Sesetengah topik penyelesaian masalah LC tidak pernah lapuk, kerana terdapat isu dalam amalan LC, walaupun teknologi instrumen bertambah baik dari semasa ke semasa. Terdapat banyak cara masalah boleh timbul dalam sistem LC dan berakhir dalam bentuk puncak yang lemah. Apabila isu berkaitan dengan bentuk puncak timbul, senarai pendek kemungkinan punca hasil ini membantu memudahkan pengalaman penyelesaian masalah kami.
Seronok menulis lajur "Penyelesaian Masalah LC" ini dan memikirkan topik setiap bulan, kerana sesetengah topik tidak pernah ketinggalan zaman. Semasa dalam bidang kromatografi menyelidik topik atau idea tertentu menjadi usang kerana ia digantikan dengan idea yang lebih baharu dan lebih baik, dalam bidang penyelesaian masalah, sejak artikel penyelesaian masalah pertama muncul dalam jurnal ini (sebahagian daripada topik LC pada masa itu)O8(sesetengah topik dalam Jurnal LC pada masa itu) masih relevan). beberapa tahun kebelakangan ini, saya telah memfokuskan beberapa bahagian Penyelesaian Masalah LC pada trend kontemporari yang mempengaruhi kromatografi cecair (LC) (contohnya, perbandingan relatif pemahaman kita tentang kesan tekanan ke atas pengekalan [2] Pendahuluan Baharu) Tafsiran kami tentang keputusan LC dan cara menyelesaikan masalah dengan instrumen LC moden. Dalam ansuran bulan ini, saya akan teruskan pada beberapa siri 1 Disember (20), yang mana saya mulakan pada beberapa siri 20 Disember. Topik "hidup dan mati" penyelesaian masalah LC — elemen yang bagus untuk mana-mana penyelesai masalah adalah penting, tidak kira umur sistem yang kami gunakan. Topik teras siri ini sangat relevan dengan carta dinding "Panduan Penyelesaian Masalah LC" LCGC yang terkenal (4) yang tergantung di banyak makmal. Untuk bahagian ketiga siri ini, saya memilih untuk memfokuskan pada senarai teratas atau isu-isu yang berkaitan dengan carta puncak4. punca potensi yang berbeza bagi bentuk puncak yang buruk!Kami tidak boleh mempertimbangkan semua isu ini secara terperinci dalam satu artikel, jadi dalam ansuran pertama mengenai topik ini, saya akan menumpukan pada beberapa perkara yang paling kerap saya lihat. Saya harap pengguna LC muda dan tua akan menemui beberapa petua dan peringatan berguna mengenai topik penting ini.
Saya mendapati diri saya semakin menjawab soalan penyelesai masalah dengan "apa-apa sahaja boleh jadi". Tanggapan ini mungkin kelihatan mudah apabila mempertimbangkan pemerhatian yang sukar untuk ditafsirkan, tetapi saya mendapati ia selalunya sesuai. Dengan banyak kemungkinan penyebab bentuk puncak yang buruk, adalah penting untuk sentiasa berfikiran terbuka apabila mempertimbangkan masalah yang mungkin berlaku, dan untuk dapat memberi keutamaan kepada punca yang berpotensi untuk memulakan usaha menyelesaikan masalah kami, memfokuskan kepada perkara yang paling penting, kemungkinan besar.
Satu langkah penting dalam mana-mana latihan penyelesaian masalah — tetapi satu yang saya fikir kurang dihormati — ialah menyedari bahawa terdapat masalah yang perlu diselesaikan. Menyedari bahawa terdapat masalah selalunya bermakna menyedari bahawa apa yang berlaku pada alat itu berbeza daripada jangkaan kami, yang dibentuk oleh teori, pengetahuan empirikal dan pengalaman (5). "Bentuk puncak" yang dirujuk di sini sebenarnya tidak merujuk kepada bentuk bersimetri, tidak simetri sahaja. licin, gebu, pinggir utama, tailing, dll.), tetapi juga pada lebarnya. Jangkaan kami untuk bentuk puncak sebenar adalah mudah. ​​Teori (6) menyokong jangkaan buku teks bahawa, dalam kebanyakan kes, puncak kromatografi harus simetri dan menepati bentuk taburan Gaussian, seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 1a. Perkara yang lebih luas yang kami jangkakan daripada topik yang lebih kompleks pada masa hadapan dan topik yang akan kami bincangkan pada masa hadapan. artikel.Bentuk puncak lain dalam Rajah 1 menunjukkan beberapa kemungkinan lain yang boleh diperhatikan—dalam erti kata lain, beberapa cara perkara boleh menjadi salah. Dalam baki ansuran ini, kami akan meluangkan masa membincangkan beberapa contoh situasi khusus yang boleh membawa kepada jenis bentuk ini.
Kadangkala puncak tidak diperhatikan sama sekali dalam kromatogram di mana ia dijangka akan dielusi. Carta dinding di atas menunjukkan bahawa ketiadaan puncak (dengan mengandaikan sampel sebenarnya mengandungi analit sasaran pada kepekatan yang sepatutnya menjadikan tindak balas pengesan mencukupi untuk melihatnya di atas bunyi bising) biasanya berkaitan dengan beberapa isu instrumen atau keadaan fasa mudah alih yang tidak betul (jika diperhatikan sama sekali). puncak, biasanya terlalu "lemah").Senarai pendek masalah dan penyelesaian yang berpotensi dalam kategori ini boleh didapati dalam Jadual I.
Seperti yang dinyatakan di atas, persoalan tentang berapa banyak pelebaran puncak yang perlu diterima sebelum memberi perhatian dan cuba membetulkannya adalah topik yang kompleks yang akan saya bincangkan dalam artikel akan datang.Pengalaman saya ialah pelebaran puncak yang ketara selalunya disertai dengan perubahan ketara dalam bentuk puncak, dan ekor puncak adalah lebih biasa daripada pra-puncak atau belahan.Walau bagaimanapun, nominal simetri puncak yang boleh juga disebabkan oleh beberapa puncak yang berbeza:
Setiap isu ini telah dibincangkan secara terperinci dalam isu Penyelesaian Masalah LC sebelum ini, dan pembaca yang berminat dengan topik ini boleh merujuk artikel sebelumnya ini untuk mendapatkan maklumat tentang punca dan penyelesaian yang berpotensi untuk isu ini. Butiran lanjut.
Puncak tailing, puncak hadapan dan belahan semuanya boleh disebabkan oleh fenomena kimia atau fizikal, dan senarai penyelesaian yang berpotensi untuk masalah ini berbeza-beza secara meluas, bergantung pada sama ada kita menghadapi masalah kimia atau fizikal. Selalunya, dengan membandingkan puncak yang berbeza dalam kromatogram, anda boleh mencari petunjuk penting tentang yang mana puncanya. Jika semua puncak fizikal berkemungkinan satu bentuk atau bukan kromatogram yang serupa. beberapa puncak terjejas, tetapi selebihnya kelihatan baik, kemungkinan besar penyebabnya adalah kimia.
Punca kimia bagi peak tailing adalah terlalu rumit untuk dibincangkan secara ringkas di sini. Pembaca yang berminat dirujuk kepada isu "LC Troubleshooting" baru-baru ini untuk perbincangan yang lebih mendalam (10). Walau bagaimanapun, satu perkara yang mudah untuk dicuba ialah mengurangkan jisim analit yang disuntik dan melihat sama ada bentuk puncak bertambah baik. Jika ya, maka ini adalah petunjuk yang baik bahawa masalah ini adalah lebihan terhad. jisim analit, atau keadaan kromatografi mesti diubah supaya bentuk puncak yang baik boleh diperolehi walaupun dengan jisim yang lebih besar disuntik.
Terdapat juga banyak sebab fizikal yang berpotensi untuk tailing puncak. Pembaca yang berminat dengan perbincangan terperinci tentang kemungkinan dirujuk kepada satu lagi isu terbaru "Penyelesaian Masalah LC" (11).Salah satu punca fizikal yang lebih biasa bagi tailing puncak ialah sambungan yang lemah pada satu titik antara penyuntik dan pengesan (12). Contoh yang melampau ditunjukkan dalam Rajah 1d sistem suntikan baru, yang kami perolehi dalam Rajah 1d sistem suntikan baru, yang kami perolehi dalam Rajah 1d yang baru. yang kami tidak pernah gunakan sebelum ini, dan memasang gelung suntikan volum kecil dengan ferrule yang telah diacu pada kapilari keluli tahan karat. Selepas beberapa eksperimen penyelesaian masalah awal, kami menyedari bahawa kedalaman port dalam stator injap suntikan adalah jauh lebih dalam daripada yang biasa kami lakukan, mengakibatkan volum mati yang besar di bahagian bawah port. Masalah ini mudah diselesaikan dengan menggantikan kedudukan tiub ferru yang betul, kami boleh melaraskan gelung suntikan yang lain dengan betul. isipadu mati di bahagian bawah pelabuhan.
Bahagian hadapan puncak seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 1e juga boleh disebabkan oleh masalah fizikal atau kimia. Punca fizikal biasa bagi tepi hadapan ialah dasar zarah lajur tidak tersusun dengan baik atau zarah telah disusun semula dari semasa ke semasa. Seperti halnya tailing puncak yang disebabkan oleh fenomena fizikal ini, cara terbaik untuk membetulkannya adalah dengan menggantikan lajur dan teruskan berjalan. Pada asasnya, asalan yang timbul daripada bahagian depan kimia sering timbul daripada apa yang dipanggil puncak kimia. Keadaan pengekalan "bukan linear". Di bawah keadaan yang ideal (linear), jumlah analit yang dikekalkan oleh fasa pegun (oleh itu, faktor pengekalan) adalah berkaitan secara linear dengan kepekatan analit dalam lajur. Secara kromatografi, ini bermakna apabila jisim analit yang disuntik ke dalam lajur meningkat, puncak menjadi lebih tinggi, tetapi perhubungan tidak linear ini terputus, tetapi tidak lebih lebar. bukan sahaja menjadi lebih tinggi tetapi juga lebih luas apabila lebih banyak jisim disuntik.Selain itu, bentuk tak linear menentukan bentuk puncak kromatografi, mengakibatkan tepi depan atau belakang.Seperti dengan beban lampau jisim yang menyebabkan ekor puncak (10), pendahuluan puncak yang disebabkan oleh pengekalan tak linear juga boleh didiagnosis dengan mengurangkan bentuk analit yang disuntik mesti ditingkatkan secara jisim, jika kaedah penyuntikan puncak mesti ditingkatkan secara jisim. tepi, atau keadaan kromatografi mesti diubah untuk meminimumkan tingkah laku ini.
Kadang-kadang kita memerhatikan apa yang kelihatan sebagai puncak "berpecah", seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 1f. Langkah pertama dalam menyelesaikan masalah ini adalah untuk menentukan sama ada bentuk puncak disebabkan oleh elusi separa (iaitu, kehadiran dua sebatian yang berbeza tetapi mengelusikan rapat). Puncak "pecah" berkaitan dengan Prestasi fizikal tidak ada kaitan dengan lajur itu sendiri. Selalunya, petunjuk paling penting untuk keputusan ini ialah sama ada semua puncak dalam kromatogram mempamerkan bentuk terbelah, atau hanya satu atau dua. Jika ia hanya satu atau dua, ia mungkin isu elusi bersama; jika semua puncak berpecah, ia mungkin isu fizikal, kemungkinan besar berkaitan dengan lajur itu sendiri.
Puncak pisah yang berkaitan dengan sifat fizikal lajur itu sendiri biasanya disebabkan oleh bahagian alur masuk atau alur keluar yang tersumbat, atau penyusunan semula zarah dalam lajur, membolehkan fasa mudah alih mengalir lebih laju daripada fasa bergerak di kawasan tertentu pembentukan saluran lajur .di kawasan lain (11). Frit yang tersumbat separa kadangkala boleh dibersihkan dengan membalikkan aliran melalui lajur; bagaimanapun, dalam pengalaman saya, ini biasanya penyelesaian jangka pendek dan bukannya jangka panjang. Ini selalunya membawa maut dengan lajur moden jika zarah bergabung semula dalam lajur. Pada ketika ini, adalah lebih baik untuk menggantikan lajur dan meneruskan.
Puncak dalam Rajah 1g, juga daripada contoh baru-baru ini dalam makmal saya sendiri, biasanya menunjukkan bahawa isyarat adalah sangat tinggi sehingga ia telah mencapai hujung julat tindak balas yang tinggi. Untuk pengesan penyerapan optik (UV-vis dalam kes ini), apabila kepekatan analit sangat tinggi, analit menyerap sebahagian besar cahaya yang melalui sel aliran pengesan, meninggalkan sangat sedikit cahaya daripada keadaan fototeavinder yang akan dikesan. oleh pelbagai sumber hingar, seperti cahaya sesat dan "arus gelap", menjadikan isyarat sangat "kabur" dalam rupa dan bebas daripada kepekatan analit. Apabila ini berlaku, masalah selalunya boleh diselesaikan dengan mudah dengan mengurangkan jumlah suntikan analit—mengurangkan isipadu suntikan, mencairkan sampel atau kedua-duanya.
Dalam sekolah kromatografi, kami menggunakan isyarat pengesan (iaitu, paksi-y dalam kromatogram) sebagai penunjuk kepekatan analit dalam sampel. Oleh itu, nampaknya pelik untuk melihat kromatogram dengan isyarat di bawah sifar, kerana tafsiran mudah ialah ini menunjukkan kepekatan analit negatif – yang sudah tentu tidak mungkin secara fizikal. Dalam pengalaman saya, pengesanan puncak negatif adalah yang paling kerap menggunakan optik, serapan UV.
Dalam kes ini, puncak negatif hanya bermaksud bahawa molekul yang mengelusi daripada lajur menyerap kurang cahaya daripada fasa bergerak itu sendiri sejurus sebelum dan selepas puncak. Ini boleh berlaku, contohnya, apabila menggunakan panjang gelombang pengesanan yang agak rendah (<230 nm) dan bahan tambahan fasa mudah alih yang menyerap sebahagian besar cahaya pada panjang gelombang ini. Aditif tersebut boleh menjadi komponen pelarut fasa mudah alih atau pelarut yang sebenarnya boleh digunakan sebagai komponen metanol a. puncak untuk menyediakan keluk penentukuran dan mendapatkan maklumat kuantitatif yang tepat, jadi tidak ada sebab asas untuk mengelakkannya (kaedah ini kadang-kadang dirujuk sebagai "pengesanan UV tidak langsung") (13). Walau bagaimanapun, jika kita benar-benar ingin mengelakkan puncak negatif sama sekali, dalam kes pengesanan penyerapan, penyelesaian terbaik adalah menggunakan panjang gelombang pengesanan yang berbeza, supaya fasa mudah alih menyerap lebih banyak daripada fasa mudah alih itu supaya fasa menyerap lebih sedikit daripada fasa mudah alih. ringan daripada analit.
Puncak negatif juga boleh muncul apabila menggunakan pengesanan indeks biasan (RI) apabila indeks biasan komponen selain daripada analit dalam sampel, seperti matriks pelarut, adalah berbeza daripada indeks biasan fasa mudah alih. Ini juga berlaku dengan pengesanan UV-vis, tetapi kesan ini cenderung dilemahkan berbanding pengesanan RI. Dalam kedua-dua kes, pemadanan negatif terhadap komposisi sampel boleh dikurangkan secara lebih rendah dengan lebih banyak matriks yang hampir sama. fasa mudah alih.
Dalam bahagian tiga mengenai topik asas penyelesaian masalah LC, saya membincangkan situasi di mana bentuk puncak yang diperhatikan berbeza daripada bentuk puncak yang dijangkakan atau biasa. Penyelesaian masalah yang berkesan untuk masalah sedemikian bermula dengan pengetahuan tentang bentuk puncak yang dijangkakan (berdasarkan teori atau pengalaman terdahulu dengan kaedah sedia ada), jadi sisihan daripada jangkaan ini adalah jelas. Masalah bentuk puncak mempunyai banyak punca potensi yang berbeza (terlalu luas, pemasangan tailing). sebab yang paling kerap saya lihat. Mengetahui butiran ini menyediakan tempat yang baik untuk memulakan penyelesaian masalah, tetapi tidak menangkap semua kemungkinan. Pembaca yang berminat dengan senarai sebab dan penyelesaian yang lebih mendalam boleh merujuk kepada carta dinding "Panduan Penyelesaian Masalah LC" LCGC.
(4) Carta dinding “Panduan Penyelesaian Masalah LC” LCGC.https://www.chromatographyonline.com/view/troubleshooting-wallchart (2021).
(6) A. Felinger, Analisis Data dan Pemprosesan Isyarat dalam Kromatografi (Elsevier, New York, NY, 1998), ms 43-96.
(8) Wahab MF, Dasgupta PK, Kadjo AF dan Armstrong DW, Anal.Chim.Journal.Rev. 907, 31–44 (2016).https://doi.org/10.1016/j.aca.2015.11.043.