Terima kasih kerana melawat Nature.com.Versi penyemak imbas yang anda gunakan mempunyai sokongan CSS yang terhad.Untuk pengalaman terbaik, kami mengesyorkan agar anda menggunakan penyemak imbas yang dikemas kini (atau lumpuhkan Mod Keserasian dalam Internet Explorer).Sementara itu, untuk memastikan sokongan berterusan, kami akan menjadikan tapak tanpa gaya dan JavaScript.
Evolusi parasit mikrob melibatkan tindak balas antara pemilihan semula jadi, yang menyebabkan parasit bertambah baik, dan hanyutan genetik, yang menyebabkan parasit kehilangan gen dan mengumpul mutasi yang merosakkan.Di sini, untuk memahami bagaimana tindak balas ini berlaku pada skala makromolekul tunggal, kami menerangkan struktur cryo-EM ribosom Encephalitozoon cuniculi, organisma eukariotik dengan salah satu genom terkecil dalam alam semula jadi.Pengurangan melampau rRNA dalam ribosom E. cuniculi disertai dengan perubahan struktur yang belum pernah terjadi sebelumnya, seperti evolusi penyambung rRNA bersatu yang tidak diketahui sebelum ini dan rRNA tanpa bonjolan.Di samping itu, ribosom E. cuniculi terselamat daripada kehilangan serpihan dan protein rRNA dengan membangunkan keupayaan untuk menggunakan molekul kecil sebagai peniruan struktur serpihan dan protein rRNA yang terdegradasi.Secara keseluruhannya, kami menunjukkan bahawa struktur molekul yang telah lama dianggap berkurangan, merosot, dan tertakluk kepada mutasi yang melemahkan mempunyai beberapa mekanisme pampasan yang memastikan mereka aktif walaupun penguncupan molekul yang melampau.
Oleh kerana kebanyakan kumpulan parasit mikrob mempunyai alat molekul unik untuk mengeksploitasi perumah mereka, kita sering perlu membangunkan terapeutik yang berbeza untuk kumpulan parasit yang berbeza1,2.Walau bagaimanapun, bukti baru menunjukkan bahawa beberapa aspek evolusi parasit adalah konvergen dan sebahagian besarnya boleh diramal, menunjukkan asas yang berpotensi untuk campur tangan terapeutik yang luas dalam parasit mikrob3,4,5,6,7,8,9.
Kerja sebelumnya telah mengenal pasti trend evolusi biasa dalam parasit mikrob yang dipanggil pengurangan genom atau pereputan genom10,11,12,13.Penyelidikan semasa menunjukkan bahawa apabila mikroorganisma melepaskan gaya hidup bebas mereka dan menjadi parasit intraselular (atau endosimbion), genom mereka mengalami metamorfosis yang perlahan tetapi menakjubkan selama berjuta-juta tahun9,11.Dalam proses yang dikenali sebagai pereputan genom, parasit mikrob mengumpul mutasi yang merosakkan yang mengubah banyak gen yang sebelum ini penting kepada pseudogen, yang membawa kepada kehilangan gen secara beransur-ansur dan keruntuhan mutasi14,15.Keruntuhan ini boleh memusnahkan sehingga 95% gen dalam organisma intrasel tertua berbanding spesies hidup bebas yang berkait rapat.Oleh itu, evolusi parasit intraselular adalah tarik tali antara dua kuasa yang bertentangan: pemilihan semula jadi Darwinian, yang membawa kepada peningkatan parasit, dan keruntuhan genom, membuang parasit ke dalam kelalaian.Bagaimana parasit itu berjaya muncul dari tarik tali ini dan mengekalkan aktiviti struktur molekulnya masih tidak jelas.
Walaupun mekanisme pereputan genom tidak difahami sepenuhnya, ia nampaknya berlaku terutamanya disebabkan oleh hanyutan genetik yang kerap.Oleh kerana parasit hidup dalam populasi yang kecil, aseksual dan terhad secara genetik, mereka tidak dapat menghapuskan mutasi yang merosakkan secara berkesan yang kadangkala berlaku semasa replikasi DNA.Ini membawa kepada pengumpulan mutasi berbahaya yang tidak dapat dipulihkan dan pengurangan genom parasit.Akibatnya, parasit bukan sahaja kehilangan gen yang tidak lagi diperlukan untuk kemandiriannya dalam persekitaran intrasel.Ketidakupayaan populasi parasit untuk menghapuskan mutasi merosakkan sporadis secara berkesan yang menyebabkan mutasi ini terkumpul di seluruh genom, termasuk gen mereka yang paling penting.
Kebanyakan pemahaman semasa kami tentang pengurangan genom adalah berdasarkan semata-mata pada perbandingan jujukan genom, dengan kurang perhatian terhadap perubahan dalam molekul sebenar yang melaksanakan fungsi pengemasan dan berfungsi sebagai sasaran dadah yang berpotensi.Kajian perbandingan telah menunjukkan bahawa beban mutasi mikrob intraselular yang merosakkan nampaknya memberi predisposisi protein dan asid nukleik kepada salah lipatan dan agregat, menjadikannya lebih bergantung kepada pendamping dan hipersensitif kepada haba19,20,21,22,23.Selain itu, pelbagai parasit—evolusi bebas kadangkala dipisahkan sebanyak 2.5 bilion tahun—mengalami kehilangan pusat kawalan kualiti yang serupa dalam sintesis protein5,6 dan mekanisme pembaikan DNA24.Walau bagaimanapun, sedikit yang diketahui tentang kesan gaya hidup intraselular terhadap semua sifat makromolekul selular yang lain, termasuk penyesuaian molekul terhadap peningkatan beban mutasi yang merosakkan.
Dalam kerja ini, untuk lebih memahami evolusi protein dan asid nukleik mikroorganisma intraselular, kami menentukan struktur ribosom parasit intraselular Encephalitozoon cuniculi.E. cuniculi ialah organisma seperti kulat yang tergolong dalam kumpulan mikrosporidia parasit yang mempunyai genom eukariotik yang luar biasa kecil dan oleh itu digunakan sebagai organisma model untuk mengkaji pereputan genom25,26,27,28,29,30.Baru-baru ini, struktur ribosom cryo-EM telah ditentukan untuk genom sederhana Microsporidia, Paranosema locustae, dan Vairimorpha necatrix31,32 (~3.2 Mb genom).Struktur ini mencadangkan bahawa beberapa kehilangan penguatan rRNA dikompensasikan oleh pembangunan hubungan baru antara protein ribosom jiran atau pemerolehan protein msL131,32 ribosom baru.Spesies Encephalitozoon (genom ~2.5 juta bp), bersama-sama dengan Ordospora saudara terdekat mereka, menunjukkan tahap muktamad pengurangan genom dalam eukariota - mereka mempunyai kurang daripada 2000 gen pengekodan protein, dan dijangkakan bahawa ribosom mereka bukan sahaja tidak mempunyai serpihan pengembangan rRNA (serpihan rRNA yang membezakan eukariotik yang disebabkan oleh empat bakteria eukariotik) dan juga kekurangan ribosom ribosom bakteria. homolog dalam genom E. cuniculi26,27,28.Oleh itu, kami membuat kesimpulan bahawa ribosom E. cuniculi boleh mendedahkan strategi yang tidak diketahui sebelum ini untuk penyesuaian molekul kepada pereputan genom.
Struktur cryo-EM kami mewakili ribosom sitoplasma eukariotik terkecil untuk dicirikan dan memberikan gambaran tentang cara tahap muktamad pengurangan genom mempengaruhi struktur, pemasangan dan evolusi jentera molekul yang penting kepada sel.Kami mendapati bahawa ribosom E. cuniculi melanggar banyak prinsip lipatan RNA dan pemasangan ribosom yang dipelihara secara meluas, dan menemui protein ribosom baru yang tidak diketahui sebelum ini.Secara tidak dijangka, kami menunjukkan bahawa ribosom mikrosporidia telah mengembangkan keupayaan untuk mengikat molekul kecil, dan membuat hipotesis bahawa pemotongan dalam rRNA dan protein mencetuskan inovasi evolusi yang akhirnya boleh memberikan kualiti berguna pada ribosom.
Untuk meningkatkan pemahaman kami tentang evolusi protein dan asid nukleik dalam organisma intrasel, kami memutuskan untuk mengasingkan spora E. cuniculi daripada kultur sel mamalia yang dijangkiti untuk membersihkan ribosom mereka dan menentukan struktur ribosom ini.Sukar untuk mendapatkan sejumlah besar mikrosporidia parasit kerana mikrosporidia tidak boleh dibiakkan dalam medium nutrien.Sebaliknya, mereka tumbuh dan membiak hanya di dalam sel perumah.Oleh itu, untuk mendapatkan biojisim E. cuniculi untuk penulenan ribosom, kami menjangkiti garisan sel buah pinggang mamalia RK13 dengan spora E. cuniculi dan menkultur sel yang dijangkiti ini selama beberapa minggu untuk membolehkan E. cuniculi berkembang dan membiak.Menggunakan monolayer sel yang dijangkiti kira-kira setengah meter persegi, kami dapat membersihkan kira-kira 300 mg spora Microsporidia dan menggunakannya untuk mengasingkan ribosom.Kami kemudian mengganggu spora yang telah disucikan dengan manik kaca dan mengasingkan ribosom mentah menggunakan pecahan polietilena glikol berperingkat bagi lisat.Ini membolehkan kami memperoleh kira-kira 300 µg ribosom E. cuniculi mentah untuk analisis struktur.
Kami kemudian mengumpul imej cryo-EM menggunakan sampel ribosom yang terhasil dan memproses imej ini menggunakan topeng yang sepadan dengan subunit ribosom besar, kepala subunit kecil, dan subunit kecil.Semasa proses ini, kami mengumpul imej kira-kira 108,000 zarah ribosom dan mengira imej cryo-EM dengan resolusi 2.7 Å (Rajah Tambahan 1-3).Kami kemudian menggunakan imej cryoEM untuk memodelkan rRNA, protein ribosom, dan faktor hibernasi Mdf1 yang dikaitkan dengan ribosom E. cuniculi (Rajah 1a, b).
a Struktur ribosom E. cuniculi dalam kompleks dengan faktor hibernasi Mdf1 (pdb id 7QEP).b Peta faktor hibernasi Mdf1 yang dikaitkan dengan ribosom E. cuniculi.c Peta struktur sekunder membandingkan rRNA pulih dalam spesies Microsporidian dengan struktur ribosom yang diketahui.Panel menunjukkan lokasi serpihan rRNA yang diperkuat (ES) dan tapak aktif ribosom, termasuk tapak penyahkodan (DC), gelung sarcinicin (SRL), dan pusat pemindahan peptidil (PTC).d Ketumpatan elektron yang sepadan dengan pusat pemindahan peptidil ribosom E. cuniculi menunjukkan bahawa tapak pemangkin ini mempunyai struktur yang sama dalam parasit E. cuniculi dan perumahnya, termasuk H. sapiens.e, f Ketumpatan elektron yang sepadan bagi pusat penyahkodan (e) dan struktur skematik pusat penyahkodan (f) menunjukkan bahawa E. cuniculi mempunyai sisa U1491 dan bukannya A1491 (penomboran E. coli) dalam banyak eukariota lain.Perubahan ini menunjukkan bahawa E. cuniculi mungkin sensitif terhadap antibiotik yang menyasarkan tapak aktif ini.
Berbeza dengan struktur ribosom V. necatrix dan P. locustae yang telah ditubuhkan sebelum ini (kedua-dua struktur mewakili keluarga microsporidia Nosematidae yang sama dan sangat serupa antara satu sama lain), 31,32 E. ribosom cuniculi menjalani banyak proses rRNA dan pemecahan protein.Denaturasi selanjutnya (Rajah Tambahan 4-6).Dalam rRNA, perubahan yang paling ketara termasuk kehilangan lengkap serpihan 25S rRNA yang diperkuatkan ES12L dan degenerasi separa heliks h39, h41, dan H18 (Rajah 1c, Rajah Tambahan 4).Antara protein ribosom, perubahan yang paling ketara termasuk kehilangan lengkap protein eS30 dan pemendekan protein eL8, eL13, eL18, eL22, eL29, eL40, uS3, uS9, uS14, uS17, dan eS7 (Rajah Tambahan 4, 5).
Oleh itu, pengurangan ekstrem genom spesies Encephalotozoon/Ordospora dicerminkan dalam struktur ribosomnya: E. cuniculi ribosomes mengalami kehilangan kandungan protein yang paling dramatik dalam ribosom sitoplasma eukariotik tertakluk kepada pencirian struktur, malah ia tidak mempunyai rRNA dan serpihan protein yang juga dipelihara secara meluas dalam tiga domain eukariota, tetapi dalam domain eukariota secara meluas, bukan sahaja.Struktur ribosom E. cuniculi menyediakan model molekul pertama untuk perubahan ini dan mendedahkan peristiwa evolusi yang telah diabaikan oleh kedua-dua genomik perbandingan dan kajian struktur biomolekul intraselular (Tambahan Rajah 7).Di bawah, kami menerangkan setiap peristiwa ini bersama-sama dengan kemungkinan asal evolusinya dan potensi kesannya terhadap fungsi ribosom.
Kami kemudian mendapati bahawa, sebagai tambahan kepada pemotongan rRNA yang besar, ribosom E. cuniculi mempunyai variasi rRNA di salah satu tapak aktifnya.Walaupun pusat pemindahan peptidil ribosom E. cuniculi mempunyai struktur yang sama seperti ribosom eukariotik lain (Rajah 1d), pusat penyahkodan berbeza disebabkan oleh variasi jujukan pada nukleotida 1491 (penomboran E. coli, Rajah 1e, f).Pemerhatian ini penting kerana tapak penyahkodan ribosom eukariotik biasanya mengandungi residu G1408 dan A1491 berbanding residu jenis bakteria A1408 dan G1491.Variasi ini mendasari sensitiviti berbeza ribosom bakteria dan eukariotik kepada keluarga aminoglikosida antibiotik ribosom dan molekul kecil lain yang menyasarkan tapak penyahkodan.Di tapak penyahkodan ribosom E. cuniculi, residu A1491 telah digantikan dengan U1491, yang berpotensi mencipta antara muka pengikatan unik untuk molekul kecil yang menyasarkan tapak aktif ini.Varian A14901 yang sama juga terdapat dalam mikrosporidia lain seperti P. locustae dan V. necatrix, menunjukkan bahawa ia tersebar luas di kalangan spesies mikrosporidia (Rajah 1f).
Oleh kerana sampel ribosom E. cuniculi kami telah diasingkan daripada spora yang tidak aktif secara metabolik, kami menguji peta cryo-EM E. cuniculi untuk pengikatan ribosom yang diterangkan sebelum ini di bawah keadaan tekanan atau kelaparan.Faktor hibernasi 31,32,36,37, 38. Kami memadankan struktur ribosom hibernasi yang telah ditetapkan sebelum ini dengan peta cryo-EM bagi ribosom E. cuniculi.Untuk dok, ribosom S. cerevisiae digunakan dalam kompleks dengan faktor hibernasi Stm138, ribosom belalang dalam kompleks dengan faktor Lso232, dan ribosom V. necatrix dalam kompleks dengan faktor Mdf1 dan Mdf231.Pada masa yang sama, kami mendapati ketumpatan cryo-EM sepadan dengan faktor selebihnya Mdf1.Sama seperti pengikatan Mdf1 pada ribosom V. necatrix, Mdf1 juga mengikat pada ribosom E. cuniculi, di mana ia menyekat tapak E ribosom, mungkin membantu menyediakan ribosom apabila spora parasit menjadi tidak aktif secara metabolik apabila badan tidak aktif (Rajah 2).).
Mdf1 menyekat tapak E ribosom, yang kelihatan membantu menyahaktifkan ribosom apabila spora parasit menjadi tidak aktif secara metabolik.Dalam struktur ribosom E. cuniculi, kami mendapati bahawa Mdf1 membentuk hubungan yang tidak diketahui sebelum ini dengan batang ribosom L1, bahagian ribosom yang memudahkan pembebasan tRNA deasilasi daripada ribosom semasa sintesis protein.Kenalan ini mencadangkan bahawa Mdf1 berpisah daripada ribosom menggunakan mekanisme yang sama seperti tRNA deasetilasi, memberikan penjelasan yang mungkin tentang bagaimana ribosom mengeluarkan Mdf1 untuk mengaktifkan semula sintesis protein.
Walau bagaimanapun, struktur kami mendedahkan hubungan yang tidak diketahui antara Mdf1 dan kaki ribosom L1 (bahagian ribosom yang membantu melepaskan tRNA deasilasi daripada ribosom semasa sintesis protein).Khususnya, Mdf1 menggunakan sesentuh yang sama seperti segmen siku molekul tRNA terdeasilasi (Rajah 2).Pemodelan molekul yang tidak diketahui sebelum ini menunjukkan bahawa Mdf1 berpisah daripada ribosom menggunakan mekanisme yang sama seperti tRNA deasetilasi, yang menerangkan bagaimana ribosom menghilangkan faktor hibernasi ini untuk mengaktifkan semula sintesis protein.
Apabila membina model rRNA, kami mendapati bahawa ribosom E. cuniculi mempunyai serpihan rRNA yang dilipat secara tidak normal, yang kami panggil rRNA bersatu (Rajah 3).Dalam ribosom yang merangkumi tiga domain kehidupan, rRNA melipat ke dalam struktur di mana kebanyakan asas rRNA sama ada berpasangan dan berlipat antara satu sama lain atau berinteraksi dengan protein ribosom38,39,40.Walau bagaimanapun, dalam ribosom E. cuniculi, rRNA nampaknya melanggar prinsip lipatan ini dengan menukarkan beberapa heliks mereka kepada kawasan rRNA yang tidak dilipat.
Struktur heliks rRNA H18 25S dalam S. cerevisiae, V. necatrix, dan E. cuniculi.Biasanya, dalam ribosom yang merangkumi tiga domain kehidupan, penghubung ini bergulung menjadi heliks RNA yang mengandungi 24 hingga 34 sisa.Dalam Microsporidia, sebaliknya, penyambung rRNA ini secara beransur-ansur dikurangkan kepada dua penyambung yang kaya dengan uridin tunggal yang mengandungi hanya 12 sisa.Kebanyakan sisa ini terdedah kepada pelarut.Angka tersebut menunjukkan bahawa mikrosporidia parasit kelihatan melanggar prinsip umum lipatan rRNA, di mana pangkalan rRNA biasanya digabungkan dengan pangkalan lain atau terlibat dalam interaksi rRNA-protein.Dalam mikrosporidia, beberapa serpihan rRNA mengambil lipatan yang tidak menguntungkan, di mana bekas heliks rRNA menjadi serpihan beruntai tunggal yang memanjang hampir dalam garis lurus.Kehadiran kawasan luar biasa ini membolehkan rRNA mikrosporidia mengikat serpihan rRNA jauh menggunakan bilangan asas RNA yang minimum.
Contoh paling menarik bagi peralihan evolusi ini boleh diperhatikan dalam heliks rRNA H18 25S (Rajah 3).Dalam spesies dari E. coli kepada manusia, asas heliks rRNA ini mengandungi 24-32 nukleotida, membentuk heliks yang sedikit tidak teratur.Dalam struktur ribosom yang dikenal pasti sebelum ini daripada V. necatrix dan P. locustae,31,32 tapak heliks H18 sebahagiannya tidak bergelung, tetapi pasangan bes nukleotida dikekalkan.Walau bagaimanapun, dalam E. cuniculi serpihan rRNA ini menjadi penghubung terpendek 228UUUGU232 dan 301UUUUUUUUU307.Tidak seperti serpihan rRNA biasa, penghubung yang kaya dengan uridin ini tidak bergelung atau membuat sentuhan yang meluas dengan protein ribosom.Sebaliknya, mereka menggunakan struktur terbuka pelarut dan terbuka sepenuhnya di mana helai rRNA dilanjutkan hampir lurus.Konformasi terbentang ini menerangkan bagaimana E. cuniculi hanya menggunakan 12 pangkalan RNA untuk mengisi jurang 33 Å antara heliks rRNA H16 dan H18, manakala spesies lain memerlukan sekurang-kurangnya dua kali lebih banyak pangkalan rRNA untuk mengisi jurang tersebut.
Oleh itu, kita boleh menunjukkan bahawa, melalui lipatan yang tidak menguntungkan secara bertenaga, mikrosporidia parasit telah membangunkan strategi untuk menguncup walaupun segmen rRNA yang kekal secara meluas dipelihara merentas spesies dalam tiga domain kehidupan.Nampaknya, dengan mengumpul mutasi yang mengubah heliks rRNA menjadi penyambung poli-U pendek, E. cuniculi boleh membentuk serpihan rRNA luar biasa yang mengandungi sesedikit mungkin nukleotida untuk pengikatan serpihan rRNA distal.Ini membantu menjelaskan cara mikrosporidia mencapai pengurangan dramatik dalam struktur molekul asasnya tanpa kehilangan integriti struktur dan fungsinya.
Satu lagi ciri luar biasa E. cuniculi rRNA ialah rupa rRNA tanpa penebalan (Rajah 4).Bonjolan ialah nukleotida tanpa pasangan asas yang berpintal keluar dari heliks RNA dan bukannya bersembunyi di dalamnya.Kebanyakan tonjolan rRNA bertindak sebagai pelekat molekul, membantu mengikat protein ribosom bersebelahan atau serpihan rRNA lain.Sesetengah bonjolan bertindak sebagai engsel, membenarkan heliks rRNA melentur dan melipat secara optimum untuk sintesis protein yang produktif 41 .
a Penonjolan rRNA (penomboran S. cerevisiae) tidak terdapat dalam struktur ribosom E. cuniculi, tetapi terdapat dalam kebanyakan eukariota lain b E. coli, S. cerevisiae, H. sapiens, dan ribosom dalaman E. cuniculi.parasit tidak mempunyai banyak bonjolan rRNA purba yang sangat terpelihara.Penebalan ini menstabilkan struktur ribosom;oleh itu, ketiadaan mereka dalam microsporidia menunjukkan pengurangan kestabilan lipatan rRNA dalam parasit microsporidia.Perbandingan dengan batang P (L7/L12 berpunca dalam bakteria) menunjukkan bahawa kehilangan benjolan rRNA kadangkala bertepatan dengan kemunculan benjolan baru di sebelah benjolan yang hilang.Heliks H42 dalam rRNA 23S/28S mempunyai bonjolan purba (U1206 dalam Saccharomyces cerevisiae) yang dianggarkan berumur sekurang-kurangnya 3.5 bilion tahun kerana perlindungannya dalam tiga domain kehidupan.Dalam microsporidia, bonjolan ini dihapuskan.Walau bagaimanapun, bonjolan baru muncul di sebelah bonjolan yang hilang (A1306 dalam E. cuniculi).
Secara mengejutkan, kami mendapati bahawa ribosom E. cuniculi kekurangan kebanyakan bulge rRNA yang terdapat dalam spesies lain, termasuk lebih daripada 30 bonjolan yang dipelihara dalam eukariota lain (Rajah 4a).Kehilangan ini menghilangkan banyak sentuhan antara subunit ribosom dan heliks rRNA bersebelahan, kadangkala mewujudkan lompang berongga besar dalam ribosom, menjadikan ribosom E. cuniculi lebih berliang berbanding ribosom yang lebih tradisional (Rajah 4b).Terutama, kami mendapati bahawa kebanyakan bonjolan ini juga hilang dalam struktur ribosom V. necatrix dan P. locustae yang dikenal pasti sebelum ini, yang diabaikan oleh analisis struktur sebelumnya31,32.
Kadang-kadang kehilangan bonjolan rRNA disertai dengan perkembangan bonjolan baru di sebelah bonjolan yang hilang.Sebagai contoh, batang P ribosom mengandungi bonjolan U1208 (dalam Saccharomyces cerevisiae) yang terselamat daripada E. coli kepada manusia dan oleh itu dianggarkan berumur 3.5 bilion tahun.Semasa sintesis protein, bonjolan ini membantu batang P bergerak antara konformasi terbuka dan tertutup supaya ribosom boleh merekrut faktor terjemahan dan menghantarnya ke tapak aktif.Dalam ribosom E. cuniculi, penebalan ini tiada;bagaimanapun, penebalan baru (G883) yang terletak hanya dalam tiga pasangan asas boleh menyumbang kepada pemulihan fleksibiliti optimum batang P (Rajah 4c).
Data kami pada rRNA tanpa bulge menunjukkan bahawa pengecilan rRNA tidak terhad kepada kehilangan unsur rRNA pada permukaan ribosom, tetapi mungkin juga melibatkan nukleus ribosom, mewujudkan kecacatan molekul spesifik parasit yang belum diterangkan dalam sel hidup bebas.spesies hidup diperhatikan.
Selepas memodelkan protein ribosom kanonik dan rRNA, kami mendapati bahawa komponen ribosom konvensional tidak dapat menjelaskan tiga bahagian imej cryo-EM.Dua daripada serpihan ini adalah saiz molekul kecil (Rajah 5, Rajah Tambahan 8).Segmen pertama diapit antara protein ribosom uL15 dan eL18 dalam kedudukan yang biasanya diduduki oleh terminal C eL18, yang dipendekkan dalam E. cuniculi.Walaupun kita tidak dapat menentukan identiti molekul ini, saiz dan bentuk pulau ketumpatan ini dijelaskan dengan baik oleh kehadiran molekul spermidine.Pengikatannya pada ribosom distabilkan oleh mutasi khusus mikrosporidia dalam protein uL15 (Asp51 dan Arg56), yang nampaknya meningkatkan pertalian ribosom untuk molekul kecil ini, kerana ia membenarkan uL15 membungkus molekul kecil ke dalam struktur ribosom.Tambahan Rajah 2).8, data tambahan 1, 2).
Pengimejan Cryo-EM menunjukkan kehadiran nukleotida di luar ribosa yang terikat pada ribosom E. cuniculi.Dalam ribosom E. cuniculi, nukleotida ini menduduki tempat yang sama dengan nukleotida 25S rRNA A3186 (penomboran Saccharomyces cerevisiae) dalam kebanyakan ribosom eukariotik lain.b Dalam struktur ribosom E. cuniculi, nukleotida ini terletak di antara protein ribosom uL9 dan eL20, dengan itu menstabilkan hubungan antara kedua-dua protein.analisis pemuliharaan jujukan cd eL20 di kalangan spesies microsporidia.Pokok filogenetik spesies Microsporidia (c) dan penjajaran jujukan berbilang protein eL20 (d) menunjukkan bahawa sisa pengikat nukleotida F170 dan K172 dipelihara dalam kebanyakan Microsporidia tipikal, kecuali S. lophii, dengan pengecualian Microsporidia cawangan awal, yang mengekalkan sambungan rRNA ES39L.e Angka ini menunjukkan bahawa sisa pengikat nukleotida F170 dan K172 hanya terdapat dalam eL20 genom mikrosporidia yang sangat berkurangan, tetapi tidak dalam eukariota lain.Secara keseluruhannya, data ini mencadangkan bahawa ribosom Microsporidian telah membangunkan tapak pengikat nukleotida yang nampaknya mengikat molekul AMP dan menggunakannya untuk menstabilkan interaksi protein-protein dalam struktur ribosom.Pemuliharaan tinggi tapak pengikat ini dalam Microsporidia dan ketiadaannya dalam eukariota lain menunjukkan bahawa tapak ini mungkin memberikan kelebihan survival terpilih untuk Microsporidia.Oleh itu, poket pengikat nukleotida dalam ribosom mikrosporidia tidak kelihatan sebagai ciri yang merosot atau bentuk akhir degradasi rRNA seperti yang diterangkan sebelum ini, sebaliknya merupakan inovasi evolusi yang berguna yang membolehkan ribosom mikrosporidia mengikat secara langsung molekul kecil, menggunakannya sebagai blok bangunan molekul.blok bangunan untuk ribosom.Penemuan ini menjadikan ribosom mikrosporidia satu-satunya ribosom yang diketahui menggunakan nukleotida tunggal sebagai blok binaan strukturnya.f Laluan evolusi hipotesis yang diperoleh daripada pengikatan nukleotida.
Ketumpatan berat molekul rendah kedua terletak pada antara muka antara protein ribosom uL9 dan eL30 (Rajah 5a).Antara muka ini sebelum ini diterangkan dalam struktur ribosom Saccharomyces cerevisiae sebagai tapak pengikat untuk nukleotida 25S rRNA A3186 (sebahagian daripada sambungan rRNA ES39L)38.Telah ditunjukkan bahawa dalam ribosom P. locustae ES39L yang merosot, antara muka ini mengikat nukleotida tunggal 31 yang tidak diketahui, dan diandaikan bahawa nukleotida ini ialah bentuk akhir rRNA yang dikurangkan, di mana panjang rRNA ialah ~130-230 bes.ES39L dikurangkan kepada satu nukleotida 32.43.Imej cryo-EM kami menyokong idea bahawa ketumpatan boleh dijelaskan oleh nukleotida.Walau bagaimanapun, resolusi struktur kami yang lebih tinggi menunjukkan bahawa nukleotida ini adalah molekul ekstraribosomal, mungkin AMP (Rajah 5a, b).
Kami kemudian bertanya sama ada tapak pengikat nukleotida muncul dalam ribosom E. cuniculi atau sama ada ia wujud sebelum ini.Oleh kerana pengikatan nukleotida terutamanya dimediasi oleh residu Phe170 dan Lys172 dalam protein ribosom eL30, kami menilai pemuliharaan residu ini dalam 4396 wakil eukariota.Seperti dalam kes uL15 di atas, kami mendapati bahawa sisa Phe170 dan Lys172 sangat terpelihara hanya dalam Microsporidia biasa, tetapi tidak terdapat dalam eukariota lain, termasuk Microsporidia Mitosporidium dan Amphiamblys atipikal, di mana serpihan ES39L rRNA tidak berkurangan 44, 45, 45, .-e).
Diambil bersama, data ini menyokong idea bahawa E. cuniculi dan mungkin mikrosporidia kanonik lain telah mengembangkan keupayaan untuk menangkap sejumlah besar metabolit kecil dalam struktur ribosom dengan cekap untuk mengimbangi penurunan tahap rRNA dan protein.Dengan berbuat demikian, mereka telah membangunkan keupayaan unik untuk mengikat nukleotida di luar ribosom, menunjukkan bahawa struktur molekul parasit mengimbangi dengan menangkap metabolit kecil yang banyak dan menggunakannya sebagai meniru struktur RNA dan serpihan protein yang terdegradasi..
Bahagian ketiga yang tidak disimulasikan peta cryo-EM kami, terdapat dalam subunit ribosom besar.Resolusi yang agak tinggi (2.6 Å) peta kami menunjukkan bahawa ketumpatan ini tergolong dalam protein dengan kombinasi unik sisa rantaian sisi yang besar, yang membolehkan kami mengenal pasti ketumpatan ini sebagai protein ribosom yang tidak diketahui sebelum ini yang kami kenal pasti sebagai Ia dinamakan msL2 (Microsporidia- protein khusus L2) (kaedah, rajah 6).Carian homologi kami menunjukkan bahawa msL2 dipelihara dalam klad Microsporidia genus Encephaliter dan Orosporidium, tetapi tiada dalam spesies lain, termasuk Microsporidia lain.Dalam struktur ribosom, msL2 menduduki jurang yang dibentuk oleh kehilangan rRNA ES31L yang dilanjutkan.Dalam kekosongan ini, msL2 membantu menstabilkan lipatan rRNA dan boleh mengimbangi kehilangan ES31L (Rajah 6).
Ketumpatan elektron dan model protein ribosom khusus Microsporidia msL2 yang terdapat dalam ribosom E. cuniculi.b Kebanyakan ribosom eukariotik, termasuk ribosom 80S Saccharomyces cerevisiae, mempunyai penguatan rRNA ES19L yang hilang dalam kebanyakan spesies Microsporidian.Struktur ribosom mikrosporidia V. necatrix yang telah ditubuhkan sebelum ini menunjukkan bahawa kehilangan ES19L dalam parasit ini dikompensasikan oleh evolusi protein ribosom msL1 yang baharu.Dalam kajian ini, kami mendapati bahawa ribosom E. cuniculi juga membangunkan protein mimik RNA ribosom tambahan sebagai pampasan yang jelas untuk kehilangan ES19L.Walau bagaimanapun, msL2 (kini diberi anotasi sebagai protein ECU06_1135 hipotesis) dan msL1 mempunyai asal-usul struktur dan evolusi yang berbeza.c Penemuan penjanaan protein ribosom msL1 dan msL2 yang tidak berkaitan secara evolusi ini menunjukkan bahawa jika ribosom mengumpul mutasi yang memudaratkan dalam rRNA mereka, mereka boleh mencapai tahap kepelbagaian komposisi yang belum pernah terjadi sebelumnya walaupun dalam subset kecil spesies yang berkait rapat.Penemuan ini boleh membantu menjelaskan asal dan evolusi ribosom mitokondria, yang terkenal dengan rRNA yang sangat berkurangan dan kebolehubahan yang tidak normal dalam komposisi protein merentas spesies.
Kami kemudian membandingkan protein msL2 dengan protein msL1 yang diterangkan sebelum ini, satu-satunya protein ribosom khusus mikrosporidia yang diketahui terdapat dalam ribosom V. necatrix.Kami ingin menguji sama ada msL1 dan msL2 berkaitan secara evolusi.Analisis kami menunjukkan bahawa msL1 dan msL2 menduduki rongga yang sama dalam struktur ribosom, tetapi mempunyai struktur primer dan tertier yang berbeza, yang menunjukkan asal evolusi bebasnya (Rajah 6).Oleh itu, penemuan msL2 kami memberikan bukti bahawa kumpulan spesies eukariotik padat boleh secara bebas mengembangkan protein ribosom yang berbeza secara struktur untuk mengimbangi kehilangan serpihan rRNA.Penemuan ini ketara kerana kebanyakan ribosom eukariotik sitoplasma mengandungi protein invarian, termasuk keluarga 81 protein ribosom yang sama.Kemunculan msL1 dan msL2 dalam pelbagai klad mikrosporidia sebagai tindak balas kepada kehilangan segmen rRNA lanjutan menunjukkan bahawa kemerosotan seni bina molekul parasit menyebabkan parasit mencari mutasi pampasan, yang akhirnya boleh membawa kepada pemerolehan mereka dalam populasi parasit yang berbeza.struktur.
Akhirnya, apabila model kami siap, kami membandingkan komposisi ribosom E. cuniculi dengan yang diramalkan daripada jujukan genom.Beberapa protein ribosom, termasuk eL14, eL38, eL41, dan eS30, sebelum ini dianggap hilang daripada genom E. cuniculi kerana ketiadaan homolog mereka dari genom E. cuniculi.Kehilangan banyak protein ribosom juga diramalkan dalam kebanyakan parasit intraselular dan endosimbion lain yang sangat berkurangan.Sebagai contoh, walaupun kebanyakan bakteria hidup bebas mengandungi keluarga 54 protein ribosom yang sama, hanya 11 daripada keluarga protein ini mempunyai homolog yang boleh dikesan dalam setiap genom bakteria terhad hos yang dianalisis.Bagi menyokong tanggapan ini, kehilangan protein ribosom telah diperhatikan secara eksperimen dalam V. necatrix dan P. locustae microsporidia, yang kekurangan protein eL38 dan eL4131,32.
Walau bagaimanapun, struktur kami menunjukkan bahawa hanya eL38, eL41 dan eS30 sebenarnya hilang dalam ribosom E. cuniculi.Protein eL14 telah dipelihara dan struktur kami menunjukkan mengapa protein ini tidak dapat ditemui dalam carian homologi (Rajah 7).Dalam ribosom E. cuniculi, kebanyakan tapak pengikatan eL14 hilang akibat degradasi ES39L yang diperkuatkan rRNA.Dengan ketiadaan ES39L, eL14 kehilangan sebahagian besar struktur sekundernya, dan hanya 18% daripada jujukan eL14 adalah sama dalam E. cuniculi dan S. cerevisiae.Pemeliharaan jujukan yang lemah ini adalah luar biasa kerana walaupun Saccharomyces cerevisiae dan Homo sapiens—organisma yang berevolusi selang 1.5 bilion tahun—berkongsi lebih daripada 51% sisa yang sama dalam eL14.Kehilangan pemuliharaan anomali ini menjelaskan mengapa E. cuniculi eL14 pada masa ini dianotasi sebagai protein M970_061160 yang diduga dan bukan sebagai protein ribosom eL1427.
dan Ribosom Microsporidia kehilangan sambungan rRNA ES39L, yang menghapuskan sebahagian tapak pengikat protein ribosom eL14.Dengan ketiadaan ES39L, protein mikrospora eL14 mengalami kehilangan struktur sekunder, di mana bekas α-helix yang mengikat rRNA merosot menjadi gelung panjang minimum.b Penjajaran jujukan berbilang menunjukkan bahawa protein eL14 sangat terpelihara dalam spesies eukariotik (57% identiti jujukan antara yis dan homolog manusia), tetapi kurang dipelihara dan mencapah dalam mikrosporidia (di mana tidak lebih daripada 24% sisa adalah sama dengan homolog eL14).daripada S. cerevisiae atau H. sapiens).Pemuliharaan jujukan yang lemah dan kebolehubahan struktur sekunder ini menerangkan mengapa homolog eL14 tidak pernah ditemui dalam E. cuniculi dan mengapa protein ini dianggap telah hilang dalam E. cuniculi.Sebaliknya, E. cuniculi eL14 sebelum ini dianotasi sebagai protein M970_061160 yang diduga.Pemerhatian ini menunjukkan bahawa kepelbagaian genom microsporidia kini dianggarkan terlalu tinggi: sesetengah gen yang pada masa ini dianggap hilang dalam mikrosporidia sebenarnya dipelihara, walaupun dalam bentuk yang sangat berbeza;sebaliknya, ada yang dianggap mengodkan gen microsporidia untuk protein khusus cacing (cth, protein hipotetikal M970_061160) sebenarnya mengekod untuk protein yang sangat pelbagai yang terdapat dalam eukariota lain.
Penemuan ini menunjukkan bahawa denaturasi rRNA boleh membawa kepada kehilangan pemuliharaan jujukan secara dramatik dalam protein ribosom bersebelahan, menjadikan protein ini tidak dapat dikesan untuk carian homologi.Oleh itu, kita mungkin melebihkan tahap sebenar kemerosotan molekul dalam organisma genom kecil, kerana sesetengah protein yang dianggap hilang sebenarnya berterusan, walaupun dalam bentuk yang sangat diubah.
Bagaimanakah parasit dapat mengekalkan fungsi mesin molekul mereka di bawah keadaan pengurangan genom yang melampau?Kajian kami menjawab soalan ini dengan menerangkan struktur molekul kompleks (ribosom) E. cuniculi, organisma dengan salah satu genom eukariotik terkecil.
Telah diketahui selama hampir dua dekad bahawa molekul protein dan RNA dalam parasit mikrob sering berbeza daripada molekul homolog mereka dalam spesies hidup bebas kerana mereka tidak mempunyai pusat kawalan kualiti, dikurangkan kepada 50% daripada saiznya dalam mikrob hidup bebas, dsb.banyak mutasi melemahkan yang menjejaskan lipatan dan fungsi.Sebagai contoh, ribosom organisma genom kecil, termasuk banyak parasit intraselular dan endosimbion, dijangka kekurangan beberapa protein ribosom dan sehingga satu pertiga daripada nukleotida rRNA berbanding spesies hidup bebas 27, 29, 30, 49. Walau bagaimanapun, cara molekul ini berfungsi dalam parasit masih sebahagian besarnya menjadi misteri genom melalui.
Kajian kami menunjukkan bahawa struktur makromolekul boleh mendedahkan banyak aspek evolusi yang sukar untuk diekstrak daripada kajian genomik perbandingan tradisional parasit intrasel dan organisma sekatan hos yang lain (Tambahan Rajah 7).Sebagai contoh, contoh protein eL14 menunjukkan bahawa kita boleh menilai terlalu tinggi tahap kemerosotan sebenar radas molekul dalam spesies parasit.Parasit encephalitic kini dipercayai mempunyai ratusan gen khusus mikrosporidia.Walau bagaimanapun, keputusan kami menunjukkan bahawa sesetengah daripada gen yang kelihatan khusus ini sebenarnya hanyalah varian gen yang sangat berbeza yang biasa berlaku pada eukariota lain.Selain itu, contoh protein msL2 menunjukkan bagaimana kita mengabaikan protein ribosom baharu dan memandang rendah kandungan mesin molekul parasit.Contoh molekul kecil menunjukkan bagaimana kita boleh mengabaikan inovasi paling bijak dalam struktur molekul parasit yang boleh memberi mereka aktiviti biologi baharu.
Diambil bersama, keputusan ini meningkatkan pemahaman kita tentang perbezaan antara struktur molekul organisma terhad tuan rumah dan rakan sejawatannya dalam organisma hidup bebas.Kami menunjukkan bahawa mesin molekul, yang telah lama dianggap berkurangan, merosot, dan tertakluk kepada pelbagai mutasi yang melemahkan, sebaliknya mempunyai satu set ciri struktur luar biasa yang diabaikan secara sistematik.
Sebaliknya, serpihan rRNA bukan besar dan serpihan bercantum yang kami temui dalam ribosom E. cuniculi mencadangkan bahawa pengurangan genom boleh mengubah walaupun bahagian jentera molekul asas yang dipelihara dalam tiga domain kehidupan - selepas hampir 3.5 bilion tahun .evolusi bebas spesies.
Serpihan rRNA bebas bonjolan dan bercantum dalam ribosom E. cuniculi sangat diminati berdasarkan kajian terdahulu tentang molekul RNA dalam bakteria endosimbiotik.Sebagai contoh, dalam endosimbion aphid Buchnera aphidicola, molekul rRNA dan tRNA telah ditunjukkan mempunyai struktur sensitif suhu disebabkan oleh bias komposisi A+T dan perkadaran tinggi pasangan asas bukan kanonik20,50.Perubahan dalam RNA ini, serta perubahan dalam molekul protein, kini dianggap bertanggungjawab untuk terlalu bergantung endosimbion pada pasangan dan ketidakupayaan endosimbion untuk memindahkan haba 21, 23 .Walaupun rRNA mikrosporidia parasit mempunyai perubahan struktur yang berbeza, sifat perubahan ini menunjukkan bahawa kestabilan haba yang berkurangan dan pergantungan yang lebih tinggi pada protein pendamping mungkin merupakan ciri umum molekul RNA dalam organisma dengan genom yang berkurangan.
Sebaliknya, struktur kami menunjukkan bahawa mikrosporidia parasit telah mengembangkan keupayaan unik untuk menentang serpihan rRNA dan protein yang dipelihara secara meluas, membangunkan keupayaan untuk menggunakan metabolit kecil yang banyak dan mudah didapati sebagai meniru struktur rRNA dan serpihan protein yang merosot.Kemerosotan struktur molekul..Pendapat ini disokong oleh fakta bahawa molekul kecil yang mengimbangi kehilangan serpihan protein dalam rRNA dan ribosom E. cuniculi mengikat residu khusus mikrosporidia dalam protein uL15 dan eL30.Ini menunjukkan bahawa pengikatan molekul kecil kepada ribosom mungkin merupakan hasil pemilihan positif, di mana mutasi khusus Microsporidia dalam protein ribosom telah dipilih untuk keupayaan mereka untuk meningkatkan pertalian ribosom untuk molekul kecil, yang mungkin membawa kepada organisma ribosom yang lebih cekap.Penemuan ini mendedahkan inovasi pintar dalam struktur molekul parasit mikrob dan memberi kita pemahaman yang lebih baik tentang cara struktur molekul parasit mengekalkan fungsinya walaupun evolusi reduktif.
Pada masa ini, pengenalpastian molekul kecil ini masih tidak jelas.Tidak jelas mengapa penampilan molekul kecil ini dalam struktur ribosom berbeza antara spesies microsporidia.Khususnya, tidak jelas mengapa pengikatan nukleotida diperhatikan dalam ribosom E. cuniculi dan P. locustae, dan bukan dalam ribosom V. necatrix, walaupun terdapat residu F170 dalam protein eL20 dan K172 V. necatrix.Pemadaman ini mungkin disebabkan oleh sisa 43 uL6 (terletak bersebelahan dengan poket pengikat nukleotida), iaitu tirosin dalam V. necatrix dan bukan threonine dalam E. cuniculi dan P. locustae.Rantai sisi aromatik besar Tyr43 boleh mengganggu pengikatan nukleotida akibat pertindihan sterik.Sebagai alternatif, pemadaman nukleotida yang jelas mungkin disebabkan oleh resolusi rendah pengimejan cryo-EM, yang menghalang pemodelan serpihan ribosom V. necatrix.
Sebaliknya, kerja kami mencadangkan bahawa proses pereputan genom mungkin merupakan daya ciptaan.Khususnya, struktur ribosom E. cuniculi menunjukkan bahawa kehilangan rRNA dan serpihan protein dalam ribosom mikrosporidia mewujudkan tekanan evolusi yang menggalakkan perubahan dalam struktur ribosom.Varian ini berlaku jauh dari tapak aktif ribosom dan kelihatan membantu mengekalkan (atau memulihkan) himpunan ribosom optimum yang sebaliknya akan terganggu oleh rRNA yang dikurangkan.Ini menunjukkan bahawa inovasi utama ribosom mikrosporidia nampaknya telah berkembang menjadi keperluan untuk menampan hanyutan gen.
Mungkin ini digambarkan dengan baik oleh pengikatan nukleotida, yang tidak pernah diperhatikan dalam organisma lain setakat ini.Fakta bahawa sisa pengikat nukleotida terdapat dalam mikrosporidia biasa, tetapi tidak dalam eukariota lain, menunjukkan bahawa tapak pengikat nukleotida bukan sekadar peninggalan yang menunggu untuk hilang, atau tapak terakhir untuk rRNA dipulihkan kepada bentuk nukleotida individu.Sebaliknya, tapak ini kelihatan seperti ciri berguna yang mungkin telah berkembang dalam beberapa pusingan pemilihan positif.Tapak pengikatan nukleotida mungkin hasil sampingan daripada pemilihan semula jadi: sebaik sahaja ES39L terdegradasi, mikrosporidia terpaksa mendapatkan pampasan untuk memulihkan biogenesis ribosom yang optimum tanpa ketiadaan ES39L.Memandangkan nukleotida ini boleh meniru hubungan molekul nukleotida A3186 dalam ES39L, molekul nukleotida menjadi blok binaan ribosom, yang pengikatannya dipertingkatkan lagi dengan mutasi jujukan eL30.
Berkenaan dengan evolusi molekul parasit intrasel, kajian kami menunjukkan bahawa daya pemilihan semula jadi Darwin dan hanyutan genetik pereputan genom tidak beroperasi secara selari, tetapi berayun.Pertama, hanyutan genetik menghapuskan ciri penting biomolekul, menjadikan pampasan amat diperlukan.Hanya apabila parasit memenuhi keperluan ini melalui pemilihan semula jadi Darwin, makromolekul mereka mempunyai peluang untuk membangunkan ciri-ciri mereka yang paling mengagumkan dan inovatif.Yang penting, evolusi tapak pengikat nukleotida dalam ribosom E. cuniculi menunjukkan bahawa corak evolusi molekul yang rugi-untuk-dapat ini bukan sahaja melunaskan mutasi yang merosakkan, tetapi kadangkala memberikan fungsi baharu sepenuhnya pada makromolekul parasit.
Idea ini selaras dengan teori keseimbangan bergerak Sewell Wright, yang menyatakan bahawa sistem pemilihan semula jadi yang ketat mengehadkan keupayaan organisma untuk berinovasi51,52,53.Walau bagaimanapun, jika hanyutan genetik mengganggu pemilihan semula jadi, hanyutan ini boleh menghasilkan perubahan yang tidak menyesuaikan diri (atau malah merugikan) tetapi membawa kepada perubahan selanjutnya yang memberikan kecergasan yang lebih tinggi atau aktiviti biologi baharu.Rangka kerja kami menyokong idea ini dengan menggambarkan bahawa jenis mutasi yang sama yang mengurangkan lipatan dan fungsi biomolekul nampaknya menjadi pencetus utama untuk penambahbaikannya.Selaras dengan model evolusi menang-menang, kajian kami menunjukkan bahawa pereputan genom, yang secara tradisinya dilihat sebagai proses degeneratif, juga merupakan pemacu utama inovasi, kadangkala dan mungkin juga sering membenarkan makromolekul memperoleh aktiviti parasit baharu.boleh menggunakannya.