Terima kasih kerana melawat Nature.com.Anda menggunakan versi penyemak imbas dengan sokongan CSS terhad.Untuk pengalaman terbaik, kami mengesyorkan agar anda menggunakan penyemak imbas yang dikemas kini (atau lumpuhkan Mod Keserasian dalam Internet Explorer).Di samping itu, untuk memastikan sokongan berterusan, kami menunjukkan tapak tanpa gaya dan JavaScript.
Memaparkan karusel tiga slaid serentak.Gunakan butang Sebelum dan Seterusnya untuk bergerak melalui tiga slaid pada satu masa, atau gunakan butang gelangsar pada penghujung untuk bergerak melalui tiga slaid pada satu masa.
Penghalang darah-otak dan penghalang darah-otak menghalang agen bioterapeutik daripada mencapai sasaran mereka dalam sistem saraf pusat, dengan itu menghalang rawatan penyakit saraf yang berkesan.Untuk menemui pengangkut otak baru dalam vivo, kami memperkenalkan perpustakaan peptida phage T7 dan mengumpul darah dan cecair serebrospinal (CSF) secara bersiri menggunakan model kolam besar yang sedar berkanu bagi tikus.Klon fag tertentu sangat diperkaya dalam CSF selepas empat pusingan pemilihan.Ujian peptida calon individu mendedahkan pengayaan lebih daripada 1000 kali ganda dalam CSF.Bioaktiviti penghantaran pengantara peptida ke otak telah disahkan oleh pengurangan 40% dalam tahap amiloid-β dalam cecair serebrospinal menggunakan perencat peptida BACE1 yang dikaitkan dengan peptida transit novel yang dikenal pasti.Keputusan ini menunjukkan bahawa peptida yang dikenal pasti oleh kaedah pemilihan in vivo phage mungkin merupakan kenderaan yang berguna untuk penghantaran sistemik makromolekul ke otak dengan kesan terapeutik.
Penyelidikan terapi disasarkan sistem saraf pusat (CNS) sebahagian besarnya tertumpu pada mengenal pasti ubat dan ejen yang dioptimumkan yang mempamerkan sifat penyasaran CNS, dengan usaha yang kurang untuk menemui mekanisme yang mendorong penghantaran ubat aktif ke otak.Ini mula berubah sekarang kerana penghantaran ubat, terutamanya molekul besar, merupakan bahagian penting dalam pembangunan dadah neurosains moden.Persekitaran sistem saraf pusat dilindungi dengan baik oleh sistem penghalang serebrovaskular, yang terdiri daripada penghalang darah-otak (BBB) ​​dan penghalang darah-otak (BCBB)1, menjadikannya mencabar untuk menghantar ubat ke otak1,2.Dianggarkan bahawa hampir semua ubat molekul besar dan lebih daripada 98% ubat molekul kecil disingkirkan daripada otak3.Itulah sebabnya sangat penting untuk mengenal pasti sistem pengangkutan otak baru yang menyediakan penghantaran ubat terapeutik yang cekap dan spesifik kepada CNS 4,5.Walau bagaimanapun, BBB dan BCSFB juga memberikan peluang yang sangat baik untuk penghantaran dadah kerana ia menembusi dan memasuki semua struktur otak melalui vaskularnya yang luas.Oleh itu, usaha semasa untuk menggunakan kaedah penghantaran bukan invasif ke otak sebahagian besarnya berdasarkan mekanisme pengangkutan pengantara reseptor (PMT) menggunakan reseptor BBB6 endogen.Walaupun kemajuan utama baru-baru ini menggunakan laluan reseptor transferin7,8, pembangunan lanjut sistem penyampaian baharu dengan sifat yang dipertingkatkan diperlukan.Untuk tujuan ini, matlamat kami adalah untuk mengenal pasti peptida yang mampu mengantarkan pengangkutan CSF, kerana ia pada dasarnya boleh digunakan untuk menghantar makromolekul ke CNS atau untuk membuka laluan reseptor baru.Khususnya, reseptor dan pengangkut khusus sistem serebrovaskular (BBB dan BSCFB) boleh berfungsi sebagai sasaran yang berpotensi untuk penghantaran ubat bioterapeutik yang aktif dan spesifik.Cecair serebrospinal (CSF) ialah produk rembesan plexus koroid (CS) dan bersentuhan langsung dengan cecair interstisial otak melalui ruang subarachnoid dan ruang ventrikel4.Baru-baru ini telah ditunjukkan bahawa cecair serebrospinal subarachnoid meresap secara berlebihan ke dalam interstitium otak9.Kami berharap dapat mengakses ruang parenkim menggunakan saluran masuk subarachnoid ini atau terus melalui BBB.Untuk mencapai matlamat ini, kami melaksanakan strategi pemilihan in vivo phage yang mantap yang secara idealnya mengenal pasti peptida yang diangkut oleh salah satu daripada dua laluan berbeza ini.
Kami kini menerangkan kaedah saringan paparan in vivo phage secara berurutan dengan pensampelan CSF ditambah dengan penjujukan pemprosesan tinggi (HTS) untuk memantau pusingan pemilihan awal dengan kepelbagaian perpustakaan tertinggi.Pemeriksaan dilakukan ke atas tikus yang sedar dengan kanula cisterna besar (CM) yang ditanam secara kekal untuk mengelakkan pencemaran darah.Yang penting, pendekatan ini memilih kedua-dua penargetan otak dan peptida dengan aktiviti pengangkutan merentasi halangan serebrovaskular.Kami menggunakan phages T7 kerana saiznya yang kecil (~ 60 nm) 10 dan mencadangkan bahawa ia sesuai untuk pengangkutan vesikel yang membolehkan penyeberangan transselular halangan endothelial dan/atau epitelium-medulla.Selepas empat pusingan panning, populasi phage telah diasingkan menunjukkan pengayaan CSF dalam vivo yang kuat dan persatuan microvessel serebrum.Yang penting, kami dapat mengesahkan penemuan kami dengan menunjukkan bahawa peptida calon terbaik pilihan dan disintesis secara kimia dapat mengangkut kargo protein ke dalam cecair serebrospinal.Pertama, kesan farmakodinamik CNS telah ditubuhkan dengan menggabungkan peptida transit terkemuka dengan perencat peptida BACE1.Di samping menunjukkan bahawa strategi penyaringan fungsi in vivo boleh mengenal pasti peptida pengangkutan otak baru sebagai pembawa kargo protein yang berkesan, kami menjangkakan pendekatan pemilihan fungsi yang serupa juga menjadi penting dalam mengenal pasti laluan pengangkutan otak baru.
Berdasarkan unit pembentuk plak (PFU), selepas langkah pembungkusan phage, perpustakaan rawak 12-mer linear T7 peptida phage dengan kepelbagaian kira-kira 109 telah direka dan dicipta (lihat Bahan dan Kaedah).Adalah penting untuk ambil perhatian bahawa kami menganalisis perpustakaan ini dengan teliti sebelum panning in vivo.Penguatan PCR sampel perpustakaan phage menggunakan primer diubah suai menghasilkan amplikon yang boleh digunakan secara langsung untuk HTS (Tambahan Rajah 1a).Disebabkan oleh a) ralat penjujukan HTS11, b) kesan ke atas kualiti primer (NNK)1-12, dan c) kehadiran fag jenis liar (wt) (sisipan rangka) dalam perpustakaan siap sedia, prosedur penapisan jujukan telah dilaksanakan untuk mengekstrak maklumat jujukan yang disahkan sahaja (Tambahan Rajah 1b).Langkah penapis ini digunakan untuk semua perpustakaan penjujukan HTS.Bagi perpustakaan standard, sebanyak 233,868 bacaan diperolehi, di mana 39% daripadanya melepasi kriteria penapis dan digunakan untuk analisis perpustakaan dan pemilihan untuk pusingan berikutnya (Tambahan Rajah 1c-e).Bacaan kebanyakannya adalah gandaan 3 pasangan asas panjang dengan puncak pada 36 nukleotida (Tambahan Rajah 1c), mengesahkan reka bentuk perpustakaan (NNK) 1-12.Terutama, kira-kira 11% daripada ahli perpustakaan mengandungi sisipan PAGISRELVDKL jenis liar (wt) 12 dimensi, dan hampir separuh daripada jujukan (49%) mengandungi sisipan atau pemadaman.HTS perpustakaan perpustakaan mengesahkan kepelbagaian peptida yang tinggi di perpustakaan: lebih daripada 81% jujukan peptida ditemui sekali sahaja dan hanya 1.5% berlaku dalam ≥4 salinan (Tambahan Rajah 2a).Kekerapan asid amino (aa) pada semua 12 kedudukan dalam himpunan berkorelasi dengan baik dengan frekuensi yang dijangkakan untuk bilangan kodon yang dihasilkan oleh repertoir NKK yang merosot (Tambahan Rajah 2b).Kekerapan yang diperhatikan bagi sisa aa yang dikodkan oleh sisipan ini berkorelasi baik dengan kekerapan yang dikira (r = 0.893) (Tambahan Rajah 2c).Penyediaan perpustakaan phage untuk suntikan termasuk langkah-langkah penguatan dan penyingkiran endotoksin.Ini sebelum ini telah terbukti berpotensi mengurangkan kepelbagaian perpustakaan phage12,13.Oleh itu, kami menyusun perpustakaan phage yang diperkuatkan plat yang telah menjalani penyingkiran endotoksin dan membandingkannya dengan perpustakaan asal untuk menganggarkan kekerapan AA.Korelasi yang kuat (r = 0.995) diperhatikan di antara kolam asal dan kolam yang dikuatkan dan disucikan (Tambahan Rajah 2d), menunjukkan bahawa persaingan antara klon yang dikuatkan pada plat menggunakan T7 phage tidak menyebabkan berat sebelah utama.Perbandingan ini adalah berdasarkan kekerapan motif tripeptida dalam setiap perpustakaan, kerana kepelbagaian perpustakaan (~109) tidak dapat ditangkap sepenuhnya walaupun dengan HTS.Analisis kekerapan aa pada setiap kedudukan mendedahkan kecenderungan bergantung kepada kedudukan kecil dalam tiga kedudukan terakhir repertoir yang dimasukkan (Tambahan Rajah 2e).Kesimpulannya, kami membuat kesimpulan bahawa kualiti dan kepelbagaian perpustakaan boleh diterima dan hanya perubahan kecil dalam kepelbagaian yang diperhatikan disebabkan oleh penguatan dan penyediaan perpustakaan phage antara beberapa pusingan pemilihan.
Pensampelan cecair serebrospinal bersiri boleh dilakukan dengan menanam kanula secara pembedahan ke dalam CM tikus sedar untuk memudahkan pengecaman T7 phage yang disuntik secara intravena (iv) melalui BBB dan/atau BCSFB (Rajah 1a-b).Kami menggunakan dua lengan pemilihan bebas (lengan A dan B) dalam tiga pusingan pertama pemilihan in vivo (Rajah 1c).Kami secara beransur-ansur meningkatkan ketegasan pemilihan dengan mengurangkan jumlah phage yang diperkenalkan dalam tiga pusingan pertama pemilihan.Untuk pusingan keempat panning, kami menggabungkan sampel dari cawangan A dan B dan melakukan tiga pilihan bebas tambahan.Untuk mengkaji sifat in vivo zarah faj T7 dalam model ini, faj jenis liar (sisipan induk PAGISRELVDKL) telah disuntik ke dalam tikus melalui urat ekor.Pemulihan faj daripada cecair serebrospinal dan darah pada titik masa yang berbeza menunjukkan bahawa faj ikosahedral T7 yang agak kecil mempunyai fasa pelepasan awal yang cepat dari petak darah (Tambahan Rajah 3).Berdasarkan titer yang diberikan dan isipadu darah tikus, kami mengira bahawa hanya kira-kira 1% berat.phage daripada dos yang diberikan dikesan dalam darah 10 minit selepas suntikan intravena.Selepas penurunan pesat awal ini, pelepasan primer yang lebih perlahan diukur dengan separuh hayat 27.7 minit.Yang penting, hanya sedikit faj yang telah diambil dari petak CSF, menunjukkan latar belakang yang rendah untuk penghijrahan faj jenis liar ke dalam petak CSF (Tambahan Rajah 3).Secara purata, hanya kira-kira 1 x 10-3% titer T7 phage dalam darah dan 4 x 10-8% daripada phage yang mula diselitkan dikesan dalam cecair serebrospinal sepanjang tempoh pensampelan (0-250 min).Terutama, separuh hayat (25.7 min) fag jenis liar dalam cecair serebrospinal adalah serupa dengan yang diperhatikan dalam darah.Data ini menunjukkan bahawa penghalang yang memisahkan petak CSF daripada darah adalah utuh dalam tikus berkanulasi CM, membolehkan pemilihan perpustakaan phage secara in vivo untuk mengenal pasti klon yang mudah diangkut dari darah ke dalam petak CSF.
(a) Menyediakan kaedah untuk pensampelan semula cecair serebrospinal (CSF) dari kolam besar.(b) Rajah menunjukkan lokasi selular penghalang sistem saraf pusat (CNS) dan strategi pemilihan yang digunakan untuk mengenal pasti peptida yang melintasi halangan otak darah (BBB) ​​dan halangan otak darah.(c) Carta alir saringan paparan in vivo phage.Dalam setiap pusingan pemilihan, phages (pengecam haiwan di dalam anak panah) disuntik secara intravena.Dua cawangan alternatif bebas (A, B) disimpan secara berasingan sehingga pusingan ke-4 pemilihan.Untuk pusingan pemilihan 3 dan 4, setiap klon faj yang diekstrak daripada CSF disusun secara manual.(d) Kinetik phage diasingkan daripada darah (bulatan merah) dan cecair serebrospinal (segitiga hijau) semasa pusingan pertama pemilihan dalam dua tikus kanulasi selepas suntikan intravena perpustakaan peptida T7 (2 x 1012 phages / haiwan).Petak biru menunjukkan purata kepekatan awal phage dalam darah, dikira daripada jumlah phage yang disuntik, dengan mengambil kira jumlah isipadu darah.Petak hitam menunjukkan titik persilangan garis y yang diekstrapolasi daripada kepekatan phage darah.(e, f) Kemukakan kekerapan relatif dan pengedaran semua kemungkinan motif tripeptida bertindih yang terdapat dalam peptida.Bilangan motif yang terdapat dalam 1000 bacaan ditunjukkan.Secara ketara (p < 0.001) motif diperkaya ditanda dengan titik merah.(e) Plot serakan korelasi membandingkan kekerapan relatif motif tripeptida perpustakaan yang disuntik dengan fag yang berasal dari darah daripada haiwan #1.1 dan #1.2.(f) Plot serakan korelasi membandingkan frekuensi relatif motif tripeptida fag haiwan #1.1 dan #1.2 yang diasingkan dalam darah dan cecair serebrospinal.(g, h) Perwakilan ID jujukan phage diperkaya dalam darah (g) berbanding perpustakaan yang disuntik dan phage diperkaya dalam CSF (h) berbanding darah selepas pusingan pemilihan in vivo dalam kedua-dua haiwan.Saiz kod satu huruf menunjukkan kekerapan asid amino itu berlaku pada kedudukan itu.Hijau = polar, ungu = neutral, biru = asas, merah = berasid dan hitam = asid amino hidrofobik.Rajah 1a, b direka dan dihasilkan oleh Eduard Urich.
Kami menyuntik perpustakaan peptida phage ke dalam dua tikus instrumen CM (clades A dan B) dan phage terpencil daripada cecair serebrospinal dan darah (Rajah 1d).Pelepasan pantas awal perpustakaan kurang ketara berbanding fag jenis liar.Purata separuh hayat perpustakaan yang disuntik dalam kedua-dua haiwan adalah 24.8 minit dalam darah, serupa dengan faj jenis liar, dan 38.5 minit dalam CSF.Sampel darah dan cecair cerebrospinal phage dari setiap haiwan tertakluk kepada HTS dan semua peptida yang dikenal pasti dianalisis untuk kehadiran motif tripeptida pendek.Motif tripeptida dipilih kerana ia menyediakan asas minimum untuk pembentukan struktur dan interaksi peptida-protein14,15.Kami mendapati korelasi yang baik dalam pengedaran motif antara perpustakaan phage yang disuntik dan klon yang diekstrak daripada darah kedua-dua haiwan (Rajah 1e).Data menunjukkan bahawa komposisi perpustakaan hanya diperkaya sedikit dalam petak darah.Kekerapan asid amino dan jujukan konsensus dianalisis selanjutnya pada setiap kedudukan menggunakan penyesuaian perisian Weblogo16.Menariknya, kami mendapati pengayaan yang kuat dalam sisa glisin darah (Rajah 1g).Apabila darah dibandingkan dengan klon yang dipilih daripada CSF, pemilihan yang kuat dan beberapa nyahpilihan motif diperhatikan (Rajah 1f), dan asid amino tertentu lebih disukai hadir pada kedudukan yang telah ditetapkan dalam 12-anggota (Rajah 1h).Terutama, haiwan individu berbeza dengan ketara dalam cecair serebrospinal, manakala pengayaan glisin darah diperhatikan dalam kedua-dua haiwan (Tambahan Rajah 4a-j).Selepas penapisan ketat data jujukan dalam cecair serebrospinal haiwan #1.1 dan #1.2, sejumlah 964 dan 420 peptida 12-mer unik telah diperolehi (Tambahan Rajah 1d–e).Klon fag terpencil telah dikuatkan dan tertakluk kepada pusingan kedua pemilihan in vivo.Faj yang diekstrak daripada pusingan kedua pemilihan tertakluk kepada HTS dalam setiap haiwan dan semua peptida yang dikenal pasti digunakan sebagai input kepada program pengecaman motif untuk menganalisis kejadian motif tripeptida (Rajah 2a, b, ef).Berbanding dengan kitaran pertama phage yang pulih daripada CSF, kami memerhatikan pemilihan lanjut dan nyahpilihan banyak motif dalam CSF dalam cawangan A dan B (Rajah 2).Algoritma pengenalan rangkaian telah digunakan untuk menentukan sama ada ia mewakili corak jujukan konsisten yang berbeza.Persamaan yang jelas diperhatikan antara jujukan 12 dimensi yang dipulihkan oleh CSF dalam klad alternatif A (Rajah 2c, d) dan klad B (Rajah 2g, h).Analisis terkumpul dalam setiap cawangan mendedahkan profil pemilihan yang berbeza untuk peptida 12-mer (Tambahan Rajah 5c, d) dan peningkatan dalam nisbah CSF / titer darah dari semasa ke semasa untuk klon terkumpul selepas pemilihan pusingan kedua berbanding pusingan pertama pemilihan (Tambahan Rajah 5e).).
Pengayaan motif dan peptida dalam cecair serebrospinal dengan dua pusingan berturut-turut pemilihan paparan faj berfungsi in vivo.
Semua fag cecair serebrospinal yang diperolehi daripada pusingan pertama setiap haiwan (haiwan #1.1 dan #1.2) dikumpulkan, dikuatkan, dijujukan HT dan disuntik semula bersama (2 x 1010 faj/haiwan) 2 tikus berkanulasi SM (#1.1 → #).2.1 dan 2.2, 1.2 → 2.3 dan 2.4).( a, b, e, f ) Taburan korelasi yang membandingkan kekerapan relatif motif tripeptida semua phages yang berasal dari CSF dalam pusingan pemilihan pertama dan kedua.Kekerapan relatif dan pengedaran motif yang mewakili semua kemungkinan tripeptida bertindih yang terdapat dalam peptida dalam kedua-dua orientasi.Bilangan motif yang terdapat dalam 1000 bacaan ditunjukkan.Motif yang ketara (p < 0.001) dipilih atau dikecualikan dalam salah satu perpustakaan yang dibandingkan diserlahkan dengan titik merah.(c, d, g, h) Perwakilan logo jujukan bagi semua jujukan panjang 12 asid amino yang kaya dengan CSF berdasarkan pusingan 2 dan 1 pemilihan in vivo.Saiz kod satu huruf menunjukkan kekerapan asid amino itu berlaku pada kedudukan itu.Untuk mewakili logo, kekerapan jujukan CSF yang diekstrak daripada haiwan individu antara dua pusingan pemilihan dibandingkan dan jujukan yang diperkaya dalam pusingan kedua ditunjukkan: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 dan (h) #1.2–#2.4.Asid amino yang paling diperkaya pada kedudukan tertentu dalam (c, d) haiwan no.2.1 dan no.2.2 atau (g, h) dalam haiwan no.2.3 dan no.2.4 ditunjukkan dalam warna.Hijau = polar, ungu = neutral, biru = asas, merah = berasid dan hitam = asid amino hidrofobik.
Selepas pusingan ketiga pemilihan, kami mengenal pasti 124 jujukan peptida unik (# 3.1 dan # 3.2) daripada 332 klon phage yang disusun semula CSF yang diasingkan daripada dua haiwan (Tambahan Rajah 6a).Jujukan LGSVS (18.7%) mempunyai perkadaran relatif tertinggi, diikuti dengan sisipan jenis liar PAGISRELVDKL (8.2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2.2%) dan SARGSWREIVSLS (2.2%).Dalam pusingan keempat terakhir, kami mengumpulkan dua dahan yang dipilih secara bebas daripada tiga haiwan berasingan (Rajah 1c).Daripada 925 klon phage berjujukan pulih daripada CSF, dalam pusingan keempat kami mendapati 64 jujukan peptida unik (Tambahan Rajah 6b), antaranya perkadaran relatif fag jenis liar menurun kepada 0.8%.Klon CSF yang paling biasa pada pusingan keempat ialah LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3.6%) dan RLSSVDSDLSGC (3, 2%).%)).Julat panjang peptida yang dipilih adalah disebabkan oleh sisipan/pemadaman nukleotida atau kodon berhenti pramatang dalam primer perpustakaan apabila menggunakan kodon merosot untuk reka bentuk perpustakaan NNK.Kodon henti pramatang menjana peptida yang lebih pendek dan dipilih kerana ia mengandungi motif aa yang menggalakkan.Peptida yang lebih panjang mungkin terhasil daripada sisipan/pemadaman dalam primer perpustakaan sintetik.Ini meletakkan kodon hentian yang direka bentuk di luar bingkai dan membacanya sehingga kodon hentian baharu muncul di hilir.Secara umum, kami mengira faktor pengayaan untuk keempat-empat pusingan pemilihan dengan membandingkan data input dengan data output sampel.Untuk saringan pusingan pertama, kami menggunakan titer phage jenis liar sebagai rujukan latar belakang tidak khusus.Menariknya, pemilihan phage negatif adalah sangat kuat dalam kitaran CSF pertama, tetapi tidak dalam darah (Rajah 3a), yang mungkin disebabkan oleh kebarangkalian rendah penyebaran pasif kebanyakan ahli perpustakaan peptida ke dalam petak CSF atau phage relatif cenderung untuk disimpan atau dikeluarkan dengan lebih cekap daripada aliran darah daripada bakteria.Walau bagaimanapun, dalam pusingan kedua panning, pemilihan faj yang kuat dalam CSF diperhatikan dalam kedua-dua klad, menunjukkan bahawa pusingan sebelumnya telah diperkayakan dalam fag yang memaparkan peptida yang menggalakkan pengambilan CSF (Rajah 3a).Sekali lagi, tanpa pengayaan darah yang ketara.Juga dalam pusingan ketiga dan keempat, klon phage diperkaya dengan ketara dalam CSF.Membandingkan kekerapan relatif bagi setiap jujukan peptida unik antara dua pusingan pemilihan terakhir, kami mendapati bahawa jujukan itu lebih diperkaya dalam pemilihan pusingan keempat (Rajah 3b).Sebanyak 931 motif tripeptida telah diekstrak daripada kesemua 64 jujukan peptida unik menggunakan kedua-dua orientasi peptida.Motif yang paling diperkaya dalam pusingan keempat telah diperiksa dengan lebih teliti untuk profil pengayaan mereka merentas semua pusingan berbanding perpustakaan yang disuntik (potongan: 10% pengayaan) (Tambahan Rajah 6c).Corak pemilihan umum menunjukkan bahawa kebanyakan motif yang dikaji telah diperkayakan dalam semua pusingan sebelumnya bagi kedua-dua cabang pemilihan.Walau bagaimanapun, beberapa motif (cth SGL, VSG, LGS GSV) kebanyakannya daripada klad alternatif A, manakala yang lain (cth FGW, RTN, WGF, NTR) diperkayakan dalam klad alternatif B.
Pengesahan pengangkutan CSF bagi peptida yang diperkaya dengan fag yang diperkaya CSF dan peptida pemimpin biotinilasi yang dikonjugasikan kepada muatan streptavidin.
(a) Nisbah pengayaan dikira dalam keempat-empat pusingan (R1-R4) berdasarkan titer phage (PFU) yang disuntik dan titer phage CSF yang ditentukan (output = O).Faktor pengayaan untuk tiga pusingan terakhir (R2-R4) dikira dengan perbandingan dengan pusingan sebelumnya dan pusingan pertama (R1) dengan data berat.Bar terbuka ialah cecair serebrospinal, bar berlorek adalah plasma.(***p<0.001, berdasarkan ujian-t Pelajar).(b) Senarai peptida phage yang paling banyak, disusun mengikut perkadaran relatifnya kepada semua phage yang dikumpul dalam CSF selepas pusingan 4 pemilihan.Enam klon faj yang paling biasa diserlahkan dalam warna, bernombor dan faktor pengayaannya antara pusingan 3 dan 4 pemilihan (inset).( c, d ) Enam klon phage yang paling diperkaya, perpustakaan phage kosong dan phage ibu bapa dari pusingan 4 dianalisis secara individu dalam model pensampelan CSF.CSF dan sampel darah dikumpulkan pada titik masa yang ditunjukkan.(c) Jumlah yang sama bagi 6 klon faj calon (2 x 1010 faj/haiwan), faj kosong (#1779) (2 x 1010 faj/haiwan) dan pustaka peptida faj stok (2 x 1012 faj/haiwan) Suntikan sekurang-kurangnya 3 CM melalui tin yang ditadbirkan kepada haiwan ekor yang berasinganFarmakokinetik CSF setiap klon phage yang disuntik dan perpustakaan peptida phage dari semasa ke semasa ditunjukkan.(d) menunjukkan purata nisbah CSF/darah untuk semua phages/mL pulih sepanjang masa pensampelan.(e) Empat peptida peneraju sintetik dan satu kawalan hancur dikaitkan dengan biotin kepada streptavidin melalui N-terminus mereka (paparan tetramer) diikuti dengan suntikan (urat ekor iv, 10 mg streptavidin/kg).Sekurang-kurangnya tiga tikus diintubasi (N = 3).).Sampel CSF dikumpul pada titik masa yang ditunjukkan dan kepekatan streptavidin diukur oleh CSF anti-streptavidin ELISA (nd = tidak dikesan).(*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, berdasarkan ujian ANOVA).(f) Perbandingan jujukan asid amino bagi klon peptida fag yang paling diperkayakan #2002 (ungu) dengan klon peptida fag terpilih lain daripada pemilihan pusingan ke-4.Serpihan asid amino yang serupa dan serupa adalah berkod warna.
Daripada semua fag yang diperkaya dalam pusingan keempat (Rajah 3b), enam klon calon telah dipilih untuk analisis individu selanjutnya dalam model pensampelan CSF.Jumlah yang sama enam calon phage, phage kosong (tiada sisipan) dan perpustakaan peptida prophage telah disuntik ke dalam tiga haiwan CM berkanulasi, dan farmakokinetik ditentukan dalam ujian CSF (Rajah 3c) dan darah (Tambahan Rajah 7).Semua klon phage yang diuji menyasarkan petak CSF pada tahap 10-1000 kali lebih tinggi daripada phage kawalan kosong (#1779).Contohnya, klon #2020 dan #2077 mempunyai titer CSF kira-kira 1000 kali lebih tinggi daripada faj kawalan.Profil farmakokinetik setiap peptida yang dipilih adalah berbeza, tetapi kesemuanya mempunyai keupayaan homing CSF yang tinggi.Kami melihat penurunan berterusan dari masa ke masa untuk klon #1903 dan #2011, manakala untuk klon #2077, #2002 dan #2009 peningkatan dalam tempoh 10 minit pertama mungkin menunjukkan pengangkutan aktif tetapi perlu disahkan.Klon #2020, #2002, dan #2077 stabil pada tahap tinggi, manakala kepekatan CSF klon #2009 perlahan-lahan menurun selepas peningkatan awal.Kami kemudian membandingkan kekerapan relatif setiap calon CSF dengan kepekatan darahnya (Rajah 3d).Korelasi titer min setiap calon CSF dengan titer darahnya pada setiap masa pensampelan menunjukkan bahawa tiga daripada enam calon diperkaya dengan ketara dalam CSF darah.Menariknya, klon #2077 menunjukkan kestabilan darah yang lebih tinggi (Tambahan Rajah 7).Untuk mengesahkan bahawa peptida itu sendiri mampu mengangkut kargo secara aktif selain daripada zarah phage ke dalam petak CSF, kami mensintesis empat peptida pemimpin yang diterbitkan dengan biotin di terminal N di mana peptida melekat pada zarah phage.Peptida biotinilasi (nos. 2002, 2009, 2020 dan 2077) telah dikonjugasikan dengan streptavidin (SA) untuk mendapatkan bentuk multimerik yang agak meniru geometri phage.Format ini juga membolehkan kami mengukur pendedahan SA dalam darah dan cecair serebrospinal sebagai peptida protein pengangkut kargo.Yang penting, data phage selalunya boleh dihasilkan semula apabila peptida sintetik diberikan dalam format konjugasi SA ini (Rajah 3e).Peptida hancur mempunyai pendedahan awal yang kurang dan pelepasan CSF yang lebih cepat dengan tahap tidak dapat dikesan dalam masa 48 jam.Untuk mendapatkan gambaran tentang laluan penghantaran klon phage peptide ini ke dalam ruang CSF, kami menganalisis penyetempatan hits peptide phage individu menggunakan imunohistokimia (IHC) untuk mengesan secara langsung zarah phage 1 jam selepas suntikan intravena dalam vivo.Terutama, klon #2002, #2077, dan #2009 boleh dikesan oleh pewarnaan kuat dalam kapilari otak, manakala faj kawalan (#1779) dan klon #2020 tidak dikesan (Tambahan Rajah 8).Ini menunjukkan bahawa peptida ini menyumbang kepada kesan pada otak dengan tepat dengan melintasi BBB.Analisis terperinci lanjut diperlukan untuk menguji hipotesis ini, kerana laluan BSCFB juga mungkin terlibat.Apabila membandingkan jujukan asid amino bagi klon yang paling diperkaya (#2002) dengan peptida terpilih lain, diperhatikan bahawa sesetengah daripada mereka mempunyai sambungan asid amino yang serupa, yang mungkin menunjukkan mekanisme pengangkutan yang serupa (Rajah 3f).
Oleh kerana profil plasmanya yang unik dan peningkatan ketara dalam CSF dari semasa ke semasa, klon paparan phage #2077 telah diterokai lebih lanjut dalam tempoh 48 jam yang lebih lama dan dapat menghasilkan semula peningkatan pesat dalam CSF yang diperhatikan dalam hubungan dengan tahap SA yang berterusan (Rajah 4a).Mengenai klon fag lain yang dikenal pasti, #2077 diwarnakan dengan kuat untuk kapilari otak dan menunjukkan kolokalisasi yang ketara dengan lektin penanda kapilari apabila dilihat pada resolusi yang lebih tinggi dan mungkin beberapa pewarnaan dalam ruang parenkim (Rajah 4b).Untuk menyiasat sama ada kesan farmakologi pengantara peptida boleh diperolehi dalam CNS, kami melakukan eksperimen di mana versi biotinilasi i) peptida transit #2077 dan ii) peptida perencat BACE1 dicampur dengan SA pada dua nisbah berbeza.Untuk satu kombinasi kami hanya menggunakan perencat peptida BACE1 dan untuk yang lain kami menggunakan nisbah 1:3 perencat peptida BACE1 kepada peptida #2077.Kedua-dua sampel telah diberikan secara intravena dan paras darah dan cecair serebrospinal beta-amyloid peptide 40 (Abeta40) diukur dari semasa ke semasa.Abeta40 diukur dalam CSF kerana ia mencerminkan perencatan BACE1 dalam parenchyma otak.Seperti yang dijangkakan, kedua-dua kompleks mengurangkan tahap darah Abeta40 dengan ketara (Rajah 4c, d).Walau bagaimanapun, hanya sampel yang mengandungi campuran peptida no.2077 dan perencat peptida BACE1 yang terkonjugasi kepada SA menyebabkan penurunan ketara dalam Abeta40 dalam cecair serebrospinal (Rajah 4c).Data menunjukkan bahawa peptida no.2077 mampu mengangkut protein 60 kDa SA ke dalam CNS dan juga mendorong kesan farmakologi dengan perencat SA-konjugasi peptida BACE1.
(a) Suntikan klon (2 × 10 phages/haiwan) T7 phage yang menunjukkan profil farmakokinetik jangka panjang peptida CSF #2077 (RLSSVDSSDLSGC) dan kawalan tidak disuntik (#1779) dalam sekurang-kurangnya tiga tikus diintubasi CM.(b) Imej mikroskopik konfokal bagi mikrovessel kortikal perwakilan dalam tikus yang disuntik phage (2 × 10 10 phages/haiwan) menunjukkan pewarnaan balas peptida #2077 dan vesel (lektin).Klon fag ini diberikan kepada 3 ekor tikus dan dibenarkan beredar selama 1 jam sebelum perfusi.Otak telah dipotong dan diwarnai dengan antibodi berlabel FITC poliklonal terhadap kapsid fag T7.Sepuluh minit sebelum perfusi dan penetapan seterusnya, lektin berlabel DyLight594 ditadbir secara intravena.Imej pendarfluor yang menunjukkan pewarnaan lektin (merah) bahagian luminal saluran mikro dan fag (hijau) dalam lumen kapilari dan tisu otak perivaskular.Bar skala sepadan dengan 10 µm.(c, d) Peptida perencatan BACE1 berbiotinilasi sahaja atau digabungkan dengan peptida transit terbiotinilasi #2077 digabungkan dengan streptavidin diikuti dengan suntikan intravena sekurang-kurangnya tiga tikus CM berkanulasi (10 mg streptavidin/kg).Pengurangan perencat peptida BACE1 dalam Aβ40 diukur oleh Aβ1-40 ELISA dalam darah (merah) dan cecair serebrospinal (oren) pada titik masa yang ditunjukkan.Untuk kejelasan yang lebih baik, garis putus-putus dilukis pada graf pada skala 100%.(c) Peratusan pengurangan dalam Aβ40 dalam darah (segitiga merah) dan cecair serebrospinal (segitiga oren) pada tikus yang dirawat dengan streptavidin terkonjugasi kepada peptida transit #2077 dan peptida perencatan BACE1 dalam nisbah 3:1.(d) Peratusan pengurangan dalam darah Aβ40 (bulatan merah) dan cecair serebrospinal (bulatan oren) tikus yang dirawat dengan streptavidin ditambah dengan peptida perencatan BACE1 sahaja.Kepekatan Aβ dalam kawalan ialah 420 pg/ml (sisihan piawai = 101 pg/ml).
Paparan Phage telah berjaya digunakan dalam beberapa bidang penyelidikan bioperubatan17.Kaedah ini telah digunakan untuk kajian kepelbagaian vaskular in vivo18,19 serta kajian yang mensasarkan saluran otak20,21,22,23,24,25,26.Dalam kajian ini, kami memperluaskan penggunaan kaedah pemilihan ini bukan sahaja kepada pengenalpastian langsung peptida yang menyasarkan saluran serebrum, tetapi juga kepada penemuan calon dengan sifat pengangkutan aktif untuk menyeberangi penghalang darah-otak.Kami kini menerangkan pembangunan prosedur pemilihan in vivo dalam tikus diintubasi CM dan menunjukkan potensinya untuk mengenal pasti peptida dengan sifat homing CSF.Menggunakan phage T7 yang memaparkan perpustakaan peptida rawak 12-mer, kami dapat menunjukkan bahawa phage T7 cukup kecil (diameter kira-kira 60 nm)10 untuk disesuaikan dengan penghalang darah-otak, dengan itu secara langsung melintasi penghalang darah-otak atau plexus choroid.Kami memerhatikan bahawa penuaian CSF daripada tikus CM berkanulasi adalah kaedah pemeriksaan fungsi in vivo yang dikawal dengan baik, dan fag yang diekstrak bukan sahaja terikat pada vaskular tetapi juga berfungsi sebagai pengangkut merentasi penghalang darah-otak.Tambahan pula, dengan mengumpul darah secara serentak dan menggunakan HTS pada CSF dan phages yang berasal dari darah, kami mengesahkan bahawa pilihan CSF kami tidak dipengaruhi oleh pengayaan darah atau kesesuaian untuk pengembangan antara pusingan pemilihan.Walau bagaimanapun, petak darah adalah sebahagian daripada prosedur pemilihan, kerana fag yang mampu mencapai petak CSF mesti bertahan dan beredar dalam aliran darah cukup lama untuk memperkayakan diri mereka di dalam otak.Untuk mengekstrak maklumat jujukan yang boleh dipercayai daripada data HTS mentah, kami melaksanakan penapis yang disesuaikan dengan ralat penjujukan khusus platform dalam aliran kerja analisis.Dengan memasukkan parameter kinetik ke dalam kaedah pemeriksaan, kami mengesahkan farmakokinetik pantas jenis T7 phages (t½ ~ 28 min) dalam darah24, 27, 28 dan juga menentukan separuh hayat mereka dalam cecair serebrospinal (t½ ~ 26 min) seminit).Walaupun profil farmakokinetik yang sama dalam darah dan CSF, hanya 0.001% daripada kepekatan darah phage dapat dikesan dalam CSF, menunjukkan mobiliti latar belakang rendah fag T7 jenis liar merentasi penghalang darah-otak.Kerja ini menyerlahkan kepentingan pemilihan pusingan pertama apabila menggunakan strategi panning in vivo, terutamanya untuk sistem phage yang cepat dibersihkan daripada peredaran, kerana beberapa klon dapat mencapai petak CNS.Oleh itu, pada pusingan pertama, pengurangan dalam kepelbagaian perpustakaan adalah sangat besar, kerana hanya bilangan klon yang terhad akhirnya dikumpulkan dalam model CSF yang sangat ketat ini.Strategi panning in vivo ini termasuk beberapa langkah pemilihan seperti pengumpulan aktif dalam petak CSF, kelangsungan hidup klon dalam petak darah, dan penyingkiran pantas klon fag T7 daripada darah dalam masa 10 minit pertama (Rajah 1d dan Rajah Tambahan 4M).).Oleh itu, selepas pusingan pertama, klon fag yang berbeza telah dikenal pasti dalam CSF, walaupun kolam awal yang sama digunakan untuk haiwan individu.Ini menunjukkan bahawa beberapa langkah pemilihan yang ketat untuk perpustakaan sumber dengan bilangan ahli perpustakaan yang ramai menghasilkan pengurangan yang ketara dalam kepelbagaian.Oleh itu, peristiwa rawak akan menjadi sebahagian daripada proses pemilihan awal, yang sangat mempengaruhi keputusan.Berkemungkinan banyak klon dalam perpustakaan asal mempunyai kecenderungan pengayaan CSF yang hampir sama.Walau bagaimanapun, walaupun dalam keadaan percubaan yang sama, keputusan pemilihan mungkin berbeza disebabkan oleh bilangan kecil setiap klon tertentu dalam kumpulan awal.
Motif yang diperkaya dalam CSF berbeza daripada motif dalam darah.Menariknya, kami mencatat peralihan pertama ke arah peptida kaya glisin dalam darah haiwan individu.(Rajah 1g, Rajah Tambahan 4e, 4f).Faj yang mengandungi peptida glisin mungkin lebih stabil dan kurang berkemungkinan untuk dikeluarkan daripada peredaran.Walau bagaimanapun, peptida yang kaya dengan glisin ini tidak dikesan dalam sampel cecair serebrospinal, menunjukkan bahawa perpustakaan yang dipilih telah melalui dua langkah pemilihan yang berbeza: satu dalam darah dan satu lagi dibenarkan untuk terkumpul dalam cecair serebrospinal.Klon diperkaya CSF hasil daripada pusingan keempat pemilihan telah diuji secara meluas.Hampir semua klon yang diuji secara individu telah disahkan diperkaya dalam CSF berbanding dengan faj kawalan kosong.Satu hit peptida (#2077) telah diperiksa dengan lebih terperinci.Ia menunjukkan separuh hayat plasma yang lebih lama berbanding hits lain (Rajah 3d dan Rajah Tambahan 7), dan menariknya, peptida ini mengandungi sisa sistein di terminal-C.Baru-baru ini telah ditunjukkan bahawa penambahan sistein kepada peptida boleh meningkatkan sifat farmakokinetiknya dengan mengikat albumin 29 .Ini pada masa ini tidak diketahui untuk peptida #2077 dan memerlukan kajian lanjut.Sesetengah peptida menunjukkan kebergantungan valens dalam pengayaan CSF (data tidak ditunjukkan), yang mungkin berkaitan dengan geometri permukaan yang dipaparkan bagi kapsid T7.Sistem T7 yang kami gunakan menunjukkan 5-15 salinan setiap peptida setiap zarah faj.IHC dilakukan pada klon faj plumbum calon yang disuntik secara intravena ke dalam korteks serebrum tikus (Tambahan Rajah 8).Data menunjukkan bahawa sekurang-kurangnya tiga klon (No. 2002, No. 2009 dan No. 2077) berinteraksi dengan BBB.Ia masih perlu ditentukan sama ada interaksi BBB ini mengakibatkan pengumpulan CSF atau pergerakan klon ini terus ke BCSFB.Yang penting, kami menunjukkan bahawa peptida terpilih mengekalkan kapasiti pengangkutan CSF mereka apabila disintesis dan terikat pada kargo protein.Pengikatan peptida terbiotinilasi N-terminal kepada SA pada dasarnya mengulangi keputusan yang diperoleh dengan klon fag masing-masing dalam darah dan cecair serebrospinal (Rajah 3e).Akhir sekali, kami menunjukkan bahawa peptida plumbum #2077 mampu menggalakkan tindakan otak perencat peptida biotinilasi BACE1 yang terkonjugasi kepada SA, menyebabkan kesan farmakodinamik yang ketara dalam CNS dengan mengurangkan tahap Abeta40 dengan ketara dalam CSF (Rajah 4).Kami tidak dapat mengenal pasti sebarang homolog dalam pangkalan data dengan melakukan carian homologi jujukan peptida bagi semua hits.Adalah penting untuk ambil perhatian bahawa saiz perpustakaan T7 adalah lebih kurang 109, manakala saiz perpustakaan teori untuk 12-mers ialah 4 x 1015. Oleh itu, kami hanya memilih sebahagian kecil daripada ruang kepelbagaian perpustakaan peptida 12-mer, yang mungkin bermakna bahawa peptida yang lebih dioptimumkan boleh dikenal pasti dengan menilai ruang jujukan yang dikenal pasti ini.Secara hipotesis, salah satu sebab mengapa kami tidak menemui sebarang homolog semula jadi bagi peptida ini mungkin adalah nyahpilihan semasa evolusi untuk menghalang kemasukan tidak terkawal motif peptida tertentu ke dalam otak.
Secara keseluruhan, keputusan kami menyediakan asas untuk kerja masa depan untuk mengenal pasti dan mencirikan sistem pengangkutan halangan serebrovaskular dalam vivo dengan lebih terperinci.Persediaan asas kaedah ini adalah berdasarkan strategi pemilihan berfungsi yang bukan sahaja mengenal pasti klon dengan sifat mengikat vaskular serebrum, tetapi juga termasuk langkah kritikal di mana klon yang berjaya mempunyai aktiviti intrinsik untuk menyeberangi halangan biologi dalam vivo ke dalam petak CNS.adalah untuk menjelaskan mekanisme pengangkutan peptida ini dan keutamaan mereka untuk mengikat kepada mikrovaskulatur khusus ke kawasan otak.Ini boleh membawa kepada penemuan laluan baharu untuk pengangkutan BBB dan reseptor.Kami menjangkakan bahawa peptida yang dikenal pasti boleh secara langsung mengikat kepada reseptor serebrovaskular atau kepada ligan yang beredar yang diangkut melalui BBB atau BCSFB.Vektor peptida dengan aktiviti pengangkutan CSF yang ditemui dalam kerja ini akan disiasat lebih lanjut.Kami sedang menyiasat kekhususan otak peptida ini untuk keupayaan mereka untuk menyeberangi BBB dan/atau BCSFB.Peptida baharu ini akan menjadi alat yang sangat berharga untuk potensi penemuan reseptor atau laluan baharu dan untuk pembangunan platform baharu yang sangat cekap untuk penghantaran makromolekul, seperti biologi, ke otak.
Cannulate tangki besar (CM) menggunakan pengubahsuaian kaedah yang diterangkan sebelum ini.Tikus Wistar yang telah dibius (200-350 g) telah dipasang pada radas stereotaksik dan hirisan median dibuat di atas kulit kepala yang dicukur dan disediakan secara aseptik untuk mendedahkan tengkorak.Gerakkan dua lubang di kawasan selempang atas dan kencangkan skru penetapan di dalam lubang.Satu lubang tambahan telah digerudi di puncak oksipital sisi untuk panduan stereotaktik kanula keluli tahan karat ke dalam CM.Sapukan simen gigi di sekeliling kanula dan kencangkan dengan skru.Selepas pengawetan foto dan pengerasan simen, luka kulit ditutup dengan jahitan supramid 4/0.Peletakan kanula yang betul disahkan oleh kebocoran spontan cecair serebrospinal (CSF).Keluarkan tikus dari radas stereotaxic, terima penjagaan selepas pembedahan dan pengurusan kesakitan yang sesuai, dan biarkan ia pulih sekurang-kurangnya satu minggu sehingga tanda-tanda darah diperhatikan dalam cecair serebrospinal.Tikus Wistar (Crl:WI/Han) diperolehi dari Sungai Charles (Perancis).Semua tikus dipelihara di bawah keadaan bebas patogen tertentu.Semua eksperimen haiwan telah diluluskan oleh Pejabat Veterinar Kota Basel, Switzerland, dan telah dilakukan mengikut Lesen Haiwan No. 2474 (Penilaian Pengangkutan Otak Aktif dengan Mengukur Tahap Calon Terapeutik dalam Cecair Cerebrospinal dan Otak Tikus).
Perlahan-lahan pastikan tikus sedar dengan kanula CM di tangan.Keluarkan Datura dari kanula dan kumpulkan 10 µl cecair serebrospinal yang mengalir secara spontan.Oleh kerana patensi kanula akhirnya terjejas, hanya sampel cecair serebrospinal yang jelas tanpa bukti pencemaran darah atau perubahan warna dimasukkan dalam kajian ini.Secara selari, kira-kira 10-20 μl darah diambil dari hirisan kecil di hujung ekor ke dalam tiub dengan heparin (Sigma-Aldrich).CSF dan darah dikumpulkan pada pelbagai titik masa selepas suntikan intravena T7 phage.Kira-kira 5-10 μl cecair dibuang sebelum setiap sampel CSF dikumpulkan, yang sepadan dengan isipadu mati kateter.
Perpustakaan dijana menggunakan vektor T7Select 10-3b seperti yang diterangkan dalam manual sistem T7Select (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996).Secara ringkas, sisipan DNA 12-mer rawak telah disintesis dalam format berikut:
Kodon NNK digunakan untuk mengelakkan kodon hentian berkembar dan lebihan asid amino dalam sisipan.N ialah nisbah ekuimolar bercampur secara manual bagi setiap nukleotida, dan K ialah nisbah ekuimolar bercampur manual bagi nukleotida adenin dan sitosin.Kawasan terkandas tunggal telah ditukar kepada DNA terkandas berganda dengan pengeraman selanjutnya dengan dNTP (Novagen) dan enzim Klenow (New England Biolabs) dalam penampan Klenow (New England Biolabs) selama 3 jam pada suhu 37°C.Selepas tindak balas, DNA beruntai dua telah dipulihkan oleh pemendakan EtOH.DNA yang terhasil telah dicerna dengan enzim sekatan EcoRI dan HindIII (kedua-duanya dari Roche).Sisipan yang dibelah dan dimurnikan (QIAquick, Qiagen) (ligase T4, New England Biolabs) kemudiannya diikat dalam bingkai menjadi vektor T7 pra-dibelah selepas asid amino 348 daripada gen kapsid 10B.Tindak balas ligasi diinkubasi pada 16° C. selama 18 jam sebelum pembungkusan in vitro.Pembungkusan Phage secara in vitro dilakukan mengikut arahan yang dibekalkan dengan kit pengklonan T7Select 10-3b (Novagen) dan penyelesaian pembungkusan telah dikuatkan sekali untuk lisis menggunakan Escherichia coli (BLT5615, Novagen).Lisat telah disentrifugasi, dititrasi dan dibekukan pada -80° C. sebagai larutan stok gliserol.
Penguatan langsung PCR bagi kawasan pembolehubah fag yang dikuatkan dalam sup atau plat menggunakan primer gabungan 454/Roche-amplicon proprietari.Primer gabungan ke hadapan mengandungi jujukan mengapit rantau pembolehubah (NNK) 12 (khusus templat), GS FLX Titanium Adapter A, dan urutan kunci perpustakaan empat asas (TCAG) (Tambahan Rajah 1a):
Primer gabungan terbalik juga mengandungi biotin yang dilekatkan untuk menangkap manik dan GS FLX Titanium Adapter B yang diperlukan untuk penguatan klon semasa PCR emulsi:
Amplikon kemudiannya tertakluk kepada 454/Roche pyrosequencing mengikut protokol 454 GS-FLX Titanium.Untuk penjujukan Sanger manual (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA Analyzer), DNA phage T7 telah dikuatkan oleh PCR dan disusun dengan pasangan primer berikut:
Sisipan daripada plak individu tertakluk kepada penguatan PCR menggunakan Kit Polimerase DNA Mula Pantas Roche (mengikut arahan pengilang).Lakukan permulaan panas (10 minit pada 95 °C) dan 35 kitaran rangsangan (50 saat pada 95 °C, 1 minit pada 50 °C dan 1 minit pada 72 °C).
Faj dari perpustakaan, faj jenis liar, faj yang diselamatkan daripada CSF dan darah, atau klon individu telah dikuatkan dalam Escherichia coli BL5615 dalam sup TB (Sigma Aldrich) atau dalam hidangan 500 cm2 (Thermo Scientific) selama 4 jam pada 37 ° C.Phage diekstrak daripada plat dengan membilas plat dengan penimbal Tris-EDTA (Analitik Fluka) atau dengan mengumpul plak dengan hujung pipet steril.Faj telah diasingkan daripada supernatan kultur atau penimbal pengekstrakan dengan satu pusingan pemendakan polietilena glikol (PEG 8000) (Promega) dan digantung semula dalam penimbal Tris-EDTA.
Fag yang dikuatkan telah dikenakan 2-3 pusingan penyingkiran endotoksin menggunakan manik penyingkiran endotoksin (Miltenyi Biotec) sebelum suntikan intravena (IV) (500 μl/haiwan).Pada pusingan pertama, 2×1012 phages telah diperkenalkan;dalam kedua, 2×1010 phages;dalam pusingan pemilihan ketiga dan keempat, 2×109 phages setiap haiwan.Kandungan faj dalam CSF dan sampel darah yang dikumpul pada titik masa yang dinyatakan ditentukan oleh pengiraan plak mengikut arahan pengilang (manual sistem T7Select).Pemilihan faj dilakukan dengan suntikan intravena perpustakaan yang telah disucikan ke dalam urat ekor atau dengan suntikan semula fag yang diekstrak daripada CSF dari pusingan pemilihan sebelumnya, dan penuaian berikutnya dilakukan pada 10 minit, 30 minit, 60 minit, 90 minit, 120 minit, 180 minit, dan sampel darah 240 minit masing-masing.Sebanyak empat pusingan in vivo panning telah dijalankan di mana kedua-dua cawangan terpilih disimpan dan dianalisis secara berasingan semasa tiga pusingan pertama pemilihan.Semua sisipan phage yang diekstrak daripada CSF daripada dua pusingan pertama pemilihan tertakluk kepada 454/Roche pyrosequencing, manakala semua klon yang diekstrak daripada CSF daripada dua pusingan terakhir pemilihan telah disusun secara manual.Semua fag darah dari pusingan pertama pemilihan juga tertakluk kepada 454/Roche pyrosequencing.Untuk suntikan klon fag, fag terpilih telah dikuatkan dalam E. coli (BL5615) pada plat 500 cm2 pada suhu 37°C selama 4 jam.Klon yang dipilih secara individu dan dijujukan secara manual telah dibiakkan dalam medium TB.Selepas pengekstrakan phage, penulenan dan penyingkiran endotoksin (seperti yang diterangkan di atas), 2×1010 phages/haiwan dalam 300 μl disuntik secara intravena ke dalam satu urat ekor.
Prapemprosesan dan penapisan kualitatif data jujukan.Data mentah 454/Roche telah ditukar daripada format peta aliran standard binari (sff) kepada format boleh dibaca manusia (fasta) Pearson menggunakan perisian vendor.Pemprosesan lanjut jujukan nukleotida telah dilakukan menggunakan program dan skrip C proprietari (pakej perisian yang belum dikeluarkan) seperti yang diterangkan di bawah.Analisis data primer termasuk prosedur penapisan berbilang peringkat yang ketat.Untuk menapis keluar bacaan yang tidak mengandungi jujukan DNA sisipan 12mer yang sah, bacaan itu diselaraskan secara berurutan untuk label mula (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), label henti (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) dan sisipan latar belakang (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC) menggunakan ujian Needleman-Wunsch global.penjajaran membenarkan sehingga 2 ketidakkonsistenan setiap penjajaran31.Oleh itu, bacaan tanpa teg mula dan henti serta bacaan yang mengandungi sisipan latar belakang, iaitu, penjajaran yang melebihi bilangan ketidakpadanan yang dibenarkan, telah dialih keluar daripada pustaka.Bagi bacaan selebihnya, urutan DNA N-mer yang menjangkau dari tanda mula dan berakhir sebelum tanda henti dikeluarkan daripada urutan bacaan asal dan diproses selanjutnya (selepas ini dirujuk sebagai "sisipan").Selepas terjemahan sisipan, bahagian selepas kodon hentian pertama pada hujung 5′ primer dikeluarkan daripada sisipan.Di samping itu, nukleotida yang membawa kepada kodon tidak lengkap pada hujung 3' primer juga telah dikeluarkan.Untuk mengecualikan sisipan yang mengandungi jujukan latar belakang sahaja, sisipan yang diterjemahkan bermula dengan corak asid amino "PAG" juga telah dialih keluar.Peptida dengan panjang pasca terjemahan kurang daripada 3 asid amino telah dikeluarkan daripada perpustakaan.Akhir sekali, keluarkan lebihan dalam kumpulan sisipan dan tentukan kekerapan setiap sisipan unik.Keputusan analisis ini termasuk senarai jujukan nukleotida (sisipan) dan frekuensi (baca) mereka (Rajah Tambahan 1c dan 2).
Kumpulan sisipan DNA N-mer mengikut persamaan jujukan: Untuk menghapuskan ralat jujukan khusus 454/Roche (seperti masalah penjujukan sambungan homopolimer) dan mengalih keluar redundansi yang kurang penting, sisipan jujukan DNA N-mer yang ditapis sebelum ini (sisipan) diisih mengikut persamaan.sisipan (sehingga 2 asas tidak sepadan dibenarkan) menggunakan algoritma lelaran yang ditakrifkan seperti berikut: sisipan diisih dahulu mengikut kekerapannya (tertinggi ke terendah), dan jika ia adalah sama, mengikut isihan kedua mengikut panjang (paling lama hingga terpendek) ).Oleh itu, sisipan yang paling kerap dan paling lama menentukan "kumpulan" pertama.Kekerapan kumpulan ditetapkan kepada kekerapan kekunci.Kemudian, setiap sisipan yang tinggal dalam senarai diisih telah cuba ditambahkan pada kumpulan dengan penjajaran Needleman-Wunsch berpasangan.Jika bilangan ketidakpadanan, sisipan atau pemadaman dalam penjajaran tidak melebihi ambang 2, sisipan ditambahkan pada kumpulan dan kekerapan kumpulan keseluruhan ditingkatkan mengikut kekerapan sisipan ditambahkan.Sisipan yang ditambahkan pada kumpulan ditandakan sebagai digunakan dan dikecualikan daripada pemprosesan selanjutnya.Jika urutan sisipan tidak boleh ditambah pada kumpulan yang sedia ada, urutan sisipan digunakan untuk mencipta kumpulan baharu dengan kekerapan sisipan yang sesuai dan ditandakan sebagai digunakan.Lelaran tamat apabila setiap urutan sisipan sama ada telah digunakan untuk membentuk kumpulan baharu atau boleh dimasukkan ke dalam kumpulan yang sedia ada.Lagipun, sisipan berkumpulan yang terdiri daripada nukleotida akhirnya diterjemahkan ke dalam urutan peptida (perpustakaan peptida).Hasil analisis ini ialah satu set sisipan dan frekuensi sepadannya yang membentuk bilangan bacaan berturut-turut (Tambahan Rajah 2).
Penjanaan Motif: Berdasarkan senarai peptida unik, perpustakaan telah dicipta yang mengandungi semua kemungkinan corak asid amino (aa) seperti yang ditunjukkan di bawah.Setiap corak panjang 3 yang mungkin diekstrak daripada peptida dan corak songsangnya telah ditambah bersama-sama dengan perpustakaan motif biasa yang mengandungi semua corak (tripeptida).Perpustakaan dengan motif yang sangat berulang telah disusun dan redundansi dialih keluar.Kemudian, untuk setiap tripeptida dalam perpustakaan motif, kami menyemak kehadirannya di perpustakaan menggunakan alat pengiraan.Dalam kes ini, kekerapan peptida yang mengandungi tripeptida motif yang ditemui ditambah dan diberikan kepada motif dalam perpustakaan motif ("bilangan motif").Hasil penjanaan motif ialah tatasusunan dua dimensi yang mengandungi semua kejadian tripeptida (motif) dan nilai masing-masing, iaitu bilangan bacaan jujukan yang menghasilkan motif yang sepadan apabila bacaan ditapis, dikumpulkan dan diterjemahkan.Metrik seperti yang diterangkan secara terperinci di atas.
Normalisasi bilangan motif dan taburan yang sepadan: Bilangan motif untuk setiap sampel telah dinormalisasi menggunakan
di mana ni ialah bilangan bacaan yang mengandungi topik i.Oleh itu, vi mewakili kekerapan peratusan bacaan (atau peptida) yang mengandungi motif i dalam sampel.Nilai-P untuk bilangan motif yang tidak dinormalisasi dikira menggunakan ujian tepat Fisher.Mengenai korelogram bilangan motif, korelasi Spearman dikira menggunakan bilangan motif yang dinormalkan dengan R.
Untuk menggambarkan kandungan asid amino pada setiap kedudukan dalam perpustakaan peptida, logogram web 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com) telah dicipta.Pertama, kandungan asid amino pada setiap kedudukan peptida 12-mer disimpan dalam matriks 20×12.Kemudian, satu set 1000 peptida yang mengandungi kandungan asid amino relatif yang sama pada setiap kedudukan dijana dalam format urutan cepat dan disediakan sebagai input kepada logo web 3, yang menjana perwakilan grafik kandungan asid amino relatif pada setiap kedudukan.untuk perpustakaan peptida tertentu.Untuk menggambarkan set data berbilang dimensi, peta haba dicipta menggunakan alat yang dibangunkan secara dalaman dalam R (biosHeatmap, pakej R yang belum dikeluarkan).Dendrogram yang dibentangkan dalam peta haba dikira menggunakan kaedah pengelompokan hierarki Ward dengan metrik jarak Euclidean.Untuk analisis statistik data pemarkahan motif, nilai P untuk pemarkahan tidak normal dikira menggunakan ujian tepat Fisher.Nilai-P untuk set data lain dikira dalam R menggunakan ujian-t Pelajar atau ANOVA.
Klon faj dan faj terpilih tanpa sisipan disuntik secara intravena melalui urat ekor (2×1010 phages/haiwan dalam 300 μl PBS).Sepuluh minit sebelum perfusi dan penetapan seterusnya, haiwan yang sama disuntik secara intravena dengan 100 μl lektin berlabel DyLight594 (Vector Laboratories Inc., DL-1177).60 minit selepas suntikan phage, tikus telah diserap melalui jantung dengan 50 ml PBS diikuti oleh 50 ml 4% PFA/PBS.Sampel otak juga telah ditetapkan semalaman dalam 4% PFA/PBS dan direndam dalam 30% sukrosa semalaman pada suhu 4°C.Sampel dibekukan kilat dalam campuran OCT.Analisis imunohistokimia sampel beku dilakukan pada suhu bilik pada 30 µm cryosections yang disekat dengan 1% BSA dan diinkubasi dengan antibodi berlabel FITC poliklonal terhadap T7 phage (Novus NB 600-376A) pada 4 °C.Inkubasi semalaman.Akhirnya, bahagian itu dibasuh 3 kali dengan PBS dan diperiksa dengan mikroskop laser confocal (Leica TCS SP5).
Semua peptida dengan ketulenan minimum 98% telah disintesis oleh GenScript USA, dibiotinilasi dan diliofilkan.Biotin terikat melalui pengatur jarak glisin tiga kali ganda pada terminal-N.Semak semua peptida menggunakan spektrometri jisim.
Streptavidin (Sigma S0677) dicampur dengan lebihan ekuimolar 5 kali ganda peptida terbiotinilasi, peptida perencatan BACE1 terbiotinilasi, atau gabungan (nisbah 3:1) peptida perencatan BACE1 terbiotinilasi dan peptida perencatan BACE1 dalam 5–10% DMSO/dieram dalam PBSO.1 jam pada suhu bilik sebelum suntikan.Peptida konjugasi Streptavidin disuntik secara intravena pada dos 10 mg/kg ke dalam salah satu urat ekor tikus dengan rongga serebrum.
Kepekatan kompleks streptavidin-peptida dinilai oleh ELISA.Plat mikrotiter Nunc Maxisorp (Sigma) disalut semalaman pada suhu 4°C dengan antibodi anti-streptavidin tikus 1.5 μg/ml (Thermo, MA1-20011).Selepas menyekat (menyekat penimbal: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0.05% NP40, 0.25% gelatin, 1% BSA) pada suhu bilik selama 2 jam, basuh pinggan dengan 0.05% Tween-20/PBS (penimbal basuh) selama 3 Saat, CSF dan sampel plasma0 terbeza10 ditambah dengan 10 buffering plasma, CSF dan sampel plasma0 terbeza: CSF 1:115).Plat kemudian diinkubasi semalaman pada suhu 4 ° C dengan antibodi pengesanan (1 μg / ml, anti-streptavidin-HRP, Novus NB120-7239).Selepas tiga langkah mencuci, streptavidin dikesan dengan pengeraman dalam larutan substrat TMB (Roche) sehingga 20 minit.Selepas menghentikan pembangunan warna dengan 1M H2SO4, ukur penyerapan pada 450 nm.
Fungsi kompleks perencat streptavidin-peptide-BACE1 dinilai oleh Aβ(1-40) ELISA mengikut protokol pengilang (Wako, 294-64701).Secara ringkas, sampel CSF telah dicairkan dalam pelarut standard (1:23) dan diinkubasi semalaman pada suhu 4°C dalam plat 96-telaga yang disalut dengan antibodi tangkapan BNT77.Selepas lima langkah pencucian, antibodi BA27 terkonjugasi HRP ditambah dan diinkubasi selama 2 jam pada suhu 4° C., diikuti dengan lima langkah pencucian.Aβ(1–40) dikesan melalui pengeraman dalam larutan TMB selama 30 minit pada suhu bilik.Selepas pembangunan warna dihentikan dengan larutan henti, ukur penyerapan pada 450 nm.Sampel plasma tertakluk kepada pengekstrakan fasa pepejal sebelum Aβ(1–40) ELISA.Plasma telah ditambah kepada 0.2% DEA (Sigma) dalam plat 96-telaga dan diinkubasi pada suhu bilik selama 30 minit.Selepas membasuh plat SPE (Oasis, 186000679) berturut-turut dengan air dan 100% metanol, sampel plasma telah ditambah pada plat SPE dan semua cecair dikeluarkan.Sampel telah dibasuh (pertama dengan 5% metanol kemudian 30% metanol) dan diencerkan dengan 2% NH4OH/90% metanol.Selepas mengeringkan eluat pada 55°C selama 99 minit pada arus N2 malar, sampel dikurangkan dalam pelarut standard dan Aβ(1-40) diukur seperti yang diterangkan di atas.
Cara memetik rencana ini: Urich, E. et al.Penghantaran kargo ke otak menggunakan peptida transit yang dikenal pasti dalam vivo.Sains.5, 14104;doi:10.1038/srep14104 (2015).
Likhota J., Skjorringe T., Thomsen LB dan Moos T. Penghantaran ubat makromolekul ke otak menggunakan terapi yang disasarkan.Jurnal Neurokimia 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C., dan Martinez-Martinez, P. Penghantaran ubat peptida dan protein merentasi penghalang darah-otak.Prog Neurobiol 87, 212–251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
Pardridge, WM Penghalang darah-otak: kesesakan dalam pembangunan dadah otak.NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
Johanson, KE, Duncan, JA, Stopa, EG, dan Byrd, A. Prospek untuk penghantaran ubat yang lebih baik dan penyasaran ke otak melalui laluan choroid plexus-CSF.Penyelidikan Farmaseutikal 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
Pardridge, WM Pemodenan biofarmaseutikal dengan kuda Trojan molekul untuk penghantaran otak.Bioconjug Chem 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008).
Pardridge, pengangkutan peptida pengantara reseptor WM merentasi penghalang darah-otak.Endokr Rev. 7, 314–330 (1986).
Niewoehner, J. et al.Meningkatkan penembusan otak dan keberkesanan antibodi terapeutik menggunakan pengangkutan molekul monovalen.Neuron 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
Bien-Lee, N. et al.Pengangkutan reseptor transferrin (TfR) menentukan pengambilan otak varian pertalian antibodi TfR.J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).