Terima kasih kerana melawat Nature.com.Versi penyemak imbas yang anda gunakan mempunyai sokongan CSS yang terhad.Untuk pengalaman terbaik, kami mengesyorkan agar anda menggunakan penyemak imbas yang dikemas kini (atau lumpuhkan Mod Keserasian dalam Internet Explorer).Sementara itu, untuk memastikan sokongan berterusan, kami akan menjadikan tapak tanpa gaya dan JavaScript.
Biopsi cecair (LB) adalah konsep yang semakin popular dalam bidang bioperubatan.Konsep ini terutamanya berdasarkan pengesanan serpihan DNA ekstraselular yang beredar (ccfDNA), yang kebanyakannya dilepaskan sebagai serpihan kecil selepas kematian sel dalam pelbagai tisu.Sebilangan kecil serpihan ini berasal dari tisu atau organisma asing (asing).Dalam kerja semasa, kami telah menggunakan konsep ini pada kupang, spesies sentinel yang terkenal dengan kapasiti penapisan air laut yang tinggi.Kami menggunakan keupayaan kerang untuk bertindak sebagai penapis semula jadi untuk menangkap serpihan DNA persekitaran daripada pelbagai sumber untuk memberikan maklumat tentang biodiversiti ekosistem pantai marin.Keputusan kami menunjukkan bahawa hemolymph kupang mengandungi serpihan DNA yang sangat berbeza dalam saiz, dari 1 hingga 5 kb.Penjujukan senapang patah menunjukkan bahawa sebilangan besar serpihan DNA berasal dari mikrob asing.Antaranya, kami menemui serpihan DNA daripada bakteria, archaea dan virus, termasuk virus yang diketahui menjangkiti pelbagai perumah yang biasa ditemui dalam ekosistem marin pantai.Kesimpulannya, kajian kami menunjukkan bahawa konsep LB yang digunakan untuk kerang mewakili sumber pengetahuan yang kaya tetapi belum diterokai tentang kepelbagaian mikrob dalam ekosistem pantai marin.
Kesan perubahan iklim (CC) terhadap biodiversiti ekosistem marin adalah bidang penyelidikan yang berkembang pesat.Pemanasan global bukan sahaja menyebabkan tekanan fisiologi yang penting, tetapi juga menolak had evolusi kestabilan haba organisma marin, menjejaskan habitat beberapa spesies, mendorong mereka untuk mencari keadaan yang lebih baik [1, 2].Selain menjejaskan kepelbagaian biologi metazoa, CC mengganggu keseimbangan halus interaksi hos-mikrob.Dysbacteriosis mikrob ini menimbulkan ancaman serius kepada ekosistem marin kerana ia menjadikan organisma marin lebih mudah terdedah kepada patogen berjangkit [3, 4].Adalah dipercayai bahawa SS memainkan peranan penting dalam kematian beramai-ramai, yang merupakan masalah serius bagi pengurusan ekosistem marin global [5, 6].Ini adalah isu penting memandangkan kesan ekonomi, ekologi dan pemakanan banyak spesies marin.Ini terutama berlaku untuk bivalvia yang tinggal di kawasan kutub, di mana kesan CK lebih serta-merta dan teruk [6, 7].Malah, bivalvia seperti Mytilus spp.digunakan secara meluas untuk memantau kesan CC ke atas ekosistem marin.Tidak menghairankan, sejumlah besar biomarker telah dibangunkan untuk memantau kesihatan mereka, selalunya menggunakan pendekatan dua peringkat yang melibatkan biomarker berfungsi berdasarkan aktiviti enzim atau fungsi selular seperti daya maju sel dan aktiviti fagosit [8].Kaedah ini juga termasuk pengukuran kepekatan penunjuk tekanan tertentu yang terkumpul dalam tisu lembut selepas penyerapan sejumlah besar air laut.Walau bagaimanapun, kapasiti penapisan yang tinggi dan sistem peredaran separa terbuka bivalves memberi peluang untuk membangunkan biomarker hemolimfa baharu menggunakan konsep biopsi cecair (LB), pendekatan mudah dan invasif minimum kepada pengurusan pesakit.sampel darah [9, 10].Walaupun beberapa jenis molekul beredar boleh didapati dalam LB manusia, konsep ini terutamanya berdasarkan analisis penjujukan DNA serpihan DNA ekstraselular (ccfDNA) yang beredar dalam plasma.Sebenarnya, kehadiran DNA yang beredar dalam plasma manusia telah diketahui sejak pertengahan abad ke-20 [11], tetapi hanya dalam beberapa tahun kebelakangan ini bahawa kemunculan kaedah penjujukan throughput tinggi telah membawa kepada diagnosis klinikal berdasarkan ccfDNA.Kehadiran serpihan DNA yang beredar ini sebahagiannya disebabkan oleh pelepasan pasif DNA genomik (nuklear dan mitokondria) selepas kematian sel. Dalam individu yang sihat, kepekatan ccfDNA biasanya rendah (<10 ng/mL) tetapi boleh meningkat sebanyak 5-10 kali ganda pada pesakit yang mengalami pelbagai patologi atau mengalami tekanan, mengakibatkan kerosakan tisu. Dalam individu yang sihat, kepekatan ccfDNA biasanya rendah (<10 ng/mL) tetapi boleh meningkat sebanyak 5-10 kali ganda pada pesakit yang mengalami pelbagai patologi atau mengalami tekanan, mengakibatkan kerosakan tisu. У здоровых людей концентрация вккДНК в норме низкая (<10 нг/мл), но может повышаться в 5–10 раз глинойпличон atau подвергающихся стрессу, приводящему к повреждению тканей. Pada orang yang sihat, kepekatan cccDNA biasanya rendah (<10 ng/mL), tetapi ia boleh meningkat sebanyak 5-10 kali ganda pada pesakit dengan pelbagai patologi atau di bawah tekanan yang membawa kepada kerosakan tisu.在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/mL），但在患有各种病理或承受压受受压叛加5-下叛加倍，从而导致组织损伤。在 健康 个体 中 ， ccfdna 的 浓度 较 低 （（<10 ng/ml） 但 在 各 种 病理 或 承叛 或 承叛加 5-10 倍 ， 从而 组织。。。 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤Концентрации ccfDNA обычно низкие (<10 нг/мл) у здоровых людей, но могут быть увеличены в 5-10 раз у плица ями или стрессом, что приводит к повреждению тканей. Kepekatan ccfDNA biasanya rendah (<10 ng/ml) pada individu yang sihat, tetapi boleh meningkat 5-10 kali ganda pada pesakit dengan pelbagai patologi atau tekanan, mengakibatkan kerosakan tisu.Saiz serpihan ccfDNA berbeza secara meluas, tetapi biasanya berkisar antara 150 hingga 200 bp.[12].Analisis ccfDNA terbitan sendiri, iaitu, ccfDNA daripada sel hos normal atau berubah, boleh digunakan untuk mengesan perubahan genetik dan epigenetik yang terdapat dalam genom nuklear dan/atau mitokondria, dengan itu membantu doktor memilih terapi sasaran molekul tertentu [13].Walau bagaimanapun, ccfDNA boleh diperolehi daripada sumber asing seperti ccfDNA daripada sel janin semasa mengandung atau daripada organ yang dipindahkan [14,15,16,17].ccfDNA juga merupakan sumber maklumat penting untuk mengesan kehadiran asid nukleik agen berjangkit (asing), yang membolehkan pengesanan bukan invasif jangkitan meluas yang tidak dikenal pasti oleh kultur darah, mengelakkan biopsi invasif tisu yang dijangkiti [18].Kajian terkini sememangnya menunjukkan bahawa darah manusia mengandungi sumber maklumat yang kaya yang boleh digunakan untuk mengenal pasti patogen virus dan bakteria, dan kira-kira 1% daripada ccfDNA yang terdapat dalam plasma manusia adalah berasal dari luar [19].Kajian ini menunjukkan bahawa biodiversiti mikrobiom beredar organisma boleh dinilai menggunakan analisis ccfDNA.Walau bagaimanapun, sehingga baru-baru ini, konsep ini digunakan secara eksklusif pada manusia dan, pada tahap yang lebih rendah, dalam vertebrata lain [20, 21].
Dalam kertas kerja ini, kami menggunakan potensi LB untuk menganalisis ccfDNA Aulacomya atra, spesies selatan yang biasa ditemui di Kepulauan Kerguelen subantarctic, sekumpulan pulau di atas dataran besar yang terbentuk 35 juta tahun yang lalu.letusan gunung berapi.Menggunakan sistem eksperimen in vitro, kami mendapati bahawa serpihan DNA dalam air laut dengan cepat diambil oleh kerang dan memasuki petak hemolymph.Penjujukan senapang patah telah menunjukkan bahawa ccfDNA hemolymph kupang mengandungi serpihan DNA asalnya sendiri dan bukan asalnya, termasuk bakteria simbiotik dan serpihan DNA daripada biom tipikal ekosistem pantai marin gunung berapi sejuk.Hemolymph ccfDNA juga mengandungi jujukan virus yang diperoleh daripada virus dengan julat perumah yang berbeza.Kami juga menemui serpihan DNA daripada haiwan multisel seperti ikan bertulang, anemon laut, alga dan serangga.Kesimpulannya, kajian kami menunjukkan bahawa konsep LB boleh berjaya digunakan untuk invertebrata marin untuk menjana repertoir genomik yang kaya dalam ekosistem marin.
Dewasa (55-70 mm panjang) Mytilus platensis (M. platensis) dan Aulacomya atra (A. atra) telah dikumpulkan dari pantai berbatu intertidal Port-au-France (049°21.235 S, 070°13.490 E.).Kepulauan Kerguelen pada Disember 2018. Kupang biru dewasa lain (Mytilus spp.) diperoleh daripada pembekal komersial (PEI Mussel King Inc., Pulau Prince Edward, Kanada) dan diletakkan di dalam tangki berudara terkawal (4°C) yang mengandungi 10–20 L air garam tiruan 32‰.(garam laut tiruan Reef Crystal, Lautan Segera, Virginia, Amerika Syarikat).Bagi setiap eksperimen, panjang dan berat cengkerang individu diukur.
Protokol akses terbuka percuma untuk program ini tersedia dalam talian (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1).Secara ringkas, hemolymph LB dikumpulkan dari otot penculik seperti yang diterangkan [22].Hemolymph telah dijelaskan dengan sentrifugasi pada 1200×g selama 3 minit, supernatan dibekukan (-20°C) sehingga digunakan.Untuk pengasingan dan penulenan cfDNA, sampel (1.5-2.0 ml) telah dicairkan dan diproses menggunakan kit cfDNA NucleoSnap (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) mengikut arahan pengilang.ccfDNA disimpan pada -80°C sehingga analisis selanjutnya.Dalam sesetengah eksperimen, ccfDNA telah diasingkan dan disucikan menggunakan Kit Penyiasat DNA QIAamp (QIAGEN, Toronto, Ontario, Kanada).DNA yang telah disucikan dikira menggunakan ujian PicoGreen standard.Taburan serpihan ccfDNA terpencil dianalisis oleh elektroforesis kapilari menggunakan bioanalyzer Agilent 2100 (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) menggunakan Kit DNA Kepekaan Tinggi.Ujian dilakukan menggunakan 1 µl sampel ccfDNA mengikut arahan pengilang.
Untuk penjujukan serpihan hemolymph ccfDNA, Génome Québec (Montreal, Quebec, Kanada) menyediakan perpustakaan senapang patah menggunakan kit Campuran DNA Illumina bagi kit Illumina MiSeq PE75.Penyesuai standard (BioO) telah digunakan.Fail data mentah tersedia daripada Arkib Bacaan Jujukan NCBI (SRR8924808 dan SRR8924809).Kualiti bacaan asas dinilai menggunakan FastQC [23].Trimmomatic [24] telah digunakan untuk penyesuai kliping dan bacaan berkualiti rendah.Bacaan senapang patah dengan hujung berpasangan telah FLASH digabungkan menjadi bacaan tunggal yang lebih panjang dengan pertindihan minimum 20 bp untuk mengelakkan ketidakpadanan [25]. Bacaan yang digabungkan telah dijelaskan dengan BLASTN menggunakan pangkalan data Taksonomi NCBI bivalve (nilai e <1e−3 dan 90% homologi), dan penutupan urutan kerumitan rendah dilakukan menggunakan DUST [26]. Bacaan yang digabungkan telah dijelaskan dengan BLASTN menggunakan pangkalan data Taksonomi NCBI bivalve (nilai e <1e−3 dan 90% homologi), dan penutupan urutan kerumitan rendah dilakukan menggunakan DUST [26]. Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием базы данных таксономии двустворчорчозлылюм ( <e> 3 и 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с использованием DEBU [26]. Bacaan terkumpul telah dijelaskan dengan BLASTN menggunakan pangkalan data taksonomi bivalve NCBI (nilai e <1e-3 dan 90% homologi), dan penyamaran jujukan kerumitan rendah dilakukan menggunakan DUST [26].使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90% 同源性）用BLASTN 注释合并的读敽的读数，使用广使使用注释合并的读数，使用使用幌使读数，2年复杂度序列的掩蔽。使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 90% 同源） 用 用 用 注释 合并 读数 ， 读数 ， 使用复杂度 序列 的。。。。 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽蔽Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием таксономической базы данных двузочниклмчат <1e-3 и 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с использованием DUST [26]. Bacaan terkumpul telah dijelaskan dengan BLASTN menggunakan pangkalan data taksonomi bivalve NCBI (nilai e <1e-3 dan 90% homologi), dan penyamaran jujukan kerumitan rendah dilakukan menggunakan DUST [26].Bacaan dibahagikan kepada dua kumpulan: berkaitan dengan jujukan bivalve (di sini dipanggil baca sendiri) dan tidak berkaitan (bukan baca sendiri).Dua kumpulan telah dipasang secara berasingan menggunakan MEGAHIT untuk menghasilkan contigs [27].Sementara itu, taburan taksonomi bacaan mikrobiom asing dikelaskan menggunakan Kraken2 [28] dan secara grafik diwakili oleh carta pai Krona pada Galaxy [29, 30].Kmers optimum ditentukan sebagai kmers-59 daripada eksperimen awal kami. Contigs sendiri kemudiannya dikenal pasti dengan penjajaran dengan BLASTN (pangkalan data NCBI bivalve, nilai e <1e−10 dan 60% homologi) untuk anotasi akhir. Contigs sendiri kemudiannya dikenal pasti dengan penjajaran dengan BLASTN (pangkalan data NCBI bivalve, nilai e <1e−10 dan 60% homologi) untuk anotasi akhir. Затем собственные контиги были идентифицированы путем сопоставления с BLASTN (база данных двустворчатых моллюбиск, 1 bulan <1 ология 60%) для окончательной аннотации. Contig kendiri kemudiannya dikenal pasti dengan memadankan dengan BLASTN (pangkalan data bivalve NCBI, nilai e <1e-10 dan 60% homologi) untuk anotasi akhir.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）对齐来识对齐来识别羍自终注释。然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% Затем были идентифицированы собственные контиги для окончательной аннотации путем сопоставления с BLASTN (hari minggu оллюсков, значение e <1e-10 и гомология 60%). Contigs sendiri kemudiannya dikenal pasti untuk anotasi akhir dengan memadankan dengan BLASTN (pangkalan data bivalve NCBI, nilai e <1e-10 dan 60% homologi). Secara selari, kontig kumpulan bukan diri telah dijelaskan dengan BLASTN (pangkalan data nt NCBI, nilai e <1e-10 dan 60% homologi). Secara selari, kontig kumpulan bukan diri telah dijelaskan dengan BLASTN (pangkalan data nt NCBI, nilai e <1e-10 dan 60% homologi). Параллельно чужеродные групповые контиги были аннотированы с помощью BLASTN (база данных nt NCBI, значение e <1e-10 % Secara selari, kontig kumpulan asing telah dijelaskan dengan BLASTN (pangkalan data NT NCBI, nilai e <1e-10 dan 60% homologi).平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群。平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群。 Параллельно контиги, не относящиеся к собственной группе, были аннотированы с помощью BLASTN (база данныгих nt nt 1 огия 60%). Secara selari, contigs kumpulan bukan diri telah dijelaskan dengan BLASTN (pangkalan data nt NCBI, nilai e <1e-10 dan 60% homologi). BLASTX juga dijalankan pada nonself contigs menggunakan pangkalan data NCBI protein nr dan RefSeq (nilai e <1e−10 dan 60% homologi). BLASTX juga dijalankan pada nonself contigs menggunakan pangkalan data NCBI protein nr dan RefSeq (nilai e <1e−10 dan 60% homologi). BLASTX также был проведен на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr и RefSeq NCBI (значоский использованием баз данных белка nr и RefSeq NCBI (знаго. 10 e <1e.%) BLASTX juga dilakukan pada contigs bukan diri menggunakan pangkalan data protein nr dan RefSeq NCBI (nilai e <1e-10 dan 60% homologi).还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和）% 同 。还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和）% 同 。 BLASTX также выполняли на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr и RefSeq NCBI (значение e <1e-10 % BLASTX juga dilakukan pada contigs bukan diri menggunakan pangkalan data protein nr dan RefSeq NCBI (nilai e <1e-10 dan 60% homologi).Kumpulan BLASTN dan BLASTX bukan contig sendiri mewakili contig terakhir (lihat fail Tambahan).
Primer yang digunakan untuk PCR disenaraikan dalam Jadual S1.Taq DNA polymerase (Bio Basic Canada, Markham, ON) digunakan untuk menguatkan gen sasaran ccfDNA.Keadaan tindak balas berikut digunakan: denaturasi pada 95°C selama 3 minit, 95°C selama 1 minit, tetapkan suhu penyepuhlindapan selama 1 minit, pemanjangan pada 72°C selama 1 minit, 35 kitaran, dan akhirnya 72°C dalam masa 10 minit..Produk PCR dipisahkan oleh elektroforesis dalam gel agarose (1.5%) yang mengandungi SYBRTM Safe DNA Gel Stain (Invitrogen, Burlington, ON, Kanada) pada 95 V.
Kerang (Mytilus spp.) telah diaklimatkan dalam 500 ml air laut beroksigen (32 PSU) selama 24 jam pada suhu 4°C.DNA plasmid yang mengandungi pengekodan sisipan jujukan cDNA galectin-7 manusia (nombor penyertaan NCBI L07769) telah ditambahkan pada vial pada kepekatan akhir 190 μg/μl.Kerang yang diinkubasi dalam keadaan yang sama tanpa penambahan DNA adalah kawalan.Tangki kawalan ketiga mengandungi DNA tanpa kerang.Untuk memantau kualiti DNA dalam air laut, sampel air laut (20 μl; tiga ulangan) diambil dari setiap tangki pada masa yang dinyatakan.Untuk kebolehkesanan DNA plasmid, kupang LB dituai pada masa yang dinyatakan dan dianalisis oleh qPCR dan ddPCR.Disebabkan kandungan garam yang tinggi dalam air laut, aliquot telah dicairkan dalam air berkualiti PCR (1:10) sebelum semua ujian PCR.
PCR titisan digital (ddPCR) dilakukan menggunakan protokol BioRad QX200 (Mississauga, Ontario, Kanada).Gunakan profil suhu untuk menentukan suhu optimum (Jadual S1).Titisan dijana menggunakan penjana titisan QX200 (BioRad).ddPCR telah dijalankan seperti berikut: 95°C selama 5 minit, 50 kitaran 95°C selama 30 saat dan suhu penyepuhlindapan yang diberikan selama 1 minit dan 72°C selama 30 saat, 4°C selama 5 minit dan 90°C dalam masa 5 minit.Bilangan titisan dan tindak balas positif (bilangan salinan/µl) diukur menggunakan pembaca titisan QX200 (BioRad).Sampel dengan kurang daripada 10,000 titisan telah ditolak.Kawalan corak tidak dilakukan setiap kali ddPCR dijalankan.
qPCR dilakukan menggunakan Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Sydney, Australia) dan primer khusus LGALS7.Semua PCR kuantitatif dilakukan dalam 20 µl menggunakan Kit PCR Hijau SYBR QuantiFast (QIAGEN).qPCR dimulakan dengan pengeraman 15 minit pada 95°C diikuti dengan 40 kitaran pada 95°C selama 10 saat dan pada 60°C selama 60 saat dengan satu pengumpulan data.Lengkung lebur dijana menggunakan pengukuran berturut-turut pada 95°C selama 5 saat, 65°C selama 60 saat, dan 97°C pada penghujung qPCR.Setiap qPCR dilakukan dalam tiga kali ganda, kecuali untuk sampel kawalan.
Memandangkan kerang terkenal dengan kadar penapisan yang tinggi, kami mula-mula menyiasat sama ada ia boleh menapis dan mengekalkan serpihan DNA yang terdapat dalam air laut.Kami juga berminat sama ada serpihan ini terkumpul dalam sistem limfa separa terbuka mereka.Kami menyelesaikan isu ini secara eksperimen dengan mengesan nasib serpihan DNA larut yang ditambahkan pada tangki kerang biru.Untuk memudahkan pengesanan serpihan DNA, kami menggunakan DNA plasmid asing (bukan diri) yang mengandungi gen galectin-7 manusia.ddPCR mengesan serpihan DNA plasmid dalam air laut dan kerang.Keputusan kami menunjukkan bahawa jika jumlah serpihan DNA dalam air laut kekal secara relatifnya dari masa ke masa (sehingga 7 hari) tanpa kehadiran kerang, maka dengan kehadiran kerang tahap ini hampir hilang sepenuhnya dalam masa 8 jam (Rajah 1a, b).Serpihan DNA eksogen mudah dikesan dalam masa 15 minit dalam cecair intravalvular dan hemolymph (Rajah 1c).Serpihan ini masih boleh dikesan sehingga 4 jam selepas pendedahan.Aktiviti penapisan berkenaan dengan serpihan DNA ini adalah setanding dengan aktiviti penapisan bakteria dan alga [31].Keputusan ini menunjukkan bahawa kupang boleh menapis dan mengumpul DNA asing dalam petak bendalir mereka.
Kepekatan relatif DNA plasmid dalam air laut dengan kehadiran (A) atau ketiadaan (B) kupang, diukur dengan ddPCR.Dalam A, keputusan dinyatakan sebagai peratusan, dengan sempadan kotak mewakili persentil ke-75 dan ke-25.Keluk logaritma yang dipasang ditunjukkan dalam warna merah, dan kawasan yang berlorek dengan kelabu mewakili selang keyakinan 95%.Dalam B, garis merah mewakili min dan garis biru mewakili selang keyakinan 95% untuk kepekatan.C Pengumpulan DNA plasmid dalam hemolymph dan cecair injap kupang pada masa yang berbeza selepas penambahan DNA plasmid.Keputusan dibentangkan sebagai salinan mutlak yang dikesan/mL (±SE).
Seterusnya, kami menyiasat asal usul ccfDNA dalam kerang yang dikumpul dari katil kerang di Kepulauan Kerguelen, sekumpulan pulau terpencil dengan pengaruh antropogenik yang terhad.Untuk tujuan ini, cccDNA daripada hemolymphs kupang telah diasingkan dan disucikan dengan kaedah yang biasa digunakan untuk membersihkan cccDNA manusia [32, 33].Kami mendapati bahawa purata kepekatan hemolymph ccfDNA dalam kerang berada dalam julat mikrogram per ml hemolymph yang rendah (lihat Jadual S2, Maklumat Tambahan).Julat kepekatan ini jauh lebih besar daripada orang yang sihat (nanogram per mililiter rendah), tetapi dalam kes yang jarang berlaku, dalam pesakit kanser, tahap ccfDNA boleh mencapai beberapa mikrogram per mililiter [34, 35].Analisis terhadap taburan saiz hemolymph ccfDNA menunjukkan bahawa serpihan ini sangat berbeza dalam saiz, antara 1000 bp hingga 1000 bp.sehingga 5000 bp (Rajah 2).Keputusan yang sama diperoleh menggunakan Kit Penyiasat QIAamp berasaskan silika, kaedah yang biasa digunakan dalam sains forensik untuk mengasingkan dan memurnikan DNA genomik dengan cepat daripada sampel DNA berkepekatan rendah, termasuk ccfDNA [36].
Elektroforegram ccfDNA wakil hemolymph kupang.Diekstrak dengan Kit Plasma NucleoSnap (atas) dan Kit Penyiasat DNA QIAamp.B Plot biola menunjukkan taburan kepekatan ccfDNA hemolymph (±SE) dalam kupang.Garis hitam dan merah masing-masing mewakili median dan kuartil pertama dan ketiga.
Kira-kira 1% daripada ccfDNA pada manusia dan primata mempunyai sumber asing [21, 37].Memandangkan sistem peredaran separa terbuka bivalves, air laut yang kaya dengan mikrob dan taburan saiz ccfDNA kupang, kami membuat hipotesis bahawa hemolymph kupang ccfDNA mungkin mengandungi kumpulan DNA mikrob yang kaya dan pelbagai.Untuk menguji hipotesis ini, kami menyusun hemolymph ccfDNA daripada sampel Aulacomya atra yang dikumpul dari Kepulauan Kerguelen, menghasilkan lebih 10 juta bacaan, 97.6% daripadanya melepasi kawalan kualiti.Bacaan kemudiannya dikelaskan mengikut sumber kendiri dan bukan kendiri menggunakan pangkalan data bivalve BLASTN dan NCBI (Rajah S1, Maklumat Tambahan).
Pada manusia, kedua-dua DNA nuklear dan mitokondria boleh dilepaskan ke dalam aliran darah [38].Walau bagaimanapun, dalam kajian ini, adalah tidak mungkin untuk menerangkan secara terperinci DNA genomik nuklear kerang, memandangkan genom A. atra belum dijujukan atau diterangkan.Walau bagaimanapun, kami dapat mengenal pasti beberapa serpihan ccfDNA asal kami sendiri menggunakan perpustakaan bivalve (Rajah S2, Maklumat Tambahan).Kami juga mengesahkan kehadiran serpihan DNA dari asal kami sendiri dengan amplifikasi PCR yang diarahkan bagi gen A. atra yang dijujukan (Rajah 3).Begitu juga, memandangkan genom mitokondria A. atra tersedia dalam pangkalan data awam, seseorang boleh mencari bukti untuk kehadiran serpihan ccfDNA mitokondria dalam hemolimfa A. atra.Kehadiran serpihan DNA mitokondria telah disahkan oleh penguatan PCR (Rajah 3).
Pelbagai gen mitokondria hadir dalam hemolymph A. atra (titik merah – nombor stok: SRX5705969) dan M. platensis (titik biru – nombor stok: SRX5705968) yang dikuatkan oleh PCR.Rajah diadaptasi daripada Breton et al., 2011 B Penguatan supernatan hemolimfa daripada A. atra Disimpan di atas kertas FTA.Gunakan penebuk 3 mm untuk menambah terus ke tiub PCR yang mengandungi campuran PCR.
Memandangkan kandungan mikrob yang banyak dalam air laut, kami pada mulanya menumpukan pada pencirian jujukan DNA mikrob dalam hemolymph.Untuk melakukan ini, kami menggunakan dua strategi yang berbeza.Strategi pertama menggunakan Kraken2, program klasifikasi jujukan berasaskan algoritma yang boleh mengenal pasti jujukan mikrob dengan ketepatan yang setanding dengan BLAST dan alat lain [28].Lebih daripada 6719 bacaan ditentukan sebagai asal bakteria, manakala 124 dan 64 adalah dari archaea dan virus, masing-masing (Rajah 4).Serpihan DNA bakteria yang paling banyak ialah Firmicutes (46%), Proteobacteria (27%) dan Bacteroidetes (17%) (Rajah 4a).Pengagihan ini konsisten dengan kajian terdahulu mikrobiom kerang biru marin [39, 40].Gammaproteobacteria ialah kelas utama Proteobacteria (44%), termasuk banyak Vibrionales (Rajah 4b).Kaedah ddPCR mengesahkan kehadiran serpihan DNA Vibrio dalam ccfDNA A. atra hemolymph (Rajah 4c) [41].Untuk mendapatkan maklumat lanjut tentang asal bakteria ccfDNA, pendekatan tambahan telah diambil (Rajah S2, Maklumat Tambahan). Dalam kes ini, bacaan yang bertindih dipasang sebagai bacaan akhir berpasangan dan diklasifikasikan sebagai bacaan diri (bivalves) atau bukan asal menggunakan BLASTN dan nilai e 1e−3 dan potongan dengan> 90% homologi. Dalam kes ini, bacaan yang bertindih dipasang sebagai bacaan akhir berpasangan dan diklasifikasikan sebagai bacaan diri (bivalves) atau bukan asal menggunakan BLASTN dan nilai e 1e−3 dan potongan dengan> 90% homologi. В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и были классифицированыстости каквланыство юски) atau чужие по происхождению с использованием BLASTN dan значения e 1e-3 dan отсечения с гомологией> 90%. Dalam kes ini, bacaan bertindih dikumpul sebagai bacaan berpasangan dan diklasifikasikan sebagai asli (bivalve) atau bukan asal menggunakan BLASTN dan nilai e 1e-3 dan potongan dengan> 90% homologi.在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN 和1e-3 的e 值咐>90% 我歌为自身（双壳类）或非自身来源。在 这 种 情况 下 ， 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 ， 使用 使用 使用 的 9 % 和 的 和 0%同源性 的 分类 自身 （双 壳类） 非 自身。。。。。。。。 В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и классифицированы как собствоственский и) atau несобственные по происхождению с использованием значений e BLASTN и 1e-3 dan порога гомологии> 90%. Dalam kes ini, bacaan bertindih dikumpulkan sebagai bacaan berpasangan dan diklasifikasikan sebagai bacaan sendiri (bivalves) atau bukan asal menggunakan nilai e BLASTN dan 1e-3 dan ambang homologi >90%.Memandangkan genom A. atra belum lagi dijujukan, kami menggunakan strategi pemasangan de novo pemasang MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS).Sebanyak 147,188 contigs telah dikenal pasti sebagai bergantung (bivalves) asal.Contigs ini kemudiannya diletupkan dengan e-nilai 1e-10 menggunakan BLASTN dan BLASTX.Strategi ini membolehkan kami mengenal pasti 482 serpihan bukan bivalve yang terdapat dalam A. atra ccfDNA.Lebih separuh (57%) daripada serpihan DNA ini diperoleh daripada bakteria, terutamanya daripada simbion insang, termasuk simbion sulfotropik, dan daripada simbion insang Solemya velum (Rajah 5).
Kelimpahan relatif pada tahap jenis.B Kepelbagaian mikrob dua filum utama (Firmicutes dan Proteobacteria).Penguatan perwakilan ddPCR C Vibrio spp.A. Serpihan gen 16S rRNA (biru) dalam tiga hemolimfa atra.
Sebanyak 482 contig yang dikumpul telah dianalisis.Profil umum taburan taksonomi anotasi contig metagenomik (prokariot dan eukariota).B Pengedaran terperinci serpihan DNA bakteria yang dikenal pasti oleh BLASTN dan BLASTX.
Analisis Kraken2 juga menunjukkan bahawa ccfDNA kerang mengandungi serpihan DNA arkeologi, termasuk serpihan DNA Euryarchaeota (65%), Crenarchaeota (24%) dan Thaurmarcheota (11%) (Rajah 6a).Kehadiran serpihan DNA yang diperoleh daripada Euryarchaeota dan Crenarchaeota, yang sebelum ini ditemui dalam komuniti mikrob kerang California, tidak sepatutnya mengejutkan [42].Walaupun Euryarchaeota sering dikaitkan dengan keadaan yang melampau, kini diakui bahawa kedua-dua Euryarchaeota dan Crenarcheota adalah antara prokariot yang paling biasa dalam persekitaran kriogenik marin [43, 44].Kehadiran mikroorganisma metanogenik dalam kerang tidak menghairankan, memandangkan laporan terkini mengenai kebocoran metana yang meluas dari kebocoran dasar di Dataran Tinggi Kerguelen [45] dan kemungkinan pengeluaran metana mikrob diperhatikan di luar pantai Kepulauan Kerguelen [46].
Perhatian kami kemudian beralih kepada bacaan daripada virus DNA.Untuk pengetahuan terbaik kami, ini adalah kajian luar sasaran pertama tentang kandungan virus kerang.Seperti yang dijangkakan, kami menjumpai serpihan DNA bakteriofaj (Caudovirales) (Rajah 6b).Walau bagaimanapun, DNA virus yang paling biasa datang daripada filum nukleositovirus, juga dikenali sebagai virus DNA besar sitoplasma nuklear (NCLDV), yang mempunyai genom terbesar daripada mana-mana virus.Dalam filum ini, kebanyakan jujukan DNA tergolong dalam keluarga Mimimidoviridae (58%) dan Poxviridae (21%), yang perumah semula jadinya termasuk vertebrata dan arthropoda, manakala sebahagian kecil jujukan DNA ini tergolong dalam alga virologi yang diketahui.Menjangkiti alga eukariotik marin.Urutan itu juga diperoleh daripada virus Pandora, virus gergasi dengan saiz genom terbesar daripada mana-mana genera virus yang diketahui.Menariknya, julat hos yang diketahui dijangkiti virus, seperti yang ditentukan oleh penjujukan hemolymph ccfDNA, adalah agak besar (Rajah S3, Maklumat Tambahan).Ia termasuk virus yang menjangkiti serangga seperti Baculoviridae dan Iridoviridae, serta virus yang menjangkiti amoeba, alga dan vertebrata.Kami juga menemui jujukan yang sepadan dengan genom Pithovirus sibericum.Pitovirus (juga dikenali sebagai "virus zombi") mula-mula diasingkan daripada permafrost berusia 30,000 tahun di Siberia [47].Oleh itu, keputusan kami adalah konsisten dengan laporan terdahulu yang menunjukkan bahawa tidak semua spesies moden virus ini telah pupus [48] dan bahawa virus ini mungkin terdapat dalam ekosistem marin subartik terpencil.
Akhirnya, kami menguji untuk melihat sama ada kami boleh menemui serpihan DNA daripada haiwan multiselular lain.Sebanyak 482 contig asing telah dikenal pasti oleh BLASTN dan BLASTX dengan perpustakaan nt, nr dan RefSeq (genomik dan protein).Keputusan kami menunjukkan bahawa antara serpihan asing ccfDNA haiwan multiselular DNA tulang tulang mendominasi (Rajah 5).Serpihan DNA daripada serangga dan spesies lain juga telah ditemui.Sebahagian besar serpihan DNA belum dikenal pasti, mungkin disebabkan oleh kekurangan perwakilan sebilangan besar spesies marin dalam pangkalan data genomik berbanding spesies daratan [49].
Dalam kertas kerja ini, kami menggunakan konsep LB untuk kerang, dengan alasan bahawa penjujukan pukulan hemolymph ccfDNA boleh memberikan gambaran tentang komposisi ekosistem pantai marin.Khususnya, kami mendapati bahawa 1) hemolymph kupang mengandungi kepekatan yang agak tinggi (paras mikrogram) serpihan DNA yang beredar yang agak besar (~1-5 kb);2) serpihan DNA ini adalah bebas dan tidak bebas 3) Antara sumber asing serpihan DNA ini, kami menemui DNA bakteria, arkeologi dan virus, serta DNA haiwan multiselular lain;4) Pengumpulan serpihan ccfDNA asing ini dalam hemolymph berlaku dengan cepat dan menyumbang kepada aktiviti penapisan dalaman kerang.Kesimpulannya, kajian kami menunjukkan bahawa konsep LB, yang setakat ini digunakan terutamanya dalam bidang bioperubatan, mengkodkan sumber pengetahuan yang kaya tetapi belum diterokai yang boleh digunakan untuk lebih memahami interaksi antara spesies sentinel dan persekitaran mereka.
Sebagai tambahan kepada primata, pengasingan ccfDNA telah dilaporkan dalam mamalia, termasuk tikus, anjing, kucing, dan kuda [50, 51, 52].Walau bagaimanapun, untuk pengetahuan kami, kajian kami adalah yang pertama melaporkan pengesanan dan penjujukan ccfDNA dalam spesies marin dengan sistem peredaran terbuka.Ciri anatomi dan keupayaan penapisan kerang ini mungkin, sekurang-kurangnya sebahagiannya, menerangkan ciri saiz berbeza bagi serpihan DNA yang beredar berbanding spesies lain.Pada manusia, kebanyakan serpihan DNA yang beredar dalam darah adalah serpihan kecil bersaiz antara 150 hingga 200 bp.dengan puncak maksimum 167 bp [34, 53].Sebahagian kecil tetapi ketara serpihan DNA bersaiz antara 300 dan 500 bp, dan kira-kira 5% lebih panjang daripada 900 bp.[54].Sebab bagi taburan saiz ini ialah sumber utama ccfDNA dalam plasma berlaku akibat kematian sel, sama ada disebabkan oleh kematian sel atau disebabkan oleh nekrosis sel hematopoietik yang beredar dalam individu yang sihat atau disebabkan apoptosis sel tumor dalam pesakit kanser ( dikenali sebagai DNA tumor yang beredar)., ctDNA).Taburan saiz ccfDNA hemolymph yang kami temui dalam kerang adalah antara 1000 hingga 5000 bp, menunjukkan bahawa ccfDNA kerang mempunyai asal yang berbeza.Ini adalah hipotesis logik, kerana kerang mempunyai sistem vaskular separuh terbuka dan hidup dalam persekitaran akuatik marin yang mengandungi kepekatan tinggi DNA genomik mikrob.Malah, eksperimen makmal kami menggunakan DNA eksogen telah menunjukkan bahawa kupang mengumpul serpihan DNA dalam air laut, sekurang-kurangnya selepas beberapa jam ia terdegradasi selepas pengambilan selular dan/atau dilepaskan dan/atau disimpan dalam pelbagai organisasi.Memandangkan jarangnya sel (kedua-dua prokariotik dan eukariotik), penggunaan petak intravalvular akan mengurangkan jumlah ccfDNA daripada sumber diri dan juga daripada sumber asing.Memandangkan kepentingan imuniti semula jadi bivalve dan bilangan besar fagosit yang beredar, kami selanjutnya membuat hipotesis bahawa walaupun ccfDNA asing diperkaya dalam fagosit beredar yang mengumpul DNA asing apabila tertelan mikroorganisma dan/atau serpihan selular.Secara keseluruhan, keputusan kami menunjukkan bahawa bivalve hemolymph ccfDNA ialah repositori unik maklumat molekul dan mengukuhkan status mereka sebagai spesies sentinel.
Data kami menunjukkan bahawa penjujukan dan analisis serpihan hemolymph ccfDNA yang berasal dari bakteria boleh memberikan maklumat penting tentang flora bakteria hos dan bakteria yang terdapat dalam ekosistem marin di sekelilingnya.Teknik penjujukan tangkapan telah mendedahkan urutan bakteria komensal A. insang atra yang akan terlepas jika kaedah pengenalan rRNA 16S konvensional telah digunakan, sebahagiannya disebabkan oleh bias perpustakaan rujukan.Malah, penggunaan data LB kami yang dikumpul daripada M. platensis dalam lapisan kupang yang sama di Kerguelen menunjukkan bahawa komposisi simbion bakteria yang berkaitan dengan insang adalah sama untuk kedua-dua spesies kupang (Rajah S4, Maklumat Tambahan).Persamaan dua kupang yang berbeza secara genetik ini mungkin mencerminkan komposisi komuniti bakteria dalam deposit sejuk, sulfur dan gunung berapi Kerguelen [55, 56, 57, 58].Tahap mikroorganisma penurun sulfur yang lebih tinggi telah diterangkan dengan baik apabila menuai kerang dari kawasan pantai bioturbat [59], seperti pantai Port-au-France.Kemungkinan lain ialah flora kupang komensal mungkin terjejas oleh penghantaran mendatar [60, 61].Lebih banyak penyelidikan diperlukan untuk menentukan korelasi antara persekitaran marin, permukaan dasar laut, dan komposisi bakteria simbiotik dalam kerang.Kajian-kajian ini sedang berjalan.
Panjang dan kepekatan hemolymph ccfDNA, kemudahan penulenannya, dan kualiti tinggi untuk membolehkan penjujukan senapang patah pantas adalah beberapa kelebihan menggunakan ccfDNA kupang untuk menilai biodiversiti dalam ekosistem pantai marin.Pendekatan ini amat berkesan untuk mencirikan komuniti virus (viromo) dalam ekosistem tertentu [62, 63].Tidak seperti bakteria, archaea dan eukariota, genom virus tidak mengandungi gen yang dipelihara secara filogenetik seperti jujukan 16S.Keputusan kami menunjukkan bahawa biopsi cecair daripada spesies penunjuk seperti kerang boleh digunakan untuk mengenal pasti bilangan serpihan virus ccfDNA yang agak besar yang diketahui menjangkiti perumah yang biasanya mendiami ekosistem marin pantai.Ini termasuk virus yang diketahui menjangkiti protozoa, arthropod, serangga, tumbuhan dan virus bakteria (cth, bacteriophages).Taburan yang sama ditemui apabila kami memeriksa virom hemolymph ccfDNA kerang biru (M. platensis) yang dikumpulkan dalam lapisan kerang yang sama di Kerguelen (Jadual S2, Maklumat Tambahan).Penjujukan senapang patah ccfDNA sememangnya pendekatan baru yang mendapat momentum dalam kajian virom manusia atau spesies lain [21, 37, 64].Pendekatan ini amat berguna untuk mengkaji virus DNA untai dua, kerana tiada gen tunggal yang dipelihara di kalangan semua virus DNA untai dua, yang mewakili kelas virus yang paling pelbagai dan luas di Baltimore [65].Walaupun kebanyakan virus ini kekal tidak dikelaskan dan mungkin termasuk virus dari bahagian dunia virus yang tidak diketahui sepenuhnya [66], kami mendapati bahawa virom dan julat perumah kupang A. atra dan M. platensis berada di antara kedua-dua spesies.begitu juga (lihat rajah S3, maklumat tambahan).Persamaan ini tidak menghairankan, kerana ia mungkin mencerminkan kekurangan selektiviti dalam pengambilan DNA yang terdapat dalam persekitaran.Kajian masa depan menggunakan RNA yang telah dimurnikan pada masa ini diperlukan untuk mencirikan virom RNA.
Dalam kajian kami, kami menggunakan saluran paip yang sangat ketat yang diadaptasi daripada kerja Kowarski dan rakan sekerja [37], yang menggunakan pemadaman dua langkah bacaan terkumpul dan contig sebelum dan selepas pemasangan ccfDNA asli, menghasilkan perkadaran tinggi bacaan tidak dipetakan.Oleh itu, kami tidak boleh menolak bahawa sesetengah bacaan yang tidak dipetakan ini mungkin masih mempunyai asalnya sendiri, terutamanya kerana kami tidak mempunyai genom rujukan untuk spesies kupang ini.Kami juga menggunakan saluran paip ini kerana kami bimbang tentang chimera antara bacaan diri dan bukan bacaan sendiri dan panjang bacaan yang dijana oleh Illumina MiSeq PE75.Satu lagi sebab bagi majoriti bacaan yang belum dipetakan ialah kebanyakan mikrob marin, terutamanya di kawasan terpencil seperti Kerguelen, tidak diberi anotasi.Kami menggunakan Illumina MiSeq PE75, dengan mengandaikan panjang serpihan ccfDNA serupa dengan ccfDNA manusia.Untuk kajian masa depan, memandangkan keputusan kami menunjukkan bahawa hemolymph ccfDNA mempunyai bacaan yang lebih lama daripada manusia dan/atau mamalia, kami mengesyorkan menggunakan platform penjujukan yang lebih sesuai untuk serpihan ccfDNA yang lebih panjang.Amalan ini akan menjadikannya lebih mudah untuk mengenal pasti lebih banyak petunjuk untuk analisis yang lebih mendalam.Mendapatkan jujukan genom nuklear A. atra lengkap yang tidak tersedia pada masa ini juga akan memudahkan diskriminasi ccfDNA daripada sumber diri dan bukan diri.Memandangkan penyelidikan kami telah menumpukan pada kemungkinan menerapkan konsep biopsi cecair kepada kerang, kami berharap bahawa kerana konsep ini digunakan dalam penyelidikan masa depan, alat dan saluran paip baharu akan dibangunkan untuk meningkatkan potensi kaedah ini untuk mengkaji kepelbagaian mikrob kerang.ekosistem marin.
Sebagai biomarker klinikal bukan invasif, paras plasma manusia ccfDNA yang tinggi dikaitkan dengan pelbagai penyakit, kerosakan tisu, dan keadaan tekanan [67,68,69].Peningkatan ini dikaitkan dengan pembebasan serpihan DNA asalnya sendiri selepas kerosakan tisu.Kami menangani isu ini menggunakan tekanan haba akut, di mana kerang terdedah secara ringkas kepada suhu 30 °C.Kami melakukan analisis ini pada tiga jenis kupang yang berbeza dalam tiga eksperimen bebas.Walau bagaimanapun, kami tidak menemui sebarang perubahan dalam tahap ccfDNA selepas tekanan haba akut (lihat Rajah S5, maklumat tambahan).Penemuan ini mungkin menjelaskan, sekurang-kurangnya sebahagiannya, hakikat bahawa kerang mempunyai sistem peredaran darah separuh terbuka dan mengumpul sejumlah besar DNA asing disebabkan oleh aktiviti penapisan yang tinggi.Sebaliknya, kerang, seperti banyak invertebrata, mungkin lebih tahan terhadap kerosakan tisu yang disebabkan oleh tekanan, dengan itu mengehadkan pembebasan ccfDNA dalam hemolimfa mereka [70, 71].
Sehingga kini, analisis DNA biodiversiti dalam ekosistem akuatik tertumpu terutamanya pada pengekodan metabar DNA alam sekitar (eDNA).Walau bagaimanapun, kaedah ini biasanya terhad dalam analisis biodiversiti apabila primer digunakan.Penggunaan penjujukan senapang patah memintas batasan PCR dan pemilihan set primer yang berat sebelah.Oleh itu, dalam erti kata lain, kaedah kami lebih dekat dengan kaedah penjujukan senapang patah eDNA throughput tinggi yang baru-baru ini digunakan, yang mampu secara langsung menyusun DNA yang terfragmentasi dan menganalisis hampir semua organisma [72, 73].Walau bagaimanapun, terdapat beberapa isu asas yang membezakan LB daripada kaedah eDNA standard.Sudah tentu, perbezaan utama antara eDNA dan LB ialah penggunaan hos penapis semula jadi.Penggunaan spesies marin seperti span dan bivalve (Dresseina spp.) sebagai penapis semula jadi untuk mengkaji eDNA telah dilaporkan [74, 75].Walau bagaimanapun, kajian Dreissena menggunakan biopsi tisu dari mana DNA diekstrak.Analisis ccfDNA daripada LB tidak memerlukan biopsi tisu, peralatan dan logistik yang khusus dan kadangkala mahal yang berkaitan dengan eDNA atau biopsi tisu.Malah, kami baru-baru ini melaporkan bahawa ccfDNA daripada LB boleh disimpan dan dianalisis dengan sokongan FTA tanpa mengekalkan rantaian sejuk, yang merupakan cabaran utama untuk penyelidikan di kawasan terpencil [76].Pengekstrakan ccfDNA daripada biopsi cecair juga mudah dan menyediakan DNA berkualiti tinggi untuk penjujukan senapang patah dan analisis PCR.Ini adalah kelebihan besar memandangkan beberapa batasan teknikal yang berkaitan dengan analisis eDNA [77].Kesederhanaan dan kos kaedah persampelan yang rendah juga amat sesuai untuk program pemantauan jangka panjang.Sebagai tambahan kepada keupayaan penapisan yang tinggi, satu lagi ciri bivalves yang terkenal ialah komposisi mucopolysaccharide kimia lendir mereka, yang menggalakkan penyerapan virus [78, 79].Ini menjadikan bivalvia penapis semula jadi yang ideal untuk mencirikan biodiversiti dan kesan perubahan iklim dalam ekosistem akuatik tertentu.Walaupun kehadiran serpihan DNA yang diperolehi hos boleh dilihat sebagai batasan kaedah berbanding dengan eDNA, kos yang berkaitan dengan memiliki ccfDNA asli sebegitu berbanding dengan eDNA secara serentak boleh difahami untuk sejumlah besar maklumat yang tersedia untuk kajian kesihatan.hos mengimbangi.Ini termasuk kehadiran jujukan virus yang disepadukan ke dalam genom hos hos.Ini amat penting untuk kerang, memandangkan kehadiran retrovirus leukemik yang disebarkan secara mendatar dalam bivalvia [80, 81].Satu lagi kelebihan LB berbanding eDNA ialah ia mengeksploitasi aktiviti fagositik sel darah yang beredar dalam hemolimfa, yang menelan mikroorganisma (dan genomnya).Fagositosis adalah fungsi utama sel darah dalam bivalvia [82].Akhir sekali, kaedah ini mengambil kesempatan daripada kapasiti penapisan tinggi kupang (purata 1.5 l/j air laut) dan peredaran dua hari, yang meningkatkan pencampuran lapisan air laut yang berbeza, membolehkan penangkapan eDNA heterolog.[83, 84].Oleh itu, analisis ccfDNA kerang merupakan satu cara yang menarik memandangkan kesan pemakanan, ekonomi dan alam sekitar kerang.Sama seperti analisis LB yang dikumpul daripada manusia, kaedah ini juga membuka kemungkinan mengukur perubahan genetik dan epigenetik dalam DNA perumah sebagai tindak balas kepada bahan eksogen.Sebagai contoh, teknologi penjujukan generasi ketiga boleh dijangkakan untuk melaksanakan analisis metilasi seluruh genom dalam ccfDNA asli menggunakan penjujukan nanopore.Proses ini harus difasilitasi oleh fakta bahawa panjang serpihan ccfDNA kerang sesuai dengan platform penjujukan yang dibaca lama yang membolehkan analisis metilasi DNA seluruh genom daripada satu penjujukan tanpa memerlukan transformasi kimia.85,86] Ini adalah satu kemungkinan yang menarik, kerana telah ditunjukkan bahawa pola metilasi DNA dan mencerminkan tindak balas yang berterusan terhadap gen tekanan alam sekitar.Oleh itu, ia boleh memberikan gambaran yang berharga tentang mekanisme asas yang mengawal tindak balas selepas pendedahan kepada perubahan iklim atau bahan pencemar [87].Walau bagaimanapun, penggunaan LB bukan tanpa batasan.Tidak perlu dikatakan, ini memerlukan kehadiran spesies penunjuk dalam ekosistem.Seperti yang dinyatakan di atas, menggunakan LB untuk menilai biodiversiti ekosistem tertentu juga memerlukan saluran paip bioinformatik yang ketat yang mengambil kira kehadiran serpihan DNA daripada sumber.Satu lagi masalah utama ialah ketersediaan genom rujukan untuk spesies marin.Diharapkan bahawa inisiatif seperti Projek Genom Mamalia Marin dan projek Fish10k yang baru ditubuhkan [88] akan memudahkan analisis sedemikian pada masa hadapan.Aplikasi konsep LB kepada organisma pemakan penapis marin juga serasi dengan kemajuan terkini dalam teknologi penjujukan, menjadikannya sangat sesuai untuk pembangunan penanda bio berbilang ohm untuk memberikan maklumat penting tentang kesihatan habitat marin sebagai tindak balas kepada tekanan alam sekitar.
Data penjujukan genom telah disimpan dalam Arkib Baca Jujukan NCBI https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 di bawah Bioprojects SRR8924808.
Brierley AS, Kingsford MJ Kesan perubahan iklim terhadap hidupan marin dan ekosistem.Biologi Cole.2009;19: P602–P614.
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Almpanidou V, Bevilacqua S, et al.Pertimbangkan kesan gabungan perubahan iklim dan tekanan tempatan yang lain terhadap persekitaran marin.persekitaran saintifik am.2021;755:142564.
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P, et al.).Sains pertama bulan Mac.2020;7:48.
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. Mengurangkan toleransi haba di bawah keadaan tekanan haba yang berulang menerangkan kematian musim panas yang tinggi bagi kupang biru.Laporan saintifik 2019;9:17498.
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER, et al.Perubahan terkini dalam kekerapan, punca dan tahap kematian haiwan.Proc Natl Acad Sci USA.2015;112:1083-8.
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mugheti D, Cerruti F, Hosseini S, et al.Berbilang patogen bukan spesies khusus mungkin telah menyebabkan kematian besar-besaran Pinna nobilis.kehidupan.2020;10:238.
Bradley M, Coutts SJ, Jenkins E, O'Hara TM.Potensi kesan perubahan iklim terhadap penyakit zoonosis Artik.Kesihatan Int J Circumpolar.2005;64:468–77.
Beyer J., Greene NW, Brooks S., Allan IJ, Ruus A., Gomez T. et al.Kupang biru (Mytilus edulis spp.) sebagai organisma isyarat dalam pemantauan pencemaran pantai: kajian semula.Mar Environ Res 2017;130:338-65.
Siravegna G, Marsoni S, Siena S, Bardelli A. Integrasi biopsi cecair dalam rawatan kanser.Nat Rev Clean Oncol.2017;14:531–48.
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C, et al.Kematangan biopsi cecair: Membenarkan DNA tumor beredar.Nat Rev Kanser.2017;17:223–38.
Mandel P., Metais P. Asid nukleik dalam plasma manusia.Minit mesyuarat anak syarikat Soc Biol.1948;142:241-3.
Bronkhorst AJ, Ungerer W, Holdenrieder S. Peranan baharu untuk DNA bebas sel sebagai penanda molekul untuk rawatan kanser.Kuantifikasi analisis biomolar.2019;17:100087.
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS Biopsi cecair memasuki klinik - isu pelaksanaan dan cabaran masa depan.Nat Rev Clin Oncol.2021;18:297–312.
Lo YM, Corbetta N., Chamberlain PF, Rai W., Sargent IL, Redman CW dan lain-lain.DNA janin terdapat dalam plasma dan serum ibu.Lancet.1997;350:485-7.
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR Kajian perjalanan kehamilan dan komplikasinya menggunakan RNA ekstraselular yang beredar dalam darah wanita semasa kehamilan.Dopediatrik.2020;8:605219.
Ollerich M, Sherwood K, Keown P, Schütz E, Beck J, Stegbauer J, et al.Biopsi cecair: DNA bebas sel penderma digunakan untuk mengesan lesi alogenik dalam cantuman buah pinggang.Nat Rev Nephrol.2021;17:591–603.
Juan FC, Lo YM Inovasi dalam diagnostik pranatal: penjujukan genom plasma ibu.Anna MD.2016;67:419-32.
Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D, et al.Pengesanan patogen pantas dengan penjujukan metagenomik generasi seterusnya cecair badan yang dijangkiti.Perubatan Nat.2021;27:115-24.