt-villus bagi mikroarkitektur epitelium 3D dan organisasi spatial. Struktur unik ini diperlukan untuk mengekalkan homeostasis usus dengan melindungi niche sel stem dalam crypt basal daripada antigen mikrob eksogen dan metabolitnya. Di samping itu, vili usus dan sel merembeskan mukus permukaan epitel refinaktif yang berbeza berfungsi pada permukaan mucus. bijih, mencipta semula struktur epitelium 3D adalah penting untuk pembinaan model usus in vitro. Terutama sekali, usus-on-a-cip mimetik organik boleh mendorong morfogenesis 3D spontan epitelium usus dengan fungsi fisiologi dan biomekanik yang dipertingkatkan. Di sini, kami menyediakan protokol induksi mikroorganisma yang boleh dihasilkan semula pada intestinal usus sebagai intestinal yang boleh dihasilkan semula. cip hibrid tertanam Transwell. Kami menghuraikan kaedah terperinci untuk fabrikasi peranti, pengkulturan Caco-2 atau sel epitelium organoid usus dalam tetapan konvensional serta pada platform mikrobendalir, aruhan morfogenesis 3D dan pencirian epitelium 3D yang mantap menggunakan modaliti pengimejan berbilang .Protokol berfungsi ini mencapai penjanaan semula mikroorganisma mikromorfik. kaedah ogenesis menggunakan tegasan ricih dan gerakan mekanikal yang berkaitan secara fisiologi dan tidak memerlukan kejuruteraan atau manipulasi sel yang kompleks, yang mungkin mengatasi teknik sedia ada yang lain. Kami membayangkan bahawa protokol yang dicadangkan kami boleh mempunyai implikasi yang luas untuk komuniti penyelidikan bioperubatan, menyediakan kaedah untuk menjana semula lapisan epitelium usus 3D secara in vitro untuk farmaseutikal bioperubatan, klinikal dan farmaseutikal.
Eksperimen menunjukkan bahawa sel Caco-2 epitelium usus yang dikultur dalam gut-on-a-chip1,2,3,4,5 atau peranti mikrobendalir dwilapis6,7 boleh menjalani morfogenesis 3D spontan secara in vitro tanpa pemahaman yang jelas tentang mekanisme asas. Dalam kajian baru-baru ini kami, kami mendapati bahawa penyingkiran peranti morfogen apithelial yang dirembeskan secara basolateral adalah morfogenD apithelial yang diperlukan secara in vitro. in vitro, yang telah ditunjukkan oleh Caco-2 dan organoid usus yang berasal dari pesakit.Sel-sel epitelium telah disahkan. Dalam kajian ini, kami secara khusus menumpukan pada pengeluaran sel dan pengedaran kepekatan antagonis Wnt yang kuat, Dickkopf-1 (DKK-1), dalam cip-on-a-chip dan peranti mikrobendalir diubah suai yang mengandungi sisipan Transwell, yang dipanggil "Cip Hibrid". 1, atau Soggy-1) kepada usus pada cip menghalang morfogenesis atau mengganggu lapisan epitelium 3D tersusun awal, menunjukkan bahawa tekanan antagonis semasa kultur bertanggungjawab untuk morfogenesis usus secara in vitro. Oleh itu, pendekatan praktikal untuk mencapai morfogenesis yang teguh pada antara muka epitelium adalah untuk membuang atau mengekalkan tahap penggumpalan basog dalam bahagian sisi yang aktif secara minima -platform on-a-chip atau hibrid-on-a-chip) atau resapan .Media basolateral (cth, dari sisipan Transwell ke dalam takungan basolateral yang besar dalam telaga).
Dalam protokol ini, kami menyediakan kaedah terperinci untuk mengarang peranti mikro usus pada cip dan cip hibrid boleh dimasukkan Transwell (langkah 1-5) untuk menkultur sel epitelium usus pada membran berliang berasaskan polydimethylsiloxane (PDMS) (langkah 6A, 7A, 8, 9) atau poliester Bs, 8 steps, membran Transwell, 8, 9) ced 3D morphogenesis in vitro (langkah 10).Kami juga mengenal pasti ciri selular dan molekul yang menunjukkan histogenesis khusus tisu dan pembezaan selular yang bergantung kepada keturunan dengan menggunakan pelbagai modaliti pengimejan (langkah 11-24). Monolayers 2D, dan biokimia usus dan Pengeluaran semula persekitaran mikro biomekanikal.in vitro.Untuk mendorong morfogenesis 3D daripada monolayers epitelium 2D, kami mengalih keluar antagonis morfogen dalam kedua-dua bentuk kultur dengan mengalirkan medium ke dalam petak basolateral kultur. Akhir sekali, kami menyediakan perwakilan lapisan boleh bergantung kepada epitelium D yang boleh bergantung kepada model 3D yang boleh digunakan. pertumbuhan epitelium, kultur bersama hos-mikrobime longitudinal, jangkitan patogen, kecederaan radang, disfungsi penghalang epitelium dan terapi berasaskan probiotik Contoh.pengaruh.
Protokol kami mungkin berguna kepada pelbagai saintis dalam bidang asas (cth, biologi mukosa usus, biologi sel stem dan biologi perkembangan) dan penyelidikan gunaan (cth, ujian ubat praklinikal, pemodelan penyakit, kejuruteraan tisu dan gastroenterologi) kesan luas. diberikan kepada khalayak yang mengkaji dinamik isyarat sel semasa perkembangan usus, penjanaan semula atau homeostasis .Selain itu, protokol kami berguna untuk menyoal siasat jangkitan di bawah pelbagai agen berjangkit seperti Norovirus 8, Sindrom Pernafasan Akut Teruk Coronavirus 2 (SARS-CoV-2), Clostridium difficile, Salmonella Typhimuorium.Khalayak patologi dan patogenesis penyakit juga berguna.Penggunaan sistem mikrofisiologi usus pada cip boleh membenarkan kultur bersama membujur 10 dan penilaian seterusnya pertahanan perumah, tindak balas imun dan pembaikan kecederaan yang berkaitan dengan patogen dalam saluran gastrousus (GI) 11 . Gangguan GI lain yang berkaitan dengan sindrom usus bocor, penyakit seliak, sindrom Crohn, irritable bowel, kolitis, ulseratif, boleh dihidapi. lapisan epitelium inal disediakan menggunakan lapisan epitelium usus 3D pesakit , penyakit ini termasuk atrofi villous, pemendekan crypt, kerosakan mukosa atau halangan epitelium terjejas. Biopsi atau organoid usus yang berasal dari sel stem12,13. Untuk memodelkan dengan lebih baik kerumitan penyakit-penyakit sel periferal, jenis sel pesakit yang lebih tinggi boleh mempertimbangkan sel-sel periferal periferal yang lebih tinggi. PBMC), kepada model yang mengandungi mikroarchitectures villus-crypt usus 3D.sel imun khusus tisu, 5.
Memandangkan struktur mikro epitelium 3D boleh diperbaiki dan divisualisasikan tanpa proses pembahagian, penonton yang bekerja pada transkriptomi spatial dan pengimejan resolusi tinggi atau resolusi super mungkin berminat dengan pemetaan kami tentang dinamik spatiotemporal gen dan protein pada niche epitelium.Berminat dengan teknologi.Tindak balas terhadap rangsangan mikrob atau imun.Tambahan pula, crosstalk hos-mikrobiom membujur 10, 14 yang menyelaraskan homeostasis usus boleh diwujudkan dalam lapisan mukosa usus 3D dengan mengkultur bersama pelbagai spesies mikrob, komuniti mikrob atau mikrobiota najis, terutamanya dalam usus-usus.dalam platform.Pendekatan ini amat menarik kepada khalayak yang mempelajari imunologi mukosa, gastroenterologi, mikrobiom manusia, kulturomik dan mikrobiologi klinikal yang ingin memupuk mikrobiota usus yang tidak dikultur sebelum ini di dalam makmal. Jika protokol morfogenesis in vitro kami boleh disesuaikan dengan format kultur berskala, seperti sisipan berbilang telaga dalam 24, 496 dan juga protokol kompilasi plat yang berterusan, 496 atau 24, 496 disebarkan kepada mereka yang sedang membangunkan platform penapisan atau pengesahan farmaseutikal, bioperubatan Atau pemprosesan tinggi untuk industri makanan. Sebagai bukti prinsip, kami baru-baru ini menunjukkan kebolehlaksanaan sistem morfogenesis pemprosesan tinggi multipleks yang boleh berskala kepada format plat 24-telaga. Selain itu, pelbagai produk organ-on-a-cip,17 telah dikomersialkan,16 dikomersialkan dalam kaedah vitroogenesis kami. dipercepatkan dan berpotensi diterima pakai oleh banyak makmal penyelidikan, industri atau agensi kerajaan dan kawal selia untuk memahami pengaturcaraan semula selular morfogenesis usus in vitro pada tahap transkriptomi untuk menguji ubat atau bioterapeutik Penyerapan dan pengangkutan calon dadah dinilai menggunakan pengganti usus 3D atau menggunakan model reproducibility organ-on-a-cip tersuai atau komersial untuk menilai kebolehhasilan semula gut.
Sebilangan terhad model eksperimen yang berkaitan dengan manusia telah digunakan untuk mengkaji morfogenesis epitelium usus, terutamanya disebabkan oleh kekurangan protokol yang boleh dilaksanakan untuk mendorong morfogenesis 3D secara in vitro. Malah, kebanyakan pengetahuan semasa tentang morfogenesis usus adalah berdasarkan kajian haiwan (cth, ikan zebra20, tikus21 atau ayam yang paling penting dan boleh dipersoalkan secara entensif). ly, tidak menentukan dengan tepat proses pembangunan manusia. Model-model ini juga sangat terhad dalam keupayaan mereka untuk diuji dalam cara berskala pelbagai hala. Oleh itu, protokol kami untuk menjana semula struktur tisu 3D secara in vitro mengatasi prestasi dalam model haiwan in vivo serta model kultur sel 2D statik tradisional lain. Seperti yang diterangkan sebelum ini, menggunakan struktur epitelial 3D yang berbeza dalam sel-sel epitelium tempatan dibenarkan -paksi vilus sebagai tindak balas kepada pelbagai rangsangan mukosa atau imun. Lapisan epitelium 3D boleh menyediakan ruang untuk mengkaji bagaimana sel mikrob bersaing untuk membentuk ceruk ruang dan evolusi ekologi sebagai tindak balas kepada faktor perumah (cth, lapisan mukus dalam lawan luar, rembesan IgA dan peptida antimikrobial).Tambahan pula, 3D membolehkan kita memahami struktur epitelium mikrobiologi dan 3D terhadap struktur epitel usus. menghasilkan metabolit mikrob (cth, asid lemak rantai pendek) yang membentuk organisasi selular dan relung sel stem dalam crypt basal. Ciri-ciri ini hanya boleh ditunjukkan apabila lapisan epitelium 3D ditubuhkan secara in vitro.
Sebagai tambahan kepada kaedah kami untuk mencipta struktur epitelium usus 3D, terdapat beberapa kaedah in vitro. Kultur organoid usus ialah teknik kejuruteraan tisu tercanggih berdasarkan penanaman sel stem usus di bawah keadaan morfogen tertentu23,24,25. Walau bagaimanapun, penggunaan model organoid 3D-kultur-mikrobi selalunya adalah untuk analisis kultur mikroorganisma perumah untuk analisis kultur kollen dalam pengangkutan. adalah tertutup di dalam organoid dan, oleh itu, pengenalan komponen luminal seperti sel mikrob atau antigen eksogen adalah terhad.Akses kepada lumen organoid boleh dipertingkatkan menggunakan penyuntik mikro,26,27 tetapi kaedah ini adalah invasif dan intensif buruh dan memerlukan pengetahuan khusus untuk melaksanakannya.Tambahan pula, kultur organoid tradisional yang dikekalkan dalam perancah hidrogel di bawah keadaan statik tidak mencerminkan secara tepat biomekanik aktif dalam vivo.
Pendekatan lain yang digunakan oleh beberapa kumpulan penyelidikan menggunakan perancah hidrogel 3D prastruktur untuk meniru struktur epitelium usus dengan mengkultur sel-sel usus manusia yang terpencil pada permukaan gel. Fabrikasi perancah hidrogel menggunakan cetakan 3D, gilingan mikro atau acuan yang direka secara litografi dengan susunan sel vitrogen terpencil yang berkaitan dengan sel vitrogen yang berkaitan kecerunan, mewujudkan struktur epitelium nisbah aspek yang tinggi dan crosstalk stroma-epitelial dengan memasukkan sel stroma dalam perancah.Walau bagaimanapun, sifat perancah prastruktur mungkin menghalang paparan proses morfogenetik spontan itu sendiri.Model ini juga tidak menyediakan luminal dinamik atau aliran interstitial shearmorphic yang dinamik, yang tidak memerlukan tekanan dalam sel-sel cecair interstitial yang terkini. kajian menggunakan perancah hidrogel dalam platform mikrobendalir dan struktur epitelium usus bercorak menggunakan teknik pengetsaan laser. Organoid usus tetikus mengikut corak terukir untuk membentuk struktur tiub usus, dan aliran bendalir intraluminal boleh direkapitulasi menggunakan modul mikrobendalir. Walau bagaimanapun, model ini tidak mempamerkan proses mekanogenetik cetak3 yang spontan3 model ini. kumpulan yang sama dapat mencipta tiub usus kecil dengan proses morfogenetik spontan. Walaupun fabrikasi kompleks segmen usus yang berbeza dalam tiub, model ini juga tidak mempunyai aliran bendalir luminal dan ubah bentuk mekanikal. Selain itu, kebolehkendalian model mungkin terhad, terutamanya selepas proses bioprinting selesai, mengganggu keadaan eksperimen atau interaksi sel-ke-sel. Sebaliknya, biomorfologi yang dicadangkan oleh protokol fizik kami yang relevan. meniru motilitas usus, kebolehcapaian kompartmen apikal dan basolateral bebas, dan penciptaan semula persekitaran mikro biologi kompleks modulariti.Oleh itu, protokol morfogenesis 3D in vitro kami mungkin menyediakan pendekatan pelengkap untuk mengatasi cabaran kaedah sedia ada.
Protokol kami tertumpu sepenuhnya pada morfogenesis epitelium 3D, dengan hanya sel epitelium dalam kultur dan tiada jenis sel lain di sekelilingnya seperti sel mesenkim, sel endothelial dan sel imun. Seperti yang diterangkan sebelum ini, teras protokol kami ialah induksi morfogenesis epitelium dengan mengeluarkan perencat morfogen yang dirembeskan pada sisi basolateral W hibrid-modul chibusity yang diperkenalkan. -on-a-chip membolehkan kami mencipta semula lapisan epitelium 3D yang beralun, kerumitan biologi tambahan seperti interaksi epitelium-mesenchymal33,34, pemendapan Matriks ekstraselular (ECM) 35 dan, dalam model kami, ciri-ciri crypt-villus yang menyampaikan ceruk sel stem dalam kript basal masih perlu dipertimbangkan lagi.Stromal memainkan peranan protein dalam sel-sel fibroblast dalam sel-sel fibromesenchymal. s dan pengawalan morfogenesis usus dalam vivo35,37,38. Penambahan sel mesenkim pada model kami meningkatkan proses morfogenetik dan kecekapan lampiran sel. Lapisan endothelial (iaitu, kapilari atau limfatik) memainkan peranan penting dalam mengawal selia pengangkutan molekul39 dan pengambilan sel imun40 dalam model lain yang berkaitan dengan tisu mikro. quisite apabila model tisu direka bentuk untuk menunjukkan interaksi berbilang organ.Oleh itu, sel endothelial mungkin perlu disertakan untuk memodelkan ciri fisiologi yang lebih tepat dengan resolusi peringkat organ.Sel imun yang diperolehi oleh pesakit juga penting untuk memaparkan tindak balas imun semula jadi, persembahan antigen, crosstalk imun adaptif semula jadi dan imuniti khusus tisu dalam konteks mimili.
Penggunaan cip hibrid adalah lebih mudah daripada gut-on-a-chip kerana persediaan peranti adalah lebih mudah dan penggunaan sisipan Transwell membolehkan kultur epitelium usus yang boleh berskala. Walau bagaimanapun, sisipan Transwell yang boleh didapati secara komersial dengan membran poliester tidak elastik dan tidak boleh mensimulasikan pergerakan seperti peristaltik. Tambahan pula, dalam petak serpihan hibrid Transwell tidak kekal di dalam petak serpihan apikal di bahagian apikal. .Jelas sekali, sifat statik dalam petak apikal jarang membolehkan pembiakan bersama bakteria jangka panjang dalam cip hibrid. Walaupun kita boleh mendorong morfogenesis 3D dengan kukuh dalam sisipan Transwell apabila menggunakan cip hibrid, kekurangan biomekanik yang berkaitan secara fisiologi dan aliran bendalir apikal mungkin mengehadkan kebolehlaksanaan platform cip hibrid untuk aplikasi yang berpotensi.
Rekonstruksian penuh paksi crypt-villus manusia dalam usus-on-a-cip dan budaya hibrid-on-cip yang belum ditubuhkan sepenuhnya. Oleh kerana morphogenesis bermula dari monolayer epitel, mikro-mikro. Epitel 3d, kawasan -kawasan crypt dan villous tidak jelas dibatasi. Walaupun saluran atas yang lebih tinggi pada cip menyebabkan ketinggian peningkatan epitelium mikro, ketinggian maksimum masih terhad kepada ~ 300-400 μm. 00 μm41.
Dari sudut pengimejan, pengimejan resolusi super in situ bagi mikroarkitek 3D mungkin terhad kepada usus pada cip, memandangkan jarak kerja yang diperlukan dari kanta objektif ke lapisan epitelium adalah pada urutan beberapa milimeter. Untuk mengatasi masalah ini, objektif yang jauh mungkin diperlukan. Tambahan pula, membuat bahagian nipis untuk penyediaan pengimejan adalah mencabar dan keanjalan yang tinggi memandangkan keanjalan pengimejan MS. mikrofabrikasi lapisan demi lapisan usus pada cip melibatkan lekatan kekal di antara setiap lapisan, adalah amat mencabar untuk membuka atau mengeluarkan lapisan atas untuk memeriksa struktur permukaan lapisan epitelium. Contohnya, dengan menggunakan mikroskop elektron pengimbasan (SEM).
Hidrofobisiti PDMS telah menjadi faktor pengehad dalam kajian berasaskan mikrobendalir yang berkaitan dengan molekul kecil hidrofobik, memandangkan PDMS boleh secara tidak spesifik menyerap molekul hidrofobik tersebut. Alternatif kepada PDMS boleh dipertimbangkan dengan bahan polimer lain. Sebagai alternatif, pengubahsuaian permukaan PDMS (cth, salutan dengan liposori4 ) boleh meminimumkan bahan-bahan lipofilik4 (cth. tion molekul hidrofobik.
Akhir sekali, kaedah kami tidak dicirikan dengan baik dari segi menyediakan penapisan pemprosesan tinggi atau platform eksperimen mesra pengguna "satu saiz untuk semua". Protokol semasa memerlukan pam picagari bagi setiap peranti mikro, yang menggunakan ruang dalam inkubator CO2 dan menghalang eksperimen berskala besar. Had ini boleh dipertingkatkan dengan ketara oleh kebolehskalaan format well-well, 964 atau well-well, 964 sisipan yang membenarkan penambahan berterusan dan penyingkiran media basolateral).
Untuk mendorong morfogenesis 3D epitelium usus manusia secara in vitro, kami menggunakan peranti usus cip mikrobendalir yang mengandungi dua saluran mikro selari dan membran berliang elastik di antaranya untuk mencipta antara muka lumen-kapilari. Kami juga menunjukkan penggunaan peranti mikrobendalir satu saluran (cip hibrid) yang menyediakan aliran epithel permukaan basolar berterusan dalam kedua-dua platform pertumbuhan basolar di bawah powell powell. daripada pelbagai sel epitelium usus manusia boleh ditunjukkan dengan menggunakan manipulasi arah aliran untuk membuang antagonis morfogen dari petak basolateral. Keseluruhan prosedur eksperimen (Rajah 1) terdiri daripada lima bahagian: (i) mikrofabrikasi cip usus atau cip boleh dimasukkan Transwell (langkah 1-5; Kotak 1 dalam sel-sel hibrid atau sel testial intestinal) (ii) Penyediaan organ intestinai (ii) sel-sel hibrid atau sel testial (ii) oids;kotak 2-5), (iii) kultur sel epitelium usus pada cip usus atau cip hibrid (langkah 6-9), (iv) aruhan morfogenesis 3D secara in vitro (langkah 10) dan (v) ) untuk mencirikan struktur mikro epitelium 3D (langkah 11-24) . dengan membandingkan morfogenesis epitelium kepada kawalan spatial, temporal, bersyarat atau prosedur.
Kami menggunakan dua platform kultur yang berbeza: gut-on-a-chip dengan saluran lurus atau saluran berbelit tak linear, atau cip hibrid yang mengandungi sisipan Transwell (TW) dalam peranti mikrobendalir, yang direka seperti yang diterangkan dalam Kotak 1, dan langkah 1 -5. "Pembuatan Peranti" menunjukkan langkah utama dalam membuat cip tunggal atau cip hibrid. organoid) dan prosedur kultur yang digunakan dalam protokol ini."In vitro morphogenesis" menunjukkan langkah-langkah keseluruhan di mana Caco-2 atau sel epitelium terbitan organoid dikultur pada cip usus atau pada sisipan Transwell cip hibrid, diikuti dengan aruhan morfogenesis 3D dan pembentukan struktur epitelium yang dicirikan. Nombor aplikasi langkah program di bawah setiap contoh nombor kotak boleh dipaparkan. digunakan, sebagai contoh, dalam pencirian pembezaan sel, kajian fisiologi usus, penubuhan ekosistem hos mikrobiom, dan pemodelan penyakit. Imej imunofluoresensi dalam "Pembezaan Sel" menunjukkan nukleus, F-aktin dan MUC2 yang dinyatakan dalam 3D Caco-2 epitelium lapisan epitelium muco-2 yang dijana pada cip mukosa permukaan mukosa yang dijana pada cip isyarat mucolu permukaan. imej orensen dalam Fisiologi Usus menunjukkan lendir yang dihasilkan dengan mengotorkan sisa asid sialik dan N-asetilglukosamin menggunakan aglutinin kuman gandum pendarfluor. Kedua-dua imej bertindih dalam "Budaya Bersama Mikrob Hos" menunjukkan kultur bersama mikrob hos yang mewakili dalam usus pada cip. Panel kiri menunjukkan ko-kultur mikro Ca.Fresenfluor hijau (kokulturer hijau) E. -2 sel epitelium. Panel kanan menunjukkan penyetempatan GFP E. coli yang dikultur bersama dengan sel epitelium 3D Caco-2, diikuti dengan pewarnaan imunofluoresensi dengan F-actin (merah) dan nukleus (biru). Pemodelan penyakit menggambarkan usus yang sihat berbanding usus yang bocor dalam cip keradangan usus di bawah cabaran fisiologis imun (PSS, saccharig) dan sel-sel imunisasi LPG (bakteria dan bakteria L-popog). PBMC;hijau).Sel Caco-2 telah dikultur untuk membentuk lapisan epitelium 3D. Bar skala, 50 µm.Imej di baris bawah: "Pembezaan sel" disesuaikan dengan kebenaran daripada rujukan.2.Oxford University Press;Dihasilkan semula dengan kebenaran Ruj.5.NAS;“Hos-Microb Co-Culture” disesuaikan dengan kebenaran daripada ruj.3.NAS;“Pemodelan Penyakit” disesuaikan dengan kebenaran daripada rujukan.5.NAS.
Kedua-dua cip gut-on-chip dan hibrid telah difabrikasi menggunakan replika PDMS yang dirobohkan daripada acuan silikon oleh litografi lembut1,44 dan bercorak dengan SU-8. Reka bentuk saluran mikro dalam setiap cip ditentukan dengan mengambil kira hidrodinamik seperti tegasan ricih dan tekanan hidrodinamik1,4,12. Reka bentuk gut-on-tend-12 lurus yang terdiri daripada dua cip parax lurus yang bercorak gut-on-tend1 (Extended parax-chip). saluran mikro, telah berkembang menjadi usus-on-a-cip yang kompleks (Data Lanjutan Rajah 1b) yang merangkumi sepasang saluran mikro melengkung untuk mendorong Peningkatan masa tinggal bendalir, corak aliran tak linear dan ubah bentuk berbilang paksi sel kultur (Rajah 2a–f) 12. Apabila kita boleh memilih usus-biomekanik yang lebih kompleks untuk menjadi biomekanik usus. menunjukkan bahawa Gut-Chip yang berbelit-belit juga mendorong dengan kuat morfogenesis 3D dalam jangka masa yang sama dengan tahap pertumbuhan epitelium yang sama berbanding Gut-Chip yang asal, tanpa mengira jenis sel yang dikultur. Oleh itu, untuk mendorong morfogenesis 3D, reka bentuk usus pada cip linear dan kompleks boleh ditukar ganti. Replika silikon-Figura yang disediakan dengan acuan negatif SUPDMS selepas diawetkan.2a).Untuk mengarang usus pada cip, lapisan atas PDMS atas yang disediakan diikat secara berurutan pada filem PDMS berliang dan kemudian diselaraskan dengan lapisan PDMS yang lebih rendah dengan ikatan tidak boleh balik menggunakan rawatan korona (Rajah 2b–f). Untuk mengarang cip hibrid, replika PDMS yang telah disembuhkan diikat pada slaid kaca untuk mencipta satu-satu saluran mikrocmonnel yang boleh membentuk satu saluran mikroc. dan Data Lanjutan Rajah 2).Proses ikatan dilakukan dengan merawat permukaan replika dan kaca PDMS dengan plasma oksigen atau rawatan korona. Selepas pensterilan peranti mikrofabrikasi yang dilekatkan pada tiub silikon, persediaan peranti telah bersedia untuk melakukan morfogenesis 3D epitelium usus (Rajah 2g).
a, Ilustrasi skematik penyediaan bahagian PDMS daripada acuan silikon bercorak SU-8. Larutan PDMS yang tidak diawet dituang ke dalam acuan silikon (kiri), diawet pada 60 °C (tengah) dan dirobohkan (kanan). PDMS yang dirobohkan dipotong menjadi kepingan dan dibersihkan untuk kegunaan selanjutnya.b, Gambar acuan silikon PDMS yang digunakan untuk menyediakan lapisan atas silikon PDMS. membran berliang.d, Satu siri gambar komponen PDMS atas dan bawah serta peranti usus pada cip yang dipasang.e, Skema penjajaran komponen PDMS atas, membran dan bawah. Setiap lapisan diikat secara tidak dapat dipulihkan oleh rawatan plasma atau korona.f, Skema bagi peranti gut-on-a-chip fabrikasi dan vakum yang tersusun dengan mikrokutum yang tersusun. -a-cip untuk kultur sel mikrobendalir.Usus fabrikasi pada cip yang dipasang dengan tiub silikon dan picagari diletakkan di atas slip penutup.Peranti cip diletakkan pada penutup cawan Petri 150 mm untuk diproses.Pengikat digunakan untuk menutup tiub silikon.h, Gambar visual bagi fabrikasi cip hibrid dan morfogenesis 3D ke dalam kultur hibrid yang disediakan dalam cip bebas2Dujian bebas yang disediakan dalam serpihan hibrid2D. telah dimasukkan ke dalam cip hibrid untuk mendorong morfogenesis 3D usus. Medium dialirkan melalui saluran mikro di bawah lapisan sel yang ditubuhkan pada sisipan Transwell. Bar skala, 1 cm.h Dicetak semula dengan kebenaran daripada rujukan.4.Lain-lain.
Dalam protokol ini, garisan sel Caco-2 dan organoid usus digunakan sebagai sumber epitelium (Rajah 3a). Kedua-dua jenis sel telah dibiakkan secara bebas (Kotak 2 dan Kotak 5) dan digunakan untuk menyemai saluran mikro bersalut ECM bagi usus cip atau sisipan Transwell. Apabila sel-sel bercantum (>95% liputan kultur secara rutin (>95%, liputan dan kultur sel-sel serpihan) secara rutin. 50) dalam kelalang T dituai untuk menyediakan ampaian sel tercerai oleh cecair trypsinization (kotak 2). Organoid usus manusia daripada biopsi usus atau reseksi pembedahan telah dikultur dalam kubah perancah Matrigel dalam plat 24-telaga untuk menyokong persekitaran mikro struktur, Ruchpongnt, dan Meomorphic microenvironment yang penting. dan faktor pertumbuhan yang disediakan seperti yang diterangkan dalam Kotak 3 ditambah setiap hari sehingga organoid membesar kepada ~500 µm diameter. Organoid yang telah tumbuh sepenuhnya dituai dan diasingkan menjadi sel tunggal untuk pembenihan ke usus atau sisipan Transwell pada cip (Kotak 5). penderma), tapak lesi (cth, lesi berbanding kawasan tidak lesi) dan lokasi gastrousus dalam saluran (cth, duodenum, jejunum, ileum, sekum, kolon atau rektum).
a, Aliran kerja untuk induksi morfogenesis usus dalam cip usus. Epitelium usus manusia Caco-2 dan organoid usus digunakan dalam protokol ini untuk menunjukkan morfogenesis 3D. Sel epitelium terpencil telah disemai dalam peranti gut-on-a-chip yang disediakan (penyediaan cip). Sebaik sahaja sel disemai (dilekatkan pada PD0 apirous) membran (dilekatkan pada hari PD0) dan MS. aliran cal (AP) dimulakan dan dikekalkan untuk 2 hari pertama (aliran, AP, D0-D2). Aliran Basolateral (BL) juga dimulakan bersama-sama dengan gerakan regangan kitaran (regangan, aliran, AP dan BL) apabila monolayer 2D lengkap terbentuk. Morfogenesis 3D usus berlaku secara spontan selepas 5 hari kultur perwakilan Phamorfologi, morfogenogenesis D5 (Phamorfologi, morfologi, kultur BL). pada setiap langkah atau titik masa percubaan (graf bar, 100 µm). Empat gambar rajah skematik yang menggambarkan lata morfogenesis usus yang sepadan (kanan atas). Anak panah putus-putus dalam skema mewakili arah aliran bendalir.b, imej SEM menunjukkan topologi permukaan bagi epitelium Caco-2 3D yang telah ditetapkan (di sebelah kiri kawasan mikron tersusun semula). lapisan 3D Caco-2 (kanan).c, Pandangan hadapan mendatar bagi Caco-2 3D, claudin (ZO-1, merah) dan selaput sempadan berus berterusan berlabel F-actin (hijau) dan nukleus (biru) Penggambaran konfokal imunofluoresensi bagi sel epitelium pada cip usus. Pandangan anak panah berkonflik masa bagi setiap titik fokus arah ke arah tengah. perubahan morfologi dalam organoid yang dikultur pada cip yang diperolehi oleh mikroskop kontras fasa pada hari 3, 7, 9, 11, dan 13. Inset (kanan atas) menunjukkan pembesaran tinggi imej yang disediakan.e, fotomikrograf DIC bagi epitelium 3D organoid yang ditubuhkan dalam usus pada hirisan yang diambil pada hari 7.f, Penanda bertindih sel imunofluoresen L5;magenta), sel goblet (MUC2; hijau), F-actin (kelabu) dan nukleus (cyan) yang tumbuh pada cip usus selama 3 hari, masing-masing (Kiri) dan 13 hari (tengah) organoid pada lapisan epitelium. Lihat juga Data Lanjutan Rajah 3, yang menyerlahkan imej isyarat kanan LGR5 (Kiri) (Kiri) dan 13 hari (tengah). epitelium organoid ditubuhkan dalam usus pada cip dengan mengotorkan membran plasma dengan pewarna CellMask (kanan) pada hari ke-13 kultur. Bar skala ialah 50 μm melainkan dinyatakan sebaliknya.b Dicetak semula dengan kebenaran rujukan.2.Oxford University Press;c Disesuaikan dengan kebenaran Rujukan.2.Oxford University Press;e dan f disesuaikan dengan kebenaran melalui rujukan.12 Di Bawah Lesen Creative Commons CC BY 4.0.
Dalam usus pada cip, adalah perlu untuk mengubah suai permukaan hidrofobik membran berliang PDMS untuk salutan ECM yang berjaya. Dalam protokol ini, kami menggunakan dua kaedah berbeza untuk mengubah suai hidrofobisiti membran PDMS. Untuk membiakkan sel Caco-2, pengaktifan permukaan melalui rawatan UV/ozon sahaja sudah memadai untuk mengurangkan hidrofobisiti PDMS mikrofluida, sel-sel EPDMS dan melekat pada permukaan. kultur idik epitelium organoid memerlukan kefungsian permukaan berasaskan kimia untuk mencapai pemendapan protein ECM yang cekap dengan menggunakan polietilenaimina (PEI) dan glutaraldehid secara berurutan pada saluran mikro PDMS. Selepas pengubahsuaian permukaan, protein ECM didepositkan untuk menutup permukaan PDMS yang difungsikan dan kemudian dimasukkan ke dalam sel mikrofluida terpencil yang terpencil. hanya meresap medium ke dalam saluran mikro atas sehingga sel membentuk monolayer lengkap, manakala saluran mikro bawah mengekalkan keadaan statik. Kaedah yang dioptimumkan untuk pengaktifan permukaan dan salutan ECM membolehkan lampiran epitelium organoid untuk mendorong morfogenesis 3D pada permukaan PDMS.
Kultur Transwell juga memerlukan salutan ECM sebelum pembenihan sel;walau bagaimanapun, kultur Transwell tidak memerlukan langkah prarawatan yang kompleks untuk mengaktifkan permukaan sisipan berliang. Untuk menumbuhkan sel Caco-2 pada sisipan Transwell, salutan ECM pada sisipan berliang mempercepatkan lampiran sel Caco-2 tercerai (<1 jam) dan pembentukan penghalang simpang ketat (<1-2 hari). Untuk kultur organoid dalam selitan berliang, isolated Transwell. dilekatkan pada permukaan membran (<3 h) dan dikekalkan sehingga organoid membentuk monolayer lengkap dengan integriti halangan . Kultur Transwell dilakukan dalam plat 24-telaga tanpa menggunakan cip hibrid.
Morfogenesis 3D in vitro boleh dimulakan dengan menggunakan aliran bendalir pada aspek basolateral lapisan epitelium yang telah ditetapkan. Dalam usus pada cip, morfogenesis epitelium bermula apabila medium diserap ke dalam saluran mikro atas dan bawah (Rajah 3a). nutrien dan serum kepada sel yang terikat pada membran berliang dan menjana tegasan ricih luminal, kami biasanya menggunakan aliran dwi dalam usus pada cip.Dalam cip hibrid, sisipan Transwell yang mengandungi monolayers epitelium telah dimasukkan ke dalam cip hibrid.Kemudian, medium telah digunakan di bawah sisi basolateral sisipan Transwell berliang melalui mikrochannel.Aliran ini3-lateral morfologi usus berlaku pada kedua-dua platform kultur basotilasi5 hari.
Ciri morfologi lapisan epitelium 3D kejuruteraan mikro boleh dianalisis dengan menggunakan pelbagai modaliti pengimejan, termasuk mikroskopi kontras fasa, mikroskopi kontras gangguan pembezaan (DIC), SEM, atau mikroskopi konfokal imunofluoresensi (Rajah 3 dan 4). Kontras fasa atau pengimejan lapisan DIC boleh dilakukan dengan mudah pada sebarang masa kultur epithelD. kepada ketelusan optik filem PDMS dan poliester, kedua-dua platform cip-on-a-chip dan hibrid boleh menyediakan pengimejan in situ masa nyata tanpa memerlukan pembahagian atau pembongkaran peranti. Apabila melakukan pengimejan imunofluoresensi (Rajah 1, 3c, f dan 4b, c), sel-sel biasanya dituruti oleh Xtont/hyl 4 (wtont/hyl 4) (wtont/hyl) 0 dan 2% (wt/vol) ) albumin serum lembu (BSA), mengikut turutan. Bergantung pada jenis sel, bahan fiksatif, permeabiliser dan agen penyekat yang berbeza boleh digunakan. Antibodi utama yang menyasarkan penanda sel atau rantau yang bergantung kepada keturunan digunakan untuk menyerlahkan sel yang tidak bergerak in situ pada cip, diikuti oleh antibodi sekunder bersama-sama dengan pensasaran counterstain-2, nuidylene-2, cledylene-6. ) indole, DAPI) atau F-actin (cth, phalloidin berlabel pendarfluor). Pengimejan hidup berasaskan pendarfluor juga boleh dilakukan di situ untuk mengesan pengeluaran lendir (Rajah 1).1, "Pembezaan sel" dan "Fisiologi usus"), penjajahan rawak sel mikrob (Rajah 1, "Kokultur hos-mikrob") , pengambilan sel imun (Rajah 1, 'Pemodelan Penyakit') atau kontur morfologi epitelium 3D (Rajah 3c, f dan cip yang berasingan dari mikrob yang memisahkan bahagian atas dari cip, f dan gut). lapisan nnel, seperti yang diterangkan dalam ref.Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 2, morfologi epitelium 3D serta mikrovili pada sempadan berus apikal boleh divisualisasikan oleh SEM (Rajah 3b). Ekspresi penanda pembezaan boleh dinilai dengan melakukan penjujukan PCR5 kuantitatif atau sel tunggal RNA sel. Dalam kes ini, sel cipharpsin cipharves tumbuh epithelial adalah sel hibrid usus 3D. isasi dan kemudian digunakan untuk analisis molekul atau genetik.
a, Aliran Kerja untuk induksi morfogenesis usus dalam cip hibrid. Caco-2 dan organoid usus digunakan dalam protokol ini untuk menunjukkan morfogenesis 3D dalam platform cip hibrid. Sel epitelium terdisosiasi telah disemai dalam sisipan Transwell yang disediakan (persediaan TW; lihat rajah di bawah). Sebaik sahaja sel disemai (berbenih) dan dilekatkan ke dalam sel kultur Transwell. Selepas 7 hari, satu sisipan Transwell tunggal yang mengandungi monolayer 2D sel epitelium telah disepadukan ke dalam cip hibrid untuk memperkenalkan aliran basolateral (Aliran, BL), yang akhirnya membawa kepada penjanaan lapisan epitelium 3D (morfogenesis). Mikrograf kontras fasa yang menunjukkan ciri morfologi sel epitelium organ manusia yang diperolehi daripada penderma masa kolon normal (C10 schedule lineor) (C103 penderma masa percubaan). s dalam lapisan atas menggambarkan konfigurasi percubaan untuk setiap langkah.b, Cip hibrid (skema kiri) boleh membawa kepada morfogenesis 3D sel epitelium organoid dengan pandangan mikroskop confocal atas ke bawah diambil pada kedudukan Z yang berbeza (atas, tengah dan bawah;lihat skematik kanan dan garis putus-putus yang sepadan).menunjukkan ciri morfologi yang jelas.F-aktin (cyan), nukleus (kelabu).c, Mikrograf confocal pendarfluor (pandangan bersudut 3D) bagi sel epitelium terbitan organoid yang dikultur dalam Transwell statik (TW; inset dalam kotak putus-putus putih) berbanding cip hibrid (shot penuh terbesar) membandingkan 2D berbanding 3D morfologi sudut kanan atas (masing-masing pasangan 2D berbanding 3D sudut kanan atas, set silang silang 2D berbanding 3D menegak; Z”) juga menunjukkan ciri 2D dan 3D. Bar skala, 100 µm.c Dicetak semula dengan kebenaran daripada rujukan.4.Lain-lain.
Kawalan boleh disediakan dengan mengkultur sel yang sama (Caco-2 atau sel epitelium organoid usus) ke dalam lapisan tunggal dua dimensi di bawah keadaan kultur statik konvensional. Terutamanya, penyusutan nutrien mungkin disebabkan oleh kapasiti volum terhad saluran mikro (iaitu ~4 µL dalam saluran atas pada aplikasi gut-chip asal reka bentuk bemorfologi, bemorfologi, dan lain-lain).
Proses litografi lembut hendaklah dilakukan di dalam bilik yang bersih. Bagi setiap lapisan pada cip (lapisan atas dan bawah serta membran) dan cip hibrid, topeng foto yang berbeza telah digunakan dan dibuat pada wafer silikon yang berasingan kerana ketinggian saluran mikro adalah berbeza. Ketinggian sasaran saluran mikro atas dan bawah usus pada cip adalah 500 µm 0.0.m2, saluran hibrid, 2, saluran sasaran masing-masing adalah 500µm. µm.
Letakkan wafer silikon 3 inci dalam pinggan dengan aseton. Putar pinggan perlahan-lahan selama 30 saat, kemudian keringkan wafer dengan udara. Pindahkan wafer ke pinggan dengan IPA, kemudian putar pinggan selama 30 saat untuk membersihkan.
Larutan piranha (campuran hidrogen peroksida dan asid sulfurik pekat, 1:3 (vol/vol)) boleh digunakan secara pilihan untuk memaksimumkan penyingkiran sisa organik daripada permukaan wafer silikon.
Larutan Piranha sangat menghakis dan menjana haba. Langkah berjaga-jaga keselamatan tambahan diperlukan. Untuk pelupusan sisa, biarkan larutan sejuk dan pindahkan ke bekas sisa kering yang bersih. Gunakan bekas sekunder dan labelkan bekas sisa dengan betul. Sila ikut garis panduan keselamatan kemudahan untuk prosedur yang lebih terperinci.
Dehidrasi wafer dengan meletakkannya di atas plat panas 200 °C selama 10 minit. Selepas dehidrasi, wafer digoncang lima kali di udara untuk menyejukkan.
Tuangkan ~10 g photoresist SU-8 2100 ke bahagian tengah wafer silikon yang telah dibersihkan.Gunakan pinset untuk meratakan photoresist pada wafer.Sesekali letakkan wafer pada plat panas 65°C untuk menjadikan photoresist kurang melekit dan lebih mudah merebak.Jangan letakkan wafer terus pada plat panas.
SU-8 diagihkan sama rata pada wafer dengan menjalankan salutan putaran. Programkan putaran masuk SU-8 selama 5–10 saat untuk merambat pada 500 rpm pada pecutan 100 rpm/s. Tetapkan putaran utama untuk corak ketebalan 200 µm pada 1,500 µm µm 50 (mencapai ketinggian 1,500 µm µm, atau 0,000 rpm) lapisan atas usus pada cip; lihat "Langkah kritikal" di bawah) ditetapkan pada pecutan 300 rpm/s 30 saat pada 1,200 rpm.
Kelajuan putaran utama boleh dilaraskan mengikut ketebalan sasaran corak SU-8 pada wafer silikon.
Untuk mengarang corak SU-8 dengan ketinggian 500 µm untuk lapisan atas usus pada cip, salutan putaran dan langkah bakar lembut Kotak ini (langkah 7 dan 8) diulang secara berurutan (lihat langkah 9) untuk menghasilkan dua lapisan 250 µm Lapisan tebal SU-8, yang boleh dilapisi dan disambungkan ke dalam kotak dedahan 10µm dengan 10 µm tinggi ini.
Bakar wafer bersalut SU-8 dengan lembut dengan meletakkan wafer di atas pinggan panas pada suhu 65 °C selama 5 minit, kemudian tukar tetapan kepada 95 °C dan eramkan selama 40 minit tambahan.
Untuk mencapai ketinggian 500 μm corak SU-8 dalam saluran mikro atas, ulangi langkah 7 dan 8 untuk menghasilkan dua lapisan SU-8 setebal 250 μm.
Menggunakan Penjajar Topeng UV, lakukan ujian lampu mengikut arahan pengilang untuk mengira masa pendedahan wafer.(masa pendedahan, ms) = (dos pendedahan, mJ/cm2)/(kuasa lampu, mW/cm2).
Selepas menentukan masa pendedahan, letakkan topeng foto pada pemegang topeng penjajar topeng UV dan letakkan topeng foto pada wafer bersalut SU-8.
Letakkan permukaan cetakan fotomask terus pada sisi bersalut SU-8 wafer silikon untuk meminimumkan penyebaran UV.
Dedahkan wafer bersalut SU-8 dan topeng foto secara menegak kepada 260 mJ/cm2 cahaya UV untuk masa pendedahan yang telah ditetapkan (lihat langkah 10 kotak ini).
Selepas pendedahan UV, wafer silikon bersalut SU-8 dibakar pada suhu 65°C selama 5 minit dan 95°C selama 15 minit pada setiap plat panas untuk menghasilkan corak dengan ketinggian 200 μm. Panjangkan masa selepas bakar pada 95 °C hingga 30 minit untuk menghasilkan corak dengan ketinggian 500 µm.
Pemaju dituangkan ke dalam pinggan kaca, dan wafer yang dibakar diletakkan di dalam pinggan. Isipadu pemaju SU-8 mungkin berbeza-beza bergantung pada saiz plat kaca.Pastikan anda menggunakan pemaju SU-8 yang mencukupi untuk mengeluarkan sepenuhnya SU-8 yang tidak terdedah.Sebagai contoh, apabila menggunakan piring kaca berdiameter 150 mm dengan kapasiti 1 L, gunakan ~300 mL 5 minit pemaju putaran.
Bilas acuan yang telah dibangunkan dengan ~10 mL pembangun segar diikuti dengan IPA dengan menyembur larutan menggunakan pipet.
Letakkan wafer dalam pembersih plasma dan dedahkan kepada plasma oksigen (gas atmosfera, tekanan sasaran 1 × 10−5 Torr, kuasa 125 W) selama 1.5 minit.
Letakkan wafer dalam desikator vakum dengan slaid kaca di dalamnya.Wafer dan slaid boleh diletakkan bersebelahan.Jika desikator vakum dibahagikan kepada beberapa lapisan oleh plat, letakkan slaid di ruang bawah dan wafer di dalam ruang atas.Titiskan 100 μL trichloro(1H, 1H, 2H, 2H, larutan silaneoro) pada kaca vakum, 2H, 2H. isasi.
Cairkan satu vial sel Caco-2 beku dalam tab mandi air 37°C, kemudian pindahkan sel yang telah dicairkan ke dalam kelalang T75 yang mengandungi 15 mL medium Caco-2 yang telah dipanaskan terlebih dahulu pada suhu 37°C.
Untuk melepasi sel Caco-2 pada ~90% pertemuan, mula-mula panaskan medium Caco-2, PBS, dan 0.25% trypsin/1 mM EDTA dalam tab mandi air 37°C.
Aspirasikan medium dengan penyedutan vakum. Basuh sel dua kali dengan 5 mL PBS suam dengan mengulangi penyedutan vakum dan menambah PBS segar.